JP5977605B2 - ４−ｈｐｐｄ阻害剤に対する感受性を判定する方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＨＩＳ１遺伝子における一塩基置換を標的として、イネにおける４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を判定する方法に関する。

バイオエタノール燃料の需要増に伴い、海外からの飼料用穀物の輸入価格が高騰し、日本国内の畜産経営を圧迫している。そこで、飼料の国内生産及び自給率の向上を目的とし、休耕田等を利用した水稲以外の転作作物の作付けが行われている。しかしながら、排水不良等の問題から、これら転作作物の栽培に適した水田には限りがあるため、飼料としてのイネの利用や、高い生産性を備えた飼料イネ専用品種（多収品種）の開発が進められている。かかる多収品種において、その特性である多収性や安定した栽培性を発揮させつつ、家畜の嗜好性や栄養価を向上させるためには、栽培田の雑草防除が重要な栽培管理技術となる（非特許文献１）。また、多収品種やイネに限らず、安定的で経済的な作物の生産には、低コストで省力的であり、簡便な雑草防除が求められており、それには選択性の高い除草剤の開発・施用が効果的であるため（非特許文献２）、施用除草剤に対する抵抗性作物の開発や栽培が必要とされている。

一方、栽培田の雑草防除においては、低薬量で広範囲の雑草に効き、人体や環境にも影響が少ないことから、スルホニルウレア（ＳＵ）系除草剤が広く普及している。しかしながら、ＳＵ系除草剤に対して耐性を有するイヌホタルイ等の雑草の発生が確認されており、イネ等の栽培管理における問題となっている。

昨今、かかる問題の解決策として、ベンゾビシクロン（ＢＢＣ）やメソトリオンやテフリルトリオン等のＳＵ系除草剤耐性植物にも効果を示す除草剤成分が開発され、実用化されている。ＢＢＣ、メソトリオン、テフリルトリオンはいずれも、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（４−ＨＰＰＤ）の機能を阻害する薬剤（４−ＨＰＰＤ阻害剤）であり、この酵素の機能を阻害することにより、カロチノイド合成系を間接的に阻害し、葉緑素の崩壊を引き起こすことにより、植物を白化、枯死に至らせる（図１ 参照）。これら阻害剤については、食用米品種に対する安全性は十分に確認されているため、イネの栽培において急速に普及しつつある。

しかしながら、多収品種については、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が、開発段階等において十分に検討されていなかったこともあり、多収品種である飼料用イネの７品種において、４−ＨＰＰＤ阻害剤に弱く、場合によっては枯死に至る可能性があることが報告されている（非特許文献１及び３）。

４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を確実に識別できる方法や、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を高めることができる方法が開発されれば、例えば、図２に示すように、食用米品種、飼料用米品種の輪作体系における、前年作の「こぼれ種」の発芽リスク（漏生籾、苗の問題）の制御に４−ＨＰＰＤ阻害剤を活用でき、ひいては飼料用米品種等の生産拡大が期待できる。また、これらの方法を利用することで、必要に応じてイネ等の作物の栽培の区分管理技術にも活用することができる。さらに、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を識別するマーカーとなる遺伝子が見出されば、イネを含む作物を効率的に育種することが可能となる。

このため、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を植物に付与するための技術や、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定するための技術の開発が強く望まれている。しかしながら、これら目的を効率的に達成し得る技術は、いまだ開発されていない。

関野 景介ら、「飼料用イネ１９品種の水稲用除草剤ベンゾビシクロン感受性」、日本作物学会紀事、２００９年３月２５日、２２７巻、別号、１２０〜１２１ページ Ｔｅｒｒｙ Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、２０１０年１１月２３日、１０７巻、４７号、２０２４０〜２０２４５ページ 丸山 清明ら、「飼料用イネなどが一部の除草剤に弱いことが判明」、［ｏｎｌｉｎｅ］、２０１０年３月２６日、独立行政法人 農業・食品産業技術総合研究機構 中央農業総合研究センター、プレスリリース、［２０１０年９月２９日検索］、インターネット〈ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｎａｒｃ．ｎａｒｏ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｒｅｓｓ／ｈ２２／０３２６／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ〉

本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、イネにおける４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を効率的に判定しうる技術を提供することにある。

本発明者らは、前記目的を達成すべく、まず、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性に関与する遺伝子の同定を試みた。具体的には、本発明者らは、まず、４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性イネと４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性イネとを用いた量的遺伝子座（ＱＴＬ）解析を行った。その結果、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性決定遺伝子座がイネの第２染色体短腕に座乗していることが判明した。次いで、本発明者らは、ＱＴＬ解析で特定された遺伝子座にある鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子に、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７が挿入された日本晴系統を用いて表現型（４−ＨＰＰＤ阻害型感受性）を調査したところ、Ｔｏｓ１７挿入ホモ個体が４−ＨＰＰＤ阻害剤に感受性を示すことを見出した。見出された鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子を、シロイナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）及びイネに導入したところ、これらの形質転換植物が４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を示したことから、この遺伝子が、植物に４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性をもたらす原因遺伝子（以下、４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｇｅｎｅ Ｎｏ．１（ＨＩＳ１）とも称する）であることが裏付けられた。

さらに、本発明者らは、４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性イネと４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性イネにおけるＨＩＳ１遺伝子の構造の比較を行った。その結果、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対して感受性を示すイネ品種においては、ＨＩＳ１遺伝子の第５エキソンや第４エクソンに一塩基置換が生じ、そのコードするタンパク質において、それぞれＶ２８６ＧおよびＶ２４６Ｉのアミノ酸置換をもたらしていた。よって、ＨＩＳ１遺伝子の一塩基置換により、ＨＩＳ１タンパク質の機能が抑制され、イネに４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性をもたらすものと考えられた。

これら知見に基づき、本発明者らは、イネのＨＩＳ１遺伝子の一塩基置換を標的として、イネにおける４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を判定することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、より詳しくは、以下のものである。

[１] イネにおける４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を判定する方法であって、被験イネのＨＩＳ１遺伝子における下記（ａ）または（ｂ）の一塩基置換を検出し、当該一塩基置換が存在する場合に被験イネが４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性を有すると判定される方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２８６位又は該部位に対応するバリンからグリシンへのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２４６位又は該部位に対応するバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換
[２] ［１］に記載の方法に用いられるための試薬であって、イネのＨＩＳ１遺伝子の塩基配列に相補的な連続する少なくとも１５塩基の塩基配列を含み、下記（ｉ）又は（ii）に記載のオリゴヌクレオチドである試薬。

