WO2012090950A1 - ４－ｈｐｐｄ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物 - Google Patents

４－ｈｐｐｄ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物 Download PDF

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WO2012090950A1
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plant
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acid sequence
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加藤　浩
英郎 前田
嘉弘 春原
郁男 安東
大島　正弘
元滋 川田
吉田　均
咲子 廣瀬
万紀子 川岸
洋二郎 谷口
和優 村田
寛明 前田
山田　祐司
景介 関野
明彦 山崎
Original Assignee
独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
富山県
株式会社エス・ディー・エス バイオテック
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Definitions

  • the present invention relates to an agent for imparting resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor to a plant, a transformed plant cell capable of regenerating a plant body having increased resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor, and the cell thereof
  • the present invention relates to a plant regenerated from, and a method for producing them.
  • the present invention also relates to a method for determining resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor in a plant, and a method for breeding a plant with enhanced resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor using the determination.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Non-Patent Document 2 development and cultivation of crops resistant to applied herbicides are required.
  • sulfonylurea (SU) herbicides are widely used because they are effective for a wide range of weeds with a low dosage and have little effect on the human body and the environment.
  • SU sulfonylurea
  • Non-patent Documents 1 and 3 the sensitivity to 4-HPPD inhibitors has not been fully studied at the development stage and the like, and in seven varieties of high-yielding rice for feed, 4-HPPD inhibitors However, it is reported that it may lead to death in some cases (Non-patent Documents 1 and 3).
  • 4-HPPD inhibitors can be used to control the germination risk (problems of leakage and seedlings) of “spilled seeds” of the previous year's crops, and as a result, production of rice varieties for feed etc. Expansion can be expected.
  • it can be used for the category management technique for cultivation of crops such as rice as needed.
  • a gene serving as a marker for identifying resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor is found, it becomes possible to efficiently breed rice-containing crops.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and an object thereof is to provide a technique capable of efficiently imparting resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor to a plant, and a plant. It is an object of the present invention to provide a technique capable of efficiently determining resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor.
  • the present inventors first attempted to identify a gene involved in resistance to a 4-HPPD inhibitor in plants. Specifically, the present inventors first performed a quantitative locus (QTL) analysis using 4-HPPD inhibitor-sensitive rice and 4-HPPD inhibitor-resistant rice. As a result, it was found that the 4-HPPD inhibitor resistance determining locus is located on the short arm of chromosome 2 of rice. Next, the present inventors have used a phenotype (Nipponbare strain) in which a retrotransposon Tos17 is inserted into a gene presumed to be an iron / ascorbate-dependent oxidoreductase gene located at a locus specified by QTL analysis.
  • QTL quantitative locus
  • the present inventors compared the structure of the HIS1 gene in 4-HPPD inhibitor sensitive rice and 4-HPPD inhibitor resistant rice by PCR analysis. As a result, in rice varieties sensitive to 4-HPPD inhibitors, insertion or deletion occurred in the 4th to 5th exons of the HIS1 gene. It was thought to provide sensitivity to HPPD inhibitors.
  • the rice gene (HSL1 gene) having the highest homology with the HIS1 gene is located on chromosome 6. Furthermore, when this HSL1 gene was introduced into rice, it was revealed that this transformed rice also showed resistance to 4-HPPD inhibitors.
  • the present inventors can produce a plant with increased resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor by using the HIS1 gene or a homologous gene thereof, and It has been found that resistance or sensitivity to 4-HPPD inhibitors in plants can be determined using the gene as a target, and the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • At least one DNA selected from the group consisting of the following (a) to (d) encoding a protein having an activity to impart resistance to a 4-HPPD inhibitor to a plant, or the DNA inserted A drug for imparting resistance to a 4-HPPD inhibitor to a plant including a vector (a) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 17 (B) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 17 (C) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 16 (D) DNA encoding an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 17.
  • A From the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 17 DNA encoding the protein (B) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 17 (C) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 16 (D) DNA encoding an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 17. (3) A plant body with increased resistance to a 4-HPPD inhibitor regenerated from the transformed plant cell according to (2).
  • a plant having enhanced resistance to a 4-HPPD inhibitor which is a progeny or clone of the plant according to (3).
  • (6) A method for producing a plant with increased resistance to a 4-HPPD inhibitor, (I) at least one DNA selected from the group consisting of the following (a) to (d) encoding a protein having an activity to impart resistance to a 4-HPPD inhibitor to a plant, or the DNA inserted Introducing a vector into a plant cell; (A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 17 (B) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 17 (C) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 16 (D)
  • a DNA encoding a double-stranded RNA complementary to the transcription product of the DNA according to the agent (a) (1) for imparting sensitivity to a 4-HPPD inhibitor to a plant comprising: (B) DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of the DNA according to (1)
  • (11) A plant propagation material with enhanced sensitivity to the 4-HPPD inhibitor according to (9) or (10).
  • a method for producing a plant with enhanced sensitivity to a 4-HPPD inhibitor (I) at least one DNA selected from the group consisting of the following (a) to (c) encoding an RNA having an activity to impart sensitivity to a 4-HPPD inhibitor to a plant, or a vector into which the DNA is inserted Introducing into the plant cell; (A) DNA encoding double-stranded RNA complementary to the transcription product of DNA according to (1) (B) DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of the DNA according to (1) (C) DNA encoding an RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product of the DNA according to (1) (II) a step of regenerating a plant from the transformed plant cell into which the DNA or the vector into which the DNA has been introduced in step (I) is introduced; Including methods.
  • a method for determining resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor in a plant comprising at least one DNA selected from the group consisting of the following (a) to (d) in a test plant or an expression control region thereof: (A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 17 (B) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 17 (C) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 16 (D) DNA encoding an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 17.
  • a method for determining resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor in a plant wherein the expression or amplification product of at least one DNA selected from the group consisting of (a) to (d) below in a test plant Or a method characterized by detecting the molecular weight of the expression product (a) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 17 (B) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 17 (C) DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 16 (D) DNA encoding an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 17.
  • a method for breeding a plant having increased resistance to a 4-HPPD inhibitor (A) crossing a plant variety resistant to 4-HPPD inhibitor with any variety, (B) determining the resistance or sensitivity to the 4-HPPD inhibitor in the individual obtained by the mating in the step (a) by the method described in (13) or (14), and (c) 4- Selecting an individual determined to be resistant to the HPPD inhibitor.
  • a method for breeding a plant having increased sensitivity to a 4-HPPD inhibitor (A) crossing a plant variety sensitive to a 4-HPPD inhibitor with any variety, (B) determining the resistance or sensitivity to the 4-HPPD inhibitor in the individual obtained by the mating in the step (a) by the method described in (13) or (14), and (c) 4- Selecting an individual determined to be sensitive to the HPPD inhibitor.
  • NPTII kanamycin resistance gene driven by the nos promoter
  • hygromycin resistance gene hygR
  • CaMV35S-P CaMV35S promoter
  • HIS1 hygromycin resistance gene driven by the CaMV35S promoter
  • pIG121-Hm / HIS1 binary vector
  • hygromycin resistance gene driven by CaMV35S promoter (35S Pro) and AK065581 (HIS1) driven by CaMV35S promoter (35S Pro) used for transformation of Arabidopsis thaliana and rice by Agrobacterium method
  • mHPT hygromycin resistance gene driven by CaMV35S promoter
  • AK065581 HIS1 driven by CaMV35S promoter (35S Pro) used for transformation of Arabidopsis thaliana and rice by Agrobacterium method
  • hygromycin resistance gene (mHPT ) driven by CaMV35S promoter (35S Pro) and AK241948 ( HSL1 ) driven by CaMV35S promoter (35S Pro) used for transformation of Arabidopsis thaliana and rice by Agrobacterium method expression cassette, as well as border sequence (RB: right border sequence, LB: left border sequence) is a diagram showing an outline of binary vector (35s HSL1 pZH2B) linked to.
  • Each expression cassette of kanamycin resistance gene ( NPT2 ) driven by nos promoter (NOSpro), AK241948 (HSL1) driven by CaMV35S promoter (35S Pro) used for transformation of tomato by Agrobacterium method, and border sequence (RB: right border sequence, LB: left border sequence) is a diagram showing an outline of binary vector (35s HSL1 pZK3) linked to. It is a figure which shows the 4-HPPD inhibitor resistance gene (AK065581) identified by the QTL analysis which exists on a rice chromosome, and its homologous gene. Recombinant A.
  • “Nipponbare” and “Kanto 239” indicate the results of Nipponbare (wild type) (4-HPPD inhibitor-resistant varieties) and Kanto 239 (wild type), respectively.
  • “1A, 2, 3, 3D, 3F, 3-3, 9, 15” indicate that this is a result of Kanto No. 239 (recombinant rice) into which the target gene (AK065581) was introduced (also in FIGS. 12 to 15) The same).
  • “Application Date” and “Evaluation Date” were examined on the “day of seeding on a solid (agar) medium to which a 4-HPPD inhibitor was added” and “the growth status of plants grown from the seed,” respectively. Day “(the same applies to FIGS. 12 to 15 and 22).
  • “Exon 1” indicates a region of exon 1 of the HIS1 gene amplified by PCR using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • “Exon 2” indicates a region of exon 2 of the HIS1 gene amplified by PCR using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, "Exon 3 region of HIS1 gene amplified by PCR using a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8," exon 4 " A primer comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and a primer comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 The exon 4 region of the HIS1 gene amplified by PCR using a mer is shown, where “exon 5” is a primer consisting
  • the “first half of exon 4” is the first half region inside exon 4 of the HIS1 gene amplified by PCR using the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14. Indicates. Furthermore, in the figure, arrowheads indicate that the sizes are 100 pb, 200 bp, and 500 bp, respectively. It is a schematic diagram which shows the result of having compared the structure of the Nipponbare HIS1 gene and the corresponding gene of Momiroman and Takanari. It is a schematic diagram which shows the result of having compared the structure of the Nipponbare HIS1 gene and the corresponding gene of Kasalath.
  • HIS1 gene HIS1 gene and its homologous gene (HSL1 gene) encode, and shows homology. It is a figure which shows the expression pattern in each structure
  • the HIS1 gene and its homologous gene are phylogenetic trees indicating that they belong to a gene group unique to a grass family (monocotyledonous) plant.
  • HIS is an abbreviation for “HIS1-LIKE” and indicates that it is a homologous gene of HIS1.
  • “Kanto 239” indicates the result of Kanto 239 (wild type), and “23-1”, “23-21” and “23-25” are homologous genes (AK241948). It shows that it is a result of Kanto No. 239 (recombinant rice) into which is introduced.
  • the agent for imparting resistance to a 4-HPPD inhibitor of the present invention to a plant is a DNA encoding a protein having an activity that imparts resistance to a 4-HPPD inhibitor to a plant (hereinafter referred to as resistance of the present invention). Or a vector having the DNA inserted therein (sometimes referred to as DNA).
  • the “4-HPPD inhibitor” means a drug (4-HPPD inhibitor) that inhibits the function of 4-HPPD (4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase). As shown in FIG. 1, the 4-HPPD inhibitor indirectly inhibits the function of 4-HPPD, thereby indirectly inhibiting the carotenoid synthesis system, causing chlorophyll decay and whitening the plant, leading to death. .
  • Examples of the “4-HPPD inhibitor” in the present invention include benzobicyclone (BBC), mesotrione, tefryltrione, tembotrione, (2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl) -cyclohexane-1,3dione (
  • Examples include triketone 4-HPPD inhibitors such as 2- (2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl) cyclohexane-1,3-dione; NTBC), and pyrazole 4-HPPD inhibitors such as pyrazolate, benzophenap, and pyrazoxifene.
  • the 4-HPPD inhibitor to be used for imparting resistance to plants using the resistance DNA of the present invention is preferably a triketone 4-HPPD inhibitor such as BBC, mesotrione, tefryltrione, tembotrione, NTBC, and BBC. Is particularly preferred.
  • herbicides such as the 4-HPPD inhibitors described above are extremely diverse as compounds, but can be classified into several groups as follows from the viewpoint of the mechanism of action (“Agrobiogum to pesticides”). See “Later-Current Status and Future of Pest Weed Control”, Japan, CMC Publishing, January 2010).
  • ACCase Acetyl-CoA carboxylase
  • Herbicides belonging to this group are further classified into (1) 4-aryloxyphenoxypropionic acid type, (2) cyclohexanedione oxime type, and (3) dione type.
  • This group of herbicides targeting the acetolactate synthase (ALS) -inhibiting herbicide ALS causes the plant to become impaired by inhibiting ALS activity and inhibiting branched amino acid production.
  • the herbicides belonging to this group are further classified into (1) sulfonylurea, (2) triazolinone, (3) triazolopyrimidine, (4) pyrimidinyl salicylic acid, and (5) imidazolinone.
  • III 4-HPPD Metabolism-Inhibiting Herbicide This herbicide group that inhibits 4-HPPD metabolism in the tyrosine metabolic pathway indirectly inhibits the plant's carotenoid synthesis system, leading to whitening and death of the plant.
  • Herbicides belonging to this group are further classified into (1) cyclohexanedione, (2) pyrazole, (3) bicyclo (4), isoxazole, and (5) triketone.
  • (1) cyclohexanedione series include benzoylcyclohexane-1,3-dione derivatives.
  • (2) Examples of pyrazole series include pyrazolate, benzophenap and pyrazoxifene.
  • Bicyclo Examples of the system include 3-substituted benzoyl-bicyclo [4,1,0] heptane-2,4-dione derivatives.
  • Examples of the isoxazole system include isoxaflutol and ( 5) Examples of the triketone series include BBC, mesotrione, tefryltrione, and tembotrione.
  • PPO Protoporphyrinogen-IX Oxidase
  • This group of herbicides inhibits chlorophyll synthesis, leading to cell membrane disruption and death. The herbicides belonging to this group are further classified into (1) diphenyl ether type, (2) diallyl type, and (3) pyrazole type.
  • V Very long-chain fatty acid elongation enzyme
  • VLFCAE Very long-chain fatty acid elongation enzyme
  • the nucleotide sequence of a gene (HIS1 gene; Os02g0280700) presumed to be an iron / ascorbic acid-dependent oxidoreductase gene derived from Nipponbare is represented by SEQ ID NO: 1, and the protein encoded by the DNA Is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence of a gene derived from Nipponbare (HIS1-LIKE (HSL) 1 gene; Os06g0176700 / Os06g0178500 (AK241948)) is represented by SEQ ID NO: 16 and the protein encoded by the DNA Is shown in SEQ ID NO: 17.
  • One embodiment of the resistant DNA of the present invention is a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (typically, a DNA containing the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1). It is.
  • another embodiment of the resistant DNA of the present invention includes a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 (typically including the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 16). DNA).
