EA029482B1 - Молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений - Google Patents

Молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений Download PDF

Info

Publication number
EA029482B1
EA029482B1 EA201201264A EA201201264A EA029482B1 EA 029482 B1 EA029482 B1 EA 029482B1 EA 201201264 A EA201201264 A EA 201201264A EA 201201264 A EA201201264 A EA 201201264A EA 029482 B1 EA029482 B1 EA 029482B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
plant
gene
polynucleotide
rna
endogenous
Prior art date
Application number
EA201201264A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201201264A1 (ru
Inventor
Роберт Д. Саммонс
Сергей И. Ивашута
Хун Лю
Дафу Ван
Пол К.К. Фэн
Андрей Ю. Коуранов
Скотт Е. Андерсен
Original Assignee
Монсанто Текнолоджи Ллс
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44563804&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA029482(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Монсанто Текнолоджи Ллс filed Critical Монсанто Текнолоджи Ллс
Publication of EA201201264A1 publication Critical patent/EA201201264A1/ru
Publication of EA029482B1 publication Critical patent/EA029482B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/60—Isolated nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
    • A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение представляет способы и молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений, например, путем использования РНК для системной регуляции генов. Различные аспекты настоящего изобретения представляют способы и молекулы полинуклеотидов для регуляции эндогенных генов и трансгенов в растительной клетке и молекулах полинуклеотидов.

Description

Настоящее изобретение представляет способы и молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений, например, путем использования РНК для системной регуляции генов. Различные аспекты настоящего изобретения представляют способы и молекулы полинуклеотидов для регуляции эндогенных генов и трансгенов в растительной клетке и молекулах полинуклеотидов.
029482 Β1
029482
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительных заявок США № 61/311762, поданной 8 марта 2010 г., 61/349807, поданной 28 мая 2010 г., и 61/381556, поданной 10 сентября 2010 г., содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылок. Распечатка последовательности, содержащаяся в файле "38-21_56855_Б.!х!" размером 133 килобайта (при измерении в операционной системе М§-А1пботек), созданном 7 марта 2011 г., подана с настоящей заявкой и включена в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники
Здесь описаны молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений и способы изготовления и использования таких молекул.
Уровень техники
Неспособность гербицидов контролировать рост устойчивых сорных растений представляет проблему, в особенности в случае, когда такие сорные растения растут на поле культуры, устойчивой к гербицидам, которая может обладать меньшей устойчивостью к гербициду, чем сорное растение. Идентифицированы сорные растения, обладающие различными механизмами устойчивости к гербицидам. Авторы работы Сашек е! а1. (2010) Ргос. Ыаб. Асаб δα. И8А, 107(3): 1029-1034 сообщали об устойчивости амаранта, обусловленной селекцией множественных копий генов, продуцирующих белки-мишени гербицидов. В работах Ваегкоп е! а1. (2002) Р1ап! РЬукю1., 129(3): 1265-1275; Ргек!оп е! а1. (2006) Рекбабе ΒίосЬет. РЬукю1., 84(3): 227-235; и Аакебп е! а1. (2006) Аееб Кек. (Ох&гб), 46(5): 432-440 сообщалось об устойчивости элевсины индийской, латука компасного и плевела, обусловленной мутациями генов, продуцирующих белки-мишени гербицидов. Одним из наблюдаемых механизмов устойчивости мелколепестника канадского к глифосату являлось вакуолярное разрушение глифосата; см. Се е! а1. (2010) Рек! Мападетеп! δα., 66: 576-576. Авторы работы Шбауа! е! а1. (1997) Рекбабе ВюсЬет. РЬукю1., 57(2):137146 сообщали об устойчивости росички кровяной, обусловленной экспрессией ферментов, метаболизирующих гербициды до неактивных химических соединений. В Кеббу е! а1. (2008) 1. Адбс. Рооб СЬет., 56(6): 2125-2130 сообщалось о накоплении аминометилфосфоновой кислоты в видах растений, обработанных глифосатом.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении описаны способы и молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений, например, путем использования РНК для системной регуляции генов. Различные аспекты настоящего изобретения представляют способы и молекулы полинуклеотидов для регуляции эндогенных генов и трансгенов в растительной клетке и молекулах полинуклеотидов. Полинуклеотиды, композиции и способы, описанные здесь, пригодны для регуляции эндогенных генов у вредителей или патогенов растений. В одном из аспектов настоящего изобретения молекулы полинуклеотидов представлены в составе композиций, способных проникать или поглощаться тканью живого растения и инициировать системный сайленсинг эндогенных генов или трансгенов или их РНК-транскриптов. В некоторых аспектах настоящего изобретения молекулы полинуклеотидов в конечном итоге обеспечивают растение или дают возможность продукции в клетках растения РНК, способной при физиологических условиях растительной клетки гибридизоваться с РНК-транскриптом эндогенного гена-мишени или трансгена-мишени в клетке растения, тем самым воздействуя на регуляцию гена-мишени, например, путем сайленсинга или супрессии гена-мишени. В других аспектах настоящего изобретения молекулы полинуклеотидов также можно использовать для того, чтобы в конечном итоге обеспечить растение, или для продукции в клетках растения, РНК, способной при физиологических условиях гибридизоваться с РНК-транскриптом генамишени клетки беспозвоночного-вредителя или вируса-патогена растения, тем самым воздействуя на регуляцию гена-мишени, например, путем сайленсинга или супрессии гена-мишени. В некоторых аспектах сайленсинг или супрессия гена-мишени приводит к повышению экспрессии другого гена, который находится под воздействием или управлением экспрессии гена-мишени.
Считается, что композиции и способы согласно изобретению действуют по одному или нескольким природным метаболическим путям, вовлеченным в РНК-опосредованную супрессию генов, согласно общему описанию в обзорах Вгобегкеп апб Уошпе! (2006), Тгепбк Сепебск, 22:268-280; Тотаб апб 2атоге (2005) Сепек & Беу., 19:517-529; УаисЬеге! (2006) Сепек Беу., 20:759-771; Мешк е! а1. (2005) Аппи. Кеу. Се11 Беу. Вю1., 21:297-318; и 1опек-КЬоабек е! а1. (2006) Аппи. Кеу. Р1ап! Вю1., 57:19-53. В РНКопосредованной супрессии генов обычно участвует интермедиат - двуцепочечная РНК (дцРНК), образующаяся в ходе внутримолекулярных взаимодействий в пределах одной молекулы РНК или межмолекулярных взаимодействий двух молекул РНК. Этот длинный дцРНК-интермедиат подвергается процессингу с участием рибонуклеазы семейства РНКазы III (дайсер или дайсер-подобной рибонуклеазы) с образованием одной или нескольких более коротких двуцепочечных РНК, одна цепь которых встроена в комплекс РНК-индуцированного сайленсинга ("К18С"). Например, путь миРНК включает расщепление длинного двуцепочечного РНК-интермедиата на малые интерферирующие РНК ("миРНК"). Считается, что размер миРНК находится в диапазоне от приблизительно 19 до приблизительно 25 пар оснований, однако наиболее распространенные классы миРНК растений включают миРНК, содержащие 21 пару оснований или 24 пары оснований. См. Натб!оп е! а1. (2002) ЕМВО 1., 21: 4671-4679. Как используется
- 1 029482
здесь, "олигонуклеотид" означает молекулу полинуклеотида длиной 18-25 нуклеотидов, по размеру аналогичную процессированным молекулам малых РНК, участвующим в механизмах сайленсинга генов. Различные варианты воплощения настоящего изобретения включают композиции, включающие олигонуклеотиды или полинуклеотиды или смеси олигонуклеотидов и полинуклеотидов.
Аспекты изобретения включают способы и композиции для: обеспечение одноцепочечных молекул РНК в растительной клетке для системной регуляции генов; обработку композициями гербицидов, включающими поверхностно-активные вещества и летальные для растений агенты, представляющие одноцепочечные РНК для супрессии эндогенных генов растительной клетки; нанесение на поверхность растения наружного покрытия, включающего поверхностно-активное вещество (например, кремнийорганическое поверхностно-активное вещество) и молекулу олигонуклеотида или полинуклеотида для супрессии эндогенного гена растительной клетки; композиции контактного действия для индукции сайленсинга гена-мишени растения, включающие: (а) агент, обуславливающий проницаемость тканей растения для полинуклеотидов, и (б) молекулы полинуклеотида; и обработку композициями гербицидов, включающими: (а) агент, обуславливающий проницаемость тканей растения для молекул полинуклеотида, и (б) молекулы полинуклеотида. В необязательном случае эти композиции могут включать ненуклеотидный гербицид.
В других аспектах изобретения представлены способы для борьбы с самосевными растениями, устойчивыми к гербицидам; исследование "обратной генетики" путем регуляции эндогенного гена растения за счет обработки ткани растущего растения композицией для внедрения одноцепочечных молекул РНК в растительную клетку для системной регуляции генов; индукции системного сайленсинга генамишени, включающей наружное нанесение полинуклеотидов на растение; индукции системного сайленсинга гена-мишени в растении путем: (а) обработки растения, обуславливающей проницаемость тканей растения для молекул полинуклеотида и (б) наружного нанесения полинуклеотидов на растение; исследование "обратной генетики" путем регуляции эндогенного гена растения за счет наружного нанесения на растущее растение композиции, включающей молекулы полинуклеотида и агента, обуславливающего проницаемость тканей растения для молекул такого полинуклеотида.
В других аспектах изобретение представляет растение, включающее экзогенную ДНК или РНК для супрессии эндогенного гена, причем указанная экзогенная ДНК не интегрирована в хромосому растения, экзогенная РНК не является транскриптом ДНК, интегрированной в хромосому растения, а эндогенный ген подавляют путем наружного нанесения полинуклеотида на растение. Эти и другие аспекты настоящего изобретения более подробно описаны в следующих разделах.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой §ЕЦ ГО N0: 1 - нуклеотидную последовательность, кодирующую ΕΡδΡδ амаранта Палмера.
Фиг. 2 представляет собой §ЕЦ ГО N0: 3, являющуюся нуклеотидной последовательностью синтезированного гена Ροϊ III.
На фиг. 3 показан процент смертности растений амаранта Палмера, обработанных дцРНК. На фиг. ЗА изображены растения через 7 суток после обработки глифосатом. На фиг. 3В изображены растения, обработанные поверхностно-активным веществом и раствором длинных дцРНК, а затем, спустя 72 ч глифосатом. На фиг. 3С изображены растения, обработанные поверхностно-активным веществом и раствором коротких дцРНК, а затем, спустя 72 ч - глифосатом.
На фиг. 4 показано обесцвечивание растений ΝίοοΙίαηα ЬсШкапиапа. обработанных композицией дцРНК.
Фиг. 5 представляет собой §ЕЦ ГО N0: 2, являющуюся нуклеотидной последовательностью фитоиндесатуразы ΝίοοΙίαηα ЬепШаппапа.
На фиг. 6 изображены антисмысловые оцДНК-олигонуклеотиды (8ЕЦ ГО N0: 15), меченные по 5'концу А1еха Р1иог 488, проникающие в листья амаранта Палмера, устойчивого к глифосату, как описано в примере 9.
На фиг. 7 изображены результаты анализа мРНК ЕР8Р8, измеренные в листьях амаранта Палмера, устойчивого к глифосату, обработанных ЕЧЧ-антисмысловыми оцДНК-олигонуклеотидами, как описано в примере 9. Столбики представляют повторные эксперименты по обработке #1 - #4 (обозначенные числами, заключенными в круги, и относящиеся к табл. 2) и контрольные эксперименты (листья, обработанные оцДНК-олигонуклеотидами, антисмысловыми по отношению к белку семян ячменя §ЕЦ ГО N0: 14, обработанные или не обработанные глифосатом).
На фиг. 8 изображены результаты анализа белка ЕР8Р8, измеренные в листьях амаранта Палмера, устойчивого к глифосату, обработанных нанесением ЕЧЧ-антисмысловых оцДНК-олигонуклеотидов, как описано в примере 9; варианты обработки обозначены числами, заключенными в круги, и относятся к табл. 2.
На фиг. 9 изображены результаты накопления шикимата, измеренные в листьях амаранта Палмера, устойчивого к глифосату, обработанных ЕЧЧ-антисмысловыми оцДНК-олигонуклеотидами в ходе двух экспериментов, как описано в примере 9; варианты обработки обозначены числами, заключенными в круги, и относятся к табл. 2.
- 2 029482
На фиг. 10 изображена нуклеотидная последовательность фитоиндесатуразы ΝίεοΙίαηα ЬсШкапиапа (δΗΟ ГО N0: 2).
На фиг. 11 схематически изображено положение проанализированных олигонуклеотидов и полинуклеотидов (см. табл. 3) по отношению к последовательности фитоинсинтазы (8Е(5 ГО N0: 16), как описано в примере 10.
На фиг. 12А изображено обесцвечивание верхушечных листьев растений №соДапа Ьеп1йаш1апа, обработанных нанесением буфера ("Контроль"), 200-членного дцРНК-полинуклеотида, последовательность которого соответствовала сегменту, состоящему из нуклеотидов 914-1113 5>Е0 ГО N0: 2 ("200-п.о. дцРНК"), и комбинации одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов и полинуклеотидов (5>Е0 ГО N08: 16, 17, 20, 21, 24, 25 и 26) ("олиго оцДНК"), как описано в примере 10. На фиг. 12В изображены результаты нозерн-блоттинга РНК, выделенной из растений №соДапа ЬеШкапиапа. обработанных буфером (контроль), 200-членным дцРНК-полинуклеотидом и оцДНК-олигонуклеотидами. Кроме того, показана РНК, выделенная из растений, подвергнутых стрессу путем хранения при 4°С в темноте в течение ночи перед обработкой 200-членными дцРНК-полинуклеотидами.
На фиг. 13 изображено обесцвечивание верхушечных листьев растений №соДапа ЬейДат1апа, обработанных нанесением различных комбинаций полинуклеотидов или олигонуклеотидов в двух повторностях (числа, относящиеся к вариантам обработки, перечислены в табл. 4), как описано в примере 10. Контрольные (вариант обработки 13 в табл. 4) растения не показаны.
На фиг. 14 изображено обесцвечивание верхушечных листьев растений №соДапа Ьеййат1апа, обработанных нанесением полинуклеотидов, перечисленных в табл. 5, как описано в примере 10.
На фиг. 15 изображено обесцвечивание верхушечных листьев, наблюдаемое у растений №соДапа Ьеп1йат1апа после наружного нанесения 21-членной ΡΌδ-антисмысловой оцДНК (5>Е0 ГО N0: 34, "21п.о. антисмысловая ΡΌδ") или ранее проанализированных 22-членных ΡΌδ-антисмысловых олигонуклеотидов без промотора Т7 (5>Е0 ГО N08: 22 и 23) ("антисмысловая ΡΌδ"). После наружного нанесения чистого буфера или 21-членной ΡΌδ-смысловой оцДНК (5>Е0 ГО N0: 36, "21-п.о. смысловая ΡΌδ"), как описано в примере 10, наблюдали незначительное обесцвечивание или отсутствие обесцвечивания верхушечных листьев.
На фиг. 16 изображено выравнивание ДНК-последовательностей ΡΌδ амаранта Палмера и №соДапа Ьеп1йат1апа, демонстрирующее приблизительно 71% идентичности (1252/1762), как описано в примере 11.
На фиг. 17 изображено обесцвечивание верхушечных листьев, наблюдаемое у растений амаранта Палмера, обработанных нанесением 678-п.о. или 198-п.о. дцРНК ΡΌδ амаранта Палмера, но не у растений амаранта Палмера, обработанных нанесением 260-п.о. дцРНК гена листоеда О1аЬгоДса, как описано в примере 11.
На фиг. 18А изображено обесцвечивание верхушечных листьев, стеблей и цветков растений №соДапа Ьеп1йат1апа, вначале обработанных раствором поверхностно-активного вещества, а затем - олигонуклеотидом оцДНК ΡΌδ для индукции системного сайленсинга фитоиндесатуразы, как описано в примере 12. На фиг. 18В изображено обесцвечивание верхушечных листьев, стеблей и цветков растений №соДапа Ьеп1Дат1апа, обработанных нанесением олигонуклеотида оцДНК ΡΌδ для индукции системного сайленсинга фитоиндесатуразы, с кондиционированием или без кондиционирования раствором поверхностно-активного вещества, как описано в примере 12.
На фиг. 19 изображены результаты анализа различных линий амаранта Палмера, устойчивых к глифосату (три растения на повторность), обработанных при условиях, перечисленных в табл. 6, как описано в примере 13. Фотографии сняты на 7 сутки после обработки глифосатом (эксперименты 1-6) или на 9 сутки после обработки глифосатом (эксперименты 7-9).
На фиг. 20 изображено положение двух небольших РНК, идентифицированных как часто встречающиеся в растениях амаранта Палмера, обработанных дцДНК ΒΡ8Ρ8, и показанных в виде нуклеотидов, выделенных подчеркнутым курсивом в положениях 564-588 и 743 - 767 полноразмерного ΒΡ8Ρ8 (5>Е0 ГО N0: 40), как описано в примере 14. В последовательности ΒΡδΡδ также показано положение четырех "коротких" молекул дцРНК ΒΡδΡδ олигонуклеотидного размера (подчеркнутый некурсивный текст) и трех "длинных" двуцепочечных РНК-полинуклеотидов (полужирный текст, как описано в примере 1.
На фиг. 21А изображены результаты обработки растений амаранта Палмера поверхностноактивным веществом, а затем дцРНК в одном из трех наносимых количеств, с последующей обработкой гербицидом, как описано в примере 17. На фиг. 21В изображены результаты анализа 1, выполненного с использованием амаранта Палмера, устойчивого к глифосату и выращенного из семян, собранных в полевых условиях, как описано в примере 17; показаны растения через 8 суток и 30 суток после обработки гербицидом.
На фиг. 22 изображены результаты обработки растений амаранта Палмера поверхностно-активным веществом - амином твердых жиров и сульфатом аммония или реагентами для трансфекции, как описано в примере 18.
На фиг. 23 изображены результаты обработки растений амаранта Палмера, устойчивых к глифоса- 3 029482
ту, дцРНК ЕР8Р8 или гибридами ДНК/РНК ЕР8Р8, как описано в примере 19.
На фиг. 24 изображены результаты обработки растений амаранта Палмера, устойчивых к глифосату, полинуклеотидами дцРНК ЕР8Р8 или оцДНК ЕР8Р8, как описано в примере 20. Верхняя фотография была снята спустя 8 суток после опрыскивания гербицидом, а на нижнем графике (гистограмме) представлены результаты в виде повреждений от глифосата (ГП), определенных спустя 8 суток после опрыскивания гербицидом.
На фиг. 25А изображены двенадцать дцРНК-полинуклеотидов, соответствующих сегментам ДНК длиной приблизительно по 250 п.о., перекрывающих в мозаичном порядке всю кодирующую последовательность и часть 5'- и З'-нетранслируемых областей гена ЕР8Р8 амаранта Палмера, как описано в примере 21; четыре "короткие" молекулы дцРНК ЕР8Р8 олигонуклеотидного размера, соответствующие описанию в примере 1 и на фиг. 1 расположены в сегментах мозаики 2, З, 4 и 8 соответственно и показаны в виде светло-серых столбиков в пределах этих сегментов. На фиг. 25В и 25С изображены результаты обработки растений амаранта Палмера, устойчивых к глифосату, дцРНК, сконструированными из указанных четырех "коротких" молекул дцРНК, или буфером.
На фиг. 26 изображены результаты обработки устойчивых к глифосату растений амаранта Палмера глифосатом с последующим обрызгиванием 1% 8П\уе1 Ь-77 и нанесением дцРНК ЕР8Р8 в буфере, содержавшем 2% сульфат аммония, как описано в примере 22. Необработанные ("НО") контрольные растения обрабатывали только опрыскиванием 1% 8П\уе1 Ь-77, но не гербицидом и не дцРНК. Растения фотографировали и оценивали на 16 сутки после обработки.
На фиг. 27 изображены результаты обработки полевой популяции высококопийного устойчивого к глифосату амаранта Палмера композицией, содержавшей 20Х или 100Х количество полинуклеотидов дцРНК ЕР8Р8, поверхностно-активное вещество, сульфат аммония и гербицид, или композицией, содержавшей поверхностно-активное вещество, сульфат аммония и гербицид, как описано в примере 2З. При каждой обработке обрабатывали делянки размером 1 фут на 5 футов в двух повторностях.
На фиг. 28 изображено развитие обесцвечивания и гибель растений салата, обработанных 1 наномоль оцДНК на растение, на (сверху вниз) 37, 46 и 60 сутки после обработки, как описано в примере 24.
На фиг. 29А изображены системный сайленсинг в растениях салата, подтверждаемый обесцвечиванием, наблюдавшимся на 4 или 12 сутки после обработки нанесением полинуклеотидов, как описано в примере 24. На фиг. 29В показан системный сайленсинг, подтверждаемый обесцвечиванием, наблюдавшимся на 4 сутки после обработки нанесением четырех отдельных антисмысловых оцДНК ("НЬ287", 8ЕО ГО N0: 43; "НЬ288", 8ЕО ГО N0: 44; "НЬ289", 8ЕО ГО N0: 45; и "НЬ290", 8ЕО ГО N0: 46) или смесью всех четырех этих оцДНК.
На фиг. 30 изображено обесцвечивание листьев (справа сверху) и цветков (справа посередине) растений томата, обработанных полинуклеотидами фитоиндесатуразы томата, как описано в примере 25. На фиг. 30 также показано замедление роста растений томата, обработанных полинуклеотидами РЭ8 (снизу).
На фиг. 31 показано усиление глифосатной гербицидной активности полинуклеотидов ЕР8Р8 по отношению к низкокопийному амаранту Палмера полинуклеотидами ΊΊΡ и то, что полинуклеотиды ΊΊΡ обладали гербицидной активностью сами по себе, как описано в примере 26. Полинуклеотиды ЕР8Р8 "1,3, 4" относятся к "коротким" дцРНК, содержащим антисмысловую цепь, способную гибридизоваться с мРНК, являющейся транскриптом гена ЕР8Р8 амаранта Палмера (8Еф ГО N0: 1) в положениях 14-38 (короткая дцРНК-1), 345-369 (короткая дцРНК-3) и 1105-1129 (короткая дцРНК-4) соответственно, обозначенных подчеркнутыми нуклеотидами на фиг. 1 (см. пример 1). ЕР8Р8 "5" относится к ГОТ [5] (8Еф ГО N08: 91-92, как описано в табл. 11).
На фиг. 32 показано усиление глифосатной гербицидной активности полинуклеотидов ЕР8Р8 по отношению к высококопийному амаранту Палмера полинуклеотидами Т1Р и то, что полинуклеотиды Т1Р обладали гербицидной активностью сами по себе, как описано в примере 26. Полинуклеотиды ЕР8Р8 "1,3, 4" относятся к "коротким" дцРНК, содержащим антисмысловую цепь, способную гибридизоваться с мРНК, являющейся транскриптом гена ЕР8Р8 амаранта Палмера (8Еф ГО N0: 1) в положениях 14-38 (короткая дцРНК-1), 345-369 (короткая дцРНК-3) и 1105-1129 (короткая дцРНК-4) соответственно, обозначенных подчеркнутыми нуклеотидами на фиг. 1 (см. пример 1). ЕР8Р8 "5" относится к ГОТ [5] (8Еф ГО N08: 91-92, как описано в табл. 11).
На фиг. 33 показано действие гербицидов на амарант Палмера после обработки указанными комбинациями неполинуклеотидных гербицидов и полинуклеотидов, как описано в примере 28.
На фиг. 34 изображено выравнивание промотора локуса 1 РЭ8 Мсойаиа Ьеп1йат1аиа (8Еф ГО N0: 319) и промотора локуса 2 РЭ8 (8Еф ГО N0: 320), как описано в примере 30.
На фиг. 35 схематически изображены промоторы локуса 1 и локуса 2 РЭ8 Мсойаиа Ьеи1йат1аиа и области, являющиеся мишенями смеси полинуклеотидов, как описано в примере 30.
На фиг. 36 показано изменение высоты у растений №соИаиа Ьеи1йат1аиа, обработанных РЭ8антисмысловым полинуклеотидом (фиг. 36А), ЕР8Р8-антисмысловыми полинуклеотидами (фиг. 36В) или КиВ18С0-антисмысловым полинуклеотидом (фиг. 36С), как описано в примере 33.
На фиг. 37 показано действие наружного нанесения дцРНК-полинуклеотидов ("олиго ДНК ЕР8Р8"),
- 4 029482
мишенью которых является эндогенный ген ΕΡδΡδ, или чистого буфера в качестве контроля на однодольные растения 2еа шаук (Сакре), как описано в примере 34.
На фиг. 38 показано действие различных противоионов глифосата на гербицидную активность по отношению к растениям амаранта Палмера, устойчивым к глифосату, как описано в примере 35.
На фиг. 39 показано действие полиаминов спермина ("СПМ") и спермидина ("СПМД") или сульфата аммония ("СА") на устойчивые к глифосату растения амаранта Палмера, содержащие 33, 36 или 57 копий ΕΡδΡδ, как описано в примере 35. "4Х \УМ" означает "с последующей обработкой глифосатом (3360 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® ^еа!йегМАХ® на гектар)".
Подробное описание изобретения
Если не указано иное, нуклеотидные последовательности в тексте настоящего патентного описания приведены, при чтении слева направо, в направлении от 5' к 3'. Нуклеотидные последовательности могут быть представлены в виде ДНК или РНК, как указано; описание одного из этих вариантов в обязательном порядке означает и другой вариант, как известно специалисту. Если термин представлен в единственном числе, авторы изобретения также имели в виду и аспекты изобретения, описываемые этим термином во множественном числе. Под "нетранскрибируемыми" полинуклеотидами подразумевают, что эти полинуклеотиды не содержат транскриптона полной полимеразы II. Как используется здесь, "раствор" относится к гомогенным смесям и негомогенным смесям, например, суспензиям, коллоидам, мицеллам и эмульсиям.
Полинуклеотиды
Как используется здесь, "полинуклеотид" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей множественные нуклеотиды, и обычно относится как к "олигонуклеотидам" (молекула полинуклеотида длиной 18-25 нуклеотидов), так и к полинуклеотидам из 26 или более нуклеотидов. Варианты воплощения настоящего изобретения включают композиции, включающие олигонуклеотиды длиной 18-25 нуклеотидов (например, 18-членные, 19-членные, 20-членные, 21-членные, 22-членные, 23-членные, 24членные или 25-членные), или полинуклеотиды средней длины, содержащие 26 или более нуклеотидов (например, полинуклеотиды из 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 210, приблизительно 220, приблизительно 230, приблизительно 240, приблизительно 250, приблизительно 260, приблизительно 270, приблизительно 280, приблизительно 290 или приблизительно 300 нуклеотидов), или длинные полинуклеотиды длиной более приблизительно 300 нуклеотидов (например, полинуклеотиды от приблизительно 300 до приблизительно 400 нуклеотидов, от приблизительно 400 до приблизительно 500 нуклеотидов, от приблизительно 500 до приблизительно 600 нуклеотидов, от приблизительно 600 до приблизительно 700 нуклеотидов, от приблизительно 700 до приблизительно 800 нуклеотидов, от приблизительно 800 до приблизительно 900 нуклеотидов, от приблизительно 900 до приблизительно 1000 нуклеотидов, от приблизительно 300 до приблизительно 500 нуклеотидов, от приблизительно 300 до приблизительно 600 нуклеотидов, от приблизительно 300 до приблизительно 700 нуклеотидов, от приблизительно 300 до приблизительно 800 нуклеотидов, от приблизительно 300 до приблизительно 900 нуклеотидов или приблизительно 1000 нуклеотидов длиной, или более приблизительно 1000 нуклеотидов длиной, например, до полного размера гена-мишени, включая кодирующие или некодирующие, или как кодирующие, так и некодирующие фрагменты гена-мишени). Если полинуклеотид является двуцепочечным, его длину можно описать аналогичным образом в парах оснований.
Композиции полинуклеотидов, использованные в различных вариантах воплощения настоящего изобретения, включают олигонуклеотиды или полинуклеотиды или их смеси, включая РНК или ДНК или гибриды РНК/ДНК или химически модифицированные олигонуклеотиды или полинуклеотиды или их смеси. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может представлять собой комбинацию рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, например, синтетические полинуклеотиды, состоящие главным образом из рибонуклеотидов, но содержащие один или более концевых дезоксирибонуклеотидов, или синтетические полинуклеотиды, состоящие главным образом из дезоксирибонуклеотидов, но содержащие один или более концевых дидезоксирибонуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотид включает неканонические нуклеотиды, например, инозин, тиоуридин или псевдоуридин. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотид включает химически модифицированные нуклеотиды. Примеры химически модифицированных олигонуклеотидов или полинуклеотидов широко известны в данной области техники; см., например, Уегша апб Ескк1еш (1998) Аппи. Кеу. Вюсйеш., 67:99-134. Например, природный фосфодиэфирный каркас олигонуклеотида или полинуклеотида может быть частично или полностью модифицирован фосфортиоатными, фосфордитиоатными или метилфосфонатными межнуклеотидными связями, при синтезе олигонуклеотида или полинуклеотида можно использовать модифицированные нуклеиновые основания или модифицированные углеводы, и олигонуклеотиды или полинуклеотиды можно метить флуоресцентной молекулой (например, флуоресцеином или родамином)
- 5 029482
или другой меткой (например, биотином).
Полинуклеотиды могут представлять собой одно- или двуцепочечную РНК или одно- или двуцепочечную ДНК, или двуцепочечные гибриды ДНК/РНК или их модифицированные аналоги, и могут иметь длину олигонуклеотида или более. В более конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения полинуклеотиды, обеспечивающие поступление одноцепочечной РНК в растительную, выбирают из группы, состоящей из: (а) одноцепочечной молекулы РНК, (Ь) одноцепочечной молекулы РНК, самогибридизующейся с образованием двуцепочечной молекулы РНК, (с) двуцепочечной молекулы РНК, (б) одноцепочечной молекулы ДНК, (е) одноцепочечной молекулы ДНК, самогибридизующейся с образованием двуцепочечной молекулы ДНК, и (Г) одноцепочечной молекулы ДНК, включающей модифицированный ген Ροϊ III, транскрибирующийся в молекулу РНК, (д) двуцепочечной молекулы ДНК, (Н) двуцепочечной молекулы ДНК, включающей модифицированный ген Ροϊ III, транскрибирующийся в молекулу РНК, (ί) двуцепочечной гибридизующейся молекулы РНК/ДНК, или их комбинаций. В некоторых вариантах воплощения эти полинуклеотиды включают химически модифицированные нуклеотиды или неканонические нуклеотиды. В вариантах воплощения способа полинуклеотиды включают двуцепочечную ДНК, образованную за счет внутримолекулярной гибридизации, двуцепочечную ДНК, образованную за счет межмолекулярной гибридизации, двуцепочечную РНК, образованную за счет внутримолекулярной гибридизации или двуцепочечную РНК, образованную за счет межмолекулярной гибридизации. В одном варианте воплощения полинуклеотиды включают одноцепочечную ДНК или одноцепочечную РНК, самогибридизующиеся с образованием шпилечной структуры, имеющей по меньшей мере частично двуцепочечную структуру, включающую по меньшей мере один сегмент, способный гибридизоваться при физиологических условиях в клетке с РНК, транскрибированной с гена, являющегося мишенью супрессии. Без привязки к любому механизму считается, что такие полинуклеотиды продуцируют или будут продуцировать одноцепочечную РНК, включающую по меньшей мере один сегмент, способный гибридизоваться при физиологических условиях в клетке с РНК, транскрибированной с гена, являющегося мишенью супрессии. В некоторых других вариантах воплощения полинуклеотиды также включают промотор, обычно промотор, функционирующий в растительной клетке, например, промотор ροϊ II, промотор ροϊ III, промотор ροϊ IV или промотор ροϊ V.
В некоторых вариантах воплощения композиции полинуклеотидов содержат противоионы или другие молекулы, способные присоединяться к молекулам нуклеиновых кислот, например, ионы тетраалкиламмония, ионы триалкиламмония, ионы сульфония, ионы лития и полиамины, например, спермин, спермидин или путресцин. В некоторых вариантах воплощения композиции полинуклеотидов содержат неполинуклеотидные гербициды (например, химические гербициды, описанные здесь в разделе, озаглавленном "Белки, обеспечивающие устойчивость к гербицидам") или транспортный агент или агент, усиливающий проницаемость (см. раздел, озаглавленный "Агенты и варианты обработки, усиливающие проницаемость").
Полинуклеотиды предназначены для индукции системной регуляции или супрессии эндогенного гена растения и сконструированы таким образом, что содержат последовательность, практически идентичную или практически комплементарную последовательности (которая может представлять собой кодирующую последовательность или некодирующую последовательность) эндогенного гена растения или последовательности РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена растения. Под "практически идентичной" или "практически комплементарной" понимают то, что полинуклеотиды (или по меньшей мере одна цепь двуцепочечного полинуклеотида) предназначены для гибридизации с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена при физиологических условиях в клетках растения с целью регуляции или супрессии эндогенного гена.
Варианты воплощения одноцепочечных полинуклеотидов, действующих в рамках настоящего изобретения, обладают комплементарностью последовательности, которая не обязательно должна составлять 100%, но должна быть по меньшей мере достаточной для возможности гибридизации с РНКтранскриптом гена-мишени с образованием двуцепочечной структуры при физиологических условиях в растительной клетке, дающей возможность расщепления по механизму сайленсинга генов. Так, в вариантах воплощения сегмент конструируют таким образом, что он является практически идентичным или практически комплементарным непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов генамишени или матричной РНК, являющейся транскриптом гена-мишени. Под "практически идентичным" понимают 100% идентичность последовательности или по меньшей мере приблизительно 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности по сравнению с непрерывной последовательностью из 18 или более нуклеотидов гена-мишени или РНК, являющейся транскриптом гена-мишени; под "практически комплементарным" понимают 100% комплементарность последовательности или по меньшей мере приблизительно 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% комплементарность последовательности по сравнению с непрерывной последовательностью из 18 или более нуклеотидов гена-мишени или РНК, являющейся транскриптом гена-мишени. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения молекулы полинуклеотида конструируют таким образом, что они обладают 100% идентичностью или комплементарностью одному аллелю данного гена-мишени (например, кодирующей или некодирующей последовательности гена белка, обеспечи- 6 029482
вающего устойчивость к гербициду, белка, инактивирующего гербицид, гена стрессовой реакции или жизненно необходимого гена); в других вариантах воплощения молекулы полинуклеотида конструируют таким образом, что они обладают 100% идентичностью или комплементарностью множественным аллелям данного гена-мишени.
В одном из аспектов настоящего изобретения полинуклеотиды представляют собой модифицированные гены РНК-полимеразы III, например, гены, транскриптом которых является 7§Ь РНК сигналузнающей частицы или сплайсомная РНК Иб (гены Ροϊ III) или полинуклеотиды, содержащие функциональную последовательность промотора Ροϊ III. В одном из вариантов воплощения полинуклеотиды представляют собой модифицированные гены Ροϊ III, содержащие смысловую и антисмысловую ДНК, соответствующие РНК гена-мишени для регуляции путем замещения последовательности ДНК, исходно транскрибируемой геном Ροϊ III.
Полинуклеотиды, пригодные для использования в рамках настоящего изобретения, обычно влияют на регуляцию или модулирование (например, супрессию) экспрессии генов в течение периода жизни обработанного растения, равного по меньшей мере 1 неделе или более, обычно осуществляемые системным образом. Например, в течение нескольких суток после обработки листа растения композицией полинуклеотида по настоящему изобретению в листьях, расположенных латеральнее и выше обработанного листа, и в верхушечных тканях можно обнаружить первичные и промежуточные миРНК.
Способы изготовления полинуклеотидов общеизвестны в данной области. При изготовлении олигонуклеотидов в коммерческих масштабах обычно получают 2 дезоксирибонуклеотида на З'-конце смысловой цепи. Длинные молекулы полинуклеотидов можно синтезировать при использовании доступных для приобретения наборов, например, наборы от ЛтЪюи содержат ДНК, лигированную на 5'-конце, кодирующую промотор бактериальной полимеразы Т7, образующей цепи РНК, которые можно объединить в дцРНК. В качестве альтернативы молекулы дцРНК можно продуцировать при использовании экспрессионных кассет в бактериальных клетках с регулируемой или дефектной активностью фермента РНКазы III. Длинные молекулы полинуклеотидов также можно собрать из множественных фрагментов РНК или ДНК. В некоторых вариантах воплощения при выборе полинуклеотидных последовательностей, эффективных при сайленсинге генов, используют известные в данной области техники параметры, например, шкалу Рейнольдса (Ρονηοϊύδ δαοΐΌ) и правила Ташля (ТиксЫ ги1с5). В некоторых вариантах воплощения при выборе полинуклеотидных последовательностей, эффективных при сайленсинге генов, используют случайные конструкции или эмпирический выбор последовательностей полинуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения для снижения случайного сайленсинга других генов выполняют скрининг последовательности полинуклеотида по отношению к геномной ДНК целевого растения.
Композиции полинуклеотидов по настоящему изобретению можно использовать в виде композиций, например, растворов молекул полинуклеотида в низких концентрациях, по отдельности или в комбинации с другими компонентами (например, поверхностно-активными веществами, солями и неполинуклеотидными гербицидами), объединенными в одном и том же растворе или в раздельно применяемых растворах. Хотя верхнего предела концентраций и дозировок молекул полинуклеотидов, который можно было бы использовать в способах согласно изобретению, не существует, с точки зрения эффективности обычно следует определять наименьшие эффективные концентрации и дозировки. Концентрации следует корректировать с учетом объема аэрозоля, наносимого на листья растений. В одном из вариантов воплощения при обработке травянистых растений молекулами 25-членного олигонуклеотида было целесообразно использовать приблизительно 1 наномоль молекул олигонуклеотида на растение, например, от приблизительно 0,05 до 1 наномоль на растение. Другие варианты воплощения для травянистых растений включают пригодные для использования диапазоны от приблизительно 0,05 до приблизительно 100 наномоль, или приблизительно от 0,1 до приблизительно 20 наномоль, или приблизительно от 1 наномоль до приблизительно 10 наномоль полинуклеотидов на растение. Для обработки очень крупных растений, деревьев или лиан может требоваться соответственным образом увеличенные количества полинуклеотидов. При использовании длинных молекул дцРНК, которые могут быть процессированы на множественные олигонуклеотиды, можно использовать более низкие концентрации. В примерах для дальнейшего иллюстрирования вариантов воплощения настоящего изобретения по отношению к молекулам олигонуклеотидов произвольно используют множитель IX для обозначения нанесения 0,8 наномоль молекул полинуклеотида на растение; 10Х - 8 наномоль молекул полинуклеотида на растение; а 100Х - 80 наномоль молекул полинуклеотида на растение. Например, в примере 2З растения обрабатывали водным раствором, включающим 100Х наносимое количество дцРНК ΕΡδΡδ (2б4 микрограмма или 80 наномоль) на растение.
Молекулы одноцепочечной РНК
Настоящее изобретение представляет молекулы полинуклеотидов, обеспечивающие одноцепочечную РНК для системной регуляции генов в растительной клетке. Конкретнее, настоящее изобретение также представляет способы композиции и способы для индукции системной регуляции (например, системной супрессии или сайленсинга) гена-мишени растения путем наружного нанесения на растение молекулы полинуклеотида, содержащей сегмент нуклеотидной последовательности, практически идентичный или практически комплементарный непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов
- 7 029482
гена-мишени или РНК-транскрипта гена-мишени, причем композиция проникает во внутренние ткани растения и индуцирует системную регуляцию гена-мишени за счет действия одноцепочечной РНК, гибридизующейся с РНК-транскриптом, например, матричной РНК. Молекула полинуклеотида может представлять собой одну или несколько молекул полинуклеотида, содержащий один такой сегмент, много копий такого сегмента, много таких сегментов, отличающихся друг от друга, или их комбинацию.
Транспортные агенты, агенты и варианты обработки, усиливающие проницаемость
Композиции и способы согласно изобретению могут включать транспортные агенты или агенты и варианты обработки, повышающие проницаемость, для модификации поверхности тканей растения, например, листьев, стеблей, корней, цветков или плодов для проникновения молекул полинуклеотидов в клетки растения. Транспорт полинуклеотидов в клетки растения можно облегчить за счет более раннего или одновременного нанесения агента, транспортирующего нуклеотиды, на поверхность растения. В некоторых вариантах воплощения транспортный агент наносили непосредственно после нанесения композиции полинуклеотида. Агент, транспортирующий полинуклеотиды, дает возможность прохода полинуклеотидов через барьеры кутикулярного воска, устьица и/или барьеры клеточной стенки и мембраны в клетку растения. Подходящие агенты для облегчения транспорта композиции в клетку растения включают агенты, усиливающие проницаемость внешних тканей растения или усиливающие проницаемость растительных клеток для олигонуклеотидов и полинуклеотидов. Такие агенты для облегчения транспорта композиции в растительную клетку включают химический агент или физический агент или их комбинации. Химические агенты для модификации включают: (а) поверхностно-активные вещества, (Ь) органические растворители или водные растворы или водные смеси органических растворителей, (с) окислители, (е) кислоты, (ί) основания, (д) масла, (Н) ферменты или их комбинации. Варианты воплощения способа могут необязательно включать этап инкубации, этап нейтрализации (например, для нейтрализации кислоты, основания или окислителя или инактивации фермента), этап промывки или их комбинации. Варианты воплощения агентов или вариантов обработки для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов включают эмульсии, обратные эмульсии, липосомы и другие мицеллоподобные композиции. Варианты воплощения агентов или вариантов обработки для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов включают противоионы или другие молекулы, способные присоединяться к молекулам нуклеиновых кислот, например, неорганические ионы аммония, ионы алкиламмония, ионы лития, полиамины, например, спермин, спермидин или путресцин и другие катионы. Органические растворители, пригодные для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов, включают ДМСО, ДМФ, пиридин, Ν-пирролидин, гексаметилфосфорамид, ацетонитрил, диоксан, полипропиленгликоль, другие растворители, смешивающиеся с водой или способные растворять фосфонуклеотиды в неводных системах (например, растворители, используемые в реакциях синтеза). Можно использовать природные или синтетические масла с или без поверхностно-активных веществ или эмульгаторов, например, растительные масла, масла, снижающие поражение растений гербицидами (например, масла, перечисленные в 9-м Кратком руководстве по адъювантам гербицидов (9‘ь Сотрепбшт οί НегЫсМе Αάίιιναηΐδ). общедоступном он-лайн на \у\у\у.11егЫс10е.а0}иуап15.со1п). например, парафиновые масла, эфиры жирных кислот и полиолов или масла, содержащие короткоцепочечные молекулы, модифицированные амидами или полиаминами, например полиэтиленимином или Ν-тирролидином.
Такие агенты для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов наносят на растение любым стандартным способом, например, путем опрыскивания или нанесения порошка, эмульсии, суспензии или раствора; аналогично, молекулы полинуклеотида наносят на растение любым стандартным способом, например, путем опрыскивания или нанесения раствора, эмульсии или суспензии.
Примеры пригодных для использования поверхностно-активных веществ включают соли натрия или лития и жирных кислот (например, твердые жиры или амины твердых жиров или фосфолипиды) и кремнийорганические поверхностно-активные вещества Другие пригодные для использования поверхностно-активные вещества включают кремнийорганические поверхностно-активные вещества, включая неионогенные кремнийорганические поверхностно-активные вещества, например, поверхностноактивные вещества на основе трисилоксанэтоксилата или кремнийорганические полиэфирные сополимеры, например, сополимер гептаметилтрисилоксана, модифицированного полиалкиленоксидом, и метилового эфира аллилоксиполипропиленгликоля (доступного для приобретения как поверхностно-активное вещество 8П\уе1® Ь-77, имеющее СА§-номер 27306-78-1 и ЕРА-номер САЬ.РЕОАО. 5905-50073-АА, В настоящее время доступное у Мотепйуе РегГогтапсе МаЮпаН Олбани, штат Нью-Йорк, США). Если поверхностно-активное вещество 5>П\уе1 Ь-77 используют для предварительного опрыскивания листьев растений или других поверхностей, эффективными для подготовки листьев или других поверхностей растения для транспорта полинуклеотидов в клетки растения при наружном нанесении на поверхность являются концентрации в диапазоне от приблизительно 0,015 до приблизительно 2 массовых процентов (мас. %) (например, приблизительно 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас.%).
Пригодные для использования физические агенты могут включать: (а) абразивы, например, карборунд, корунд, песок, кальцит, пемзу, гранат и т. п., (б) наночастицы, например, углеродные нанотрубки,
- 8 029482
или (с) физическую силу. Углеродные нанотрубки описаны Кат е( а1. (2004) 1. Ат. СНет. §ос., 126 (22): 6850-6851, Ии е! а1. (2009) \апо Ье!!., 9(3): 1007-1010 и КкоДакоуккауа е! а1. (2009) АС8 Ыаио, 3(10): 3221-3227. Агенты на основе физических сил могут включать нагревание, охлаждение, воздействие положительным давлением или обработку ультразвуком. Варианты воплощения способа могут необязательно включать этап инкубации, этап нейтрализации (например, для нейтрализации кислоты, основания или окислителя или инактивации фермента), этап промывки или их комбинации. Способы согласно изобретению также могут включать использование других агентов, которые оказывают усиливающее действие вследствие сайленсинга некоторых генов. Например, если полинуклеотид предназначен для регуляции генов, обеспечивающих устойчивость к гербицидам, последующее применение гербицида может оказывать сильное действие на эффективность гербицида.
Агенты для лабораторного усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов включают, например, нанесение химического агента, ферментативную обработку, нагревание или охлаждение, воздействие положительным или отрицательным давлением или обработку ультразвуком. Агенты для усиления проницаемости тканей растения в полевых условиях включают химические агенты, например, поверхностно-активные вещества и соли.
Гены-мишени и гены, необходимые для жизнедеятельности
Композиции и способы согласно изобретению можно использовать для модулирования экспрессии эндогенного или трансгенного гена-мишени в растительной клетке. В различных вариантах воплощения ген-мишень включает кодирующую (кодирующую белок или транслируемую) последовательность, некодирующую (нетранслируемую) последовательность или как кодирующую, так и некодирующую последовательности. Композиции согласно изобретению могут включать полинуклеотиды и олигонуклеотиды, предназначенные для адресного воздействия на множественные гены или множественные сегменты одного или более генов. Ген-мишень может включать множественные последовательные сегменты гена-мишени, множественные непоследовательные сегменты гена-мишени, множественные аллели генамишени или множественные гены-мишени одного или более видов. Примеры генов-мишеней включают эндогенные гены растений и трансгены, экспрессирующиеся в растительных клетках. Другие примеры генов-мишеней включают эндогенные гены вирусов-патогенов растений или эндогенные гены беспозвоночных-вредителей растений.
Гены-мишени могут включать гены, кодирующие белки, обеспечивающие устойчивость к гербицидам, некодирующие последовательности, включая регуляторные РНК, и гены, необходимые для жизнедеятельности, которые представляют собой гены, необходимые для поддержания клетки в живом состоянии или для поддержания функций размножения организма. Варианты воплощения генов, необходимых для жизнедеятельности, включают гены, вовлеченные в репликацию ДНК или РНК, транскрипцию генов, РНК-опосредованную регуляцию генов, синтез белка, получение энергии и деление клетки. Один из примеров краткого справочника по генам, необходимым для жизнедеятельности, описан в работе йНапц е! а1. (2004) Ыис1е1с Ααάκ Кек., 32:Ό271-Ό272 и доступен на тЫсЛцгеДи.сп/Дед/: версия ΌΕΟ 5,4 списки 777; гены, необходимые для жизнедеятельности АгаЫДор515 (НаПапа. Примеры генов, необходимых для жизнедеятельности, включают фактор инициации трансляции (ΊΊΡ) и рибулозо-1,5бисфосфаткарбоксилазу/оксигеназу (КиВ15СО). Гены-мишени могут включать гены, кодирующие факторы транскрипции, и гены, кодирующие ферменты, вовлеченные в биосинтез или катаболизм молекул у растений, например, не ограничиваясь ими, аминокислот, жирных кислот и других липидов, Сахаров и других углеводов, биологических полимеров и вторичных метаболитов, включая алкалоиды, терпеноиды, поликетиды, нерибосомные пептиды и вторичные метаболиты смешанного биосинтетического происхождения.