（ｉ）イネのＨＩＳ１遺伝子における下記（ａ）または（ｂ）の一塩基置換の部位を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチド
（ii）イネのＨＩＳ１遺伝子における下記（ａ）または（ｂ）の一塩基置換を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２８６位又は該部位に対応するバリンからグリシンへのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２４６位又は該部位に対応するバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換

本発明において同定された遺伝子を標的として、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を効率的に判定することが可能となった。

チロシン代謝経路及びカロチノイド生合成経路と、４−ＨＰＰＤ阻害剤との概要と関連を示す図である。 食用米品種、飼料用米品種の輪作体系における、前年作の「こぼれ種」の発芽リスクの制御に関する概要を示す図である。 アグロバクテリウム法によるシロイヌナズナの形質転換に用いた、ｎｏｓプロモーター（ｎｏｓ−Ｐ）でドライブされるカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴII）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ−Ｐ）でドライブされるハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｈｙｇＲ）、及びＣａＭＶ３５ＳプロモーターでドライブされるＡＫ０６５５８１（ＨＩＳ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ／ＨＩＳ１）の概要を示す図である。 アグロバクテリウム法によるシロイヌナズナ及びイネの形質転換に用いた、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ Ｐｒｏ）でドライブされるハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｍＨＰＴ）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ Ｐｒｏ）でドライブされるＡＫ０６５５８１（ＨＩＳ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（３５ｓＨＩＳ１ ｐＺＨ２Ｂ）の概要を示す図である。 アグロバクテリウム法によるトマトの形質転換に用いた、ｎｏｓプロモーター（ＮＯＳｐｒｏ）でドライブされるカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴ２）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ Ｐｒｏ）でドライブされるＡＫ０６５５８１（ＨＩＳ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（３５ｓＨＩＳ１ ｐＺＫ３）の概要を示す図である。 アグロバクテリウム法によるシロイヌナズナ及びイネの形質転換に用いた、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ Ｐｒｏ）でドライブされるハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｍＨＰＴ）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ Ｐｒｏ）でドライブされるＡＫ２４１９４８（ＨＳＬ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（３５ｓＨＳＬ１ ｐＺＨ２Ｂ）の概要を示す図である。 アグロバクテリウム法によるトマトの形質転換に用いた、ｎｏｓプロモーター（ＮＯＳｐｒｏ）でドライブされるカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴ２）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ Ｐｒｏ）でドライブされるＡＫ２４１９４８（ＨＳＬ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（３５ｓＨＳＬ１ ｐＺＫ３）の概要を示す図である。 イネ染色体上にあるＱＴＬ解析によって特定された４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子（ＡＫ０６５５８１）とその相同遺伝子とを示す図である。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（ベンゾビシクロン（ＢＢＣ））に対する抵抗性を示す写真である。なお図中、「Ｃｏｌ」は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ野生型（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）の結果であることを示し、「♯１」及び「♯３」は、標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えシロイナズナＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）の結果であることを示す。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種：関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（ベンゾビシクロン）に対する抵抗性を示す写真である。なお図中、「関東２３９号」は、関東２３９号（野生型）の結果であることを示し、「ＢＢＣ２１−２３Ｂ」及び「ＢＢＣ２１−２３Ｃ」は、標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した関東２３９号（組換えイネ）の結果であることを示す。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（ベンゾビシクロン）に対する抵抗性を示す写真である。なお図中、「日本晴」及び「関東２３９号」は、各々日本晴（野生型）（４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種）及び関東２３９号（野生型）の結果であることを示し、「ＢＢＣ２１−１Ａ、２、３、３Ｄ、３Ｆ、３−３、９、１５」は、標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した関東２３９号（組換えイネ）の結果であることを示す（図１２〜１５においても同様）。また、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔｅ」及び「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｄａｔｅ」は、各々「４−ＨＰＰＤ阻害剤を添加した固形（寒天）培地に種を播いた日」及び「該種から発育した植物体の生育状況を調べた日」を示す（図１２〜１５及び２２においても同様）。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（メソトリオン）に対する抵抗性を示す写真である。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（テフリルトリオン）に対する抵抗性を示す写真である。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（テンボトリオン）に対する抵抗性を示す写真である。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（ＮＴＢＣ）に対する抵抗性を示す写真である。 標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）であるＨＩＳ１遺伝子の構造を示す図である。 ベンゾビシクロン感受性品種におけるＨＩＳ１遺伝子の構造の分類を示す図である。 ベンゾビシクロン感受性品種におけるＰｅｔａ型のＨＩＳ１遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す写真である。 ベンゾビシクロン感受性品種におけるＩＲ８型のＨＩＳ１遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す写真である。 ベンゾビシクロン感受性品種におけるＫａｓａｌａｔｈ型のＨＩＳ１遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す写真である。 ベンゾビシクロン感受性品種を識別するための複数のプライマーセットの組み合わせを用いたマルチプレックスＰＣＲの結果を示す写真である。 本発明のＰＣＲ判別技術により、イネ品種をＨＩＳ１遺伝子型で分類した結果を示す図である。 インドネシアで栽培されるイネ品種の主要祖先品種に対する本発明のＰＣＲ判別技術の汎用性を示す図である。 ベンゾビシクロン感受性品種のＨＩＳ１遺伝子型の地理的な起源を示す図である。

＜イネにおける４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を判定する方法＞
本発明は、イネにおける４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を判定する方法であって、被験イネのＨＩＳ１遺伝子における下記（ａ）または（ｂ）の一塩基置換を検出し、当該一塩基置換が存在する場合に被験イネが４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性を有すると判定される方法を提供する。
（ａ）Ｖ２８６Ｇのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換
（ｂ）Ｖ２４６Ｉのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換
本発明の方法を適用する「イネ」としては特に制限はない。４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を評価したい所望のイネを本発明の方法に適用することができる。