  • the term “plurality” generally refers to within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, more preferably within 10 amino acids, and particularly preferably within several amino acids in the entire amino acid sequence of HIS1 protein or HSL1 protein (for example, 5 amino acids or less, 3 amino acids or less, 2 amino acids or less, 1 amino acid).
  • the DNA sequence information of the DNA is used to obtain a 4-HPPD inhibitor against the same species or other plants. It is possible to isolate a homologous gene encoding a protein having the activity of imparting resistance to plants. As a plant for obtaining such a homologous gene, a monocotyledonous plant is preferable, and a gramineous plant is particularly preferable.
  • Examples of gramineous plants include rice (for example, 4-HPPD inhibitor resistant varieties such as Nipponbare, Koshihikari, Kitaoba, Akihikari, Akitakomachi, Fukuhibiki, Bekoaoba, Bekkogo, Yume Aoba, Hokuriku 193, Leaf Star, Tasuta, Kusanohoshi, Hosiaoba, Nishiaoba, Tachiaba, Maki Mizuho, Momomogo Aoba, Hamasari, Minamiyutaka), barley, sorghum, corn, and the like.
  • rice for example, 4-HPPD inhibitor resistant varieties such as Nipponbare, Koshihikari, Kitaoba, Akihikari, Akitakomachi, Fukuhibiki, Bekoaoba, Bekkogo, Yume Aoba, Hokuriku 193, Leaf Star, Tasuta, Kusanohoshi, Hosiaoba, Nishi
  • Examples of a method for obtaining a homologous gene include a hybridization technique (Southern, EM, J. Mol. Biol., 98: 503, 1975) and a polymerase chain reaction (PCR) technique (Saiki, R. et al.). K., et al. Science, 230: 1350-1354, 1985, Saiki, RK et al. Science, 239: 487-491, 1988).
  • a hybridization reaction is usually performed under stringent conditions. Examples of stringent hybridization conditions include 6M urea, 0.4% SDS, 0.5 ⁇ SSC, or equivalent stringency hybridization conditions.
  • Isolation of genes with higher homology can be expected by using conditions with higher stringency, for example, 6M urea, 0.4% SDS, and 0.1xSSC.
  • the resistant DNA of the present invention encodes a protein having an activity of imparting resistance to a 4-HPPD inhibitor to a plant, the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 16 and stringent conditions DNA that hybridizes with is included.
  • the protein encoded by the obtained homologous gene usually has high homology with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 17.
  • High homology is sequence homology of at least 60% or more, preferably 80% or more (eg, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% or more).
  • Sequence homology can be determined using the BLASTX (amino acid level) program (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). The program is based on the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul. Yes.
  • the resistance DNA of the present invention has a homology of 60% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 17 as long as it encodes a protein having an activity that imparts resistance to a 4-HPPD inhibitor to plants. DNA encoding the amino acid sequence is included.
  • DNA examples include a barley-derived gene (HvHCP1 (AF527606)), a corn-derived gene (ZmHSL1 (BT062842), ZmHSL2 (NM_001153464)), and a sorghum-derived gene (SbHSL1 (XM_002436546)). (See FIG. 21).
  • HvHCP1 barley-derived gene
  • ZmHSL1 corn-derived gene
  • ZmHSL2 NM_001153464
  • SbHSL1 sorghum-derived gene
  • Whether or not a protein encoded by a specific gene has an activity of imparting resistance to a 4-HPPD inhibitor to a plant can be determined by, for example, introducing the gene into a plant as described in Examples below. It can be determined by examining whether or not the resistance is imparted to the produced plant (see Example 2). That is, when using Arabidopsis thaliana (A. thaliana: ecotype Columbia) that whitens in an agar medium containing 0.03 ⁇ M BBC, the transformant produced by introducing the gene into Arabidopsis thaliana has the BBC concentration. If it can grow without whitening in the presence, it can be determined that the protein encoded by the gene has an activity to confer resistance to a 4-HPPD inhibitor to a plant.
  • Arabidopsis thaliana A. thaliana: ecotype Columbia
  • the transformant produced by introducing the gene into Kanto 239 has the BBC concentration. If it can grow without whitening in the presence of, it can be determined that the protein encoded by the gene has an activity to confer resistance to a 4-HPPD inhibitor to a plant. Furthermore, when a triketone-based 4-HPPD inhibitor (mesotrione, tefryltrione, tembotrione, NTBC, etc.) other than BBC is used, 1 ⁇ M of the transformant produced by introducing the gene into Kanto No. 239 is used.
  • the protein encoded by the gene confers resistance to 4-HPPD inhibitors if it can grow without whitening in the presence of mesotrione, 2.5 ⁇ M tefryltrione, 0.5 ⁇ M tembotrione or 1 ⁇ M NTBC. It can be determined that it has activity.
  • the form of the resistant DNA of the present invention is not particularly limited, and includes genomic DNA and chemically synthesized DNA in addition to cDNA.
  • genomic DNA for example, genomic DNA is extracted from a plant, a genomic library (plasmid, phage, cosmid, BAC, PAC, etc. can be used as vectors) is developed and developed, and the HIS1 gene (for example, The DNA is prepared by colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on the base sequence of the DNA of SEQ ID NO: 1) or the HSL1 gene (for example, DNA of SEQ ID NO: 16). It is possible.
  • a primer specific for the HIS1 gene or the HSL1 gene it is also possible to prepare a primer specific for the HIS1 gene or the HSL1 gene and perform PCR using the primer.
  • cDNA is synthesized based on mRNA extracted from a plant, inserted into a vector such as ⁇ ZAP to create a cDNA library, developed, and colony hybridization in the same manner as described above.
  • it can be prepared by performing plaque hybridization or by performing PCR. If a commercially available DNA synthesizer is used, the target DNA can be prepared by synthesis.
  • the present invention also provides an agent for imparting sensitivity to a 4-HPPD inhibitor to a plant.
  • the resistance to a 4-HPPD inhibitor is suppressed by suppressing the function of the protein encoded by the HIS1 gene. Therefore, a drug for conferring resistance to the 4-HPPD inhibitor of the present invention to a plant is a DNA encoding an RNA having an activity that imparts sensitivity to the plant to the 4-HPPD inhibitor, or the DNA inserted therein.
  • Vector
  • RNA encoding an RNA having an activity to impart sensitivity to a 4-HPPD inhibitor to a plant is a dsRNA (double-stranded RNA) complementary to the endogenous transcript of the resistant DNA of the present invention described above.
  • RNAi RNA interference, RNA interference
  • Dicer RNaseIII-like nuclease
  • siRNA short interference RNA
  • a specific protein binds to the siRNA to form a nuclease complex (RISC: RNA-induced silencing complex).
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • This complex recognizes and binds to the same sequence as siRNA, and cleaves the transcript (mRNA) of the target gene at the center of siRNA by RNaseIII-like enzyme activity.
  • the antisense strand of siRNA binds to mRNA and acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RsRP) to synthesize dsRNA.
  • RsRP RNA-dependent RNA polymerase
  • the DNA encoding the dsRNA of the present invention comprises an antisense DNA encoding an antisense RNA for any region of a target gene, ie, a transcription product (mRNA) of an endogenous resistant DNA of the present invention, and any of the mRNAs.
  • a sense DNA encoding the sense RNA of the region, and the antisense RNA and the sense RNA can be expressed from the antisense DNA and the sense DNA, respectively.
  • dsRNA can be produced from these antisense RNA and sense RNA.
  • antisense RNA and sense RNA are expressed from the same vector
  • antisense RNA and sense RNA are expressed from different vectors, respectively.
  • an antisense RNA expression cassette in which a promoter capable of expressing a short RNA such as a polIII system is linked upstream of the antisense DNA and the sense DNA.
  • sense RNA expression cassettes are constructed, and these cassettes are inserted into the vector in the same direction or in the opposite direction.
  • an expression system in which antisense DNA and sense DNA are arranged in opposite directions so as to face each other on different strands.
  • one double-stranded DNA in which an antisense RNA coding strand and a sense RNA coding strand are paired is provided, and antisense RNA and sense RNA from each strand are provided on both sides thereof.
  • a promoter is provided oppositely so that it can be expressed.
  • a terminator is added to the 3 ′ end of each strand (antisense RNA coding strand, sense RNA coding strand). It is preferable to provide.
  • this terminator a sequence in which four or more A (adenine) bases are continued can be used.
  • the two promoter types are preferably different.
  • antisense RNA expression in which a promoter capable of expressing a short RNA such as a pol III system is linked upstream of the antisense DNA and the sense DNA.
  • a cassette and a sense RNA expression cassette are constructed, and these cassettes are held in different vectors.
  • the dsRNA used in the present invention is preferably siRNA.
  • siRNA means double-stranded RNA consisting of short strands in a range that does not show toxicity in cells.
  • the chain length is not particularly limited as long as the expression of the target gene can be suppressed and it does not show toxicity.
  • the chain length of dsRNA is, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, and more preferably 21 to 30 base pairs.
  • an appropriate sequence preferably an intron sequence
  • a double-stranded RNA having a hairpin structure preferably an intron sequence
  • hpRNA self-complementary 'hairpin' RNA
  • the DNA encoding the dsRNA of the present invention need not be completely identical to the base sequence of the target gene, but is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (eg, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% or more). Sequence identity can be determined by the technique described above (BLAST program).
  • the part of the double-stranded RNA in which the RNAs in the dsRNA are paired is not limited to a perfect pair, but is mismatched (the corresponding base is not complementary) or bulge (there is no base corresponding to one strand) ) Or the like may include an unpaired portion.
  • both bulges and mismatches may be included in the double-stranded RNA region where RNAs in dsRNA pair.
  • Another embodiment of a DNA encoding an RNA having an activity conferring sensitivity to a 4-HPPD inhibitor on a plant is a DNA encoding an antisense RNA complementary to a transcription product of an endogenous resistant DNA of the present invention (Antisense DNA).
  • Antisense DNA suppresses target gene expression by inhibiting transcription initiation by triplex formation, transcription suppression by hybridization with a site where an open loop structure is locally created by RNA polymerase, and progressing synthesis Inhibition of transcription by hybridization with certain RNA, suppression of splicing by hybridization at the junction of intron and exon, suppression of splicing by hybridization with spliceosome formation site, suppression of transition from nucleus to cytoplasm by hybridization with mRNA , Splicing suppression by hybridization with a capping site or poly (A) addition site, translation initiation suppression by hybridization with a translation initiation factor binding site, translation suppression by hybridization with a ribosome binding site near the initiation codon Outgrowth inhibitory peptide chains by the formation of a hybrid with a coding region or polysome binding sites of mRNA, and hybrid formation by gene silencing of the interaction site between a nucleic acid and protein.
  • the antisense DNA used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above.
  • an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 'end of the mRNA of the target gene is designed, it will be effective for inhibiting translation of the gene.
  • sequences complementary to the coding region or the 3 'untranslated region can also be used.
  • the DNA containing the antisense sequence of the non-translated region as well as the translated region of the gene is also included in the antisense DNA used in the present invention.
  • the antisense DNA to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 'side.
  • Antisense DNA is a phosphorothioate method (Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-) based on the sequence information of the resistant DNA of the present invention (for example, DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1). 3221, 1988) and the like.
  • the prepared DNA can be introduced into plants by a known method described later.
  • the sequence of the antisense DNA is preferably a sequence that is complementary to the transcription product of the endogenous resistant DNA of the present invention possessed by the plant, but it is not completely complementary as long as it can effectively inhibit gene expression. May be.
  • the transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more) to the transcript of the target gene.
  • the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, more preferably 500 bases or more.
  • the length of the antisense DNA used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb.
  • RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves an endogenous resistance DNA transcript of the present invention. It encodes DNA.
  • Some ribozymes have a group I intron type and a size of 400 nucleotides or more like M1RNA contained in RNaseP, but some have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type ( Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzymes, 35: 2191, 1990).
  • the self-cleaving domain of hammerhead ribozyme cleaves on the 3 ′ side of C15 of G13U14C15, but it is important for activity that U14 forms a base pair with A at position 9, and the base at position 15 is In addition to C, it has been shown to be cleaved by A or U (Koizumi et.al., FEBS Lett. 228: 225, 1988).
  • the ribozyme substrate binding site is designed to be complementary to the RNA sequence near the target site, it is possible to create a restriction enzyme-like RNA-cleaving ribozyme that recognizes the UC, UU or UA sequence in the target RNA.
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. Hairpin ribozymes are found, for example, in the minus strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus (Buzayan, Nature 323: 349, 1986). It has been shown that this ribozyme can also be designed to cause target-specific RNA cleavage (Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology 30: 112, 1992). A ribozyme designed to cleave the target is linked to a promoter such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and a transcription termination sequence so that it is transcribed in plant cells.
  • a promoter such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and a transcription termination sequence
  • Such structural units are arranged in tandem so that a plurality of sites in the target gene can be cleaved, thereby further enhancing the effect (Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271, 1992). ).
  • Such a ribozyme can be used to specifically cleave the target transcription product of the endogenous resistant DNA of the present invention, thereby suppressing the expression of the DNA.
  • ⁇ Vector into which DNA according to the present invention is inserted As a vector into which the DNA of the present invention (DNA encoding the resistant DNA of the present invention or RNA having an activity that imparts sensitivity to a 4-HPPD inhibitor to a plant) is inserted, the inserted gene is inserted in a plant cell. There is no particular limitation as long as it can be expressed.
  • the vector according to the present invention may contain a promoter for constitutively or inducibly expressing the DNA of the present invention. Examples of promoters for constant expression include cauliflower mosaic virus 35S promoter, rice actin promoter, corn ubiquitin promoter, and the like.
  • promoters for inducible expression are known to be expressed by external factors such as infection and invasion of filamentous fungi, bacteria and viruses, low temperature, high temperature, drying, UV irradiation, and spraying of specific compounds.
  • the promoter etc. which are mentioned are mentioned.
  • promoters examples include rice chitinase gene promoters expressed by infection and invasion of filamentous fungi, bacteria, and viruses, tobacco PR protein gene promoters, rice lip19 gene promoters induced by low temperatures, Induced rice hsp80 and hsp72 gene promoters, Arabidopsis thaliana rab16 gene promoter induced by drying, Parsley chalcone synthase gene promoter induced by UV irradiation, corn induced under anaerobic conditions Examples include the promoter of alcohol dehydrogenase gene.
  • the rice chitinase gene promoter and tobacco PR protein gene promoter are also induced by specific compounds such as salicylic acid, and lab16 is also induced by spraying the plant hormone abscisic acid.
  • the drug of the present invention may be the DNA of the present invention, the vector itself into which the DNA is inserted, or a mixture of other components.