Композиции и способы
Одноцепочечные молекулы РНК согласно изобретению можно внедрять в клетку растения напрямую в виде РНК или непрямым образом, например, когда молекулы полинуклеотида в композиции для обработки вызывают в клетке растения продукцию одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться с транскриптом гена-мишени. Во многих вариантах воплощения композиции молекул полинуклеотидов, кроме того, включают один или несколько агентов, усиливающих проницаемость, для облегчения транспорта молекул полинуклеотидов в растительную клетку, например, агенты для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов. В аспектах настоящего изобретения способы включают одно или более нанесений композиции полинуклеотида и одно или более нанесений агента, усиливающего проницаемость, для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов. Если агент для усиления проницаемости представляет собой кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, варианты воплощения молекул полинуклеотидов представляют собой двуцепочечные РНК-олигонуклеотиды, одноцепочечные РНК-олигонуклеотиды, двуцепочечные РНК-полинуклеотиды, одноцепочечные РНКполинуклеотиды, двуцепочечные ДНК-олигонуклеотиды, одноцепочечные ДНК-олигонуклеотиды, двуцепочечные ДНК-полинуклеотиды, одноцепочечные ДНК-полинуклеотиды, химически модифицированные РНК- или ДНК-олигонуклеотиды или полинуклеотиды или их смеси.
Один из аспектов настоящего изобретения представляет способ для индукции системного сайленсинга гена-мишени в растении, включающий: (а) усиление проницаемости тканей растения для полинук- 9 029482
леотидов и (б) наружного нанесения молекул полинуклеотида на растение, причем молекулы полинуклеотида включают по меньшей мере один непрерывный сегмент из 18 или более нуклеотидов, клонированный или иным образом полученный из гена-мишени в антисмысловой или смысловой ориентации, за счет чего молекулы полинуклеотида проникают во внутренние ткани растения и индуцируют системный сайленсинг гена-мишени. Усиление проницаемости и нанесение полинуклеотидов можно выполнять раздельно или в один этап. Если усиление проницаемости и нанесение полинуклеотида выполняют в ходе отдельных этапов, усиление проницаемости может предшествовать или следовать за нанесением полинуклеотида в течение минут, часов или суток. В некоторых вариантах воплощения на одном и том же растении можно выполнять более одного этапа усиления проницаемости или более одного этапа нанесения молекул полинуклеотида. В вариантах воплощения способа указанный сегмент можно клонировать или получить из: (а) кодирующего (т.е. кодирующего белок), (б) некодирующего или (с) как кодирующего, так и некодирующего фрагментов гена-мишени. Некодирующие фрагменты включают ДНК (или РНК, кодируемую ДНК), кодирующую регуляторные РНК-последовательности (например, промоторы, интроны, 5'- или З'-нетранслируемые области, микро-РНК, транс-активные миРНК, природные антисмысловые миРНК и другие малые РНК, обладающие регуляторной функцией) или кодирующую РНК, обладающие структурной или ферментативной функцией (например, рибозимы, рибосомные РНК, тРНК, аптамеры и рибопереключатели).
В различных вариантах воплощения способа индукции системного сайленсинга гена-мишени в растении ген-мишень представляет собой: (а) эндогенный ген растения, (Ь) эндогенный ген вируса-патогена растения, (с) эндогенный ген беспозвоночного-вредителя растения, (б) эндогенный ген симбионта беспозвоночного-вредителя растения или (е) искусственный ген, внедренный в трансгенное растение. В вариантах воплощения, где ген-мишень является эндогенным геном растения, ген-мишень (а) представляет собой эндогенный ген растения, необходимый для поддержания роста или жизнедеятельности растения, (Ь) кодирует белок, обеспечивающий устойчивость растения к гербицидам или (с) транскрибируется в молекулу регуляторной РНК. В вариантах воплощения способа для индукции системного сайленсинга гена-мишени в растении усиление проницаемости включает нанесение химического агента, обработку абразивом, нанесение повреждений, ферментативную обработку, нагревание или охлаждение, воздействие положительным или отрицательным давлением, обработку ультразвуком или их комбинации. В некоторых вариантах воплощения усиление проницаемости включает нанесение поверхностно-активного вещества, например, кремнийорганических поверхностно-активных веществ, например, кремнийорганического полиэфирного сополимера, например, сополимера гептаметилтрисилоксана, модифицированного полиалкиленоксидом, и метилового эфира аллилоксиполипропиленгликоля (доступного для приобретения как поверхностно-активное вещество 8бие1® Ь-77). В вариантах воплощения способа усиление проницаемости включает нанесение: (а) поверхностно-активного вещества, (Ь) органического растворителя или водного раствора или водной смеси органического растворителя, (с) полипропиленгликоля или водного раствора или водной смеси полипропиленгликоля, (б) наночастиц, (е) окислителя, (ί) кислоты или основания или (д) масла или их комбинации. Варианты воплощения способа могут необязательно включать этап инкубации, этап нейтрализации (например, для нейтрализации кислоты, основания или окислителя или инактивации фермента), этап промывки или их комбинации.
Настоящее изобретение представляет композиции для наружного нанесения для индукции системного сайленсинга гена-мишени в растении, включающий: (а) агент для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов и (б) молекулы полинуклеотида, включающие по меньшей мере один непрерывный сегмент из 18 или более нуклеотидов, практически идентичный или комплементарный нуклеотидной последовательности гена-мишени в антисмысловой или смысловой ориентации. Такие композиции можно использовать в различных способах, описанных здесь, включая способы исследования "обратной" генетики путем модулирования эндогенного гена растения, а также в качестве гербицидных композиций для описанных способов борьбы с сорными растениями и самосевными растениями. Другой аспект изобретения представляет растение, включающее экзогенную ДНК или РНК для супрессии эндогенного гена, причем указанная экзогенная ДНК не интегрирована в хромосому растения, а экзогенная РНК не является транскриптом ДНК, интегрированной в хромосому растения, и причем эндогенный ген подавляют путем наружного нанесения полинуклеотида на растение. В качестве альтернативы экзогенная ДНК или РНК может быть предназначена для супрессии эндогенного гена растения, вовлеченного в реакцию на вредителя или патоген, для борьбы с вредителями или заболеваниями растений. Такое растение можно вырастить из семени или получить в процессе обрезки, клонирования или черенкования (т. е. растение, не выращенное из семени). Такое растение может являться пропашной культурой, фруктовым растением, овощным растением, деревом или декоративным растением. Например, в вариантах воплощения согласно изобретению, описанных здесь, растение представляет собой пропашную культуру (например, кукурузу, сою, хлопчатник, рапс, сахарную свеклу, люцерну, сахарный тростник, рис и пшеницу) или овощное растение (например, томат, сладкий перец, острый перец, дыню, арбуз, огурец, баклажан, цветную капусту, брокколи, салат, шпинат, лук, горох, морковь, сахарную кукурузу, китайскую капусту, лук-порей, фенхель, тыкву, кабачки или тыкву-горлянку, редис, брюссельскую капусту, физалис, бобы, фасоль или бамию), или зелень (например, базилик, петрушку, кофейное дерево или чайный куст),
- 10 029482
или фруктовое растение (например, яблоню, грушу, вишню, персик, сливу, абрикос, банан, овощной банан, столовые сорта винограда, винные сорта винограда, цитрусовые, авокадо, манго или ягодные культуры), или дерево, выращиваемое в декоративных или коммерческих целях (например, фруктовое или орехоплодное дерево), или декоративное растение (например, цветочное декоративное растение или кустарник, или газонную траву). Варианты воплощения растения, полученного в процессе обрезки, клонирования или черенкования (т.е. растения, не выращенного из семени), включают фруктовые деревья и растения, включая цитрусовые, яблони, авокадо, томаты, баклажан, огурец, дыни, арбузы и виноград, а также различные декоративные растения.
Способы исследования "обратной" генетики
В еще одном аспекте настоящее изобретение представляет способ исследования "обратной" генетики путем регуляции или модулирования эндогенного гена-мишени растения; такой способ включает нанесение на ткани растущего растения композиции для внедрения (прямым или непрямым образом) одноцепочечной РНК согласно изобретению для системной регуляции генов в растительную клетку. В вариантах воплощения такого способа матричная РНК, кодирующая белок, или ген регуляторной РНК подвергается адресному воздействию полинуклеотида согласно изобретению, что вызывает модулирование гена в течения периода жизни растения, равного по меньшей мере 1 неделе, например, с целью идентификации свойств, которые может придавать растению наружное нанесение полинуклеотидов. Указанный способ, кроме того, может включать дополнительные этапы, например, воздействие большого количества соединений на растение с целью идентификации взаимодействия гербицидов или воздействие на растение факторов абиотического стресса (например, недостатка воды, недостатка питательных веществ, теплового стресса, холодового стресса, солевого стресса) или биологическую обработку (например, проверку устойчивости к вредителям-насекомым или нематодам или вирусному, грибковому или бактериальному патогену, или воздействию химического соединения или биологического фактора) с целью идентификации реакций растения на стресс или обработку. В еще одном аспекте настоящего изобретения выполняют скрининг библиотек растений с различными генами, подвергнутыми временному сайленсингу, по отношению к библиотекам соединений (например, гербицидов, фитогормонов, эндогенных или экзогенных индукторов защитных веществ, например, салициловой кислоты или гарпинов, недостатка веществ, представляющих собой биогенные элементы для растений, например, азота, фосфора, калия, серы, кальция, магния, железа и цинка) с целью идентификации взаимодействий между такими соединениями. Примеры растений, пригодных для проведения такого скрининга, включают ЛтатаиШик ра1тег1 и ΝίεοΙίαηα ЪетНапйапа.
Способы сайленсинга трансгенов
В еще одном аспекте настоящего изобретения этот способ можно использовать для сайленсинга трансгена, экспрессируемого в растении, таким образом обеспечивая отрицательный контроль, дающий возможность независимого от события измерения участия трансгена в производительности растения или его действия на какое-либо свойство. Для получения отрицательного контроля может требоваться многократная последовательная обработка молекулами полинуклеотида согласно изобретению во время жизненного цикла растения.
Специфическое применение
В родственном аспекте композиции и способы согласно изобретению также можно использовать для временного сайленсинга одного или более генов в клетке растущего растения или целом растении для получения желательного фенотипа в ответ на условия культивирования, стресса под воздействием окружающей среды, абиотических или биологических факторов или изменения потребностей рынка во время вегетационного периода или после сбора урожая. Например, композиции и способы согласно изобретению можно использовать для временной супрессии генов биосинтеза или катаболизма с целью получения растения или растительного продукта с желательным фенотипом, например, желательной композицией питательных веществ в продуктах зерновых культур, например, супрессии гена ΡΆΌ2 для получения желательного профиля жирных кислот в сое или рапсовом масле или других масличных культурах, или супрессии генов биосинтеза лигнина, например, СОМТ и ССОМТ с целью получения более легкоусваиваемых кормовых растений. Аналогичным образом, композиции и способы согласно изобретению можно использовать для временной супрессии молекул регуляторных РНК, например, микро-РНК или ложной мишени эндогенной микро-РНК, например, эндогенной микро-РНК, предшественника микро-РНК или ложной мишени микро-РНК, как описано в публикации патентной заявки США 2009/0070898, включенной в настоящий документ посредством ссылки. Варианты воплощения настоящего изобретения можно использовать для супрессии эндогенного гена растения, вовлеченного в реакцию на вредителя или патоген, для борьбы с вредителями или заболеваниями растений. Полинуклеотиды, композиции и способы доставки, описанные здесь, кроме того, можно использовать для супрессии эндогенного гена-мишени беспозвоночного-вредителя растений, например, чешуекрылых или жесткокрылых вредителей, которые могут проглатывать РНК с растений, таким образом обеспечивая борьбу с вредителями растений или заболеваниями, вызываемыми вредителями, например, путем наружного опрыскивания зерновых, овощных культур или фруктовых деревьев молекулами ДНК или РНК, мишенью которых является ген, необходимый для жизнедеятельности беспозвоночного или симбионта беспозво- 11 029482
ночного-вредителя. Полинуклеотиды, композиции и способы доставки, описанные здесь, также можно использовать для обеспечения борьбы с вирусным патогеном, например, за счет наружного противовирусного опрыскивания зерновых, овощных культур или фруктовых деревьев молекулами ДНК или РНК, мишенью которых является ген вируса.
Гербицидные композиции и способы
Один из аспектов настоящего изобретения представляет жидкую гербицидную композицию, включающую молекулы полинуклеотида в качестве агентов, вызывающих гибель растения, обеспечивающую внедрение по меньшей мере одной разновидности одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться при физиологических условиях в растительной клетке с РНК-транскриптом эндогенного(ых) гена(ов) растительной клетки. В некоторых вариантах воплощения ген-мишень кодирует белок, обеспечивающий устойчивость к гербицидам, или кодирует ген, необходимый для поддержания роста или жизнедеятельности растения. Жидкая гербицидная композиция, кроме того, может включать агенты, усиливающие проницаемость, ненуклеотидные гербициды или их комбинации, и может быть использована при многостадийной обработке ненуклеотидными гербицидами и/или агентами, усиливающими проницаемость, наносимыми раздельно. Один из вариантов воплощения жидкой гербицидной композиции представляет собой жидкость, включающую кремнийорганическое поверхностно-активное вещество в качестве агента, усиливающего проницаемость, и олигонуклеотиды или полинуклеотиды в качестве агентов, вызывающих гибель растения, обеспечивающую внедрение в клетки растения по меньшей мере одной разновидности одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться при физиологических условиях в растительной клетке с РНК-транскриптом гена-мишени растительной клетки, вызывая сайленсинг гена-мишени. В одном из вариантов воплощения жидкая гербицидная композиция, эффективная против растений, устойчивых к глифосату, включает кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например поверхностно-активное вещество δί1\\Όΐ® Ь-77, и молекулы полинуклеотида для внедрения одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться с РНК-транскриптом эндогенного или трансгенного гена ΕΡδΡδ, кодирующего белок ΕΡδΡδ, устойчивый к глифосату, при физиологических условиях в растительной клетке. Если молекула полинуклеотида предназначена для гибридизации при физиологических условиях в растительной клетке с мРНК, кодирующей эндогенный белок или РНК, не кодирующей белок, необходимыми для поддержания роста или жизнедеятельности, и для сайленсинга генов и снижения количества необходимого для жизнедеятельности белка, то молекула полинуклеотида может действовать в качестве агента, вызывающего гибель растения, т.е. нуклеотидного гербицида. Эти гербицидные композиции, включающие молекулы полинуклеотида, можно приспособить для наружного нанесения на листья растущего растения или для нанесения на корни или обрезанные стебли, например, на растения, выращенные в горшках или в гидропонной системе.
Один из аспектов настоящего изобретения представляет композицию, приспособленную для наружного нанесения на листья или другие поверхности живого растения, включающую агент, усиливающий проницаемость, например, поверхностно-активное вещество, например, кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, и олигонуклеотиды или полинуклеотиды, обеспечивающие внедрение (прямым или непрямым образом) одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться при физиологических условиях в растительной клетке с РНК-транскриптом эндогенного гена растительной клетки. В одном из вариантов воплощения эндогенный ген растения представляет собой эндогенный ген растения, кодирующий белок, обеспечивающий устойчивость к гербицидам, например, глифосату, дикамбе или сульфонилмочевины. Примеры таких белков, обеспечивающих устойчивость к гербицидам, описаны ниже в разделе "Белки, обеспечивающие устойчивость к гербицидам".
Еще один аспект изобретения представляет собой способ борьбы с самосевными устойчивыми к гербицидам растениями, растущими на поле с культурами, устойчивыми к гербицидам, включающий нанесение на листья или другие поверхности самосевных растений композиции, обеспечивающей внедрение или дающей возможность продукции в клетках самосевного растения молекулы одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться при физиологических условиях в клетке самосевного растения с РНКтранскриптом эндогенного гена клетки, причем указанный эндогенный ген (ί) представляет собой ген, необходимый для поддержания роста или жизнедеятельности самосевного растения, (ίίί) кодирует белок, обеспечивающий устойчивость самосевного растения к гербицидам или (ίίί) транскрибируется в регуляторный РНК-агент (например, промоторы, а также предшественники микро-РНК, микро-РНК, трансактивные миРНК и другие некодирующие РНК, обладающие регуляторной функцией, например, аптамеры и рибопереключатели). Композиция, обеспечивающая внедрение или дающая возможность продукции в клетках самосевного растения молекулы одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться при физиологических условиях в клетке самосевного растения с РНК-транскриптом эндогенного гена клетки, включает по меньшей мере одну молекулу полинуклеотида, выбранную из группы, состоящей из: (а) одноцепочечной молекулы РНК, (Ь) одноцепочечной молекулы РНК, самогибридизующейся с образованием двуцепочечной молекулы РНК, (с) двуцепочечной молекулы РНК, (б) одноцепочечной молекулы ДНК, (е) одноцепочечной молекулы ДНК, самогибридизующейся с образованием двуцепочечной молекулы ДНК, и (Г) одноцепочечной молекулы ДНК, включающей модифицированный ген Ροϊ III, транскрибирующийся в молекулу РНК, (д) двуцепочечной молекулы ДНК, (Н) двуцепочечной молекулы ДНК,
- 12 029482
включающей модифицированный ген Ροϊ III, транскрибирующийся в молекулу РНК, (ί) двуцепочечной гибридизующейся молекулы РНК/ДНК. В вариантах воплощения сайленсинга или супрессии эндогенного гена самосевного растения, кодирующего белок, обеспечивающий устойчивость самосевного растения к гербицидам, указанный способ может включать нанесение некоторого количества гербицида, к которому указанный белок обеспечивает устойчивость, на самосевное растение. Композиции и способы согласно изобретению можно использовать для борьбы с сорными растениями, малочувствительными (устойчивыми) к гербицидам, или самосевными трансгенными растениями, малочувствительными (устойчивыми) к гербицидам, которые могут расти на полях культур, например, на поле устойчивой к гербицидам культуры, например, кукурузы, сои, хлопчатника, рапса, сахарной свеклы, люцерны, сахарного тростника, риса, пшеницы, а также фруктовых и овощных культур. В некоторых из таких вариантов воплощения сорное или самосевное растение представляет собой амарант (например, амарант Палмера) и другие виды амаранта, мелколепестничек канадский, амарант грязный/амарант бугорчатый, амброзию трехраздельную, амброзию полыннолистную, сорго алеппское, элевсину индийскую, плевел, росичку кровяную, латук компасный, канатник Теофраста, люцерну, кукурузу, сою, рапс, хлопчатник, сахарную свеклу, сахарный тростник, рис или пшеницу. В некоторых из таких вариантов воплощения эндогенный ген кодирует белок, обеспечивающий устойчивость к гербицидам; примеры таких белков описаны здесь в разделе "Белки, обеспечивающие устойчивость к гербицидам". В других таких вариантах воплощения одноцепочечная РНК селективно подавляет ген в растении конкретного вида, но не в других растениях, что дает возможность селективной борьбы с этим видом растений. В других таких вариантах воплощения неселективная молекула одноцепочечной РНК подавляет распространенный ген в растениях многих видов, что дает возможность борьбы с расширенной группой или таксоном растений. В более конкретных вариантах воплощения указанный способ также включает нанесение на сорное или самосевное растение некоторого количества ненуклеотидного гербицида (например, глифосата, дикамбы, глюфосината или сульфонилмочевины), к которому белок, являющийся мишенью молекулы РНК, обеспечивает устойчивость, что дает возможность использования двойного механизма действия за счет снижения продукции белка-мишени под действием молекулы РНК и ингибирования функции продуцируемого белка под действием ненуклеотидного гербицида; гербицид можно применять на отдельном (более раннем или позднем) этапе или совместно с композицией нуклеотида. Применение композиции полинуклеотида одновременно или после применения традиционного ненуклеотидного гербицида в некоторых случаях обеспечивает синергический эффект борьбы с сорными или самосевными растениями (т. е. когда совместный эффект превышает сумму эффектов раздельной обработки).
Белки, обеспечивающие устойчивость к гербицидам
Природные (нетрансгенные) и трансгенные растения, обладающие малой чувствительностью (устойчивостью) к гербицидам часто содержат ген, кодирующий белок, ответственный за устойчивость к гербицидам, т. е. трансген, обеспечивающий устойчивость, мутированный эндогенный ген, обеспечивающий устойчивость или множественные копии эндогенного гена, являющегося обычной мишенью гербицида. Стратегия борьбы с такими растениями заключается в применении агента, который подавляет или по меньшей мере снижает экспрессию гена, кодирующего белок, придающий устойчивость к гербицидам. Примеры белков, обеспечивающих устойчивость к гербициду, включают, например, 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ΕΡδΡδ), глифосатоксидоредуктазу (СОХ), глифосатдекарбоксилазу, глифосат-Ы-ацетилтрансферазу (САТ), дикамбамонооксигеназу, фосфинотрицинацетилтрансферазу, дегалогеназу 2,2-дихлорпропионовой кислоты, синтазу ацетогидроксикарбоновой кислоты, ацетолактатсинтазу, галоарилнитрилазу, ацетил-кофермент А-карбоксилазу, дигидроптероатсинтазу, фитоиндесатуразу, оксигеназу протопорфирина IX, гидроксифенилпируватдиоксигеназу, парааминобензоатсинтазу, глутаминсинтазу, целлюлозосинтазу, бета-тубулин и серингидроксиметилтрансферазу.
Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих белки, придающие устойчивость к гербицидам, включают 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ΕΡδΡδ; см., например, патенты США № 5627061, 5633435 ΚΕ39247, 6040497 и 5094945 и публикации международных заявок ΡΟΤ XVО 04074443 и ХУО 04009761), глифосатоксидоредуктазу (СОХ; патент США № 5463175), глифосатдекарбоксилазу (публикация международной заявки ΡСΤ VО 05003362, патент США № 7405347 и публикация патентной заявки США 2004/0177399), глифосат-Ы-ацетилтрансферазу (САТ; патент США № 7714188), придающую устойчивость к глифосату; дикамбамонооксигеназу, придающую устойчивость к ауксин-подобным гербицидам, например, дикамбе (патент США № 7105724); фосфинотрицинацетилтрансферазу (ра! или Баг), придающую устойчивость к фосфинотрицину или глюфосинату (патент США № 5646024); дегалогеназу 2,2-дихлорпропионовой кислоты, придающую устойчивость к 2,2-дихлорпропионовой кислоте (далапону) (публикация международной заявки ΡСΤ VО 9927116); синтазу ацетогидроксикарбоновой кислоты или ацетолактатсинтазу, придающую устойчивость к ингибиторам ацетолактатсинтазы, например, сульфонилмочевине, имидазолинону, триазолпиримидину, пиримидилоксибензоатам и фталиду (патент США № 6225105); галоарилнитрилазу (Вхп), придающую устойчивость к бромоксинилу (патент США № 4810648); модифицированную ацетил-коферментА-карбоксилазу, придающую устойчивость к циклогександиону (сетоксидиму) и арилоксифеноксипропионату (галоксифопу) (патент США № 6414222); дигидроптероатсинтазу (ки1 I), придающую устойчивость к сульфонамидным гербицидам (патент США №
- 13 029482
5719046); 32 кДа-полипептид фотосистемы II (ркЬА), придающий устойчивость к триазиновым гербицидам (Н1Г8сЬЬег§ с1 а1., 1983, §с1еисе, 222:1346-1349); антранилатсинтазу, придающую устойчивость к 5метилтриптофану (патент США № 4581847); синтазу дигидродипиколиновой кислоты (бар А), придающую устойчивость к аминоэтилцистеину (публикация международной заявки РСТ XVО 8911789); фитоиндесатуразу (сШ), придающую устойчивость к пиридазиноновым гербицидам, например, норфлуразону (патент Японии 1Р 06343473); гидроксифенилпируватдиоксигеназу, оксидазу 4-гидроксифенилуксусной кислоты и 1-гидролазу 4-гидроксифенилуксусной кислоты (патент США 7304209), придающий устойчивость к циклопропилизоксазоловым гербицидам, например, изоксафлютолу (патент США № 6268549); модифицированную протопорфириногеноксидазу I (ρτοΐοχ), придающую устойчивость к ингибиторам протопорфириногеноксидазы (патент США № 5939602); арилоксиалканоатдиоксигеназу (ААО-1), придающую устойчивость к гербицидам, содержащим арилоксиалканоатную группу (νθ 05107437); серингидроксиметилтрансферазу (публикация патентной заявки США 2008/0155716), устойчивую к глюфосинату глутаминсинтазу (публикация патентной заявки США 2009/0018016). Примеры таких гербицидов включают феноксиауксины (например, 2,4-0 и дихлорпроп), пиридилоксиауксины (например, флуроксипир и трициклопир), арилоксифеноксипропионаты (АОРР) ингибиторы ацетил-кофермент А-карбоксилазы (АССаке) (например, галоксифоп, квизалофоп и диклофоп) и ингибиторы оксидазы 5-замещенного феноксиацетатпротопорфириногена IX (например, пирафлуфен и флумиклорак). Нуклеотидные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белки, обеспечивающие устойчивость к гербицидам, и последовательности белков, обеспечивающих устойчивость к гербицидам, соответствующие описанию в патенте США и публикациях патентных заявок, цитированных в этом абзаце, включены в настоящий документ в качестве ссылок.
Аспекты настоящего изобретения представляют полинуклеотиды и способы для прямого или непрямого внедрения в растительную клетку РНК, которые гибридизуются с РНК, кодирующей такие белки, обеспечивающие устойчивость к гербицидам, на уровне, смертельном для растения, или по меньшей мере на уровне, снижающем устойчивость к гербицидам. Вследствие вырождения последовательности ДНК, кодирующей белки, обеспечивающие устойчивость к гербицидам, можно сконструировать полинуклеотид для использования согласно изобретению, являющийся особенно эффективным в отношении конкретного растения. Вследствие консервативности доменов ДНК среди множества растений можно сконструировать полинуклеотид для использования согласно изобретению, являющийся эффективным в отношении различных растений.
В варианте воплощения полинуклеотид смешивали с соответствующим гербицидом для усиления активности гербицида путем обеспечения усиленной гербицидной активности. В варианте воплощения полинуклеотид использовали отдельно от гербицида, но в комбинации с применением гербицида в качестве пред- или постобработки. В вариантах воплощения кремнийорганическое поверхностно-активное вещество успешно смешивали с гербицидом и полинуклеотидом или с гербицидом или полинуклеотидом, если эти композиции применяли последовательно. Растения в условиях вегетационного домика можно обработать с помощью самоходного гусеничного опрыскивателя или лабораторного опрыскивателя с насадкой 11001ХК для доставки образца раствора с определенной скоростью (например, 140 л/га) при давлении 0,25 МПа. В поле раствор для обработки можно наносить с помощью ранцевого опрыскивателя со сжатым СО2, калиброванного на определенную скорость подачи композиции, с плосколопастной насадкой 11015 с изготовленной на заказ единственной форсункой (для снижения загрязнений до минимума) при давлении распыла 0,25 МПа; распылитель с единственной форсункой обеспечивает полосу эффективного распыления на 60 см выше листового полога растущих растений высотой от 3 до 12 дюймов.
Вышеприведенное описание и примеры, представленные в настоящей заявке, описывают предмет настоящего изобретения, включающий аспекты и варианты воплощения, описанные в следующих пунктах, пронумерованных римскими цифрами, но не ограничивающийся ими: (I) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени. (II) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид ре- 14 029482
гулирует экспрессию эндогенного гена-мишени в клетках растения, отличающихся от клеток, подвергшихся такой наружной обработке. (III) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид системно регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени по меньшей мере в одном органе растения. (IV) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанная полинуклеотидная композиция индуцирует супрессию эндогенного гена-мишени. (V) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанная полинуклеотидная композиция вызывает желательный фенотип растущего растения или органа растения. (VI) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного генамишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанная полинуклеотидная композиция подавляет экспрессию фермента, структурного белка или регуляторного белка в растущем растении или органе растения. (VII) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного генамишени, причем указанная полинуклеотидная композиция представляет собой агент, вызывающий гибель растения. (VIII) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный эндогенный ген-мишень кодирует белок, взаимодействующий с гербицидом. (IX) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного генамишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по
- 15 029482
меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный эндогенный ген-мишень выбирают из группы, состоящей из 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ΕΡ3Ρ3), синтазы ацетогидроксикарбоновой кислоты или ацетолактатсинтазы (АЬЗ), ацетил-кофермент А-карбоксилазы (АССаке), дигидроптероатсинтазы, фитоиндесатуразы (ΡΌ3), оксигеназы протопорфирина IX (РРО), гидроксифенилпируватдиоксигеназы (ΗΡΡΌ), парааминобензоатсинтазы, глутаминсинтазы (ОЗ), глутаминсинтазы, устойчивой к глюфосинату, 1-дезокси-О-ксилулозо-5-фосфатсинтазы (ΌΘΧΡсинтазы), дигидроптероатсинтазы (ΌΗΡ-синтазы), фенилаланинаммиаклиазы (ΡΑΌ), глутатион-З-трансферазы (ОЗТ), белка Ό1 фотосистемы II, монооксигеназы, цитохрома Р450, целлюлозосинтазы, бетатубулина и серингидроксиметилтрансферазы. (X) Способ регуляции экспрессии эндогенного генамишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный эндогенный ген-мишень кодирует белок, необходимый для поддержания роста растущего растения. (XI) Способ регуляции экспрессии эндогенного генамишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный эндогенный ген-мишень выбирают из группы, состоящей из РиВйСО. фактора инициации трансляции и фитоиндесатуразы. (XII) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный эндогенный генмишень кодирует белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду. (XIII) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный эндогенный генмишень кодирует мутантный фермент ацетолактатсинтазу, придающий устойчивость к сульфонилмочевине и имидазолиноновым гербицидам, или мутантную ацетил-СоА-карбоксилазу, придающую устойчивость к арилоксифеноксипропионатным гербицидам. (XIV) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанная полинуклеотидная композиция, кроме того, включает второй полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов второго эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом второго эндогенного гена-мишени. (XV) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более
- 16 029482
нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанная полинуклеотидная композиция, кроме того, включает второй полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов второго эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом второго эндогенного гена-мишени, причем указанный по меньшей мере один полинуклеотид практически идентичен или практически комплементарен непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена ΕΡδΡδ растущих растений или органов растений, а указанный второй полинуклеотид практически идентичен или практически комплементарен непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена фактора инициации трансляции растущих растений или органов растений. (XVI) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный эндогенный ген-мишень является некодирующей последовательностью, кодирующей последовательностью или комбинацией некодирующей последовательности и кодирующей последовательности. (XVII) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанную полинуклеотидную композицию наносят на орган растущих растений. (XVIII) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанную полинуклеотидную композицию наносят на лист, стебель, семя, плод или цветок растущих растений. (XIX) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанная полинуклеотидная композиция, кроме того, включает второй полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов другого сегмента эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, отличающегося от сегмента, являющегося мишенью указанного по меньшей мере одного полинуклеотида. (XX) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем растущие растения находятся на открытом поле или в вегетационном домике. (XXI) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих
- 17 029482
растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанные полинуклеотиды не интегрированы в хромосому растущих растений. (XXII) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и соли. (XXIII) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества и соли. (XXIV) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества - кремнийорганического полиэфирного сополимера и соли. (XXV) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного генамишени, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества - кремнийорганического полиэфирного сополимера и соли, причем указанный кремнийорганический полиэфирный сополимер является сополимером гептаметилтрисилоксана, модифицированного полиалкиленоксидом, и метилового эфира аллилоксиполипропиленгликоля. (XXVI) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и соли, причем указанная соль представляет собой органическую или неорганическую соль. (XXVII) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклео- 18 029482
тидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного генамишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества, органической соли аммония и неорганической соли аммония. (XXVIII) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и сульфата аммония. (XXIX) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и соли, и, кроме того, транспортный агент включает увлажнитель или хелатирующий агент. (XXX) Способ регуляции экспрессии эндогенного генамишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанную полинуклеотидную композицию наносят на растущие растения или органы растений с помощью распылителя. (XXXI) Способ регуляции экспрессии эндогенного гена-мишени в растущих растениях или органах растений, включающий наружное нанесение на растущие растения или органы растений полинуклеотидной композиции, состоящей по меньшей мере из одного полинуклеотида, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, и эффективного количества транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид регулирует экспрессию эндогенного гена-мишени, причем указанный полинуклеотид выбирают из группы, состоящей из оцДНК, дцДНК, оцРНК, дцРНК и гибридов РНК/ДНК. (XXXII) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарной непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях. (XXXIII) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарной непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая актив- 19 029482
ность гербицида в растущих растениях, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок и является геном-мишенью гербицида или геном инактивации гербицида. (XXXIV) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарной непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение по меньшей мере одного полинуклеотида во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок и является геном-мишенью гербицида или геном инактивации гербицида, выбранным из группы, состоящей из 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы (ΕΡ8Ρ8), синтазы ацетогидроксикарбоновой кислоты или ацетолактатсинтазы (АЬ8), ацетил-кофермент А-карбоксилазы (АССаке), дигидроптероатсинтазы, фитоиндесатуразы (ΡΌ8), оксигеназы протопорфирина IX (РРО), гидроксифенилпируватдиоксигеназы (ΗΡΡΌ), парааминобензоатсинтазы, глутаминсинтазы (08), глутаминсинтазы, устойчивой к глюфосинату, 1-дезокси-Э-ксилулозо-5-фосфатсинтазы (^ΟXΡ-синтазы), дигидроптероатсинтазы (ΌΗΡ-синтазы), фенилаланинаммиаклиазы (ΡΑΣ), глутатион-8-трансферазы (08Т), белка Ό1 фотосистемы II, монооксигеназы, цитохрома Р450, целлюлозосинтазы, бета-тубулина и серингидроксиметилтрансферазы. (XXXV) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанную полинуклеотидную композицию и гербицид применяют раздельно или в одном и том же растворе. (XXXVI) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарной непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанный полинуклеотид выбирают из группы, состоящей из оцДНК, дцДНК, оцРНК, дцРНК и гибридов РНК/ДНК. (XXXVII) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарной непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанная полинуклеотидная композиция, кроме того, включает второй полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов другого сегмента эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, отличающегося от сегмента, являющегося мишенью указанного по меньшей мере одного полинуклеотида. (XXXVIII) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген
- 20 029482
экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанная полинуклеотидная композиция, кроме того, включает множество полинуклеотидов, последовательность каждого из которых практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов другого сегмента эндогенного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена-мишени, отличающегося от сегмента, являющегося мишенью указанного по меньшей мере одного полинуклеотида. (XXXIX) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарной непрерывной последовательности из или более нуклеотидов, эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и соли. Способ усиления активности гербицида в растущих растениях,
включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества и соли. (КЫ) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества -кремнийорганического полиэфирного сополимера и соли. (X^II) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества - кремнийорганического полиэфирного сополимера и соли, причем указанный кремнийорганический полиэфирный сополимер является сополимером гептаметилтрисилоксана, модифицированного полиалкиленоксидом, и метилового эфира аллилоксиполипропиленгликоля. (ΝΕΟ) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарной непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и
- 21 029482
эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и соли, причем указанная соль представляет собой органическую или неорганическую соль. (ХЫУ) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарной непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества, органической соли аммония и неорганической соли аммония. (ХЬУ) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий: (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарной непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и сульфата аммония. (ХЬУТ) Способ усиления активности гербицида в растущих растениях, включающий (а) наружное нанесение на поверхность растущих растений полинуклеотидной композиции, включающей по меньшей мере один полинуклеотид, последовательность которого практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательости из 18 или более нуклеотидов, практически комплементарной непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения, причем указанный эндогенный ген экспрессирует белок, взаимодействующий с гербицидом, и эффективное количество транспортного агента, обеспечивающего проникновение полинуклеотидов во внутренние ткани растущих растений, и (б) нанесение гербицида на растущие растения; за счет чего указанный по меньшей мере один полинуклеотид проникает во внутренние ткани растущих растений и индуцирует супрессию эндогенного гена, тем самым усиливая активность гербицида в растущих растениях, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и соли, причем указанный транспортный агент также включает увлажнитель или хелатирующий агент. (ХЬУП) Усовершенствование жидкой гербицидной композиции, приспособленной для наружного нанесения на растущие растения и включающей поверхностно-активное вещество и по меньшей мере один агент, вызывающий гибель растений, причем указанный агент, вызывающий гибель растений, включает полинуклеотиды, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности гена растения или последовательности РНК, являющейся транскриптом гена растения, вызывающие системную продукцию малых РНК, гибридизующихся с зондом к гену растения. (ХЬУШ) Усовершенствование жидкой гербицидной композиции, включающей неполинуклеотидный гербицид, причем указанная композиция, кроме того, включает полинуклеотиды, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности гена растения или последовательности РНК, являющейся транскриптом гена растения. (ХЫХ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки. (Ь) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б)
- 22 029482
транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и соли. (Ы) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества и неорганической соли. (ЬП) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества - кремнийорганического полиэфирного сополимера и неорганической соли. (ЬШ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные ДНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества - кремнийорганического полиэфирного сополимера и неорганической соли, причем указанный кремнийорганический полиэфирный сополимер является сополимером гептаметилтрисилоксана, модифицированного полиалкиленоксидом, и метилового эфира аллилоксиполипропиленгликоля (доступным как поверхностно-активное вещество δί1\\Όΐ®® Ь-77). (Ь1У) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, включающая, кроме того, неполинуклеотидное гербицидное вещество. (ЬУ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные ДНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный ген растения кодирует белок, обеспечивающий устойчивость к гербицидам и представляющий собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ΕΡδΡδ), синтазу ацетогидроксикарбоновой кислоты или ацетолактатсинтазу (ΑΣδ), ацетил-кофермент Акарбоксилазу (АССазе), дигидроптероатсинтазу, фитоиндесатуразу (ΡΌδ), оксигеназу протопорфирина IX (РРО), гидроксифенилпируватдиоксигеназу (ΗΡΡΌ), парааминобензоатсинтазу, глутаминсинтазу (Οδ), глутаминсинтазу, устойчивую к глюфосинату, 1-дезокси-О-ксилулозо-5-фосфатсинтазу (ΌΘΧΡсинтазу), дигидроптероатсинтазу (ΌΗΡ-синтазу), фенилаланинаммиаклиазу (ΡΑΣ), глутатион-δтрансферазу (ΟδΤ), белок Ό1 фотосистемы II, монооксигеназу, цитохром Р450, целлюлозосинтазу, бетатубулин или серингидроксиметилтрансферазу. (ЬУ1) Композиция, состоящая главным образом из (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные ДНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки. (ЬУП) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически
- 23 029482
идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНКтранскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностноактивного вещества и соли. (БУШ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНКтранскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества и неорганической соли. (ЫХ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества - кремнийорганического полиэфирного сополимера и неорганической соли. (ЬХ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные ДНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества - кремнийорганического полиэфирного сополимера и неорганической соли, причем указанный кремнийорганический полиэфирный сополимер является сополимером гептаметилтрисилоксана, модифицированного полиалкиленоксидом, и метилового эфира аллилоксиполипропиленгликоля (доступным как поверхностно-активное вещество δίϊ^ΐ® Ь-77). (ЬХ1) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, включающая, кроме того, неполинуклеотидное гербицидное вещество. (ЬХП) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные ДНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный ген растения кодирует белок, обеспечивающий устойчивость к гербицидам и представляющий собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ΕΡδΡδ), синтазу ацетогидроксикарбоновой кислоты или ацетолактатсинтазу (ΑΣδ), ацетил-кофермент Акарбоксилазу (АССаке), дигидроптероатсинтазу, фитоиндесатуразу (ΡΌδ), оксигеназу протопорфирина IX (РРО), гидроксифенилпируватдиоксигеназу (ΗΡΡΌ), парааминобензоатсинтазу, глутаминсинтазу (Οδ), глутаминсинтазу, устойчивую к глюфосинату, 1-дезокси-О-ксилулозо-5-фосфатсинтазу (ΌΘΧΡсинтазу), дигидроптероатсинтазу (ΌΗΡ-синтазу), фенилаланинаммиаклиазу (ΡΑΣ), глутатионытрансферазу (ΟδΤ), белок Ό1 фотосистемы II, монооксигеназу, цитохром Р450, целлюлозосинтазу, бетатубулин или серингидроксиметилтрансферазу. (ЬХШ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные РНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндо- 24 029482
генным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки. (ЬХ1У) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНКтранскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностноактивного вещества и соли. (ЬХУ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНКтранскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНКтранскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества и неорганической соли. (ЬХУ1) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества -кремнийорганического полиэфирного сополимера и неорганической соли. (ЬХУП) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества - кремнийорганического полиэфирного сополимера и неорганической соли, причем указанный кремнийорганический полиэфирный сополимер является сополимером гептаметилтрисилоксана, модифицированного полиалкиленоксидом, и метилового эфира аллилоксиполипропиленгликоля (доступным как поверхностно-активное вещество δί1\\Όΐ® Ь-77). (ЬХУШ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных РНКполинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, включающая, кроме того, неполинуклеотидное гербицидное вещество. (ЬХ1Х) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНКтранскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный ген растения кодирует белок, обеспечивающий устойчивость к гербицидам и представляющий собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ΕΡδΡδ), синтазу ацетогидроксикарбоновой кислоты или ацетолактатсинтазу (АЬ§), ацетил-кофермент А-карбоксилазу (АССаке), дигидроптероатсинтазу, фитоиндесатуразу (ΡΌδ), оксигеназу протопорфирина 1Х (РРО), гидроксифенилпируватдиоксигеназу (ΗΡΡΌ), парааминобензоатсинтазу, глутаминсинтазу (Οδ), глутаминсинтазу, устойчивую к глюфосинату, 1-дезокси-О-ксилулозо-5-фосфатсинтазу (^ОXΡ-синтазу), дигидроптероатсинтазу (ΌΗΡсинтазу), фенилаланинаммиаклиазу (ΡΑ^), глутатионы-трансферазу (ΟδΤ), белок Ό1 фотосистемы II, монооксигеназу, цитохром Р450, целлюлозосинтазу, бета-тубулин или серингидроксиметилтрансферазу. (ЪХХ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных
- 25 029482
РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки. (ЬХХ1) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных РНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и соли. (ЬХХП) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных РНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества и неорганической соли. (ЬХХШ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностноактивного вещества - кремнийорганического полиэфирного сополимера и неорганической соли. (ЬХХ1У) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных РНКполинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества кремнийорганического полиэфирного сополимера и неорганической соли, причем указанный кремнийорганический полиэфирный сополимер является сополимером гептаметилтрисилоксана, модифицированного полиалкиленоксидом, и метилового эфира аллилоксиполипропиленгликоля (доступным как поверхностно-активное вещество 8Й№е!® Ь-77). (ЪХХУ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные РНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, включающая, кроме того, неполинуклеотидное гербицидное вещество. (ЪХХУ!) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт одноцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный ген растения кодирует белок, обеспечивающий устойчивость к гербицидам и представляющий собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ЕР8Р8), синтазу ацетогидроксикарбоновой кислоты или ацетолактатсинтазу (АЪ§), ацетил-кофермент А-карбоксилазу (АССаке), дигидроптероатсинтазу, фитоиндесатуразу (РБ8), оксигеназу протопорфирина 1Х (РРО), гидроксифенилпируватдиоксигеназу (НРРБ), парааминобензоатсинтазу, глутаминсинтазу (С8), глутаминсинтазу, устойчивую к глюфосинату, 1- 26 029482
дезокси-Э-ксилулозо-5-фосфатсинтазу (ЬОХР-синтазу), дигидроптероатсинтазу (ΌΗΡ-синтазу), фенилаланинаммиаклиазу (РАЬ), глутатион-§-трансферазу (О8Т), белок Ό1 фотосистемы II, монооксигеназу, цитохром Р450, целлюлозосинтазу, бета-тубулин или серингидроксиметилтрансферазу. (ЬХХУП) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные гибридные ДНК/РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки. (ЬХХУШ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНКтранскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные гибридныеДНК/РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и соли. (ЬХХРХ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные гибридныеДНК/РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества и неорганической соли. (ЬХХХ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные гибридныеДНК/РНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных гибридных ДНК/РНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества - кремнийорганического полиэфирного сополимера и неорганической соли. (ЬХХХЦ Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные гибридные ДНК/РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества кремнийорганического полиэфирного сополимера и неорганической соли, причем указанный кремнийорганический полиэфирный сополимер является сополимером гептаметилтрисилоксана, модифицированного полиалкиленоксидом, и метилового эфира аллилоксиполипропиленгликоля (доступным как поверхностно-активное вещество δίΐ^βΐ® Ь-77). (ЪХХХП) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные гибридные ДНК/РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, включающая, кроме того, неполинуклеотидное гербицидное вещество. (ЬХХХШ) Композиция, состоящая главным образом из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные гибридные ДНК/РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного ге- 27 029482
на; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки, причем указанный ген растения кодирует белок, обеспечивающий устойчивость к гербицидам и представляющий собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ΕΡδΡδ), синтазу ацетогидроксикарбоновой кислоты или ацетолактатсинтазу (ΑΕδ), ацетил-кофермент А-карбоксилазу (АССаке), дигидроптероатсинтазу, фитоиндесатуразу (ΡΌδ), оксигеназу протопорфирина IX (РРО), гидроксифенилпируватдиоксигеназу (ΗΡΡΌ), парааминобензоатсинтазу, глутаминсинтазу ^δ), глутаминсинтазу, устойчивую к глюфосинату, 1-дезокси-Эксилулозо-5-фосфатсинтазу (^ОXΡ-синтазу), дигидроптероатсинтазу (ΌΗΡ-синтазу), фенилаланинаммиаклиазу (ΡΑΣ), глутатионы-трансферазу ^δΤ), белок Ό1 фотосистемы II, монооксигеназу, цитохром Р450, целлюлозосинтазу, бета-тубулин или серингидроксиметилтрансферазу. (ЬХХХГУ) Способ селективной борьбы с самосевными устойчивыми к гербицидам растениями-мишенями, растущими на поле с культурами, устойчивыми к гербицидам, включающий нанесение на листья самосевных растений композиции, включающей олигомеры полинуклеотидов, обеспечивающей системное внедрение в клетки самосевного растения одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться при физиологических условиях в клетке самосевного растения с матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена, который (ί) представляет собой ген, необходимый для поддержания роста или жизнедеятельности самосевного растения, (ΐΐ) кодирует белок, обеспечивающий устойчивость самосевного растения к гербицидам или (ίίί) транскрибируется в регуляторный РНК-агент. (ЬХХХУ) Способ селективной борьбы с самосевными устойчивыми к гербицидам растениями-мишенями, растущими на поле с культурами, устойчивыми к гербицидам, включающий нанесение на листья самосевных растений композиции, включающей олигомеры полинуклеотидов, обеспечивающей системное внедрение в клетки самосевного растения одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться при физиологических условиях в клетке самосевного растения с матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена, который (ί) представляет собой ген, необходимый для поддержания роста или жизнедеятельности самосевного растения, (ΐΐ) кодирует белок, обеспечивающий устойчивость самосевного растения к гербицидам или (ίίί) транскрибируется в регуляторный РНК-агент, причем указанная композиция включает поверхностно-активное вещество и олигомеры, выбранные из группы, состоящей из одноцепочечной РНК, двуцепочечной РНК, одноцепочечной ДНК, двуцепочечной ДНК и гибридизованной двуцепочечной РНК/ДНК, причем последовательность указанных олигомеров практически идентична или комплементарна матричной РНК эндогенного гена, а эндогенный ген представляет собой нативный ген или рекомбинантный трансген. (ЬХХХУ!) Способ селективной борьбы с самосевными устойчивыми к гербицидам растениями-мишенями, растущими на поле с культурами, устойчивыми к гербицидам, включающий нанесение на листья самосевных растений композиции, включающей олигомеры полинуклеотидов, обеспечивающей системное внедрение в клетки самосевного растения одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться при физиологических условиях в клетке самосевного растения с матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена, который (ί) представляет собой ген, необходимый для поддержания роста или жизнедеятельности самосевного растения, (ΐΐ) кодирует белок, обеспечивающий устойчивость самосевного растения к гербицидам или (ίίί) транскрибируется в регуляторный РНК-агент, причем указанное самосевное растение представляет собой амарант Палмера, канатник Теофраста, амарант грязный/амарант бугорчатый, латук компасный, одуванчик, люцерну, кукурузу, сою, рапс, хлопчатник, сахарную свеклу, сахарный тростник, пшеницу, рис или овощное растение. (ЬХХХУП) Способ селективной борьбы с самосевными устойчивыми к гербицидам растениями-мишенями, растущими на поле с культурами, устойчивыми к гербицидам, включающий нанесение на листья самосевных растений композиции, включающей олигомеры полинуклеотидов, обеспечивающей системное внедрение в клетки самосевного растения одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться при физиологических условиях в клетке самосевного растения с матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена, который (ί) представляет собой ген, необходимый для поддержания роста или жизнедеятельности самосевного растения, (ΐΐ) кодирует белок, обеспечивающий устойчивость самосевного растения к гербицидам или (ίίί) транскрибируется в регуляторный РНК-агент, причем указанные культуры представляют собой кукурузу, сою, хлопчатник, рапс, сахарную свеклу, люцерну, сахарный тростник, рис, пшеницу или овощное растение. (ЬХХХУШ) Способ селективной борьбы с самосевными устойчивыми к гербицидам растениями-мишенями, растущими на поле с культурами, устойчивыми к гербицидам, включающий нанесение на листья самосевных растений композиции, включающей олигомеры полинуклеотидов, обеспечивающей системное внедрение в клетки самосевного растения одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться при физиологических условиях в клетке самосевного растения с матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена, который (ί) представляет собой ген, необходимый для поддержания роста или жизнедеятельности самосевного растения, (ΐΐ) кодирует белок, обеспечивающий устойчивость самосевного растения к гербицидам или (ίίί) транскрибируется в регуляторный РНК-агент, причем указанный эндогенный ген кодирует белок, обеспечивающий устойчивость самосевного растения к гербицидам и представляющий собой 5енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ΕΡδΡδ), синтазу ацетогидроксикарбоновой кислоты или ацетолактатсинтазу (ΑΣδ), ацетил-кофермент А-карбоксилазу (АССаке), дигидроптероатсинтазу, фитоиндесатуразу (ΡΌδ), оксигеназу протопорфирина К (РРО), гидроксифенилпируватдиоксигеназу (ΗΡΡΌ), пара- 28 029482
аминобензоатсинтазу, глутаминсинтазу (Οδ), глутаминсинтазу, устойчивую к глюфосинату, 1-дезоксиО-ксилулозо-5-фосфатсинтазу (^0XΡ-синтазу), дигидроптероатсинтазу (ΌΗΡ-синтазу), фенилаланинаммиаклиазу (ΡΑΌ), глутатионы-трансферазу (ΟδΤ), белок Ό1 фотосистемы II, монооксигеназу, цитохром Р450, целлюлозосинтазу, бета-тубулин или серингидроксиметилтрансферазу. (ЬХХХ1Х) Способ селективной борьбы с самосевными устойчивыми к гербицидам растениями-мишенями, растущими на поле с культурами, устойчивыми к гербицидам, включающий нанесение на листья самосевных растений композиции, включающей олигомеры полинуклеотидов, обеспечивающей системное внедрение в клетки самосевного растения одноцепочечной РНК, способной гибридизоваться при физиологических условиях в клетке самосевного растения с матричной РНК, являющейся транскриптом эндогенного гена, который (ί) представляет собой ген, необходимый для поддержания роста или жизнедеятельности самосевного растения, (ίί) кодирует белок, обеспечивающий устойчивость самосевного растения к гербицидам или (ίίί) транскрибируется в регуляторный РНК-агент, причем указанный эндогенный ген кодирует белок, обеспечивающий устойчивость самосевного растения к гербицидам и представляющий собой 5енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ΞΡδΡδ), синтазу ацетогидроксикарбоновой кислоты или ацетолактатсинтазу (ΑΌδ), ацетил-кофермент А-карбоксилазу (АССа8е), дигидроптероатсинтазу, фитоиндесатуразу (ΡΌδ), оксигеназу протопорфирина IX (РРО), гидроксифенилпируватдиоксигеназу (ΗΡΡΌ), парааминобензоатсинтазу, глутаминсинтазу (Οδ), глутаминсинтазу, устойчивую к глюфосинату, 1-дезоксиО-ксилулозо-5-фосфатсинтазу (Ό0ΧΡ-№Κ]^^), дигидроптероатсинтазу (ΌΗΡ-синтазу), фенилаланинаммиаклиазу (ΡΑΌ), глутатионЫ-трансферазу (ΟδΤ), белок Ό1 фотосистемы II, монооксигеназу, цитохром Р450, целлюлозосинтазу, бета-тубулин или серингидроксиметилтрансферазу, причем указанный способ также включает нанесение некоторого количества гербицида, к которому указанный белок обеспечивает устойчивость, на самосевное растение. (ХС) Способ исследования "обратной" генетики путем модулирования эндогенного гена-мишени растения, включающий нанесение на ткани растущего растения: (1) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных ДНКполинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (2) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных ДНКполинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (3) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных РНКполинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (4) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных РНКполинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных одноцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (5) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных гибридных ДНК/РНКполинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные гибридные ДНК/РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки. (ХС^ Способ исследования "обратной" генетики путем модулирования эндогенного генамишени растения, включающий нанесение на ткани растущего растения: (1) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена
- 29 029482
растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных ДНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (2) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные ДНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных одноцепочечных ДНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (3) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные РНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных РНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (4) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные РНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных одноцепочечных РНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (5) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные гибридные ДНК/РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; причем указанная композиция модулирует ген-мишень во время жизни растения в течение периода, равного по меньшей мере 1 неделе. (ХС11) Способ исследования "обратной" генетики путем модулирования эндогенного генамишени растения, включающий нанесение на ткани растущего растения: (1) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных ДНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (2) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные ДНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных одноцепочечных ДНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (3) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные РНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных РНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (4) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные РНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б)
- 30 029482
транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных одноцепочечных РНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (5) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные гибридные ДНК/РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; причем указанный РНК-транскрипт в составе клеток представляет собой матричную РНК, кодирующую белок, или регуляторную РНК. (ХС111) Способ исследования "обратной" генетики путем модулирования эндогенного генамишени растения, включающий нанесение на ткани растущего растения: (1) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных ДНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (2) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные ДНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных одноцепочечных ДНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (3) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные РНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (4) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные РНКполинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных одноцепочечных РНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (5) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные гибридные ДНК/РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; причем указанный способ также включает воздействие большого количества соединений на растение с целью идентификации взаимодействий гербицидов. (ХС1У) Способ исследования "обратной" генетики путем модулирования эндогенного гена растения, включающий наружное нанесение на ткани живого растения: (1) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных ДНКполинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (2) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных ДНКполинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные ДНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая
- 31 029482
сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных одноцепочечных ДНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (3) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (4) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых одноцепочечных РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные одноцепочечные РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных одноцепочечных РНКполинуклеотидов с поверхности растения в его клетки; или (5) композиции, главным образом состоящей из: (а) раствора нетранскрибируемых двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена растения или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена; причем указанные двуцепочечные гибридные ДНК/РНК-полинуклеотиды способны гибридизоваться при физиологических условиях в клетках растения с эндогенным геном или с РНК-транскриптом эндогенного гена, вызывая сайленсинг эндогенного гена; и (б) транспортного агента, эффективно облегчающего транспорт указанных двуцепочечных гибридных ДНК/РНК-полинуклеотидов с поверхности растения в его клетки. (ХСУ) Гербицидная композиция, включающая водный раствор: (а) агента для усиления проницаемости тканей растения для олигомеров полинуклеотидов и (б) олигомеров полинуклеотидов, включающих по меньшей мере одну полинуклеотидную цепь, включающую по меньшей мере один непрерывный сегмент из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения в антисмысловой или смысловой ориентации, причем эндогенный ген кодирует белок, обеспечивающий устойчивость растения к химическому гербициду, или является геном, необходимым для жизнедеятельности. (ХСУ1) Гербицидная композиция, включающая водный раствор: (а) агента для усиления проницаемости тканей растения для олигомеров полинуклеотидов и (б) олигомеров полинуклеотидов, включающих по меньшей мере одну полинуклеотидную цепь, включающую по меньшей мере один непрерывный сегмент из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения в антисмысловой или смысловой ориентации, причем эндогенный ген кодирует белок, обеспечивающий устойчивость растения к химическому гербициду, или является геном, необходимым для жизнедеятельности, а также включающая химический гербицид. (ХСУ11) Гербицидная композиция, включающая водный раствор: (а) агента для усиления проницаемости тканей растения для олигомеров полинуклеотидов и (б) олигомеров полинуклеотидов, включающих по меньшей мере одну полинуклеотидную цепь, включающую по меньшей мере один непрерывный сегмент из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения в антисмысловой или смысловой ориентации, причем эндогенный ген кодирует белок, обеспечивающий устойчивость растения к химическому гербициду, или является геном, необходимым для жизнедеятельности, а также включающая химический гербицид, включая гербицидные соединения глифосат, дикамбу, фосфинотрицин, бромоксинил, иоксинил или хлорсульфурон. (ХСУ111) Гербицидная композиция, включающая водный раствор: (а) агента для усиления проницаемости тканей растения для олигомеров полинуклеотидов и (б) олигомеров полинуклеотидов, включающих по меньшей мере одну полинуклеотидную цепь, включающую по меньшей мере один непрерывный сегмент из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена растения в антисмысловой или смысловой ориентации, причем эндогенный ген кодирует белок, обеспечивающий устойчивость растения к химическому гербициду, или является геном, необходимым для жизнедеятельности, а также включающая химический гербицид, включая соединение глифосат, поверхностно-активное вещество на основе кремнийорганического полиэфирного сополимера и олигомеры полинуклеотидов. (ХС1Х) Растение, включающее экзогенную ДНК или РНК для супрессии эндогенного гена, причем указанная экзогенная ДНК не интегрирована в хромосому растения, а экзогенная РНК не является транскриптом ДНК, интегрированной в хромосому растения, и причем эндогенный ген подавляют путем наружного нанесения полинуклеотида на растение после его прорастания из семени. (С) Способ доставки полинуклеотида во внутреннее пространство растительной клетки путем нанесения полинуклеотида на наружную поверхность растительной клетки, включающий объединение полинуклеотида с кремнийорганическим поверхностно-активным веществом. (С1) Способ доставки полинуклеотида во внутреннее пространство растительной клетки путем нанесения полинуклеотида на наружную поверхность растительной клетки, включающий объединение полинуклеотида с кремнийорганическим поверхностно-активным веществом, причем указанное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество представляет собой кремнийорганический полиэфирный сополимер. (С11) Способ доставки полинуклеотида во внутреннее пространство растительной клетки путем нанесения полинуклеотида на наружную поверхность растительной клетки, включающий объединение по- 32 029482
линуклеотида с кремнийорганическим поверхностно-активным веществом, причем указанный кремнийорганический полиэфирный сополимер является сополимером гептаметилтрисилоксана, модифицированного полиалкиленоксидом, и метилового эфира аллилоксиполипропиленгликоля. (С111) Способ доставки полинуклеотида во внутреннее пространство растительной клетки путем нанесения полинуклеотида на наружную поверхность растительной клетки, включающий объединение полинуклеотида с кремнийорганическим поверхностно-активным веществом и органической или неорганической солью. (С1У) Способ доставки полинуклеотида во внутреннее пространство растительной клетки путем наружного нанесения полинуклеотида на наружную поверхность растительной клетки, включающий объединение полинуклеотида с кремнийорганическим поверхностно-активным веществом и органической или неорганической солью, причем указанная соль представляет собой соль аммония. (СУ) Способ доставки полинуклеотида во внутреннее пространство растительной клетки путем наружного нанесения полинуклеотида на наружную поверхность растительной клетки, включающий объединение полинуклеотида с кремнийорганическим поверхностно-активным веществом и органической или неорганической солью, причем указанная соль представляет собой соль аммония, причем указанная соль аммония представляет собой сульфат аммония. (СУ1) Способ доставки полинуклеотида во внутреннее пространство растительной клетки путем наружного нанесения полинуклеотида на наружную поверхность растительной клетки, включающий объединение полинуклеотида с кремнийорганическим поверхностно-активным веществом, причем указанную полинуклеотидную композицию наносят на растущие растения или органы растений с помощью распылителя.