本発明における「４−ＨＰＰＤ阻害剤」とは、４−ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ）の機能を阻害する薬剤（４−ＨＰＰＤ阻害剤）を意味する。４−ＨＰＰＤ阻害剤は、図１に示すように、４−ＨＰＰＤの機能を阻害することにより、カロチノイド合成系を間接的に阻害し、葉緑素の崩壊を引き起こして植物を白化させ、枯死に至らせる。本発明における「４−ＨＰＰＤ阻害剤」としては、例えば、ベンゾビシクロン（ＢＢＣ）、メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン、（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルベンゾイル）−シクロヘキサン−１，３ジオン（２−（２−ｎｉｔｒｏ−４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１，３−ｄｉｏｎｅ；ＮＴＢＣ）といったトリケトン系４−ＨＰＰＤ阻害剤、ピラゾレート、ベンゾフェナップ、ピラゾキシフェンといったピラゾール系４−ＨＰＰＤ阻害剤が挙げられる。本発明の抵抗性ＤＮＡを用いて植物に抵抗性を付与する対象となる４−ＨＰＰＤ阻害剤としては、ＢＢＣ、メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン、ＮＴＢＣといったトリケトン系４−ＨＰＰＤ阻害剤が好ましく、ＢＢＣが特に好ましい。

なお、前述の４−ＨＰＰＤ阻害剤といった除草剤は、その成分が化合物としてきわめて多様であるが、作用機序の面から、下記の通り、いくつかのグループに分類できる（「農薬からアグロバイオギュレーター−病害虫雑草制御の現状と将来」、日本、シーエムシー出版、２０１０年１月 参照）。
(I) アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害型除草剤
脂質合成の最初の段階に関与するＡＣＣａｓｅを阻害するこの除草剤グループは、細胞膜合成を阻害し、植物を生育障害に至らしめる。このグループに属する除草剤はさらに（１）４−アリールオキシフェノキシプロピオン酸系、（２）シクロヘキサンジオン・オキシム系、（３）ジオン系に分類される。
(II) アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害型除草剤
ＡＬＳを標的とするこの除草剤のグループは、ＡＬＳ活性を阻害し分岐アミノ酸生成を阻害することで、植物を生育障害に至らしめる。このグループに属する除草剤はさらに（１）スルホニルウレア系、（２）トリアゾリノン系、（３）トリアゾロピリミジン系、（４）ピリミジニルサリチル酸系、（５）イミダゾリノン系に分類される。
(III) ４−ＨＰＰＤ代謝阻害型除草剤
チロシン代謝経路の４−ＨＰＰＤ代謝を阻害するこの除草剤グループは、植物のカロテノイド合成系を間接的に阻害し、植物を白化・枯死に至らしめる。このグループに属する除草剤はさらに（１）シクロヘキサンジオン系、（２）ピラゾール系、（３）ビシクロ系（４）、イソオキサゾール系、（５）トリケトン系に分類される。また、（１）シクロヘキサンジオン系としては、例えばベンゾイルシクロヘキサン−１，３−ジオン誘導体が挙げられ、（２）ピラゾール系としては、例えば、ピラゾレート、ベンゾフェナップ、ピラゾキシフェンが挙げられ、（３）ビシクロ系としては、例えば、３−置換ベンゾイル−ビシクロ［４、１、０］ヘプタン−２、４−ジオン誘導体が挙げられ、（４）イソオキサゾール系としては、例えばイソオキサフルトールが挙げられ、（５）トリケトン系としては、例えば、ＢＢＣ、メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオンが挙げられる。
（IV) プロトポルフィリノーゲン−IXオキシダーゼ（ＰＰＯ）阻害剤除草剤
このグループの除草剤は葉緑素合成を阻害し、細胞膜崩壊から枯死に至らしめる。このグループに属する除草剤はさらに（１）ジフェニルエーテル系、（２）ジアリル系、（３）ピラゾール系に分類される。
（V) 超長鎖脂肪酸伸長酵素（ＶＬＣＦＡＥ）阻害型除草剤
このグループの除草剤は植物脂質生合成系のうちＣ２０以上の超長鎖脂肪酸生合成系酵素を阻害し、植物を枯死に至らしめる。
（VI) フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）阻害型除草剤
カロテノイド生合成経路のＰＤＳ酵素を阻害するこの除草剤グループは、植物の葉緑素崩壊を引き起こし、植物を白化・枯死に至らしめる。
（VII) ＰＳ II阻害型除草剤
このグループの阻害剤は、プラストキノン（ＰＱ）に結合し、その結果ＰＱが関わる光化学系 II（ＰＳ II）から光化学系 I（ＰＳ I）への電子伝達が阻害され、植物体内での炭素固定機能が不能となり植物が枯死する。
（VIII) 合成オーキシン型除草剤
このグループの阻害剤は、植物体内に低濃度で存在し植物の生長を調節する天然オーキシンのように振る舞い、植物の分化・成長が不正常となり結果的に枯死する。
（IX) ＥＰＳＰ合成酵素（ＥＰＳＰＳ）阻害型除草剤
このグループの阻害剤は、シキミ酸回路のＥＰＳＰＳと結合し、ＥＰＳＰの合成を阻害する。その結果トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンが生合成されず、植物は枯死する。

本発明において「４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性」とは、前記の４−ＨＰＰＤ阻害剤の作用を受けるイネの性質を意味する。一方、「４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性」とは、前記の４−ＨＰＰＤ阻害剤の作用に抵抗するイネの性質を意味する。

本発明における「イネのＨＩＳ１遺伝子」とは、イネの第２染色体短腕の１０４１５２９７．．１０４１９２８７に存在する鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子である。４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性型である日本晴由来のＨＩＳ遺伝子の塩基配列を配列番号：１に、前記ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性型であるＩＲ８およびＩＲ２４由来のＨＩＳ遺伝子の塩基配列を配列番号：３に、前記ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性型であるカサラス由来のＨＩＳ遺伝子の塩基配列を配列番号：５に、前記ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性型であるモミロマン由来のＨＩＳ遺伝子の塩基配列を配列番号：７に、前記ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：８に示す。

本発明の方法は、被験イネにおいて、ＩＲ８およびＩＲ２４由来のＨＩＳ遺伝子に見出された一塩基置換（Ｖ２８６Ｇのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換）またはカサラス由来のＨＩＳ遺伝子に見出された一塩基置換（Ｖ２４６Ｉのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換）の有無を検出する。