  • Such other components are not particularly limited, and examples thereof include sterilized water, physiological saline, vegetable oil, surfactant, lipid, solubilizer, buffer, and preservative.
  • the transformed plant cell of the present invention when prepared by a method mediated by Agrobacterium described later, it may contain Agrobacterium into which the DNA is introduced.
  • a transformed plant cell capable of regenerating a plant with increased resistance to the 4-HPPD inhibitor of the present invention encodes a protein having an activity to impart resistance to the 4-HPPD inhibitor to the plant,
  • a transformed plant cell capable of regenerating a plant body having increased sensitivity to the 4-HPPD inhibitor of the present invention is the DNA encoding RNA having an activity to impart sensitivity to the 4-HPPD inhibitor to the plant, Alternatively, it is a plant cell transformed by introducing a vector having the DNA inserted therein.
  • the plant from which the plant cell of the present invention is derived is not particularly limited.
  • grasses such as rice, barley, wheat, sorghum, corn, creeping bentgrass, cruciferous plants such as Arabidopsis thaliana, and solanaceous plants such as tomatoes.
  • cruciferous plants such as Arabidopsis thaliana, and solanaceous plants such as tomatoes.
  • Leguminous plants such as soybean, alfalfa and Miyakogusa, mallows such as cotton, and red plants such as sugar beet.
  • varieties sensitive to 4-HPPD inhibitors are preferred as application targets for increasing resistance to the 4-HPPD inhibitors of the present invention.
  • rice varieties sensitive to 4-HPPD inhibitors include, but are not limited to, Habataki, Takanari, Momiroman, Mizurochikara, Luriaoba, Orochimochi, Hyogo Beef Wakamaru, Kasaras, and Kanto 239.
  • cultivars resistant to the 4-HPPD inhibitor are particularly preferred as application targets for increasing the sensitivity to the 4-HPPD inhibitor of the present invention.
  • Rice varieties resistant to 4-HPPD inhibitors include, for example, Nipponbare, Koshihikari, Kitaoba, Akihikari, Akitakomachi, Fukuhibiki, Bekoaoba, Bekkogo, Yume Aoba, Hokuriku 193, Leaf Star, etc.
  • Kusanohoshi, Hosiooba, Nishiaoba, Tachiaoba, Mizukiho Makimomo Aoba, Masaru, Minamiyutaka but are not limited to these.
  • the plant cells of the present invention include cultured cells as well as cells in the plant body.
  • various forms of plant cells such as suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, callus, immature embryos, pollen and the like are included.
  • a method for introducing a vector having the resistance DNA of the present invention inserted into a plant cell for example, a polyethylene glycol method, an electroporation method (electroporation), an Agrobacterium-mediated method, a particle gun method, etc.
  • a polyethylene glycol method for example, a polyethylene glycol method, an electroporation method (electroporation), an Agrobacterium-mediated method, a particle gun method, etc.
  • electroporation method electroporation
  • Agrobacterium-mediated method e.g., a method for example, a polyethylene glycol method, an electroporation method (electroporation), an Agrobacterium-mediated method, a particle gun method, etc.
  • Various known methods can be used.
  • the present invention provides a plant regenerated from the transformed plant cell (hereinafter also referred to as a transformed plant). Regeneration of plant bodies from transformed plant cells can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells.
  • a method for producing a transformed plant body in rice a method of introducing a gene into a protoplast with polyethylene glycol and regenerating the plant body (Datta, SK In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spanenberg Eds.). ) Pp66-74, 1995), gene transfer to protoplasts by electric pulse and regeneration of plants (Toki et al. Plant Physiol. 100, 1503-1507, 1992), direct introduction of genes into cells by particle gun method And regenerating plant bodies (Christou et al.
  • Examples of methods for regenerating sorghum plants include, for example, methods for regenerating plants by introducing genes into immature embryos and callus by the Agrobacterium method or particle gun method, and pollination using pollen that has been gene-transferred by ultrasound.
  • the method is preferably used (JA Able et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 37: 341-348, 2001, AM Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
  • the present invention includes a plant cell into which the DNA of the present invention has been introduced, a plant containing the cell, progeny and clones of the plant, and propagation material of the plant, its progeny and clones.
  • the present invention also includes (I) a step of introducing the resistant DNA of the present invention or a vector into which the DNA is inserted into a plant cell, and (II) a step in which the DNA or the DNA is inserted in step (I).
  • the present invention also provides a method for producing a plant having enhanced resistance to a 4-HPPD inhibitor, comprising a step of regenerating a plant from a transformed plant cell into which a vector has been introduced.
  • the present invention further includes (I) a step of introducing the DNA encoding an RNA having an activity imparting sensitivity to a 4-HPPD inhibitor into a plant, or a vector into which the DNA has been inserted, into a plant cell; A step of regenerating a plant body from the transformed plant cell into which the DNA or the vector into which the DNA has been introduced is introduced in the step (I), and the sensitivity to a 4-HPPD inhibitor is enhanced.
  • the present invention also provides a method for producing a plant body.
  • the method of determining resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor in a plant according to the present invention comprises the resistance DNA of the present invention or the corresponding sensitive DNA (hereinafter referred to as the detection target DNA of the present invention) in a test plant, Alternatively, the base sequence of the expression control region is analyzed.
  • Sensitive DNA refers to a DNA that encodes a protein having an activity to impart sensitivity to a 4-HPPD inhibitor to a plant.
  • the detection target DNA of the present invention is typically at least one DNA selected from the group consisting of the following (a) to (d).
  • D DNA encoding an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 17
  • the meaning of DNA in (a) to (d) is as described above in principle, but in the detection target DNA of the present invention, in particular, it means endogenous DNA, and resistance DNA and It means that both sensitive DNAs are included.
  • an amplification product obtained by amplifying the detection target DNA of the present invention or its expression control region by PCR can be used.
  • the primer used is not limited as long as it can specifically amplify the detection target DNA of the present invention or its expression control region, and the primer of the detection target DNA of the present invention or its expression control region is not limited. It can design suitably based on sequence information (for example, sequence number: 1).
  • Suitable primers include a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 14. By combining these primers as appropriate, a specific base sequence of the detection target DNA of the present invention or its expression control region can be amplified.
  • the determination of the resistance or sensitivity of the test plant to the 4-HPPD inhibitor can include, for example, a step of comparing with a “control base sequence”. If the “control base sequence” to be compared with the base sequence of the DNA to be detected of the present invention or its expression control region in the test plant is rice, typically it is a 4-HPPD inhibitor resistant variety (eg, Nipponbare Hare).
  • the base sequence of a gene presumed to be an iron / ascorbic acid-dependent oxidoreductase gene derived from Takanari or Momiroman is shown in SEQ ID NO: 15.
  • the test plant is determined to have a high probability of being sensitive to a 4-HPPD inhibitor.
  • DNA can be prepared from the test plant using a conventional method, for example, CTAB method.
  • a plant for preparing DNA not only a grown plant body but also a seed or a young plant body can be used.
  • the base sequence can be determined by a conventional method such as the dideoxy method or the Maxam-Gilbert method. In determining the base sequence, a commercially available sequence kit and sequencer can be used.
  • Whether the base sequence of the detection target DNA of the present invention or its expression control region in the test plant is different from the base sequence of the control is determined indirectly by various methods other than the determination of the direct base sequence described above. Can be analyzed. Examples of such methods include PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism, single-strand higher-order structure polymorphism) method, RFLP method using restriction fragment length polymorphism (Restriction Fragment Length Polymorphism / RFLP), and the like. Examples include PCR-RFLP method, denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE), allele specific oligonucleotide (ASO) hybridization method, and ribonuclease A mismatch cleavage method.
  • DGGE denaturant gradient gel electrophoresis
  • ASO allele specific oligonucleotide
  • Another method of determining resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor in a plant according to the present invention is to express or amplify at least one DNA selected from the group consisting of the above (a) to (d) in a test plant. It is characterized by detecting the molecular weight of the product or expression product.
  • the fourth exon region of the HIS1 gene in the 4-HPPD inhibitor-resistant varieties Nipponbare, Koshihikari, and Hokuriku 193 is the 4-HPPD inhibitor-sensitive varieties Momiroman and Takanari. Longer than them. Therefore, the resistance or sensitivity to a 4-HPPD inhibitor in a plant can be determined by detecting the molecular weight of the amplification product or expression product of the detection target DNA of the present invention.
  • detection of DNA expression includes both detection at the transcription level and detection at the translation level.
  • detection of expression is intended to include not only detection of the presence or absence of expression but also detection of the degree of expression.
  • Amplification of the detection target DNA (for example, genomic DNA) of the present invention can be performed by a PCR (Polymerase chain reaction) method.
  • the detection at the transcription level of the DNA according to the present invention can be carried out by a conventional method, for example, RT-PCR (Reverse transcribed-Polymerase chain reaction) method or Northern blotting method.
  • the primer used in carrying out the PCR is not limited as long as it can specifically amplify the detection target DNA of the present invention, and the sequence information of the resistance DNA or sensitive DNA of the present invention that has been determined (for example, , SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 15).
  • a suitable primer includes a primer having the base sequence set forth in any of SEQ ID NOS: 3 to 14.
  • a specific base sequence of the detection target DNA of the present invention can be amplified by appropriately combining these primers.
  • detection at the translation level can be performed by a conventional method, for example, Western blotting.
  • the antibody used for Western blotting may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and methods for preparing these antibodies are well known to those skilled in the art.
  • the detection target DNA of the present invention can be expressed by constructing a vector in which a reporter gene is linked to the downstream of the expression control region of the detection target DNA of the present invention so that the reporter gene can be expressed. It can also be determined by detection.
  • the expression level of the detection target DNA of the present invention in the test plant is a 4-HPPD inhibitor resistant cultivar (for example, in Japan, Nipponbare, Koshihikari, Kitaoba, Akihikari, Akitakomachi, Fukubiki, Beko Aoba, Begogo only, Yume Aoba, Hokuriku 193, Leaf Star, Tatsugata, Kusanohoshi, Hoshioba, Nishiyaoba, Tachiaba, Maki Mizuho, Momomogu Aoba, Hamasari, Minamiyutaka) (For example, if the DNA to be detected of the present invention is not substantially expressed) and the molecular weight of the amplification product or expression product of the DNA to be detected of the present invention is a 4-HPPD inhibitor resistant variety (for example, , Nipponbare, Koshihikari, Kita Aoba, Akihikari, Akitakomachi, Fubiki,
  • the present invention provides a method for breeding plants with increased resistance to 4-HPPD inhibitors.
  • a breeding method includes (a) a step of crossing a plant variety resistant to 4-HPPD inhibitor and an arbitrary plant variety, (b) resistance to 4-HPPD inhibitor in an individual obtained by crossing.
  • the method includes a step of determining sensitivity by the above-described determination method of the present invention, and (c) selecting a variety that has been determined to be resistant to a 4-HPPD inhibitor.
  • the present invention also provides a method for breeding a plant with enhanced sensitivity to a 4-HPPD inhibitor.
  • a breeding method includes (a) a step of crossing a plant variety sensitive to a 4-HPPD inhibitor with an arbitrary plant variety, (b) resistance to a 4-HPPD inhibitor in an individual obtained by crossing or A step of determining sensitivity by the determination method of the present invention, and (c) selecting a variety determined to be sensitive to a 4-HPPD inhibitor.
  • Examples of “arbitrary plant varieties” to be crossed with plant varieties resistant to 4-HPPD inhibitors include, for example, 4-HPPD inhibitor-sensitive varieties, 4-HPPD inhibitor-resistant varieties and 4-HPPD inhibitor-sensitive varieties. Individuals obtained by mating with are not limited thereto.
  • Examples of “arbitrary plant varieties” to be crossed with plant varieties sensitive to 4-HPPD inhibitors include, for example, 4-HPPD inhibitor-resistant varieties, 4-HPPD inhibitor-resistant varieties and 4-HPPD inhibitors. Examples include, but are not limited to, individuals obtained by crossing with susceptible varieties. Since sensitivity to 4-HPPD inhibitors is inherited recessively, in order for individuals obtained by mating to be sensitive to 4-HPPD inhibitors, the HIS1 gene sensitive to 4-HPPD inhibitors must be homologous. It is preferable to possess.
  • Koshihikari / Habataki Chromosome Fragment Replacement Line and Tatsugata // Tatsugata / Momiroman BC1F4 were used. That is, the Koshihikari / Habataki chromosome fragment substitution line group (KHSL) in which the resistant cultivar Koshihikari was genetically replaced and part of its chromosomal fragment was replaced with the chromosome of the Indian type susceptible cultivar Habataki was analyzed.
  • KHSL Koshihikari / Habataki chromosome fragment substitution line group
  • KHSL is composed of 32 strains, and analysis of all 12 chromosomes of Habataki is possible (for KHSL, Kazuyoshi Murata et al., “Chromosome fragment of Indian variety Habataki with Koshihikari as genetic background) (See “Creation and Evaluation of Substitution Lines”, Breeding Research, March 27, 2009, Vol. 11, No. 1, page 66).
  • Tos17 a retrotransposon discovered in rice, is activated by tissue culture and transfers its copy into the genome. It is known that when a transfer destination is inside a gene, the gene is destroyed and causes mutation (Hirochika et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 7783-7788. Page).
  • a rice population (mutant panel, database name: Tos17 mutant panel database (http://tos.nias.affrc.go.jp) that accumulated mutations produced by tissue culture using this phenomenon was used. / ⁇ Miyao / pub / tos17 /)) was used.
  • kanamycin resistance gene (NPT2) driven by nos promoter or hygromycin resistance gene (mHPT) driven by CaMV35S promoter and AK065581 (HIS1 gene) or AK241948 (HSL1 gene) driven by CaMV35S promoter
  • NPT2 kanamycin resistance gene
  • mHPT hygromycin resistance gene driven by CaMV35S promoter
  • AK065581 HIS1 gene
  • HSL1 gene AK241948 driven by CaMV35S promoter
  • Agrobacterium is cultured in a liquid medium containing antibiotics (LB or YEB), and after about 16 hours, 2 ml of the culture solution is added to the liquid medium containing antibiotics (LB or YEB). Cultured at last. After about 16 hours, the culture solution was centrifuged at 4 ° C. and 8000 rpm for 10 minutes, the supernatant was discarded, and the resulting precipitate was suspended in 500 ml of a solution containing 5% sucrose.
  • a transformation reagent silwet (registered trademark: SILWET L-77, product number: BMS-SL7755, manufactured by Biomedical Science) was added to a final concentration of 0.025%.
  • silwet registered trademark: SILWET L-77, product number: BMS-SL7755, manufactured by Biomedical Science
  • Arabidopsis from which flower buds that had already flowered and pollinated were removed was immersed in the obtained Agrobacterium suspension for 30 to 120 seconds. Then, after leaving still for about 16 hours, the plant body was grown and the seed was obtained.
