CN105861524B - 对4-hppd抑制剂的抵抗性或敏感性提高了的植物 - Google Patents

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Abstract

通过使用4‑HPPD抑制剂敏感性稻和4‑HPPD抑制剂抵抗性稻的QTL分析等，鉴定了4‑HPPD抑制剂抵抗性基因是位于稻的第2染色体短臂的被推定为铁/抗坏血酸依赖性氧化还原酶基因的基因(HIS1基因)。进而还弄清楚了HIS1基因的同源基因(HSL1基因)位于稻的第6染色体。而且发现，利用这些基因，可以有效地制作出对4‑HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性提高了的植物体，以及可以判定植物的对4‑HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性。

Description

对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性提高了的植物
本申请是申请日为2011年12月26日、申请号为201180068660.8、发明名称为“对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性提高了的植物”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的药剂、能够再生对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性提高了的植物体的转化植物细胞、由该细胞再生的植物体、以及它们的制造方法。另外本发明涉及判定植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的方法、和利用了该判定的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性提高了的植物的育种方法。
背景技术
随着生物乙醇燃料的需要增加，来自海外的饲料用谷物的进口价格高涨，压迫着日本国内的畜产经营。因此，为了提高饲料的国内生产和自给率，进行了利用休耕田等的除水稻以外的多样化作物的栽培。然而，由于排水不良等问题，适宜这些多样化作物的栽培的水田有限，因而进行了作为饲料的稻的利用、和/或具备高生产性的饲料稻专用品种(高产品种)的开发。在上述高产品种中，为了在发挥作为其特性的高产性、稳定的栽培性的同时，提高家畜的嗜好性、营养价值，栽培田的杂草防除成为重要的栽培管理技术(非专利文献1)。另外，不限于高产品种和稻，稳定且经济的作物生产要求低成本且省力、简便的杂草防除，为此选择性高的除草剂的开发·施用是有效的(非专利文献2)，因此需要开发和/或栽培对施用除草剂的抵抗性作物。
另一方面，在栽培田的杂草防除中，由于以低药量对大范围的杂草有效，对人体、环境的影响少，因而磺酰脲(SU)系除草剂广泛普及。然而，确认了对SU系除草剂具有耐性的萤蔺等杂草的产生，成为稻等的栽培管理中的问题。
近来，作为该问题的解决策略，苯并双环酮(BBC)、硝草酮、特糠酯酮(Tefuryltrione)等对SU系除草剂耐性植物也显示效果的除草剂成分被开发、实用化。BBC、硝草酮、特糠酯酮(Tefuryltrione)均是抑制4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-HPPD)的功能的药剂(4-HPPD抑制剂)，通过抑制该酶的功能，间接地抑制类胡萝卜素合成系统，引起叶绿素的崩解，从而使植物白化、枯死(参照图1)。对于这些抑制剂充分确认了对食用米品种的安全性，因而在稻的栽培中正在迅速普及。
然而，对于高产品种，有时对4-HPPD抑制剂的敏感性在开发阶段等没有被充分研究，报告了在7个品种的作为高产品种的饲料用稻中，对4-HPPD抑制剂弱，根据情况有可能导致枯死(非专利文献1和3)。
如果开发出能够确实识别对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的方法、以及能够提高对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的方法，则例如，如图2所示，可以在食用米品种、饲料用米品种的轮作体系中的上一年耕作的“遗漏种”的发芽风险(漏生稻谷、苗的问题)的控制中灵活运用4-HPPD抑制剂，进而可以期待饲料用米品种等的生产扩大。另外，通过利用这些方法，还可以根据需要在稻等的作物的栽培的区分管理技术中灵活运用。进而，如果发现了成为识别对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的标志物的基因，则可以有效地育种包含稻的作物。
因此，强烈要求开发用于赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的技术、和/或用于判定植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的技术。然而，能够有效地实现这些目的的技术目前尚未开发出。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：关野景介等，“飼料用イネ19品種の水稲用除草剤ベンゾビシクロン感受性(饲料用稻19品种的水稻用除草剂苯并双环酮敏感性)”、日本作物学会纪事、2009年3月25日、227卷、别号、120～121页
非专利文献2：Terry R.Wright等，Proc Natl Acad Sci USA.、2010年11月23日、107卷、47号、20240～20245页
非专利文献3：丸山清明等，“飼料用イネ等が一部の除草剤に弱いことが判明(判明饲料用稻等对一部分除草剂弱)”、[online]、2010年3月26日、独立行政法人农业·食品产业技术综合研究机构中央农业综合研究中心、新闻稿、[2010年9月29日检索]、国际互联网<URL:http://narc.naro.affrc.go.jp/press/h22/0326/index.htm>
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于上述现有技术中存在的课题而做出的，其目的在于，提供能够有效地赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的技术，和能够有效地判定植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的技术。
用于解决课题的方法
本发明者们为了实现上述目的，首先，尝试了鉴定植物中的与对4-HPPD抑制剂的抵抗性相关的基因。具体地，本发明者们首先进行了使用4-HPPD抑制剂敏感性稻和4-HPPD抑制剂抵抗性稻的数量性状基因座(QTL)分析。其结果判明了，4-HPPD抑制剂抵抗性决定基因座位于稻的第2染色体短臂。接着，本发明者们使用在位于由QTL分析所特定的基因座的推定为铁/抗坏血酸依赖性氧化还原酶基因的基因中插入了反转录转座子Tos17的日本晴系统调查表型(4-HPPD抑制型敏感性)，结果发现了Tos17插入纯合体对4-HPPD抑制剂显示敏感性。将发现的铁/抗坏血酸依赖性氧化还原酶基因导入拟南芥(A.thaliana)和稻中，结果这些转化植物显示对4-HPPD抑制剂的抵抗性，因此证明该基因是给植物带来对4-HPPD抑制剂的抵抗性的原因基因(以下，也称为4-羟基苯丙酮酸双加氧酶抑制剂敏感性基因1(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitor sensitive gene No.1，HIS1))。另外，与稻的HIS1基因具有高同源性的基因在大麦、高粱、玉米等中也存在。
进而，本发明者们通过PCR分析进行了4-HPPD抑制剂敏感性稻与4-HPPD抑制剂抵抗性稻中的HIS1基因的结构的比较。其结果是，在对4-HPPD抑制剂显示敏感性的稻品种中，在HIS1基因的第4～5外显子的范围中发生了插入和/或缺失，因此考虑HIS1基因的功能的抑制给植物带来了对4-HPPD抑制剂的敏感性。
另外，弄清楚了，在稻中，与HIS1基因同源性最高的稻基因(HSL1基因)位于第6染色体。进而，将该HSL1基因导入稻中，结果弄清楚了该转化稻也显示对4-HPPD抑制剂的抵抗性。
基于这些见解，本发明者们发现，通过利用HIS1基因或其同源基因，可以制作出对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性提高了的植物体，另外，以该基因为靶，可以判定植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性，从而完成了本发明。
本发明更详细地如下。
(1)用于赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的药剂，包含编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性的蛋白质的选自下述(a)～(d)中的至少一种DNA、或插入有该DNA的载体，
(a)编码包含序列号2或17所记载的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(b)编码包含在序列号2或17所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加、和/或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(c)与包含序列号1或16所记载的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA，
(d)编码与序列号2或17所记载的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列的DNA。
(2)转化植物细胞，能够再生对4-HPPD抑制剂的抵抗性提高了的植物体，该转化植物细胞中导入了编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性的蛋白质的选自下述(a)～(d)中的至少一种DNA，或者导入了插入有该DNA的载体，
(a)编码包含序列号2或17所记载的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(b)编码包含在序列号2或17所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加、和/或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(c)与包含序列号1或16所记载的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA，
(d)编码与序列号2或17所记载的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列的DNA。
(3)对4-HPPD抑制剂的抵抗性提高了的植物体，是由(2)所述的转化植物细胞再生的。