本発明の方法における一塩基置換の検出においては、まず、被験イネからＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、例えば被験イネの組織（例えば、葉）から調製することができる。イネの組織からゲノムＤＮＡを抽出する方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができ、例えば、ＳＤＳフェノール法（尿素を含む溶液又はエタノール中に保存した組織を、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）、界面活性剤（ＳＤＳ）、及びフェノールで該組織のタンパク質を変性させ、エタノールで該組織からＤＮＡを沈殿させ抽出する方法）、ＣＴＡＢ法（高濃度のＣＴＡＢ（セチルメチルアンモニウムブロマイド、Ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を含む溶液中に組織を保存し、該組織のタンパク質と多糖類とを不容化して沈殿・除去し、エタノールで該組織からＤＮＡを沈殿させ抽出する方法）、アルカリ処理法（アルカリ溶液を用いてＤＮＡを抽出する簡易方法）が挙げられる。

前記一塩基置換の検出は、かかる一塩基置換の部位を含むＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡの塩基配列を決定することにより実施することができる。該ＤＮＡの単離は、例えば、一塩基置換の部位を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、マキサムギルバート法やサンガー法等、当業者に公知の方法で行うことができる。

前記一塩基置換を検出する別の方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＰ（ＰＣＲ−配列特異的プライマー）法が挙げられる。前記一塩基置換をＰＣＲ−ＳＳＰ法により検出する場合には、プライマーを構成する一対のオリゴヌクレオチドのうちの片方のオリゴヌクレオチドの３’末端が前記一塩基置換の部位の特定の塩基種に相補的な塩基種になるように設計する。そして、このように設計された一対のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより増幅されるのは、前記部位の特定の塩基種を有する被験イネに由来するゲノムＤＮＡを鋳型にした場合に限られ、前記部位が異なる塩基種である被験イネに由来するゲノムＤＮＡを鋳型にした場合は増幅されない。このため、かかる一対のオリゴヌクレオチドを利用することにより、一塩基置換を検出することができる。

なお、本実施例に示す一塩基置換の検出は、「イネゲノムの１塩基多型判別法の開発とイネ品種識別への応用」（特開２００４−２４８６３５号公報）の記載に基づいて行った。すなわち、本実施例で用いたプライマーの３’末端は、判別すべき一塩基置換の位置に対応し、プライマーの３’末端から３番目の塩基はプライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換されている。この置換は、ＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である。

前記一塩基置換を検出するためのさらに別の方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ＰＣＲ−一本鎖高次構造多型）法が挙げられる。すなわち、一塩基置換の部位を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより増幅された２本鎖ＤＮＡを、熱やアルカリ等で処理することにより変性させ、１本鎖ＤＮＡにした後、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると、ゲル中で１本鎖ＤＮＡは分子内相互作用により折り畳まれ、高次構造を形成することになる。そして、その折り畳まれ構造の相互作用は、塩基種の相違により変化するため、分離した当該１本鎖ＤＮＡを銀染色やラジオアイソトープにより検出し、当該１本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較することにより、本発明にかかる一塩基置換を検出することができる。

前記一塩基置換を検出するさらに別の方法としては、インターカレーターを利用する方法が挙げられる。この方法においては、先ず、被験イネから前述の通りＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記ＤＮＡ試料を鋳型として、本発明にかかる一塩基置換を含む領域を増幅する。そして、前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出し、検出した前記温度の変化に伴う前記蛍光の強度の変動を対照と比較する。このような方法としては、ＨＲＭ（ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｌｔｉｎｇ、高分解融解曲線解析）法が挙げられる。

前記一塩基置換を検出するさらに別の方法としては、一塩基置換を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを利用する方法が挙げられる。この方法においては、まず、被験イネから前述の通りＤＮＡ試料を調製する。一方で、一塩基置換を含む領域に特異的にハイブリダイズし、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。そして、前記ＤＮＡ試料に、前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、さらに前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズした前記ＤＮＡ試料を鋳型として、一塩基置換の部位を含むＤＮＡを増幅する。そして、前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出する。このような方法としては、ダブルダイプローブ法、いわゆるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法が挙げられる。

以上、本発明の方法の実施形態について説明したが、本発明の方法は前記実施形態に限定されるものではない。例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用した方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法）、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法、パイロシークエンシング（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法、シングルヌクレオチドプライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）法、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法、ＤＮＡアレイ法といった、一塩基置換を検出するための公知の技術も、本発明において利用しうる。

本発明の方法により、前記一塩基置換が検出された場合には、被験イネは４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性であると判定することができる。かかる判定の正確性をより向上させるという観点から、前記２種の一塩基置換を組み合わせて検出してもよく、さらに、Ｐｅｔａ、タカナリ、およびモミロマンのＨＩＳ遺伝子に見出された塩基の欠失（フレームシフトを生じさせる、第４エキソンに存在する２８ｂｐの欠失）を組み合わせて検出してもよい。

＜本発明の方法に用いられるための試薬＞
さらに、本発明は、前記本発明の判定方法に用いられるための試薬であって、イネのＨＩＳ１遺伝子の塩基配列に相補的な連続する少なくとも１５塩基の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む試薬を提供する。当該オリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの双方が含まれる。当該オリゴヌクレオチドは、前記本発明の方法に使用し得る限り、イネのＨＩＳ１遺伝子の塩基配列に対して完全に相補的である必要はない。

本発明のオリゴヌクレオチドの一つの好ましい態様は、本発明にかかる一塩基置換の部位を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチド（プライマーセット）である。該オリゴヌクレオの長さは、通常１５〜１００塩基であり、好ましくは１７〜３０塩基である。なお、前述の通り、一塩基置換の検出法によっては、当該一対のオリゴヌクレオチドのうちのどちらか片方のオリゴヌクレオチドは、一塩基置換を含む領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含んでいてもよい。

本発明の一対のオリゴヌクレオチドの好適な例としては、下記が挙げられる。
（１）ＨＩＳ遺伝子の塩基配列決定用・・配列番号：９及び１０
（２）Ｖ２８６Ｇのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換の検出用・・配列番号：１３及び１４
（３）Ｖ２４６Ｉのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換の検出用・・配列番号：１５及び１６
本発明のオリゴヌクレオチドの他の好ましい態様は、本発明にかかる一塩基置換を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドプローブ）である。オリゴヌクレオチドプローブは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、本発明にかかる一塩基置換を含む領域に特異的にハイブリダイズするものが好ましい。このような特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドプローブは、本発明にかかる一塩基置換を含む領域の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。