Пример 1
В этом примере показана возможность использования молекул полинуклеотида согласно изобретению для борьбы с сорными растениями, устойчивыми к гербицидам. Генотипы устойчивого к глифосату амаранта Палмера идентифицировали как содержащие множественные копии, например, от 4 до более 100 копий гена, кодирующего 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ΕΡδΡδ), являющуюся мишенью соединений глифосата при обработке гербицидами.
На основании δΕΟ ГО N0: 1, показанной на фиг. 1, сконструировали четыре молекулы "коротких" дцРНК олигонуклеотидного размера, содержащих антисмысловую цепь, способную гибридизоваться с мРНК-транскриптом гена ΕΡδΡδ амаранта Палмера в положениях 14-38 (короткая дцРНК-1), положениях 153-177 (короткая дцРНК-2), 345-369 (короткая дцРНК-3) и 1105-1129 (короткая дцРНК-4), обозначенных в виде подчеркнутых нуклеотидов на фиг. 1. Эти четыре сконструированных коротких дцРНК приобрели в 1Шедга1ей ΌΝΑ Тсс1то1ощс5 (ЮТ): эти дцРНК несли липкий конец из двух нуклеотидов на 3'-конце антисмысловой цепи и два дезоксинуклеотида в качестве концевых нуклеотидов на 3'-конце смысловой цепи.
Сконструировали три молекулы "длинных" двуцепочечных РНК-полинуклеотида, одна цепь которых была способна гибридизоваться с мРНК-транскриптом гена ΕΡδΡδ амаранта Палмера в положениях 16-170 (длинная дцРНК-1), 451-722 (длинная дцРНК-2) и 1109-1328 (длинная дцРНК-3) по отношению к δΕΟ ГО N0: 1 и фиг. 1, обозначенных в виде нуклеотидов, выделенных полужирным шрифтом на фиг. 1. Эти три сконструированных длинных дцРНК изготовили, используя набор АшЪюи ΜΕΟΑ^τίρΙ® ΚΝΑί Κίΐ, № по каталогу 1626.
Вегетативные клоны амаранта Палмера, устойчивого к глифосату и несущего 16 копий эндогенного гена, кодирующего ΕΡδΡδ (Сашек, с1 а1. (2010) ΡΐΌ^ούίηβδ οί Не Ναΐίοηαΐ Асабету οί δαοικοδ 107(3): 1029-1034), выращивали в квадратных горшках размером 3,5 дюйма со смесью для рассады διιηΟΐΌ® КеШ-еайй, содержащей 3,5 кг/м3 удобрения Октосо1е® 14-14-14, в вегетационном домике при длине светового дня 14 ч, дневной температуре 30°С и ночной температуре 20°С; при необходимости растения поливали деионизованной водой.
Раствор поверхностно-активного вещества для предобработки листьев обмакиванием изготовили путем разбавления кремнийорганического поверхностно-активного вещества марки δί1\\Όΐ Ь-77 дистиллированной водой до 0,1% (об./об.). 5% (мас./об.) раствор карборунда для предобработки изготовили путем смешивания 2 г карборунда (размер 400) в 40 мл дистиллированной воды. Буферный раствор для обработки изготовили, используя 10 мМ фосфата натрия и 0,01 % (об./об.) кремнийорганического поверхностно-активного вещества δίίχν^ΐ Ь-77 в воде ΟΕΡΕ’ (Отеда Βίο-Тек) и титровали до рН 6,8. Раствор коротких дцРНК изготовили, используя эквимолярные количества каждой из четырех коротких дцРНК (идентифицированных выше) в буферном растворе для обработки в концентрации 0,005 наномоль каждой короткой дцРНК на микролитр. Раствор длинных дцРНК изготовили, используя эквимолярные количества каждой из трех длинных дцРНК в буфере для обработки в концентрации 0,0006 наномоль каждой длинной дцРНК на микролитр. Раствор смешанных (длинных/коротких) дцРНК изготовили, используя 0,005 наномоль каждой из четырех коротких дцРНК и 0,0006 наномоль каждой из трех длинных дцРНК на микролитр.
Вегетативные клоны амаранта Палмера, устойчивого к глифосату и несущего 16 копий эндогенного гена, кодирующего ΕΡδΡδ, предварительно обрабатывали раствором карборунда или раствором поверхностно-активного вещества для подготовки листьев к транспорту или проникновению дцРНК. При пре- 33 029482
добработке раствором карборунда листья повреждали путем аккуратного натирания верхней поверхности листа 0,5 мл раствора карборунда, промывали водой и высушивали промоканием. При предобработке раствором поверхностно-активного вещества четыре полностью развившихся зрелых листа погружали в раствор поверхностно-активного вещества и оставляли сушиться. После предобработки листьев раствором карборунда или раствором поверхностно-активного вещества подготовленные листья обрабатывали раствором буфера (в качестве контроля) или 40 микролитрами раствора дцРНК (нанося по 10 микролитров раствора дцРНК на каждый из 4 листьев растения). При обработке раствором коротких дцРНК на каждое обработанное растение наносили приблизительно 0,8 наномоль молекул коротких дцРНК (по 0,2 наномоль каждой короткой дцРНК). При обработке раствором длинных дцРНК на каждое обработанное растение наносили приблизительно 0,072 наномоль молекул длинных дцРНК (по 0,024 наномоль каждой длинной дцРНК). При обработке раствором смешанных (коротких/длинных) дцРНК на каждое обработанное растение наносили приблизительно 0,8 наномоль молекул коротких дцРНК и приблизительно 0,072 наномоль молекул длинных дцРНК. За исключением контрольных, все растения опрыскивали раствором гербицида глифосата (1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Коиибир® VеаίЬе^ΜАX® на гектар) непосредственно после, спустя 48 ч или спустя 72 ч после обработки дцРНК и оценивали по меньшей мере через 7 суток после обработки глифосатом.
Результаты
Шесть обработанных поверхностно-активным веществом контрольных растений (без обработки молекулами дцРНК) выжили после обработки глифосатом. Изображение растений через 7 суток после обработки глифосатом см. на фиг. 3А.
Два из четырех обработанных абразивом контрольных растений (без обработки молекулами дцРНК) погибли вследствие обработки глифосатом.
Шесть обработанных поверхностно-активным веществом растений, обработанных глифосатом непосредственно после нанесения раствора смешанных (коротких/длинных) дцРНК, выжили, но замедлили рост.
Шесть обработанных поверхностно-активным веществом растений, обработанных только раствором смешанных (коротких/длинных) дцРНК без обработки глифосатом, выжили. Пять из шести обработанных поверхностно-активным веществом растений, обработанные растворами смешанных (коротких/длинных) дцРНК, а затем глифосатом, погибли.
Пять из шести обработанных поверхностно-активным веществом растений, обработанных глифосатом через 48 ч после нанесения раствора смешанных (коротких/длинных) дцРНК, погибли.
Три из четырех обработанных карборундом растений, обработанных глифосатом через 48 ч после нанесения раствора смешанных (коротких/длинных) дцРНК, погибли.
Пять из шести обработанных поверхностно-активным веществом растений, обработанные раствором длинных дцРНК, а затем, спустя 72 ч, - глифосатом, погибли, см. фиг. 3В. Шесть из шести обработанных поверхностно-активным веществом растений, обработанные раствором коротких дцРНК, а затем, спустя 72 ч, - глифосатом, погибли, см. фиг. 3С.
Пример 2
В этом примере показана возможность использования молекул полинуклеотида согласно изобретению для совершенствования борьбы с сорными растениями, чувствительными к гербициду глифосату. Растворы смешанных (коротких/длинных) дцРНК, изготовленные в примере 1, наносили на растения канатника Теофраста, чувствительные к глифосату (всего на два листа наносили 40 микролитров), предварительно обработанные раствором поверхностно-активного вещества, использованным в примере 1. Контрольные растения после предобработки раствором поверхностно-активного вещества обрабатывали только буфером. Через 48 ч после обработки дцРНК растения обрабатывали раствором гербицида глифосата (53 г кислотного эквивалента гербицида глифосата марки Коиибир® VеаΐЬе^ΜАX® на гектар). На основе наблюдений роста растений наблюдали двукратное увеличение активности глифосата (измеренной как высота растений) по отношению к растениям, обработанным полинуклеотидной композицией и гербицидом, по сравнению с контрольными растениями, обработанными буфером и гербицидом. Растения, обработанные полинуклеотидной композицией и гербицидом, выживали при тяжелом замедлении роста; контрольные растения, обработанные буфером и гербицидом, выживали и полностью восстанавливались. Аналогичные результаты получили при исследовании других сорных растений, чувствительных к гербициду глифосату, т.е. амаранта грязного/амаранта бугорчатого, амаранта запрокинутого, амброзии трехраздельной, латука компасного, табака и одуванчика, чувствительных к гербициду глифосату.
Пример 3
В этом примере показана возможность использования молекул полинуклеотида согласно изобретению для борьбы с сорными растениями среди трансгенных культур, устойчивых к глифосату. Трансгенные растения люцерны, рапса, кукурузы, хлопчатника, риса, сои, сахарного тростника, сахарной свеклы и пшеницы, содержащие рекомбинантную ДНК для экспрессии бактериальной ΕΡδΡδ (описание генов ΕΡδΡδ "II класса", устойчивых к глифосату, см. в патенте США ΚΕ39247) обрабатывали: (а) раствором
- 34 029482
поверхностно-активного вещества, использованным в примере 1, (б) раствором смешанных (коротких/длинных) дцРНК, изготовленным в примере 1 и (с) раствором гербицида глифосата (1682 г кислотного эквивалента Коипбир® ^еаΐбе^ΜАX® на гектар) через 48 ч после обработки дцРНК. Спустя 30 суток все растения тансгенных культур, устойчивых к глифосату, выживали и не проявляли замедления роста.
Пример 4
В этом примере показана возможность использования молекул полинуклеотида согласно изобретению в качестве гербицидных агентов. Сконструировали две молекулы дцРНК-полинуклеотидов, мишенями которых являлись перекрывающиеся сегменты мРНК, кодирующей фитоиндесатуразу табака (№собапа Ьейбат1апа). Используя набор АтЬюп® МЕСАкспр!®. на основании δΕΟ ГО N0: 2 и фиг. 5 изготовили дцРНК, мишенями которых являлись фрагменты мРНК длиной 192 нуклеотида (показан полужирным шрифтом на фиг. 5) и 685 нуклеотидов (показан подчеркнутым шрифтом на фиг. 5). Изготовили раздельные растворы дцРНК. Листья растения табака предварительно обрабатывали раствором поверхностно-активного вещества, изготовленного согласно примеру 1, а затем одним из растворов дцРНК, нанося приблизительно 0,6 микромоль дцРНК на растение. На 9 сутки после обработки дцРНК имел место выраженный сайленсинг фитоиндесатуразы, наблюдаемый по обесцвечиванию верхушечных листьев; см. фиг. 4. На 15 сутки после обработки дцРНК оказалось, что половина обработанных растений погибли, а у другой половины растений обесцветились большинство надземных тканей. Нозерн-блоттинг показал присутствие миРНК, соответствующих дцРНК, использованным при обработке.
Пример 5
В этом примере также показана возможность использования молекул полинуклеотида согласно изобретению в качестве гербицидных агентов. Сконструировали дцРНК-олигонуклеотиды, мишенями которых являлись РНК, кодирующие ΕΡδΡδ каждого из следующих растений: амброзии полыннолистной (АтЬгок1а аг1ет15ИГоИа), амброзии трехраздельной (АтЬгок1а бзйба), сорго алеппского ^огдбит ба1ерепке), мелколепестничка буэносайресского (Сопу/а Ьопабепкб), росички (И1дбаба шкйабк), ИгосЫоа райсо1бек, молочая ШирНо^а Не1егорНу11а), ежовника крестьянского (Εсб^посб1оа со1опа), мари белой (Сбепоробшт а1Ьит), щетинника зеленого Ю1апа νίΓί6ίκ), щетинника итальянского ^е!апа бабс), ежовника обыкновенного (Εсб^посб1оа сгик-даШ), росички кровяной (И1дбаба капдшпабк), дурнишника ^11116161111 кбитабит), лисохвоста мышехвостниковидного (А1оресигик туокшгабек), овсюга (Аνепа Гайа), сенны (Ьеппа оЙикгГоба), ипомеи Дротоеа кр.), вьюнка полевого (Сот'оЕзбик агеепкб), сорго зернового (Ьогдйит Ысо1ог), коммелины (Соттейпа), традесканции (Тгабексапба кр.), плевела (Ъобит кр.), элевсины индийской (Бкикте тбюа), мелколепестничка канадского (Соп/уа сапабепкб), подорожника (ПаШадо 1апсео1а1а), амаранта Палмера (Атагайбик ра1теп), амаранта бугорчатого (Атагайбик йЬегси1а1ик), амаранта белого (Атагапбшк а1Ьик), амаранта гибридного (Атагапбшк буЬббик), амаранта запрокинутого (Атагапбшк гебцйехик), амаранта грязного/бугорчатого (Атагапбшк гиббЛиЬегсйаЮк), амаранта зеленого (АтагаШбик ν^^^б^к), амаранта Тунберга (Атагайбик (бипЬегдц), амаранта колючего (Атагап(бик кршокб), (Атагайбик гиЬга), (Атагайбик 1Мбик), амаранта маскированного (Атагайбик дтет/апк), амаранта гибридного (Атагайбик сЫогокйсбук), амаранта Пауэлла (Атагайбик ротабб), амаранта жминдовидного (Атагайбик Ь1бо1бек), кохии (КосЫа ксорапа), василька солнечного (Сейаигеа ко1кббабк) и канатника Теофраста (АЬйбоп (беорбгакб). Листья растений предварительно обрабатывали раствором поверхностно-активного вещества, изготовленного согласно примеру 1 и обрабатывали растворами дцРНК в количестве приблизительно 1 наномоль на растение. Спустя 15 суток растения погибли, погибали или прекратили расти.
Пример 6
В этом примере также показана возможность использования молекул полинуклеотида согласно изобретению в качестве гербицидных агентов. Сконструировали молекулы дцРНК-олигонуклеотидов, мишенями которых являлись РНК, кодирующие ацетолактатсинтазу и фитоиндесатуразу каждого из растений, перечисленных в примере 5. Листья растений предварительно обрабатывали раствором поверхностно-активного вещества, изготовленного согласно примеру 1, и обрабатывали растворами дцРНК в количестве приблизительно 1 наномоль на растение. Спустя 15 суток обработанные растения погибли, погибали или прекратили расти.
Пример 7
В этом примере также показана возможность использования молекул полинуклеотида согласно изобретению в качестве гербицидных агентов. Способ по примеру 4 повторяли, получая короткие дцРНК-олигонуклеотиды, мишенями которых являлись следующие белки амаранта Палмера: 5-еноилпирувилшикимат-3-фосфатсинтаза (ΕΡδΡδ), ацетил-кофермент А-карбоксилаза, дигидроптероатсинтаза, оксигеназа протопорфирина IX, гидроксифенилпируватдиоксигеназа, глутаминсинтаза, белок Ό1, фактор инициации трансляции (ΉΡ), рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (КиВбСО) и ДНК-зависимая АТРаза (ббАТΡа3а). Листья отдельных растений амаранта Палмера, устойчивого к глифосату, обрабатывали раствором поверхностно-активного вещества, изготовленным согласно примеру 1 и раздельно обрабатывали каждым из дцРНК-олигонуклеотидов согласно примеру 1 в количестве 1 наномоль
- 35 029482
дцРНК на растение. Спустя 30 суток обработанные растения погибли, погибали или прекратили расти.
Пример 8
В этом примере показана возможность использования синтетического гена Ροϊ III в композициях и способах согласно настоящему изобретению. На основании ЗΕ^ ГО ΝΟ: 3 и фиг. 2 создали синтетический ген Ροϊ III, используя элементы из гена миРНК И6 АгаЪЫоркхк ФаНапа, получив молекулу дцРНК, содержавшую две копии элементов КОСССК (полужирный подчеркнутый шрифт), элемент вышележащей последовательности (ЭВП), обладающий последовательностью "ТСССАСАТСО" (ЗΕ^ ГО ΝΟ: 4, полужирный подчеркнутый шрифт), ТАТА-бокс (полужирный подчеркнутый шрифт), нуклеотид "О" (полужирный подчеркнутый шрифт), антисмысловую ДНК (курсив), соответствующую бактериальной ДНК, кодирующей белок ΕΡ3Ρ3 (см. патент США КЕ39247), при экспресси в трансгенных растениях кукурузы придающий им устойчивость к гербициду глифосату, элемент "ААОАТТАОСАСОО" (3Ε^ ГО ΝΟ: 5, полужирный подчеркнутый шрифт), внедренный в антисмысловую ДНК, элемент "АСОСАТААААТ" (3Ε^ ГО ΝΟ: 6, полужирный подчеркнутый шрифт), за которым следовала смысловая ДНК (строчные буквы) и терминаторный элемент "ТТТТТТ" (3Ε^ ГО ΝΟ: 7, полужирный подчеркнутый шрифт). Раствор 0,1 мас. % кремнийорганического поверхностно-активного вещества марки Зй^е! Ь-77 и раствор множественных копий указанной молекулы дцРНК распыляли на листья самосевных растений кукурузы, устойчивых к глифосату и растущих на поле сои, устойчивой к глифосату; через 7 суток выполняли обработку гербицидом глифосатом марки Коипйир Αеаίйе^ΜΑX®. Спустя 15 суток растения кукурузы погибли, а растения сои процветали; контрольные растения кукурузы, устойчивые к глифосату и обработанные только поверхностно-активным веществом и гербицидом глифосатом, процветали.
Пример 9
Этот пример иллюстрирует один из аспектов настоящего изобретения. В этом примере молекулы полинуклеотидов наносили на и проникали в ткани растений, тем самым индуцируя системную регуляцию, т.е. сайленсинг гена-мишени (эндогенного гена ΕΡ3Ρ3). Конкретнее, композиция, включающая одноцепочечные ДНК-олигонуклеотиды (оцДНК), подавляла экспрессию эндогенного ΕΡ3Ρ3 в растениях амаранта Палмера (Атагап1йик ра1тег1), устойчивых к глифосату.
Антисмысловые оцДНК-олигонуклеотиды сконструировали, используя программное обеспечение ГОТ 3е1Тоо1к (доступное на 1ФДпа.еот/3ейоо18/Арр11еаНоп8/АпН-8еп8е/АпН-8еп8е.а8рх). Указанные олигонуклеотиды включали четыре оцДНК-олигонуклеотида, антисмысловых по отношению к ΕΡ3Ρ3 АтагапФик ра1тег1 (3Ε^ ГО ΝΟδ: 8, 9,10 и 11), два химически модифицированных (фосфортиоатом) оцДНКолигонуклеотида, антисмысловые по отношению к ΕΡ3Ρ3 Атагап1йц§ ра1тег1 (3Ε^ ГО ΝΟδ: 12 и 13), контрольный оцДНК-олигонуклеотид, антисмысловой по отношению к контрольному гену белка семян ячменя (Ногйеит уц1даге), ОепВапк ГО X97636 (3Ε^ ГО ΝΟ: 14), и химически модифицированный (меченый по 5'-концу А1еха Р1иог 488 от Фуйгодеп) оцДНК-олигонуклеотид, антисмысловой по отношению к ΕΡ3Ρ3 Атагап1йц§ ра1тег1 (3Ε^ ГО ΝΟ: 15), как показано в табл. 1.
Таблица 1. Антисмысловые оцДНК-олигонуклеотиды
Название 8ЕЦ ГО ΝΟ: Последовательность (от 5’ к 3’) Примечание
Антисмысловой РО1 8 АСССТССАСОАСТОСССТТТ
Антисмысловой РО2 9 ОТТТССТТСАСТСТССАОС
Антисмысловой РОЗ 10 ОТАОСТТОАОССАТТАТТОТ
Антисмысловой РО4 11 ОТТОАТООТАОТАОСТТОАО
Антисмысловой_Р81 12 АСССТССАСОАСТОСССТТТ фосфортиоатная модификация трех 5’-концевых и трех З’-концевых нуклеотидов
Антисмысловой_Р82 13 ОТТТССТТСАСТСТССАОС фосфортиоатная модификация трех 5’-концевых и трех 3 ’-концевых нуклеотидов
Антисмысловой_ск 14 ААОСООТТОАОСА СТОАА Контрольная последовательность, белок семян ячменя, ОепВапк ГО Х97636
Антисмысловой_РО!_488 15 АСССТССАСОАСТОСССТТТ 5’-меченый А1еха Р1иог 488
Поглощение олигонуклеотидов демонстрировали с помощью флуоресцентно меченых оцДНКолигонуклеотидов (3Ε^ ГО ΝΟ: 15), подтверждая, что оцДНК-олигонуклеотиды проникали в ткань листа. Черешки отделенных листьев амаранта Палмера, устойчивого к глифосату, помещали в 200 мМ раствор сахарозы с флуоресцентно мечеными оцДНК-олигонуклеотидами (3Ε^ ГО ΝΟ: 15). Изображения листьев получали с помощью формирователя изображений Вю-Кай Ρйа^οδΡX, оснащенного 488-нм лазером, в период от 4 до 48 ч после поглощения через черешок. Листья, инкубированные с 200 мМ чистой сахарозы, использовали в качестве контроля. Наблюдали слабое зависимое от времени сосудистое поглощение флуоресцентно меченых оцДНК-олигонуклеотидов (см. фиг. 6). Флуоресцентно меченые оцДНК-олигонуклеотиды высвобождались из сосудистой ткани в клетки спустя 8 ч после обработки и, согласно наблюдениям в моменты времени 24 ч и 48 ч, накапливались в ткани листа, что указывало на транспирационный эффект.
- 36 029482
Супрессию ΕΡδΡδ демонстрировали на отделенных листьях амаранта Палмера, устойчивого к глифосату, с помощью методики поглощения через черешок. Черешки отделенных листьев амаранта Палмера, устойчивого к глифосату, помещали в 200 мМ раствор сахарозы с олигонуклеотидами согласно вариантам обработки, перечисленным в табл. 2. Контрольные листья подвергали обработке антисмысловым контролем (δΕρ ГО ΝΟ: 14) и дополнительной обработке 50 микрограммов/мл глифосата или не подвергали дополнительной обработке глифосатом. После инкубирования в течение 48 ч измеряли уровни мРНК ΕΡδΡδ, белка ΕΡδΡδ и шикимата. Для оценки действия антисмысловых оцДНК-олигонуклеотидов на мРНК ΕΡδΡδ выделяли общую РНК листа и для сравнения уровней мРНК ΕΡδΡδ выполняли количественную ПЦР в реальном времени. Для оценки действия антисмысловых оцДНК-олигонуклеотидов на белок ΕΡδΡδ выделяли общий растворимый белок листа, разделяли его с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и измеряли уровень белка ΕΡδΡδ вестерн-блоттингом, используя антитела против ΕΡδΡδΊΊΡΆ кукурузы. Действие антисмысловых оцДНК-олигонуклеотидов на накопление шикимата как индикатор супрессии ΕΡδΡδ оценивали в ходе двух экспериментов: в эксперименте 1 листья, обработанные олигонуклеотидами, инкубировали с 50 микрограммов/мл глифосата в течение дополнительных 48 ч для поглощения через черешки (контрольные листья обрабатывали антисмысловым контролем (δΕρ ГО ΝΟ: 14) и дополнительно обрабатывали или не обрабатывали 50 микрограммов/мл глифосата); в эксперименте 2 выполняли анализ листовых дисков листьев, обработанных олигонуклеотидами, а уровень шикимата измеряли с помощью ВЭЖХ (контролем в этом случае являлись листья, не обработанные олигонуклеотидами, но инкубированные с 50 микрограммов/мл глифосата).
Таблица 2. Список вариантов обработки, использующих антисмысловые оцДНК-олигонуклеотиды
Обработка Антисмысловые оцДНК Конечная концентрация
№1 Антисмысловой РО1 (8ЕО ГО N0:8) 5 мкМ
№2 Антисмысловой РО2 (8Е<3 ГО N0:9) 5 мкМ
№3 Антисмысловой Р81 (8Ε()ΙΟΝΟ:12) 5 мкМ
№4 Антисмысловой Р32 (ЗЕ<3 ГО N0:13) 5 мкМ
№5 Антисмысловые Р81, Р82 (8Е<) ГО ΝΟ$:12,13) 10 мкМ каждого (всего 20 мкМ)
№6 Антисмысловые ΡΟΪ, РО2, РОЗ, РО4 (5Е<2 ГО ΝΟχ:8,9,10,11) 5 мкМ каждого (всего 20 мкМ)
Контроль Антисмысловой ск (8Е<2 ГО N0:14) 5 мкМ или 20 мкМ
Результаты для экспрессии мРНК ΕΡδΡδ, уровня белка ΕΡδΡδ и уровня шикимата показаны на фиг. 7, 8 и 9 соответственно. Эти результаты демонстрируют, что обработка антисмысловыми оцДНКолигонуклеотидами системно регулировала или подавляла ген-мишень за счет снижения уровней транскрипта гена-мишени (мРНК ΕΡδΡδ) или белка (ΕΡδΡδ), кодируемого геном-мишенью в ткани растения. В данном конкретном эксперименте оказалось, что варианты обработки № 1 и № 6 эффективнее подавляли уровень мРНК и белка ΕΡδΡδ и повышали эффективность глифосата, о чем свидетельствовало повышенное накопление шикимата. Эти результаты также показали, что эффективность глифосата усиливалась за счет супрессии мРНК и белка ΕΡδΡδ в растениях амаранта Палмера, устойчивых к глифосату.
Пример 10
Этот пример иллюстрирует один из аспектов настоящего изобретения. В данном примере растущие растения обрабатывали композицией для наружного нанесения для индукции системного сайленсинга гена-мишени в растении, включающий: (а) агент для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов и (б) полинуклеотиды, включающие по меньшей мере одну полинуклеотидную цепь, включающую по меньшей мере один непрерывный сегмент из 18 или более нуклеотидов гена-мишени в антисмысловой или смысловой ориентации. Конкретнее, растения табака (Νία4ί;··ιικ·ι Ьеп1Наш1апа) обрабатывали: (а) наружно наносимым раствором поверхностно-активного вещества для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов и (б) композицией, включающей наружно наносимые ДНКолигонуклеотиды или полинуклеотиды, включающие по меньшей мере один непрерывный сегмент из 18 или более нуклеотидов гена-мишени в антисмысловой или смысловой ориентации, за счет чего достигалась системная регуляция или супрессия гена-мишени (фитоиндесатуразы, "ΡΌδ").
Использованный ген-мишень представлял собой фитоиндесатуразу М^Иала Ьеп1Наш1апа (δΕρ ГО ΝΟ: 2), показанную на фиг. 10; сегмент, состоявший из нуклеотидов 421 - 1120 δΕΟ ГО ΝΟ: 2 (подчеркнутый текст на фиг. 10), использовали для конструирования 700-членного дцРНК-полинуклеотида ("700членная ΡΌδ"), а сегмент, состоящий из нуклеотидов 914 - 1113 δΕΟ ГО ΝΟ: 2 (полужирный подчеркнутый текст на фиг. 10), использовали для конструирования 200-членного дцРНК-полинуклеотида ("200членная ΡΌδ"). Последовательности других полинуклеотидов или олигонуклеотидов, использованных в вариантах обработки, перечислены в табл. 3. На фиг. 11 схематически изображено положение последовательностей указанных олигонуклеотидов и полинуклеотидов по отношению к последовательности фитоинсинтазы (δΕρ ГО ΝΟ: 2). Последовательности нерастительного происхождения, полученные из генома листоеда О1аЬго11са ("СК^") - δΕΕ) ГО ΝΟδ: 27, 28, 29 и 30 - использовали в качестве негомологичных контролей. Некоторые полинуклеотиды включали последовательность промотора Т7 (показанную в табл. 3 строчными буквами), представляющий собой промотор, распознаваемый РНК-полимеразой бактериофага Т7.
- 37 029482
Таблица 3
Описание СМЫСЛ овая / антис мысло вая последовательность Количество нуклеотидов ЗЕО ГО ΝΟ:
олиго 1 с промотором Т7 олиго 2 с промотором Т7 с с 1аа1асёас1сас1а1а£§ОСААОАОАТОТССТАООТООО 1аа1ас£ас1сас1а{а§£АСАОАТТТСТТСАСОАОАААСАТ ОО 40 44 16 17
олиго 1 без промотора Т7 с ОСААОАОАТОТССТАООТООО 21 18
олиго 2 без промотора Т7 с АСАОАТТТСТТСАООАОАААСАТОО 25 19
смесь олиго 3 с промотором Т7 АС 1аа1ас£ас1сас1а1а££САТСТССТТТААТТОТАСТОСС (ЗЕО ГО N0:20) и 1аа1ас§ас1сас1а1১ТТТААТТОТАСТОССАТТАТТС (ЗЕО ГО N0:21) 41 (ЗЕО ГО N0:20), 41 (ЗЕ<2 ГО N0:21) 20, 21
смесь олиго 3 без промотора Т7 АС САТСТССТТТААТТОТАСТОСС (ЗЕО ГО N0:22) и ТТТААТТОТАСТОССАТТАТТС (ЗЕО ГО N0:23) 22 (ЗЕО ГО N0:22), 22 (ЗЕО ГО N0:23) 22, 23
олиго 4 без промотора Т7 АС САСТТССАТССТСАТТСАОСТСОАТ 25 24
олиго 5 без промотора Т7 АС АСАССТСАТСТОТСАСССТАТСАО 24 25
олиго 6 без промотора Т7 АС САОТСТСОТАССААТСТССАТСАТ 24 26
смесь олиго СЯУУс промотором Т7 Си АС 1аа1ас§ас1сас1а1১§АТССАТОАТАТСОТОААСАТС (ЗЕО ГО N0:27) и 1аа1ас§ас1сас1 а1а §§£ОС АА АО АА АА АТ ОСО'ГСО (ЗЕО ГО N0:28) 41 (ЗЕО ГО N0:27), 38 (ЗЕО ГО N0:28) 27, 28
смесь олиго СК\У без промотора Т7 Си АС АТССАТОАТАТСОТОААСАТС (ЗЕО ГО N0:29) и ОСАААОАААААТОСОТСО (ЗЕО ГО N0:30) 21 (ЗЕО ГО N0:29), 18 (ЗЕО ГО N0:30) 29, 30
При всех анализах, описанных в этом примере, использовали следующую процедуру. Во всех анализах использовали четырехнедельные растения №соЕапа Ъеп1Наш1апа. Растения обрабатывали свежеприготовленным раствором 0,1% 8П\уе! Ь-77 в άάΗ2Ο. Два полностью развившихся листа на растение (одна семядоля, один истинный лист) погружали в раствор 8П\уе! Ь-77 на несколько секунд и оставляли сушиться на 15-30 мин, после чего наносили полинуклеотидную композицию. Конечная концентрация каждого олигонуклеотида или полинуклеотида составляла 25 мкМ (в 0,01% 8П\уе! Ь-77, 5 мМ натрийфосфатном буфере, рН 6,8), если не указано иное. На верхнюю поверхность каждого из двух предварительно обработанных листьев наносили 20 микролитров раствора, что составляло общий объем, равный 40 микролитрам (1 нмоль олигонуклеотида или полинуклеотида) на каждое растение. Обесцвечивание листьев наблюдали через 3 суток после обработки.
На фиг. 12А изображены результаты анализа, при котором на растения табака раздельно наносили 200-членный дцРНК-полинуклеотид, последовательность РНК которого соответствовала сегменту "200членной ΡΌ8" (нуклеотиды 914-1113 ВЕС) ГО ΝΟ: 2), и комбинацию одноцепочечных ДНКолигонуклеотидов и полинуклеотидов (8ЕЦ ГО ΝΟδ: 16,17, 20, 21, 24, 25 и 26). 200-членный дцРНКполинуклеотид наносили в концентрации 0,6 мкМ. Обесцвечивание верхушечных листьев наблюдали после наружного нанесения полинуклеотидов и олигонуклеотидов, что указывало на системную регуляцию или супрессию гена-мишени фитоиндесатуразы.
На фиг. 12В изображены результаты нозерн-блоттинга РНК, выделенной из растений №собапа ЪепФаш1апа, обработанных буфером (контроль), 200-членным дцРНК-полинуклеотидом и оцДНКолигонуклеотидами. Кроме того, показана РНК, выделенная из растений, подвергнутых стрессу путем хранения при 4°С в темноте в течение ночи перед обработкой 200-членными дцРНК-полинуклеотидами.
На фиг. 13 показаны фенотипы, наблюдавшиеся на 12 сутки после обработки в ходе еще одного анализа действия двенадцати комбинаций полинуклеотидов или олигонуклеотидов (см. табл. 4). В табл. 4 также перечислены наблюдения видимого обесцвечивания растений на 5 сутки после обработки и результаты измерений хлорофилла, выполненных на 7 и 12 сутки после обработки. Измерения хлорофилла являлись показателем супрессии гена-мишени фитоиндесатуразы; измерения выполняли в 6 участках верхушечной зоны, фокусируясь на явно обесцвеченных листьях или (на растениях без видимого обесцвечивания) на листьях, эквивалентно расположенных на растении; сниженные значения измерений хлорофилла указывали на супрессию фитоиндесатуразы. Эти результаты показали, что комбинации олигонуклеотидов и полинуклеотидов в вариантах обработки 2, 3, 4, 8 и 11 эффективно осуществляли системную регуляцию (супрессию) гена-мишени в обработанных растениях; вариант обработки 1 также вызывал системную регуляцию (супрессию) гена-мишени в меньшей степени. 200-членный дцРНКполинуклеотид также эффективно осуществлял системную регуляцию (супрессию) гена-мишени в обработанных растениях. Олигонуклеотиды на основе негомологичного гена (листоеда И1аЪгоЕса) (варианты обработки 5 и 6) не подавляли ген-мишень фитоиндесатуразы. Эти результаты продемонстрировали, что как смысловые, так и антисмысловые одноцепочечные ДНК-олигонуклеотиды и полинуклеотиды эффективно осуществляли системную регуляцию (супрессию) гена-мишени в обработанных растениях. В дан- 38 029482
ном конкретном примере смысловые олигонуклеотиды с промотором Т7 (вариант обработки 1) вызывали слабую системную супрессию гена фитоиндесатуразы, в то время как смысловые олигонуклеотиды без промотора Т7 (вариант обработки 7) не подавляли ген фитоиндесатуразы. В данном конкретном примере антисмысловые олигонуклеотиды с промотором Т7 (вариант обработки 2), так же как и антисмысловые олигонуклеотиды без промотора Т7 (вариант обработки 8) вызывали сильное обесцвечивание, что указывало на жесткую системную регуляцию гена-мишени фитоиндесатуразы.