  • the seeds were germinated in an agar medium containing 0.3 ⁇ M benzobicyclon (BBC) in an incubator at 25 ° C., whitening of the leaf portion can be clearly confirmed after about 2 weeks.
  • BBC benzobicyclon
  • PCR Primers that specifically amplify within each of the five exon regions of HIS1 (AK065581) were designed and subjected to PCR. In addition, PCR was performed in 35 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds using a primer having the base sequence shown in Table 1.
  • template DNA genomic DNA extracted from the leaves of BBC-sensitive rice varieties (Momiroman, Takanari, Kasaras) and BBC-resistant rice varieties (Nippon Hare, Koshihikari, Hokuriku No. 193) using the CTAB method was used.
  • Example 1 Identification of 4-HPPD Inhibitor Resistance Locus No cultivar having sensitivity to BBC, which is a kind of 4-HPPD inhibitor, is known among japonica rice. On the other hand, BBC sensitivity may appear in rice varieties bred by crossing Japonica and Indica types.
  • the rice gene having the highest homology with the known gene encoding the HPPD enzyme whose activity is inhibited by BBC is located on the short arm of chromosome 2, but was identified by QTL analysis. It was different from the gene locus (see Fig. 8).
  • Example 2 Identification of 4-HPPD inhibitor resistance gene
  • the gene that determines resistance to 4-HPPD inhibitor is on the short arm of rice chromosome 2. Therefore, paying attention to a gene presumed to be an iron / ascorbic acid-dependent oxidoreductase gene at this locus, the Tos17 insertion line was tested to clarify the linkage relationship between the phenotype (BBC hypersensitive) and the genotype. And A. of BBC sensitivity. A recombinant in which the gene was introduced into thaliana and rice was produced, and the effect of imparting BBC resistance was investigated.
  • the BBC resistance-determining gene locus identified by QTL analysis includes a gene presumed to be an iron / ascorbic acid-dependent oxidoreductase (hereinafter referred to as “target gene”), as well as the HPPD enzyme whose activity is inhibited by BBC. (See Table 4).
  • the original cultivar “Nipponbare” of the Tos17 insertion line is a BBC-resistant cultivar, but BBC-sensitive individuals appear in the line in which Tos17 is inserted into the transcription site of the target gene.
  • the phenotype (BBC sensitivity) and genotype (Tos17 insertion homotype) were examined by linkage analysis using a total of 30 individuals. As a result, all progenies of Tos17 insertion homo6 individuals showed BBC sensitivity. All BBC-sensitive individuals were isolated from the progeny of 18 Tos17-inserted heterozygous individuals. From these results, it was suggested that a gene presumed to be an iron / ascorbic acid oxidoreductase gene is deeply involved in BBC resistance.
  • the target gene is a BBC resistance gene
  • whitening occurs in an agar medium containing 0.03 ⁇ M BBC.
  • a recombinant (T2 generation) in which the target gene was introduced into thaliana (ecotype Columbia) was prepared, and the growth status of this recombinant in the presence of the BBC concentration was examined. The obtained results are shown in FIG.
  • a recombinant (T0 generation) in which the target gene was introduced into a BBC-sensitive rice variety “Kanto 239” that whitens on an agar medium containing 0.1 ⁇ M BBC was prepared, and 300 ga. i. The growth status of this recombinant in the soil treated with BBC / ha was examined. The obtained result is shown in FIG.
  • a recombinant in which the target gene was introduced into a BBC-sensitive rice variety “Kanto 239” that was whitened on an agar medium containing 0.1 ⁇ M BBC was prepared, and T1 seed or T2 seed was obtained. These were seeded on an agar medium containing 2 ⁇ M BBC to examine the growth status of the recombinants.
  • the obtained results are shown in FIG.
  • the seeds were sown in an agar medium containing 1 ⁇ M mesotrione, 2.5 ⁇ M tefryltrione, 0.5 ⁇ M tembotrione or 1 ⁇ M NTBC, and the growth status of the recombinant was examined.
  • the obtained results are shown in FIGS.
  • the rice recombinant into which the target gene has been introduced contains a triketone 4-HPPD inhibitor (mesotrione, tefryltrione, tembotrione or NTBC) other than BBC. It grew without whitening even in the medium containing it. That is, the rice recombinant into which the target gene was introduced grew without whitening on an agar medium treated with 1 ⁇ M mesotrione, 2.5 ⁇ M tefryltrione, 0.5 ⁇ M tembotrione, or 1 ⁇ M NTBC.
  • a triketone 4-HPPD inhibitor mesotrione, tefryltrione, tembotrione or NTBC
  • the target gene is a 4-HPPD inhibitor resistance gene (HIS1 gene), that is, a DNA encoding a protein having an activity to confer resistance to a 4-HPPD inhibitor to a plant. .
  • HIS1 gene 4-HPPD inhibitor resistance gene
  • Example 3 Determination of resistance or sensitivity to 4-HPPD inhibitor by nucleotide sequence analysis of HIS1 gene
  • the HIS1 gene in Japanese rice chromosome 2 was identified, but when PCR was performed to amplify the HIS1 gene, Amplification products can also be obtained in BBC-sensitive rice varieties. Further, among the BBC-sensitive rice varieties, it may be difficult to determine the sensitivity and resistance of Kasalath depending on the BBC treatment conditions. Therefore, it was examined whether or not it was possible to determine the relationship between the base sequence of the HIS1 gene and the degree of BBC sensitivity by PCR that amplifies a specific region of the HIS1 gene.
  • Momiroman, Takanari, and Kasalath are all BBC-sensitive varieties, but their levels are different, and Momiroman and Takanari have a stronger BBC sensitivity compared to BBCs of Kasalath. I have confirmed.
  • Example 4 Analysis of genes having homology with HIS1 gene
  • genes having homology with the HIS1 gene were searched in a database. That is, a tBLASTN search (default setting) was performed using NCBI Blast, using the amino acid sequence of the protein encoded by the HIS-1 gene as a query.
  • the search target data is nr / nt (non-redundant nucleotide collection).
  • HIS1 gene rice gene having the highest homology with the HIS1 gene sits on chromosome 6 and the homology of the deduced amino acid sequence is as high as about 86% (see FIG. 19). It was also revealed that homologous genes on chromosome 6 formed a multigene group (cluster) in the vicinity.
  • the HIS1 gene is mainly expressed in leaves, but the homologous gene on chromosome 6 is mainly expressed in roots and seeds that are ripening.
  • a protein encoded by a homologous gene on chromosome 6 potentially has an activity to confer resistance to a 4-HPPD inhibitor to a plant, but its effect does not appear due to low expression in leaves.
  • HIS1 Os02g0280700
  • RiceXPro rice gene expression database / http: //rickexpro.dna.affrc.go.jp/
  • Os06g0176700 / Os06g0178500 based on the results of analyzing the expression pattern of each tissue and growth period
  • FIG. 21 shows the result of extracting the amino acid sequence of a protein having homology with HIS1 by tBLASTN analysis, performing phylogenetic tree analysis using ClustalW software based on the obtained sequence, and drawing it with TreeView software. is there.
  • Example 5 Analysis of HSL1 gene The protein having the highest homology with the HIS1 gene and the activity of conferring resistance to 4-HPPD inhibitors on the rice gene (HSL1 gene) seated on chromosome 6 It was investigated whether it was DNA which codes.
  • the rice recombinant into which the homologous gene was introduced grew on the agar medium containing 0.12 ⁇ M BBC without whitening.
  • This concentration is a concentration at which the BBC resistant variety “Nihonbare” does not whiten. From this result, it was demonstrated that the HSL1 gene is a DNA encoding a protein having an activity to confer resistance to a 4-HPPD inhibitor on a plant, like the HIS1 gene, although the degree of tolerance is low.
  • the present invention can greatly contribute to the stability and increase of the yield of useful plants.

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Abstract

　４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性イネと４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性イネとを用いたＱＴＬ解析等により、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子が、イネの第２染色体短腕に座乗する鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子（ＨＩＳ１遺伝子）であることを同定した。さらに、ＨＩＳ１遺伝子との相同遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子）が、イネの第６染色体に座乗していることも明らかにした。そして、これら遺伝子を利用して、効率的に、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物体を作出すること、および植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定することが可能であることを見出した。

Description

４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物
　本発明は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を植物に付与するための薬剤、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞、その細胞から再生された植物体、並びにそれらの製造方法に関する。また本発明は、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法、及び該判定を利用した４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物の育種方法に関する。
　バイオエタノール燃料の需要増に伴い、海外からの飼料用穀物の輸入価格が高騰し、日本国内の畜産経営を圧迫している。そこで、飼料の国内生産及び自給率の向上を目的とし、休耕田等を利用した水稲以外の転作作物の作付けが行われている。しかしながら、排水不良等の問題から、これら転作作物の栽培に適した水田には限りがあるため、飼料としてのイネの利用や、高い生産性を備えた飼料イネ専用品種（多収品種）の開発が進められている。かかる多収品種において、その特性である多収性や安定した栽培性を発揮させつつ、家畜の嗜好性や栄養価を向上させるためには、栽培田の雑草防除が重要な栽培管理技術となる（非特許文献１）。また、多収品種やイネに限らず、安定的で経済的な作物の生産には、低コストで省力的であり、簡便な雑草防除が求められており、それには選択性の高い除草剤の開発・施用が効果的であるため（非特許文献２）、施用除草剤に対する抵抗性作物の開発や栽培が必要とされている。
　一方、栽培田の雑草防除においては、低薬量で広範囲の雑草に効き、人体や環境にも影響が少ないことから、スルホニルウレア（ＳＵ）系除草剤が広く普及している。しかしながら、ＳＵ系除草剤に対して耐性を有するイヌホタルイ等の雑草の発生が確認されており、イネ等の栽培管理における問題となっている。
　昨今、かかる問題の解決策として、ベンゾビシクロン（ＢＢＣ）やメソトリオンやテフリルトリオン等のＳＵ系除草剤耐性植物にも効果を示す除草剤成分が開発され、実用化されている。ＢＢＣ、メソトリオン、テフリルトリオンはいずれも、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（４－ＨＰＰＤ）の機能を阻害する薬剤（４－ＨＰＰＤ阻害剤）であり、この酵素の機能を阻害することにより、カロチノイド合成系を間接的に阻害し、葉緑素の崩壊を引き起こすことにより、植物を白化、枯死に至らせる（図１　参照）。これら阻害剤については、食用米品種に対する安全性は十分に確認されているため、イネの栽培において急速に普及しつつある。
　しかしながら、多収品種については、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が、開発段階等において十分に検討されていなかったこともあり、多収品種である飼料用イネの７品種において、４－ＨＰＰＤ阻害剤に弱く、場合によっては枯死に至る可能性があることが報告されている（非特許文献１及び３）。
　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を確実に識別できる方法や、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を高めることができる方法が開発されれば、例えば、図２に示すように、食用米品種、飼料用米品種の輪作体系における、前年作の「こぼれ種」の発芽リスク（漏生籾、苗の問題）の制御に４－ＨＰＰＤ阻害剤を活用でき、ひいては飼料用米品種等の生産拡大が期待できる。また、これらの方法を利用することで、必要に応じてイネ等の作物の栽培の区分管理技術にも活用することができる。さらに、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を識別するマーカーとなる遺伝子が見出されば、イネを含む作物を効率的に育種することが可能となる。
　このため、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を植物に付与するための技術や、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定するための技術の開発が強く望まれている。しかしながら、これら目的を効率的に達成し得る技術は、いまだ開発されていない。
関野　景介ら、「飼料用イネ１９品種の水稲用除草剤ベンゾビシクロン感受性」、日本作物学会紀事、２００９年３月２５日、２２７巻、別号、１２０～１２１ページ Ｔｅｒｒｙ　Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．、２０１０年１１月２３日、１０７巻、４７号、２０２４０～２０２４５ページ 丸山　清明ら、「飼料用イネなどが一部の除草剤に弱いことが判明」、［ｏｎｌｉｎｅ］、２０１０年３月２６日、独立行政法人　農業・食品産業技術総合研究機構　中央農業総合研究センター、プレスリリース、［２０１０年９月２９日検索］、インターネット〈ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｎａｒｃ．ｎａｒｏ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｒｅｓｓ／ｈ２２／０３２６／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ〉
　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を効率的に植物に付与しうる技術を提供すること、および植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を効率的に判定しうる技術を提供することにある。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく、まず、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性に関与する遺伝子の同定を試みた。具体的には、本発明者らは、まず、４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性イネと４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性イネとを用いた量的遺伝子座（ＱＴＬ）解析を行った。その結果、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性決定遺伝子座がイネの第２染色体短腕に座乗していることが判明した。次いで、本発明者らは、ＱＴＬ解析で特定された遺伝子座にある鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子に、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７が挿入された日本晴系統を用いて表現型（４－ＨＰＰＤ阻害型感受性）を調査したところ、Ｔｏｓ１７挿入ホモ個体が４－ＨＰＰＤ阻害剤に感受性を示すことを見出した。見出された鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子を、シロイナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）及びイネに導入したところ、これらの形質転換植物が４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を示したことから、この遺伝子が、植物に４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性をもたらす原因遺伝子（以下、４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｇｅｎｅ　Ｎｏ．１（ＨＩＳ１）とも称する）であることが裏付けられた。また、イネのＨＩＳ１遺伝子と高い相同性を有する遺伝子は、オオムギ、ソルガム、トウモロコシなどにおいても存在していた。