また、本発明のオリゴヌクレオチドは、適宜、アイソトープ、蛍光色素、ビオチン等によって標識して用いてもよい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を^３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、及びクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして^３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素又はビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、天然のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ））のみから構成されていなくともよく、非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよい。本発明に用いられる非天然型のヌクレオチドとしては、天然のヌクレオチドと同様の機能を有するものであれば特に制限されないが、本発明にかかる一塩基置換を含む領域等に対するハイブリダイゼーションの効率を上昇させ、オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの鎖長を短くすることができるという観点から、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（登録商標、２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、及びこれらの複合体が好ましい。なお、ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡのリン酸と５炭糖からなる主鎖をポリアミド鎖に置換したものである。ＬＮＡとはＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、架橋化核酸）とも称され、ヌクレオチドの２’の酸素と４’の炭素を架橋したＲＮＡである。

前記の試薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。

以下、参考例及び実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の参考例や実施例に限定されるものではない。

[参考例]
＜ＱＴＬ解析＞
コシヒカリ／ハバタキ染色体断片置換系統、および、たちすがた／／たちすがた／モミロマンのＢＣ１Ｆ４を供試した。すなわち、抵抗性品種コシヒカリを遺伝的背景とし、その染色体断片の一部をインド型感受性品種ハバタキの染色体に置き換えたコシヒカリ／ハバタキ染色体断片置換系統群（ＫＨＳＬ）を解析した。なお、ＫＨＳＬは３２系統で構成され、ハバタキの全１２染色体のすべてについて解析が可能となっている（ＫＨＳＬについては、村田和優ら、「コシヒカリを遺伝的背景としたインド型品種ハバタキの染色体断片置換系統群の作出と評価」、育種学研究、２００９年３月２７日、第１１巻、別１号、６６ページ 参照のこと）。また、感受性品種モミロマンに抵抗性品種たちすがたを１回戻し交雑して得られたＢＣ１Ｆ４系統群９４系統もＳＳＲマーカー８０種を用いて解析した（用いたＳＳＲマーカーについては 「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ２２４０ ｎｅｗ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）」、ＤＮＡ Ｒｅｓ、２００２年、９巻、６号、１９９〜２０７ページ 、並びにｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／ 参照のこと）。

＜Ｔｏｓ１７挿入系統を用いた連鎖解析＞
イネにおいて発見されたレトロトランスポゾンであるＴｏｓ１７は、組織培養によって活性化され、ゲノム内に自らのコピーを転移させる。転移先が遺伝子の内部であった場合、その遺伝子は破壊され、突然変異を引き起こすことが知られている（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６年、９３巻、７７８３〜７７８８ページ 参照）。本参考例においては、この現象を利用して組織培養により作出された変異を蓄積したイネの集団（ミュータントパネル、データベース名：Ｔｏｓ１７ミュータントパネルデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｓ．ｎｉａｓ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／〜ｍｉｙａｏ／ｐｕｂ／ｔｏｓ１７／））を利用した。Ｔｏｓ１７ミュータントパネルデータベースから、ＱＴＬ解析で特定された遺伝子座にあるＢＢＣ感受性との関与が強く疑われる、鉄・アスコルビン酸酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子の転写部位にＴｏｓ１７が挿入された２系統を選び出した。そして、これら２系統の各１５個体を栽培して得られた自殖種子を用いて、表現型（ＢＢＣ感受性）と遺伝子型（Ｔｏｓ１７の挿入）について調査した。

＜遺伝子クローンの取得＞
ＱＴＬ解析で特定された遺伝子座にある鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定されるｍＲＮＡ（ＡＫ０６５５８１）をイネジーンバンクから入手した。

＜ベクター構築および形質転換＞
ｎｏｓプロモーターでドライブされるカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴ２）又はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターでドライブされるハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｍＨＰＴ）と、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターでドライブされるＡＫ０６５５８１（ＨＩＳ１遺伝子）又はＡＫ２４１９４８（ＨＳＬ１遺伝子）の各発現カセットとを連結したバイナリーベクターを構築し（図３〜７ 参照）、アグロ法の形質転換に供試した。

Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの形質転換は、エコタイプ「Ｃｏｌｕｍｂｉａ」を用いて、Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ法にて行った（Ｗｅｉｇｅｌ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ， Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２００２） ｐ１３１−１３２ 参照）。すなわち先ず、抗生物質を含む液体培地（ＬＢまたはＹＥＢ）においてアグロバクテリウムを振とう培養し、およそ１６時間後に培養液のうち２ｍｌを抗生物質を含む液体培地（ＬＢまたはＹＥＢ）に加え、さらに振とう培養した。そして、そのおよそ１６時間後、培養液を４℃、８０００ｒｐｍにて１０分間、遠心処理をし、上澄み液を捨て、得られた沈殿物を５％スクロースを含む液５００ｍｌに懸濁した。そして、形質転換の直前に形質転換用試薬 ｓｉｌｗｅｔ（登録商標：ＳＩＬＷＥＴ Ｌ−７７、製品番号：ＢＭＳ−ＳＬ７７５５、バイオメディカルサイエンス社製）を最終濃度０．０２５％になるように加えた。次いで、得られたアグロバクテリウム懸濁液に、既に開花、受粉している花芽を除去したアラビドプシスを３０〜１２０秒間浸した。その後、およそ１６時間静置した後、植物体を生育させ、種子を得た。

イネの形質転換は、ＢＢＣ感受性イネ品種関東２３９号を用いて、「Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、２０１０年、２９巻、１１号、１２８７〜１２９５ページ」に記載の方法の一部を改変して行った。すなわち先ず、滅菌した完熟種子をＮ６Ｄ培地に置床し３０℃で７日間培養し、アグロバクテリウムを感染させ、アセトシリンゴン（ＡＳ）を含むＮ６培地（２Ｎ６−ＡＳ培地）暗黒条件下で３日間、２５℃共培養した。その後、感染した組織は、カルベニシリンを含むＮ６Ｄ培地で４〜６週間（１８時間日長）、４０ｍｇ／L ハイグロマイシン（Ｈｙｇ）存在下で培養し、Ｈｙｇ耐性カルスを再分化させた。

トマトの形質転換は、品種「マイクロトム」を供試し、図５及び７に示すベクター（３５ＳＨＩＳ１ ｐＺＫ３、３５ＳＨＳＬ１ ｐＺＫ３）を用いて、アグロバクテリウム法で実施した。なお、原品種マイクロトムは、２５℃のインキュベータで、０．３μＭのベンゾビシクロン（ＢＢＣ）を含む寒天培地で種子を発芽させると、約２週間後に葉部の白化が明瞭に確認できる。

前記トマトの形質転換の結果、ＨＩＳ１遺伝子又はＨＳＬ１遺伝子が導入された複数の再分化植物体を得られた。また、再分化した植物体はＰＣＲによって導入遺伝子を確認した。