Таблица 4
Обработк а Описание 8Е<2 ГО ΝΟ: Комментарий Обесцвечи вание (5 сутки) Хлороф илл (7 сутки) Хлоро филл (12 сутки)
1 Олиго 1 и 2 16, 17 Смысловые олиго с промотором Т7 слабое 18,6 17,5
2 Олиго 3 20,21 Антисмысловые олиго с промотором Т7 сильное 12,7 1,6
3 4 5 6 7 8 9 10 11 Олиго 1, 2 и 3 Олиго 1, 2, 3, 4, 5 и 6. смесь олиго СЮУс промотором Т7 смесь олиго СКЛУ без промотора Τ7 Олиго 1 и 2 без промотора Т7 Олиго 3 без промотора Т7 Олиго 1, 2 и 3 без промотора Т7 и олиго 4, 5 и 6. 200-членный дцРНКполинуклеот ид 1/10 смеси олигонуклеот идов из эксперимента 4 16,17, 20, 21 16,17, 20, 21, 24, 25, 26 27, 28 29, 30 18,19 22, 23 18,19, 22, 23, 24, 25, 26 Последовател ьность РНК, соответствую щая сегменту “200-членной РО8”, состоящему из нуклеотидов 914-1113 8Е<3 ГО N0:2 16, 17, 20, 21, 24, 25, 26 Смысловые и антисмысловые олиго с промотором Т7 Смысловые и антисмысловые олиго с промотором Т7, плюс антисмысловые олиго без промотора Т7 Смысловые и антисмысловые олиго с промотором Т7 Смысловые и антисмысловые олиго без промотора Т7 Смысловые олиго без промотора Т7 Антисмысловые олиго без промотора Т7 Смысловые и антисмысловые олиго без промотора Т7 Смысловые и антисмысловые дцРНКполинуклеотиды Смысловые и антисмысловые олиго с промотором Т7, плюс антисмысловые олиго без промотора сильное сильное еще отсутствует еще отсутствует еще отсутствует сильное еще отсутствует сильное сильное 11,5 15.1 30,8 34.2 32,0 11.3 30.2 11.3 11.4 2,6 2.5 37.3 38.2 41,1 3.2 34.4 4,0 4.5
Т7
12 1/100 смеси олигонуклеот идов из эксперимента 4 16,17, 20, 21, 24, 25, 26 Смысловые и антисмысловые олиго с промотором Т7, плюс антисмысловые олиго без промотора Т7 еще отсутствует 31,0 38,0
13 Контроль (отсутствует) Только буфер еще отсутствует 31,2 38,4
В табл. 5 показаны шесть полинуклеотидов: 40-членный сегмент ("40-членная смысловая оцДНК РЭЗ", δΙΊ) ГО N0: 31), состоящий из 40 5'-концевых нуклеотидов "700-членной Ρ^δ" (нуклеотиды 1081 1120 δΙΊ) ГО N0: 2), четыре антисмысловых одноцепочечных ДНК-полинуклеотида и один смысловой одноцепочечный ДНК-полинуклеотид, синтезированный на основе последовательности "40-членной смысловой оцДНК Ρ^δ" ^Е(Д ГО N0: 31). На фиг. 14 показаны результаты наружной обработки растений табака полинуклеотидами и олигонуклеотидами. Сильное обесцвечивание верхушечных листьев, указывавшее на системную регуляцию или супрессию гена-мишени фитоиндесатуразы, наблюдали после наружной обработки 21-членной Ρ^δ-антисмысловой оцДНК и 33-членной Ρ^δ-антисмысловой оцДНК, а также после наружной обработки 700-членным дцРНК-полинуклеотидом, амплифицированным с помощью ПЦР и очищенным на колонке, ранее проанализированными 22-членными Ρ^δ-антисмысловыми олигонуклеотидами с промотором Т7 (δΕ^ ГО N08: 20 и 21) ("антисмысловыми Ρ^δ с Т7"), или ранее проанализированными 22-членными Ρ^δ-антисмысловыми олигонуклеотидами без промотора Т7 (δΕ^ ГО N08: 22 и 23) ("антисмысловыми Ρ^δ"). После наружной обработки чистым буфером ("Буфер") или после наружной обработки денатурированного нагреванием (в течение 5 мин при 95°С с последующим
- 39 029482
хранением на льду) 700-членного дцРНК-полинуклеотида ("700-членная нагретая дцРНК ΡΌ8"), 15членной ΡΌδ-антисмысловой оцДНК или 18-членной ΡΌδ-антисмысловой оцДНК наблюдали слабое обесцвечивание или отсутствие обесцвечивания верхушечных листьев.
Таблица 5
Описание Последовательность 8Е<2 ГО ΝΟ:
40-членная смысловая оцДНК Ρϋδ ТОТТТТАТАСТОААТААТООСАОТАСААТТАААООАОАТО 31
15-членная антисмысловая оцДНК ΡΌδ САТСТССТТТААТТО 32
18-членная антисмысловая оцДНК Ρϋδ САТСТССТТТААТТОТАС 33
21-членная антисмысловая оцДНК Ρϋδ САТСТССТТТААТТОТАСТОС 34
33-членная антисмысловая оцДНК ΡΌ5 САТСТССТТТААТТОТАСТОССАТТАТТСАОТА 35
21-членная смысловая оцДНК РОЗ ОСАОТАСААТТАААООАОАТО 36
Результаты еще одного анализа показаны на фиг. 15; сильное обесцвечивание верхушечных листьев, указывавшее на системную регуляцию или супрессию гена-мишени фитоиндесатуразы, наблюдали после наружного нанесения 21-членной ΡΌδ-антисмысловой оцДНК (8ΕΡ ГО ΝΟ: 34, "21-п.о. антисмысловая ΡΌ8") или ранее проанализированными 22-членными ΡΌδ-антисмысловыми олигонуклеотидами без промотора Т7 (8ΕΡ ГО ΝΟδ: 22 и 23) ("антисмысловая ΡΌ8"). После наружного нанесения чистого буфера ("контроль: буфер") или 21-членной смысловой оцДНК ΡΌδ (8ΕΡ ГО ΝΟ: 36, "21-п.о. смысловая ΡΌ8") наблюдали незначительное обесцвечивание или отсутствие обесцвечивания верхушечных листьев.
Пример 11
В данном примере показана обработка растущих растений композицией для наружного нанесения для индукции системного сайленсинга гена-мишени в растении, включающий: (а) агент для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов и (б) полинуклеотиды, включающие по меньшей мере одну полинуклеотидную цепь, включающую по меньшей мере один непрерывный сегмент из 18 или более нуклеотидов гена-мишени в антисмысловой или смысловой ориентации. Конкретнее, в данном примере продемонстрирована специфичность полинуклеотидов к мишени (специфичность к последовательности).
Фитоиндесатураза амаранта Палмера (ΡΌ8) обладает последовательностью
ТСААТТТСАТСТАТТООААОТОАТТТТТТОООТСАТТСТОТОАОАААТТТСАОТОТТАОТАААОТТТ
АТООАОСАААОСАААОАААТОООСАСТОСССТТТАААООТТОТТТОТАТАОАТТАТССТАООССА
ОАОСТТОАААСТАСАТССААТТТСТТООААОССОССТАСТТАТСТТСТАСТТТТССОААТТСОССТС
ОТССТСАОААОССАТТАОААОТТОТААТТОСТООАОСАООТТТООСТООТСТАТССАСООСАААОТ
АТТТАОСТОАТОСАООТСАСАААСССАТАТТОТТООААОСАСОАОАТОТТТТАООАООАААООТТ
ОСАОСОТООААООАТОАООАТООТОАСТООТАТОАОАСТОООСТАСАТАТАТТСТТТООООСАТА
ТССАААТОТССААААТСТАТТТООАОААСТТООТАТАААТОАССОАСТОСААТООААООАОСАСТ
СТАТОАТТТТТОСААТОСССАОСААССССООТОААТТСАОТСОСТТТОАТТТТСССОАААТССТССС
ТОСАССАТТАААТООСАТАТОООСААТССТААОАААТААТОАААТОСТААССТООССАОАААААА
ТСААОТТТОССАТТОССТТОТТОССТОСТАТООСАООСООАСАОТСАТАТОТТОААОСАСААОАТО
ОТТТОАОТОТССААОАОТООАТОАОААААСААООАОТАСССОАТСОТОТААСТОАТОАТОТОТТТ
АТТОССАТОТСАААООСАСТОААСТТСАТАААТСССОАТОААСТТТСААТОСАОТОСАТСТТОАТТ
ССХСТСМССОАТТССТССАОСАОАААСАТООТТСТААСАТССССТТССТАСАССОАААСССТССАСАС
АОССТСТССАТСССТАТТСТТАААСАСАТСОАСТСАСТАООТООТОААСТТАААСТТААСТСТСОТАТАСА
САТСССТАТСТТТТТОССАССССАОТТОАСАТСТТСААССТСТТАСТАССТСАТАСТТССААСОАА
АТСТСАТАСТТСААААААСТТОАОАААТТАОТОООСОТТССТОТОАТТААТОТТСАСАТАТООТТТ
ОАСАОААААТТАААОААТАСАТАТОАССАТСТАСТСТТСАОСАООАОТССТСТТТТОАОТОТСТАТ
ОСТОАТАТОТСООАОАСАТОСААООААТАТААООАТССАААТАОАТССАТОСТООААТТООТТТТТ
ОСАСССОСООАООААТООАТТТСАСОААОСОАСАСТОАТАТТАТАОАООСААСААТОАААОАОСТ
ТОССААОСТТТТСССООАТОАААТСОСТОССОАТООААОСААООССААОАТССТСАААТАТСАТОТ
СОТСААААСТССААООТСООТТТАТААОАСТОТАССООАТТОТОААССТТОТСООССОСТОСАААО
АТСАССААТАОАОСОТТТСТАТТТАОСТООТОАТТАСАСААААСАААААТАТТТООСТТСТАТООА
АООТОСТОТСТТАТСТОООААОСТТТОТОСАСАООСТАТСОТАСАООАТТАТОАТСТОСТОАОТТС
ТСОАОСАСАААОАСААТТСОСО (8Е<3 ГО N0:37).
Синтезировали дцРНК-полинуклеотид длиной 678 пар оснований, антисмысловая цепь которого была способна гибридизоваться с РНК, кодируемой нуклеотидами в положениях 317 - 994 (показаны подчеркнутым текстом) 8ΕΟ ГО ΝΟ: 37 и дцРНК-полинуклеотид длиной 198 пар оснований, антисмысловая цепь которого была способна гибридизоваться с РНК, кодируемой нуклеотидами в положениях 797 - 994 (показаны подчеркнутым курсивом) 8ΕΟ ГО ΝΟ: 37.
- 40 029482
Фитоиндесатураза Νία4ί;··ιικ·ι ЪеШИапчана обладает последовательностью
АТОССССАААТСООАСТТОТАТСТССТОТТААТТТОАОАОТССААООТААТТСАОСТТАТСТТТООА
ОСТСОАСОТСТТСОТТОООААСТОАААОТСААОАТОТТТССТТОСАААООААТТТОТТАТОТТТТО
ОТАОТАОСОАСТССАТООООСАТААОТТААООАТТСОТАСТССААОТОССАСОАССССААОАТТО
АСАААССАСТТТААТССТТТАААООТАСТСТОСАТТОАТТАТССААСАССАОАССТАСАСААТАСА
ОТТААСТАТТТООАООСООСОТТАТТАТСАТСАТСОТТТСОТАСТТССТСАСОСССААСТАААССАТ
ТООАОАТТОТТАТТОСТООТОСАООТТТОООТСОТТТОТСТАСАОСААААТАТСТООСАОАТОСТО
ОТСАСАААССОАТАТТОСТООАООСААОАОАТОТССТАООТОООААООТАОСТОСАТООАААОАТ
ОАТОАТССАОАТТООТАСОАОАСТОООТТОСАСАТАТТСТТТООООСТТАСССАААТАТОСАОААС
СТОТТТООАОААСТАОООАТТОАТОАТСООТТОСАОТООААСОААСАТТСААТСАТАТТТОСОАТО
ССТААСААОССАОООСАОТТСАОССОСТТТОАТТТТССТОААОСТСТТССТССОССАТТАААТСОА
АТТТТСОССАТАСТАААОААСААСОАААТОСТТАССТООСССОАОАААОТСАААТТТОСТАТТСЮА
СТСТТОССАССААТОСТТОСАОООСААТСТТАТОТТОААОСТСААОАСООТТТААОТОТТААООАС
ТССАТСАОАААОСААОСТСТОССТОАТАСООТОАСАСАТОАООТОТТСАТТОССАТСТСАААСОС
АСТТААСТТСАТАААСССТОАСОАОСТТТСОАТОСАОТОСАТТТТСАТТОСТТТОАЛСЛС?ЛГ77,СГ7’С
АОСАСАААСАТООТТСАААААТСОССТТТТТАОАТСОТААСССТССТОАСАСАСТТТССАТСССОАТТОТС
С ААС А ТА ТТСА С ТСАААА ССТССССАА О ТСА О А СТААА СТСА ССАА ТАААААА О А ТССАССТОАА ТО А ОО
А ТОСААОТОТСААА ТОТТТТА ТАСТОАА ТАА У'СССЛб’УДСААТТАААСС АС АТОСТТТТСТСТТТСССА
СТССАОТООАТАТСТТОААОСТТСТТТТСССТОААОАСТООАААСАОАТСССАТАТТТССААААОТ
ТООАОААОСТАОТОСОАСТТССТОТОАТАААТОТССАТАТАТООТТТОАСАОААААСТОААОААС
АСАТСТСАТААТСТССТСТТСАССАОААОССССТТОСТСАОТСТОТАСССТСАСАТСТСТСТТАСАТ
ОТААООААТАТТАСААССССААТСАОТСТАТОТТСОААТТООТАТТТОСАСССОСАСААОАОТООА
ТАААТСОТАОТСАСТСАСАААТТАТТОАТОСТАСААТОААССААСТАОСОААССТТТТСССТОАТО
АААТТТСООСАОАТСАОАОСАААОСАААААТАТТОААОТАТСАТОТТОТСААААССССААООТСТ
ОТТТАТААААСТОТОССАООТТОТОААСССТОТСООСССТТОСАААОАТССССТАТАОАООСТТТТ
ТАТТТАОСТООТОАСТАСАСОАААСАОААОТАСТТООСТТСААТООААООТОСТОТСТТАТСАООА
ААОСТТТСТОСАСААОСТАТТОТАСАООАТТАСОАОТТАСТТСТТООССООАОССАОААОАТОТТО
ОСАСААОСААССОТАСТТАССАТАСТОААСТАА (8ЕЦ ГО N0:38).
Синтезировали дцРНК-полинуклеотид длиной 685 пар оснований, антисмысловая цепь которого была способна гибридизоваться с РНК, кодируемой нуклеотидами в положениях 421 - 1105 (показаны подчеркнутым текстом) δ НС) ГО ΝΟ: 38 и дцРНК-полинуклеотид длиной 192 пар оснований, антисмысловая цепь которого была способна гибридизоваться с РНК, кодируемой нуклеотидами в положениях 914 - 1105 (показаны подчеркнутым курсивом) δΗΟ ГО ΝΟ: 38.
Выравнивание последовательностей ДНК ΡΌδ амаранта Палмера и Νία4ί;··ιικ·ι ЪеШИапчана, выполненное с помощью глобального попарного выравнивания (растягиванием), показано на фиг. 16; согласно этому способу, идентичность двух указанных последовательностей составила приблизительно 71% (1252/1762).
Растения амаранта Палмера высотой 5-8 дюймов, содержащие 16 копий ΕΡδΡδ, обрабатывали свежеприготовленным раствором 0,1% δί1\\Η Ь-77 в άάΗ2Ο. Четыре полностью развившихся листа на растение погружали в раствор δί1\\<4 Ь-77 на несколько секунд и оставляли сушиться на период от 30 мин до 1 ч, после чего наносили полинуклеотидную композицию. Растворы отдельных полинуклеотидов изготовили для 678-п.о. дцРНК ΡΌδ амаранта Палмера, 198-п.о. дцРНК ΡΌδ амаранта Палмера, 685-п.о. дцРНК ΡΌδ Νία4ί;··ιικ·ι ЪеШИапчана и 192-п.о. дцРНК ΡΌδ Νία4ί;··ιη;··ι ЪеШИапчана (0,6 микромоль полинуклеотида в 0,01% δί1\\<4 Ь-77, 5 мм натрий-фосфатном буфере, рН 6,8). На верхнюю поверхность каждого из четырех предварительно обработанных листьев наносили 10 микролитров раствора полинуклеотида (или буфера в качестве контроля), что составляло общий объем, равный 40 микролитрам на каждое растение. Растения держали в ростовой камере, обесцвечивание листьев наблюдали через 3 суток после обработки. Наружная обработка растения 678-п.о. дцРНК ΡΌδ амаранта Палмера или 198-п.о. дцРНК ΡΌδ амаранта Палмера привела к обесцвечиванию листьев (указывавшему на сайленсинг эндогенной фитоиндесатуразы), однако обесцвечивания листьев растений амаранта Палмера, подвергнутых наружной обработке 685п.о. дцРНК ΡΌδ Νία4ί;··ιη;··ι ЪеШИапчана и 192-п.о. дцРНК ΡΌδ Νία4ί;··ιη;··ι ЪеШИапчана, не произошло. Эта специфичность к последовательности демонстрировала, что полинуклеотидные композиции и способы согласно изобретению можно использовать для селективной борьбы с заданным видом или таксоном, обладающим специфической последовательностью гена-мишени, например, для борьбы с самосевными растениями, устойчивыми к гербициду и растущими на поле с культурой, устойчивой к этому же гербициду.
В отдельном исследовании растения амаранта Палмера подвергали наружной обработке 678-п. о. дцРНК ΡΌδ амаранта Палмера (обозначенной как "700-нуклеотидная дцРНК ΡΌδ") или 198-п.о. дцРНК ΡΌδ амаранта Палмера (обозначенной как "200-нуклеотидная дцРНК ΡΌδ"), что привело к обесцвечиванию листьев (указывавшему на сайленсинг эндогенной фитоиндесатуразы), однако наружная обработка растений амаранта Палмера дцРНК гена беспозвоночного длиной 260 пар оснований (обозначенной как "260-нуклеотидная дцРНК ΌΥ49", из генома листоеда ОхаЪгойса У1г§1Гега) не привела к возникновению
- 41 029482
обесцвеченного фенотипа, что указывало на отсутствие сайленсинга эндогенной фитоиндесатуразы (фиг. 17). Эта специфичность к последовательности демонстрировала, что полинуклеотидные композиции и способы согласно изобретению можно использовать для селективной борьбы с заданным видом или таксоном.
Пример 12
В этом примере описано использование композиции для наружного нанесения, включающей по меньшей мере одну полинуклеотидную цепь, включающую по меньшей мере один непрерывный сегмент из 18 или более нуклеотидов гена-мишени в антисмысловой или смысловой ориентации для индукции системного сайленсинга гена-мишени в организме растения. Конкретнее, в этом примере продемонстрировано использование однократной обработки олигонуклеотидом фитоиндесатуразы (РОЗ) для индукции системного сайленсинга в различных органах растений, включая листья, стебли и цветки.
Во всех вариантах обработки использовали четырехнедельные растения табака №сойапа ЬеШйат1апа. Два полностью развившихся листа (одна семядоля, один истинный лист) подготавливали путем погружения в свежеприготовленный раствор поверхностно-активного вещества (0,1% Зйхеей 1.-77 в бидистиллированной воде) на несколько секунд и оставляли сушиться на 15-30 мин. Двадцать микролитров 22-членного одноцепочечного ДНК-олигонуклеотида (оцДНК), обладающего последовательностью ООСАОТАСААТТАААООАОАТО (δΕΟ ГО N0:39), соответствующей нуклеотидам в положениях 1099 - 1120 фитоиндесатуразы №сойапа Ьеп1йат1апа (З1Т) II) N0: 2), наносили в виде 25-микромолярного раствора в 0,01% Зй\уей 1,-77 в 5-миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8, на верхнюю поверхность каждого подготовленного листа, так что общее количество составило 40 микролитров (1 наномоль олигонуклеотида) на растение. Контрольные растения обрабатывали раствором Зй\уей без ДНКолигонуклеотида. Обесцвечивание растений наблюдали на 3 сутки после обработки. Верхушечные листья, стебли и цветки всех растений, обработанных оцДНК-олигонуклеотидом, демонстрировали обесцвечивание, указывавшее на системный сайленсинг РОЗ (фиг. 18А).
Цветкам как контрольных, так и обработанных оцДНК растений позволили образовать семена. Семена собирали из зрелых плодов, взвешивали и позволяли им прорасти. Масса семян была одинаковой (приблизительно 11 мг на 100 семян), морфология семян, полученных с обработанных оцДНК и контрольных растений, оказалась сходной. В отношении семян растений, обработанных оцДНК, наблюдали сниженное количество семян на плод и пониженную всхожесть (проросло 4 семени из 100) по сравнению с количеством семян на плод и всхожестью (проросли 95 семян из 100) семян контрольных растений.
В ходе отдельного исследования при использовании аналогичной процедуры растения табака подготавливали погружением в 0,1% Зй\уей 1,-77 в бидистиллированной воде и обрабатывали 22-членной оцДНК РОЗ (ЗЕЦ ГО N0: 39), наносимой в виде 25-микромолярного раствора в 0,01% Зй\уей Ь-77 в 5миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8, на верхнюю поверхность каждого подготовленного листа, так что общее количество составило 40 микролитров (1 наномоль олигонуклеотида) на растение. Другие растения не подготавливали путем обработки поверхностно-активным веществом, а обрабатывали лишь 1 наномоль 22-членной оцДНК РОЗ (ЗЕЦ ГО N0: 39), наносимой либо путем введения с помощью безыгольного шприца (показано на фиг. 18В), либо ручным нанесением капель на поверхность листа (не показано на фиг. 18В), и либо в виде 25-микромолярного раствора в 0,01% Зй\уей Ь-77 в 5миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8, либо в виде 25-микромолярного раствора в 5миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8 (без поверхностно-активного вещества). Растения, использованные в качестве отрицательного контроля, обрабатывали буферным раствором Зй\уей без ДНК-олигонуклеотида. Результаты показаны на фиг. 18В. Все растения, обработанные лишь прямым нанесением оцДНК РОЗ (без подготовки обработкой поверхностно-активным веществом Зй\уей Ь-77), при нанесении путем введения или ручного нанесения капель, демонстрировали обесцвечивание верхушечных листьев, стеблей и цветков, указывавшее на системный сайленсинг РОЗ.
Пример 13
В этом примере показаны способы и наружно наносимые композиции для индукции системного сайленсинга, включающие использование агентов для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов. Конкретнее, в этом примере описано использование полинуклеотидов согласно изобретению для борьбы с амарантом Палмера, устойчивым к гербицидам.
Растения амаранта Палмера, содержащие небольшое (менее 30) количество копий 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ЕРЗРЗ), были чувствительны к обработке дцРНК, предназначенными для сайленсинга ЕРЗРЗ, с последующей обработкой глифосатом (подробности см. в примере 1). Однако растения амаранта Палмера, содержащие большое количество копий ЕРЗРЗ (т.е. 30 или более копий ЕРЗРЗ), были устойчивы к обработке глифосатом и представляли проблему с точки зрения борьбы с устойчивостью сорных растений. Например, в одном из анализов (результаты не показаны) с использованием высококопийного устойчивого к глифосату амаранта Палмера и вариантов обработки, аналогичных описанным в примере 1, но либо при десятикратно увеличенной дозе дцРНК (т.е. до 8 наномоль коротких дцРНК, описанных в примере 1, на растение), либо при использовании патентованного состава глифосата ("гербицида марки Конпйир® ХАе'аЙкл'МАХ®'"), смешанного с поверхностно-активным вещест- 42 029482
вом на основе аминов твердых жиров, активность глифосата усиливалась (что оценивали по наблюдениям роста растений, измеряемого как высота растения), но устойчивые растения не погибали.
Три различных устойчивых к глифосату высококопийных линии амаранта Палмера (3 растения на повторность) обрабатывали дцРНК при условиях обработки, перечисленных в табл. 6, изменяя средуноситель для доставки дцРНК, агент, усиливающий проницаемость и порядок этапов. Результаты показаны на фиг. 19. Обработка "4Х" глифосатом (т.е. обработка 3360 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипкир® ШеаОтегМЛХ® на гектар, что четырехкратно превышало стандартную норму расхода, составлявшую 840 г кислотного эквивалента на гектар) самим по себе не уничтожала 35-копийный (эксперимент 3) или 57-копийный (эксперимент 6) амарант Палмера.
В одном из наборов экспериментов (1-3, табл. 6) включение 2% сульфата аммония в состав водной среды-носителя для доставки дцРНК, содержавшей 0,1% поверхностно-активное вещество на основе амина твердых жиров и 10% глицерин (эксперимент 2) повышало эффективность 10-кратной дозы дцРНК с последующим нанесением 4Х глифосата. Повышенную эффективность 10-кратной дозы дцРНК с последующим нанесением глифосата также наблюдали при включении сульфата аммония в средуноситель для доставки дцРНК без поверхностно-активного вещества на основе амина твердых жирова (эксперимент 8).
В еще одном из наборов экспериментов (4-6, табл. 6) нанесение поверхностно-активного вещества δΐίγϋί Ь-77 перед нанесением дцРНК в среде-носителе для доставки, содержавшей сульфат аммония, было эффективным, в то время как объединение поверхностно-активного вещества δΐίγϋί Ь-77 с дцРНК в среде-носителе для доставки дцРНК, содержавшей сульфат аммония, было неэффективным. Нанесение глифосата ("гербицида марки Коипкир® ШеаФегМАХ®") через 72 ч (эксперимент 7) было менее эффективным, чем нанесение глифосата через 48 ч (эксперимент 2) после обработки дцРНК.
Таблица 6
Линия амаранта Палмера Количество копий ЕР8Р8 Номер эксперимента Этап 1 Этап 2 Этап 3*
Относительная концентрация дцРНК ЕР8Р8 Среданоситель для доставки дцРНК
К31 35 1 юх 0,1% ПАВ на основе амина твердых жиров + 10% глицерин 1 % δΐίννεί Ь-77 4х ХУеаЛегМАХ (48 ч)
2 10Х 2% сульфат аммония + 0,1% ПАВ на основе амина твердых жиров + 10% глицерин 1% δϊίννεΐ Ь-77 4х ХУеаЛегМАХ (48 ч)
3 Только буфер (контроль) 2% сульфат аммония + 0,1% ПАВ на основе амина твердых жиров + 10% 1 % 8ϊ1 \νεΐ Ь-77 4х УУеаЛегМАХ (48 ч)
глицерин
Линия амаранта Палмера Количество копий ЕР8Р8 Номер эксперимента Этап 1 Этап 2 Этап 3*
Относительная концентрация дцРНК ЕР8Р8 Среданоситель ДЛЯ доставки ДЦРНК
К.34 57 4 ЮХ 1% δΐίννβΐ Ь-77 + 2% сульфат аммония 4х ^еаЛегМАХ (48 ч)
5 1% δίίχνεΐ Ь-77 юх 2% сульфат аммония 4х 9/еа1ЬегМАХ (48 ч)
6 1% 8ΐ1\νεΙ Ь-77 Только буфер (контроль) 2% сульфат аммония 4х Т/еаЛегМАХ (48 ч)
Линия амаранта Палмера Количество копий ЕР8Р8 Номер эксперимента Этап 1 Этап 2 Этап 3*
Относительная концентрация дцРНК ЕР8Р8 Среданоситель для доставки дцРНК
К.28 87 7 ЮХ 2% сульфат аммония + 0,1% ПАВ на основе амина твердых жиров + 10% глицерин 1% δϊίχνβί Ь-77 4х \Уеа1НегМАХ (72 ч)
Линия амаранта Палмера Количество копий ЕР8Р8 Номер эксп ери м епт а Этап 1 Этап 2 Этап 3*
Относительная концентрация дцРНК ЕР8Р8 Среданоситель для доставки дцРНК
К28 87 8 1% 8ί1\νεί Ь-77 ЮХ 2% сульфат аммония 4х АУеайегМАХ (72 ч)
9 1% δΐίννεί Ь-77 Только буфер (контроль) 2% сульфат аммония 4х УУеаЛегМАХ (72 ч)
*глифосат (в виде доступного для приобретения состава "гербицид марки Коипкир® ШеаФег- 43 029482
МАХ®", содержавшего 660 г/л К+ соли глифосата в носителе, включавшем смесь поверхностноактивных веществ ΜΟΝ56151 на основе амина твердых жиров (16-18С) и амина жирных кислот кокосового масла (12-14С) в соотношении 55:45) приведен с указанием использованного количества (где 1Х = 840 г кислотного эквивалента гербицида марки Коиибир® \Уеа1НегМАХ® на гектар, 4Х = 3360 г кислотного эквивалента гербицида марки Коиибир® \Уеа1НегМАХ® на гектар) и ч после нанесения дцРНК
Пример 14
В этом примере показаны способы и наружно наносимые композиции для индукции системного сайленсинга, включающие использование агентов для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов.
Обнаружили, что две малые РНК, идентифицированные путем секвенирования малых РНК, содержались в больших количествах и были уникальны для растений амаранта Палмера, обработанных четырьмя "короткими" молекулами дцРНК ΕΡδΡδ олигонуклеотидного размера, как описано в примере 1. Эти две малые РНК были соответственно картированы в положениях 743 - 764 и 566 - 585 полноразмерной ΕΡδΡδ, обладающей последовательностью, показанной на фиг. 20 (δΕφ ГО ΝΟ: 40). Сконструировали две "короткие" молекулы дцРНК олигонуклеотидного размера длиной 25 нуклеотидов, содержавшие антисмысловую цепь, способную гибридизоваться с мРНК-транскриптом гена ΕΡδΡδ амаранта Палмера в положениях 743 - 767 ("короткая дцРНК-5") и 564 - 588 ("короткая дцРНК-6"), показанных в виде курсивных подчеркнутых нуклеотидов в δΕφ ГО ΝΟ: 40, показанной на фиг. 20, где также показаны четыре "коротких" молекулы дцРНК ΕΡδΡδ олигонуклеотидного размера (подчеркнутый некурсивный текст) и три "длинных" двуцепочечных РНК-полинуклеотида (полужирный текст, как описано в примере 1).
Нанесение смеси четырех "коротких" молекул дцРНК ΕΡδΡδ олигонуклеотидного размера (описанной в примере 1) с последующим нанесением глифосата, воспроизводящее процедуру обработки, описанную в примере 1, приводило к гибели 4 из 4 растений амаранта Палмера, содержавших 16 копий ΕΡδΡδ. Использование этой же процедуры обработки, но при совместном нанесении короткой дцРНК-5 и короткой дцРНК-6 приводило к гибели 0 из 4 растений амаранта Палмера. Добавление одной или обеих из короткой дцРНК-5 и короткой дцРНК-6 к смеси четырех "коротких" молекул дцРНК ΕΡδΡδ олигонуклеотидного размера (описанной в примере 1) приводило к гибели 4 из 4 растений амаранта Палмера, т.е. антагонистического эффекта короткой дцРНК-5 и короткой дцРНК-6 не наблюдалось.
Пример 15
В этом примере показаны способы и наружно наносимые композиции для индукции системного сайленсинга, включающие использование агентов для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов. Конкретнее, в этом примере описано использование салициловой кислоты и полинуклеотидов.
Салициловая кислота (СК) индуцировала устойчивость табака к вирусам; см., например, СЫуака е1 а1. (1997) Ρ1;·ιηΙ Се11, 19:547 - 557. Растения амаранта Палмера, устойчивые к глифосату и содержавшие от 49 до 63 копий ΕΡδΡδ, подвергали предварительной обработке 15-миллимолярной СК. Раствор четырех "коротких" молекул дцРНК ΕΡδΡδ олигонуклеотидного размера (описанный в примере 1) вручную наносили через 1, 5 или 24 ч после обработки СК, с последующим опрыскиванием глифосатом через 72 ч (1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® \Уеа1НегМАХ® на гектар). При всех вариантах обработки СК через 7 суток после обработки глифосатом не наблюдали усиления действия дцРНК и активности глифосата (оцениваемой по наблюдаемому росту растений, измеряемому как высота растения).
Пример 16
В этом примере показаны способы и наружно наносимые композиции для индукции системного сайленсинга, включающие использование агентов для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов. Конкретнее, в этом примере описаны изменения порядка и расписания нанесения полинуклеотидов и раствора поверхностно-активного вещества.
Эти исследования выполняли с использованием растений амаранта Палмера с большим количеством копий (56, 63 или 100 копий) ΕΡδΡδ, применяя протокол, включавший следующие этапы: (1) нанесение дцРНК (раствора четырех "коротких" молекул дцРНК ΕΡδΡδ олигонуклеотидного размера, описанного в примере 1) в растворе, содержавшем поверхностно-активное вещество на основе амина твердых жиров и глицерин; (2) нанесение 1% раствора кремнийсодержащего поверхностно-активного вещества δίίνν^ΐ Ь-77; и (3) нанесение глифосата (1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® \Уеа1НегМАХ® на гектар). Выполняли оценку интервалов между временем нанесения полинуклеотидов и нанесения δίίνν^ΐ. опрыскивая растение δί1\\Όΐ через 30 мин, 1 или 2 ч после нанесения раствора дцРНК. В этом наборе анализов все три времени нанесения раствора δίίχν^ΐ привели к аналогичным результатам, т.е. замедлению роста большинства высококопийных растений, обработанных раствором дцРНК, по сравнению с контрольными высококопийными растениями, обработанными только поверхностноактивным веществом на основе амина твердых жиров и глицерином.
Пример 17
В этом примере показаны способы и наружно наносимые композиции для индукции системного
- 44 029482
сайленсинга, включающие использование агентов для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов. Конкретнее, в этом примере описано нанесение полинуклеотидов согласно изобретению с помощью малообъемного опрыскивателя и использование кремнийорганического поверхностноактивного вещества и сульфата аммония.
Раствор дцРНК (раствор четырех "коротких" молекул дцРНК ΕΡδΡδ олигонуклеотидного размера, описанного в примере 1) в растворе, содержавшем 2% сульфат аммония, наносили с помощью малообъемного опрыскивателя на амарант Палмера, содержавший 16 копий ΕΡδΡδ с последующим опрыскиванием глифосатом (1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипйир® АеаШегМАХ® на гектар), что приводило к гибели растений амаранта Палмера.
Шесть растений амаранта Палмера на вариант обработки обрабатывали согласно трехстадийной процедуре с помощью малообъемного опрыскивателя: (1) опрыскивание 1% δίΐ^ΐ Ь-77; (2) опрыскивание 2 миллилитрами раствора дцРНК, содержавшего равные количества четырех "коротких" молекул дцРНК ΕΡδΡδ олигонуклеотидного объема, описанного в примере 1 в одной из 3 доз (1Х, или 0,8 наномоль на растение, 2Х, или 1,6 наномоль на растение, или 4Х, или 3,2 наномоль на растение); и (3) опрыскивание глифосатом (1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипйир® АеаШегМАХ® на гектар) при норме расхода 159 литров/акр. Через девять суток после опрыскивания глифосатом все растения, опрысканные 4Х (3,2 наномоль на растение) дцРНК, погибли, а растения, опрысканные 2Х (1,6 наномоль на растение) дцРНК или 1Х (0,8 наномоль на растение) дцРНК, замедлили рост (фиг. 21 А).
Несколько анализов выполняли с использованием амаранта Палмера, устойчивого к глифосату, выращенного из семян, собранных в полевых условиях. Растения обрабатывали, используя различные протоколы, описанные ниже, причем некоторые растения подвергали наружной обработке раствором дцРНК, а контрольные растения обрабатывали буфером (средой-носителем дцРНК); нанесение осуществляли с помощью малообъемного опрыскивателя. Если не указано иное, раствор дцРНК содержал равные количества четырех "коротких" молекул дцРНК ΕΡδΡδ олигонуклеотидного объема, описанного в примере 1, в буфере в дозе 4Х (3,2 наномоль на растение); буфер состоял из 10 миллимолярного фосфата натрия и 0,01% (об./об.) кремнийорганического поверхностно-активного вещества δίΐ\\Όΐ Ь-77 в воде, обработанной диэтилпирокарбонатом (ΌΕΡΟ) (Отеда Βίο-Тек); рН буфера титровали до 6,8; а гербицид представлял собой гербицид глифосат, наносимый в количестве 840 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипйир® АеаШегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр. Результаты представлены в табл. 7.
Анализы 1 и 2. С использованием растений амаранта Палмера, устойчивых к глифосату и выращенных из семян, полученных из образца почвы, отобранного в расположении фермы, где заведомо рос амарант Палмера, устойчивый к глифосату, выполнили три анализа. В ходе первого анализа обрабатывали по десять растений на вариант обработки следующим образом: (1) опрыскивание 1% δίΚν^ί Ь-77; (2) опрыскивание 2 миллилитрами раствора дцРНК; и (3) опрыскивание глифосатом. В ходе второго анализа обрабатывали по восемнадцать растений на вариант обработки аналогично анализу 1.
Анализ 3. В ходе этого анализа выполняли сравнение вариантов обработки, осуществляемых на различных стадиях развития, и использовали проростки, выращенные из семян амаранта Палмера из округа Мэйкон, штат Джорджия, США, и выбранные на основании устойчивости к глифосату. Буфер включал 2% сульфат аммония. Двенадцать небольших (стадия 3 листьев) или двенадцать крупных (стадия 5 листьев) проростков на вариант обработки обрабатывали следующим образом: (1) опрыскивание 1% δίΐν^ί Ь-77; (2) опрыскивание 2 миллилитрами раствора дцРНК; и (3) опрыскивание глифосатом. Этот вариант обработки обеспечивал лучший способ борьбы (уничтожал большее количество растений) с небольшими проростками по сравнению с крупными проростками. Обработка дцРНК уничтожала или замедляла рост большего количества растений, устойчивых к глифосату, чем обработка буфером и гербицидом, хотя на 16 сутки после обработки погибали не все растения, обработанные дцРНК.
Анализы 4 и 5. В этих анализах использовали растения амаранта Палмера, выращенные из семян из почвы с фермы, расположенной в Пемискоте, штат Миссури, США. Буфер включал 2% сульфат аммония. Одиннадцать небольших (стадия 3 листьев) проростков на вариант обработки обрабатывали следующим образом: (1) опрыскивание 1% δίΐ\\Όΐ Ь-77; (2) опрыскивание 2 миллилитрами раствора дцРНК; и (3) опрыскивание глифосатом. В ходе анализа 5 обрабатывали по двенадцать растений на вариант обработки аналогично анализу 4.
Анализ 6. В этом анализе использовали растения амаранта Палмера, выращенные из семян из почвы с фермы ’Ίνγ2". Буфер включал 2% сульфат аммония. Восемнадцать небольших (стадия 3 листьев) проростков на вариант обработки обрабатывали следующим образом: (1) опрыскивание 1% δίΐ\\Όΐ Ь-77; (2) нанесение 2 миллилитров раствора дцРНК вручную или с помощью опрыскивателя; и (3) опрыскивание глифосатом. В ходе этого анализа способы нанесения (нанесение капель вручную или опрыскивание) привели к аналогичным результатам.
Анализ 7. В этом анализе использовали проростки амаранта Палмера на стадии 3 или 4 листьев, выращенные из семян Р3, выбранных на основании устойчивости к глифосату и более устойчивых к глифосату, чем растения в анализах 1-6. Буфер включал 2% сульфат аммония. Обрабатывали по восемнадцать
- 45 029482
растений на вариант обработки следующим образом: (1) опрыскивание 1% 8ЙАе! Б-77; (2) опрыскивание 2 миллилитрами раствора дцРНК; и (3) опрыскивание глифосатом.
Таблица 7
Номер анализа погибшие растения / всего растений Комментарии
обработанные дцРНК контроль
1 2/10 0/10 растения, выжившие после обработки дцРНК, замедлили рост по сравнению с контрольными (Фигура 21В)
2 7/18 4/18 растения, выжившие после обработки дцРНК, замедлили рост на 8 и 30 сутки после обработки, по сравнению с контрольными
3 (крупные проростки) 5/12 3/12 растения, выжившие после обработки дцРНК / сульфатом аммония, сильнее замедлили рост после обработки по сравнению с контрольными
3 (небольшие проростки) 9/12 6/12
4 7/11 2/11 растения, выжившие после обработки дцРНК / сульфатом аммония, сильнее замедлили рост после обработки по сравнению с контрольными
5 8/12 3/12
6 (нанесение капель вручную) 14/18
6 (опрыскива ние) 13/18 9/18
7 8/18 2/18
Пример 18
В этом примере показаны способы и наружно наносимые композиции для индукции системного сайленсинга, включающие использование агентов для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов.
В этих анализах раствор дцРНК содержал равные количества четырех "коротких" молекул дцРНК ΕΡδΡδ олигонуклеотидного размера, описанных в примере 1, в дозе "10Х" (8 наномоль на растение) в растворе, содержавшем либо 0,2% поверхностно-активное вещество на основе амина твердых жиров и 2% сульфат аммония (идентифицированном на фиг. 22 как "амин твердых жиров/сульфат аммония"), либо один из следующих реагентов для трансфекции: (а) полиамин (^ΙΡΚΙΜΕ™, Ρо1ур1иδ-ί^аηδίесί^оη ЗА, Илькирш, Франция)., (б) магнитные наночастицы (ЗйепсеМад, ΟΖ Вюксчепсек, Марсель, Франция), (с) пептид (наночастицы Ν-ТЕК™, 81§та-А10г1сН, Сент-Луис, штат Миссури, США), (ά) липид (δίΡΟΚΤ™ №оРХ™, АтЪюп, Фостер Сити, штат Калифорния, США), или (е) катионный липид/полимер (Тгапк1Т®, Μΐηΐδ Вю, Мадисон, штат Висконсин, США). Растения обрабатывали следующим образом: (1) нанесение раствора дцРНК вручную; (2) опрыскивание 1% ЗЙАе! Б-77; и (3) опрыскивание глифосатом, наносимым в количестве 840 г кислотного эквивалента гербицида марки КоипЪир® ШеаЛегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр. При использовании этого протокола с дцРНК в растворе поверхностноактивного вещества на основе амина твердых жиров/сульфата аммония гибли растения амаранта Палмера, устойчивые к глифосату и содержавшие 35 копий ΕΡδΡδ. Результаты показаны на фиг. 22. Замедление роста и гибель наблюдали у растений, обработанных дцРНК в растворах, содержавших полиамин (^ΙΡΚΙΜΕ™), пептид (наночастицы Ν-ΤΕΚ™), катионный липид/полимер (Тгапк1Т®), или поверхностноактивное вещество на основе амина твердых жиров/сульфат аммония.
Пример 19
В этом примере показаны способы использования композиций, включающих наружно наносимые полинуклеотиды, для индукции системного сайленсинга у растений. Конкретнее, в этом примере описано использование различных типов полинуклеотидов для индукции системного сайленсинга.
Смысловые одноцепочечные ДНК (оцДНК) и антисмысловые одноцепочечные РНК (оцРНК), соответствующие гену ΕΡδΡδ амаранта Палмера в положениях 14-38, положениях 153-177, 345-369 и 11051129 (обозначены в виде подчеркнутых нуклеотидов на фиг. 1), приобрели в 1п1е§га1еЪ ^NΑ Тесйпо1о§1ек. Эти смысловые оцДНК и антисмысловые оцРНК отжигали, нагревая смесь равных молярных количеств оцДНК и оцРНК при 95°С в течение 5 мин и медленно охлаждая в течение 1,5-2 ч до комнатной температуры и получая гибриды ДНК/РНК.
Анализ выполняли с использованием растений 16-копийного амаранта Палмера, устойчивого к глифосату, используя процедуру: (1) опрыскивание 1% δϊΚν^ί Б-77; (2) нанесение вручную общего количества, равного 0,8 наномоль дцРНК ΕΡδΡδ амаранта Палмера (как описано в примере 1) или гибридов ДНК/РНК ΕΡδΡδ амаранта
Палмера на четыре зрелых листа каждого растения; и (3) опрыскивание глифосатом, наносившее 840 г кислотного эквивалента гербицида марки КоипЪир® ШеаЛегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр.
Результаты показаны на фиг. 23. Через семь суток после опрыскивания гербицидом 4 из 6 растений, обработанных дцРНК, погибли, а оставшиеся 2 погибали, в то время как растения, опрысканные гибридом ДНК/РНК, замедлили рост (повреждение глифосатом) по сравнению с контролем.
- 46 029482
Пример 20
В этом примере показаны способы использования композиций, включающих наружно наносимые полинуклеотиды, для индукции системного сайленсинга у растений. Конкретнее, в этом примере описано использование различных типов полинуклеотидов для индукции системного сайленсинга.
В этом анализе использовали шесть растений амаранта Палмера, устойчивых к глифосату и содержавших 16 копий ЕР8Р8, на вариант обработки. На отдельные растения вручную наносили 0,8 наномоль ("1Х") дцРНК на обработку растения, десятикратно большее количество (8 наномоль на обработку растения, "10Х") оцДНК-полинуклеотидов (описанных в примере 19) в буфере, содержавшем 2% сульфат аммония, и чистый буфер в качестве контроля, с последующим опрыскиванием глифосатом спустя 48 ч, наносившим 840 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® Аеа!ЬегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр. На фиг. 24 изображены результаты. Оба варианта обработки полинуклеотидами обеспечивали лучший способ борьбы с амарантом Палмера по сравнению с растениями, обработанными только буфером и гербицидом. Два из шести растений, обработанных 10Х оцДНК, погибли, а оставшиеся четыре замедлили рост на 30%. Все шесть растений, обработанных 1Х оцДНК, погибли в течение 8 суток после опрыскивания АМ или 10 суток после обработки дцРНК.
Пример 21
В этом примере показаны способы использования композиций, включающих наружно наносимые полинуклеотиды, для индукции системного сайленсинга у растений. Конкретнее, в этом примере описан выбор последовательности полинуклеотида для индукции системного сайленсинга у растения.
Сконструировали двенадцать дцРНК длиной приблизительно по 250 п.о., содержавших одну цепь дцРНК, соответствующую фрагментам последовательностей ДНК ЕР8Р8 8Е^ ГО N08:41-52 (табл. 8), перекрывающих в мозаичном порядке всю кодирующую последовательность и часть 5'- и 3'нетранслируемых областей гена ЕР8Р8, как показано на фиг. 25А.
_ Таблица 8
Номер сегмента мозаики (см. Фигуру 25А) Последовательность 8Е(} ГО ΝΟ.