　さらに、本発明者らは、ＰＣＲ解析により、４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性イネと４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性イネにおけるＨＩＳ１遺伝子の構造の比較を行った。その結果、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して感受性を示すイネ品種においては、ＨＩＳ１遺伝子の第４～５エクソンにかけて挿入や欠失が生じていたことから、ＨＩＳ１遺伝子の機能の抑制が植物に４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性をもたらすものと考えられた。
　また、イネにおいて、ＨＩＳ１遺伝子と最も相同性の高いイネ遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子）が第６染色体に座乗していることを明らかにした。さらに、このＨＳＬ１遺伝子をイネに導入したところ、この形質転換イネも、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を示すことも明らかにした。
　これら知見に基づき、本発明者らは、ＨＩＳ１遺伝子またはその相同遺伝子を利用することにより、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物体を作出することが可能であり、また、当該遺伝子を標的として、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、より詳しくは、以下のものである。
（１）　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含む、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与するための薬剤
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（２）　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞であって、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞
　（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
　（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（３）　（２）に記載の形質転換植物細胞から再生された、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体。
（４）　（３）に記載の植物体の子孫又はクローンである、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体。
（５）　（３）又は（４）に記載の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の繁殖材料。
（６）　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法であって、
　（Ｉ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入する工程と、
　（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
　（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
　（II)工程（Ｉ）において前記ＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞から植物体を再生する工程と、
を含む方法。
（７）　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含む、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与するための薬剤
（ａ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（８）　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞であって、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞
（ａ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（９）　（８）に記載の形質転換植物細胞から再生された、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体。
（１０）　（９）に記載の植物体の子孫又はクローンである、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体。
（１１）　（９）又は（１０）に記載の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体の繁殖材料。
（１２）　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体の製造方法であって、
　（Ｉ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入する工程と、
（ａ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ
　（II)工程（Ｉ）において前記ＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞から植物体を再生する工程と、
を含む方法。
（１３）　植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法であって、被験植物における下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ又はその発現制御領域の塩基配列を解析することを特徴とする方法
　（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
　（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（１４）　植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法であって、被験植物における下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡの発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする方法
　（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
　（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（１５）　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法であって、
　（ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性の植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
　（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を、（１３）または（１４）に記載の方法により判定する工程、および
　（ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
（１６）　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物を育種する方法であって、
（ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性の植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を、（１３）または（１４）に記載の方法により判定する工程、および
（ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
　本発明において同定された遺伝子を利用することにより、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物を効率的に作出することが可能となった。また、本発明において同定された遺伝子を標的として、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を効率的に判定することが可能となった。
チロシン代謝経路及びカロチノイド生合成経路と、４－ＨＰＰＤ阻害剤との概要と関連を示す図である。 食用米品種、飼料用米品種の輪作体系における、前年作の「こぼれ種」の発芽リスクの制御に関する概要を示す図である。 アグロバクテリウム法によるシロイヌナズナの形質転換に用いた、ｎｏｓプロモーター（ｎｏｓ－Ｐ）でドライブされるカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴII）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ－Ｐ）でドライブされるハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｈｙｇＲ）、及びＣａＭＶ３５ＳプロモーターでドライブされるＡＫ０６５５８１（ＨＩＳ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（ｐＩＧ１２１－Ｈｍ／ＨＩＳ１）の概要を示す図である。 アグロバクテリウム法によるシロイヌナズナ及びイネの形質転換に用いた、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ　Ｐｒｏ）でドライブされるハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｍＨＰＴ）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ　Ｐｒｏ）でドライブされるＡＫ０６５５８１（ＨＩＳ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（３５ｓＨＩＳ１　ｐＺＨ２Ｂ）の概要を示す図である。 アグロバクテリウム法によるトマトの形質転換に用いた、ｎｏｓプロモーター（ＮＯＳｐｒｏ）でドライブされるカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴ２）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ　Ｐｒｏ）でドライブされるＡＫ０６５５８１（ＨＩＳ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（３５ｓＨＩＳ１　ｐＺＫ３）の概要を示す図である。 アグロバクテリウム法によるシロイヌナズナ及びイネの形質転換に用いた、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ　Ｐｒｏ）でドライブされるハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｍＨＰＴ）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ　Ｐｒｏ）でドライブされるＡＫ２４１９４８（ＨＳＬ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（３５ｓＨＳＬ１　ｐＺＨ２Ｂ）の概要を示す図である。 アグロバクテリウム法によるトマトの形質転換に用いた、ｎｏｓプロモーター（ＮＯＳｐｒｏ）でドライブされるカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴ２）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ　Ｐｒｏ）でドライブされるＡＫ２４１９４８（ＨＳＬ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（３５ｓＨＳＬ１　ｐＺＫ３）の概要を示す図である。 イネ染色体上にあるＱＴＬ解析によって特定された４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子（ＡＫ０６５５８１）とその相同遺伝子とを示す図である。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）の４－ＨＰＰＤ阻害剤（ベンゾビシクロン（ＢＢＣ））に対する抵抗性を示す写真である。なお図中、「Ｃｏｌ」は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ野生型（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）の結果であることを示し、「♯１」及び「♯３」は、標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えシロイナズナＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）の結果であることを示す。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種：関東２３９号）の４－ＨＰＰＤ阻害剤（ベンゾビシクロン）に対する抵抗性を示す写真である。なお図中、「関東２３９号」は、関東２３９号（野生型）の結果であることを示し、「ＢＢＣ２１－２３Ｂ」及び「ＢＢＣ２１－２３Ｃ」は、標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した関東２３９号（組換えイネ）の結果であることを示す。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４－ＨＰＰＤ阻害剤（ベンゾビシクロン）に対する抵抗性を示す写真である。なお図中、「日本晴」及び「関東２３９号」は、各々日本晴（野生型）（４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種）及び関東２３９号（野生型）の結果であることを示し、「ＢＢＣ２１－１Ａ、２、３、３Ｄ、３Ｆ、３－３、９、１５」は、標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した関東２３９号（組換えイネ）の結果であることを示す（図１２～１５においても同様）。また、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｄａｔｅ」及び「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｄａｔｅ」は、各々「４－ＨＰＰＤ阻害剤を添加した固形（寒天）培地に種を播いた日」及び「該種から発育した植物体の生育状況を調べた日」を示す（図１２～１５及び２２においても同様）。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４－ＨＰＰＤ阻害剤（メソトリオン）に対する抵抗性を示す写真である。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４－ＨＰＰＤ阻害剤（テフリルトリオン）に対する抵抗性を示す写真である。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４－ＨＰＰＤ阻害剤（テンボトリオン）に対する抵抗性を示す写真である。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４－ＨＰＰＤ阻害剤（ＮＴＢＣ）に対する抵抗性を示す写真である。 各イネ品種におけるＨＩＳ１遺伝子の各エクソン領域を増幅したＰＣＲパターンを示す電気泳動写真である。なお図中、「１」は日本晴、「２」はコシヒカリ、「３」はカサラス、「４」は北陸１９３号、「５」はタカナリ、「６」はモミロマンの結果であることを示し、「Ｍ」はサイズマーカーを示す。また、「エクソン１」は配列番号：３に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号：４に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＨＩＳ１遺伝子のエクソン１の領域を示し、「エクソン２」は配列番号：５に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＨＩＳ１遺伝子のエクソン２の領域を示し、「エクソン３」は配列番号：７に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号：８に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＨＩＳ１遺伝子のエクソン３の領域を示し、「エクソン４」は配列番号：９に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号：１０に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＨＩＳ１遺伝子のエクソン４の領域を示し、「エクソン５」は配列番号：１１に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号：１２に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＨＩＳ１遺伝子のエクソン５の領域を示す。また、「エクソン４前半」は配列番号：１３に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号：１４に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＨＩＳ１遺伝子のエクソン４内部の前半領域を示す。さらに図中、矢頭はそれぞれ１００ｐｂ、２００ｂｐ、５００ｂｐの大きさであることを示す。 日本晴のＨＩＳ１遺伝子と、モミロマン及びタカナリの対応遺伝子との構造を比較した結果を示す概要図である。 日本晴のＨＩＳ１遺伝子と、カサラスの対応遺伝子との構造を比較した結果を示す概要図である。 ＨＩＳ１遺伝子とその相同遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子）、各々がコードするタンパク質のアミノ酸配列を比較し、相同性を示す図である。 ＨＩＳ１遺伝子が座乗する遺伝子座（第２染色体）とその相同遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子：Ｏｓ０６ｇ０１７６７００／Ｏｓ０６ｇ０１７８５００）が座乗する遺伝子座（第６染色体）との各組織における発現パターンを示す図である。 ＨＩＳ１遺伝子及びその相同遺伝子は、イネ科（単子葉）植物に固有の遺伝子群に属することを示す系統樹である。なお、図中の「ＨＳＬ」は、「ＨＩＳ１－ＬＩＫＥ」の略称であり、ＨＩＳ１の相同遺伝子であることを示す。 ＨＩＳ１遺伝子と高い相同性をもつ遺伝子（ＨＳＬ１；ＡＫ２４１９４８）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４－ＨＰＰＤ阻害剤（ベンゾビシクロン）に対する抵抗性を示す写真である。なお図中、「関東２３９号」は、関東２３９号（野生型）の結果であることを示し、「２３－１」、「２３－２１」及び「２３－２５」は、相同遺伝子（ＡＫ２４１９４８）を導入した関東２３９号（組換えイネ）の結果であることを示す。
　＜４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与するための薬剤＞
　本発明の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与するための薬剤は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の抵抗性ＤＮＡと称することがある）、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含むことを特徴とする。
　本発明における「４－ＨＰＰＤ阻害剤」とは、４－ＨＰＰＤ（４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ）の機能を阻害する薬剤（４－ＨＰＰＤ阻害剤）を意味する。４－ＨＰＰＤ阻害剤は、図１に示すように、４－ＨＰＰＤの機能を阻害することにより、カロチノイド合成系を間接的に阻害し、葉緑素の崩壊を引き起こして植物を白化させ、枯死に至らせる。本発明における「４－ＨＰＰＤ阻害剤」としては、例えば、ベンゾビシクロン（ＢＢＣ）、メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン、（２－ニトロ－４－トリフルオロメチルベンゾイル）－シクロヘキサン－１，３ジオン（２－（２－ｎｉｔｒｏ－４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１，３－ｄｉｏｎｅ；ＮＴＢＣ）といったトリケトン系４－ＨＰＰＤ阻害剤、ピラゾレート、ベンゾフェナップ、ピラゾキシフェンといったピラゾール系４－ＨＰＰＤ阻害剤が挙げられる。本発明の抵抗性ＤＮＡを用いて植物に抵抗性を付与する対象となる４－ＨＰＰＤ阻害剤としては、ＢＢＣ、メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン、ＮＴＢＣといったトリケトン系４－ＨＰＰＤ阻害剤が好ましく、ＢＢＣが特に好ましい。
　なお、前述の４－ＨＰＰＤ阻害剤といった除草剤は、その成分が化合物としてきわめて多様であるが、作用機序の面から、下記の通り、いくつかのグループに分類できる（「農薬からアグロバイオギュレーター－病害虫雑草制御の現状と将来」、日本、シーエムシー出版、２０１０年１月　参照）。
(I)　アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害型除草剤
脂質合成の最初の段階に関与するＡＣＣａｓｅを阻害するこの除草剤グループは、細胞膜合成を阻害し、植物を生育障害に至らしめる。このグループに属する除草剤はさらに（１）４－アリールオキシフェノキシプロピオン酸系、（２）シクロヘキサンジオン・オキシム系、（３）ジオン系に分類される。
(II)　アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害型除草剤
ＡＬＳを標的とするこの除草剤のグループは、ＡＬＳ活性を阻害し分岐アミノ酸生成を阻害することで、植物を生育障害に至らしめる。このグループに属する除草剤はさらに（１）スルホニルウレア系、（２）トリアゾリノン系、（３）トリアゾロピリミジン系、（４）ピリミジニルサリチル酸系、（５）イミダゾリノン系に分類される。
(III)　４－ＨＰＰＤ代謝阻害型除草剤
チロシン代謝経路の４－ＨＰＰＤ代謝を阻害するこの除草剤グループは、植物のカロテノイド合成系を間接的に阻害し、植物を白化・枯死に至らしめる。このグループに属する除草剤はさらに（１）シクロヘキサンジオン系、（２）ピラゾール系、（３）ビシクロ系（４）、イソオキサゾール系、（５）トリケトン系に分類される。また、（１）シクロヘキサンジオン系としては、例えばベンゾイルシクロヘキサン－１，３－ジオン誘導体が挙げられ、（２）ピラゾール系としては、例えば、ピラゾレート、ベンゾフェナップ、ピラゾキシフェンが挙げられ、（３）ビシクロ系としては、例えば、３－置換ベンゾイル－ビシクロ［４、１、０］ヘプタン－２、４－ジオン誘導体が挙げられ、（４）イソオキサゾール系としては、例えばイソオキサフルトールが挙げられ、（５）トリケトン系としては、例えば、ＢＢＣ、メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオンが挙げられる。
（IV)　プロトポルフィリノーゲン－IXオキシダーゼ（ＰＰＯ）阻害剤除草剤
このグループの除草剤は葉緑素合成を阻害し、細胞膜崩壊から枯死に至らしめる。このグループに属する除草剤はさらに（１）ジフェニルエーテル系、（２）ジアリル系、（３）ピラゾール系に分類される。
（V)　超長鎖脂肪酸伸長酵素（ＶＬＣＦＡＥ）阻害型除草剤
このグループの除草剤は植物脂質生合成系のうちＣ２０以上の超長鎖脂肪酸生合成系酵素を阻害し、植物を枯死に至らしめる。
（VI)　フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）阻害型除草剤
カロテノイド生合成経路のＰＤＳ酵素を阻害するこの除草剤グループは、植物の葉緑素崩壊を引き起こし、植物を白化・枯死に至らしめる。
（VII)　ＰＳ　II阻害型除草剤
このグループの阻害剤は、プラストキノン（ＰＱ）に結合し、その結果ＰＱが関わる光化学系　II（ＰＳ　II）から光化学系　I（ＰＳ　I）への電子伝達が阻害され、植物体内での炭素固定機能が不能となり植物が枯死する。
（VIII)　合成オーキシン型除草剤
このグループの阻害剤は、植物体内に低濃度で存在し植物の生長を調節する天然オーキシンのように振る舞い、植物の分化・成長が不正常となり結果的に枯死する。
（IX)　ＥＰＳＰ合成酵素（ＥＰＳＰＳ）阻害型除草剤
このグループの阻害剤は、シキミ酸回路のＥＰＳＰＳと結合し、ＥＰＳＰの合成を阻害する。その結果トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンが生合成されず、植物は枯死する。