＜組換え体のＢＢＣ抵抗性検定＞
作出したＡ．ｔｈａｌｉａｎａ組換え体（Ｔ２世代）およびイネ組換え体（Ｔ０世代）のＢＢＣ抵抗性検定には、株式会社エス・ディー・エス バイオテック保有のＢＢＣ原体を後述の濃度にて用いた。

＜組換え体のトリケトン系４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性の検定＞
作出したイネ組換え体（Ｔ１及びＴ２世代）のトリケトン系４−ＨＰＰＤ阻害剤、すなわちメソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン及びＮＴＢＣ抵抗性検定には市販の各試薬を後述の濃度にて用いた。

＜ＰＣＲ＞
ＨＩＳ１（ＡＫ０６５５８１）の５つの各エクソン領域内を特異的に増幅するプライマーを設計しＰＣＲに供試した。なお、ＰＣＲは、表１において示す塩基配列からなるプライマーを用いて、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒の３５サイクルにて行った。また、鋳型ＤＮＡとしては、ＢＢＣ感受性イネ品種（モミロマン、タカナリ、カサラス）およびＢＢＣ抵抗性イネ品種（日本晴、コシヒカリ、北陸１９３号）の葉からＣＴＡＢ法を用いて抽出したゲノムＤＮＡを用いた。

（参考例１） ４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子座の特定
ジャポニカ型イネの中で、４−ＨＰＰＤ阻害剤の一種であるＢＢＣに対する感受性を有する品種は知られていない。一方、ジャポニカ型とインディカ型の交雑により育成されたイネ品種にはＢＢＣ感受性が出現することがある。

そこで、ＢＢＣ抵抗性イネ品種「コシヒカリ」と感受性イネ品種「ハバタキ」とを用いた、コシヒカリ／ハバタキ染色体断片置換系統（ＫＨＳＬ）のＱＴＬ解析を前記の通り行った。その結果、第２染色体短腕領域がハバタキ型に置換されたＫＨＳＬ（ＫＨＳＬ０４）のみが感受性を示したことから、ＢＢＣ抵抗性を決定する遺伝子座はコシヒカリの第２染色体短腕上にあることが明らかになった（表２ 参照）。なお、表２にはＫＨＳＬのＱＴＬ解析の結果の一部を示す。また、表２中「Ａ」はマーカーがコシヒカリ由来であることを示し、「Ｂ」はマーカーがハバタキ由来であることを示す。

さらに、ＢＢＣ抵抗性イネ品種「たちすがた」と感受性イネ品種「モミロマン」とを用いた、たちすがた／／たちすがた／モミロマンのＢＣ１Ｆ４のＱＴＬ解析を前記の通り行った。その結果、前記同様にＢＢＣ抵抗性を決定する遺伝子座はたちすがたの第２染色体短腕上にあることが明らかになり、異なるイネ品種を供試したＱＴＬ解析で特定された遺伝子座は同一領域であり、イネ品種「日本晴」データベース情報によると、１１種の候補遺伝子が存在することが確認された（表３ 参照）。

また、１１種の候補遺伝子の塩基配列及び推定アミノ酸配列はいずれも、ＢＢＣで影響を受けるチロシン代謝経路およびカロテノイド生合成経路（図１ 参照）の酵素及びその遺伝子と相同性がないことも明らかになった。

なお、イネ品種「日本晴」データベース情報によると、ＢＢＣで活性阻害を受けるＨＰＰＤ酵素をコードする既知遺伝子ともっとも相同性の高いイネ遺伝子は第２染色体短腕上にあるが、ＱＴＬ解析で特定された遺伝子座とは異なっていた（図８ 参照）。

さらに、ＢＢＣ抵抗性に関与する遺伝子が座乗する領域を絞り込むため、ＫＨＳＬ０４とコシヒカリとを交雑したＦ２集団、およびモミロマンにたちすがたを１回戻し交雑して得られたＢＣ１Ｆ４系統群から第２染色体短腕に関する解析集団を作出し、２集団を用いて再度の解析を試みた結果、ＢＢＣ抵抗性に関与する遺伝子はＳＳＲマーカーＲＭ１２９８０とＲＭ１２９８３との間に存在することが明らかとなった。そして、絞り込んだ領域に存在する遺伝子をＲＡＰ−ＤＢより検索した結果、グリオキサラーゼ 類似タンパク質（７４１ｂｐ）を除く、１０個の候補遺伝子の存在が確認された。

（参考例２） ４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子の同定
前述の通り、ＱＴＬ解析によって４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を決定する遺伝子がイネ第２染色体短腕上にあることが示唆された。そこで当該遺伝子座にある鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子に注目し、Ｔｏｓ１７挿入系統を供試して表現型（ＢＢＣ高感受性）と遺伝子型との連鎖関係を明らかにするとともに、ＢＢＣ感受性のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ及びイネに当該遺伝子を導入した組換え体を作出し、ＢＢＣ抵抗性付与効果を調査した。

すなわち、ＱＴＬ解析で特定されたＢＢＣ抵抗性決定遺伝子座には、ＢＢＣで活性阻害されるＨＰＰＤ酵素と同様、鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素と推定される遺伝子（以下、「標的遺伝子」とも称する）がある（表４参照）。

Ｔｏｓ１７挿入系統の原品種「日本晴」はＢＢＣ抵抗性品種であるが、標的遺伝子の転写部位にＴｏｓ１７が挿入された系統ではＢＢＣ感受性個体が出現する。合計３０個体を供試した連鎖解析により、表現型（ＢＢＣ感受性）と遺伝子型（Ｔｏｓ１７挿入ホモ型）について調査した結果、Ｔｏｓ１７挿入ホモ６個体の後代はすべてＢＢＣ感受性を示した。また、Ｔｏｓ１７挿入ヘテロ１８個体の後代からは、すべてＢＢＣ感受性の個体を分離した。この結果から、鉄・アスコルビン酸酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子がＢＢＣ抵抗性に深く関与することが示唆された。

そこで、標的遺伝子がＢＢＣ抵抗性遺伝子であることを実証するため、０．０３μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）に標的遺伝子を導入した組換え体（Ｔ２世代）を作製し、前記ＢＢＣ濃度の存在下におけるこの組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図９に示す。