1 СОССАОООСТОСАОАСОСОТТАСОТАИТСООАТССАОААТТСОТОАТТААС ОТСАСАОСАТОТСАТОТААААСАСОСОААТСАОАССООТССАСТСТТОТТТ ТААТТТОАОАСААТТТТОАТОТТОАОТСАТСССАСАССААССССААААААТ ТСААСААСАААСТСТТАТААТОАТТСССТСТАСТСТАСТАОАОТСТАСАСС ААСССАСТТТСТСТТТОСССАССААААСТТТООТТТООТААОААСТ 41
2 САССААСССАСТТТСТСТТТССССАССААААСТТТСОТТТСОТААСААСТА АОСССТСТТСТТТСССТТСТСТСТСТТААААОССТААААТССАССТААСТТТ ТТСАОССААСАААСААСОССАААТТСАОАООААОААТААТОАТООСТСАА ОСТАСТАССАТСААСААТООТОТССАТАСТООТСААТТОСАССАТАСТТТА СССААААСССАОТТАСССАААТСТТСАААААСТСТТААТТ 42
3 ССАТАСТТТАСССААААСССАОТТАСССАААТСТТСАААААСТСТТААТТТТ ССАТСАААСТТОАОААТТТСТССАААСТТСАТСТСТТТААССААТААААСА ОТТООТОООСААТСАТСААТТОТТСССААОАТТСААОСТТСТОТТОСТОСТ ОСАОСТСАСАААССТТСАТСТСТСССАОАААТТСТОТТАСААСССАТСААА САСАТСТСТССТАСТОТТСААТТСССТСССТСАААСТСТТТАТСС 43
4 ТСАААОАОАТСТСТООТАСТОТТСААТТОССТОООТСАААОТСТТТАТССА АТСОААТССТТСТТТТАОСТОСТТТОТСТОАОООСАСААСАОТОСТСОАСА АСТТОСТОТАТАОТОАТОАТАТТСТТТАТАТОТТСОАСССТСТСАСААСТСТ ТООТТТААААОТООАООАТСАТАСТАСАОССААААОООСАОТСОТАСАОС ОТТСТООТООТСТОТТТССТОТТСОТАААСАТООАААООААОАОАТ 44
5 ОАОООТТОТООТООТСТОТТТССТОТТООТАААОАТООАААООААОАОАТТ СААСТТТТССТТООТААТОСАООААСАОСОАТОСССССАТТОАСАОСТОСО ОТТССССТТССТССАССАААТТСААОТТАТОТОСТТОАТООАОТАССААОА АТОАОООАССОССССАТТООООАТСТООТАОСАООТСТАААОСААСТТОО ТТСАОАТОТАОАТТОТТТТСТТООСАСАААТТОСССТССТОТТСООО 45
6 ТООТТСАОАТОТАОАТТОТТТТСТТООСАСАААТТОСССТССТОТТСОООТС ААТОСТАААООАООССТТССАООООССААССТСААССТСТСТООАТСООТ ТАОТАОССААТАТТТААСТОСАСТТСТСАТООСТАСТССТТТОООТСТТООА ОАСОТООАОАТТОАОАТАОТТОАТАААТТОАТТТСТОТАССОТАТОТТОАА АТОАСААТАААСТТСАТООААСОСТТТООАОТАТССОТАСААСАТ 46
7 ТТОАААТОАСААТАААОТТОАТООААСОСТТТССАОТАТССОТАОААСАТ АОТОАТАОТТОООАСАООТТСТАСАТТСОАООТООТСАОАААТАСАААТСТ ССТОСАААСССАТАТОТТОАОООТОАТОСТТСААОТССТАОСТАСТТССТА ОССООАОССОССОТСАСТООТОООАСТОТСАСТОТСААОООТТОТООААС ААОСАОТТТАСАОООТОАТОТААААТТТОССОААОТТСТТОАОААОАТ 47
8 АСААОСАОТТТАСАООСТОАТОТААААТТТОССОААОТТСТТОАОААСАТ ОООТТОСААООТСАССТООАСАОАОААТАОТОТААСТОТТАСТООАССАС ССАОООАТТСАТСТООАААОАААСАТСТОСОТОСТАТСОАСОТСААСАТО 48
- 47 029482
ААСААААТОССАОАТОТТОСТАТОАСТСТТОСАСТТОТТОССТТОТАТОСА ОАТОООСССАССОССАТСАОАОАТОТООСТАОСТООАОАОТОААООААА
9 АОАТОООСССАССОССАТСАОАОАТОТООСТАОСТООАОАОТОААООААА ССОААСООАТСАТТОССАТТТССАСАОААСТОАОАААОСТТООООСААСА ОТТОАООААООАТСТОАТТАСТОТОТОАТСАСТССОССТОААААОСТАААС СССАССОССАТТОАААСТТАТОАСОАТСАССОААТООССАТООСАТТСТСТ СТТССТОССТОТССАОАТСТТССССТСАСТАТССТТОАТССОООАТОС 49
10 СТСТТССТОССТОТОСАОАТОТТСССОТСАСТАТССТТОАТСССООАТОСАС ССОТААААССТТСССООАСТАСТТТОАТОТТТТАОААААСТТСОССААОСА ТТОАТОАОТАОСТАТАТАСОАОАТССТТАААТТОТАСОССОААООТТТТОА ТТТОАОТСТААТАОТАОАТААААСОСТАТАААТАААСТООСТТТСТОСТТО АОТААТТАТОАААТТСТТТОТАТТАТОТТТОТОАОАТТТОААОТАОСТТАТА 50
11 ТААТТАТСАААТТСТТТСТАТТАТОТТТОТСАОАТТТОААОТАОСТТАТААА ТТАСААТОТАСТАААСТСТАОАААТААСТТАТСТАТСТТТТАААТСААТОА ОАААТОСАТАСТТОАААООСТТОАССТТОТАТТТОТОАССТАААОАОТАСТ ААСТТТООАОТТТССААСТСАТТТОТТТАТСТСАТТТТТТТТТААТТТТТОАТ ТТАААТТСТТТАТТТТТАТОАСТААТСАТСТАТСТТТСТТАТТСТААССААА ТОТААТАСТССТТС 51
12 ТАТОАОТААТСАТОТАТСТТТСТТАТТСТААССАААТОТААТАСТССТТССА АСТСТСТТТАААСОТССАСАСТСТОООСАСАОАОТОТААТАОТОТООТОСТ ТООАОТСТТТТААОТОАТТАТААТААТТОТАААТОТООТАОТТАОААТАТТ ТТААОТААТОТАООТООООТАТТАТООТСТТОТТОААСАТАООАТАТТТАО ОТААААААТСТАТОСАААААААООАААОТААОСАААТАААОСОААТТОА ССТОААААОААААОТООАСАТОТАТАОТОАОТТООАООААОТАТТТТ 52
Четыре "коротких" молекулы дцРНК ΞΡδΡδ олигонуклеотидного размера, соответствующие описанию в примере 1 и на фиг. 1, располагались в сегментах мозаики 2, 3, 4 и 8 соответственно, и показаны в виде светло-серых столбиков в пределах этих сегментов. Полинуклеотиды синтезировали путем транскрипции т νίΐΐΌ, используя вектор рВК322, содержавший полинуклеотиды ΞΡδΡδ, встроенные в сайты клонирования ЕсоЫ и ВатШ; плазмидную ДНК выделяли с помощью наборов ^^адеη Мах1 ргер кгЩ и гидролизовали ферментами рестрикции ЕсоЫ и ВатНР Раствор гидролизованной ДНК использовали для обработки растений без дальнейшей очистки.
Растения амаранта Палмера, устойчивые к глифосату и содержавшие 16 копий ЕΡδΡδ, обрабатывали следующим образом: опрыскивание 1% δίΐ^ΐ Б-77; (2) нанесение вручную раствора дцРНК (содержавшего полинуклеотиды, отобранные с двенадцати сегментов мозаики, или четыре "короткие" молекулы дцРНК, описанные в примере 1, при норме расхода 0,01 наномоль ДНК/растение) или буфера в качестве контроля; и (3) опрыскивание глифосатом спустя 48 ч, наносившее 840 г кислотного эквивалента гербицида марки Ноипбир® ШеаЙтегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр. Высоту надземной части обработанных растений наблюдали через 11 суток; погибшим или гибнущим растениям присваивали высоту, равную нулю. Результаты показаны на фиг. 25В и 25С. Комбинации дцРНК-полинуклеотидов, демонстрировавшие повышенную эффективность в этом анализе, включали четыре "короткие" молекулы дцРНК, описанные в примере 1, комбинацию сегментов мозаики 2, 5, 8 и 11, и комбинацию сегментов мозаики 7, 8 и 9.
Пример 22
В этом примере показаны способы использования композиций, включающих наружно наносимые полинуклеотиды, для индукции системного сайленсинга у растений. Конкретнее, в этом примере описано наружное нанесение полинуклеотидов с последующим нанесением гербицидов на растение.
В одном из анализов растения амаранта Палмера, устойчивые к глифосату и содержавшие 16 копий ΡΡδΡδ, опрыскивали глифосатом, наносимым в количестве 840 г кислотного эквивалента гербицида марки Ноипбир® Шеа1НегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр. Через два или 24 ч после нанесения гербицида растения обрабатывали опрыскиванием 1% δίΐ^ΐ Ь-77. Через 15-20 мин после обработки δι!\\Γΐ растения обрабатывали путем нанесения вручную либо 0,8 наномоль ("1Х") четырех "коротких" молекул дцРНК олигонуклеотидного размера, описанных в примере 1, в буфере, содержавшем 2% сульфат аммония, на растение, либо буфера, содержавшего 2% сульфат аммония. В этом анализе необработанные ("НО") контрольные растения обрабатывали только опрыскиванием 1% δίΐ^ΐ Ь-77, но не гербицидом и не дцРНК. Результаты показаны на фиг. 26. В этом анализе нанесение 1% δίΐ^ΐ привело к усилению активности глифосата на 60% при нанесении через 2 ч после опрыскивания гербицидом и на 20% при нанесении через 24 ч после опрыскивания гербицидом. В этом анализе нанесение 1% δίΐ^ΐ с последующей обработкой дцРНК ЕΡδΡδ привело к усилению активности глифосата по меньшей мере на 80% при нанесении через 2 ч после опрыскивания гербицидом и на 20% при нанесении через 24 ч после опрыскивания гербицидом.
В еще одном из анализов растения амаранта Палмера, выращенные из семян из почвы с расположения фермы в округе Мэйкон, штат Джорджия, США, опрыскивали глифосатом, наносимым в количестве 840 г кислотного эквивалента гербицида марки Ноипбир® Шеа1НегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр. Через трое суток после обработки гербицидом 9 из 40 растений погибли, а у трех сильно замедлился рост. Выжившие растения опрыскивали 1% δίΐ^ΐ Б-77 с последующим наружным нанесением вручную либо 8 наномоль ("10Х") четырех "коротких" молекул дцРНК олигонуклеотидного размера, описанных в примере 1, либо буфера в качестве контроля. Через трое суток еще 3 растения из группы, обработанной дцРНК, и еще 2 растения из группы, обработанной буфером, погибли. В этот момент (через 6 суток после исходной обработки гербицидом и через 3 суток после обработки δ^1^еί/дцРНК или буфером) половину выживших растений в каждой группе опрыскивали, повторно нанося глифосат (в той же дозе, что и при первом нанесении). Через две недели после этой второй обработки гербицидом остав- 48 029482
шиеся растения, обработанные дцРНК, демонстрировали 80% повреждение, а оставшиеся растения, обработанные буфером, демонстрировали 40% повреждение.
Пример 23
В этом примере показаны способы использования композиций, включающих наружно наносимые полинуклеотиды, для индукции системного сайленсинга у растений. Конкретнее, в этом примере описано одностадийное наружное нанесение одиночной композиции, включающей полинуклеотиды, поверхностно-активное вещество и гербицид, для борьбы с сорными растениями, устойчивыми к гербицидам.
Этот анализ выполняли, используя полевую популяцию растений амаранта Палмера, устойчивых к глифосату и заведомо содержавших очень большое количество копий ΕΡδΡδ (в работе Оашез е! а1. (2010) Ριόο. №И. Асаб. δοί. υδΑ, 107: 1029-1034 сообщалось, что растения с этого участка содержали от 5 до более 160 копий ΕΡδΡδ). Полинуклеотиды, использованные при этом анализе, представляли собой эквимолярную смесь четырех "коротких" молекул ΕΡδΡδ дцРНК олигонуклеотидного размера, описанных в примере 1.
Растения высотой от четырех до шести футов на обрабатываемой площади 1 фут на 5 футов однократно опрыскивали либо 264 микрограммами (" 100Х"), либо 52,8 микрограммами ("20Х") дцРНК ΕΡδΡδ в растворе, также содержавшем 1% поверхностно-активное вещество δίΚν^Ι Ь-77, 2% сульфат аммония и глифосат (наносимый в количестве 1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® АеаШегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр). Для сравнения другие растения на обрабатываемых площадях 1 фут на 5 футов опрыскивали глифосатом (в растворе, также содержавшем 1% поверхностно-активное вещество δί1\\Όΐ Ь-77 и 2% сульфат аммония) при той же норме расхода.
Результаты показаны на фиг. 27. Обработка растений только глифосатом (наносимым в количестве 1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® АеаШегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр) в растворе, также содержавшем δί1\\Όΐ Ь-77 и сульфат аммония, привела приблизительно к 70% эффективности борьбы (гибели растений). Одностадийная обработка композицией, содержавшей 20Х дцРНК-полинуклеотиды ΕΡδΡδ, поверхностно-активное вещество, сульфат аммония и гербицид, привела приблизительно к 80-85% эффективности борьбы с амарантом Палмера, устойчивым к глифосату, что приблизительно соответствует эффективности борьбы, полученной при опрыскивании глифосатом, наносимым в количестве 6720 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® АеаШегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр (т.е. в 8 раз больше, чем стандартное наносимое количество, равное приблизительно 840 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® АеаШегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр). Одностадийная обработка композицией, содержавшей 100Х дцРНКполинуклеотиды ΕΡδΡδ, поверхностно-активное вещество, сульфат аммония и гербицид, привела приблизительно к 90-95% эффективности борьбы с амарантом Палмера, устойчивым к глифосату, что приблизительно соответствует эффективности борьбы, полученной при опрыскивании глифосатом, наносимым в количестве 13440 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® АеаШегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр (т.е. в 16 раз больше, чем стандартное наносимое количество, равное приблизительно 840 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® АеаШегМАХ® на гектар при норме расхода 159 л/акр).
Пример 24
В этом примере показан способ для индукции системной регуляции гена-мишени овощного растения путем наружного нанесения на овощное растение молекулы полинуклеотида, включающей сегмент с нуклеотидной последовательностью, практически идентичной или практически комплементарной непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов гена-мишени или РНК-транскрипта генамишени, причем указанная молекула проникает во внутренние ткани овощного растения и индуцирует системную регуляцию гена-мишени. В данном примере растущие овощные растения обрабатывали композицией для наружного нанесения для индукции системного сайленсинга гена-мишени в растении овощной или фруктовой культуры, включающий: (а) агент для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов и (б) полинуклеотиды, включающие по меньшей мере одну полинуклеотидную цепь, включающую по меньшей мере один непрерывный сегмент из 18 или более нуклеотидов генамишени в антисмысловой или смысловой ориентации. Конкретнее, в этом примере продемонстрировано использование наружно наносимых полинуклеотидов для индукции системного сайленсинга гена фитоиндесатуразы (ΡΌδ) растения овощной культуры, т.е. салата (ЬасФса зайуа). ΡΌδ салата обладает последовательностью
- 49 029482
АТОТСТСТОТТТООАААТОТТТСТОССАТТААСТСААОТООАААОТОТАТАОТААТОААТСТТТСАА
ОСАСАСАААТСАСТТСААОАОАТТОТТТСААОАТТАССТСАОООСАААААОАТОТТТТОТСАТТТО
ОАТОСТОТОАТОСТАТОООТААСАОАТТОСААТТСССААОТОСТСОТТСТТТТАСАССААОАТСАА
АОААОААТОТСТССССТСТАААООТАОТТТОТОТТОАТТАТССААОАССАОАТСТТОАТААСАСАТ
СТААТТТСТТССААОСТОСТСАСТТОТСТТСААССТТСАОААСТТССССАСОСССАТСТААОССАТТ
ОААОАТТОТААТТОСТООТОСАООТТТАОСТООТТТАТСААСТОСТААОТАТТТАОСТОАТОСАОО
ТСАСААОССААТТТТАСТАОААОСААОАОАТОТТСТТООТООАААООТООСАОСТТООАААОАТО
АТОАТООАОАТТООТАТОАОАСАООТТТАСАСАТАТТСТТТООАОСТТАСССАААТОТАСААААТТ
ТАТТТООАОАОСТАООААТТААТОАТАОАТТАСАОТООААООАОСАТТСТАТОАТАТТТОСААТОС
САААТААОССТООАОААТТТАОТАООТТТОАСТТСССАОАТОТТТТАССТОСАССАТТОААТООАА
ТТТТТОСТАТАТТОАООААСААТОАААТОСТОАСОТООССТОАОАААОТОААОТТТОСААТТОООС
ТОТТОССТОСААТОТТАООТООАСАООСТТАТОТТОАООСССААОАТОООСТТАОТОТТСАООАСТ
ООАТСАОАААОСААООТАТАССТОАТСОАОТТАСТАСТОААОТОТТТАТТССААТОТСААААССА
ТТАААСТТТАТАААТССАОАТОААСТТТСААТОСААТОТАТТСТСАТТОСТСТАААССОТТТТСТТС
АООААААОСАТООТТССААОАТООСАТТТТТАОАТОООАОСССАССАОАААОАСТТТОСААОССА
АТТОТТОАССАСАТССАОТСАСТСООТСОССААОТСАОАСТСААСТСАССААТАСААААААТТОА
ОТТАААСАААСАСООААСТОТСССОААСТТТСТАТТСАОТОАТОООААТОТТСТАСААОСТОАТОС
ТТАТОТТТТСОСТАССССТОТТОАСАТТСТСААОСТТСТТТТАСССОААОААТООАААССААТТССА
ТАТТТСААААААТТАОАОААОТТАОТСООТОТТССТОТТАТАААСОТТСАТАТАТООТТТОАСАОА
ААОСТОАААААСАСАТАТОАТСАСТТАСТТТТСАОТАООТСАССТСТОСТОАОТОТОТАТОСТОАС
АТОТСАОТОАСАТОТААООААТАТТАТОАТССОААТААОТСААТОТТООАОТТООТТСТТОСТССА
ОСТОАООААТООАТТТСААОААОТОАСАСТОАТАТТАТТОАТОСААСААТОАОТОААСТТТСААО
ОСТТТТТССТОАТОАААТТОСАОСТОАТСАААОТАААОСАААААТСТТОАААТАТАААОТТОТТАА
ААСАССААООТСТОТТТАТААААСТОТТССАОАТТОТОААССАТОТСОАССССТАСАААОАТСТСС
ААТТСААООАТТТТАТТТАТСТООТОАТТАТАСТАААСААААОТАТТТООСТТСААТООООООТОС
ТОТТТТАТСТООАААААТТТОТОСАСААОСТАТТТТАСААОАТТАТСАОАТОСТТОСТАСА (8Е<2
ГО N0:53).
Синтезировали одноцепочечные ДНК-полинуклеотиды длиной 21-45 нуклеотидов со следующими последовательностями: 1аа1ас§ас1сас1а1১§Ш§§а§сйасссааЛТО1ас ("НЬ286", смысловая ориентация, 8НС) ГО N0: 54), 1аа1ас§ас1сас1а1১§а§§ссас§1са§сай1сай§йс ("НЬ287", антисмысловая ориентация, 8НС) ГО N0: 55), ссаЛсаЛТО§1§с১1аааас ( "НЬ288", антисмысловая ориентация, 8 НС) ГО N0: 56), са!а§аЛТОс1ссйссас1§ ("НЬ289", антисмысловая ориентация, 8 НС) ГО N0: 57) и сааа1аааННд1асат§§§1аа§с1ссаа ("НЬ290", антисмысловая ориентация, 8 НС) ГО N0: 58). Из смеси равных количеств всех пяти полинуклеотидов в 0,01% 8П\уе1 Ь-77 в 5-миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8 изготовили раствор оцДНК.
При анализах использовали сорт салата Ь849 "Огееи Томег". Два полностью развившихся листа каждого растения погружали в свежеприготовленный раствор 0,1% 8П\уе1 Ь-77 в бидистиллированной воде на несколько секунд. Листья оставляли сушиться в течение 15-30 мин. Затем каждое растение обрабатывали нанесением 20 микролитров раствора оцДНК на верхнюю поверхность двух листьев, обработанных 8|1ме! (всего 40 микролитров на растение). В табл. 9 перечислены использованные условия анализа и наблюдаемое обесцвечивание растений после наружной обработки оцДНК-полинуклеотидами. На фиг. 28 изображено развитие обесцвечивания и гибель растений салата, обработанных 1 наномоль оцДНК на растение, на (сверху вниз) 37, 46 и 60 сутки после обработки.
Таблица 9
Стадия развития Количество каждой нанесенной оцДНК (наномоль/растение) Первое наблюдение обесцвечивания
4 недели после прорастания, растения несут 2 полностью развившихся листа 1 3 недели после обработки
5 недели после прорастания, растения несут 4 полностью развившихся листа 4 4 суток после обработки
Эти анализы повторяли, нанося 2 или 4 наномоль оцДНК на растение. На фиг. 29 А показан системный сайленсинг, подтверждаемый обесцвечиванием, наблюдавшимся на 4 или 12 сутки после наружной обработки полинуклеотидами.
Анализы повторяли с использованием каждой отдельно взятой антисмысловой оцДНК ("НЛ287", 8НП ГО N0: 55; "НЬ288", 8Е9 ГО N0: 56; "НЬ289", 8Е9 ГО N0: 57; и "НЬ290", 8НП ГО N0: 58) при нанесении 8 наномоль полинуклеотида на растение; растения, использованные в качестве положительного контроля, обрабатывали смесью четырех отдельных антисмысловых оцДНК в количестве по 2 наномоль (при общем количестве, равным 8 наномоль полинуклеотида, наносимого на растение), а растения, использованные в качестве отрицательного контроля, обрабатывали чистым буфером. На фиг. 29В показан системный сайленсинг, подтверждаемый обесцвечиванием, наблюдавшимся на 4 сутки после наружной обработки антисмысловыми оцДНК.
- 50 029482
Пример 25
Этот пример иллюстрирует один из аспектов настоящего изобретения. В данном примере растущие растения обрабатывали композицией для наружного нанесения для индукции системного сайленсинга гена-мишени в растении, включающий: (а) агент для усиления проницаемости тканей растения для полинуклеотидов и (б) полинуклеотиды, включающие по меньшей мере одну полинуклеотидную цепь, включающую по меньшей мере один непрерывный сегмент из 18 или более нуклеотидов гена-мишени в антисмысловой или смысловой ориентации. Конкретнее, в этом примере продемонстрировано использование наружно наносимых полинуклеотидов для индукции системного сайленсинга гена фитоиндесатуразы (ΡΌδ) овощной культуры, т.е. томата (8о1апит 1усорегз1сиш).
ΡΌδ томата обладает последовательностью
ОООТТТАТСТСОСААОТОТООСТАТООТОООАСОТОТСАААТТТТООАТТОТАОССАААСАТОАОА
ТТТОАТТТАААОООААТТООССАААТСАССОАААОСАООСАТСТТСАТСАТАААТТАОТТТОТТТА
ТТТАТАСАОААТТАТАСОСТТТТАСТАОТТАТАОСАТТСООТАТСТТТТТСТОООТААСТОССАААС
САССАСАААТТТСААОТТТССАТТТААСТСТТСААСТТСААСССААССАААТТТАТТТОСТТААТТО
ТОСАОААССАСТСССТАТАТСТТСТАООТОСТТТСАТТСОТТССОАОТААААТОССТСАААТТООАС
ТТОТТТСТОСТОТТААСТТОАОАОТССААООТАОТТСАОСТТАТСТТТООАОСТСОАООТСОТСТТС
ТТТОООААСТОАААОТСОАОАТООТТОСТТОСАААООААТТСОТТАТОТТТТОСТООТАОСОААТС
ААТОООТСАТААОТТАААОАТТСОТАСТССССАТОССАСОАССАОААОАТТООТТААООАСТТОО
ООССТТТАААООТСОТАТОСАТТОАТТАТССААОАССАОАОСТООАСААТАСАОТТААСТАТТТОО
АООСТОСАТТТТТАТСАТСААСОТТССОТОСТТСТССССОСССААСТАААССАТТССАОАТТОТТАТ
ТОСТООТОСАОСТТТОООТООТТТОТСТАСАОСААААТАТТТОССАОАТССТООТСАСАААССОАТ
АСТССТООАООСААСООАТСТТСТАООТОСАААООТАОСТОСАТООАААОАТОАТСАТООАОАТТ
ООТАСОАОАСТООТТТОСАТАТАТТСТТТООООСТТАСССАААТАТТСАОААССТОТТТОСАОААТ
ТАОООАТТААСОАТСОАТТОСААТООААООААСАТТСААТОАТАТТТОСААТОССААОСААОССА
ООАОААТТСАОССОСТТТОАТТТСТССОААОСТТТАСССССТССТТТАААТООААТТТТАОССАТСТ
ТАААОААТААСОАААТОСТТАСАТООССАОАОАААОТСАААТТТОСААТТООАСТСТТОССАОСА
АТОСТТООАОООСААТСТТАТОТТОААОСТСААОАТОООАТААОТОТТААООАСТООАТОАОААА
ОСААООТОТОССООАСАОООТОАСАОАТОАООТОТТСАТТОСТАТОТСАААООСАСТСААСТТТАТ
АААСССТОАСОААСТТТСААТОСАОТОСАТТТТОАТСОСАТТОААСАООТТТСТТСАООАОАААСА
ТООТТСАААААТСОССТТТТТАОАТООТААТССТССТОАСАОАСТТТОСАТСССОАТТОТТОААСА
САТТОАОТСААААООТООССААОТСАСАСТОААСТСАССААТААААААОАТТОАОСТОААТОАОО
АТООААОТОТСААОАОТТТТАТАСТОАОТОАСООТАОТОСААТСОАОООАСАТОСТТТТОТОТТТС
ССОСТССАОТООАТАТТТТСААОСТТСТАТТОССТОААОАСТООАААОАСАТТССАТАТТТССААА
АОТТООАОААОТТАОТСООАОТАССТОТОАТАААТОТАСАТАТАТООТТТОАСАСААААСТОААО
ААСАСАТАТОАТСАТТТОСТСТТСАОСАОААОСТСАСТОСТСАОТОТОТАТОСТОАСАТОТСТОТТА
САТОТААООААТАТТАСААССССААТСАСТСТАТОТТООААТТООТТТТТССАССТОСАОААСАОТ
ОСАТАТСТСОСАОССАСТСАОАААТТАТТОАТОСААСОАТОААООААСТАССААСОСТТТТТССТО
АТОАААТТТСАОСАОАТСАААОСАААОСАААААТАТТСААОТАССАТОТТОТСААААСТССОАОО
ТСТОТТТАТААААСТОТОССАООТТОТОААСССТОТСОСССТТТАСАААОАТССССААТАОАОООО
ТТТТАТТТАОССООТОАСТАСАСОАААСАОАААТАСТТООСТТСААТООААООСОСТОТСТТАТСА
ТТОТСООААОСААОСОТАОТТТАОСТТТОТООТТАТТАТТТАОСТТСТОТАСАСТАААТТТАТОАТО
СААСААОСОТТОТАСАСААСАТАТАОААОААОАОТОСОАООТОААОСААОТАООАОАААТОТТА
ООАААОСТССТАТАСААААООАТООСАТОТТОААОАТТАОСАТСТТТТТААТСССААОТТТАААТА
ТАААОСАТАТТТТАТОТАССАСТТТСТТТАТСТООООТТТОТААТСССТТТАТАТСТТТАТОСААТСТ
ТТАСОТТАОТТАААААААААААААААААААААААСТСОА (8Е<2 ГО N0:59).
С помощью ОТ-ПЦР, используя олигонуклеотидные праймеры с последовательностями ТААТАСОАСТСАСТАТАОООТСОСАОСОАСТСАОАААТТАТТО (8Е(} ГО N0:61, СМЫСЛОВОЙ праймер) и ТААТАССАСТСАСТАТАООООТАААООССОАСАОООТТСАСААСС (8Е0 ГО N0:62, антисмысловой
праймер), синтезировали дцРНК-полинуклеотид длиной 201 нуклеотид, содержавший антисмысловую цепь, способную гибридизоваться с РНК, кодируемой последовательностью
ТСОСАОСОАСТСАОАААТТАТТОАТОСААСОАТОААООААСТАОСААСОСТТТТТССТОАТОАААТ ТТСАОСАОАТСАААОСАААОСАААААТАТТОААОТАССАТОТТОТСААААСТССОАООТСТОТТТА ТААААСТОТОССАСОТТОТОААСССТОТСООССТТТАСАААОАТССССААТАОАООООТТТТАТТТ АО (8Е<2 ГО N0:60),
соответствующей нуклеотидам в положениях 1724 - 1923 мРНК-транскрипта последовательности гена ΡΌδ томата (δΕΡ ГО ЫО: 59). Из 201-нуклеотидного дцРНК-полинуклеотида (δΕΡ ГО ЫО: 60) в
- 51 029482
0,01% δίΐ^ΐ Ь-77 в 5-миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8 изготовили 2,5-микромолярный раствор дцРНК.
Трехнедельную рассаду томата обрабатывали следующим образом. Два полностью развившихся листа погружали в свежеприготовленный раствор 0,1% 8Л^еГ Ь-77 в бидистиллированной воде на несколько секунд. Листья оставляли сушиться на период от 30 мин до 1 ч. Затем каждое растение обрабатывали нанесением 20 микролитров раствора дцРНК на верхнюю поверхность двух листьев, обработанных 811^еГ (всего 40 микролитров на растение). Контрольные растения обрабатывали буфером. Растения содержали в ростовой камере для наблюдения. На фиг. 30 показан системный сайленсинг гена-мишени Ρϋδ, подтверждаемый обесцвечиванием растений, обработанных дцРНК, спустя 30 суток после наружного нанесения. Рост растений, обработанных дцРНК, сильно замедлился по сравнению с контрольными растениями.
Пример 26
В этом примере показано усовершенствование гербицидных композиций, приспособленных для наружного нанесения на поверхность растущих растений, причем агент, вызывающий гибель растений, включает полинуклеотиды, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательностям одного или более генов растения или последовательности РНК, являющейся транскриптом гена растения. Полинуклеотиды вызывали системную супрессию гена растения в органах или тканях растения, отличающихся от тканей, подвергшихся наружному нанесению полинуклеотида. Конкретнее, в этом примере показана гербицидная композиция, приспособленная для наружного нанесения на поверхность растущих растений, включавшая поверхностно-активное вещество и по меньшей мере один агент, вызывавший гибель растений, включавший комбинации полинуклеотидов, мишенью последовательности которых являлись ген 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ΕΡδΡδ), фактор инициации транскрипции (ТГР) и ДНК-зависимая АТРаза (ббАТРаза) амаранта Палмера
Гербицидная композиция включала по меньшей мере один из следующих 21-п.о. двуцепочечных РНК-полинуклеотидов:
(1) иОзККАГ смысловая цепь
сиАсслисААСАлиооиоисс (»е<з го νο: 63)
и антисмысловая цепь
ооАСАССАииоииоАиооиАС (8ео го νο: 64)
(2) ηϋ3ΚΝΛ3: смысловая цепь
сиссАСААсииссиоилиАои (§ео го νο: 65)
и антисмысловая цепь
АСиАиАСАССААСииоиССАС (ЗЕО Го ΝΟ: 66)
(3) пОзККА4: смысловая цепь ООиСАССиООАСАСАСААиАО (8Е<2 ГО ΝΟ: 67)
и антисмысловая цепь
сиАиисисиоиссАооисАСС (8Е<з го νο: 68)
(4) ηϋ3ΝΛ5: смысловая цепь
ААисссАОАиоииссиАиоАС (зес? го νο: 69)
и антисмысловая цепь
Смесь множественных полинуклеотидов была предпочтительной при предотвращении отбора в сторону устойчивости обработанных растений. В одном из вариантов воплощения гербицидная композиция включала смесь всех четырех вышеописанных дцРНК-полинуклеотидов, обладавших δΕρ ГО ΝΟδ: 63-70. В еще одном из вариантов воплощения гербицидная композиция включала одноцепочечные ДНК-полинуклеотиды, дезоксирибонуклеотидные последовательности которых соответствовали одной или более из последовательностей дцРНК δΕρ ГО ΝΟδ: 63-70. В еще одном из вариантов воплощения гербицидная композиция включала гибриды РНК/ДНК, нуклеотидные последовательности которых соответствовали одной или более из последовательностей дцРНК δΕρ ГО ΝΟδ: 63-70. В еще одном из вариантов воплощения гербицидная композиция включала дцРНК-полинуклеотиды, в которых 2'гидроксилы были метилированы для стабильности.
Гербицидная композиция включала поверхностно-активное вещество, например, δίΐ^ΐ Ь-77 (или другое эффективное поверхностно-активное вещество, например, ПАВ, представленные в примере 36). В необязательном случае гербицидная композиция могла включать один или более дополнительных компонентов, например, соль, хелатирующий агент или увлажнитель (например, компоненты, представленные в примере 35) для повышения производительности гербицида, например, за счет улучшения транспорта полинуклеотида во внутренние ткани растения, повышения эффективности полинуклеотидов или стимуляции гербицидной активности неполинуклеотидного гербицида.
В необязательном случае гербицидная композиция включала полинуклеотиды, предназначенные для регуляции множественных генов растения. В одном из вариантов воплощения гербицидная композиция включала полинуклеотиды, последовательность которых являлась практически идентичной или комплементарной последовательности второго гена или последовательности РНК-транскрипта второго гена,
- 52 029482
причем регуляция второго гена обеспечивала синергическое усиление гербицидной активности композиции.
В одном из вариантов воплощения гербицидная композиция включала полинуклеотиды, последовательность которых являлась практически идентичной или комплементарной последовательности эндогенного гена 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ΕΡδΡδ) амаранта Палмера или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена ΕΡδΡδ, а также полинуклеотиды, последовательности которых были практически идентичны или комплементарны последовательности эндогенного гена фактора инициации трансляции (Т^) амаранта Палмера или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена ΊΊΡ. Фактор инициации трансляции (ΤΈ) представляет собой кодируемый белок хлоропластов ядерной ДНК, необходимый для инициации синтеза белка и экспрессируемый во всех органах растения. ЛгаЫόορδΐδ ФаНапа содержит ортологическую последовательность, названную АТ1017220,1 (описанную в общедоступной базе данных ТНе А^аЬ^бορδ^δ Iηΐο^таί^οη Κ^δου^, доступной он-лайн на ююю.а^аЬ1όορδ1δ.ο^д/δе^νIеίδ/Τа1^ΟЬ^есί?ίуρе=Iοсиδ&ηате=АΤIΟ17220) и имеющую номер доступа ОепВапк ОЕ 186478573, идентифицированную как белок, локализованный в хлоропластах, сходный с бактериальным фактором инициации трансляции 2; описание этого гена см. также в работе Мщга е! ай (2007) Ρϊππί Сей, 19:1313-1328. Последовательности ΉΡ идентифицировали у амаранта Палмера (АшагапШиз ρа1те^^); определили, что один из генов ΉΡ обладает последовательностью δΕ^ ГО ΝΟ: 71. Примеры полинуклеотидов для супрессии этого гена ΊΊΡ АшагапШиз ρа1те^^ перечислены в табл. 10.
Таблица 10
Полинуклео тид Пол ожени е в последова тельности ΤΙΡ Последовательность 8Е<) ГО ΝΟ.
ΤΙΡ амаранта Палмера Полная последова тельность 8ЕО ГО N0:71 АТООСААСААТООСТТСССТАОТОАОТТТОООААОСТСТООАО СААСТТОСТСАОООСААТТООАООТТТССТТТТСАТТООТТААО ААААТТАСАТТОССТАОААОАААТТОТАОТТОСААТТТТАООСА АТТАООАООООООАООАОАТООСОТТАСОТТТСООТОТОТАОА СТТТСТОТСАСТАСТОАТТАТОТТТСТОАОСААООАААТОСТОТ ТТСТСТТСААААТОСАТАТАОТОАСАОТАААОААОАОООТСТС АТСТТОААОССТТСТССТААОССООТТТТОАААТССОООТСТОА ТСОАААТСООАААТТТООООАОАСТТСООТООСОТТТТСОАОТ ААТОООАААТТОСАТААТОТАОАООАОАООААОААООТТАТТО АТТСАТТООАТОАООТАТТАОААААООССОАОАОАТТАОАААС ООСОААСТТАСААОСАОАТААТАСАААООАТАОСАСАААТОТА ААТАААССОТСТССОАОТОТААОТАОТТСААССААТООТАААС СТОТАААТААТТТОААСАААОООААОССТАААОСТОСОААОАО ССТТТООАОАААСООАААТССАОТТТСТАСТОТОСАААААОТА ОТОСААОААТСТССОААОАТТОААААООТТОАОАОАОТООААО СТСОААСОАССАСССААТСОТСТОАААСОАТААОАСССССАОТ ОССАСТАСАОАООССТОАОАТТААОТТОСАООСАААОССТТСТ АСТОСТССТССАСССАТОССТААОААОССООТТТТСААООАТОТ аОООАТОТССТССАОАОСТОАТОООААООАССАОТСТОТОААА ТСТАААОАОАООААОССТАТТСТАОТООАСАААТТТОССАССА АОААООСАТСАОТТОАТССОТСОАТТОСТСААОСАОТААТТОС СССАССАА ААССТОСТАААТТТССТТСТООАААОТТТАААОАТО АТТАТСООААОААОООТСТТОСАОСТСОТСООССОААОАОССО ТАТООТСААТСАТОАТОАТАТТОАААТОСАТОААОАСАСТТСА ОАОСТСОСТСТТТСТАТТССТООТОСТОСТАСООСТСООАААОО САООАААТООАОТААООСААСТСОСААООСТСССАОАССССА АОСАОСТАОАОАТОССОСТССТОТТАААОТООАААТСТТАОАО ОТТОААОААААОООСАТОТСОАССОААОААТТАОСАТАСААСТ 71
- 53 029482
200-п.о. ДНК 341-541 ТСССТАТТАСССААООТОАААТТСТТООСТАССТСТАТТСТААО ОООАТААААССАОАТООТОТОСАААСТСТТОАСААОССААТОО ТАААОАТОАТАТОТОАААОАТАТОАСОТООАООТТТТОСАСОС АСТТТСТОААСАААТООААОАААТОССТСОАААОААОСАААТТ ТТССАССААСАТСАССТТОАСААССТТСААОАТАССССТССТС ТОСТТ АСТАТ ААТОООТСАТСТАОАТСАТООСААОАСОАСССТТ СТООАТТАТАТАСООААОАОСААООТТОСТОСТТСТОААОСТО ОТОООАТТАСАСААООТАТТООТОСТТАТАААОТООААОТАСС ООТТОАТООСААОТТОСТОССТТОТОТСТТТСТТОАСАСТСССО ОАСАСОАООСОТТСООООСААТОАОООСТСОТООАОСААОАОТ ОАСАОАТАТТОСТАТТАТАОТТОТАОСТОСТОАСОАТОООАТСС ОТССТСАААСАААТОААОССАТАОСАСАТОСААААОСАОСТОО ТОТАССТАТТОТООТТОСААТТААТААОАТТОАСААООАТООО ОСТААТССООАССОТОТОАТОСААОАОСТТТСАТСААТТООТСТ ААТОССАОАООАТТООООТООТОАТАССССААТООТСААОАТА АОТОСТСТААААООТОААААТОТООАСОАОТТАСТСОАОАСАО ССАТОСТТОТСОССОАОТТОСААОАОТТАААООСТААТССТСАО АССААСОСТААССССАСТСТААТТОАООСТСОТСТТСАТАААТ СААААССАСССАТТСССАСТТТТАТТОТССАСААТССТАСССТС АААСААООООАТАСТОТАОТТТОТООООААОСАТТТОООААОО ТТСОТОСССТАТТТОАТСАСООАОООААТСОСОТТОАТОААОСТ ОСТССАТСТАТТССССТОСАССТТАТТОСАТТСААТААТОТТСС ТТТТОССООТОАТОАОТТСОАООТАОТОАОТТСССТТОАТАТАО СТСОТОААААООСАОАООТССОТОСАОАОТСТТТАСОАААТОА ОСОТАТАОСТОСТААООССООАОАСООАААООТТАСОСТОТСА ТССТТООСАТСООСТОТТТСТТСАОООААОАТООСТООТТТООА ТТТОСАССАОТТАААТАТСАТТТТОААООТТОАТОТТСАОООАТ СААТСОАООСАТТОАООСААОСТСТАОААОТТСТТССТСААОА ТААСОТСАСТТТОААОТТТСТСТТАСААОСОАССООАОАТОТТА СТАСААОТОАТОТТОАТСТТОСАОТТОСТАОТАААОСТАТТАТС ТТООООТТСААТОТОААООСАССАООТТСТОТСОАААААТТАО САОАТААСАААООТОТТОАААТТСООСТТТАТАААОТСАТТТАТ ОАТСТААТТОАСОАСАТОСООАОТОСААТООААООААТОСТАО АТСССОТТОАООААСААОТТОСААТТООТТСАОССОААОТОСО ООСТАСАТТСАОТАОТООТАОТООССОТОТСОСТООАТОСАТО ОТОАССОАОООАААОАТТАССАААООСТОТОООАТТСОАОТОА ТАСООААОООАААААСТОТССАСОТТООАОТТСТТОАТТСОТТО СОТСОАОТАА ТТТСОАОТААТОООАААТТООАТААТОТАОАООАОАООААОАА ООТТАТТОАТТСАТТООАТОАООТАТТАОААААООССОАОАОА ТТАОАААСООСОААСТТАСААОСАОАТААТАОАААООАТАОСА САААТОТАААТАААССОТСТССОАОТОТААОТАОТТСААССАА ТСОТАААССТОТАААТААТТТОААСААА 72
160-п.о. дцРНК 342-501 Смысловая цепь: иисоАоиААисооАААииооАиААиоиАОАООАОАООААОА АСоииАииоАиисАииссАисАОсиАииАОААААсассоАО АОАииАОАААСООСОААСииАСААОСАОАиААиАОАААООА иАОСАСАААиоиАААиАААСсоисиссоАоиоиААои Антисмысловая цепь: АсииАСАсисооАОАСооиииАиииАСАиииоиосилиссии исиАииАисиосииоиААоиисоссоииисиААисисисоос сиииисиААилссисАиссААиоААисААиААСсиисиисси сиссисиАСАииАиссААиииссслииАсисоАА 73 74
антисмыслов ая ДНК ΤΙΡ А31 555-576 АТТТСТССАААСОСТСТТСОСА 75
антисмыслов ая ДНК ΤΙΡ А52 342-363 АТССААТТТСССАТТАСТСОАА 76
антисмыслов аяДНК ΤΙΡ А53 412-433 ОТТТСТААТСТСТСООССТТТТ 77
антисмыслов аяДНК ΤΙΡ А54 488-509 ТТОААСТАСТТАСАСТСООАО 78
антисмыслов аяДНК ΤΙΡ А85 368-389 ТААССТТСТТССТСТССТСТА 79
антисмыслов аяДНК ΤΙΡ А86 790-811 ОТССТТСССАТСАОСТСТООА 80
антисмыслов аяДНК ΤΙΡ А57 1052-1073 СОТАОСАОСАССАООААТАО 81
антисмыслов аяДНК ΤΙΡ А88 1655-1676 САОСАОСТАСААСТАТААТАО 82
В одном из вариантов воплощения гербицидная композиция включала смесь по меньшей мере двух из вышеописанных дцРНК-полинуклеотидов ΕΡδΡδ, обладавших δΕρ ΙΌ Ν0δ: 63-70, а также по меньшей мере одного полинуклеотида, последовательность которого была практически идентична или комплементарна последовательности эндогенного гена фактора инициации трансляции (ΤΙΡ) амаранта Палмера или последовательности РНК-транскрипта эндогенного гена ΤΙΡ, например, полинуклеотидов, представленных в табл. 10. В одном из специфических вариантов воплощения гербицидная композиция включала смесь четырех дцРНК-полинуклеотидов ΕΡδΡδ, обладавших δΕρ ΙΌ Ν0δ: 63-70 и двуцепочечного РНК-полинуклеотида ΤΙΡ длиной 160 пар оснований, обладающего смысловой последовательностью
иисоАсиААиоооАААииссАиААисиАСАссАСАсоААСААсоииАииоАи исАиисоАисАСсиАииАОААААОосссАОАОАииАОАААСоосоААсииАС ААССАСАиААиАСАААССАиАССАСАААиоиАААиАААСССиСиСССАСиСи ΑΑΟυ (8ЕО ГО ΝΟ. 73)
и антисмысловой последовательностью
АсииАСАсисооАОАСОоиииАиииАСАииисиссиАиссииисиАииАиси
осииоиААоиисссссииисиААисисисооссиииисиААиАСсисАиссАА
исААисААиААСсиисииссисиссисиАСАииАиссААииисссАиилсисс
АА (8Е<2 ГО ΝΟ. 74).
- 54 029482
В некоторых вариантах воплощения полинуклеотиды были предназначены для регуляции множественных генов-мишеней, что приводило к синергическому действию на гербицидную активность. Например, синергическое действие на гербицидную активность получили при обработке растения полинуклеотидами, предназначенными для супрессии фактора инициации трансляции (ТГР) и 5енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ΕΡ3Ρ3) с последующей обработкой неполинуклеотидным гербицидом глифосатом.
Полинуклеотиды, перечисленные в табл. 11, получили путем синтеза или транскрипции т νΐίΐΌ.