(4)对4-HPPD抑制剂的抵抗性提高了的植物体，是(3)所述的植物体的后代或克隆。
(5)(3)或(4)所记载的对4-HPPD抑制剂的抵抗性提高了的植物体的繁殖材料。
(6)对4-HPPD抑制剂的抵抗性提高了的植物体的制造方法，该方法包括以下工序：
(I)将编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性的蛋白质的选自下述(a)～(d)中的至少一种DNA、或插入有该DNA的载体导入植物细胞的工序，
(a)编码包含序列号2或17所记载的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(b)编码包含在序列号2或17所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加、和/或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(c)与包含序列号1或16所记载的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA，
(d)编码与序列号2或17所记载的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列的DNA；和
(II)由在工序(I)中导入了所述DNA或者导入了插入有该DNA的载体的转化植物细胞再生植物体的工序。
(7)用于赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的药剂，包含编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的活性的RNA的选自下述(a)～(c)中的至少一种DNA、或插入有该DNA的载体，
(a)编码与(1)所记载的DNA的转录产物互补的双链RNA的DNA，
(b)编码与(1)所记载的DNA的转录产物互补的反义RNA的DNA，
(c)编码具有特异性地裂开(1)所记载的DNA的转录产物的核酶活性的RNA的DNA。
(8)转化植物细胞，能够再生对4-HPPD抑制剂的敏感性提高了的植物体，该转化植物细胞中导入了编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的活性的RNA的选自下述(a)～(c)中的至少一种DNA，或者导入了插入有该DNA的载体，
(a)编码与(1)所记载的DNA的转录产物互补的双链RNA的DNA，
(b)编码与(1)所记载的DNA的转录产物互补的反义RNA的DNA，
(c)编码具有特异性地裂开(1)所记载的DNA的转录产物的核酶活性的RNA的DNA。
(9)对4-HPPD抑制剂的敏感性提高了的植物体，是由(8)所述的转化植物细胞再生的。
(10)对4-HPPD抑制剂的敏感性提高了的植物体，是(9)所述的植物体的后代或克隆。
(11)(9)或(10)所记载的对4-HPPD抑制剂的敏感性提高了的植物体的繁殖材料。
(12)对4-HPPD抑制剂的敏感性提高了的植物体的制造方法，该方法包括以下工序：
(I)将编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的活性的RNA的选自下述(a)～(c)中的至少一种DNA、或插入有该DNA的载体导入植物细胞的工序，
(a)编码与(1)所记载的DNA的转录产物互补的双链RNA的DNA，
(b)编码与(1)所记载的DNA的转录产物互补的反义RNA的DNA，
(c)编码具有特异性地裂开(1)所记载的DNA的转录产物的核酶活性的RNA的DNA；和
(II)由在工序(I)中导入了所述DNA或者导入了插入有该DNA的载体的转化植物细胞再生植物体的工序。
(13)植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的判定方法，其特征在于，分析受试植物中的选自下述(a)～(d)中的至少一种DNA或其表达调控区的碱基序列，
(a)编码包含序列号2或17所记载的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(b)编码包含在序列号2或17所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加、和/或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(c)与包含序列号1或16所记载的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA，
(d)编码与序列号2或17所记载的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列的DNA。
(14)植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的判定方法，其特征在于，检测受试植物中的选自下述(a)～(d)中的至少一种DNA的表达或扩增产物、或者表达产物的分子量，
(a)编码包含序列号2或17所记载的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(b)编码包含在序列号2或17所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加、和/或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(c)与包含序列号1或16所记载的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA，
(d)编码与序列号2或17所记载的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列的DNA。
(15)对4-HPPD抑制剂的抵抗性提高了的植物的育种方法，包括以下工序：
(a)使对4-HPPD抑制剂为抵抗性的植物品种与任意品种杂交的工序，
(b)通过(13)或(14)所述的方法来判定由工序(a)中的杂交所得的个体的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的工序，和
(c)筛选被判定为对4-HPPD抑制剂具有抵抗性的个体的工序。
(16)对4-HPPD抑制剂的敏感性提高了的植物的育种方法，包括以下工序：
(a)使对4-HPPD抑制剂为敏感性的植物品种与任意品种杂交的工序，
(b)通过(13)或(14)所述的方法来判定由工序(a)中的杂交所得的个体的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的工序，和
(c)筛选被判定为对4-HPPD抑制剂具有敏感性的个体的工序。
发明的效果
通过利用本发明中鉴定的基因，可以有效地制作出对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性提高了的植物。另外，以本发明中鉴定的基因为靶可以有效地判定植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性。
附图说明
图1是显示酪氨酸代谢途径和类胡萝卜素生物合成途径、与4-HPPD抑制剂的概要和关联的图。
图2是显示与食用米品种、饲料用米品种的轮作体系中的、上一年耕作的“遗漏种”的发芽风险的控制相关的概要的图。
图3是显示在利用农杆菌法的拟南芥的转化中使用的、连接了由nos启动子(nos-P)驱动的卡纳霉素抵抗性基因(NPTII)、由CaMV35S启动子(CaMV35S-P)驱动的潮霉素抵抗性基因(hygR)、和由CaMV35S启动子驱动的AK065581(HIS1)的各表达盒、以及边界序列(RB：右边界序列、LB：左边界序列)的双元载体(pIG121-Hm/HIS1)的概要的图。
图4是显示在利用农杆菌法的拟南芥和稻的转化中使用的、连接了由CaMV35S启动子(35S Pro)驱动的潮霉素抵抗性基因(mHPT)、由CaMV35S启动子(35S Pro)驱动的AK065581(HIS1)的各表达盒、以及边界序列(RB：右边界序列、LB：左边界序列)的双元载体(35sHIS1 pZH2B)的概要的图。
图5是显示在利用农杆菌法的番茄的转化中使用的、连接了由nos启动子(NOSpro)驱动的卡纳霉素抵抗性基因(NPT2)、由CaMV35S启动子(35S Pro)驱动的AK065581(HIS1)的各表达盒、以及边界序列(RB：右边界序列、LB：左边界序列)的双元载体(35sHIS1 pZK3)的概要的图。
图6是显示在利用农杆菌法的拟南芥和稻的转化中使用的、连接了由CaMV35S启动子(35S Pro)驱动的潮霉素抵抗性基因(mHPT)、由CaMV35S启动子(35S Pro)驱动的AK241948(HSL1)的各表达盒、以及边界序列(RB：右边界序列、LB：左边界序列)的双元载体(35sHSL1 pZH2B)的概要的图。
图7是显示在利用农杆菌法的番茄的转化中使用的、连接了由nos启动子(NOSpro)驱动的卡纳霉素抵抗性基因(NPT2)、由CaMV35S启动子(35S Pro)驱动的AK241948(HSL1)的各表达盒、以及边界序列(RB：右边界序列、LB：左边界序列)的双元载体(35sHSL1 pZK3)的概要的图。
图8是显示位于稻染色体上的通过QTL分析而特定的4-HPPD抑制剂抵抗性基因(AK065581)及其同源基因的图。
图9是显示导入了靶基因(AK065581)的重组A.thaliana(生态型Columbia(哥伦比亚))的对4-HPPD抑制剂(苯并双环酮(BBC))的抵抗性的照片。此外图中，“Col”表示是A.thaliana野生型(生态型Columbia)的结果，“#1”和“#3”表示是导入了靶基因(AK065581)的重组拟南芥A.thaliana(生态型Columbia)的结果。
图10是显示导入了靶基因(AK065581)的重组稻(4-HPPD抑制剂敏感性品种：关东239号)的对4-HPPD抑制剂(苯并双环酮)的抵抗性的照片。此外图中，“关东239号”表示是关东239号(野生型)的结果，“BBC21-23B”和“BBC21-23C”表示是导入了靶基因(AK065581)的关东239号(重组稻)的结果。
图11是显示导入了靶基因(AK065581)的重组稻(关东239号)的对4-HPPD抑制剂(苯并双环酮)的抵抗性的照片。此外图中，“日本晴”和“关东239号”分别表示是日本晴(野生型)(4-HPPD抑制剂抵抗性品种)和关东239号(野生型)的结果，“BBC21-1A、2、3、3D、3F、3-3、9、15”表示是导入了靶基因(AK065581)的关东239号(重组稻)的结果(在图12～15中也同样)。另外，“Application Date”和“Evaluation Date”分别表示“在添加了4-HPPD抑制剂的固体(琼脂)培养基中播种的日期”和“调查由该种发育的植物体的生长发育状况的日期”(在图12～15和22中也同样)。
图12是显示导入了靶基因(AK065581)的重组稻(关东239号)的对4-HPPD抑制剂(硝草酮)的抵抗性的照片。
图13是显示导入了靶基因(AK065581)的重组稻(关东239号)的对4-HPPD抑制剂(特糠酯酮(Tefuryltrione))的抵抗性的照片。