また、０．１μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＢＢＣ感受性イネ品種「関東２３９号」に標的遺伝子を導入した組換え体（Ｔ０世代）を作製し、３００ｇａ．ｉ．／ｈａのＢＢＣで処理した培土におけるこの組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図１０に示す。

さらに、０．１μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＢＢＣ感受性イネ品種「関東２３９号」に標的遺伝子を導入した組換え体を作製し、Ｔ１種子又はＴ２種子を得た。これらを２μＭのＢＢＣを含む寒天培地に播種し組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図１１に示す。また、前記種子を１μＭのメソトリオン、２．５μＭのテフリルトリオン、０．５μＭのテンボトリオン又は１μＭのＮＴＢＣを含む寒天培地に播種し組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図１２〜１５に示す。

図９に示した結果から明らかなように、標的遺伝子を導入した前記Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ組換え体は、０．０３μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化せず生育した。また図１０に示した結果から明らかなように、標的遺伝子を導入した前記イネ組換え体は、３００ｇａ．ｉ．／ｈａのＢＢＣで処理した培土で白化せずに生育した。さらに、図１１に示した結果から明らかなように、標的遺伝子を導入した前記イネ組換え体は、２μＭのＢＢＣで処理した寒天培地で白化せずに生育した。なお、この濃度はＢＢＣ抵抗性品種である日本晴を白化させる高濃度である。

また、図１２〜１５に示した結果から明らかなように、標的遺伝子を導入した前記イネ組換え体は、ＢＢＣ以外のトリケトン系４−ＨＰＰＤ阻害剤（メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン又はＮＴＢＣ）を含む培地においても白化せずに生育した。すなわち、標的遺伝子を導入したイネ組換え体は、１μＭのメソトリオン、２．５μＭのテフリルトリオン、０．５μＭのテンボトリオン又は１μＭのＮＴＢＣで処理した寒天培地で白化せずに生育した。

これらの結果から、標的遺伝子は４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子（ＨＩＳ１遺伝子）、すなわち４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが実証された。

［実施例］
＜塩基配列の解析＞
ＢＢＣ感受性を示す５つのイネ品種「タカナリ」、「モミロマン」、「ＩＲ８」、「ＩＲ２４」、「Ｋａｓａｌａｔｈ」の葉部から抽出したＤＮＡを供試した。

各品種のＨＩＳ１遺伝子をＰＣＲでクローニングするため、データベース（Ｒａｐ−ｄｂ）にあるＢＢＣ抵抗性（非感受性）のイネ品種「日本晴」のＨＩＳ１遺伝子の塩基配列をもとに、順向きプライマーとして「AACCACCCCCGAGTCTAAGT（配列番号：９）」、逆向きプライマーとして「GCTACGCTGATAAAGGGTAGGA（配列番号：１０）」を設計した。

ＰＣＲで増幅後、独立にクローン化し、全塩基配列を解析した。

＜ＰＣＲ＞
−ＤＮＡ抽出−
鋳型ＤＮＡはイネ各品種の葉部約０．１ｇを供試してＰＩ−５０α(クラボウ)を用いて抽出・精製した。

−ＰＣＲ条件−
ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ １５ｕｇ/０．５ｕｌ、Ｇｏ Ｔａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ５ｕｌ(Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｄＮＴＰ 各２００ｕＭ、ＭｇＣｌ_２ １．５ｍＭ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む)、プライマー２種 各０．５ｕｌ、ｍｉｌｌｉＱ水 ３．５ｕｌ、合計１０ｕｌの反応液を調製して行った。ＰＣＲの温度条件及び各温度の反応時間は、以下に示すように個々の供試プライマー毎に最適化した。比較対照区として、鋳型ＤＮＡのかわりにｍｉｌｌｉＱ水を添加した反応液を用いた。

−Ｐｅｔａ型を識別するＰＣＲ−
順向きプライマーとして「GTTCTGAACAAGTATGCATCAGGA（配列番号：１１）」、逆向きプライマーとして「GGTGTCACCTAAGTTGATCAGCAAT（配列番号：１２）」を設計した。ＰＣＲ条件は「９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒」を３２回繰り返した。

−ＩＲ８型を識別するＰＣＲ−
順向きプライマーとして「ATGTCAGTGGCCTGCAAGTT（配列番号：１３）」、逆向きプライマーとして「CTCCTTCTCGGCGTTTGGCC（配列番号：１４）」を設計した。ＰＣＲ条件は「９４℃３０秒、６５℃３０秒、７２℃３０秒」を３２回繰り返した。

−Ｋａｓａｌａｔｈ型を識別するＰＣＲ−
順向きプライマーとして「AGATGTCAGTGGCCTGCCAA（配列番号：１５）」、逆向きプライマーとして「CCTGAACTCTTCGACGCTCA（配列番号：１６）」を設計した。ＰＣＲ条件は「９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒」を３２回繰り返した。

−マルチプレックスＰＣＲ−
Ｐｅｔａ型、ＩＲ８型、日本晴型を１反応で識別するマルチプレックスＰＣＲに用いるプライマーとして「GTTCTGAACAAGTATGCATCAGGA（配列番号：１１）」（順向き）、「ATGTCAGTGGCCTGCAAGTT（配列番号：１３）」（順向き）、「GGTGTCACCTAAGTTGATCAGCAAT（配列番号：１２）」（逆向き）、「CTCCTTCTCGGCGTTTGGCC（配列番号：１４）」（逆向き）を設計した。ＰＣＲ条件は「９４℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃３０秒」を３２回繰り返した。

−電気泳動−
ＰＣＲ産物の電気泳動はいずれも、３％アガロース電気泳動を行った。

（実施例１） ＨＩＳ１遺伝子の変異を標的とした４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性の判定
（１）ＨＩＳ１遺伝子の塩基配列
データベース(Ｒａｐ−ｄｂ)によると、ＢＢＣ抵抗性のイネ品種「日本晴」のＨＩＳ１遺伝子はイネ２番染色体上にあり、５つのエキソンから構成される（図１６）。アミノ酸配列解析データベース（Ｓｃａｎ Ｐｒｏｓｉｔｅ）によると、ＨＩＳ１の推定アミノ酸配列には酵素活性ドメインと推定される領域が第４エキソンから第５エキソンにわたる領域に存在する（図１６）。