Таблица 11
Название
Комментар
Нуклеотидные последовательности
ют ίί]
ГОТ [4]
ии
ццРНК ЕР8Р8 маранта Палмера, содержащая два цезоксирибонукле этида (обозначены полужирным
подчеркнутым
Смысловая цепь: СиАССАиСААСААиООиОиССАиАС (ЗЕО ГО ΝΟ. 83) ι, Антисмысловая цепь: ОиАиООАСАССАииоииОАиООиАОиА (ЗЕО го
ΝΟ. 84)
Смысловая цепь: АОииООиОООСААиСАиСААииОТТ (ЗЕО ГО ΝΟ. 85)
' Антисмысловая цепь: ААСААииОАиОАииОСССАССААСиси (ЗЕО ГО
ΝΟ. 86)
текстом) на 3' <онце смысловой дели (25-членной) ' д 2-нуклеотидный липкий конец на ’-конце
антисмысловой дели (27дленной); мимически
Смысловая цепь: ООиСОАСААСииОСиоиАиАОиОАТ (ЗЕО ГО ΝΟ. 87) Антисмысловая цепь: АиСАСиАиАСАОСААОииоиСОАССиС (ЗЕО ГО
ΝΟ. 88)
Смысловая цепь: иОСААООиСАССиООАСАОАОААТА (ЗЕО ГО ΝΟ. 89) Антисмысловая цепь: иАиисисиоиССАООиОАССииОСААС (ЗЕО го ΝΟ. 90)
ГОТ [5]
дцРНК ЕР8Р8 амаранта Палмера (21членная) с тупыми концами; химически
Смысловая цепь: ААСАиОААСААААиОССАОАи (ЗЕО ГО ΝΟ. 91) Антисмысловая цепь: АисиоослииииоиисАиоии (зец го νο. 92)
тупыми концами |1]
ГОТ с тупыми концами [2]
ГОТ с тупыми концами [3]
дцРНК ЕРЗРЗ амаранта Палмера (27членная) с тупыми концами; синтезирована путем
13-антисмысловая цепь ОиАиООАСАССАииоииОАиООиАОиА (ЗЕО ГО ΝΟ. 93)
13-смысловая цепь иАСиАССАиСААСААиССиСиССАиАС (ЗЕО ГО ΝΟ. 94)
28-антисмысловая цепь ААиААииОАиОАииОСССАССААСиси (ЗЕО ГО ΝΟ. 95)
28-смысловая цепь АОАОииОСиОООСААиСАиСААииАии (ЗЕО го ΝΟ. 96)
38-антисмысловая цепь АиСАСилиАСАОСААСииСШСОАССАС (ЗЕО ГО ΝΟ. 97)
38-смысловая цепь оиооисоАСААсииосисиАилоиоАи (зео го ΝΟ. 98)
ГОТ с тупыми
43-антисмысловая цепь иАиисисиоиССАООиОАССииОСААС (ЗЕО ГО ΝΟ. 99)
концами (4]
48-смысловая цепь ииОСААООиСАССиООАСАОАОААиА (8ЕО ГО ΝΟ. 100)
ЗОН [2]
ЗОН [3]
ЗОН 14]
дцРНК ЕР8Р8 амаранта Палмера (27членная) с 3’липкими концами; синтезирована путем
транскрипции Т7 ίη νίΐτο
13-антисмысловая цепь ёОиАиООАСАССАиисииОАиООиАОиАС (ЗЕО
ГО ΝΟ. 101)
18-смысловая цепь ОСиАССАиСААСААиООиОиССАиАССАС (ЗЕО ГО ΝΟ. 102)
28-антисмысловая цепь дААСААииОАиОАииОСССАССААСиСАС (ЗЕО ГО ΝΟ. 103)
28-смысловая цепь ОАОииОСиОООСААиСАиСААииАииСАС (ЗЕО ГО
ΝΟ. 104)
38-антисмысловая цепь дАиСАСиАиАСАОСААОииОиСОАСАС (ЗЕО
ГО ΝΟ. 105)
38-смысловая цепь ОиСОАСААСииОСиоиАиАСиОАиСАС (ЗЕО го ΝΟ. 106)
48-антисмысловая цепь ёиАиисисиоиссАОсисАСсииссАСАС (ЗЕО Го ΝΟ. 107)
48-смысловая цепь ОиОСААООиСАССиООАСАОАОААиАСАС (ЗЕО
ГО ΝΟ. 108)
ГОТ со шпилькой [1]
ГОТ со шпилькой
ш
ГОТ со шпилькой 131
ГОТ со шпилькой [4]
[ΤΙΡ]
одноцепочечна
я РНК ЕРЗРЗ
амаранта
Палмера,
самогибридизу
ющаяся с
образованием
шпильки,
содержащей
антисмыслову
плече и
антисмыслову
ю
последователь ность на 3’плече с
тетрануклеоти дной петлей; химически синтезирована ГОТ
18оиАиооАСАССАииоииолиооиАоиАОАААиАсиАССАисААСААи осиоисслилс (зео го νο. Ю9)
ААиААиисАиоАииосссАССААсисисААААОАсииосиссссААи САисААццАии (зео го νο. по)
АисАсиАиАСАОСААоииоисоАССАССАААоиооисоАСААсиио сиоилиАоиоли (зео го νο. ш)
иАиисисиоиссАооиоАссииосААсоАААоииосААОоисАСси ООАСАОАОААиА (ЗЕО ГО ΝΟ. 112)
дцРНК фактора
инициации
трансляции (ΤΙΡ)
амаранта Палмера
(160-членная),
синтезированная
путем
транскрипции Т7 ίη νίΐτο
Смысловая цепь:
иисоАоиААиоооАААииооАиААиоиАОАОСАОАООААОААСоии АииоАиисАиисоАиоАооиАииАОААААОоссоАОАОАииАОААА СООСОААСииАСААОСАОАиААиАОАААООАиАОСАСАААиОиАААи АААССоисиссоАоиоиААои (зео го νο. 73)
Антисмысловая цепь:
АсииАСАсисооАОАСооиииАиииАСАиииоиссиАиссииисиАи иАисиссиисиААсиисоссоииисиААисисисооссиииисиААи АСсисАиссААиоААисААилАссиисииссисиссисиАСАииАис СААииисссАииАсисоАА (зео го νο. 74)
[ййАТРаза] дцРНК ДНКзависимой
Смысловая цепь:
ОАисАСАААииисссссиииАиоАисАААЦАсооААСАиААОАСАОА
- 55 029482
АТРазы (ббАТРаза) амаранта Палмера (168-членная), синтезированная путем транскрипции Т7 ϊη νίΐτο иАСАсиисААСАССАиоАиисосАииоооооиоиооииАсисоисои исиооАоиАиисссисАоииоАиосАооиоААоиАиоАсиосААиАА АисисссссиАиссисссисссиииии (§е<2 го νο. из) Антисмысловая цепь: АААААСооАсссАООАиАсссссАСАиииАииосАсисАиАсиисАС СиОСАиСААСиОАОООААиАСиССАОААСОАСОАОиААССАСАСССС СААиосоААисАиооиоиисААоиоиАисиоисииАиоииссоиАии иоАисАиАААссоосАААиииоиоАис (§е<2 го νο. ι ы)
Растворы полинуклеотидов изготовили и нанесли на листья амаранта Палмера, используя протоколы, описанные в табл. 12.
Таблица 12
Номер протокола (описание) Протокол
1 (1-этапная вручную) 1. С помощью пипетки вручную нанести смесь полинуклеотидов в 1 % δίίννεί Ь-77, 2% сульфате аммония в 10-миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8 (или контрольный буферный раствор 1% δίίννεί Ь-77, 2% сульфата аммония в 10миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8) 2. Через 48 или 72 часа опрыскать глифосатом (“2Х ν/тах” или 1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® \Уса1НегМАХ® на гектар) с помощью обычного опрыскивателя (10 галлонов/акр)
2 (1-этапная опрыскивателем) 1. Опрыскать смесью полинуклеотидов в 1% δίίννεί Ь-77,2% сульфате аммония в 10миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8 (или контрольным буферным раствором 1% δίίννεί Ь-77, 2% сульфата аммония в 10-миллимолярном натрийфосфатном буфере, рН 6,8), используя опрыскиватель ΜΐΠϊ 2. Через 48 или 72 часа опрыскать глифосатом (“2Х ν/тах” или 1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® ^еа1йегМАХ® на гектар) с помощью обычного опрыскивателя (10 галлонов/акр)
3 (2-этапная вручную) 1. Опрыскать 1% δίίννεί аналогично Ому этапу, используя обычный опрыскиватель или опрыскиватель МИН; 2. С помощью пипетки вручную нанести смесь полинуклеотидов в 1% δίίννεί Ь-77, 2% сульфате аммония в 10-миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8 (или контрольный буферный раствор 1% δίίννεί Ь-77, 2% сульфата аммония в 10миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8) 3. Через 48 или 72 часа опрыскать глифосатом (“2Х \Утах” или 1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® ХУеаНтетМАХ® на гектар) с помощью обычного опрыскивателя (10 галлонов/акр)
4 (2-этапная опрыскивателем) 1. Опрыскать 1% δίίννεί аналогично 1-му этапу, используя обычный опрыскиватель или опрыскиватель МИН; 2. Опрыскать смесью полинуклеотидов в 1% δίίννεί Ь-77, 2% сульфате аммония в 10миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8 (или контрольным буферным раствором 1% δίίννεί Ь-77, 2% сульфата аммония в 10-миллимолярном натрийфосфатном буфере, рН 6,8), используя опрыскиватель ΜίΠί 3. Через 48 или 72 часа опрыскать глифосатом (“2Х ν/тах” или 1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® \УеаСЬетМАХ® на гектар) с помощью обычного опрыскивателя (10 галлонов/акр)
5 (смесь в резервуаре) Опрыскать смесью полинуклеотидов в 1% δίίννεί Ь-77, 2% сульфате аммония в 10миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8, содержащей глифосат в количестве 1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Роипбир® УУеаШегМАХ® на гектар (или контрольным буферным раствором 1% δίίννεί Ь-77, 2% сульфата аммония в 10миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8, содержащим глифосат в количестве 1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Коипбир® ХУеаШегМАХ® на гектар), используя опрыскиватель Μίΐΐί
Комбинации полинуклеотидов тестировали, как указано в табл. 13.
__Таблица 13
Полинуклео тиды, нанесенные в комбинации 8Е<2 ΙϋΝΟ, Протокол Нанесенное количество каждого полинуклеот ида (г/акр) Общее нанесенное количество полинуклео тида (г/акр) Количест во копий ЕР8РЗ* Результат ы**
ЮТ [1] 83,84, 1 0,29 0,87 112 гибель 75%
ГОТ [3] 87,88 0,29 (27 СПО)
ГОТ [4] 89,90 0,29
ГОТ[1] 83,84, 1 0,29 1,4 112 гибель 100%
ГОТ [3] 87,88 0,29 (27 СПО)
ГОТ [4] 89,90 0,29
[ΤΙΡ] 73,74 0,50
ГОТ[1] 83,84, 1 0,29 1,37 112 замедление
ГОТ [3] 87,88 0,29 роста на
ГОТ [4] 89,90 0,29 11,2%
[сЫАТРаза] 113,114 0,50 (27 СПО)
ГОТ[1] 83,84, 1 0,29 1,87 112 гибель 100%
ГОТ [3] 87,88 0,29 (27 СПО)
ГОТ [4] 89,90 0,29
[ΤΙΡ] 73,74 0,50
[ййАТРаза] 114,114 0,50
ГОТ[1] 83,84, 1 0,29 1,2 112,36 0% контроль
ГОТ [2] 85,86 0,29 (11 СПО);
ГОТ [3] 87,88 0,29 0% контроль
ГОТ [4] 89,90 0,29 (31 СПО)
ЮТ[1] 83,84, 1 1,4 5,8 112,36 0% контроль
ГОТ [2] 85,86 1,4 (11 СПО);
ГОТ [3] 87,88 1,4 замедление
ГОТ [4] 89,90 1,4 роста на 15% (31 СПО)
ГОТ[1] 83,84, 1 2,9 12 112,36 0% контроль
ГОТ [2] 85,86 2,9 (11 СПО);
ГОТ [3] 87,88 2,9 замедление
ГОТ [4] 89,90 2,9 роста на 35% (31 СПО)
ГОТ[1] 83,84, 1 5,8 23 112,36 замедление
ГОТ [2] 85,86 5,8 роста на 51%
ГОТ [3] 87,88 5,8 (11 СПО);
ГОТ [4] 89,90 5,8 замедление роста на
- 56 029482
ГОТ[1] ЮТ [2] ЮТ [3] ЮТ [4] 83,84, 85,86 87,88 89,90 2 0,29 0,29 0,29 0,29 1,2 33,54 100% (31 СПО) замедление роста на 9% (6 СПО)
ГОТ[1] 83,84, 2 5,8 23 33,54 гибель 100%
ЮТ [2] 85,86 5,8 (6 СПО)
ГОТ [3] 87,88 5,8
ГОТ [4] 89,90 5,8
ГОТ[1] 83,84, 2 0,29 0,87 33,54 замедление
ЮТ [3] 87,88 0,29 роста на 20%
ЮТ [4] 89,90 0,29 (6 СПО)
ГОТ[1] 83,84, 2 5,8 17 33,54 гибель 100%
ГОТ [3] 87,88 5,8 (6 СПО)
ЮТ [4] 89,90 5,8
ЮТ [5] 91,92 1 0,29 0,29 34, 36, 54 замедление роста на 14,1% (22 СПО)
ГОТ [5] 91,92 1 2,9 2,9 34, 36, 54 гибель 100% (22 СПО)
ГОТ[1] 83,84, 1 2,9 12 34, 36, 54 гибель 100%
ГОТ [2] 85,86 2,9 (22 СПО)
ГОТ [3] 87,88 2,9
ГОТ [4] 89,90 2,9
ГОТ[1] 83,84, 1 2,9 14 34, 36, 54 гибель 100%
ГОТ [2] 85,86 2,9 (22 СПО)
ГОТ [3] 87,88 2,9
ГОТ [4] 89,90 2,9
ГОТ [5] 91,92 2,9
ГОТ[1] 83,84, 1 2,9 8,7 34, 36, 54 гибель 100%
ГОТ [3] 87,88 2,9 (22 СПО)
ГОТ [4] 89,90 2,9
ГОТ[1] 83,84, 1 2,9 12 34,36, 54 гибель 100%
ГОТ [3] 87,88 2,9 (22 СПО)
ГОТ [4] 89,90 2,9
ГОТ [5] 91,92 2,9
ГОТ [5] 91,92 1 0,29 0,29 33, 54, 55 замедление роста на 71% (18 СПО)
ГОТ [5] 91,92 1 2,9 2,9 33,54,55 гибель 100% (18 СПО)
ГОТ[1] 83,84, 1 0,29 1,4 33,54, 55 гибель 100%
ГОТ [2] 85,86 0,29 (18 СПО)
ГОТ [3] 87,88 0,29
ГОТ [4] 89,90 0,29
ЮТ [5] 91,92 0,29
ГОТ[1] 83,84, 1 0,29 1,2 33,54,55 гибель 100%
ГОТ [2] 85,86 0,29 (18 СПО)
ГОТ [3] 87,88 0,29
ГОТ [4] 89,90 0,29
ГОТ со 109 3 0,29 1,2 16,33 гибель 100%
шпилькой [1] 110 0,29 (18 СПО)
ГОТ со 111 0,29
шпилькой [2] ГОТ со 112 0,29
шпилькой [3] ГОТ со шпилькой [4]
ГОТ[1] 83,84, 3 0,29 1,2 16,33 гибель 100%
ГОТ [2] 85,86 0,29 (18 СПО)
ГОТ [3] 87,88 0,29
ГОТ [4] 89,90 0,29
ГОТ[1] 83,84, 3 0,29 0,87 16,36 гибель 100%
ГОТ [3] 87,88 0,29 (18 СПО)
ГОТ [4] 89,90 0,29
ГОТ [1] 83,84, 3 5,8 17 16,36 гибель 100%
ГОТ [3] 87,88 5,8 (18 СПО)
ГОТ [41 89,90 5,8
ГОТ[1] 83,84, 3 29 87 16,36 гибель 100%
ГОТ [3] 87,88 29 (18 СПО)
ГОТ [41 89,90 29
ГОТ[1] 83,84, 3 0,29 1,1 16, 36 гибель 100%
ЮТ [2] 85,86 0,29 (18 СПО)
ГОТ [3] 87,88 0,29
ЮТ [4] 89,90 0,29
3’-ОН[1] 101,102 3 Неприменимо 22-26 16 гибель 100%
З’-ОН [2] 103,104 микролитров (10 СПО)
З’-ОН [3] 105,106 (по объему)
З’-ОН [4] 107,108
ГОТ с тупыми 93,94 3 0,29 1,1 16 гибель 75%
концами [1] 95,96 0,29 (10 СПО)
ГОТ с тупыми 97,98 0,29
концами [2] ГОТ с тупыми концами [3] ГОТ с тупыми концами [41 99,100 0,29
ГОТ с тупыми 93,94 3 5,8 23 16 гибель 100%
концами [1] 95,96 5,8 (10 СПО)
ГОТ с тупыми 97,98 5,8
концами [2] ГОТ с тупыми концами [3] ГОТ с тупыми концами [41 99,100 5,8
ГОТ[1] 83,84, 3 29 87 16 замедление
ГОТ [2] 85,86 29 роста на 34%
ГОТ [3] 87,88 29 (14 СПО)
ГОТ [2] 85,86 3 29 87 16 замедление
ГОТ [3] 87,88 29 роста на 48%
ГОТ [4] 89,90 29 (14 СПО)
ГОТ[1] 83,84, 3 29 87 16 замедление
ГОТ [2] 85,86 29 роста на 25%
ГОТ [4] 89,90 29 (14 СПО)
ГОТ [1] 83,84, 3 29 58 16 замедление
ГОТ [4] 89,90 29 роста на 44% (14 СПО)
ГОТ [3] 87,88 3 29 58 16 замедление
ГОТ [4] 89,90 29 роста на 41% (14 СПО)
ГОТ [2] 85,86 3 29 58 16 замедление
ГОТ [4] 89,90 29 роста на 40% (14 СПО)
ГОТ[1] 83,84 3 29 29 16 замедление
- 57 029482
*если указано более одного значения количества копий, обработанные растения представляли собой смесь по количеству копий
**СПО = суток после обработки; "0% контроль" означал отсутствие наблюдаемых различий между обработанными и контрольными растениями; % замедления роста рассчитывали как [100 - (средняя высота тестируемых растений/средняя высота контрольных растений)х100] Сконструировали двуцепочечные 25-членные РНК-полинуклеотиды для супрессии гена ΤΙΡ Атагап!йи§ ра1тег1, перечисленные в табл. 14.
_ Таблица 14
Название Последовательность 8Е<2 ГО ΝΟ:
Т1Р_дцРНК1 антисмысловая цепь: 5'-иииисиААиАссисАиссААиоААи-з‘ 115
смысловая цепь: 5'-АиисАииссАиоАосиАииАОАААА-з ’ 116
Т1Р_дцРНК2 антисмысловая цепь: 5'-иАисиосииоиААоиисоссоииис-з ‘ 117
смысловая цепь: 5'-ОАААСООСОААСииАСААОСАОАиА-3' 118
Т1Р_дцРНКЗ антисмысловая цепь: 5'-ооАСАСОоиииАиииАСАиииоиос-з' 119
смысловая цепь: 5 '-ОСАСАААиоиАААиАААССОиСиСС-3' 120
Т1Р_дцРНК4 антисмысловая цепь: 5'-иАиииАСАОоиииАССАииооииоА-з4 121
смысловая цепь: 5'-иСААССААиООиАААССиоиАААиА-3' 122
25-членные дцРНК-полинуклеотиды ΤΙΡ тестировали по отношению к амаранту Палмера, устойчивому к глифосату и содержавшему как большое (112), так и небольшое (16) количество копий ЕРЗРЗ.
Высококопийные растения обрабатывали смесью 4 коротких дцРНК ЕРЗРЗ (короткой дцРНК-1, короткой дцРНК-3, короткой дцРНК-4, как описано в примере 1 и ΙΌΤ [5] (ЗЕ^ ΙΌ Ν0δ: 91-92, как описано в табл. 11) в количестве 11,5 г/акр и одной отдельно взятой дцРНК ΤΙΡ в количестве 5,8 г/акр, или каждой отдельно взятой 25-членной дцРНК ΤΙΡ в количестве 5,8 г/акр; растворы полинуклеотидов составляли в 10-миллимолярном натрий-фосфатном буфере (рН 6,8), содержавшем 2% сульфат аммония и 1% ЗПхме! Ь-77. Через тридцать минут после обработки полинуклеотидом растения либо опрыскивали глифосатом (1682 г кислотного эквивалента гербицида марки РонпОнр® ^еаШегМАХ® на гектар), либо не опрыскивали глифосатом.
Низкокопийные растения обрабатывали смесью 4 коротких дцРНК ЕРЗРЗ (короткой дцРНК-1, короткой дцРНК-3, короткой дцРНК-4, как описано в примере 1 и ΙΌΤ [5] (ЗЕ^ ΙΌ Ν0δ: 91-92, как описано в табл. 11) в количестве 0,23 г/акр и одной отдельно взятой дцРНК ΤΙΡ в количестве 5,8 г/акр, или каждой отдельно взятой 25-членной дцРНК ΤΙΡ в количестве 5,8 г/акр; растворы полинуклеотидов составляли в 10-миллимолярном натрий-фосфатном буфере (рН 6,8), содержавшем 2% сульфат аммония и 1% ЗПхме! Ь-77. Через тридцать минут после обработки полинуклеотидом растения либо опрыскивали глифосатом (1682 г кислотного эквивалента гербицида марки РонпОнр® ^еаШегМАХ® на гектар), либо не опрыскивали глифосатом.
Результаты изображены на фиг. 31 и 32 и показали, что полинуклеотиды ΤΙΡ усиливали активность полинуклеотидов ЕРЗРЗ, и что полинуклеотиды ΤΙΡ обладали гербицидной активностью сами по себе.
Пример 27
Аспекты настоящего изобретения включают полинуклеотидные композиции и способы для стимуляции активности неполинуклеотидных гербицидов в растениях. Например, полинуклеотидную композицию, предназначенную для регуляции гена-мишени гербицида, гена инактивации гербицида или гена стрессовой реакции или комбинации таких генов-мишеней, наносили на сорное или самосевное растение одновременно с, после или до нанесения неполинуклеотидного гербицида (обычно традиционно используемого химического гербицида), что приводило к стимуляции активности неполинуклеотидного гербицида. Комбинация полинуклеотидной композиции с неполинуклеотидным гербицидом (например, традиционно используемым химическим гербицидом) обеспечивала синергическое действие, т.е. гербицидный эффект комбинации превышал сумму гербицидного эффекта полинуклеотидной композиции и гербицидного эффекта неполинуклеотидного гербицида.
Примеры традиционно используемых химических гербицидов и соответствующих генов-мишеней гербицидов представлены в табл. 15.
- 58 029482
Таблица 15
Примеры гербицидов Ген-мишень (ген-мишень гербицида)
глифосат 5 -енолпирувилшикимат-3 -фосфатсинтаза (ΕΡδΡδ)
Лактофен, флумиоксазин и т.д. протопорфириногеноксидаза (РРО)
Мезотрион, изоксафлютол 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназа (ΗΡΡϋ)
Квизалофоп, клетодим ацетил-кофермент А-карбоксилаза (АССазе)
Норфлуразон, кломазон фитоиндесатураза (Ρϋδ)
глюфосинат глутаминсинтаза (Οδ)
Римсульфурон, хлорсульфурон ацетолактатсинтаза (ΑΙ,δ)
Атразин, диурон, бромоксинил, метрибузин белок ϋΐ фотосистемы II (ΡδΙΙ)
Динитроанилин, пендиметалин тубулин
Дихлобенил, изоксабен Целлюлозосинтаза
Примеры традиционно используемых химических гербицидов и соответствующих генов инактивации гербицидов представлены в табл. 16.
_ _ Таблица 16
Примеры гербицидов Ген-мишень (ген инактивации гербицида)
Ацетохлор, метолахлор глутатионы-трансфераза (ΟδΤ)
Многие гербициды, включая производные сульфонилмочевины Монооксигеназы, включая цитохромы Р450 (см., например, цитохром Р450, придающий устойчивость к ингибиторам ΗΡΡϋ, бензотиадиазинонам, производным сульфонилмочевины и гербицидам других классов, описанный в публикации патентной заявки США 2009/0011936)
Тиазопир эстеразы (например, эстеразы, вовлеченные в апоптоз и старение)
2,4-ϋ, метрибузин, глюкозилтрансферазы; малонилтрансферазы
Глифосат, паракват Гены клеточной компартментализации и секвестрации (например, переносчики АВС)
Пример 28
В этом примере показан способ для индукции системной регуляции эндогенного гена-мишени растущего растения, включающий нанесение на листья растущего растения полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов эндогенного гена-мишени или матричной РНК-транскрипта эндогенного гена-мишени, причем указанные полинуклеотиды проникают во внутренние ткани растущего растения и индуцируют системную регуляцию эндогенного гена-мишени.
Сконструировали двуцепочечные РНК или антисмысловые оцДНК-полинуклеотиды для геновмишеней гербицидов 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ΕΡδΡδ), фитоиндесатуразы (ΡΌδ), оксигеназы протопорфирина БС (РРО), фенилаланинаммиаклиазы (ГАН), гидроксифенилпируватдиоксигеназы (ΗΡΡΌ), ацетил-кофермент А-карбоксилазы (АССазе), ацетолактасинтазы (Α^δ) и глутаминсинтазы (Οδ). Для каждого гена, являющегося мишенью гербицидов, наносили раствор, содержавший смесь 8 антисмысловых оцДНК-полинуклеотидов в 2% сульфате аммония в 10-миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8, при норме расхода 2,32 г/акр после опрыскивания 0,5% δΐΐ^ΐ Ь-77 (10 галлонов/акр). Протестированные полинуклеотиды и полученные наблюдаемые фенотипы перечислены в табл. 17.
- 59 029482
Таблица 17
Ген Название Разм ер (нук леот идов) Последовательность 8Е<} ГО ΝΟ: Фенотип
ЕР8Р8 РЭ8 РРО РАЬ ΗΡΡϋ Смысловая цепь Ρϋδ Антисмысловая цепь Ρϋδ РРО ОЫОО1 РРООЫОО2 РРО оыооз РРО ОЫОО4 РРО ОЫОО5 РРО ОЫОО6 РРО ОЫОО7 РРО ОЫОО8 РАЬ ОЫОО1 РАЬ ОЫОО2 РАЬ ОЫООЗ РАЬ ОЫОО4 РАЬ ОЫОО5 РАЬ ОЫОО6 РАЬ ОЫОО7 РАЬ ОЫОО8 ΗΡΡϋ ОЫОО1 ΗΡΡϋ ОЫ0О2 ΗΡΡϋ ОЫООЗ ΗΡΡϋ ОЫОО4 ΗΡΡϋ ОЫОО5 ΗΡΡϋ ОЫОО6 185 185 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 (См. последовательности, представленные в рабочих Примерах 1, 9, 13,14, 21, 26) ОАСООАААСССиССАОАОАООСиои осАиоссиАииоииАААСАСАисоА оисАсиАооиооиоААоииАААсии ААсисисоиАЫАСААААОАиисАои иООАССАСАОиССААОСОиОААОАО ииииииосиАААиААСОООАОосАА АиАСОАООАОАиоссиАисииииис ССАССССАОи АСиООООиООСАААААСАиАООСАЫ сиссисоиАииисссисссоииАиии АОСААААААсисиисАсосииссАс исиооиссААсиоААисииииоиАи АСОАОАоииААоиииААсиисАссА ссиАоиоАсисоАиоиоиииААСАА иАоосАиосАСАОссисисиооАОс оиииссоис ОТОАТАТТАССТССААСАСОАТ АТАОТААОСАСАООАТСООАО СТТТСААТССАСТОТСААССО АТСААОСОТТСОААОАССТСАТ САОСААТООСООТАООТААСА ОСААТТОСССОААТССТТТТА ТАОСТСААТАТСААООТССТА ТСАТААОСАСССТСТАТАСАС ТТСТТААССТСОТСОАОАТО АТАСССОАОТАТССТТОСААА ТАОООСССАСООССТТООАОТ АОСООАТАТААССТСАОСТАО СТТСОТООСССААСОААТОАС СААОСТСОООТСССТОСТТОС ООААООТАОАТОАСАТОАОТТ ОАТООСАТАОТТАССАСТОТС ТССОТАОСТТАСАТАССОААО ТССААОТОААТАООАОАААСА АОСАОСТТСТОСОТСТТСТАС АСАОСАСОСАСОССААОАССО СОАТОТААООААТТТООТААА СОАООООАТТОСАОСАОААОА 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 Наружное нанесение дцРНК с последующим глифосатом приводило к гибели амаранта Палмера, устойчивого к глифосату (до 60 копий ЕР8Р8) в течение 7-10 суток Наружное нанесение дцРНК приводило к развитию обесцвеченного фенотипа с замедленным ростом и оказывало системное действие. Наружное нанесение антисмысловых ДНК приводило к замедлению роста растения. Наружное нанесение антисмысловых ДНК приводило к замедлению роста растения. Наружное нанесение антисмысловых ДНК приводило к замедлению роста растения.
ΗΡΡϋ ОЫОО7 21 ОТАООАОААТАСООТОААОТА 147
ΗΡΡϋ ОЫОО8 21 ОАССССААОААААТСОТСТОС 148
АССазе АССА ОЫОО1 20 ОТСТТАСААОООТТСТСАА 149 Наружное нанесение антисмысловой ДНК приводило к замедлению роста растения.
АССА ОЫОО2 21 АТСТАТОТТСАССТСССТО'ГО 150
АССА ОЫООЗ 21 АТАААССАТТАОСТТТСССОО 151
АССА ОЫОО4 21 ТТТАТТООААСААОСООАОТТ 152
АССА ОЫОО5 21 ТАТАОСАССАСТТСССОАТАО 153
АССА ОЫОО6 21 ОСАССАСОАООАТСАСААОАА 154
АССА ОЫОО7 21 ССАСССОАОАААССТСТССАА 155
АССА ОЫОО8 21 САОТСТТОАСОАОТОАТТССТ 156
АЬ8 АЬ8-ОЫОО1 22 ОТТСТТСАОООСТАААТСОООА 157 Значительные изменения фенотипа отсутствуют
АЬ8-ОЫОО2 22 ОТТСААОАОСТТСААСОАОААС 158
АЬ8-ОЫСОЗ 22 АТАСАААСТССААСОСОТССАО 159
АЬ8-ОЫОО4 22 СТСТТООАААОСАТСАОТАССА 160
АЬ8-ОЫОО5 22 СТАОАААОАТАСССАСССААТТ 161
АЬ8-ОЫОО6 22 АСТАОААТТСАААСАСССАССС 162
АЬ8-ОЫОО7 22 ТТТСТОСТСАТТСААСТСС'ГСС 163
АЬ8-ОЫОО8 22 ТАТОТАТОТОСССООТТАОСТТ 164
08 (глутамин синтаза) 08 ОЫОО1 21 ТСАТАТССААОССАОАТССТС 165 Νο зфпЫсагН рЬепо1уре
08 ОЫОО2 21 ТОСАТСАСАСАТСАССААОАТ 166
08 ОЫООЗ 21 ОТАСТССТОТТСААТОССАТА 167
08 ОЫОО4 21 АТТОАТАССАОСАТАОАОАСА 168
08 ОЫОО5 21 АОСААТТСТСТСТАОААТОТА 169
08 0Ы006 21 САТСАТТССТСАТСОАСТТАО 170
08 0Ы007 21 СТСТСОТТОСССТСТССАТАА 171
08 ОЫОО8 21 СААСОССССАООАОАААОТТС 172
Исследовали гербицидную активность оцДНК-полинуклеотидов, мишенью которых являются ферменты 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназа (ΗΡΡΌ) и протопорфириногеноксидаза (РРО) и фактор инициации трансляции (Т1Р), и их действие на гербицидную активность при использовании в комбинации с гербицидами мезотрионом, фомесафеном и атразином по отношению к амаранту Палмера. Полинуклеотиды, использованные в этом эксперименте, представляли собой 8 ΗΡΡΌ-антисмысловых оцДНКолигонуклеотидов (8ΕΡ ΙΌ ΝΟδ: 141-148), 8 РРО-антисмысловых олигонуклеотидов (δΕρ ΙΌ ΝΟδ:125132) и 8 Т1Р-антисмысловых оцДНК-олигонуклеотидов (δΕρ ΙΌ ΝΟδ: 75-82, см. пример 26).
Растения амаранта Палмера (Атагап!йик ра1теп), чувствительные к глифосату, выращивали в квадратных 4-дюймовых горшках со смесью для рассады Зип Ого® Κеά^-Εа^ίй, содержавшей 3,5 кг/кубический метр удобрения Οδтосоίе® 14-14-14, в вегетационном домике при длине светового дня 14 ч, дневной температуре 30°С и ночной температуре 20°С. При необходимости растения поливали путем подпочвенного орошения.
Растения от 10 до 15 см высотой вручную обрабатывали 40 микролитрами (4 полностью развившихся зрелых листа на каждом растении обрабатывали 10 микролитрами раствора на лист) буферного раствора, содержавшего поверхностно-активное вещество (в качестве контроля; 0,5% δΐ1\\Π Ь-77 и 2% сульфат аммония), или смеси антисмысловых олигонуклеотидов, мишенями которых являлись ΗΡΡΌ, РРО или Т1Р, в составе, содержавшем буфер, поверхностно-активное вещество и оцДНК-полинуклеотид. Некоторые растения оставляли необработанными и использовали в качестве контрольных. Через два- 60 029482
дцать четыре часа необработанные растения, растения, обработанные раствором "буфер-поверхностноактивное вещество", и растения, обработанные раствором "буфер-поверхностно-активное веществооцДНК", обрабатывали с помощью самоходного гусеничного опрыскивателя, оснащенного насадкой 9501Е и калиброванного на распыление 93 литров раствора на гектар при использовании ингибитора 11РР1) - мезотриона (4 фунта активного ингредиента на галлон), или ингибитора РРО - фомесафена (2 фунта активного ингредиента на галлон), или ингибитора фотосистемы II - атразина (90% активного ингредиента), как указано в табл. 18. При всех вариантах обработки гербицидами добавляли маслянистый концентрат, снижающий повреждение целевых культур (Сгор οιϊ еопееп1га1е, С0С) в концентрации 1%. С целью обеспечить возможность обнаружения усиления гербицидной активности под действием смеси олигонуклеотидов использованы низкие нормы расхода гербицидов (мезотрион: 13 г на акр, что эквивалентно 1/8Х нормы расхода, рекомендованной для полевых условий; фомесафен: 16 г на акр, что эквивалентно 1/22Х нормы расхода, рекомендованной для полевых условий; и атразин: 170 г на акр, что эквивалентно 1/8Х нормы расхода, рекомендованной для полевых условий).
__Таблица 18
Номер варианта обработк и Предобработка Активны й ингредиен т Норма расхода (граммов активного ингредиента на гектар)
0 1 2 3 Буфер-поверхностноактивное вещество Без обработки Буфер-поверхностноактивное вещество Буфер-поверхностноактивное вещество-оцДНКНРРИ Мезотрион Мезотрион 13 13
4 Буфер-поверхностноактивное вещество-оцДНКНРРИ Мезотрион 13
5 Без обработки Фомесафе н 16
6 Буфер-поверхностноактивное вещество Фомесафе н 16
7 Буфер-поверхностноактивное вещество-оцДНКРРО
8 Буфер-поверхностноактивное вещество-оцДНКРРО Фомесафе н 16
9 Без обработки Атразин 170
10 Буфер-поверхностноактивное вещество-оцДНКΤΙΡ
11 Буфер-поверхностноактивное вещество-оцДНКΤΙΡ Атразин 170
Высоту растений определяли на четвертые сутки после обработки гербицидами. Сбор данных производили в ходе одного эксперимента с четырьмя повторностями на вариант обработки. Результаты (выраженные в виде высоты растений амаранта Палмера под влиянием комбинаций обработки раствором "буфер-поверхностно-активное вещество", оцДНК и гербицидом) представлены в табл. 19 и на фиг. 33. Растения, обработанные НРРО-антисмысловыми оцДНК-олигонуклеотидами, РРО-антисмысловыми оцДНК-олигонуклеотидами и ТГР-антисмысловыми оцДНК-олигонуклеотидами, демонстрировали замедление роста (высота согласно измерениям составила 125, 153 и 115 мм соответственно), в то время как высота растений, обработанных раствором "буфер-поверхностно-активное вещество" (контрольных), составила 185 мм (фиг. 33). Обработка НРРО-антисмысловыми оцДНК-олигонуклеотидами, РРОантисмысловыми оцДНК-олигонуклеотидами и ТГО-антисмысловыми оцДНК-олигонуклеотидами соответственно, вызывала 32%, 18% и 38% замедление роста по сравнению с контролем "буферповерхностно-активное вещество".
Крупных различий в высоте между растениями, обработанными раствором "буфер-поверхностноактивное вещество" с последующей обработкой гербицидами, и растениями, обработанными только гербицидами, не наблюдали. Растения, обработанные НРРЭ-антисмысловыми оцДНК-олигонуклеотидами, а затем мезотрионом, демонстрировали наибольшее замедление роста (высота согласно измерениям составила 100 мм) - на 46% по сравнению с растениями, обработанными раствором "буфер-поверхностноактивное вещество". Высота растений, обработанных РРО-антисмысловыми оцДНК-олигонуклеотидами, а затем фомесафеном, согласно измерениям составила 126 мм, что означало замедление роста на 32% по сравнению с растениями, обработанными раствором "буфер-поверхностно-активное вещество". Высота растений, обработанных ТГО-антисмысловыми оцДНК-олигонуклеотидами, а затем атразином, согласно измерениям составила 121 мм, что означало замедление роста на 34% по сравнению с растениями, обработанными раствором "буфер-поверхностно-активное вещество".
- 61 029482
Таблица 19
Номер варианта обработк и Предобработка Активный ингредиент Норма расхода (граммов активного ингредиент а на гектар) Высота растени й (мм) Стандартна я ошибка
0 Буфер - - 185 15
1 Без обработки Мезотрион 13 180 18
2 Буфер Мезотрион 13 179 18
3 оцДНК-НРРЭ 125 19
4 оцДНК-НРРЭ Мезотрион 13 100 7
5 Без обработки Фомесафен 23 158 12
6 Буфер Фомесафен 23 139 10
7 оцДНК-РРО 153 20
8 оцДНК-РРО Фомесафен 23 126 6
9 Без обработки Атразин 170 146 19
10 оцДНК-ΤΙΡ 115 17
11 оцДНК-ΤΙΡ Атразин 170 121 16
Пример 29
В этом примере показаны протестированные последовательности двуцепочечных РНК-полинуклеотидов, сконструированные для различных генов, необходимых для жизнедеятельности, с целью выяснения действия протестированных последовательностей на наблюдаемый фенотип. Для каждого гена, необходимого для жизнедеятельности, на амарант Палмера наносили раствор, содержавший дцРНК-полинуклеотиды в 2% сульфате аммония в 10-миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8, при норме расхода 240 пикомоль на растение после опрыскивания 0,5% δΐ1\ΥΌΐ Б-77 (10 галлонов/акр). Протестированные полинуклеотиды и полученные наблюдаемые фенотипы перечислены в табл. 20.
Таблица 20
Ген Назв ание Разм ер (нук леот идов) П оследовател ьность 8Е<2 ГО ΝΟ: Фенотип
Фактор инициации трансляции (ΤΙΡ) смыс ловая цепь 160 иисоАоиААиссоАААииооАиААиоиА ОАООАОАООААСААОоииАииоАиисАи иССАиОАСОиАииАОААААСОССОАОАС АииАСАААСООССААСииАСААОСАСАи ААиАСАААООАиАССАСАААиоиАААиА ААССсисисссАоиоиААои 73 Наружное нанесение дцРНК приводило к замедлению роста растения.
антис мысл овая цепь 160 АсииАСАсиссоАОАСооиииАииилсА иииоиосиАиссииисиАиилисиосии оиААсиисосссииисиААисисисоосс иииисиААиАСсисАиссААиоААисАА идАссиисииссисиссисиАСАиилисс ААиииссслииАсисоАА 74
ДНКзависимая АТРаза (ббАТРаза) смыс ловая цепь 168 ОАисАСАААииисссссиииАисАисАА АиАСООААСАиААОАСАОАиАСАСииОА АСАССАиоАиисосАииоооооиоиоои иАсисоиссиисиосАоилиисссисАси иоАиосАОоиоААоиАисАсиссААиАА АисисссосиАиссиоооисссиииии 113 Наружное нанесение дцРНК приводило к замедлению роста растения.
антис мысл овая цепь 168 АААААССОАСССАСОАиАОССССАСАиии АииосАоисАиАсиисАссисслисААси ОАООСААиАСиССАОААСОАСОАОиААС САСАСссссААиоссААисАиооисиисА АоиоиАисиоисииАиоииссоилииио АисАиАААссоосАААиииоисАис 114
Гидрокси-3метилбут-2енилдифосф атсинтаза (ΗΜΕϋδ) смыс ловая цепь 200 сисААссиссисААСсисААслиосАсс ААиоАААисисссАииссААииоссАсс сиисиисАссАиоосииоооАОАиАссА иСАОООиСисиСиААСАОААССАССАСАА ОАССАОАиАОАСссииосАСААооииоо САААисииООААСААААОСАОСиОАААи исАССААООАоиоосАССАиииоААО 173 Значительные изменения фенотипа отсутствуют.
антис мысл овая цепь 200 сиисАААиооиоссАсиссииосиоААии исАОсиссииииоииссААОАииьоссА АссиисиссААСооисилисиссисииси ооиооиисиоииАОАОАСАСссисАисе илисиссс ааосс лисе иоААОААОосис ссААииссААисосАОАииислиисоисс АисиисАСсиисАссАосиисАО 174
- 62 029482
Эндосперм, независимы смыс ловая 183 исссАисАААоиисссилсААААиАиоио САсиииссиАисииссииосссссАиисА 175 Значительные изменения
й от цепь иАСАААсиАисиисАиисиАСААСоиоо фенотипа
удобрений/ сииооиоАиииисиисииисиААОАоио отсутствуют.
ТР (ΡΙΕ) ииоАСААиоАОАииоиАсиоиоссАссс ААииАисААосАссААисиссиооАОАО ооиисАсииоАСА
антис 183 иоисААсиоААСссисиссАООАОАииос 176
мысл иссиисАиААииоосисссАСАоилсААи
овая сислииоисААСАсисииАОАААСААСА
цепь АААиСАССААОССАССииСиАСААиСААС АиАоиииоиАисААиоссоосААООААО АиАОСАААсиосАСАиАииииоиАоооА АсиииалиоооА
КРТ5В смыс 143 ииоиосииААААСАисоАССАОАСАОАС 177 Значительные
(КРТБ)- ловая ААиАииисииссиоииоииосАсиАоии изменения
субъединиц цепь ОАиссиоАиАсосиоАААСсиооиоАии фенотипа
а АТРазы иАоииооиоисААСАААСАиАоииАиси отсутствуют.
268- иАиссиооАСАсисиоссоисооААилиа
протеасомы антис 143 ли АисАилиисссАсоосАОАсиоиссАос 178
МЫСЛ АиААОАиААсиАиеиииоииоАСАССАА
овая сиАААисАССАОсииисАоссиАисАсо
цепь АиСААСиАОиССААСААСАОСААОАААи АииоисиоисиооисоАиоииииААОСА САА
лигаза 1 СМЫС 159 сосиосАоииооиоААоиАСАисссоос 179 Значительные
(ЫО1) ловая ААООосАииисАсиссооиииссАсоиси изменения
цепь ооииссиАиссоАОАсоАиАААисиссА фенотипа
ОАООАСОССАСАиСАисиОАОСАООиООС ООАиАиоиАСАОАисиСААОСАААСААи ССАСАССОСАААААОАО отсутствуют.
антис 159 сисиииииосооиоиооАииоиииосии 180
МЫСЛ ОАОлисиоиАСАилиссоссАссиосисА
овая ОАиоАиоисосоиссисиооАОАиииАи
цепь ССисиСООАиАСОААССАОАСОиООАААС саоАоиоАААиссссииоссоооАисиАс иисАссААсиосАосо
тРНК- СМЫС 159 иАААОАиООСООАААААиСОАСиАиОАи 181 Значительные
синтаза (18) ловая АААиисАииоАСАААиисоосиоисАос изменения
цепь ОАсииоАиииАисссисАиисАОАОААи фенотипа
иоАососАисАсиосисоиссиосислио иАииисиисоссосААСоиииисиисоси САСсоиолиииоААиоА отсутствуют.
антис 159 иСАииСАААиСАСООиОАОСОААОАААА 182
мысл СОииОСООСОААОАААиАСАиОАОСАОО
овая АсоАосАоисАиососисААиисисиоА
цепь АиОАОСОАиАААиСААСиСОСиОАСАОС соААиииоисААисААииилисАиАоис ОАиииииссоссдисиииА
Убиквитин- смыс 150 иоААСсиоАиосиоААооАААооАиАии 183 Значительные
специфичес ловая оАиосиАоиоААоиАоиисосссААСоо изменения
кая цепь иоссАииАОААосииоссиАосиАосиАС фенотипа
протеаза 14 исАОсиссооАСОАОоиоАиооАсииси отсутствуют.
(ивр) АСАОСАСиОСАииОААОССАААООСААС исеиАСААА
антис 150 ииисиАосАоиисссиииоссиисААио 184
мысл САоиосиоиАОААоиссАисАссиссисс
овая осАосиоАоиАссиАОсиАООСААОсии
цепь сиААиоосАсссииооосоААсилсиисА сиАосАисААилиссиииссиисАОСАис АОсиисА
Серингидро смыс 155 АСАСсиосссиААСАисисооооииииси 185 Значительные
ксиметилтр ловая соААСААОАииииоииАААоиооссоАО изменения
ансфераза 2 цепь иАииииоАиосиосиоииААОсиоосис фенотипа
(8НМТ) иАААААиСААООСиОАСАСААААООААС АААоииоААООАсиисоииоссАСсиис САоисиооиоииии отсутствуют.
антис 155 ААААСАССАОАСиОСААООиООСААСОА 186
мысл АоиссиисААсиииоииссиииисисис
овая АОСсииоАиииииАСАОссАосииААСА
цепь осАОСАисААААиАсисооссАсиииААС ААААисиисиисоАОААААСсссоАСАи оииАОСосАОоиои
Метионин- смыс 159 иСААСиАСОААОСАООСАААииСиССАА 187 Значительные
тРНК- ловая ААоиАААоосАииооАоиииииоооААи изменения
лигаза/синт цепь ОАСОССААОААиисиААилиАссиоиАО фенотипа
аза (М18) ААоиоиооАОАиАсиАисиосиААСААА САООСсиоАОоиАисАОАСАСАиисиис АсииоооссгоАисиисААО отсутствуют.
антис 159 сииоААОАиссссссААоиоААСААиои 188
мысл сисиоАиАссисАсоссиоиииоииАсс
овая АолиАоидисиссАСАсиисиАСАОсиА
цепь иАиилоААиисииоосоисАиисссААА ААсиссААиоссиииАсииииооАОААи иисссиосиисоилсиисА
Пример 30
В этом примере показаны полинуклеотиды, мишенями которых являлись области особенно низкой гомологии последовательностей и которые можно использовать, например, для отбора специфического аллеля гена-мишени или гена специфического вида. Полинуклеотиды, мишенями которых являлись некодирующие последовательности, можно использовать для регуляции некодирующих РНК, вовлеченных в регуляцию генов, например, регуляторных некодирующих РНК, которые процессируются в миРНК по ΚNА^-регулируемому пути. На фиг. 34 изображено выравнивание промотора локуса 1 ΡΌδ №сойапа Ьеп1йаш1апа (δΕ^ ГО ΝΟ: 319) и промотора локуса 2 ΡΌδ (δΕ^ ГО ΝΟ: 320); в случае локуса 1, содержавшего множественные сайты начала транскрипции, последовательность промотора, использованная при данном выравнивании, является последовательностью сайта начала транскрипции, расположенной наиболее
- 63 029482
близко к 5'-концу. Обнаружено, что гены ΡΌδ1 и ΡΌδ2 Мсобапа Ъеп1Нат1апа обладали низкой гомологией последовательностей в области промотора, но высокой гомологией последовательностей в кодирующей области.
Полинуклеотиды, мишенями которых являлись различные фрагменты промоторов ΡΌδ1 и ΡΌδ2, перечислены в табл. 21.