　本発明の抵抗性ＤＮＡの例として、日本晴由来の鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子（ＨＩＳ１遺伝子；Ｏｓ０２ｇ０２８０７００）の塩基配列を配列番号：１に、前記ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
　また、本発明の抵抗性ＤＮＡの別の例として、日本晴由来の遺伝子（ＨＩＳ１－ＬＩＫＥ（ＨＳＬ）１遺伝子；Ｏｓ０６ｇ０１７６７００／Ｏｓ０６ｇ０１７８５００（ＡＫ２４１９４８）の塩基配列を配列番号：１６に、前記ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１７に示す。
　本発明の抵抗性ＤＮＡの1つの態様は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（典型的には、配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ）である。
　また、本発明の抵抗性ＤＮＡの別の態様は、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（典型的には、配列番号：１６に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ）である。
　現在の技術水準においては、当業者であれば、かかるＤＮＡの塩基配列情報が得られた場合、その塩基配列に対して種々の改変を行い、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする変異遺伝子の製造を行うことが可能である。また、自然界においても、塩基配列が変異することは起こり得ることである。従って、本発明の抵抗性ＤＮＡには、前記活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ここで「複数」とは、ＨＩＳ１タンパク質又はＨＳＬ１タンパク質のアミノ酸配列全体においては、通常、５０アミノ酸以内、好ましくは３０アミノ酸以内、より好ましくは１０アミノ酸以内、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
　さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の抵抗性ＤＮＡが得られた場合、そのＤＮＡの塩基配列情報を利用して、同種若しくは他の植物から、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする相同遺伝子を単離することが可能である。このような相同遺伝子を取得するための植物としては、単子葉植物が好ましく、イネ科植物が特に好ましい。イネ科植物としては、例えば、イネ（例えば、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種である、日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陸１９３号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ）、オオムギ、ソルガム、トウモロコシなどが挙げられる。
　相同遺伝子を取得するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１，１９８８）が挙げられる。相同遺伝子を単離するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ　尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用いれば、より相同性の高い遺伝子の単離を期待することができる。本発明の抵抗性ＤＮＡには、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡが含まれる。
　取得された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の配列の相同性である。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。本発明の抵抗性ＤＮＡには、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡとしては、例えば、オオムギ由来の遺伝子（ＨｖＨＣＰ１（ＡＦ５２７６０６））、トウモロコシ由来の遺伝子（ＺｍＨＳＬ１（ＢＴ０６２８４２）、ＺｍＨＳＬ２（ＮＭ＿００１１５３４６４））、ソルガム由来の遺伝子（ＳｂＨＳＬ１（ＸＭ＿００２４３６５４６））が挙げられる（図２１　参照）。
　特定の遺伝子がコードするタンパク質が４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するか否かは、例えば、後述の実施例に記載するように、当該遺伝子を植物に導入することにより、作出した植物に前記抵抗性が付与されているか否かを検定することにより判定することができる（実施例２　参照）。すなわち、０．０３μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ：エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）を用いる場合においては、前記遺伝子をシロイヌナズナに導入することにより作出した形質転換体が、前記ＢＢＣ濃度の存在下において白化せずに生育できれば、前記遺伝子がコードするタンパク質は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有していると判定できる。また、０．１μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＢＢＣ感受性イネ品種「関東２３９号」を用いる場合においては、前記遺伝子を関東２３９号に導入することにより作出した形質転換体が、前記ＢＢＣ濃度の存在下において白化せずに生育できれば、前記遺伝子がコードするタンパク質は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有していると判定できる。さらに、ＢＢＣ以外のトリケトン系４－ＨＰＰＤ阻害剤（メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン、ＮＴＢＣ等）を用いる場合においては、前記遺伝子を関東２３９号に導入することにより作出した形質転換体が、１μＭのメソトリオン、２．５μＭのテフリルトリオン、０．５μＭのテンボトリオン又は１μＭのＮＴＢＣの存在下において白化せずに生育できれば、前記遺伝子がコードするタンパク質は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有していると判定できる。
　本発明の抵抗性ＤＮＡとしては、その形態に特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。これらＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、植物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作成し、これを展開して、ＨＩＳ１遺伝子（例えば、配列番号：１に記載のＤＮＡ）又はＨＳＬ１遺伝子（例えば、配列番号：１６に記載のＤＮＡ）の塩基配列を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、ＨＩＳ１遺伝子又はＨＳＬ１遺伝子に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、植物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。また、市販のＤＮＡ合成機を用いれば、目的のＤＮＡを合成により調製することも可能である。
　＜４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与するための薬剤＞
　また、本発明は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与するための薬剤を提供する。後述の実施例において示す通り、ＨＩＳ１遺伝子がコードするタンパク質の機能が抑制されることにより、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が抑制される。従って、本発明の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与するための薬剤は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含むことを特徴とする。
　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡの一つの態様は、上記した内因性の本発明の抵抗性ＤＮＡの転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）をコードするＤＮＡである。標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するｄｓＲＮＡを細胞内に導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内因性遺伝子の発現がいずれも抑制される、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉、ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と呼ばれる現象を引き起こすことができる。細胞に約４０～数百塩基対のｄｓＲＮＡが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅIII様のヌクレアーゼが、ＡＴＰ存在下で、ｄｓＲＮＡを３’末端から約２１～２３塩基対ずつ切り出し、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ＲＮＡ）が生じる。このｓｉＲＮＡに、特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体はｓｉＲＮＡと同じ配列を認識して結合し、ＲＮａｓｅIII様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部で標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）を切断する。また、この経路とは別にｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｓＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成される。このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となって、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅する経路も考えられている。
　本発明のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子、すなわち内因性の本発明の抵抗性ＤＮＡの転写産物（ｍＲＮＡ）のいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスＤＮＡと、該ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスＤＮＡを含み、該アンチセンスＤＮＡおよび該センスＤＮＡより、それぞれアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させることができる。また、これらのアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡよりｄｓＲＮＡを作成することができる。
　本発明のｄｓＲＮＡの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを発現させる場合がある。同一のベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよびセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入する構成である。
　また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスＤＮＡとセンスＤＮＡとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスＲＮＡコード鎖とセンスＲＮＡコード鎖とが対となった一つの二本鎖ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡコードＤＮＡ）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとを発現し得るようにプロモーターを対向して備える。この場合には、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスＲＮＡコード鎖、センスＲＮＡコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、Ａ（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類は異なっていることが好ましい。
　また、異なるベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよびセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットとをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させる構成である。
　本発明に用いるｄｓＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡが好ましい。「ｓｉＲＮＡ」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味する。標的遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ、その鎖長に特に制限はない。ｄｓＲＮＡの鎖長は、例えば、１５～４９塩基対であり、好適には１５～３５塩基対であり、さらに好適には２１～３０塩基対である。
　本発明のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列（イントロン配列が望ましい）を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドＲＮＡ（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ'ｈａｉｒｐｉｎ'　ＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ））を作るようなコンストラクト（Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４０７：３１９，２０００、Ｗｅｓｌｅｙ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ．２７：５８１，２００１、Ｐｉｃｃｉｎ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２９：Ｅ５５，２００１）を用いることもできる。
　本発明のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は上述した手法（ＢＬＡＳＴプログラム）により決定できる。
　ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。
　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡの他の態様は、内因性の本発明の抵抗性ＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）である。アンチセンスＤＮＡが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などが挙げられる。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座２　核酸IV　遺伝子の複製と発現」、日本生化学会編，東京化学同人、ｐｐ．３１９－３４７、１９９３）。本発明で用いられるアンチセンスＤＮＡは、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、標的遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。
　アンチセンスＤＮＡは、本発明の抵抗性ＤＮＡ（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）の配列情報を基にホスホロチオネート法（Ｓｔｅｉｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６：３２０９－３２２１，１９８８）などにより調製することが可能である。調製されたＤＮＡは、後述する公知の方法で、植物へ導入できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、植物が持つ内因性の本発明の抵抗性ＤＮＡの転写産物と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有する。効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡの他の態様は、内因性の本発明の抵抗性ＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡである。リボザイムには、グループIイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素，３５：２１９１，１９９０）。
　例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５のＣ１５の３’側を切断するが、活性にはＵ１４が９位のＡと塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣの他にＡまたはＵでも切断されることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ　ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２２８：２２５，１９８８）。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することが可能である（Ｋｏｉｚｕｍｉ　ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２３９：２８５，１９８８、小泉誠および大塚栄子，蛋白質核酸酵素，３５：２１９１，１９９０、Ｋｏｉｚｕｍｉ　ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７０５９，１９８９）。
　また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，Ｎａｔｕｒｅ　３２３：３４９，１９８６）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ　ａｎｄ　Ｓａｓａｋｉ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：６７５１，１９９２、菊池洋，化学と生物　３０：１１２，１９９２）。標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８６：１２７１，１９９２）。このようなリボザイムを用いて標的となる内因性の本発明の抵抗性ＤＮＡの転写産物を特異的に切断し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる。
　＜本発明にかかるＤＮＡが挿入されるベクター＞
　上記本発明のＤＮＡ（本発明の抵抗性ＤＮＡ、又は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ）が挿入されるベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。本発明にかかるベクターは、本発明のＤＮＡを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーターなどが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーターやタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ８０遺伝子とｈｓｐ７２遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、ｒａｂ１６は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
　本発明の薬剤は、本発明のＤＮＡや該ＤＮＡが挿入されたベクター自体であってもよく、他の成分が混合されているものであってもよい。このような他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤が挙げられる。また、後述のアグロバクテリウムを介する方法により本発明の形質転換植物細胞を調製する場合においては、前記ＤＮＡが導入されたアグロバクテリウムを含有するものであってもよい。
　＜本発明の形質転換植物細胞＞
　本発明の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードし、前記本発明の抵抗性ＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入されることにより形質転換された植物細胞である。
　また、本発明の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入されることにより形質転換された植物細胞である。
　本発明の植物細胞の由来する植物としては特に制限はなく、例えば、イネ、オオムギ、コムギ、ソルガム、トウモロコシ、クリーピングベントグラスなどのイネ科植物、シロイヌナズナなどのアブラナ科植物、トマトなどのナス科植物、ダイズ、アルファルファ、ミヤコグサなどのマメ科植物、ワタなどのアオイ科植物、テンサイ等のアカザ科植物が挙げられる。
　これら植物において、特に、４－ＨＰＰＤ阻害剤に感受性の品種が、本発明の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を高める適用対象として好ましい。４－ＨＰＰＤ阻害剤に感受性のイネ品種としては、例えば、ハバタキ、タカナリ、モミロマン、ミズホチカラ、ルリアオバ、おどろきもち、兵庫牛若丸、カサラス、関東２３９号、が挙げられるが、これらに制限されない。
　また、これら植物において、特に、４－ＨＰＰＤ阻害剤に抵抗性の品種が、本発明の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を高める適用対象として好ましい。４－ＨＰＰＤ阻害剤に抵抗性のイネ品種としては、例えば、日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陸１９３号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカが挙げられるが、これらに制限されない。
　本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉などが含まれる。
　植物細胞へ本発明の抵抗性ＤＮＡが挿入されたベクターを導入する方法としては、例えば、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
　＜本発明の植物体、およびその繁殖材料、並びに前記植物体の製造方法＞
　本発明は、前記形質転換植物細胞から再生された植物体（以下、形質転換植物体とも称する）を提供する。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
　例えば、イネにおいて、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．Ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｔｏ　Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　Ｉ　ａｎｄ　Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ　Ｅｄｓ．）ｐｐ６６－７４，１９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００，１５０３－１５０７，１９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７－９６２，１９９１）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ．６：２７１－２８２，１９９４）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。
　また、オオムギに関する形質転換植物体を作出する手法としては、Ｔｉｎｇａｙら（Ｔｉｎｇａｙ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１１：１３６９－１３７６，１９９７）、Ｍｕｒｒａｙら（Ｍｕｒｒａｙ　Ｆ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　２２：３９７－４０２，２００４）、およびＴｒａｖａｌｌａら（Ｔｒａｖａｌｌａ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　２３：７８０－７８９，２００５）に記載された方法を挙げることができる。