ＢＢＣ感受性を示す５つのイネ品種「タカナリ」、「モミロマン」「ＩＲ８」、「ＩＲ２４」、「Ｋａｓａｌａｔｈ」のＨＩＳ１遺伝子をＰＣＲで増幅後、独立にクローン化し、全塩基配列を解析した。その結果、ＨＩＳ１の変異パターンにより、ＢＢＣ感受性品種は少なくとも３群に分類できることを明らかにした（図１７）。具体的には、「タカナリ」「モミロマン」は酵素活性ドメインと推定される領域内の第４エキソンに２８ｂｐの欠失が生じ、その遺伝子下流域ではコドンフレームにずれが生じている（図１７）。「ＩＲ８」、「ＩＲ２４」では酵素活性ドメインと推定される領域内の第５エキソンにアミノ酸置換を引き起こす塩基配列の異常が生じている（図１７）。「Ｋａｓａｌａｔｈ」では酵素活性ドメインと推定される領域内の第４エキソンにアミノ酸置換を引き起こす塩基配列の異常が生じている（図１７）。

次に、これらの情報をもとに、３種のＢＢＣ感受性品種のＨＩＳ１遺伝子型を判別可能なプライマーを設計した。

（２）ＰＣＲ
−Ｐｅｔａ型を識別するＰＣＲ−
Ｐｅｔａ型を識別するＰＣＲによって、「Ｐｅｔａ」では約２９０ｂｐ、「日本晴」では約３２０ｂｐに増幅産物を確認し、鋳型ＤＮＡのかわりにｍｉｌｌｉＱ水を添加した反応では増幅産物が見られないことを確認した。さらに、各イネ品種を供試した際のＰＣＲ産物を比較した。その結果、Ｐｅｔａ型のＨＩＳ１遺伝子型を持つことが塩基配列解析で判明している「タカナリ」、「モミロマン」では「Ｐｅｔａ」と同じく約２９０ｂｐの増幅産物を確認した。加えて、「Ｔａｄｕｃａｎ」、「ＩＲ６４」、「密陽２３」、「ミズホチカラ」、「夢十色」、「やまだわら」、「ハバタキ」、「おどろきもち」の各品種でも、「Ｐｅｔａ」と同じく約２９０ｂｐの増幅産物を確認した（図１８Ａ）。なお、「ＩＲ２６２−３８-６-１１」、「水原２３２」についても同様に約２９０ｂｐの増幅産物を確認した。

−ＩＲ８型を識別するＰＣＲ−
ＩＲ８型を識別するＰＣＲによって、「ＩＲ８」では約５００ｂｐに増幅産物を確認し、「日本晴」や、鋳型ＤＮＡのかわりにｍｉｌｌｉＱ水を添加した反応では増幅産物が見られないことを確認した。さらに、各イネ品種を供試した際のＰＣＲ産物を比較した。その結果、ＩＲ８型のＨＩＳ１遺伝子型を持つことが塩基配列解析で判明している「ＩＲ２４」では、ＩＲ８と同じく約５００ｂｐの増幅産物を確認した。加えて、「ＤＧＷＧ(１２１８９)」「水原２５８」「ルリアオバ」の各品種で、「ＩＲ８」と同じく約５００ｂｐの増幅産物を確認した（図１８Ｂ）。

−Ｋａｓａｌａｔｈ型を識別するＰＣＲ−
Ｋａｓａｌａｔｈ型を識別するＰＣＲによって、「Ｋａｓａｌａｔｈ」では約６２０ｂｐに増幅産物を確認し、「日本晴」や、鋳型ＤＮＡのかわりにｍｉｌｌｉＱ水を添加した反応では増幅産物が見られないことを確認した。その上で、各イネ品種を供試した際のＰＣＲ産物を比較した。その結果、「ＩＲ３６」ではＫａｓａｌａｔｈ型のＨＩＳ１遺伝子型を持つことが塩基配列解析で判明している「Ｋａｓａｌａｔｈ」と同じく約６２０ｂｐの増幅産物を確認した（図１８Ｃ）。

−マルチプレックスＰＣＲ−
マルチプレックスＰＣＲによって、「モミロマン」では約２９０ｂｐ、「日本晴」では約３２０ｂｐ、「ＩＲ８」では約５００ｂｐに増幅産物を確認し、鋳型ＤＮＡのかわりにｍｉｌｌｉＱ水を添加した反応では増幅産物が見られないことを確認した。さらに、各イネ品種を供試した際のＰＣＲ産物を比較した。その結果、「Ｐｅｔａ型」、「日本晴型」、「ＩＲ８型」を判別可能であることを確認した（図１９）。

−ＨＩＳ１遺伝子型によるＢＢＣ感受性イネ品種の分類−
前記のＰＣＲ判別技術により、イネ品種をＨＩＳ１遺伝子型で分類し、その結果を図２０に示した。

インドネシアで栽培されるイネ品種の主要祖先品種については、吉田ら（２００９:日作紀 ７８(３): ３３５-３４３) によって近縁係数平均値が示されている。前記のＰＣＲ判別技術は、インドネシアで栽培されるイネ品種の主要祖先５品種すべてをカバーすることができる（図２１）。

本実施例において明らかとなったＢＢＣ感受性品種のＨＩＳ１遺伝子型は、個々の遺伝型によって地理的に固有の起源を持つことが推定できる（図２２）。

本発明のイネにおける４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を判定する方法は、例えば、輪作体系における前年作のこぼれ種の発芽リスクの軽減に利用することができる。本発明は、有用植物の収穫量の安定や増大に大きく貢献し得るものである。

配列番号９〜２８
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列

Claims (2)

1. イネにおける４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を判定する方法であって、被験イネのＨＩＳ１遺伝子における下記（ａ）または（ｂ）の一塩基置換を検出し、当該一塩基置換が存在する場合に被験イネが４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性を有すると判定される方法。
   （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２８６位又は該部位に対応するバリンからグリシンへのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換
   （ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２４６位又は該部位に対応するバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換
2. 請求項１に記載の方法に用いられるための試薬であって、イネのＨＩＳ１遺伝子の塩基配列に相補的な連続する少なくとも１５塩基の塩基配列を含み、下記（ｉ）又は（ii）に記載のオリゴヌクレオチドである試薬。
   （ｉ）イネのＨＩＳ１遺伝子における下記（ａ）または（ｂ）の一塩基置換の部位を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチド
   （ii）イネのＨＩＳ１遺伝子における下記（ａ）または（ｂ）の一塩基置換を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
   （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２８６位又は該部位に対応するバリンからグリシンへのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換
   （ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２４６位又は該部位に対応するバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換をもたらす一塩基置換