__Таблица 21
Смес ь Полин уклеот ид промотормишень Последовательность δΕ<) ГО ΝΟ. положе ние/нап равленн ость
2 НЬ419 мотив промотора Ρϋδ 1 ТСССАТСТСССАСАТСООТТАСТО 189 590-567
2 НЬ420 мотив промотора Ρϋδ 1 САОТААСССАТОТОООАОАТОООА 190 567-590
2 НЬ421 мотив промотора Ρϋδ 1 ОССТОАТОАААТТСААОТОСТА 191 557-536
2 НБ422 мотив промотора ΡΟδ ί АААСТСАССТТССАААТААТС 192 517-497
2 НЬ423 мотив промотора Ρϋδ 1 ОААСССААААТТОТСАСТТТТТ 193 448-427
3 НЬ424 мотив промотора ΡΟδ 1 АТОСАСТТОТТТАТАСТСТТОТСА 194 403-438
3 НБ425 мотив промотора Ρϋδ 1 АТТТАТТАОТСТТСТАААОАА 195 357-337
3 НЬ426 мотив промотора Ρϋδ 1 ТСТАОТАОСТТАТААОАТТАОСТТ 196 287-264
3 НЬ427 мотив промотора ΡΌδ 1 СТТОТСССТТТТАТОООТСТТТ 197 240-183
3 НЬ428 мотив промотора Ρϋδ 1 СССОТОСААТТТСТОООААОС 198 86-66
5 НЬ429 мотив промотора ΡΟδ 2 АТТАОТТТТТТАТАСАСОАААОАТ 199 13131336
5 НБ430 мотив промотора Ρϋδ 2 атстттсототатаааааастаат 200 13361313
5 Н1Л31 мотив промотора ΡΌδ 2 ттоотоотттооссасттссот 201 12911270
5 НЬ432 мотив промотора Ρϋδ 2 ТТТОТТТОСТАТТТАССТОСА 202 12561236
5 НБ433 мотив промотора ΡΌδ 2 СААТТТОСАОСААСТСОСАСТООА 203 12051182
6 НЬ434 мотив промотора Ρϋδ 2 ТСССАССАТТООСТАТТССОАС 204 11561135
6 НЬ435 мотив промотора Ρϋδ 2 СТОТСТСТСТТТТТААТТТСТ 205 11051085
6 НЬ436 мотив промотора ΡΌδ 2 ССАСТТТОСАСАСАТСТСССАСТТ 206 10561033
6 НЬ437 мотив промотора ΡΟδ 2 ОАСОАТССАСОТАТАОТАСТАО 207 1016-995
6 НЬ438 мотив промотора Ρϋδ 2 ТТТАААТАААОАААТТАТТТА 208 889-869
1 НЬ439 промотор Ρϋδ 1 ТААТАСОАСТСАСТАТАОООСТТОАОТТ ТАТААСОААОСТ 209
1 НЬ440 промотор Ρϋδ 1 ТААТАСОАСТСАСТАТАОООСТТСТААТ ТТТСААООАСО 210
1 НЬ441 промотор ΡΌδ 1 АОСТТСТААТТТТСААССАССАТА 211 Антисм ысловая цепь
1 НЬ442 промотор Ρϋδ 1 ОТСАТОТОАСТССАСТТТОАТТТТО 212 Антисм ысловая цепь
1 НЬ443 промотор Ρϋδ 1 СТСААТТССОАТАААТТТААОАААТ 213 Антисм ысловая цепь
1 НБ444 промотор Ρϋδ 1 СОААОСТАТТООАССОАССТААТТТС 214 Смысло вая цепь
1 НЕ445 промотор ΡΌδ 1 ООААТТОАОООСТТСССАОАААТТОС 215 Смысло вая цепь
1 НЬ446 промотор ΡΌδ 1 АТОАСТТТТТОАТТООТОАААСТАА 216 Смысло вая цепь
4 НЬ447 промотор ΡΌδ 2 ТААТАСОАСТСАСТАТАССТОСААСТСС ААСАСАСААААААТТТС 217 Смысло вая цепь
4 НБ448 промотор Ρϋδ 2 ТААТАСОАСТСАСТАТАОСТТСАААААТ ААТСАТААТТТТА 218 Антисм ысловая цепь
4 НБ449 промотор Ρϋδ 2 ОСАТААТАТАТТОАТССССТАТ 219 Антисм ысловая цепь
4 НБ450 промотор Ρϋδ 2 СТОАААОТТСАТАСАТАООТАСТС 220 Антисм ысловая цепь
4 НБ451 промотор Ρϋδ 2 ООТАСТССААТТТТСАСТАТАТ 221 Антисм ысловая цепь
4 НБ452 промотор Ρϋδ 2 СТОААААТТССАОТАССТАТОТАТ 222 Смысло вая цепь
4 НЬ453 промотор Ρϋδ 2 АТОТАТОААСТТТСАОААТАТТАТАСС 223 Смысло вая цепь
4 НБ454 промотор Ρϋδ 2 ТАССООАТСААТАТАТТАТОСТ 224 Смысло вая цепь
Шесть различных комбинаций полинуклеотидов (1 наномоль каждого наносимого полинуклеотида/растение), соответствующие перечисленным в табл. 21 и показанные на фиг. 35, тестировали на 4недельных растениях №собапа Ъеп1Нат1апа, используя процедуру, аналогичную описанной в примере 12. Растворы полинуклеотидов изготовили, используя 0,01% (об./об.) δΐί^ΐ Ь-77 и 2% (мас./об.) сульфат аммония в 5-миллимолярном фосфате натрия, рН 6,8. Два полностью развившихся листа на каждое растение погружали в свежеприготовленный раствор 0,1% δΐί^ΐ Ь-77 в бидистиллированной воде на не64
029482
сколько секунд и оставляли сушиться. Приблизительно через 30 мин на каждый из двух предобработанных листьев наносили 20 микролитров раствора полинуклеотида. Растения, использованные в качестве положительного контроля, аналогичным образом обрабатывали ДНК-олигонуклеотидом, мишенью которого являлся консервативный сегмент кодирующей области ΡΌ81 и ΡΌ82; растения, использованные в качестве отрицательного контроля, аналогичным образом обрабатывали ДНК-олигонуклеотидом, предназначенным для сайленсинга зеленого флуоресцирующего белка (ΟΡΡ). Все шесть комбинаций полинуклеотидов, мишенями которых являлись области промоторов ΡΌ81 или ΡΌ82, индуцировали системный сайленсинг обработанных растений, что подтверждалось обесцвечиванием. Обработка дцРНК или дцДНК-полинуклеотидами длиной приблизительно 200 п.о., мишенями которых являлись области промоторов ΡΌ81 или ΡΌ82, также индуцировала системный сайленсинг обработанных растений, что подтверждалось обесцвечиванием.
В генах ЛшагапШиз ра1шеп идентифицировали следующие дополнительные геномные последовательности (включая промотор и транскрибированные последовательности интронов и экзонов) для использования при конструировании полинуклеотидов для наружного нанесения, перечисленные в табл. 22.
Таблица 22
65
029482
ОТАОАООТСАТАООТОТТСАОААТАОАТССАААОАСССОАТАТТТАССООАС ТТТОТАААСААСТТААСССОАСТТСААААТСААТТТАСААТСАТАТААААОС ААТАТООАСТТАААССОАТТТТОААССОАССТТОАССООТТОАТССОААТОА АТОССТСТАСТСТТААОСАТОТСААСТОТААТАТОАААТАОААТТАТААТАТ АААСТААОТТСАТОТТТТСТТСААСТАСАААТОАААТТТТАТСАСССАААТА АТОТОТОААТАСССССАОСААТАООТТОААТООСАТТТАОТТСАСТТОАТТТТ АССАСАССАСАТСТОСССТСАТАТТССАТТСТТСАОТТТАОТТОТТАОТАОСТ ОТАСАТААТАОАСТААТТААОТТОТСАТТТТОАТССАТОТТАТССТТОТСТОО САТАААСООАТТООААТТСТАТААТААААСТТТООСТТАСТТТАТПТОСТСТ АООАООООТТАТОТСАТАТОТОСАСТСТОТТООСААСССОАСААТОС ААААС АТТТТСАТАСТТООТАССТТОТТОСОТОТТТТОТССССТТСОТАТТТТОТААСТ ОТТОАТОААТОТОТАААААТАТАСТАСАТОАТСАТАТССТАОТАООТСТТСТТ САССТАОТАААОАААТТТТТСТААСАСОАОААОТТСААААСАТАТТСССАТТ АССАТТАТССААСАТСАОТАСССОАОТССААОТААСАТАОООТОТСССТТТА ТОАТАОТАТААОААТТОСТССАТСАААААСОСОТОАТТОТАОССАСОАТАО ТАООСОООАОАООТАСАООАТТТОААААТТТТОААТТОСТААААСОСТАТСА ООАТСТТОТТТТТСТТАСТТТОАТОТТОСТТТТТТОАААТТТОАТССАААТТОТ ТАААТТАТТСАСАСТААТТССТСТТСАТССТСТССТСААСТТТСТАСААТСТТ ТСАООССОСАТТСТСАСАОТОААООСТСААТТАААСААООТОАОТСТТТТТТ ТОТСТТААСТСТТАТОСАОТТСАТТАТСТСТТСТАСТОАТОАОААААССАСТА ТТТООССТААТТСТААТТТССТТСТАООТТОСТТТООАТСОТТСАААТСАТСС ТССАТСАССТТСОСАСОАААААТСТОООСТАССАОСССААСААААОААОАА СОАТОАОССОТСТАОТОААТСТТСТССТОСАОСАТСАОТОТСТОААОААСОА ОТСТСССААТТСТТОАОССААОТТСССООТСТТСТСААОТАТСТААСАТТСТТ ТАТТТТСАТТСТТССАСАСАСТСОСААТТТООАТААСОАОАТОТСТТТАОАСА ССТСТООООААСААОООАОАААТОАОТСТАОАООТТОСТАОАОАОААСОАО АТАААТАСТААТАТАТАТОААТАТТТСАТААТССАСАТТАААААААТАСААТ ТОААТТТОСАТТАТООТОААСТАССАААОААТСОААТАТТТТТТААТАСТССА ТСТТТТСТСОТСТАСАСТТСТОСАТТСТАОАСАСАТТСТАСАСТТССААТТАА ААСААСТООАСТОТОАОАТАТТОАТССОСААОСАООААОСТАТТССТСААСС АСАААТТССТААТССТАСАСАТОТСОТТОСААТОСААССАССАССАССТССТ ОТАОСОТСТОССССАОСТСССОТСТСТТСАССАОССАСТССТСОТССТОСОТТ АССТОССССАОСОССТОСТОССАСОТСАОСТААОССАТСАСТТССАССТСТС ААОАОСССТАТСТСАООСАСАТТСТАССОТАОТССАОСТССТООСОАОССОС СТТТСОТОААООТААОТОТАТАССССТТТТТТАОТОТТОТАТТТСТОТОТТАТА ТСААТТТТТОСАТТТТОТОААССТОААААТАААТСТТТСАТТТТССАТАООТТ ООАОАТАААОТТААОАААООАСААОТСАТАТОСАТТАТСОАООСТАТОААО ТТОАТОААТОАААТСОАОСТАСОТАТОТТАТТОСТТТАААСТТСАТОССТТАС ОССОТОААСТТ
АЬ81 АСАААААОСАСАААТТСААТААТАТАСТСТТТААОТТТОТТТАТСТТСТААТТ АОТТСООТТААААСООТТССССАСТТТСТТСТССОАСТСТСАСААТТАТСТТС СССТАТТСАТТТТТСТТССАСССТСТСТААТООСООСТОТТТССТТСААТАТСА АТООТООАААОАТТООААСТТТАТОТТСААОАСАСОААТТСОТТТОТОООТТ ТОТААОААААТТТСАТТТТАОААСТСАТАСТТСТАТАТТТОАААААСАТАТОС САААААСТТСААООТТТАААОСААТООААОТТТСТОСАААТОСААСАОТАА АТАТАОТТССТОТТТСАОСТСАТТСТАООТААТТТТАТТТСТСОААААТТТСС ОАТТТАСААТТАААТТААТСТТОТТТТОТАООТААТОААТТОСАОААОАААТ АОАТООАТТСТТАТТТОТТТАТТООТАТТТОТТТАТАААТТТТТОТТТАТАТТА ОТТТСТОААТТОТОАТТАТТСТОАТТОТАТОТСААООТТТАООТТОТТАТТАА ТАААТОТАААТТООАТТОАТТОААОТТОСААТААООТОАТООСОТСАТОСТО АТТОТТОТАААТТТТ 230
АЬ32 СААСААТОАОААТТТАСААТССАТАТСААТСТТОАТАТТСААСООТАТТТАА ОТААТТАААОААСААССАТТОТТААОСОССТССАСТАТСТТСТТССТТСТСАТ ТСТССАТТСТСОСТТАОСТТТССТСТСОСАСТААТТАССТССАТТТОСААССТТ ТСААОСТТТСААСААТООСОТССАСТТСТТСАААСССАССАТТТТССТСТТТТ АСТАААССТААСААААТСССТААТСТОСААТСАТССАТТТАСОСТАТСССТТТ ОТССААТТСТСТТАААСССАСТТСТТСТТСТТСААТССТССОССОСССССТТСА ААТСТСАТСАТСТТСТТСТСААТСАССТАААССТАААССТССТТССОСТАСТА ТААСТСААТСАССТТСАТСТСТСАССОАТОАТАААСССТСТТСТТТТОТТТССС ОАТТТАОСССТОААОААСССАОААААООТТОСОАТОТТСТСОТТОААОСТСТ ТОААСОТОААООТОТТАССОАТОТТТТТОСТТАСССТООТООАОСАТССАТО ОАААТССАТСААССТСТТАСТСОТТСТААТАТСАТТАОАААТОТТСТТССТСС АСАТОААСААООТООООТТТТСОСТОСТОААООСТАСОСТСОТОСТАСТООА СОСОТТООАОТТТОТАТТОССАСТТСТООТСС 231
ЕРЗР81 АТТТООАТААСТТТТТССТТТОАТТССААТСОСАТТАТТТТТААТАСАОТАТТ АТОААСТОАТТТААТОАААОТООАООААОТТТСААТТТТТАААОТТОТАООТ ОТААТОТТТТСТСАТТТТООАТАТОАААОТООАООААОТТТСААТТТСОААТС АТОТТТОССАОТТОАТТСААТОААТОСТСТТООАААТОАССААОАОТТСААО ОСТТСТТОТТАТААААСАТТТСААТТТТОАТСТААОААТОААСТАТТТАОААС ТТАААОТААТТАААТТАТТАОТТАТААСТТАТАААААААТТСААТТТТААССТ ТАААТТТАТАААТТАТОАССТТАААААОАТСААОТАТТОААСОСАТАТТТАО АААААТТАТААТТСООСТТАТСАОТСТСАТАТТОАОАСООТСТСОТССААОА СААСТТОТАТСАТТТАТАТААТСАААТАТААТТАТОАОТСТАТТСАТОТАООТ ТТСААСТТТАААОССТАООТОАААОАТАТОТТОТАОСАТСТТТОТОАААОТС АОССТАТААСТТООТТСТААААТТТТОААОСАТААССАТАТАОТСССТСОАА ТТСАТТСААОТТОТССААТТТАСТТТТТТАТАСТТОССОАОАСААСАТТТААА СССТТААТАТТТСТААТТААТСТТААТТАААААТТАТОААААТТТОАТАТТАА ТААТСТТТОТАТТОАААСОААТТТААСААОАТСТСАСАТОАСТАТОТТТТААС ТТАТАОАТТАААААААААТАСАААТТААОАОТОАТААОТОААТАОТОСССС ААААСАААТОСОАСААСТТАОАТСААТТОСАОСТААТАТТАСОТАОСААОТ САТСАСТТТААСАТСААААТТОАТСАСТТАТАООТТСАААТТСАААСТТТТАС ТТТААТТОАТАТОТТТАААТАСТАСТТТАААТТОАААТТОАТАТТТТТААООТ СААААТТОАААССТТТААОАТТАТААТТОААААТТООСАОААОАААААСАА АОАОАААОААТАТААОАСАСОСАААТТОТАССОАТСТАСТСТТАТТТСААТТ ТОАОАСООТСТСОСССААОАСТАОАТОТТСООТСАТССТАСАССААССССАА ААААТТСААСААСАААОТСТТАТААТСАТТСССТСТААТСТАСТАСАОТСТА САССААСССАСТТТСТСТТТОСССАССААААСТТТООТТТООТААОААСТААО СССТСТТСТТТСССТТСТСТСТСТСТТААААОССТОАААААТССАССТААСТТТ ТТТТТААОССААСАААСААСОССАААТТСАОАОАААОААТААТООСТСААО СТАСТАССАТСААСААТООТОТССАААСТООТСААТТОСАССАТАСТТТАСС САААТСССАОТТАСССАААТСТТСАААААСТСТТААТТТТООАТСАААСТТО АОААТТТСТССАААОТТСАТОТСТТТААССААТААААААОАОТТООТОООСА АТСАТТСААТТОТТСССААОАТТСААОСТТСТОТТОСТОСТОСАОСТОАОААА ССТТСАТСТОТСССАОАААТТОТОТТАСААСССАТСАААОАОАТСТСТООТА СТОТТСААТТОССТОООТСАААОТСТТТАТССААТСОААТССТТСТТТТАОСТ ОСТТТОТСТОАООТАТТТАТТТСТСААСТОСОААААСААТСТСТАТТТОАТАТ ТООААТТТАТАТТАСАТАСТССАТСТТОТТОТААТТОСАТТАОТАОАТАСТТА ТОТТТТОАССТТТОТТСАТТТОТТТОТТОААТТООТАОТОТТОАОААТТТОААТ ОТААТТАТТТОТТТТТССАТОТОААТТТААТСТОАТТАААТССАСТТСТТАТТТ АТОТТААОТТОСААТОАТОТТТОССАААТООТТАТСАТТОААООАТААОТТТ ОССТАСТТТТОАСССТСССААСТТСОСООТООТАОАОССАТТТТАТОТТАТТО ООООАААТТАОАААОАТТТАТТТОТТТТОССТТТСОАААТАОТАОСОТТСОТ ОАТТСТОАТТТОООТОТСТТТАТАОАТАТОАТАТАТОООТТАТТСАТОТААТО ТОТАООТТТАТОСАТТАТОТТООАТОСАТОТСТООТОТТАТТОСТОТАААТОО АТОААТОТТОТТАТТТООАОАСАТТТТТТСАТТСАТТТТТТСССТТТТТААТТО ОААСТОСААОАОООАААСТТАТТСООАОТААТТААААООТТОТСАОТТССА ТАСАСТОСАТСАААОАСОААОААСТТОАСАТАОАТОТТОААООСТААТССТТ АТСАСТОСТТОААТТСААТАТОТАТСТОААААТТТТАССССТСТАТАТОСАТС ТОТТТТТОСТААТАААОТОТТТТТООАСТАТСАТОТТТТОТОАТОСТТААОАО ООТОАТАТТАСТОАОАТАААТООАААТАТСААААТААСАТСТАТТОТОААОТ 232
ΕΡ3Ρ32 СААОСТТСААТТАТСОТТТТСААААТААОТАТТТСАААОТСТАТАААОАТАТТ ТОААААТССАААТТОААТААОТТААТАКТТАААТТАТОАСАТАТААТТАТОА САТАТААТТТОАССАТОАТАТТТТАСААТСТААСТТААТТТТОААСТТАТТАТ ТТСТААТАТТСААТТАТССТТСТАААААТААОТАТТТАААТТОТАТАОАТАТА ТТОТАТААСАТТТАОТТСАААТТТААТТАТТОАТАОТТТТАТТОАСТАТТТАТТ ТООКОТТТОАААТТСАТССАТАСААТОАТАОААТААСАССАТТТТТТАТАТА АСТТСОТТСТААААТТТТОААОСАТААССАТАТАСТСССТССААТТСАТССАА ОТТОТССААТТТАСТТТТТСАТАСТТОССОАООСААСАТТТАААСССТТААТА ТТТСТААТТААТОТТААТТАААААТТАТОААААТТТОАТАТТААТААТССТТО 233
66
029482
083 ТАТТСАААСАААТСТААСААСАТСССАСАТОАСТАТСТТТТААСТТАТАСАТ ТААОААТААААТАСАААТТААОАОТААТААОТОААТАОТОТСССААААСАА АТАООАСААСТТООАТОААТТООАООТАОТАТТАООТАОСААОТОАТСАСТТ ТААСАТСААААТТОАТСАОТТАСАООТТСАААТТОАААСТТТТАСТТТААТТО АТАТОТТТАААТАСТАСТТТАААТТОАААТТОАТАТТСТТААООТСААААТТО ААААСТТТААОАТТАТААТТОАААААТОСССАОААОАТОААААААСАОАОА ОАААОСАТОТААОАСАСОСАААТТОААССАОТСТАСТСТТОТТТСААТТТОА ОАСООТСТСОСССААОАССАОАТОТТСАОТСАТССТАСАССААССССААААА АТТСААСААСАААСТСТТАТААТОАТТСССТСТААТСТАСТАОАОТСТАСАСС ААСССАСТТТСТСТТТОСССАССААААСТТТООТГТООТОАОААСТААОСССТ СТТСТТТСССТТСТСТСТСТТААААОССТААААСССАССААСТТТТТСАОССА АОАААСААСОСОАААТТСАОАООААОААТААТООСТСААОСТАСТАССАТС ААСААТООТОТССАТАСТООТСААТТОСАССАТАСТТТАСССААААСССАОТ ТАСССАААТСТТСАААААСТСТТААТТТТООАТСАААСТТОАОААТТТСТССА ААОТТСАТОТСТТТААССААТААААОАОТТООТОООСААТСАТСААТТОТТС ССААОАТТСААОСТТСТОТТОСТОСТОСАССТСАОАААССТТСАТСТОТСССА ОАААТТОТОТТАСААСССАТСАААОАОАТСТСТООТАСТОТТСААТТОССТО ООТСАААОТСТТТАТССААТСОААТССТТСТТТТАОСТОСТТТОТСТОАОООС АСААСАОТООТСОАСААСТТОСТОТАТАОТОАТОАТАТТСТТТАТАТОТТОО АСОСТСТСАОААСТСТТООТТТААААОТООАООАТОАТАОТАСАОССААААО ООСАОТСОТАОАОООТТОТООТООТСТОТТТССТОТТООТАААОАТООАААО ОААОАОАТТСААСТТТТССТТООТААТОСАООААСАОСОАТОСОСССАТТОА САОСТССООТТОССОТТОСТООАООАААТТСААОТТАТОТОСТТОАТООАОТ АССААОААТОАОООАОСОССССАТТСОООАТСТООТАОСАООТСТАААОСА АСТТООТТСАОАТОТАОАТТОТТТТСТТООСАСАААТТОСССТССТОТТСООО ТСААТОСТАААООАООССТТССАОООООСААООТСААОСТСТСТООАТСООТ ТАОТАОССААТАТТТААСТОСАСТТСТСАТООСТАСТССТТТОООТСТТООАО АСОТООАОАТТОАОАТАОТТОАТАААТТОАТТТСТОТАССОТАТОТТОАААТ ОАСААТАААОТТОАТООААСОСТТТООАОТАТССОТАОААСАТАОТОАТАОТ ТОООАСАООТТСТАСАТТСОАООТООТСАОАААТАСАААТСТССТООАААОО САТАТОТТОАОООТОАТОСТТСААОТОСТАОСТАСТТССТАОССООАОССОС СОТСАСТООТОООАСТОТСАСТОТСААОООТТОТООААСААОСАОТТТАСАО ОТАТААТОТТААСССТТАСССТТСАСАТТОТТСТОСТАААТТСТАОАООАССС ТТТСААТТСТОООТОООАТААОСАСООСААТТТОАССОСАААААААТТОСАА ААТТАТТСТОСТОАТАОААСАТСТСОАОАТОАОАТСАТАТТОАОТТТТООСО ТСААСАТАААССТААТСАААТААТОАААААТАСАААСАТСАТАТСОТТТСТТ ТТСТСТТТАТОАСТАОАСАСТСТСТАТТАТТССТТОАТТОООАТСТТАТТТОАА АТТОСТОТОТАОССТАСАССТСАТОТТСАОАТТТТОТТСОТАТАССАОАСТТТ ТСТТОАТТОООАТСТТАТТТОТССССТООАТТТТОСАТАОООТОАТОТААААТ ТТСССОААОТТСТТОАОААОАТОООТТОСААООТСАССТООАСАОАОААТА ОТОТААСТОТТАСТООАССАСССАОООАТТСАТСТООАААОАААСАТСТОСО ТОСТАТСОАСОТСААСАТОААСААААТОССАОАТОТТОСТАТОАСТСТТОСА ОТТОТТОССТТОТ АТОСА ОАТОООСССАССОССАТСАОАОАТОТООСТ АООТ ООАОАОТОААООАААССОААСООАТОАТТОССАТТТОСАСАОААСТОАОАА АОСТТООООСААСАОТТОАСОААООАТСТОАТТАСТОТОТОАТСАСТССОСС ТОААААОСТАААССССАСССССАТТОАААСТТАТОАСОАТСАССОААТООСС АТООСАТТСТСТСТТОСТОССТОТОСАОАТОТТСССОТСАСТАТССТТОАТСС ОООАТОСАСССОТААААССТТСССОСАСТАСТТТСАТОТТТТАОААААОТТС ОССААОСАТТОА ТСТТААТТТОТАТТТТАТТАТТААТСТАТААОТТААААСАТАОТСААОТОАОА ТСТТОТТТОАТТСОТСТСТАТОСААООАТТТТСАТАТСААСТТТТСАТААТТТТ ТОАТТАТАСАСААТТАСАААТАТТААСОААСОААТААОТОСАТТАААААОА ОТОСАААААОСАААТОООАСАСТТОТОТТОААТАООАОООАОТАТАСАТТА АОАТОААТСТААСОАОАТСТСАСАТООАТАТААТТТОТСТТСТАТАТАТОТСТ ААААААТСТТОАТСАААТТТСТСТТТССААААТАОААТАТТСТАААТОСОАА ОААСАТТААОАААСООАОООАОТАСТТАТААОТТААСАТАОТТОООООТАТ ТТАООТАААААААТСТАТОССААААОТАОАААОТООАСААТТАОАОТОАСТ ТТАСТАААТААООАААОТООАСАТТТААААТОААТСООАОООАОСАТАТТА АСТТТАТТТТСАААОТОТОАААСАТААТСАТАТТТАООТАААААААТТАТСА АТТТААСОТСААААТТОАТСАСАААТАООТТААААТТОАААТТТТТТАТОТТА АТТОАТСТАТТОТТСАСТТТАААТТОАААТТОАТАТССТТТААООТТААААТТ ААТАССТСТААААТТААААТТАТТАААООСССАОААААТААААААААААОА АОАСАООСТАТТАОТААААТТАТТААОТАТОТААООТТОАТАСАСОСОСОАА ТТОАОССООСССАСТТТТАОТТТСААТТТОАААСАОТСТСААТСААОАССАА ТТАТТТАТТАТТТТАТТАТТТТАТТОТТТТААОСТСААТОООТТООАСТТОАТА ААТТАТАТТТТОАООАОАСОООСТАТТАОТААААТТААТАОТТООААТСТТТ ТТТОАТАТАСТАТАААААОАООТАТСТООТООАОССТТАААТСТОСОСААТТ ОААОТССТСААТАСАСАТСТСОСТСТТСТТАТТСТСТТТСАТСТАТТТССТССТ ТТОАТСАААСТАСОССАТОТСТСТСТТАААТОАТСТСОТТААССТТААТСТСТ СТОАААСТАССОАТААОАТТАТСОСТОААТАСАТАТООТААТАСААСААТСС ТТССТСТТТТТСАТТТ 234
085 ААААААССОТСТТАТТТОТАОААААТААААААСТАААААОТАОТАТСААСТТ ТТАОАСТАОТСАТААОТОАОТООСАТСАААСТТОТТСТАТАААААОООААОА ОТТССТСААСТТОАОАТТСАТАТТТТТТОТОАТТТСТАААТАОААОААСАТАС ТСАТСТТССАСТТСТСТТАТТСАТСАААТТТТАТТТОТТССССАААААААСАТ ОТСТСТТСТТАСАОАТСТСАТСААТСТТААТСТТТСТОАСТССАСТОАОААОА ТСАТТОСТОААТАСАТАТООТСАОТТТТСАТСССТТТТТТТТАССТТТААТССС АСТТТТТОТТТТТАСССАССАТТТТТТТСАТСТАТТТТСТСТТАААОАТТТТАА СТТТТТАСТТТТТТОТСТАТАТААСАТТСАТТТТТТСААТТОООТАООТТАСАА ΑΑΤΤΤΟΤΑΤΑΑΑΤΑΑΑΤΑΑΑΤΑΑΑΤΝΝΝΝΝΝΝΝΝΤΑΟΟΤΤΑΑΤΟΟΟΑΟΤΤΤΤ ААСТТТТТСТТООТТТТТОТОТАТАТАССААТСАТТТАТТТТСАСТАОТОТАОО ТТААААААТАТСТАААААТААЛТЛАААТАОААТАААААТОТААТСАСТАОА ТТААСССАТОААТТАТТТСССТТОТТТТТАСТСАААСТТТТТАСССТТОТТААА ААААТААТОАТАТАААТАААТТТТТОАОООТТТОТТАААСССАТАТОТААТС ТАТАТСОААААААТТАОАТАОСОООТТТТОТТОТООАСАААСТАААТААСАА АТТТАООААТАААСТТТТОАОООТТТАТТОААААААТААСССАТАТТТААТС ТАТАТСОААААААТОАТАОСОАОСТТТОТАТАОАТ 235
ΗΡΡΌ СОТСОААОТАОААОАСОСООААОСТОСТТТТААСАТСАОСОТТТСОСАТООО ОСТАТТСССТОТОТТТСТССТАТТСААТТООААААСООТОТСОТТТТАТСТОА ООТТСАТТТАТАТООООАТОТТОТОСТТСООТАТОТААОСТАСООАААТОАА ТОТООООАТОТОТТТТТТСТТССТСОСТТТОАСОАААТОССООАСОАЛТСАТ СОТТТАОАООАСТТОАТТТТООСАТТСОААООТТООАТСАТОСТОТАОООАА ТОТСССТОАОТТООСТССТОСААТТОСТТАТТТОААОААОТТТАСТОООТТТС АТОАОТТТОСТОАОТТТАСАОСТОААОАТОТТОООАСОАОТОАААОТООАТТ ОААТТСАОССОТАТТООСАААСААТОАТОАААТООТОТТОТТТССОАТОААТ ОААССТОТОТАТОООАСАААААООААОАОССАААТТСАААСТТАТТТООАО САТААТОААООООСТООТОТАСАОСАТТТООСТТТОАТОАОТОААОАСАТАТ ТТТООАСТТТААОООАОАТОАООААОАОААОТОТТСТТООТОООТТТОАОТТ ТАТОССОТСОССОССТССОАСТТАТТАССООААТТТОАООААСАОАОСТОСТ ОАТОТАТТОАОТОАООАОСАОАТОААООАОТОТОААОАОТТООООАТТТТО ОТООАТАААОАТОАТСАОООСАСТТТОСТТСАААТСТТСАССАААССТАТТО ОАОАСАООТАААТТТТААТСТТОСТТТСААТТОСТТТТОСТТОАТООАТТОАС ТАОСАААТТТОАТСОСАТТТТОТТОСТТАТАТОАСТТОАТОАТАСТТССТСТО ТТТСОАААТАСТСОСТАСАТТСОСТАСАТТТТОТТТТОТОСАСТАТТСАТСОТТ СААОСТТАТТТТАСАТАТТОСОАСТААТОТОТААСТАААААТАТАОТСААОТ ОООАТСТТОТТТОААТСОТСТААТООСАТАСТТТСАТСАТАТТАААТТТТТАТ ААТТТТТАОАТТАОТОТАОТТТААОАТАТТААТОСТСААААТТОТОСАТТООА ТТОСОТААААААОТОАААТОТАОСААОТАТТАТОААА 236
ΡΌδ ААААССАААООАААТААОТТАТАООТАООАААААТТОТТАТТОААОТТААТ ОТАОТАААСТАОТААСТТАААСТОТОАТАССССООАТТТАОСТТАААААОАО АТТОАТАОАСТАСТСАТАТСААСААООТОСАТСТТСТТТТСТАОООАОСССАТ ТТОСТААОААСТСТАСАОТТААОСОТОСТТООТООООАОСААТСТТАООАТО ООТОАССТССТОООААОТТТТССТОООТОСОСАСОООТОАООССАААОТОСО ТТАААААОАСТТОТОТТООТСТОТООООСТТОТСТАСАОТСТССАТОАОТАОТ САССООСООТАСОАОАООССООООТОТТАСАТАААСАОАСТСАААООСОСТ ААОССААОТАОССААТАОСААСАТОТОТООССТОСООАСАОТСАСАААААС АСАСААТТТСТТАТТТТТАСТСТСТТТТАТСТСТТТТАООСТТТАОССАТСААС ААТААААСААСАТОАТАААОСААТТСАТТТАСТОСТАААТТССААСААТТТО 237
67
029482
СТСССТТТТТССТОТТСТТТСАОТТТСАСАТАСССТСТТАТСААТСТАТАТССА АААСТАТТТСАТТТТССАААСТСТТТТАААСССАААААТСААААСТТТТОАТТ ОААОААСАААСТТТСООООТТТТООААААТОАОТСАТТТТООАТАТОСТТОТ ОСТАСТСААТССАСАТСААОАТАТОТТСТТТТАООАААТТСАААТААССССА СТТСААТТТСАТСТАТТООААОТОАТТТТТТОООТСАТТСТОТОАОАААТТТС АОТ
РРОХ ТООТАССТАСССТОТТТАСАТТТТСААТТТСССССТТТТТТСТСТАСТАСТССТ АСТТТАТТОАТТСТТАТССАТОТОТОТТСТАТОООААТТОАСАТТААТТОТТС АООТОТОТАТОСТООТОАТССТТСТААОТТОАОТАТОАААОСТОСАТТТООА ААООТСТООАССТТАОАОСААААОООТООТАОТАТСАТТОССООТАСАСТСА АААСТАТТСАСОАААООААСААТААТССТССАССОССТСОАОАСССОТССОТ ААТСАССАТТАСТСАТТОСТТТССТТСАССТТОТАТСТТАССТТААТАТАСАТО ТАТТТААТТОАТААТОТСАСАТТОССТСАТТТОСАОССОССТТССТАААССТА АОООССАОАСТОТТООАТССТТТАООАААОООСТСАТТАТОТТАССТАССОС САТТОСТОСТАООТАТСТТТТОАСТСТСАААТСТТАААТАТТТСТСАТСТТСТС СТТСТОСТААТАСТАОТАТОТТТАССАТСТТТТТАТТТТТТТАООСТТООСАОТ АААОТСАААСТАТСОТООАСАСТТТСТААТАТТОАТААОТСОСТСААТООТО ААТАСААТСТСАСТТАТСАААСАСССОАТООАССООТТТСТОТТАООАССАА АОСООТТОТСАТОАСТОТСССТТСАТАСАТТОСААОТАОССТОСТТСОТССОС ТСТСАОТОАОТАТСАТТСТТТССТТСАТТТСТТТТСОТТТАТТОТТОТССААТО ТСТТОТТАААСАССАОТТТООССТТОТОСТСОТОААТТАТООСТАСААТОТТА АСТОАТТСАООСАСТОТОООАОАТОССТААОТТТСТААААССТСТОСОСАТА АТОТТТОТТТООАТОТТАООААТТОСАТТОАААААТТОСТТТТОТОАТОТТОА ТОТТААТАССААТТАСААОТОТОТТСТТСААСТТСТОСААТАССТТОТТСОАО ТОАОСТТОАОООООТТТАОАТТАОТОТССААТОТОАААСТАОСАААТОААСТ ССААОСОСТОООАТАООТССТТОООАТООАОССССТОАТАСССААОАСАОТ АТТСАААСССТСТААОТАОАОТОАОАОАТСААООАААОАААСТОООТООТТ ССТСАААТСОТААААААТОААТАСАОТОТСАТОАТТОСТААТСТТАТСАСАА АТСОТААААААТОААТТАТООТСОАТТТТООАСТАТТТТТОООТСАТТТТОАО ТОААТСТСОААСТТАААААОСОАОТСТТСТАОСАОТТСТТОТТАСАОСОООО САТАСАТАСОТАССААТТТСОТТТТТТАСТАТТТОАОССТТТТСАСТОТТОТО ОССООТААТАТООААТАОТСТАОСАСТТСТОСОТОТОТАСААСТАОТАТТТА ТТОТААТТАТОТОАТСОСАСТТААСТСТСАОАТААААССТТААОСАСТААСА ТТТТОТТТТООТТОААООААТСАООАООАААОААААТТОАОООАТТТОТТОО ТАТАТАОАТТССТТТОТТТООАТААСААААТТООАОТООАОАОАТТТООААО СААСААТТТТАТАССОАТТАОТТСССАТТАСАСТТАТОТТСАТТАСААААТТТ СТССААААОТООАААОАТТТТОАОТОААААТОТТТТТТАТТТСТСТТССТСТС ССТТТСТТТСССТСТТАААСАААСААООАААОТТААТСТТАТСАТТССОТАСС ТТССССТТСТОТТСТТТТТТТТСТСТССААААТТСТТАТССТААСОТАОТОТТА ТТОТСАСТОТСТТАТОААСОАОААТТСТТТТСТТССТААТАСТОСТТОТОТТОС АСАОТСААТОАТТТАОСТАОАТСАТСТТТООТТАОСТАСТСААААТАТТТАСА ТААААТАСТТОТАОАААТАААТАССААТАООТСТТОТСААОААОТАОТТТСА АТОСТАТААОТТТТААССААТССТСААААТТТАСАССАТООАОАТАТСТОСО ОАТААОААСТАОТААСТОТАОСАОСТОТААСТОТТОСААТСАОТТТТАТООТ ТТОССТТОСАААТСАААСТТТООАТОТТОТТТОССТТАСААТТТОТТАСТАТТ АСОТСААОТТТАОТОТТСОСССТТСАСАТТОТАСТТТООТТТТТОТТТТССТТО СААТТТОСТСТТТОААОТАТАААОТОСТОАОТОСТОАОТОСТОАОТОСТОАС СТТТССТОСТСАООАТОТТОСТОСАОАТТСТСТТТСТСААТТТТАСТАТССАСС АОТСОСАОСАОТОТСССТТТСТТАТСССАААОААОСААТТАОАССАОААТОС ТТОАТСОАТООАОААСТААААООАТТСОООСААТТОСАТССТСОСАОССАОО ОТОТООАААССТТОООТАТАТОСТСССАТТСААСТАТАТСТСААТТТТТАТОА ОТАТТТТТСТТТСТСТОААТТАТТСААТТТООТОАСОТТАААТТТТОАТТОТАС ТСОАСАООААСААТТТАТАОТТСАТСТСТТТТСССТООТСОАОСАССАССТОО ТАООАССТТОАТСТТОАОСТАСАТТООАООТОСТАСАААТОТТООСАТАТТА СААААООСААОТСАТТТАТАСААТТАТАТСТОТТСТАТССТСАААТААСТОС ОТАТСААТССТОАСОАСАТОСТТОСТТОТАТСОАТОСАОАОТОААОАТОА 238
Пример 31
В этом примере показаны последовательности полинуклеотидов, регулирующих экспрессию генов у более чем одного вида растений. У различных видов сорных растений идентифицировали две высококонсервативных области последовательностей ΕΡ8Ρ8, показанные в табл. 23 как последовательности "Область 1" и "Область 2".
Таблица 23
Вид/ген или консенсусная последовательно СТЬ Область 1 8ЕЦ ГО ΝΟ: Область 2 8ЕЦ ГО ΝΟ:
ЕирЬогЫа_Ье1егорЬу11 а_1Контиг1 АСТТТАСАОООАОАТО ТАААОТТ 239 ТСОАТОТОААСАТОААСАААА ТОССАОАТОТСОСТАТОАСАТТ ООСТОТООТТО 251
ЕирЬогЬ1а_Ье1егорЬу11 а_2Контиг1 АОТТТОСАОООАОАТО ТОАААТТ 240 ТСОАТОТОААТАТОААСААААТ ОССАОАТОТТОСТАТОАСАТТА ОСТОТООТТОС 252
АтЬгоыайтй Да_1 Ко нтиг1 АОТТТАСАОООООАТС ТАААОТТ 241 ТСОАТОТТААСАТОААСААААТ ОССАОАТОТТОССАТОАСОСТТ ОСАОТСОТТОС 253
канатник_Т еофраста _1Контиг1 АОТТТОСАОООТОАТО ТААААТТ 242 ТТОАТОТСААСАТОААСААААТ ОССАОАТОТТОССАТОАСТСТС ОСТОТТОТТОС 254
ХатЫитЩгитапит _2Контиг1 АОТТТОСАОООТОАТО ТОАААТТ 243 ТТОАТОТСААСАТОААСААААТ ОССТОАТОТСОСААТОАСТСТТ ОСТОТООТТОС 255
1ротоеа_ЬеДегасеа_! ΚοηίήγΙ АОТТТАСАОООООАТС ТТААОТТ 244 ТТОАТОТСААСАТОААСААААТ ОССАОАТОТТОССАТОАСТСТТ ОСТОТАОТТОС 256
СНепороДшт_а1Ьит_ 1Контиг1 АОТТТАСАОООТОАТО ТААААТТ 245 ТТОАТОТСААСАТОААСААААТ ОССАО АТОТСОСААТОАСТСТТ ОСТОТТОТТОС 257
О1ёкапа_5апёшпаП8_ 1Контиг1 АОТТТОСАОООТОАТО ТОАААТТ 246 ТТОАСОТСААСАТОААСААААТ ОССТОАТОТСОСААТОАСТСТТ ОСТОТООТТОС 258
8еппа_оЬ1и81ГоПа_1К онтигЗ АСТТТАСАОООАОАТО ТААААТТ 247 ТТОАТОТСААСАТОААСААОАТ ОССАОАТОТТОССАТОАСОСТТ ОСТОТАОТТОС 259
Амарант_грязный/ам арант бугорчатый Е ΡδΡδ АОТТТАСАОООТОАТО ТААААТТ 248 ТСОАСОТСААСАТОААТААААТ ОССАОАТОТТОСТАТОАСТСТТ ОСАОТТОТТОС 260
Амарант Палмера Е Р8Р8 АОТТТАСАОООТОАТО ТААААТТ 249 ТСОАСОТСААСАТОААСАААА ТОССАОАТОТТОСТАТОАСТСТ ТОСАОТТОТТОС 261
амарант__Палмера_1К онтиг! АОТТТАСАОООТОАТО ТААААТТ 250 ТСОАСОТСААСАТОААСАААА ТОССАОАТОТТОСТАТОАСТСТ ТОСАОТТОТТОС 262
В табл. 24 перечислены 21-, 22-, 24-, 35-, 45- и 55-членные последовательности дцРНК-полинуклеотидов, сконструированные на основе консенсусной последовательности области 2 ΕΡ8Ρ8, таОАМОТсААсАТОААсААаАТСССаСАТОТМОСКАТОАСНсТЮСМСТТЧОТТОС
(8ЕО ГО N0:263).
- 68 029482
Таблица 24
Название Последовательность 8Е<2 го ΝΟ:
Консенсусная_21членная дцРНК Смысловая цепь: ААСАиОААСААААиОССАОАи Антисмысловая цепь: АисиоосдииииоиисАиоии 264 265
Консенсусная_22членная дцРНК Смысловая цепь: ААСАиОААСААААиОССАОАиО Антисмысловая цепь: САисиоосАииииоиислиоии 266 267
Консенсусная_24членная дцРНК Смысловая цепь: СААСАиОААСААААиОССАОАиои Антисмысловая цепь: АСАисиоосАииииоиисАиоиио 268 269
Консенсусная_35членная дцРНК Смысловая цепь: иСОАССиСААСАиОААСААААиОССАОАиоииОСи Антисмысловая цепь; АОСААСАисиоосАииииоиисАиоииоАСоисоА 270 271
Консенсусная_45членная дцРНК Смысловая цепь: исоАсоисААСАиоААСААААиоссАОАиоииосиАиоАсисиио Антисмысловая цепь: СААОАоисАиАОСААСАисиоосАииииоиисАиоииоАСоисоА 272 273
Консенсусная_55членная дцРНК Смысловая цепь: исоАСоисААСАиоААСААААиоссАОАиеииосиАиоАсисииос Аоииоииос Антисмысловая цепь: осААСААсиссААСАоисАиАОСААСАисиоосАииииоиисАиои иоАСоисоА 274 275
Консенсусные последовательности дцРНК-полинуклеотидов ЕРЗРЗ синтезировали транскрипцией ΐη уйго и использовали для наружного нанесения как препараты неочищенной РНК. Сорные растения, устойчивые к глифосату (16-копийные амарант Палмера и мелколепестничек канадский) обрабатывали шестью отдельно взятыми (21-, 22-, 24-, 35-, 45-, 55-членными) консенсусными последовательностями дцРНК; сорные растения, не обладавшие устойчивостью к глифосату (амарант грязный /амарант бугорчатый, сенну, росичку, ипомею, марь, молочай) обрабатывали тремя отдельно взятыми более короткими (21-, 22-, 24-членными) консенсусными дцРНК. После обработки полинуклеотидами растения, устойчивые к глифосату, обрабатывали глифосатом (1682 г кислотного эквивалента гербицида марки Ноипбир® \¥еа1НегМАХ® на гектар), а растения, не обладавшие устойчивостью к глифосату, обрабатывали глифосатом (105 г кислотного эквивалента гербицида марки Ноипбир® Шеа!НегМАХ® на гектар). На 7 сутки после обработки обнаружили, что все шесть консенсусных дцРНК-полинуклеотидов области 2 ЕРЗРЗ приводили к 100% контролю (гибели растений) амаранта Палмера, устойчивых к глифосату; контрольные растения амаранта Палмера, обработанные только глифосатом, не погибли. На 7 сутки после обработки обнаружили, что три более коротких (21-, 22-, 24-членных) консенсусных дцРНК-полинуклеотидов области 2 ЕРЗРЗ, протестированные по отдельности, приводили к 95%, 80% и 65% контролю амаранта грязного/амаранта бугорчатого (погибшие и поврежденные растения совместно) соответственно; растения амаранта грязного/амаранта бугорчатого, обработанные только глифосатом, позволяли получить приблизительно 40% контроль (погибшие и поврежденные растения совместно); а смесь всех трех более коротких (21-, 22-, 24-членных) консенсусных дцРНК-полинуклеотидов позволяла получить приблизительно такой же контроль, как и при обработке только глифосатом. Консенсусные дцРНКполинуклеотиды области 2 ЕРЗРЗ не оказывали видимого действия на другие протестированные виды сорных растений (амарант грязный/амарант бугорчатый, сенну, росичку, ипомею, марь, молочай).
Пример 32
В этом примере показано использование наружного нанесения полинуклеотида для временного сайленсинга гена растения с целью получения желательного фенотипа. Сайленсинг полифенолоксидазы в тканях растения ингибирует побурение разрезов или поврежденных тканей растения, что является ценным качеством для фруктов и овощей, у которых устойчивость к побурению представляет собой желательное качество.
Сконструировали антисмысловые ДНК-олигонуклеотиды, мишенями которых являлись три гена полифенолоксидазы (РРО1, РРО2 и РРО3) салата; последовательности олигонуклеотидов показаны в табл. 25; подчеркнутый текст обозначает последовательность Т7, включенную в антисмысловые полинуклеотиды.
Таблица 25
Антисмы еловые олигонук леотиды Последовательность (5'-3') 8Е<) 11) ΝΟ. Длина
ΗΗ07 ТААТАСОАСТСАСТАТАОООСТТТАТТОААТТТАОСТАТОТААТС 276 45
НН09 ТААТАСОАСТСАСТАТАОООТТТАТСААССАААТОТОСАОС 277 41
НН11 ТААТАСОАСТСАСТАТАОООТТОТСТОТАСАТААТТОТОАОАТТТОТОО 278 49
Трехнедельные растения салата (сорт ЗУК3603 Ь4) обрабатывали следующим образом. Два исходных листа (листья, являющиеся старшими и имеющие размер ~60% от размера созревшего листа) на каждом растении подвергали предобработке 0,1% (об./об.) Зй^е1-Ь-77 и оставляли сушиться (~15 мин). На каждый лист в виде мелких капель наносили 20 микролитров смеси антисмысловых полинуклеотидов к генам полифенолоксидазы в растворе 0,01% (об./об.) Зй^е! Ь-77 и 2% (мас./об.) сульфата аммония в 5миллимолярном фосфате натрия, рН 6,8; каждый лист обрабатывали 6,7 наномоль каждого из трех полинуклеотидов НН07, НН09 и НН11 (при общем количестве 20 наномоль на растение). Контрольные расте- 69 029482
ния обрабатывали либо неродственным полинуклеотидом НН02-05 (антисмысловым по отношению к фитоиндесатуразе), либо только буфером (0,01% (об./об.) διΐ\\Βί Ь-77 и 2% (мас./об.) сульфата аммония в 5-миллимолярном фосфате натрия, рН 6,8).