图14是显示导入了靶基因(AK065581)的重组稻(关东239号)的对4-HPPD抑制剂(环磺酮)的抵抗性的照片。
图15是显示导入了靶基因(AK065581)的重组稻(关东239号)的对4-HPPD抑制剂(NTBC)的抵抗性的照片。
图16是显示扩增各稻品种中的HIS1基因的各外显子区而得的PCR图谱的电泳照片。此外图中，“1”表示是日本晴的结果，“2”表示是コシヒカリ的结果，“3”表示是カサラス的结果，“4”表示是北陆193号的结果，“5”表示是タカナリ的结果，“6”表示是モミロマン的结果，“M”表示尺寸标志物。另外，“外显子1”表示通过使用了包含序列号3所记载的碱基序列的引物和包含序列号4所记载的碱基序列的引物的PCR而扩增的HIS1基因的外显子1的区，“外显子2”表示通过使用了包含序列号5所记载的碱基序列的引物和包含序列号6所记载的碱基序列的引物的PCR而扩增的HIS1基因的外显子2的区，“外显子3”表示通过使用了包含序列号7所记载的碱基序列的引物和包含序列号8所记载的碱基序列的引物的PCR而扩增的HIS1基因的外显子3的区，“外显子4”表示通过使用了包含序列号9所记载的碱基序列的引物和包含序列号10所记载的碱基序列的引物的PCR而扩增的HIS1基因的外显子4的区，“外显子5”表示通过使用了包含序列号11所记载的碱基序列的引物和包含序列号12所记载的碱基序列的引物的PCR而扩增的HIS1基因的外显子5的区。另外，“外显子4前半”表示通过使用了包含序列号13所记载的碱基序列的引物和包含序列号14所记载的碱基序列的引物的PCR而扩增的HIS1基因的外显子4内部的前半区。进而图中，箭头分别表示为100pb、200bp、500bp的大小。
图17是显示将日本晴的HIS1基因、与モミロマン和タカナリ的对应基因的结构进行比较而得的结果的概要图。
图18是显示将日本晴的HIS1基因、与カサラス的对应基因的结构进行比较而得的结果的概要图。
图19是将由HIS1基因及其同源基因(HSL1基因)分别所编码的蛋白质的氨基酸序列进行比较，显示同源性的图。
图20是显示HIS1基因所位于的基因座(第2染色体)与其同源基因(HSL1基因：Os06g0176700/Os06g0178500)所位于的基因座(第6染色体)在各组织中的表达图谱的图。
图21是显示HIS1基因及其同源基因属于稻科(单子叶)植物中固有的基因群的系统树。此外，图中的“HSL”是“HIS1-LIKE”的简称，表示是HIS1的同源基因。
图22是显示导入了与HIS1基因具有高同源性的基因(HSL1；AK241948)的重组稻(关东239号)的对4-HPPD抑制剂(苯并双环酮)的抵抗性的照片。此外图中，“关东239号”表示是关东239号(野生型)的结果，“23-1”、“23-21”和“23-25”表示是导入了同源基因(AK241948)的关东239号(重组稻)的结果。
具体实施方式
＜用于赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的药剂＞
本发明的用于赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的药剂的特征在于，包含编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性的蛋白质的DNA(以下有时称为本发明的抵抗性DNA)、或插入有该DNA的载体。
本发明中的“4-HPPD抑制剂”是指抑制4-HPPD(4-羟基苯丙酮酸双加氧酶)的功能的药剂(4-HPPD抑制剂)。4-HPPD抑制剂如图1所示，通过抑制4-HPPD的功能，来间接地抑制类胡萝卜素合成系统，引起叶绿素的崩解从而使植物白化，直至枯死。作为本发明中的“4-HPPD抑制剂”，可列举例如，苯并双环酮(BBC)、硝草酮、特糠酯酮(Tefuryltrione)、环磺酮、(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰)-环己烷-1,3-二酮(2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)cyclohexane-1,3-dione；NTBC)这样的三酮系4-HPPD抑制剂、吡唑特、吡草酮、苄草唑这样的吡唑系4-HPPD抑制剂。作为成为使用本发明的抵抗性DNA赋予植物以抵抗性的对象的4-HPPD抑制剂，优选BBC、硝草酮、特糠酯酮(Tefuryltrione)、环磺酮、NTBC这样的三酮系4-HPPD抑制剂，特别优选BBC。
此外，前述的称为4-HPPD抑制剂的除草剂，其成分作为化合物是极为多样的，从作用机理方面出发，如下所述，可以分类为几个组(参照“農薬からアグロバイオギュレーター－病害虫雑草制御の現状と将来(由农药到土壤生物调节器——病害虫杂草控制的现状与将来)”、日本、シーエムシー出版、2010年1月)。
(I)乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制型除草剂
抑制参与脂质合成的最初阶段的ACCase的该除草剂组，抑制细胞膜合成，直至使植物生长发育障害。属于本组的除草剂进一步分类为(1)4-芳氧基苯氧基丙酸系、(2)环己烷二酮·肟系、(3)二酮系。
(II)乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制型除草剂
以ALS为靶的本除草剂组，通过抑制ALS活性，抑制支链氨基酸生成，从而使植物生长发育障害。属于本组的除草剂进一步分类为(1)磺酰脲系、(2)三唑啉酮系、(3)三唑并吡啶系、(4)嘧啶基水杨酸系、(5)咪唑烷酮系。
(III)4-HPPD代谢抑制型除草剂
抑制酪氨酸代谢途径的4-HPPD代谢的本除草剂组，间接地抑制植物的类胡萝卜素合成系统，使植物白化·枯死。属于本组的除草剂进一步分类为(1)环己烷二酮系、(2)吡唑系、(3)双环系、(4)异唑系、(5)三酮系。另外，作为(1)环己烷二酮系，可列举例如苯甲酰环己烷-1,3-二酮衍生物，作为(2)吡唑系，可列举例如，吡唑特、吡草酮、苄草唑，作为(3)双环系，可列举例如，3-取代苯甲酰-双环[4,1,0]庚烷-2,4-二酮衍生物，作为(4)异唑系，可列举例如异唑草酮，作为(5)三酮系，可列举例如，BBC、硝草酮、特糠酯酮(Tefuryltrione)、环磺酮。
(IV)原卟啉原-IX氧化酶(PPO)抑制剂除草剂
本组的除草剂抑制叶绿素合成，引起细胞膜崩解至枯死。属于本组的除草剂进一步分类为(1)二苯醚系、(2)二烯丙基系、(3)吡唑系。
(V)超长链脂肪酸延伸酶(VLCFAE)抑制型除草剂
本组的除草剂在植物脂质生物合成系统中抑制C20以上的超长链脂肪酸生物合成系统酶，从而使植物枯死。
(VI)八氢番茄红素脱氢酶(PDS)抑制型除草剂
抑制类胡萝卜素生物合成途径的PDS酶的本除草剂组，引起植物的叶绿素崩解，从而使植物白化·枯死。
(VII)PS II抑制型除草剂
本组的抑制剂与质体醌(PQ)结合，其结果PQ所参与的从光化学系统II(PS II)到光化学系统I(PS I)的电子传递被抑制，破坏植物体内的碳固定功能，从而植物枯死。
(VIII)合成植物激素型除草剂
本组的抑制剂像在植物体内以低浓度存在调节植物的生长的天然植物激素那样发挥作用，使植物的分化·成长不正常，结果枯死。
(IX)EPSP合成酶(EPSPS)抑制型除草剂
本组的抑制剂与莽草酸途径的EPSPS结合，抑制EPSP的合成。其结果是色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸不能生物合成，植物枯死。
作为本发明的抵抗性DNA的例子，将来源于日本晴的推定为铁/抗坏血酸依赖性氧化还原酶基因的基因(HIS1基因；Os02g0280700)的碱基序列示于序列号1，将由所述DNA所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号2。
另外，作为本发明的抵抗性DNA的其他例子，将来源于日本晴的基因(HIS1-LIKE(HSL)1基因；Os06g0176700/Os06g0178500(AK241948)的碱基序列示于序列号16，将由所述DNA所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号17。
本发明的抵抗性DNA的1种方式是，编码包含序列号2所记载的氨基酸序列的蛋白质的DNA(典型地为包含序列号1所记载的碱基序列的编码区的DNA)。
另外，本发明的抵抗性DNA的其他方式是，编码包含序列号17所记载的氨基酸序列的蛋白质的DNA(典型地为包含序列号16所记载的碱基序列的编码区的DNA)。
在现在的技术水准下，只要是本领域技术人员，就能够在获得该DNA的碱基序列信息的情况下，对其碱基序列进行各种改变，制造编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性的蛋白质的突变基因。另外，即使在自然界，碱基序列突变也是可以发生的。因此，本发明的抵抗性DNA只要编码具有所述活性的蛋白质，则也包含编码包含在序列号2或17所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加、和/或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质的DNA。这里“多个”是指在HIS1蛋白质或HSL1蛋白质的氨基酸序列全体中通常50个氨基酸以内、优选30个氨基酸以内、更优选10个氨基酸以内、特别优选数个氨基酸以内(例如，5个氨基酸以内、3个氨基酸以内、2个氨基酸以内、1个氨基酸)。
进而，在现在的技术水准下，只要是本领域技术人员，就能够在得到了特定的抵抗性DNA的情况下，利用其DNA的碱基序列信息，从同种或者其他植物中分离编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性的蛋白质的同源基因。作为用于获得这样的同源基因的植物，优选单子叶植物，特别优选稻科植物。作为稻科植物，例如，稻(例如，作为4-HPPD抑制剂抵抗性品种的日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陆193号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ)、大麦、高粱、玉米等。
作为用于获得同源基因的方法，可列举例如，杂交技术(Southern(DNA印迹),E.M.,J.Mol.Biol.，98：503，1975)、聚合酶链反应(PCR)技术(Saiki,R.K.,et al.Science,230:1350-1354,1985，Saiki,R.K.et al.Science,239:487-491,1988)。为了分离同源基因，通常在严格条件下进行杂交反应。作为严格的杂交的条件，可以例示6M尿素、0.4％SDS、0.5xSSC的条件或严格性与此同等的杂交条件。如果使用严格性更高的条件，例如6M尿素、0.4％SDS、0.1xSSC的条件，则可以期待同源性更高的基因的分离。本发明的抵抗性DNA只要编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性的蛋白质，则包含与包含序列号1或16所记载的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA。