　ソルガム植物体を再生させる方法としては、例えば、アグロバクテリウム法やパーティクルガン法により、未熟胚やカルスに遺伝子導入して植物体を再生させる方法、超音波によって遺伝子導入した花粉を用いて受粉する方法が好適に用いられる（Ｊ．Ａ．Ａｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７：３４１－３４８，２００１、Ａ．Ｍ．Ｃａｓａｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１１２１２－１１２１６，１９９３、Ｖ．Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　２４：５１３－５２２，２００５、Ｊ．Ｍ．ＪＥＯＵＮＧ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ　１３７：２０－２８，２００２、Ｖ　Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　２４（９）：５１３－５２２，２００５、Ｚｕｏ－ｙｕ　Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４４：７８９－７９８，２０００、Ｓ．Ｇｕｒｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　２８（３）：４２９－４４４，２００９、ＺＹ　Ｚｈａｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　３４３：２３３－２４４，２００６、ＡＫ　Ｓｈｒａｗａｔ　ａｎｄ　Ｈ　Ｌｏｒｚ，Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｊ，４（６）：５７５－６０３，２００６、Ｄ　Ｓｙａｍａｌａ　ａｎｄ　Ｐ　Ｄｅｖｉ　Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ，４１（１２）：１４８２－１４８６，２００３、Ｚ　Ｇａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｊ，３（６）：５９１－５９９，２００５）。
　さらに、シロイヌナズナであれば、Ａｋａｍａら（Ａｋａｍａ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１２：７－１１，１９９２）の方法が挙げられ、本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
　一旦、ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。従って、本発明には、本発明のＤＮＡが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
　また、本発明は、（Ｉ）前記本発明の抵抗性ＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入する工程、および（II)工程（Ｉ）において前記ＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞から植物体を再生する工程を含むことを特徴とする、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法をも提供するものである。
　さらに、本発明は、（Ｉ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入する工程、および（II)工程（Ｉ）において前記ＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞から植物体を再生する工程、を含むことを特徴とする、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体の製造方法をも提供するものである。
　＜植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法＞
　本発明の、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法は、被験植物における、本発明の抵抗性ＤＮＡ若しくは対応する感受性ＤＮＡ（以下、本発明の検出対象ＤＮＡと称する）、又はその発現制御領域の塩基配列を解析することを特徴とする。なお、「感受性ＤＮＡ」とは４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡのことである。
　本発明の検出対象ＤＮＡは、典型的には、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡである。
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
　なお、（ａ）から（ｄ）におけるＤＮＡの意味は、原則として、前記の通りであるが、本発明の検出対象ＤＮＡにおいては、特に、内因性のＤＮＡを意味し、また、抵抗性ＤＮＡおよび感受性ＤＮＡの双方が含まれる意味である。
　後述の実施例において示すように、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種である日本晴におけるＨＩＳ１遺伝子と比較して、４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種であるモミロマン、タカナリ、カサラスにおける対応遺伝子の配列においては、塩基の挿入や欠失が認められる。従って、本発明の検出対象ＤＮＡの塩基配列を解析することによって、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定することができる。
　また、後述の実施例において示すように、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性は劣性遺伝することから、本発明の検出対象ＤＮＡの発現量、並びにその発現量を制御する領域（エンハンサー、プロモータ－、サイレンサー、インスレーター）の塩基配列を解析することによって、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定することもできる。
　本発明の検出対象ＤＮＡ又はその発現制御領域の塩基配列の解析に際しては、本発明の検出対象ＤＮＡまたはその発現制御領域をＰＣＲにより増幅した増幅産物を用いることができる。前記ＰＣＲを実施する場合において、用いられるプライマーは、本発明の検出対象ＤＮＡまたはその発現制御領域を特異的に増幅できるものである限り制限はなく、本発明の検出対象ＤＮＡまたはその発現制御領域の配列情報（例えば、配列番号：１）に基づいて適宜設計することができる。好適なプライマーとしては、配列番号：１３に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：１４記載の塩基配列からなるプライマーが挙げられる。これらプライマーを適宜組み合わせて、本発明の検出対象ＤＮＡまたはその発現制御領域の特定の塩基配列を増幅することができる。
　なお、被験植物の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性の判定においては、例えば、「対照の塩基配列」と比較する工程を含むことができる。被験植物における本発明の検出対象ＤＮＡ又はその発現制御領域の塩基配列と比較する「対照の塩基配列」は、イネであれば、典型的には、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種（例えば、日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陸１９３号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ）または４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種（例えば、ハバタキ、タカナリ、モミロマン、ミズホチカラ、ルリアオバ、おどろきもち、兵庫牛若丸、カサラス、関東２３９号）における本発明の検出対象ＤＮＡ又はその発現制御領域の塩基配列である。
　なお、本発明の感受性ＤＮＡの例として、タカナリ又はモミロマン由来の鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子（変異ＨＩＳ１遺伝子）の塩基配列を配列番号：１５に示す。
　決定した被験植物における本発明の検出対象ＤＮＡ又はその発現制御領域の塩基配列と、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種におけるそれらの塩基配列（例えば、配列番号：１、配列番号：１６）または４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種におけるそれらの塩基配列（例えば、配列番号：１５）とを比較することにより、被験植物が４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有するか感受性を有するかを評価することができる。例えば、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種における塩基配列（例えば、配列番号：１）と比較して、塩基配列において大きな相違がある場合（特に、新たな終止コドンの出現やフレームシフトにより、コードするタンパク質の分子量やアミノ酸配列に大きな変化が生じる場合）、被験植物は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して感受性を有している蓋然性が高いと判定される。
　なお、本発明の判定方法における、被験植物からのＤＮＡの調製は、常法、例えば、ＣＴＡＢ法を用いて行うことができる。ＤＮＡを調製するための植物としては、成長した植物体のみならず、種子や幼植物体を用いることもできる。また、塩基配列の決定は、常法、例えば、ジデオキシ法やマキサム-ギルバート法などにより行なうことができる。塩基配列の決定においては、市販のシークエンスキットおよびシークエンサーを利用することができる。
　被験植物における本発明の検出対象ＤＮＡまたはその発現制御領域の塩基配列が、対照の塩基配列と相違するか否かは、上記した直接的な塩基配列の決定以外に、種々の方法により間接的に解析することができる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用したＲＦＬＰ法やＰＣＲ－ＲＦＬＰ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法が挙げられる。
　本発明の、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する別の方法は、被験植物における前記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡの発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする。
　後述の実施例において示すように、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種である日本晴、コシヒカリ、北陸１９３号におけるＨＩＳ１遺伝子の第４エクソン前半領域は、４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種であるモミロマンやタカナリにおけるそれらよりも長い。従って、本発明の検出対象ＤＮＡの増幅産物または発現産物の分子量を検出することによって、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定することができる。
　また、後述の実施例において示すように、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性は劣性遺伝することから、本発明の検出対象ＤＮＡの発現を検出することによって、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定することができる。
　ここで「ＤＮＡの発現の検出」には、転写レベルにおける検出および翻訳レベルにおける検出の双方を含む意である。また、「発現の検出」には、発現の有無の検出のみならず、発現の程度の検出も含む意である。
　本発明の検出対象ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）の増幅は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により実施することができる。
　本発明にかかるＤＮＡの転写レベルにおける検出は、常法、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やノーザンブロッティング法により実施することができる。前記ＰＣＲを実施する場合において用いられるプライマーは、本発明の検出対象ＤＮＡを特異的に増幅できるものである限り制限はなく、既に決定された本発明の抵抗性ＤＮＡ若しくは感受性ＤＮＡの配列情報（例えば、配列番号：１、配列番号：１６、配列番号：１５）に基づいて適宜設計することができる。好適なプライマーとしては、配列番号：３～１４のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーが挙げられる。また、これらプライマーを適宜組み合わせて、本発明の検出対象ＤＮＡの特定の塩基配列を増幅することができる。
　一方、翻訳レベルにおける検出は、常法、例えば、ウェスタンブロッティング法により、実施することができる。ウェスタンブロッティングに用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これら抗体の調製方法は、当業者に周知である。
　また、本発明の検出対象ＤＮＡの発現は、本発明の検出対象ＤＮＡの発現制御領域の下流にレポーター遺伝子を発現可能に連結したベクターを構築し、当該ベクターを植物細胞に導入し、レポーター活性を検出することにより、判定することもできる。
　遺伝子発現の検出の結果、被験植物において、本発明の検出対象ＤＮＡの発現量が４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種（例えば、イネにおいては、日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陸１９３号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ）の発現量よりも有意に低ければ（例えば、本発明の検出対象ＤＮＡが実質的に発現していなければ）、また、本発明の検出対象ＤＮＡの増幅産物または発現産物の分子量が４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種（例えば、日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陸１９３号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ）における分子量と有意に異なれば、被験植物は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して感受性を有している蓋然性が高いと判定される。実際、後述の実施例において示すように４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種（日本晴、コシヒカリ、北陸１９３号）の抵抗性ＤＮＡと比較して、４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種（モミロマン、タカナリ）における感受性ＤＮＡの分子量は有意に小さい。
　＜本発明の植物を育種する方法＞
　本発明は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法を提供する。かかる育種方法は、（ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性の植物品種と任意の植物品種とを交配させる工程、（ｂ）交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を、上記本発明の判定方法により判定する工程、および（ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性を有すると判定された品種を選抜する工程を含む。
　また、本発明は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物を育種する方法を提供する。かかる育種方法は、（ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性の植物品種と任意の植物品種とを交配させる工程、（ｂ）交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を、上記本発明の判定方法により判定する工程、および（ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性を有すると判定された品種を選抜する工程を含む。
　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性の植物品種と交配させる「任意の植物品種」としては、例えば、４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種と４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種との交配により得られた個体が挙げられるが、これらに制限されない。また、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性の植物品種と交配させる「任意の植物品種」としては、例えば、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種と４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種との交配により得られた個体が挙げられるが、これらに制限されない。４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性は劣性遺伝することから、交配により得られた個体が４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性を示すためには、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性型のＨＩＳ１遺伝子をホモで保有することが好ましい。
　本発明の育種方法を利用すれば、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性又は感受性の品種を、種子や幼植物の段階で選抜することが可能となり、当該形質を有する品種の育成を、短期間で行うことが可能となる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、下記実施例は下記の通りに実験、解析を行った。
　＜ＱＴＬ解析＞
　コシヒカリ／ハバタキ染色体断片置換系統、および、たちすがた／／たちすがた／モミロマンのＢＣ１Ｆ４を供試した。すなわち、抵抗性品種コシヒカリを遺伝的背景とし、その染色体断片の一部をインド型感受性品種ハバタキの染色体に置き換えたコシヒカリ／ハバタキ染色体断片置換系統群（ＫＨＳＬ）を解析した。なお、ＫＨＳＬは３２系統で構成され、ハバタキの全１２染色体のすべてについて解析が可能となっている（ＫＨＳＬについては、村田和優ら、「コシヒカリを遺伝的背景としたインド型品種ハバタキの染色体断片置換系統群の作出と評価」、育種学研究、２００９年３月２７日、第１１巻、別１号、６６ページ　参照のこと）。また、感受性品種モミロマンに抵抗性品種たちすがたを１回戻し交雑して得られたＢＣ１Ｆ４系統群９４系統もＳＳＲマーカー８０種を用いて解析した（用いたＳＳＲマーカーについては　「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　２２４０　ｎｅｗ　ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　ｒｉｃｅ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）」、ＤＮＡ　Ｒｅｓ、２００２年、９巻、６号、１９９～２０７ページ　、並びにｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／　参照のこと）。
　＜Ｔｏｓ１７挿入系統を用いた連鎖解析＞
　イネにおいて発見されたレトロトランスポゾンであるＴｏｓ１７は、組織培養によって活性化され、ゲノム内に自らのコピーを転移させる。転移先が遺伝子の内部であった場合、その遺伝子は破壊され、突然変異を引き起こすことが知られている（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６年、９３巻、７７８３～７７８８ページ　参照）。本実施例においては、この現象を利用して組織培養により作出された変異を蓄積したイネの集団（ミュータントパネル、データベース名：Ｔｏｓ１７ミュータントパネルデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｓ．ｎｉａｓ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／～ｍｉｙａｏ／ｐｕｂ／ｔｏｓ１７／））を利用した。Ｔｏｓ１７ミュータントパネルデータベースから、ＱＴＬ解析で特定された遺伝子座にあるＢＢＣ感受性との関与が強く疑われる、鉄・アスコルビン酸酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子の転写部位にＴｏｓ１７が挿入された２系統を選び出した。そして、これら２系統の各１５個体を栽培して得られた自殖種子を用いて、表現型（ＢＢＣ感受性）と遺伝子型（Ｔｏｓ１７の挿入）について調査した。
　＜遺伝子クローンの取得＞
　ＱＴＬ解析で特定された遺伝子座にある鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定されるｍＲＮＡ（ＡＫ０６５５８１）をイネジーンバンクから入手した。
　＜ベクター構築および形質転換＞
　ｎｏｓプロモーターでドライブされるカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴ２）又はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターでドライブされるハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｍＨＰＴ）と、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターでドライブされるＡＫ０６５５８１（ＨＩＳ１遺伝子）又はＡＫ２４１９４８（ＨＳＬ１遺伝子）の各発現カセットとを連結したバイナリーベクターを構築し（図３～７　参照）、アグロ法の形質転換に供試した。
　Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの形質転換は、エコタイプ「Ｃｏｌｕｍｂｉａ」を用いて、Ｆｌｏｒａｌ　ｄｉｐ法にて行った（Ｗｅｉｇｅｌ　ａｎｄ　Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ，　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（２００２）　ｐ１３１－１３２　参照）。すなわち先ず、抗生物質を含む液体培地（ＬＢまたはＹＥＢ）においてアグロバクテリウムを振とう培養し、およそ１６時間後に培養液のうち２ｍｌを抗生物質を含む液体培地（ＬＢまたはＹＥＢ）に加え、さらに振とう培養した。そして、そのおよそ１６時間後、培養液を４℃、８０００ｒｐｍにて１０分間、遠心処理をし、上澄み液を捨て、得られた沈殿物を５％スクロースを含む液５００ｍｌに懸濁した。そして、形質転換の直前に形質転換用試薬　ｓｉｌｗｅｔ（登録商標：ＳＩＬＷＥＴ　Ｌ－７７、製品番号：ＢＭＳ－ＳＬ７７５５、バイオメディカルサイエンス社製）を最終濃度０．０２５％になるように加えた。次いで、得られたアグロバクテリウム懸濁液に、既に開花、受粉している花芽を除去したアラビドプシスを３０～１２０秒間浸した。その後、およそ１６時間静置した後、植物体を生育させ、種子を得た。
　イネの形質転換は、ＢＢＣ感受性イネ品種関東２３９号を用いて、「Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．、２０１０年、２９巻、１１号、１２８７～１２９５ページ」に記載の方法の一部を改変して行った。すなわち先ず、滅菌した完熟種子をＮ６Ｄ培地に置床し３０℃で７日間培養し、アグロバクテリウムを感染させ、アセトシリンゴン（ＡＳ）を含むＮ６培地（２Ｎ６－ＡＳ培地）暗黒条件下で３日間、２５℃共培養した。その後、感染した組織は、カルベニシリンを含むＮ６Ｄ培地で４～６週間（１８時間日長）、４０ｍｇ／L　ハイグロマイシン（Ｈｙｇ）存在下で培養し、Ｈｙｇ耐性カルスを再分化させた。
　トマトの形質転換は、品種「マイクロトム」を供試し、図５及び７に示すベクター（３５ＳＨＩＳ１　ｐＺＫ３、３５ＳＨＳＬ１　ｐＺＫ３）を用いて、アグロバクテリウム法で実施した。なお、原品種マイクロトムは、２５℃のインキュベータで、０．３μＭのベンゾビシクロン（ＢＢＣ）を含む寒天培地で種子を発芽させると、約２週間後に葉部の白化が明瞭に確認できる。
　前記トマトの形質転換の結果、ＨＩＳ１遺伝子又はＨＳＬ１遺伝子が導入された複数の再分化植物体を得られた。また、再分化した植物体はＰＣＲによって導入遺伝子を確認した。
　＜組換え体のＢＢＣ抵抗性検定＞
　作出したＡ．ｔｈａｌｉａｎａ組換え体（Ｔ２世代）およびイネ組換え体（Ｔ０世代）のＢＢＣ抵抗性検定には、株式会社エス・ディー・エス　バイオテック保有のＢＢＣ原体を後述の濃度にて用いた。
　＜組換え体のトリケトン系４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性の検定＞
　作出したイネ組換え体（Ｔ１及びＴ２世代）のトリケトン系４－ＨＰＰＤ阻害剤、すなわちメソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン及びＮＴＢＣ抵抗性検定には市販の各試薬を後述の濃度にて用いた。
　＜ＰＣＲ＞
　ＨＩＳ１（ＡＫ０６５５８１）の５つの各エクソン領域内を特異的に増幅するプライマーを設計しＰＣＲに供試した。なお、ＰＣＲは、表１において示す塩基配列からなるプライマーを用いて、９４℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　３０秒の３５サイクルにて行った。また、鋳型ＤＮＡとしては、ＢＢＣ感受性イネ品種（モミロマン、タカナリ、カサラス）およびＢＢＣ抵抗性イネ品種（日本晴、コシヒカリ、北陸１９３号）の葉からＣＴＡＢ法を用いて抽出したゲノムＤＮＡを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例１）　４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子座の特定