取得的同源基因所编码的蛋白质通常与序列号2或17所记载的氨基酸序列具有高同源性。高同源性是指至少60％以上、优选80％以上(例如，85％、90％、95％、97％、99％以上)的序列同源性。序列同源性可以利用BLASTX(氨基酸水平)的程序(Altschul et al.,J.Mol.Biol.，215：403-410，1990)来确定。该程序基于Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264-2268，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877，1993)。在通过BLASTX来分析氨基酸序列的情况下，参数例如score＝50、wordlength＝3。另外，在使用Gapped BLAST程序分析氨基酸序列的情况下，可以如Altschul等(Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)所记载那样进行。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体手法是公知的。本发明的抵抗性DNA只要编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性的蛋白质，则可以包含编码与序列号2或17所记载的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列的DNA。作为这样的DNA，可列举例如，来源于大麦的基因(HvHCP1(AF527606))、来源于玉米的基因(ZmHSL1(BT062842)、ZmHSL2(NM＿001153464))、来源于高粱的基因(SbHSL1(XM＿002436546))(参照图21)。
由特定基因所编码的蛋白质是否具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性，例如，如后述的实施例所记载的那样，可以通过将该基因导入植物，检验制作出的植物是否被赋予所述抵抗性，从而判定(参照实施例2)。即，在使用以含0.03μM的BBC的琼脂培养基白化的拟南芥(A.thaliana：生态型Columbia)的情况下，如果通过将所述基因导入拟南芥而制作出的转化体在所述BBC浓度存在下不发生白化而能够生长发育，则可以判定由所述基因编码的蛋白质具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性。另外，在使用以含0.1μM的BBC的琼脂培养基白化的BBC敏感性稻品种“关东239号”的情况下，如果通过将所述基因导入关东239号而制作出的转化体在所述BBC浓度的存在下不白化而能够生长发育，则可以判断由所述基因所编码的蛋白质具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性。进而，在使用除BBC以外的三酮系4-HPPD抑制剂(硝草酮、特糠酯酮(Tefuryltrione)、环磺酮、NTBC等)的情况下，如果通过将所述基因导入关东239号而制作出的转化体在1μM的硝草酮、2.5μM的特糠酯酮(Tefuryltrione)、0.5μM的环磺酮或1μM的NTBC的存在下不白化而能够生长发育，则可以判定由所述基因所编码的蛋白质具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性。
作为本发明的抵抗性DNA，对其形态不特别限定，包含cDNA、以及基因组DNA、和化学合成DNA。这些DNA的调制对本领域技术人员来说可以利用常用手段来进行。基因组DNA例如可以如下调制：从植物提取基因组DNA，制成基因组文库(作为载体可以利用质粒、噬菌体、粘粒、BAC、PAC等)，将其展开，使用以HIS1基因(例如，序列号1所记载的DNA)或HSL1基因(例如，序列号16所记载的DNA)的碱基序列为基础调制的探针进行菌落杂交或噬斑杂交，从而调制。另外，还可以制作对HIS1基因或HSL1基因为特异性的引物，通过进行利用该引物的PCR来调制。另外，cDNA例如可以如下调制：以从植物提取的mRNA为基础合成cDNA，将其插入λZAP等载体而制作cDNA文库，将其展开，与上述同样地进行菌落杂交或噬斑杂交，并进行PCR，从而调制。另外，如果使用市售的DNA合成仪，则还可以通过合成来调制目的DNA。
＜用于赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的药剂＞
另外，本发明提供用于赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的药剂。如后述的实施例中所示，通过由HIS1基因所编码的蛋白质的功能被抑制，对4-HPPD抑制剂的抵抗性被抑制。因此，本发明的用于赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的药剂的特征在于，包含编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的活性的RNA的DNA、或插入有该DNA的载体。
编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的活性的RNA的DNA的一种形态是，编码与上述的内源性的本发明的抵抗性DNA的转录产物互补的dsRNA(双链RNA)的DNA。通过将具有与靶基因序列同一或类似的序列的dsRNA导入细胞内，从而可以引起导入的外来基因和靶内源性基因的表达均被抑制的、被称为RNAi(RNA干涉、RNA interference)的现象。如果约40～数百碱基对的dsRNA被导入细胞中，则具有解旋酶结构域的被称为Dicer的RNaseIII样的核酸酶在ATP存在下将dsRNA从3’末端开始以约每21～23碱基对切下，生成siRNA(short interference RNA)。该siRNA与特异性的蛋白质结合，形成核酸酶复合体(RISC：RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex))。该复合体识别并结合与siRNA相同的序列，通过RNaseIII样的酶活性而在siRNA的中央部切割靶基因的转录产物(mRNA)。另外，与该途径不同地，siRNA的反义链与mRNA结合作为RNA依赖性RNA聚合酶(RsRP)的引物发挥作用，合成dsRNA。还考虑到该dsRNA再次成为Dicer的底物，生成新的siRNA而扩增作用的途径。
编码本发明的dsRNA的DNA包含编码针对靶基因、即内源性的本发明的抵抗性DNA的转录产物(mRNA)的任一区的反义RNA的反义DNA、和编码该mRNA的任一区的正义RNA的正义DNA，通过该反义DNA和该正义DNA，可以分别表达反义RNA和正义RNA。另外，通过这些反义RNA和正义RNA，可以制成dsRNA。
作为使本发明的dsRNA的表达系统保持在载体等中的情况下的构成，有由同一载体表达反义RNA和正义RNA的情况，和由不同载体分别表达反义RNA和正义RNA的情况。作为由同一载体表达反义RNA和正义RNA的构成，例如为，分别构建在反义DNA和正义DNA的上游分别连接了polIII系那样的能够表达短RNA的启动子的反义RNA表达盒和正义RNA表达盒，将这些盒以同方向或逆方向插入载体的构成。
另外，还可以构成将反义DNA和正义DNA逆向地配置使其不同链上对向而得的表达系统。在本构成中，具备反义RNA编码链和正义RNA编码链成对而成的一个双链DNA(siRNA编码DNA)，在其两侧以能够由各个链表达反义RNA和正义RNA的方式对向地具备启动子。这种情况下，为了避免在正义RNA和反义RNA的下游添加多余的序列，优选在各个链(反义RNA编码链、正义RNA编码链)的3’末端分别具备终止子。本终止子可以使用连续4个以上A(腺嘌呤)碱基的序列等。另外，在本回文型的表达系统中，优选二个启动子的种类不同。
另外，作为由不同载体表达反义RNA和正义RNA的构成，例如为，分别构建在反义DNA和正义DNA的上游分别连接了polIII系那样的能够表达短RNA的启动子的反义RNA表达盒和正义RNA表达盒，使这些盒保持在不同载体中的构成。
作为本发明中使用的dsRNA，优选siRNA。“siRNA”是指包含在细胞内不显示毒性的范围的短链的双链RNA。只要能够抑制靶基因的表达，并且不显示毒性，则对其链长不特别限制。dsRNA的链长例如为15～49碱基对，优选为15～35碱基对，进一步优选为21～30碱基对。
作为编码本发明的dsRNA的DNA，也可以使用在靶序列的反向重复之间插入适当的序列(优选为内含子序列)，制作具有发夹结构的双链RNA(自身互补发夹RNA，self-complementary’hairpin’RNA(hpRNA))那样的结构(Smith，N.A.，et al.Nature，407：319，2000、Wesley，S.V.et al.Plant J.27：581，2001、Piccin，A.et al.Nucleic AcidsRes.29：E55，2001)。
编码本发明的dsRNA的DNA不需要与靶基因的碱基序列完全同一，但具有至少70％以上、优选80％以上、进一步优选90％以上(例如，95％、96％、97％、98％、99％以上)的序列的同一性。序列的同一性可以通过上述的方法(BLAST程序)来确定。
dsRNA中RNA彼此配对的双链RNA的部分不限于完全配对的，还可以由于错配(对应的碱基不互补)、凸起(没有与一条链对应的碱基)等而包含不配对部分。本发明中，dsRNA中的RNA彼此配对的双链RNA区中也可以包含凸起和错配这两者。
编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的活性的RNA的DNA的其他方式，是编码与内源性的本发明的抵抗性DNA的转录产物互补的反义RNA的DNA(反义DNA)。作为反义DNA抑制靶基因的表达的作用，可列举由三链形成产生的转录起始抑制、由与通过RNA聚合酶而局部制成开状环(loop)结构的部位形成杂种而产生的转录抑制、由与合成正在进行的RNA形成杂种而产生转录抑制、由在内含子与外显子的接合点形成杂种而产生的剪接抑制、由与剪接体形成部位形成杂种而产生的剪接抑制、由与mRNA形成杂种而产生的由核向细胞质的移行抑制、由与帽化部位和/或多聚(A)添加部位形成杂种而产生的剪接抑制、由与翻译起始因子结合部位形成杂种而产生的翻译起始抑制、由与起始密码子附近的核糖体结合部位形成杂种而产生的翻译抑制、由与mRNA的翻译区和/或多核糖体结合部位形成杂种而产生的肽链的伸长阻止、以及由与核酸和蛋白质的相互作用部位形成杂种而产生的基因表达抑制等。这些作用抑制转录、剪接、或翻译的过程，从而抑制靶基因的表达(平岛和井上“新生化学实验讲座2核酸IV遺伝子の複製と発現(基因的复制和表达)”、日本生化学会编，东京化学同人、pp.319-347、1993)。本发明中使用的反义DNA可以通过上述任一作用来抑制靶基因的表达。作为一种方式，如果设计与靶基因的mRNA的5’端附近的非翻译区互补的反义序列，则应该对基因的翻译抑制是有效的。但是，也可以使用与编码区或3’侧的非翻译区互补的序列。这样，不仅包含基因的翻译区序列的反义序列的DNA，包含非翻译区的序列的反义序列的DNA也包含在本发明中所利用的反义DNA中。使用的反义DNA连接在适当的启动子的下游，优选在3’侧连接包含转录终止信号的序列。
反义DNA可以以本发明的抵抗性DNA(例如，包含序列号1所记载的碱基序列的DNA)的序列信息为基础通过硫代磷酸酯法(Stein，Nucleic Acids Res.，16：3209-3221，1988)等来调制。调制的DNA可以通过后述的公知方法导入植物中。反义DNA的序列优选为与植物所具有的内源性的本发明的抵抗性DNA的转录产物互补的序列，但只要能够有效地抑制基因的表达，则也可以不完全互补。转录的RNA对作为靶的基因的转录产物具有优选90％以上(例如，95％、96％、97％、98％、99％以上)的互补性。为了有效地抑制靶基因的表达，反义DNA的长度至少为15个碱基以上，优选为100个碱基以上，进一步优选为500个碱基以上。通常，使用的反义DNA的长度短于5kb，优选短于2.5kb。
编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的活性的RNA的DNA的其他方式，是编码具有使内源性的本发明的抵抗性DNA的转录产物特异性地裂开的核酶活性的RNA的DNA。核酶中有组I内含子型、RNaseP所含的M1RNA那样400核苷酸以上的大小的核酶，也有称为锤头型、发夹型的具有40个核苷酸左右的活性结构域的核酶(小泉诚和大塚荣子、蛋白质核酸酶，35：2191，1990)。
例如，锤头型核酶的自切割结构域，切割G13U14C15的C15的3’侧，但对活性来说U14与9位的A形成碱基对是重要的，显示15位的碱基除了C以外是A或U也可以被切割(Koizumi et.al.，FEBS Lett.228：225，1988)。如果以核酶的底物结合部与靶部位附近的RNA序列互补的方式设计，则可以制作出识别靶RNA中的UC、UU或UA这样的序列的作为限制性酶的RNA切割核酶(Koizumi et.al.，FEBS Lett.239：285，1988、小泉诚和大塚荣子，蛋白质核酸酶，35：2191，1990、Koizumi et.al.，Nucleic.Acids.Res.17：7059，1989)。
另外，发夹型核酶在本发明的目的中也是有用的。发夹型核酶在例如烟草环斑病毒的卫星RNA的负链发现(Buzayan，Nature 323：349，1986)。该核酶也显示可以设计成引起靶特异性的RNA切割那样(Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acids Res.19：6751，1992、菊池洋，化学と生物(化学和生物)30：112，1992)。设计成能够切割靶那样的核酶，为了在植物细胞中转录而连接花椰菜花叶病毒的35S启动子等启动子和转录终止序列。将这样的构成单元串联地排列，制成能够切割靶基因内的多个部位那样，可以进一步提高效果(Yuyama etal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.186：1271，1992)。使用这样的核酶可以特异性地切割成为靶的内源性的本发明的抵抗性DNA的转录产物，从而抑制该DNA的表达。
＜插入了本发明的DNA的载体＞
作为插入了上述本发明的DNA(本发明的抵抗性DNA、或编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的活性的RNA的DNA)的载体，只要是能在植物细胞内表达插入基因的载体，就不特别限制。本发明的载体可以包含用于恒定地或诱导地表达本发明的DNA的启动子。作为用于恒定地表达的启动子，可列举例如，花椰菜花叶病毒的35S启动子、稻的肌动蛋白启动子、玉米的泛素启动子等。另外，作为用于诱导地表达的启动子，可列举例如，已知通过丝状菌·细菌·病毒的感染和/或侵入、低温、高温、干燥、紫外线的照射、特定的化合物的散布等外因而表达的启动子等。作为这样的启动子，可列举例如，通过丝状菌·细菌·病毒的感染和/或侵入而表达的稻几丁质酶基因的启动子、烟草的PR蛋白质基因的启动子、通过低温而诱导的稻的lip19基因的启动子、通过高温而诱导的稻的hsp80基因和hsp72基因的启动子、通过干燥而诱导的拟南芥的rab16基因的启动子、通过紫外线的照射而诱导的欧芹的查耳酮合成酶基因的启动子、通过厌氧条件诱导的玉米的醇脱氢酶基因的启动子等。另外，稻几丁质酶基因的启动子和烟草的PR蛋白质基因的启动子还可以通过水杨酸等特定化合物的散布来诱导，rab16还可以通过植物激素脱落酸的散布来诱导。
本发明的药剂可以是本发明的DNA、插入有该DNA的载体本身，也可以是混合了其他成分的药剂。作为这样的其他成分不特别限定，可列举例如，灭菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂质、溶解辅助剂、缓冲剂、保存剂。另外，通过后述的介由农杆菌的方法来调制本发明的转化植物细胞的情况下，还可以是含有导入了所述DNA的农杆菌的药剂。
＜本发明的转化植物细胞＞
本发明的能够再生对4-HPPD抑制剂的抵抗性提高了的植物体的转化植物细胞，是通过导入编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性的蛋白质的所述本发明的抵抗性DNA、或者导入插入有该DNA的载体，而被转化的植物细胞。
另外，本发明的能够再生对4-HPPD抑制剂的敏感性提高了的植物体的转化植物细胞，是通过导入编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的活性的RNA的所述DNA、或者导入插入有该DNA的载体，而被转化的植物细胞。
作为本发明的植物细胞所来源的植物不特别限定，可列举例如，稻、大麦、小麦、高粱、玉米、匍匐翦股颖等稻科植物、拟南芥等十字花科植物、番茄等茄科植物、大豆、紫花苜蓿、百脉根等豆科植物、棉花等锦葵科植物、甜菜等藜科植物。
在这些植物中，特别是对4-HPPD抑制剂为敏感性的品种优选作为本发明的提高对4-HPPD抑制剂的抵抗性的适用对象。作为对4-HPPD抑制剂为敏感性的稻品种，可列举例如，ハバタキ、タカナリ、モミロマン、ミズホチカラ、ルリアオバ、おどろきもち、兵库牛若丸、カサラス、关东239号，但不限于这些。
另外，这些植物中，特别是对4-HPPD抑制剂为抵抗性的品种优选作为本发明的提高对4-HPPD抑制剂的敏感性的适用对象。作为对4-HPPD抑制剂为抵抗性的稻品种，可列举例如，日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陆193号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ，但不限于这些。
本发明的植物细胞除了培养细胞植物，还包含植物体中的细胞。进而，包含各种形态的植物细胞，例如，悬浮培养细胞、原生质体、叶的切片、愈伤组织、未熟胚、花粉等。
作为对植物细胞导入插入有本发明的抵抗性DNA的载体的方法，可以使用例如，聚乙二醇法、电穿孔法(electroporation)、介由农杆菌的方法、基因枪法等本领域技术人员公知的各种方法。
＜本发明的植物体、及其繁殖材料、以及所述植物体的制造方法＞
本发明提供由所述转化植物细胞再生的植物体(以下也称为转化植物体)。由转化植物细胞的植物体的再生可以根据植物细胞的种类通过本领域技术人员公知的方法来进行。
例如，在稻中，关于制成转化植物体的方法，已经确立了以下几种技术：通过聚乙二醇向原生质体进行基因导入，从而再生植物体的方法(Datta，S.K.In Gene Transfer ToPlants(Potrykus I and Spangenberg Eds.)pp66-74，1995)；通过电脉冲向原生质体进行基因导入，从而再生植物体的方法(Toki et al.Plant Physiol.100，1503-1507，1992)；通过基因枪法向细胞直接导入基因，从而再生植物体的方法(Christou et al.Bio/technology，9：957-962，1991)；以及介由农杆菌导入基因，从而再生植物体的方法(Hieiet al.Plant J.6：271-282，1994)等，在本申请发明的技术领域中广泛被使用。
另外，作为制作关于大麦的转化植物体的方法，可列举Tingay等(Tingay S.etal.Plant J.11：1369-1376，1997)、Murray等(Murray F et al.Plant Cell Report 22：397-402，2004)、和Travalla等(Travalla S et al.Plant Cell Report 23：780-789，2005)所记载的方法。
作为再生高粱植物体的方法，优选使用例如，通过农杆菌法、基因枪法在未熟胚、愈伤组织中进行基因导入而再生植物体的方法；使用通过超声波进行了基因导入的花粉而进行受粉的方法(J.A.Able et al.，In Vitro Cell.Dev.Biol.37：341-348，2001、A.M.Casas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11212-11216，1993、V.Giriashankar etal.，Plant Cell Rep 24：513-522，2005、J.M.JEOUNG et al.，Hereditas 137：20-28，2002、V Girijashankar et al.，Plant Cell Rep 24(9)：513-522，2005、Zuo-yu Zhao etal.，Plant Molecular Biology 44：789-798，2000、S.Gurel et al.，Plant Cell Rep 28(3)：429-444，2009、ZY Zhao，Methods Mol Biol，343：233-244，2006、AK Shrawat and HLorz，Plant Biotechnol J，4(6)：575-603，2006、D Syamala and P Devi Indian J ExpBiol，41(12)：1482-1486，2003、Z Gao et al.，Plant Biotechnol J，3(6)：591-599，2005)。
进而如果是拟南芥，可列举Akama等(Akama et al.Plant Cell Reports12：7-11，1992)的方法，在本发明中，优选使用这些方法。
一旦得到基因组内导入了本发明的DNA的植物体，则可以由该植物体通过有性生殖或无性生殖获得后代。另外，还可以从该植物体和/或其后代或克隆得到繁殖材料(例如，种子、果实、切穗、植株、愈伤组织、原生质体等)，以它们为基础量产该植物体。因此，本发明中包含导入了本发明的DNA的植物细胞、包含该细胞的植物体、该植物体的后代和克隆、以及该植物体、其后代和克隆的繁殖材料。
另外，本发明还提供对4-HPPD抑制剂的抵抗性提高了的植物体的制造方法，其特征在于，包括以下工序：(I)将所述本发明的抵抗性DNA、或插入有该DNA的载体导入植物细胞的工序；和(II)由在工序(I)中导入了所述DNA或者导入了插入有该DNA的载体的转化植物细胞再生植物体的工序。