　ジャポニカ型イネの中で、４－ＨＰＰＤ阻害剤の一種であるＢＢＣに対する感受性を有する品種は知られていない。一方、ジャポニカ型とインディカ型の交雑により育成されたイネ品種にはＢＢＣ感受性が出現することがある。
　そこで、ＢＢＣ抵抗性イネ品種「コシヒカリ」と感受性イネ品種「ハバタキ」とを用いた、コシヒカリ／ハバタキ染色体断片置換系統（ＫＨＳＬ）のＱＴＬ解析を前記の通り行った。その結果、第２染色体短腕領域がハバタキ型に置換されたＫＨＳＬ（ＫＨＳＬ０４）のみが感受性を示したことから、ＢＢＣ抵抗性を決定する遺伝子座はコシヒカリの第２染色体短腕上にあることが明らかになった（表２　参照）。なお、表２にはＫＨＳＬのＱＴＬ解析の結果の一部を示す。また、表２中「Ａ」はマーカーがコシヒカリ由来であることを示し、「Ｂ」はマーカーがハバタキ由来であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　さらに、ＢＢＣ抵抗性イネ品種「たちすがた」と感受性イネ品種「モミロマン」とを用いた、たちすがた／／たちすがた／モミロマンのＢＣ１Ｆ４のＱＴＬ解析を前記の通り行った。その結果、前記同様にＢＢＣ抵抗性を決定する遺伝子座はたちすがたの第２染色体短腕上にあることが明らかになり、異なるイネ品種を供試したＱＴＬ解析で特定された遺伝子座は同一領域であり、イネ品種「日本晴」データベース情報によると、１１種の候補遺伝子が存在することが確認された（表３　参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、１１種の候補遺伝子の塩基配列及び推定アミノ酸配列はいずれも、ＢＢＣで影響を受けるチロシン代謝経路およびカロテノイド生合成経路（図１　参照）の酵素及びその遺伝子と相同性がないことも明らかになった。
　なお、イネ品種「日本晴」データベース情報によると、ＢＢＣで活性阻害を受けるＨＰＰＤ酵素をコードする既知遺伝子ともっとも相同性の高いイネ遺伝子は第２染色体短腕上にあるが、ＱＴＬ解析で特定された遺伝子座とは異なっていた（図８　参照）。
　さらに、ＢＢＣ抵抗性に関与する遺伝子が座乗する領域を絞り込むため、ＫＨＳＬ０４とコシヒカリとを交雑したＦ２集団、およびモミロマンにたちすがたを１回戻し交雑して得られたＢＣ１Ｆ４系統群から第２染色体短腕に関する解析集団を作出し、２集団を用いて再度の解析を試みた結果、ＢＢＣ抵抗性に関与する遺伝子はＳＳＲマーカーＲＭ１２９８０とＲＭ１２９８３との間に存在することが明らかとなった。そして、絞り込んだ領域に存在する遺伝子をＲＡＰ－ＤＢより検索した結果、グリオキサラーゼ　類似タンパク質（７４１ｂｐ）を除く、１０個の候補遺伝子の存在が確認された。
　（実施例２）　４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子の同定
　前述の通り、ＱＴＬ解析によって４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を決定する遺伝子がイネ第２染色体短腕上にあることが示唆された。そこで当該遺伝子座にある鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子に注目し、Ｔｏｓ１７挿入系統を供試して表現型（ＢＢＣ高感受性）と遺伝子型との連鎖関係を明らかにするとともに、ＢＢＣ感受性のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ及びイネに当該遺伝子を導入した組換え体を作出し、ＢＢＣ抵抗性付与効果を調査した。
　すなわち、ＱＴＬ解析で特定されたＢＢＣ抵抗性決定遺伝子座には、ＢＢＣで活性阻害されるＨＰＰＤ酵素と同様、鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素と推定される遺伝子（以下、「標的遺伝子」とも称する）がある（表４　参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　Ｔｏｓ１７挿入系統の原品種「日本晴」はＢＢＣ抵抗性品種であるが、標的遺伝子の転写部位にＴｏｓ１７が挿入された系統ではＢＢＣ感受性個体が出現する。合計３０個体を供試した連鎖解析により、表現型（ＢＢＣ感受性）と遺伝子型（Ｔｏｓ１７挿入ホモ型）について調査した結果、Ｔｏｓ１７挿入ホモ６個体の後代はすべてＢＢＣ感受性を示した。また、Ｔｏｓ１７挿入ヘテロ１８個体の後代からは、すべてＢＢＣ感受性の個体を分離した。この結果から、鉄・アスコルビン酸酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子がＢＢＣ抵抗性に深く関与することが示唆された。
　そこで、標的遺伝子がＢＢＣ抵抗性遺伝子であることを実証するため、０．０３μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）に標的遺伝子を導入した組換え体（Ｔ２世代）を作製し、前記ＢＢＣ濃度の存在下におけるこの組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図９に示す。
　また、０．１μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＢＢＣ感受性イネ品種「関東２３９号」に標的遺伝子を導入した組換え体（Ｔ０世代）を作製し、３００ｇａ．ｉ．／ｈａのＢＢＣで処理した培土におけるこの組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図１０に示す。
　さらに、０．１μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＢＢＣ感受性イネ品種「関東２３９号」に標的遺伝子を導入した組換え体を作製し、Ｔ１種子又はＴ２種子を得た。これらを２μＭのＢＢＣを含む寒天培地に播種し組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図１１に示す。また、前記種子を１μＭのメソトリオン、２．５μＭのテフリルトリオン、０．５μＭのテンボトリオン又は１μＭのＮＴＢＣを含む寒天培地に播種し組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図１２～１５に示す。
　図９に示した結果から明らかなように、標的遺伝子を導入した前記Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ組換え体は、０．０３μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化せず生育した。また図１０に示した結果から明らかなように、標的遺伝子を導入した前記イネ組換え体は、３００ｇａ．ｉ．／ｈａのＢＢＣで処理した培土で白化せずに生育した。さらに、図１１に示した結果から明らかなように、標的遺伝子を導入した前記イネ組換え体は、２μＭのＢＢＣで処理した寒天培地で白化せずに生育した。なお、この濃度はＢＢＣ抵抗性品種である日本晴を白化させる高濃度である。
　また、図１２～１５に示した結果から明らかなように、標的遺伝子を導入した前記イネ組換え体は、ＢＢＣ以外のトリケトン系４－ＨＰＰＤ阻害剤（メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン又はＮＴＢＣ）を含む培地においても白化せずに生育した。すなわち、標的遺伝子を導入したイネ組換え体は、１μＭのメソトリオン、２．５μＭのテフリルトリオン、０．５μＭのテンボトリオン又は１μＭのＮＴＢＣで処理した寒天培地で白化せずに生育した。
　これらの結果から、標的遺伝子は４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子（ＨＩＳ１遺伝子）、すなわち４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが実証された。
　（実施例３）　ＨＩＳ１遺伝子の塩基配列解析による４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性の判定
　日本型イネ第２染色体にあるＨＩＳ１遺伝子は特定されたが、ＨＩＳ１遺伝子を増幅するＰＣＲを行うと、ＢＢＣ感受性イネ品種においても増幅産物は得られる。またＢＢＣ感受性イネ品種のなかでカサラスは、ＢＢＣ処理条件によっては感受性・抵抗性の判定が困難な場合がある。そこで、ＨＩＳ１遺伝子の特定領域を増幅するＰＣＲにより、ＨＩＳ１遺伝子の塩基配列とＢＢＣ感受性の程度との関連の有無を判定できるかどうかを調べた。
　なお、図には示さないが、モミロマン、タカナリ、カサラスはいずれもＢＢＣ感受性品種であるが、その程度が異なり、カサラスのＢＢＣ感受性と比較して、モミロマン及びタカナリはより強いＢＢＣ感受性を示すことは確認している。
　そこで先ずは、ＨＩＳ１遺伝子の５つの各エクソン領域内を特異的に増幅するプライマーを用いたＰＣＲによって、ＢＢＣ感受性品種（モミロマン、タカナリ、カサラス）とＢＢＣ抵抗性品種（日本晴、コシヒカリ、北陸１９３号）とを解析した。得られた結果は図１６に示す。
　図１６に示した結果から明らかなように、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンの前半部分を特異的に増幅するプライマーを用いたＰＣＲにて解析した結果、ＢＢＣ強感受性品種のモミロマン及びタカナリではＢＢＣ抵抗性品種と比較して、ＰＣＲ産物の分子量が小さいことが分かった。
　さらに、ＢＢＣ感受性品種　モミロマン及びタカナリと、ＢＢＣ抵抗性品種　日本晴とをゲノムＤＮＡの配列において比較した。得られた結果は図１７に示す。
　図１７に示した結果から明らかなように、前述のＰＣＲの解析結果と合致して、モミロマン及びタカナリにおいては、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンの前半部分において２８ｂｐが欠失していることが分かった。さらに、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンと第５エクソンとの間のイントロンにおいても、１９ｂｐ及び１６ｂｐの欠失部位があることは明らかになった。また、ＨＩＳ１遺伝子の第５エクソンにおいては、１ｂｐ（アデニン）の欠失と５ｂｐの挿入とがあることも確認された。
　また、ＢＢＣ感受性品種　カサラスと、ＢＢＣ抵抗性品種　日本晴とをゲノムＤＮＡの配列において比較した。得られた結果は図１８に示す。
　図１８に示した結果から明らかなように、前述のＰＣＲの解析結果と合致して、カサラスにおいては、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンの前半部分における欠失は認められなかった。しかし、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンと第５エクソンとの間のイントロンにおいては、ＴＡの挿入と１６ｂ．ｐ．の欠失部位とがあることが明らかになった。また、ＨＩＳ１遺伝子の第５エクソンにおいては、アデニンの欠失、５ｂｐの挿入、及びシトシンの挿入があることも確認された。
　従って、かかる結果から、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンから第５エクソンにかけての塩基の欠失及び／又は挿入によって、ＨＩＳ１遺伝子がコードするタンパク質が有する４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性が抑制されていることが明らかになった。また、モミロマン及びタカナリと、カサラスとの４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性の相違は、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンの前半部分における欠失の有無等に起因するものだと考えられる。
　（実施例４）　ＨＩＳ１遺伝子と相同性を有する遺伝子の解析
　次に、ＨＩＳ１遺伝子と相同性を有する遺伝子をデータベースにて探索した。すなわち、ＮＣＢＩ　Ｂｌａｓｔを用い、ＨＩＳ－１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をクエリーとしてｔＢＬＡＳＴＮ検索（デフォルト設定）を行った。なお、サーチ対象データはｎｒ／ｎｔ（ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）である。
　その結果、ＨＩＳ１遺伝子と最も相同性の高いイネ遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子）は第６染色体に座乗し、推定アミノ酸配列の相同性は約８６％と高いことが明らかになった（図１９　参照）。また、第６染色体上の相同遺伝子は近傍で多重遺伝子群（クラスター）を形成していることも明らかになった。
　しかしながら、これらの第６染色体上の相同遺伝子がコードするタンパク質は、ＨＩＳ１遺伝子に変異が生じている感受性品種においても発現していると推定される。
　この点に関しては、図２０に示す通り、ＨＩＳ１遺伝子は主に葉で発現しているが、第６染色体上の相同遺伝子は主に根や登熟中の種子で発現していることから、第６染色体上の相同遺伝子がコードするタンパク質は、潜在的に４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有しているが、葉での発現量が低いためその効果が現れていないという可能性が考えられる
　なお図２０は、ＲｉｃｅＸＰｒｏ（イネ遺伝子発現データベース／ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅｘｐｒｏ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）を用いて、ＨＩＳ１（Ｏｓ０２ｇ０２８０７００）と第６染色体上の相同遺伝子（Ｏｓ０６ｇ０１７６７００／Ｏｓ０６ｇ０１７８５００）の組織・生育時期別の発現パターンを解析した結果に基づく（Ｓａｔｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０１０年１１月２日［Ｅｐｕｂ　ａｈｅａｄ　ｏｆ　ｐｒｉｎｔ］　参照）。
　また、ＨＩＳ１遺伝子の相同遺伝子は単子葉植物のみに散在し、双子葉植物においては確認されないことが明らかになった（図２１　参照）。さらに、ＨＩＳ１遺伝子と相同性がやや低い遺伝子群は、エチレン合成系ＡＣＣオキシダーゼ遺伝子群をはじめ植物全般に分布しているが、機能的には異なると考えられる。なお図２１は、ｔＢＬＡＳＴＮ解析により、ＨＩＳ１と相同性を持つタンパク質のアミノ酸配列を抽出し、得られた配列をもとに、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを用いて系統樹解析を行い、ＴｒｅｅＶｉｅｗソフトウェアによって描画したものである。
　（実施例５）　ＨＳＬ１遺伝子の解析
　ＨＩＳ１遺伝子と最も相同性高く、第６染色体に座乗するイネ遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子）についても、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであるかどうかを調べた。
　すなわち、０．１μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＢＢＣ感受性イネ品種「関東２３９号」に標的遺伝子を導入した組換え体を作製し、Ｔ１種子又はＴ２種子を得た。これらを０．１２μＭのＢＢＣを含む寒天培地に播種し組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図２２に示す。
　図２２に示した結果から明らかなように、相同遺伝子を導入したイネ組換え体は０．１２μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化せずに生育した。この濃度はＢＢＣ抵抗性品種「日本晴」が白化しない濃度である。この結果から、耐性の程度は低いものの、ＨＳＬ１遺伝子はＨＩＳ１遺伝子と同様に４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが実証された。
　本発明の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を用いて栽培を行えば、栽培田や栽培畑の雑草防除を効率的に行うことができる。また、本発明の植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法は、例えば、輪作体系における前年作のこぼれ種の発芽リスクの軽減に利用することができる。このように、本発明は、有用植物の収穫量の安定や増大に大きく貢献し得るものである。
配列番号３～１４
＜２２３＞　人工的に合成されたプライマーの配列

Claims (16)

  1. 　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含む、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与するための薬剤
    （ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
    （ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
    （ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
    （ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
  2. 　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞であって、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞
    （ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
    （ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
    （ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
    （ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
  3. 　請求項２に記載の形質転換植物細胞から再生された、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体。
  4. 　請求項３に記載の植物体の子孫又はクローンである、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体。
  5. 　請求項３又は４に記載の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の繁殖材料。
  6. 　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法であって、
    　（Ｉ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入する工程と、
    （ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
    （ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
    （ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
    （ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
    　（II)工程（Ｉ）において前記ＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞から植物体を再生する工程と、
    を含む方法。
  7. 　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含む、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与するための薬剤
    （ａ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
    （ｂ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
    （ｃ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
  8. 　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞であって、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞
    （ａ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
    （ｂ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
    （ｃ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
  9. 　請求項８に記載の形質転換植物細胞から再生された、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体。
  10. 　請求項９に記載の植物体の子孫又はクローンである、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体。
  11. 　請求項９又は１０に記載の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体の繁殖材料。
  12. 　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体の製造方法であって、
    　（Ｉ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入する工程と、
    （ａ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
    （ｂ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
    （ｃ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ
    　（II)工程（Ｉ）において前記ＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞から植物体を再生する工程と、
    を含む方法。
  13. 　植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法であって、被験植物における下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ又はその発現制御領域の塩基配列を解析することを特徴とする方法
    （ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
    （ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
    （ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
    （ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
  14. 　植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法であって、被験植物における下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡの発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする方法
    （ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
    （ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
    （ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
    （ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
  15. 　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法であって、
    （ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性の植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
    （ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を、請求項１３または１４に記載の方法により判定する工程、および
    （ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
  16. 　４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物を育種する方法であって、
    （ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性の植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
    （ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を、請求項１３または１４に記載の方法により判定する工程、および
    （ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
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