进而，本发明还提供对4-HPPD抑制剂的敏感性提高了的植物体的制造方法，其特征在于，包括以下工序：(I)将编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的活性的RNA的所述DNA、或插入有该DNA的载体导入植物细胞的工序；和(II)由在工序(I)中导入了所述DNA或者导入了插入有该DNA的载体的转化植物细胞再生植物体的工序。
＜植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的判定方法＞
本发明的、植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的判定方法的特征在于，分析受试植物中的本发明的抵抗性DNA或者对应的敏感性DNA(以下称为本发明的检测对象DNA)、或其表达调控区的碱基序列。此外、“敏感性DNA”是指编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的活性的蛋白质的DNA。
本发明的检测对象DNA典型地是选自下述(a)～(d)中的至少一种DNA。
(a)编码包含序列号2或17所记载的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(b)编码包含在序列号2或17所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加、和/或插入了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(c)与包含序列号1或16所记载的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA，
(d)编码与序列号2或17所记载的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列的DNA。
此外，(a)～(d)中的DNA的含义原则上如上所述，但在本发明的检测对象DNA中，特指内源性的DNA，另外，是包含抵抗性DNA和敏感性DNA双方的含义。
如后述的实施例中所示，与作为4-HPPD抑制剂抵抗性品种的日本晴中的HIS1基因相比，作为4-HPPD抑制剂敏感性品种的モミロマン、タカナリ、カサラス中的对应基因的序列中，发现了碱基的插入和/或缺失。因此，通过分析本发明的检测对象DNA的碱基序列，可以判定植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性。
另外，如后述的实施例中所示，由于对4-HPPD抑制剂的敏感性为隐性遗传，因而可以通过分析本发明的检测对象DNA的表达量、以及控制其表达量的区(增强子、启动子、沉默子、绝缘子)的碱基序列，来判定植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性。
在分析本发明的检测对象DNA或其表达调控区的碱基序列时，可以使用将本发明的检测对象DNA或其表达调控区通过PCR进行扩增而得的扩增产物。在进行所述PCR的情况下，所使用的引物只要能够特异性地扩增本发明的检测对象DNA或其表达调控区，就没有限制，可以基于本发明的检测对象DNA或其表达调控区的序列信息(例如，序列号1)来适宜设计。作为合适的引物，可列举包含序列号13所记载的碱基序列的引物和包含序列号14所记载的碱基序列的引物。将这些引物适宜组合，可以扩增本发明的检测对象DNA或其表达调控区的特定碱基序列。
此外，在受试植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的判定中，例如，可以包含与“对照的碱基序列”比较的工序。与受试植物中的本发明的检测对象DNA或其表达调控区的碱基序列比较的“对照的碱基序列”，如果在稻中，典型地是4-HPPD抑制剂抵抗性品种(例如，日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陆193号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ)或4-HPPD抑制剂敏感性品种(例如，ハバタキ、タカナリ、モミロマン、ミズホチカラ、ルリアオバ、おどろきもち、兵库牛若丸、カサラス、关东239号)中的本发明的检测对象DNA或其表达调控区的碱基序列。
此外，作为本发明的敏感性DNA的例子，将推定为来源于タカナリ或モミロマン的铁/抗坏血酸依赖性氧化还原酶基因的基因(突变HIS1基因)的碱基序列示于序列号15。
通过将确定的受试植物中的本发明的检测对象DNA或其表达调控区的碱基序列、与4-HPPD抑制剂抵抗性品种中的这些碱基序列(例如，序列号1、序列号16)或4-HPPD抑制剂敏感性品种中的这些碱基序列(例如，序列号15)进行比较，从而可以评价受试植物对4-HPPD抑制剂具有抵抗性还是具有敏感性。例如，在与4-HPPD抑制剂抵抗性品种的碱基序列(例如，序列号1)比较，碱基序列中有大的差异的情况(特别是通过新的终止密码子的出现和/或移码，编码的蛋白质的分子量和/或氨基酸序列发生大的变化的情况)下，判定受试植物对4-HPPD抑制剂具有敏感性的概率高。
此外，本发明的判定方法中的、由受试植物的DNA的调制，可以使用常规方法、例如CTAB法来进行。作为用于调制DNA的植物，不仅可以使用成长的植物体，还可以使用种子和/或幼植物体。另外，碱基序列的确定可以通过常规方法、例如双脱氧链终止法、马克萨姆-吉尔伯特化学测序法(Maxam-Gilbert method)等来进行。在碱基序列的确定中，可以利用市售的测序试剂盒和测序仪。
受试植物中的本发明的检测对象DNA或其表达调控区的碱基序列是否与对照的碱基序列不同，除了上述的直接的碱基序列确定以外，还可以通过各种方法间接地分析。作为这样的方法，可列举例如，PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism、单链构象多态性)法、利用了限制性酶片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism/RFLP)的RFLP法和/或PCR-RFLP法、变性剂浓度梯度凝胶电泳法(denaturantgradient gel electrophoresis：DGGE)、等位基因特异性的寡核苷酸(Allele SpecificOligonucleotide/ASO)杂交法、核糖核酸酶A错配切割法。
本发明的、植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的判定的其他方法的特征在于，检测受试植物中的选自所述(a)～(d)中的至少一种DNA的表达或扩增产物或者表达产物的分子量。
如后述的实施例中所示，作为4-HPPD抑制剂抵抗性品种的日本晴、コシヒカリ、北陆193号中的HIS1基因的第4外显子前半区，比作为4-HPPD抑制剂敏感性品种的モミロマン和/或タカナリ中的HIS1基因的第4外显子前半区长。因此，可以通过本发明的检测对象DNA的扩增产物或表达产物的分子量，来判定植物中的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性。
另外，如后述的实施例中所示，由于对4-HPPD抑制剂的敏感性隐性遗传，因而可以通过检测本发明的检测对象DNA的表达，来判定植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性。
这里“DNA的表达的检测”是包含转录水平的检测和翻译水平的检测双方的含义。另外，“表达的检测”是不仅包含表达的有无的检测，还包含表达的程度的检测的含义。
本发明的检测对象DNA(例如，基因组DNA)的扩增可以通过PCR(聚合酶链反应，Polymerase chain reaction)法来实施。
本发明的DNA的转录水平的检测可以通过常规方法、例如RT-PCR(逆转录聚合酶链反应，Reverse transcribed-Polymerase chain reaction)法和/或RNA印迹法来实施。在实施所述PCR时使用的引物只要是能够特异性地扩增本发明的检测对象DNA就没有限制，可以基于已经确定的本发明的抵抗性DNA或者敏感性DNA的序列信息(例如，序列号1、序列号16、序列号15)来适宜设计。作为适合的引物，可列举包含序列号3～14任一项所记载的碱基序列的引物。另外，可以将这些引物适宜组合来扩增本发明的检测对象DNA的特定碱基序列。
另一方面，翻译水平的检测可以通过常规方法、例如蛋白质印迹法来实施。蛋白质印迹中使用抗体既可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，这些抗体的调制方法是本领域技术人员公知的。
另外，本发明的检测对象DNA的表达可以如下判定：构建在本发明的检测对象DNA的表达调控区的下游以能表达的方式连接了报告物基因的载体，将该载体导入植物细胞，检测报告物活性，从而判定。
如果基因表达的检测的结果是在受试植物中本发明的检测对象DNA的表达量与4-HPPD抑制剂抵抗性品种(例如，在稻中为日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陆193号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ)的表达量相比有意义地低(例如，如果本发明的检测对象DNA实质上不表达)，另外，本发明的检测对象DNA的扩增产物或表达产物的分子量与4-HPPD抑制剂抵抗性品种(例如，日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陆193号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ)中的分子量有意义地不同，则判定受试植物对4-HPPD抑制剂具有敏感性的概率高。实际上，如后述的实施例中所示，与4-HPPD抑制剂抵抗性品种(日本晴、コシヒカリ、北陆193号)的抵抗性DNA比较，4-HPPD抑制剂敏感性品种(モミロマン、タカナリ)中的敏感性DNA的分子量有意义地小。
＜本发明的植物的育种方法＞
本发明提供对4-HPPD抑制剂的抵抗性提高了的植物的育种方法。该育种方法包括以下工序：(a)使对4-HPPD抑制剂为抵抗性的植物品种与任意品种杂交的工序，(b)通过上述本发明的判定方法来判定杂交所得的个体的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的工序，和(c)筛选被判定为对4-HPPD抑制剂具有抵抗性的品种的工序。
另外，本发明提供对4-HPPD抑制剂的敏感性提高了的植物的育种方法。该育种方法包括以下工序：(a)使对4-HPPD抑制剂为敏感性的植物品种与任意品种杂交的工序，(b)通过上述本发明的判定方法来判定由杂交所得的个体的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的工序，和(c)筛选被判定为对4-HPPD抑制剂具有敏感性的品种的工序。
作为与对4-HPPD抑制剂为抵抗性的植物品种杂交的“任意植物品种”，可列举例如，4-HPPD抑制剂敏感性品种、4-HPPD抑制剂抵抗性品种与4-HPPD抑制剂敏感性品种杂交而得的个体，但不限于这些。另外，作为与对4-HPPD抑制剂为敏感性的植物品种杂交的“任意植物品种”，可列举例如，4-HPPD抑制剂抵抗性品种、4-HPPD抑制剂抵抗性品种与4-HPPD抑制剂敏感性品种杂交而得的个体，但不限于这些。对4-HPPD抑制剂的敏感性为隐性遗传，因而为了杂交所得的个体对4-HPPD抑制剂显示敏感性，优选以纯合保有对4-HPPD抑制剂为敏感性型的HIS1基因。
如果利用本发明的育种方法，则可以在种子和/或幼植物的阶段筛选4-HPPD抑制剂抵抗性或敏感性的品种，可以在短时间内进行具有该性状的品种的育成。
实施例
以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于以下实施例。另外，下述实施例如下所述进行实验、分析。
＜QTL分析＞
将コシヒカリ/ハバタキ染色体片段替换系统、和たちすがた//たちすがた/モミロマン的BC1F4供于试验。即，对以抵抗性品种コシヒカリ作为遗传背景，将其染色体片段一部分替换成印度型敏感性品种ハバタキ的染色体而得的コシヒカリ/ハバタキ染色体片段替换系统群(KHSL)进行分析。此外，KHSL由32个系统构成，对于ハバタキ的全12染色体的全部进行分析成为可能(对于KHSL，参照村田和优等，“コシヒカリを遺伝的背景としたインド型品種ハバタキの染色体断片置換系統群の作出と評価”、育种学研究、2009年3月27日、第11卷、别1号、66页)。另外，使敏感性品种モミロマン与抵抗性品种たちすがた杂交2次而得的BC1F4系统群94个系统也使用SSR标志物80种进行分析(关于使用的SSR标志物，参照“Development and mapping of 2240new SSR markers for rice(Oryza sativa L.)”、DNA Res、2002年、9卷、6号、199～207页、以及http：//www.gramene.org/)。
＜使用了Tos17插入系统的连锁分析＞
作为在稻中发现的反转录转座子的Tos17，通过组织培养而被活性化，向基因组内转移自身的拷贝。已知在转移目的地在基因的内部的情况下，该基因被破坏，引起突变(参照Hirochika等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1996年、93卷、7783～7788页)。在本实施例中，使用利用了该现象而通过组织培养制作出的积累了突变的稻的集团(突变体面板(mutantpanel)、数据库名：Tos17突变体面板数据库(http：//tos.nias.affrc.go.jp/～miyao/pub/tos17/))。从Tos17突变体面板数据库中筛选出了在位于通过QTL分析所特定的基因座的被强烈怀疑与BBC敏感性相关的、推定为铁/抗坏血酸氧化还原酶基因的基因的转录部位插入了Tos17的2个系统。然后，使用将这2个系统的各15个体栽培而得的自殖种子，对于表型(BBC敏感性)和基因型(Tos17的插入)进行调查。
＜基因克隆的取得＞
从稻基因库获得位于通过QTL分析所特定的基因座的被推定为铁/抗坏血酸依赖性氧化还原酶基因的mRNA(AK065581)。
＜载体构建和转化＞
构建连接有由nos启动子驱动的卡纳霉素抵抗性基因(NPT2)或由CaMV35S启动子驱动的潮霉素抵抗性基因(mHPT)、和由CaMV35S启动子驱动的AK065581(HIS1基因)或AK241948(HSL1基因)的各表达盒的双元载体(参照图3～7)，供试于农杆菌法的转化。
A.thaliana的转化使用生态型“Columbia”通过Floral dip法来进行(参照Weigeland Glazebrook，Arabidopsis，a laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(2002)p131-132)。即首先，在含抗生素的液体培养基(LB或YEB)中将农杆菌进行振荡培养，约16小时后将2ml培养液加入到含抗生素的液体培养基(LB或YEB)中，进一步振荡培养。然后，约16小时后，将培养液以4℃、8000转/分钟离心处理10分钟，舍弃上清液，将所得的沉淀物悬浮于含5％蔗糖的液体500ml中。然后，在就要转化之前加入转化用试剂silwet(注册商标：SILWET L-77、制品号：BMS-SL7755、バイオメディカルサイエンス社制)至最终浓度0.025％。接着，在所得的农杆菌悬浮液中将已经开花、除去了受粉的花芽的拟南芥浸渍30～120秒。然后，静置约16小时后，使植物体生长发育，得到种子。
稻的转化使用BBC敏感性稻品种关东239号，将“Taniguchi等、Plant Cell Rep.、2010年、29卷、11号、1287～1295页”所述的方法的一部分改变而进行。即首先，将灭菌的完熟种子置床于N6D培养基中在30℃培养7天培养，感染农杆菌，以含乙酰丁香酮(AS)的N6培养基(2N6-AS培养基)在黑暗条件下在25℃共培养3天。然后，将感染的组织用含羧苄青霉素的N6D培养基、在40mg/L潮霉素(Hyg)存在下培养4～6周(18小时日长)，使Hyg耐性愈伤组织再分化。
番茄的转化将品种“マイクロトム”供试验，使用图5和7所示的载体(35SHIS1pZK3、35SHSL1 pZK3)通过农杆菌法实施。此外，原品种マイクロトム在25℃的孵育下用含0.3μM的苯并双环酮(BBC)的琼脂培养基使种子发芽，则约2周后可以明确确认叶部的白化。
所述番茄的转化的结果得到了导入有HIS1基因或HSL1基因的多个再分化植物体。另外，再分化的植物体通过PCR而确认了导入基因。
＜重组体的BBC抵抗性检定＞
制作的A.thaliana重组体(T2世代)和稻重组体(T0世代)的BBC抵抗性检定中，以后述的浓度使用株式会社エス·ディー·エスバイオテック保有的BBC原体。
＜重组体的对三酮系4-HPPD抑制剂的抵抗性的检定＞
制作的稻重组体(T1和T2世代)的三酮系4-HPPD抑制剂、即硝草酮、特糠酯酮(Tefuryltrione)、环磺酮和NTBC抵抗性检定中，以后述的浓度使用市售的各试剂。
＜PCR＞
设计特异性地扩增HIS1(AK065581)的5个各外显子区内的引物供于PCR。此外，PCR使用包含表1所示的碱基序列的引物，以94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的35个循环进行。另外，作为模板DNA，使用从BBC敏感性稻品种(モミロマン、タカナリ、カサラス)和BBC抵抗性稻品种(日本晴、コシヒカリ、北陆193号)的叶使用CTAB法提取的基因组DNA。
表1
(实施例1)4-HPPD抑制剂抵抗性基因座的特定
在粳稻型稻中，尚未知对作为4-HPPD抑制剂的一种的BBC具有敏感性的品种。另一方面，通过粳稻型与籼稻型杂交而育成的稻品种中有时出现BBC敏感性。
于是，如上所述进行使用BBC抵抗性稻品种“コシヒカリ”与敏感性稻品种“ハバタキ”的、コシヒカリ/ハバタキ染色体片段替换系统(KHSL)的QTL分析。其结果是仅第2染色体短臂区被替换成ハバタキ型的KHSL(KHSL04)显示敏感性，因此明确了确定BBC抵抗性的基因座位于コシヒカリ的第2染色体短臂上(参照表2)。此外，表2显示KHSL的QTL分析的结果的一部分。另外，表2中“A”表示标志物来源于コシヒカリ，“B”表示标志物来源于ハバタキ。
表2
进而，如上所述进行使用BBC抵抗性稻品种“たちすがた”和敏感性稻品种“モミロマン”的、たちすがた//たちすがた/モミロマン的BC1F4的QTL分析。其结果与上述同样地明确了决定BBC抵抗性的基因座位于たちすがた的第2染色体短臂上，在供试不同稻品种的QTL分析中特定的基因座位于同一区，根据稻品种“日本晴”数据库信息，确认了存在11种候选基因(参照表3)。
表3
另外，还明确了11种候选基因的碱基序列和推定氨基酸序列均与受BBC影响的酪氨酸代谢途径和类胡萝卜素生物合成途径(参照图1)的酶及其基因没有同源性。
此外，根据稻品种“日本晴”数据库信息，本来与编码因BBC受到活性抑制的HPPD酶的已知基因同源性高的稻基因位于第2染色体短臂上，但与QTL分析所特定的基因座不同(参照图8)。
进而，为了压缩与BBC抵抗性相关的基因所在的区，由KHSL04与コシヒカリ杂交而得的F2集团、和使モミロマン与たちすがた杂交2次而得的BC1F4系统群制作出与第2染色体短臂相关的分析集团，使用2个集团尝试再次分析，结果明确了与BBC抵抗性相关的基因存在于SSR标志物RM12980和RM12983之间。然后，通过RAP-DB检索存在于压缩后的区的基因，结果确认除了乙二醛酶类似蛋白质(741bp)以外，还存在10个候选基因。
(实施例2)4-HPPD抑制剂抵抗性基因的鉴定
如上所述，通过QTL分析提示决定对4-HPPD抑制剂的抵抗性的基因存在于稻第2染色体短臂上。于是关注位于该基因座的被推定为铁/抗坏血酸依赖性氧化还原酶基因的基因，在供试于Tos17插入系统而明确表型(BBC高敏感性)与基因型的连锁关系的同时，制作在BBC敏感性的A.thaliana和稻中导入了该基因的重组体，调查BBC抵抗性赋予效果。
即，在由QTL分析所特定的BBC抵抗性决定基因座中，与被BBC抑制活性的HPPD酶同样地，存在被推定为铁/抗坏血酸依赖性氧化还原酶的基因(以下也称为“靶基因”)(参照表4)。
表4
Tos17插入系统的原品种“日本晴”是BBC抵抗性品种，但在靶基因的转录部位插入了Tos17的系统中出现了BBC敏感性个体。通过供试合计30个体的连锁分析对于表型(BBC敏感性)和基因型(Tos17插入纯合)进行调查的结果是，Tos17插入的6个纯合个体的后代全部显示BBC敏感性。另外，从Tos17插入的18个杂合个体的后代中，全部分离出BBC敏感性的个体。由该结果提示，被推定为铁/抗坏血酸氧化还原酶基因的基因与BBC抵抗性密切相关。
于是，为了证实靶基因是BBC抵抗性基因，制作在用含0.03μM的BBC的琼脂培养基白化的A.thaliana(生态型Columbia)中导入靶基因而得的重组体(T2世代)，调查在所述BBC浓度的存在下的本重组体的生长发育状况。所得的结果示于图9。
另外，制作在用含0.1μM的BBC的琼脂培养基白化的BBC敏感性稻品种“关东239号”中导入靶基因而得的重组体(T0世代)，调查在用300ga.i./ha的BBC处理后的培土中的本重组体的生长发育状况。所得的结果示于图10。
进而，制作在用含0.1μM的BBC的琼脂培养基白化的BBC敏感性稻品种“关东239号”中导入靶基因而得的重组体，得到T1种子或T2种子。将这些种子播种于含2μM的BBC的琼脂培养基上，调查重组体的生长发育状况。所得的结果示于图11。另外，将所述种子接种于含1μM的硝草酮、2.5μM的特糠酯酮(Tefuryltrione)、0.5μM的环磺酮或1μM的NTBC的琼脂培养基，研究重组体的生长发育状况。所得的结果示于图12～15。
正如由图9所示的结果可以明确的那样，导入了靶基因的所述A.thaliana重组体在含0.03μM的BBC的琼脂培养基上不白化地生长发育。另外正如由图10所示的结果可以明确的那样，导入了靶基因的所述稻重组体在以300ga.i./ha的BBC处理后的培土上不白化地生长发育。进而，正如由图11所示的结果可以明确的那样，导入了靶基因的所述稻重组体在以2μM的BBC处理的琼脂培养基上不白化地生长发育。此外，该浓度是使作为BBC抵抗性品种的日本晴白化的高浓度。
另外，正如由图12～15所示的结果可以明确的那样，导入了靶基因的所述稻重组体在包含除BBC以外的三酮系4-HPPD抑制剂(硝草酮、特糠酯酮(Tefuryltrione)、环磺酮或NTBC)的培养基中也不白化地生长发育。即，导入了靶基因的稻重组体在经1μM的硝草酮、2.5μM的特糠酯酮(Tefuryltrione)、0.5μM的环磺酮或1μM的NTBC处理的琼脂培养基上白化地生长发育。
由这些结果证实，靶基因是4-HPPD抑制剂抵抗性基因(HIS1基因)、即编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性的蛋白质的DNA。
(实施例3)利用HIS1基因的碱基序列分析的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的判定
位于日本型稻第2染色体的HIS1基因被特定，但如果进行扩增HIS1基因的PCR，则在BBC敏感性稻品种中也得到扩增产物。另外在BBC敏感性稻品种中，カサラス有时难以根据BBC处理条件而进行敏感性·抵抗性的判定。因此，通过扩增HIS1基因的特定区的PCR来调查是否可以判定HIS1基因的碱基序列与BBC敏感性的程度有无关联。
此外，虽然没有图示，但モミロマン、タカナリ、カサラス均是BBC敏感性品种，但其程度不同，确认了与カサラス的BBC敏感性相比，モミロマン和タカナリ显示更强的BBC敏感性。
因此，首先，通过使用特异性地扩增HIS1基因的5个各外显子区内的引物的PCR来分析BBC敏感性品种(モミロマン、タカナリ、カサラス)和BBC抵抗性品种(日本晴、コシヒカリ、北陆193号)。所得的结果示于图16。
正如由图16所示的结果可以明确的那样，通过使用特异性地扩增HIS1基因的第4外显子的前半部分的引物的PCR而进行分析，结果明确了，在BBC强敏感性品种モミロマン和タカナリ中，与BBC抵抗性品种相比，PCR产物的分子量小。
进而，将BBC敏感性品种モミロマン和タカナリ与BBC抵抗性品种日本晴在基因组DNA的序列中进行比较。所得的结果示于图17。
正如由图17所示的结果可以明确的那样，可知与上述的PCR的分析结果一致地，在モミロマン和タカナリ中，HIS1基因的第4外显子的前半部分中28bp缺失。进而明确了，HIS1基因的第4外显子和第5外显子之间的内含子中也有19bp和16bp的缺失部位。另外，还确认了在HIS1基因的第5外显子中有1bp(腺嘌呤)的缺失和5bp的插入。
另外，将BBC敏感性品种カサラス与BBC抵抗性品种日本晴在基因组DNA的序列中进行了比较。所得的结果示于图18。
正如由图18所示的结果可以明确的那样，与上述的PCR的分析结果一致地，在カサラス中，没有在HIS1基因的第4外显子的前半部分中发现缺失。但是，明确了在HIS1基因的第4外显子和第5外显子之间的内含子中有TA的插入和16b.p.的缺失部位。另外，还确认了HIS1基因的第5外显子中有腺嘌呤的缺失、5bp的插入、和胞嘧啶的插入。
因此，由上述结果可明确，通过从HIS1基因的第4外显子至第5外显子的范围内的碱基的缺失和/或插入，HIS1基因所编码的蛋白质所具有的赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性被抑制。另外，考虑モミロマン和タカナリ、与カサラス的对4-HPPD抑制剂的敏感性的差异，起因于HIS1基因的第4外显子的前半部分中的缺失的有无等。
(实施例4)与HIS1基因具有同源性的基因的分析
接下来，利用数据库探索与HIS1基因具有同源性的基因。即，使用NCBI Blast，以HIS-1基因所编码的蛋白质的氨基酸序列作为询问(query)进行tBLASTN检索(默认设定)。此外，搜索对象数据为nr/nt(无冗余的核苷酸集合，non-redundant nucleotidecollection)。
其结果明确了，与HIS1基因同源性最高的稻基因(HSL1基因)位于第6染色体，推定氨基酸序列的同源性高达约86％(参照图19)。另外，还明确了第6染色体上的同源基因在附近形成了多重基因群(簇)。
然而，推定这些第6染色体上的同源基因所编码的蛋白质在HIS1基因发生突变的敏感性品种中也表达。
关于这一点，如图20所示，HIS1基因主要在叶中表达，但第6染色体上的同源基因主要在根、成熟中的种子中表达，因而认为可能第6染色体上的同源基因所编码的蛋白质虽然潜在地具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性，但由于在叶中的表达量低，所以可能其效果不显现。
此外图20基于使用RiceXPro(稻基因表达数据库/http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)分析HIS1(Os02g0280700)和第6染色体上的同源基因(Os06g0176700/Os06g0178500)在不同组织·生长发育时期的表达图谱而得的结果(参照Sato等，Nucleic Acids Res.2010年11月2日[Epub ahead of print])。
另外明确了，HIS1基因的同源基因仅散在于单子叶植物中，在双子叶植物没有发现(参照图21)。进而与HIS1基因同源性稍低的基因群以乙烯合成系统ACC氧化酶基因群为代表分布于植物全体中，认为在功能上不同。此外图21是通过tBLASTN分析，提取与HIS1具有同源性的蛋白质的氨基酸序列，以所得的序列为基础，使用ClustalW软件进行系统树分析，通过TreeView软件而描绘的。
(实施例5)HSL1基因的分析
对于与HIS1基因同源性最高的、位于第6染色体的稻基因(HSL1基因)，调查是否是编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性的蛋白质的DNA。
即，制作在以含0.1μM的BBC的琼脂培养基白化的BBC敏感性稻品种“关东239号”中导入了靶基因的重组体，得到T1种子或T2种子。将它们播种于含0.12μM的BBC的琼脂培养基，调查重组体的生长发育状况。所得的结果示于图22。
正如由图22所示的结果可以明确的那样，导入了同源基因的稻重组体在含0.12μM的BBC的琼脂培养基上不白化地生长发育。该浓度是BBC抵抗性品种“日本晴”不白化的浓度。由该结果证实，虽然耐性的程度低，但HSL1基因与HIS1基因同样地是编码具有赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的活性的蛋白质的DNA。
产业可利用性
如果使用本发明的对4-HPPD抑制剂的抵抗性提高了的植物进行栽培，则可以有效地进行栽培水田、栽培旱田的杂草防除。另外，本发明的植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的判定方法可以在例如轮作体系中的上一年耕作的遗漏种的发芽风险的减轻中利用。这样，本发明对有用植物的收获量的稳定和/或增加有较大贡献。
序列表自由文本
序列号3～14
＜223＞人工合成的引物的序列

Claims (8)

1.选自下述(a)～(b)中的至少一种DNA、或插入有该DNA的载体的用途，用于制造用于赋予植物以对4-HPPD抑制剂的抵抗性的药剂，
(a)编码由序列号17所记载的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA，
(b)由序列号16所记载的碱基序列组成的DNA。
2.选自下述(a)～(b)中的至少一种DNA、或插入有该DNA的载体的用途，用于提高植物体对4-HPPD抑制剂的抵抗性，
(a)编码由序列号17所记载的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA，
(b)由序列号16所记载的碱基序列组成的DNA。
3.选自下述(a)～(c)中的至少一种DNA、或插入有该DNA的载体的用途，用于制造用于赋予植物以对4-HPPD抑制剂的敏感性的药剂，
(a)编码与权利要求1中所记载的任一DNA的转录产物互补的双链RNA的DNA，
(b)编码与权利要求1中所记载的任一DNA的转录产物互补的反义RNA的DNA，
(c)编码具有特异性地裂开权利要求1中所记载的任一DNA的转录产物的核酶活性的RNA的DNA。
4.选自下述(a)～(c)中的至少一种DNA、或插入有该DNA的载体的用途，用于提高植物体对4-HPPD抑制剂的敏感性，
(a)编码与权利要求1中所记载的任一DNA的转录产物互补的双链RNA的DNA，
(b)编码与权利要求1中所记载的任一DNA的转录产物互补的反义RNA的DNA，
(c)编码具有特异性地裂开权利要求1中所记载的任一DNA的转录产物的核酶活性的RNA的DNA。
5.植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的判定方法，其特征在于，分析受试植物中的选自下述(a)～(b)中的至少一种DNA或其表达调控区的碱基序列，当检测到该DNA或其表达调控区的碱基序列时，判定植物对4-HPPD抑制剂为抵抗性，当检测不到该DNA或其表达调控区的碱基序列时，判定植物对4-HPPD抑制剂为敏感性，
(a)编码由序列号17所记载的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA，
(b)由序列号16所记载的碱基序列组成的DNA。
6.植物的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的判定方法，其特征在于，检测受试植物中的选自下述(a)～(b)中的至少一种DNA的表达或扩增产物或者表达产物的分子量，当检测到该表达或该扩增产物或者表达产物的分子量正确时，判定植物对4-HPPD抑制剂为抵抗性，当检测不到该表达或该扩增产物或者表达产物的分子量不正确时，判定植物对4-HPPD抑制剂为敏感性，
(a)编码由序列号17所记载的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA，
(b)由序列号16所记载的碱基序列组成的DNA。
7.对4-HPPD抑制剂的抵抗性提高了的植物的育种方法，包括以下工序：
(a)使对4-HPPD抑制剂为抵抗性的植物品种与任意品种杂交的工序，
(b)通过权利要求5或6所述的方法来判定由工序(a)中的杂交所得的个体的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的工序，和
(c)筛选被判定为对4-HPPD抑制剂具有抵抗性的个体的工序。
8.对4-HPPD抑制剂的敏感性提高了的植物的育种方法，包括以下工序：
(a)使对4-HPPD抑制剂为敏感性的植物品种与任意品种杂交的工序，
(b)通过权利要求5或6所述的方法来判定由工序(a)中的杂交所得的个体的对4-HPPD抑制剂的抵抗性或敏感性的工序，和
(c)筛选被判定为对4-HPPD抑制剂具有敏感性的个体的工序。
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