Приблизительно через 3 недели после наружной обработки полинуклеотидами "необработанные" листья салата (т.е. листья, не обработанные путем наружного нанесения полинуклеотидов) срезали с верхушки салата под водой и инкубировали в чашке с 1,33-миллимолярным метилжасмонатом в 5% этаноле. Листья инспектировали на предмет побурения центральной жилки и фотографировали каждые 24 ч. С оставшихся растений отбирали образцы и замораживали их для анализа малых РНК и мРНК.
Растения, обработанные антисмысловыми полинуклеотидами к полифенолоксидазе НН07, НН09 и НН11, демонстрировали значительное ослабление побурения центральной жилки после обработки метилжасмонатом. Растения, обработанные НН02-05 (антисмысловым полинуклеотидом к фитоиндесатуразе) в качестве контроля, демонстрировали незначительное ослабление побурения центральной жилки по сравнению с контролем, обработанным буфером.
Пример 33
В этом примере показана гербицидная композиция, приспособленная для наружного нанесения на растущее растение и включающая поверхностно-активное вещество и по меньшей мере один агент, вызывающий гибель растений, причем указанный агент, вызывающий гибель растений, включает полинуклеотиды, последовательность которых практически идентична или комплементарна последовательности гена растения или последовательности РНК, являющейся транскриптом гена растения, вызывающие системную супрессию гена растения. Конкретнее, в этом примере показана гербицидная композиция, приспособленная для наружного нанесения на растущее растение и включающая поверхностно-активное вещество и по меньшей мере один агент, вызывающий гибель растений, причем указанный агент, вызывающий гибель растений, включает полинуклеотиды, вызывающие супрессию генов эндогенной фитоиндесатуразы (ΡΌδ), 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ΞΡδΡδ) или рибулозо-1,5бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (КиВ18С0) №соЕапа ЬепЛапиапа. В этом примере также показано использование наружно наносимых полинуклеотидов для супрессии очень интенсивно экспрессирующегося гена (рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы) в организме растения. Антисмысловой полинуклеотид с последовательностью САТСТССТТТААТТСТАСТСС (8Е<) ГО N0:34) сконструировали для эндогенного гена фитоиндесатуразы (ΡΌδ) №соЕапа ЬепЛапиапа, содержавшего фрагменты последовательности кДНК
АТОССССАААТСООАСТТОТАТСТОСТОТТААТТТОАОАОТССААООТААТТСАОСТТАТСТТТООА
ОСТСОАООТСТТСОТТОООААСТОАААОТСААОАТОТТТОСТТОСАААООААТТТОТТАТОТТТТО
ОТАСТАССОАСТССАТСССССАТААОТТААОСАТТССТАСТССААОТОССАССАСССОААСАТТС
АСАААООАСТТТААТССТТТАААООТАОТСТОСАТТОАТТАТССААОАССАОАОСТАОАСААТАСА
ОТТААСТАТТТООАООСООСОТТАТТАТСАТСАТСОТТТСОТАСТТССТСАСОСССААСТАААССАТ
ТООАОАТТОТТАТТОСТООТОСАООТТТОООТООТТТОТСТАСАОСААААТАТСТООСАОАТОСТО
СТСАСАААСССАТАТТОСТОСАСССААОАОАТОТССТАОСТСООААООТАССТССАТООАААСАТ
ОАТОАТООАОАТТООТАСОАОАСТОООТТОСАСАТАТТСТТТООООСТТАСССАААТАТОСАОААС
СТОТТТООАСААСТАООСАТТОАТСАТСООТТОСАСТОСААССААСАТТСААТОАТАТТТОСОАТО
ССТААСААОССАООООАОТТСАОССОСТТТОАТТТТССТОААОСТСТТССТОСОССАТТАААТООА
АТТТТООССАТАСТАААСААСААССАААТОСТТАСОТООСССОАСАААСТСАААТТТССТАТТОСА
СТСТТОССАОСААТОСТТООАОООСААТСТТАТОТТОААОСТСААОАСООТТТААОТОТТААООАС
ТООАТОАОАААОСААООТОТОССТОАТАОООТОАСАОАТОАООТОТТСАТТОССАТОТСАААООС
АСТТААСТТСАТАААСССТОАСОАОСТТТСОАТОСАОТОСАТТТТОАТТОСТТТОААСАОАТТТСТТ
САООАОАААСАТООТТСАААААТООССТТТТТАОАТООТААСССТССТОАОАОАСТТТОСАТОССО
АТТОТОСААСАТАТТОАОТСААААООТООССААОТСАОАСТАААСТСАСОААТААААААОАТСОА
ОСТОААТОАООАТООААОТОТСАААТОТТТТАТАСТОААТААТООСАОТАСААТТАААООАОАТО
СТТТТОТОТТТСССАСТССАОТОСАТАТСТТОААССТТСТТТТОССТСААОАСТОСАААОАОАТССС
АТАТТТССААААОТТООАОААОСТАОТОООАОТТССТОТОАТАААТОТССАТАТАТООТТТОАСАО
ААААСТОААОААСАСАТСТСАТААТСТОСТСТТСАОСАОААОСССОТТССТСАОТОТОТАСССТОА
САТОТСТОТТАСАТОТААООААТАТТАСААССССААТСАОТСТАТОТТООААТТООТАТТТОСАСС
СССАОААОАОТОСАТАААТСОТАОТОАСТСАОАААТТАТТОАТССТАСААТОААСОААСТАОССА
АОСТТТТСССТОАТОАААТТТСООСАОАТСАОАОСАААОСАААААТАТТОААОТАТСАТОТТОТСА
АААССССААООТСТОТТТАТААААСТОТОССАООТТОТОААСССТОТСООСССТТОСАААОАТССС
СТАТАОАОООТТТТТАТТТАОСТООТОАСТАСАСОАААСАОААОТАСТТООСТТСААТООААООТО
СТСТСТТАТСАСОАААССТТТОТОСАСААОСТАТТОТАСАООАТТАСОАОТТАСТТСТТООССОСА
ОССАОААОАТОТТООСАОААОСААОСОТАОТТАОСАТАОТОААСТАА (8Е(? ГО N0:38).
Антисмысловые полинуклеотиды с последовательностями СТОТОАТСАТСАТАТОТАТСА (8Е(2 ГО N0:279), ссттаастстссаостаосаа (ЗЕО ГО N0:280),
САОСССОСАААТОТТТСАТТС (8Е0 ГО N0:281), ОССОТСААТООССОСАТТОСТ (ЗЕО ГО N0:282), тссттссстсасаааооосао (ЗЕ<3> ГО N0:283) и ттосстсатостостаатсто (8Е<2 ГО N0:284) сконструировали для эндогенного гена 5-еноилпирувилшикимат-Зфосфатсинтазы (ЕРЗРЗ) Νίοοΐΐαηα ЪепОктшта, основанного на последовательности кДНК ЕРЗР5 Νίβοΐίαηα Ъеп1капйапа
СТТАТАТОТОСТТААОССТААСОТОСАСССООССССТТААССССАОСАОТТТТСААТСТАССТАССС
ТСТСТАССАТТТТСТТСТАОТТСОТСААААТТТСТААСТТТОАОААААСААОССАААОТТТТТОТТТ
СТААОААСОСААААТОАОТОАААТТТТТТОСАОСААТООСАСАОАТТАОСАОСАТОАСОСААООО
АТАСАОАССССТААТСТГААТТССТАТТТТССТААААСССААААООТТССТСТТТТТТСОСАТТСТА
ТСТТСТТТООАТСАААОААААТААСССААААТТСАОСААААТСТТТОТОООТОТОТААОАААОАТТ
САОТТТТОАОООТООСАААОТСАССТТТТАООАТТТОТОСАТСАОТООССАСТОСАСАОААОСССА
АСОАОАТТОТОСТОСААСССАТСАААОАТАТАТСАООСАСТОТТАААТТОССТООТТСТАААТССС
ТТТССААССОТАТТСТССТТСТТОСТОСССТТТСТСАОООААООАСТОТТОТТОАСААТТТАСТОАО
ТАСТОАТСАСАТТСАТТАСАТССТТООТОССТТОААААСАСТТООАСТТСАТОТАОААОАТОАСАА
- 70 029482
ТОААААССААСОАОСААТТОТООААООТТОТООТОООСАОТТТССТОТСООСОАОААОТСТОАОО
ААОАААТССААСТАТТССТТООАААТОСАООААСАОСААТОСООССАТТОАСООСАОСАОТТАСТ
ОТАОСТООАООАСАТТСААОАТАТОТАСТТОАТООАОТТССТАООАТОАОАОАОАОАССОАТ
(ЗЕО Ιϋ N0:285),
САСТОАССТТССАТТАОАСОТАООСТССТТАТАТСТОСТТААСССТААССТОСАОСССОСССССАА
ССССАОСАОТТТТСААТСТАССТАССОТСТСТАССАТТТТСТТАТАОТАОТТОААААТТТСТААСТТТ
ОАОААААСААСССАААОТТТТСТТТСТААОААСАСАААСООАСТОАААТТТТТТОСАОСААТООС
АСАОАТТАОСАОСАТОАООСААОООАТАСАОАССССТААТСТТААТТССТАТТТТССТААААСССА
АААООТТССТСТТТТТТСОСАТТСТАТСТТСАТТООАТСАААОААААТААСССААААТТСАОСААА
АТСТТТОТОООТОТОТААОАААОАТТСАОТТТТОАОООТООСАААОТСАССТТТТАООАТТТОТОС
АТСАОТООССАСТОСАСАОААОССТААСОАОАТТОТОСТОСААССТАТСАААОАТАТАТСАООСА
СТОТТ АААТТАССТООТТСТАААТСССТТТССААТССТ АТТСТССТТСТТОСТОСССТТТСТОАОООА
АООАСТОТТОТТОАСААТТТАСТОАОТАОТОАТОАСАТТСАТТАСАТОСТТООТОСАТТОААААСА
СТТООАСТТСАТОТАОААОАТОАСААТОААААССААСОАОСААТСОТАОААООТТОТООТОООСА
ОТТТССТОТСООСААОААОТСТОАООААОАААТССААСТАТТССТТООАААТОСАООААСАОСАА
ТОСООССАТТОАСООСАОСАОТТАСТОТАОСТООТООАСАТТСТАОАТАТОТАСТТОАТООАОТТС
СТАООАТ (ЗЕО ГО N0:286) и
АААТТСТТООТТСОАООАООТСАОААОТАСААОТСТССТОСААААОСАТАТОТТОААООАОАТОС
СТСААОТОСТАОСТАСТТТТТООСОООТОСАОСТОТСАСАООТООААСТОТСАСТОТТОААООТТО
ТООААСААОСАОТТТАСАОООООАТОТТААОТТТОСТОАООТССТСОААААОАТОООООСАОААО
ТТАСАТООАСАОАОААСАОТОТСАСООТТАААООАССТССААООААСТСТТСТООААТОАААСАТ
ТТОСОООСТОТТОАСОТТААСАТОААСААААТОССАОАТОТТОССАТОАСТСТТОСТОТАОТТОСА
СТТТТТОСТОАТАОТССТАСТОССАТААОАОАТОТТОСТАОСТООАОАОТТААООАААСТОАОСОО
АТОАТТОССАТАТОСАСАОААСТТАООААОТТОООТОСААСАОТТОТАОААОООССАОАСТАСТО
САТААТСАСТССАССТОААААОТТААААОТАОСООАААТТОАТАСАТАТОАТОАТСАСАОААТОО
ССАТООСТТТСТСТСТТОСООСТТОТОСТОАТОТТССАОТСАССАТТААООАССССООТТОТАСТСО
СААААССТТССССААСТАСТТТОАСОТТСТССАОСАОТАТТССААОСАТТАААССАСТТТССАТТАА
ОААТТТТОАААААОАОАОАСТТТОАСААСААТООТОТСАТАССООААОАОААААОСТТТОАТССА
АОСТТТСААСТССТТТТСАТТТОТСАТОТОАТОАТСАТТОТАТТТОТТОААОТТОАОСТОСТТТТСТТ
ТТОТССАОААОАСАТОТАТООАТАСТАТТ АСТАТ АТАОТТААООТОААСТСАОСА (ЗЕО ГО
N0:287). Антисмысловые полинуклеотиды с последовательностями
ССАСАТООТССАОТАТСТОСС (АК 195, КВС81 -2-3-4, ЗЕО ГО N0:288), сааосааооаасссатссатт (АК 196, КВС81-2-3-4, 8Е0 ГО N0:289), ооссасасстосатосаттос (АК 197, КВС81-2-3-4, ЗЕО ГО N0:290), ототтсасоотаоасааатсс (АК 198, КВС81-2, ЗЕО ГО N0:291), тосастосасттоасосасот (АК 199, КВС81-2, 8Е0 ГО N0:292), аастоатосаттосасттоас (АК 200, КВСЗЗ-4, 8Е0 ГО N0:293),
САААТСАООААООТАТОАОАО (АК201, КВС5 3-4, 8Е0 ГО N0:294), и ТОТСААООТТТТОТТТССТОО (АК202, КВС83-4, 8Е0 ГО N0:295) сконструировали для эндогенного гена рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (КиЕНзСО)
Νΐϋοίίαηα Ъеп1кагтапа, основанного на фрагментах последовательности кДНК малой цепи 2А КиВкСО хлоропластов Νΐοοίΐαηα Ъеп1кагтапа
ОСААТООСТТССТСАОТТСТТТССТСАОСАОСАОТТОССАСССОСАОСААТОТТОСТСААОСТААС
АТООТТОСАССТТТСАСАООТСТТААОТСТОСТОССТСАТТСССТОТТТСААОАААОСААААССТТО
АСАТСАСТТССАТТОССАОСААСООСООААОАОТОСААТОСАТОСАООТОТООССАССААТТААС
АТОААСААОТАТОАОАСТСТСТСАТАССТТСССОАТТТОАОССАООАОСААТТОСТСТССОАААТТ
ОАОТАССТТТТОААОААТООАТОООТТССТТОСТТООААТТСОАОАСТОАОАААООАТТТОТСТАС
СОТОААСАССАСААОТСАССАООАТАСТАТОАТООСАОАТАСТООАССАТОТООААОСТАССТАТ
ОТТСООАТОСАСТОАТОССАСССААОТОТТООСТОАООТОООАОАООСОААОААООААТАСССАС
АООССТОООТССОТАТСАТТООАТТТОАСААСОТОСОТСААОТОСАОТОСАТСАОТТТСАТТОССТ
ССААОССТОАСООСТАС (ЗЕО ГО N0:296),
АСААТООСТТССТСАОТТСТТТССТСАОСАОСАОТТОССАСССОСАОСААТОТТОСТСААОСТААС
АТООТТОСАССТТТСАСТООТСТТААОТСАОСТОССТТТТТСССТОТТТСААООААОСААААССТТО
АСАТСАСТТССАТТОССАОСААСООСООААОАОТОСААТОСАТОСАООТОТООССАССААТТААС
ААОААОААОТАСОАОАСТСТСТСАТАССТТССТОАТСТОАОСОТООАОСААТТОСТТАОСОАААТТ
ОАОТАССТСТТОАААААТООАТОООТТССТТОСТТООААТТСОАОАСТОАОСССООАТТТОТСТАС
СОТОААСАССАСААОТСАССОООАТАСТАТОАСООСАОАТАСТООАССАТОТООААОТТОССТАТ
ОТТСООАТОСАСТОАТОССАСССААОТОТТООССОАООТООААОАООСОААОААООСАТАСССАС
АООССТООАТССОТАТТАТТООАТТСОАСААСОТОСОТСААОТОСАОТОСАТСАОТТТСАТТОССТ
АСААОССАОААСОСТАС (ЗЕО П> N0:297)
СААОССААСАТООТТОСАСССТТСАСТООССТСААОТССОССТССТССТТСССТОТТАССАООААА
СААААССТТОАСАТТАССТССАТТОСТАОСААТООТООААОАОТТСААТОСАТОСАООТОТООССА
ССААТТААСАТОААОААОТАСОАОАСАСТСТСАТАССТТССТОАТТТОАОССАООАОСААТТОСТТ
АОТОААОТТОАОТАССТТТТОАААААТООАТОООТТССТТОСТТООААТТСОАОАСТОАОСОТООА
ТТСОТСТАСССТСААСАССАСААСТСАССАООАТАСТАССАТООСАОАТАСТООАССАТСТСОАА
ОТТОСССАТОТТСОООТОСАСТОАТОССАСТСАООТОТТООСТОАООТСОАООАООСАААОААОО
СТТАСССАСААОССТОООТТАОААТСАТТООАТТСОАСААСОТССОТСААОТОСААТОСАТСАОТТ
ТТАТСОССТССААОССАОААООСТАС (ЗЕО П> N0:298), И
ООСТСАОТТАТОТССТСАОСТОССОСТОТТТССАССООСОССААТОСТОТТСААОССАОСАТООТС ОСАСССТТСАСТООССТСААООССОССТССТССТТСССООТТТССАООАААСААААССТТОАСАТТ АСТТССАТТОСТАОАААТООТООААОАОТССААТОСАТОСАООТОТООССОССААТТААСААОАА ОААОТАСОАОАСАСТСТСАТАССТТССТОАТТТОАОСОТООАОСААТТОСТТАОСОАААТТОАОТА ССТТТТОАААААТООАТОООТТССТТОСТТООААТТСОАОАСТОАОСАТООАТТСОТСТАССОТОА АСАССАССАСТСАССАООАТАСТАСОАТООСАОАТАСТООАСОАТОТООААОТТОСССАТОТТСО ООТОСАССОАТОССАСТСАООТСТТООСТОАООТАОАООАООССААОААООСТТАСССАСААОСС ТОООТСАОААТСАТТООАТТСОАСААСОТССОТСААОТОСААТОСАТСАОТТТСАТСОССТАСААО СССОААООСТАТ (8Εζ) ГО N0:299).
Растения Νΐοοίΐαηα ЪеШИапчапа обрабатывали согласно процедуре, аналогичной описанной в примере 12. Растворы полинуклеотидов (или смешанные полинуклеотиды в случае ΕΡδΡδ и КиВ1зС0) изготовили, используя 0,01% (об./об.) δΐΐ^ί Ь-77 и 2% (мас./об.) сульфат аммония в 5-миллимолярном фосфате натрия, рН 6,8. Два полностью развившихся листа на каждое растение погружали в свежеприготовленный раствор 0,1% δίΐνοΊ Ь-77 в бидистиллированной воде на несколько секунд и оставляли сушиться. Приблизительно через 30 мин на каждый из двух предобработанных листьев наносили 20 микролитров раствора полинуклеотида. В эксперименте с ΡΌδ каждое из 5 растений обрабатывали 25 наномоль ΡΌδантисмыслового полинуклеотида (δΕρ ГО N0: 34); в эксперименте с ΕΡδΡδ каждое из 5 растений обрабатывали 50 наномоль каждого ΕΡδΡδ-антисмыслового полинуклеотида (δΕρ ГО Ν0δ:279-284); а в эксперименте с КиВ1зС0 каждое из 5 растений обрабатывали 50 наномоль каждого КиВ1зС0антисмыслового полинуклеотида (δΕρ ГО Ν0δ:288-295). Парные контрольные растения обрабатывали буфером (0,01% (об./об.) δΐΐ^ί Ь-77 и 2% (мас./об.) сульфата аммония в 5-миллимолярном фосфате натрия, рН 6,8). Результаты, измеренные как высота растений на 12 сутки (ΡΌδ и ΕΡδΡδ) или 10 сутки (КиВ1зС0) после обработки, показаны на фиг. 36А-36В. Растения, обработанные ΡΌδ-антисмысловыми
- 71 029482
полинуклеотидами, демонстрировали значительное замедление роста (фиг. 36 А) и обесцвечивание. Растения, обработанные ΕΡδΡδ-антисмысловыми полинуклеотидами, демонстрировали значительное замедление роста (фиг. 36В) и тяжелые повреждения меристемы и тканей стебля. Растения, обработанные РиЫзСО-антисмысловыми полинуклеотидами, демонстрировали значительное замедление роста (фиг. 36С) и деформированные верхушечные ткани.
Целью второго набора экспериментов являлось исследование эффектов сайленсинга компонента эндогенного пути сайленсинга ΡΝΑί у растений. Белки Аг§опаи1е (АОО) являются компонентами РНКиндуцируемого комплекса сайленсинга (Ы8С), связывающими малые РНК в процессе ΡΝΑίсайленсинга. Следует ожидать, что супрессия Аг§опаи1е снизит наблюдаемый фенотипический эффект, вызываемый процессом ΡNΑ^-сайленсинга. АОО1-антисмысловые полинуклеотиды с последовательностями
ООАООСААААТАСОАОССТСА (НЬ510, 8ЕО ГО N0:300),
САСТААТСТТААТАССАААСТ (НЬ511, 8Е<2 ГО N0:301), ТАТСССТСАТТАССАТАОССАТТАТ (НЬ512, 8Е<2 ГО N0:302), тстсааоаататсасостссс (НЕ513, 8Е() ГО N0:303),
СССТТООООАСОСТООСАООТСАС (НЬ514, 8Е<2 ГО N0:304),
ТААТАСОАСТСАСТАТАОООООАОАОАОСТАОАТСТТТТО (НЬ515,8ЕЦ ГО N0:305), ТААТАСОАСТСАСТАТАООСАСАОТАТТТСТТССТССААСС (НЬ516, 8ЕЦ ГО N0:306),
ТТОСТСАТСТТАААТАСАТОТ (НЬ517, 8Е(^ ГО N0:307), ТСАТСТТАААТАСАТОТТТТСТСА (НЬ518, 8Е<2 ГО N0:308), ттатсттсаоооатасаттаос (НБ519, 8Е(} ГО N0:309), ААТАСТОСТТОСТСАТСТТАААТА (НЬ520, 8ЕЦ ГО N0:310), ОАСААТТССААОТТСАОТТТС (НЬ521, 8Е<2 ГО N0:311), ССОТТТТАОАТСАССАТАААОАОА (НЬ522, 8Е<2 ГО N0:312),
ТТОТСТООТААТАТСАСААТС (НЬ523, ЗЕ<2 ГО N0:313)
сконструировали для эндогенного гена Аг§опаи1е-1 (АОО1) №сойапа Ьеп1йаш1апа на основе двух частичных кДНК-последовательностей АОО1-2 №сойапа Ьеп1йаш1апа,
АТООТОАООААОАООАОААСТОАОТТАССТООТТСТООТОАОАОСТСТОООТСТСААОАААСТОО
СООАСАОООТСОТООССАОСАТССАСАОСАОСТОСАССААОСТАССТСССАОАСТССАТАТСААА
СТОСААТОАСТАСТСАОССААТАССТТАТОСААОАССААСТОАААСАТССТССОААОСТООТТССТ
САТСТСАОССАССТОАОСАООСАОСТСТАСААОТОАСАСААСАОТТССАОСААСТТОСТТТОСААС
ААОААОСООСТАСААСОСААОСАОТТССАССТОСАТСААОСАААТТАСТААООТТТССССТ ОСОТС
САОООААООООАОСААТООТАТОАОАТОСАТАОТСАААОССААТСАСТТСТТСОСАОАОСТОССТ
САСАААСАСТТОСАССАОТАТОАТСТСАСААТТТСТССАСАООТОТСАТСАССТСОСОТСААССОТ
ОСТОТСАТООСОСААСТООТОААОСТОТАССААОААТСТСАТСТТОООААОАОАСТТССАОСАТАТ
ОАТСОААООААААСТСТАТАСАСТОСАОООССССТТССАТТТОТТСАААААОАСТТСААААТААСТ
СТТАТТОАТОАТОАООАТОООССТООТООТОСТАОААОООАААОООААТТТАААОТТОТОАТСАА
АТТООСТОСССОТОСТОАТСТТСАТСАСТТОООААТОТТТТТАОААОООАААСАООСТОАТОСАСС
ТСААОАООСОСТТСААОТТСТООАТАТТОТТСТОСОТОАОТТОС'СААСАТСТАООТТТТОТССТОТО
ООТСОТТСТТТСТАТТСССОТОАТТТАОООСОАААОСААССАТТОООТОААООТТТАОАААОТТОО
СОТОООТТСТАТСАААОСАТТСОССССАСАСАААТОООСТТАТСАСТОААСАТСОАТАТОТСТТСС
АСТОСАТТСАТТОАОССАСТОССАОТСАТТОАТТТТОТОАСАСАССТТСТОААССОАСАТОТОССА
- 72 029482
ТСТАСАССАСТОТСТОАТОСТООССОТОТАААОАТАААААААОСТСТОАОАООТОТСААООТООА
ООТТАСТСАТССТСОАААТАТОСООАООААОТАССОСАТТТСОООТТТААСАТСТСААОСААСАА
САСАСТТОАССТТСССТСТТСАТОААААТОСТАСАСТОАААТСТОТААТТОАОТАТТТТССАСААА
САТАТООСТТТОТААТТСАОСАТАСТСАОТООССТТОТСТАСААОТТООАААТСАОСАОАОАССТА
АТТАСТТОССААТООААОТСТОСААОАТТОТООАОООАСАААСОТАСТСАААОСОСТТОААТОАС
АОАСАОАТТАСТОСАСТТСТОАААОТОАССТОССАОСОТССССААОООАОООАОСОТОАТАТТСТТ
ОАОАСССТАСАТСАТААТОССТАТССТААТСАСССАТАТОССААСОАСТТТСОТАТТААОАТТАСТ
САСААСТТОССАСААСТТСАСССТСОТАТТТТОССТССАССТССССТТАААТАТСАТСАТААСССТ
СОАСААААССАСТСССТСССАСААСТТОСССААТСОААТАТСАТСААТААСААААТССТАААТСС
АСООАСООТОААСААТТООАТСТОСАТАААСТТСТСТСОСААТОТОСААОАТАСТОТТССТСАТОО
ОТТТТОСТСТОАОСТТССАСАААТОТОССАОАТАТСТООСАТОААТТТСААТССАААТССТОТТСТО
ССАССТТСОАОТОСАСОСССТОАТСАООТСОАААОАОТАТТОААААСТСОАТТТСАТОАТОСТАТО
АСТААСТТОСАОСТОСАТОООАОАОАОСТТОАТТТОСТАОТТСТСАТСТТСССАОАСААТААТООА
ТСТСТТТАТООТОАТСТОААОСОСАТТТОТОАОАСТОААСТАООАОТСОТСТСАСАОТОСТОТТТО
АСААААСАТСТАТТТААОАТОАОСАААСАОТАТСТАОССААТОТАССОСТСААААТСААТСТОАА
ООТОООАОООАОАААСАСТОТОСТТОТТОАТОСААТАТСОАООСОААТТССТСТТОТСАОСОАСС
ООССТАССАТСАТТТТТООТССАОАТОТСАСССАСССТСАСССТОСООАООАСТСТАОСССАТССА
ТТОССССООТООТТОСТТСТСААОАТТООССТОАОАТТАСАААОТАТОСТООТСТАОТТТСТОСТСА
АССССАТАООСААОАОСТТАТТСАООАТСТОТАСАСОАСТАООСААОАТССТОТТААООООАСАО
ТТОСТССТООААТСАТТААСОАСТТАСТТАТАТССТТСССААОАОСТАСТСОАСААААОССССАСА
ОААТААТТТТСТАТАОСОАТООТО1ТАСТОААОСАСААТТТТАТСААОТОСТТСТОТТСОААСТТС
АТОССАТССОСАААССАТОТССОТСТТТСОАСССАААТТАТСАОСССССАОТСАСАТТТОТТОТОО
ТТСАОАААСОАСАТСАСАСААООСТТТТТОССААТААССАССОТОАСАОАААТОСАОТТОАСАОО
АСССООААСАТТАТАССТООТАСТОТТСТАОАТТСАААСАТАТОССАСССОАСАОАСТТТОАТТТС
ТАТСТТТОТАОССАТОССООСАТАСАОООТАСОАОССОТССАОСТСАСТАССАТОТТСТАТСООАС
ОАОААСАААТТСАСАОССОАТОСОСТОСАОТСТТТОАССААСААССТСТССТАТАСАТАТОСААСО
ТССАСОСОТТССОТСТССАТСОТТСССССТОСАТАТТАТССАСАТТТООСАОСТТТСССТОСТСОАТ
ТТТАТАТООАОССООАОАСАТСТОАСООТООТТСАОТААСААОТООСОСТОСТООТООСАОАООО
ООТООТОСАООАОСТОСТОСААООААСАСССОАОССССААОТОСТОСТОСТОСТОТТАОАССТСТ
ТССТОСОСТСААООАТААТОТОААОАОООТТАТОТТСТАСТОС (8ЕЦ ГО N0:314) И
САССТАТСАСТСТСТТТСТСТСТСТАСАААСАТАТСОТОССОТТТСТСТСТСООССТСТСТТСОТОТТ
ТТАОООСАССОТСОТООТТООТАТССАСОСООСОСТТТТОАОТТАТТАССАТООТОСООААОААОА
ООАСТОАТОТТССТООТООТОСТОАОАОТТТТОАСТСССАТОАААСТООАООСССАСОАОСТООТ
ОСССААСОСССАТСАСАОСАОСАССААСАТСАОСАТСАОСААООССОАООААСАООСТОСССАС
СТСАОСАТСОАООАСАТООТООССОТООТОСТОООООАОСТССАСОТООТООААТООССССТСАА
СААТССТАТООТСОАССТССТОААТАСТАССААСАОООСАООООААСТСААСАОТАТСААСОАСО
ТООАООАСААССССАОСОССОТООТООСАТООООООССОТООООСАСООССАССАОТАСССОАОС
ТОСАССАА ОС ААСССАОАСТССАСАТСАОССТОТАССАТ АТООААОАССАТСАСАААСАТАСТСА
ОАООСТОСТТССТСОТСТСАОССАССТОААССААСОАСАСАОСААОТОАСТСАОСААТТССАОСА
АСТТОТТОТОСАСССАОААОСАОСТОСААСССААОСААТАСААССАОСАТСОАОСААОТСОАТОА
ООТТТССАСТССООССАООАААОСОТАОТАСТООТАТТАОАТОСАТАОТТААООССААТСАСТТСТ
ТТОСССАСТТАССТСАСАААСАТСТССАССАСТАТОАТОТТТСААТТАСТССТОАСОТССССТСТС
ОСООТОТСААССООСССОТСАТООАОСАОСТООТОААОСТТТАТАОАОААТСССАТСТТОООААО
АООСТТССАОССТАТОАСООААОАААААОТСТАТАСАСАОСАССОССССТСССТТТТОТТСААААО
САТТТТААААТСАСТСТААТТОАТОАТСАТОАТССАССТССТССТССТАССАСССАААОАОАСТТТ
АААОТТСТОАТСААОСТООСООСТСОТОСТОАТСТТСАТСАСТТССООАТОТТСТТАСААОООАОА
САООСТОАТОСАССССААОААОСАСТТСАООТОСТООАТАТТОТОСТАСОТОАОТТОССААСАТСТ
АОСТАТТСТССТОТОООССОСТСТТТСТАТТССССТСАТТТАООАСОААОАСААССАСТОООТОАА
ООТТТАОАОАОСТООСОТОССТТСТАТСАААОТАТТСОТССТАСАСАОАТОООАТТАТСССТОААТ
АТТОАТАТОТСТТССАСООСТТТСАТТОАОССАСТОССОАТТАТТОАСТТСОТСАОССАОСТТСТОА
АТСОООАТАТСТСТТСТАОАССАСТСТСТОАТОСТОАССОСОТТААОАТАААОААООСАСТОАОАО
ОТОТАААООТОООООТСАСТСАТСОТООАААТАТОСООАООААСТАТСОСАТТТСТООСТТОАСОТ
СТСААОСААСААОАОАОТТОАСТТТТССТСТСОАТОАААООООТАСОАТОАААОСТОТТОТООАА
ТАТТТТСССОАААССТАТССТТТТСТСАТТСОССАТАСССАСТССССТТСТСТТСААСТТССАААТА
СОСАОАООССАААТТАСТТОССААТОСААОТАТОТААОАТТОТАОАОООАСАОАОАТАСТСАААО
СОСТТОААТОАОАООСАОАТААСАОСАСТТСТААААОТОАССТСССААСОТССТСААОАОАОАОА
АСОТОАТАТТСТТСАОАСТОТТСАТСАСААТОСТТАТОСТОАТОАСССАТАТССОААООАОТТТОО
ТАТТААОАТСАСТСАОСАССТТОСТСААОТТСАСОСТСОССТТТТСССТССАССТТСССТТАААТА
ССАТОАТАСАОСТСОАОАСАААОАСТОТСТОССАСААОТСООССАОТООААТАТОАТОААТААОА
АААТООТТААТСОАСОААСАОТОААСААСТООАТСТСТОТАААСТТТТСТСОСААТОТССААОАС
АСАОТТОСАСОТООАТТТТОТТССОАОСТТОСАСАААТОТОСАТОАТАТСССОААТОААСТТСААТ
СССААТССТОТТСТАССАССАОТОАОТОСТСОСССТОАТСААОТТОАОАОАОТСТТОААААСТСОА
ТТТСАСОАТОСТАТОАСАААОТТОСАОССАААТОООАОАОАОСТАОАТСТТТТОАТТОТСАТАТТА
ССАОАСААТААСООСТСТСТТТАТООТОАТСТААААСООАТТТОТОАААСТОААСТТООААТТОТС
ТСАСААТОСТОСТТОАСААААСАТОТАТТТААОАТОАОСААОСАОТАТТТАОСТААТОТАТСССТО
ААСАТ АААТОТОААООТТОСАООААОАААТАСТОТОСТСОТТОАТОСОСТСТСТАОАСОААТТСС
ССТТОТСАОСОАССОСССААСТАТСАТТТТТООТОСАСАТОТСАСССАТССССАСССТООООАООА
ТТСТАОСССОТСААТТОСТОСООТООТТОСТТСТСААСАТТООССТОАААТТАСАААОТАТОСТОО
ТТТООТТТСТОСТСААОСОСАТАООСААОАОСТТАТАСААОАТСТОТАСААОАСТТООСААОАТСС
АОТТАОАООАССТОТОАСТООТСОСАТОАТАААООААТТАСТТАТТТССТТССОТСОАОСААСТОО
АСАОААОССОСАОАОААТТАТАТТСТАСАОАОАТООТОТТАОТОААООАСААТТТТАССААОТТСТ
ТСТТТТТСААСТТСАТССААТССССААООСАТСТССАТСТТТАОААСССААСТАТСАСССССССОТТ
АСОТТТОТТОТООТССАОАААСООСАТСАТАСТАООТТОТТТОССААТААССАССАСОАСАОАААТ
ОСАСТТОАТСССАСТОССААСАТТТТОССТССТАСССТТСТАСАТТСАААСАТАТСССАСССТАСТ
СААТТТОАТТТСТАТСТСТСТАСССАТОСССССАТАСАООСТАСТАСССОСССАССТСАТТАТСАТ
ОТТСТОТСООАТОАОААСААТТТТАСТОСТОАСОСССТОСАОТСТТТОАСТААСААТСТТТОСТАТА
САТАТССТАООТСТАСТСОТТСТСТСТССАТТОТТССАССАОСАТАТТАТССАСАТТТСССАССТТТ
СССТОСТСООТТТТАСАТООАОССАОАОАСАТСТОАТААТООАТСАОТСАСААОСССАОСТССТТС
АААСАОАООАООТТТАООАОСТАТОООААООАОСАСОСОАССАССАООТОСТООТОСТОСТОТАА
ОСССССТТССТОСТСТСААООАОААТОТТААОАСООТТАТОТТТТАТТОТ (8ЕЦ ГО N0:315).
Растения Хкойапа Ьеп1Наш1апа обрабатывали согласно процедуре, аналогичной описанной в примере 12. Растворы полинуклеотидов (или смешанные полинуклеотиды в случае ΑΟΟ1) изготовили, ис73
029482
пользуя 0,01% (об./об.) διϊ\\υί Ь-77 и 2% (мас./об.) сульфат аммония в 5-миллимолярном фосфате натрия, ρΗ 6,8. Два полностью развившихся листа на каждое растение погружали в свежеприготовленный раствор 0,1% διϊ\\χΊ Ь-77 в бидистиллированной воде на несколько секунд и оставляли сушиться. Приблизительно через 30 мин на каждый из двух предобработанных листьев наносили 20 микролитров раствора полинуклеотида. В эксперименте с ΡΌδ каждое из 5 растений обрабатывали 25 наномоль ΡΌδантисмыслового полинуклеотида (δΕρ ГО ΝΟ: 34); в эксперименте с ΑΟΟ1 каждое из 5 растений обрабатывали 50 наномоль каждого из 14 Α0Ο1-антисмысловых полинуклеотидов (δΕρ ГО ΝΟδ:300-313); при объединенной обработке ΡΌδ и ΑΟΟ каждое из 5 растений обрабатывали 25 наномоль ΡΌδантисмыслового полинуклеотида (δΕρ ГО ΝΟ: 34), а 50 наномоль каждого из 14 Α0Ο1-антисмысловых полинуклеотидов (δΕρ ГО ΝΟδ:300-313) наносили на отдельные листья. Парные контрольные растения обрабатывали буфером (0,01% (об/об) διϊ\\υί Ь-77 и 2% (мас./об.) сульфата аммония в 5-миллимолярном фосфате натрия, ρΗ 6,8). Различий между растениями, обработанными Α0Ο1-антисмысловыми полинуклеотидами и растениями, обработанными только буфером, не наблюдали. Растения, обработанные ΡΌδантисмысловыми полинуклеотидами, демонстрировали системное обесцвечивание. Растения, обработанные и ΡΌδ-антисмысловыми полинуклеотидами, и раздельно наносимыми Α0Ο1-антисмысловыми полинуклеотидами, не демонстрировали системного обесцвечивания, указывая на то, что супрессия ΑΟΟ1 блокировала системное распространение сигнала сайленсинга.
Пример 34
В этом примере показан способ для индукции системной регуляции эндогенного гена-мишени растущего растения, включающий нанесение на листья указанного растущего растения полинуклеотидов, последовательность которых практически идентична или практически комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов указанного эндогенного гена-мишени или матричной РНК-транскрипта указанного эндогенного гена-мишени, причем указанные полинуклеотиды проникают во внутренние ткани указанного растущего растения и индуцируют системную регуляцию указанного эндогенного гена-мишени. Конкретнее, в этом примере показано использование композиции, включающей поверхностно-активное вещество и полинуклеотиды для по меньшей мере временной индукции системной регуляции эндогенного гена 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ΕΡδΡδ) 2еа тауз.
Геномную последовательность эндогенного гена 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ΕΡδΡδ) 2еа тауз идентифицировали как
АССТАСТТСССССТСОССССТСТСАТООТСТСТСТСОСОСССАОАТСТССТАСТАСАСООСАССОСТ
ОСАОСОСОТССТОТСОСОООООТТООТООСАООСАОСОАОАОСТТОССОТТССТСТСТСТСАОТТО
ТСАООТССТАООСТСАССТСАССООСТСССАОСССОСТТСТАТТТСТТССТССССОАССССОТОСАО
ОТООСАОТССАОТССАСОССАССААССОСОАООСОААССАААССААСССАСТСТССССААССССО
СОСОСССАСОССОСССОСССТАССААССАТСООСОТСООСААТСОСООССАТООСОАССААООСС
СССОСОООСАССОТСТСССТСОАССТСОССОСОССОССОССОССОССАОСОСССОССОСССТССА
СССОСОТССССАОСАОАТСОТОСТОСАОСССАТСААСОАОАТСТСССССАСССТСААОСТССССО
ООТССААОТСОСТТТССААССОСАТССТССТОСТСОССОСССТОТССОАСОТОАСССАТТТТООТС
СТТОСТОСОСТОСССТОТСТСАСТОСТАССТАААТОТТТТОССТОТСОААТАССАТООАТТСТСООТ
ОТААТССАТСТСАСОАТСАОАТССАССОСАТОТСССАТОССТАОСТСТСТСТААТТТОТСТАОТАОТ
ТТОТАТАССОАТТААТАТТОАТАААТСООТАССОСААААОСТАООТОТАААТАААСАСТАОАААА
ТТООАТОТТССССТАТСООССТОТАСТСООСТАСТСОТТСТТОТОАТООСАТОСТОТСТСТТСТТОСТ
ОТТТООТОААСААССТТАТОАААТТТОООСОСАААОААСТСОСССТСААОООТТОАТСТТАТОССА
ТСОТСАТОАТАААСАОТОСАОСАСООАСОАТССТТТАСОТТОТТТТТААСАААСТТТОТСАОАААА
СТАОСАТСАТТААСТТСТТААТОАСОАТТТСАСААСАААААААООТААССТСОСТАСТААСАТААС
ААААТАСТТОТТОСТТАТТААТТАТАТОТТТТТТААТСТТТОАТСАООООАСААСАОТООТТОАТАА
ССТОТТОААСАОТОАООАТОТССАСТАСАТОСТСООООССТТОАООАСТСТТОСТСТСТСТСТСОА
АОСОСАСАААОСТОССААААОАОСТСТАСТТОТТООСТОТСОТССАААСТТСССАСТТОАСОАТТ
СТАААОАСОААОТССАОСТСТТСТТОООСААТССТОСААСТОСААТССООССАТТОАСАОСАОСТ
ОТТАСТОСТОСТООТООАААТОСААССТАТОТТТССТСТСТТТСТСТСТАСААТАСТТОСТОСАОТТ
АОТАТОАААСССАТОООТАТОТСТАСТООСТТАТОСТОТАТТОСТТТТТОААСТТСАОТТАСОТОСТ
ТОАТСОАОТАССААОААТОАОСОАОАОАСССАТТОССОАСТТСОТТОТСООАТТОААОСАССТТО
ОТОСАОАТОТТОАТТОТТТССТТООСАСТСАСТОСССАССТОТТСОТОТСААТООААТСООАОООС
ТАССТООТСССААОСТТАССТАСТААООСССАСАТСТТАСАТТСТТСТСТАААТСОТАСААСТАТТ
СТССАОСТТТТОСАТТТСТААООАААОСАТТОАТТОАТСТОААТТТОАТССТАСАССАСААААТАТ
ССТАСАААТОСТСАТСССТААСТАОСАААСААТОААОТААТАСТТОССАТОТОТТТАТСАААТТАА
ТТТССАТСТТСТООООСАТТОССТОТТТТСТАОТСТААТАССАТТТОТТТТТАОСАТТААТТАОСТСТ
ТАСААТТОТТАТОТТСТАСАОСТСААОСТСТСТСОСТССАТСАОСАОТСАОТАСТТОАОТОССТТСС
ТОАТСОСТОСТССТТТООСТСТТОСООАТОТОСАСАТТОАААТСАТТОАТАААТТААТСТССАТТСС
СТАССТСОАААТОАСАТТСАСАТТОАТООАОСОТТТТООТОТОАААОСАОАОСАТТСТОАТАОСТО
СОАСАОАТТСТАСАТТААОООАООТСАААААТАСААОТААОСТСТОТААТОТАТТТСАСТАСТТТО
АТОССААТОТТТСАОТТТТСАОТТТТССАААСАОТСОСАТСААТАТТТОААТАОАТОСАСТОТАОА
- 74 029482
АААААААТСАТТССАОООАААААСТАСТАСТОАСТАТТТТОАСТОТАААТТАТТТТАССАСТСОСА
АТАТАОТСАОТСТАТТООАСТСААОАСССТОААССОАААТАСССАОТТААТТАТСССАТТАТАСАО
АСОАСААССАТОТАТАСТАТТОАААСТТООТТТАТААОАОААТСТАООТАОСТООАСТСОТАОСТС
АТОТОТОААССТОСТТСТСТАТТОСТТТАОААООАТАТАТСТАТОТСОТТАТОСААСАТОСТТСССТ
ТАСССАТТТСТАСТОАААТСАСТТТСАТААСТТССТТАОТССТТСССТАААСОАААССТТОТТТТТС
ТТТОСААТСААСАОСТССССТАААААТСССТАТСТТСААССТОАТСССТСААССССААССТАТТТС
ТТОССТОСТОСТОСААТТАСТООАООСАСТОТОАСТСТООААООТТОТООСАССАССАОТТТОСАО
СТАААОАТТТСТТСОСТООТОСТАСААТААСТССТТТТОТСТТТТТСОТТТСАОСАТТСТТСТСАОА
ОТСАСТАААТААСАТТАТСАТСТОСАААТСТСАААТАОАСАТАСТТАСОТОААТТСАТОТААССОТ
ТТССТТАСАААТТТОСТОАААССТСАСОСТОАТСТОААОТТТОСТСАООТАСТСОАОАТОАТООСА
ОСОААООТТАСАТООАССОАОАСТАОСОТААСТОТТАСТООСССАССОСОООАОССАТТТОООАС
ОАААСАССТСААООСОАТТОАТОТСААСАТОААСААОАТОССТСАТОТСОССАТОАСТСТТОСТОТ
ССТТОСССТСТТТОССОАТООССССАСАОССАТСАОАОАССОТААААСАТТСТСАОСССТАСААСС
АТОССТСТТСТАСАТСАСТАСТТОАСААСАСТАААААСТАТТОССТСОТТОССАСТООСТТССТСО
АСАСТАААССАСАСССАСАССАТСОТТССОАТССССАСССАССТААССААССТААСССТАСАТА
СТТСАСАТОТСТСАСОТСОТСТТТССАТАОСТСОСТОССТСТТАОСООСТТОССТССООТСОСТССА
ТССТСООТТОСТОТСТОТОТТТТССАСАОСТООСАССАТСТСТТОАООААОООССОСАСТАСТОСА
ТСАТСАСОССОСССОАСААОСТОААСОТСАСОССОАТСОАСАСОТАСОАСОАССАСАССАТОССС
АТОСССТТСТСССТТСССОССТОТОСССАОСТСССССТСАССАТССОССАСССТООСТОСАССССС
ААОАССТТССССОАСТАСТТСОАТОТОСТОАОСАСТТТСОТСААС.ААТТААТАААОСОТОСОАТАС
ТАССАСОСАОСТТОАТТОААОТОАТАООСТТОТОСТСАООАААТАСАТТТСТТТТОТТСТОТТТТТТ
СТСТТТСАСОООАТТААОТТТТОАОТСТОТААСОТТАСТТОТТТОТАОСААОТТТСТАТТТСООАТС
ТТААОТТТСТССАСТСТААСССАААТТТСАТТТСААСАСТССТТССТТОСААТААТААСААТААТА
ААТТАССТТТСАСТСОСТСТСААОССТССТССТАССТТТТАССАСАТСССАТТАСАСАТТСАТСАТ
СААСААСААТААААССТТТТАОССТСАААСААТААТАОТОААСТТАТТТТТТАОТССТАААСААОТ
ТОСАТТАССАТАТАСТТААААСАСААААСААССТАААОТТАСССТТТАСАСАТСТССАТАТТСТТТ
тссат (ЗЕ<2 ГО N0:316),
с 5'-нетранслируемой областью, расположенной в положениях 1 - 306, и 3'-нетранслируемой областью, расположенной в положениях 3490 - 3907. Последовательность кДНК ЕР8Р8 идентифицировали как
АССТАСТТСССССТСОССССТСТСАТОСТСТСТСТСОСОСССАОАТСТОСТАСТАСАССОСАССССТ
ОСАОСОСОТСОТСТСОСОООООТТООТООСАООСАОСОАОАОСТТОССОТТССТСТСТСТСАОТТО
ТСАООТССТАООСТСАССТСАССООСТСССАОСССОСТТСТАТТТСТТССТССССОАССССОТОСАО
ОТООСАОТССАОТССАССССАССААССОСОАООСОААССАААССААСССАСТСТССССААССССС
СОСОСССАООССОСССОСССТАССААССАТСООСОТСООСААТООСООССАТООСОАССААООСС
ОССОСОООСАССОТОТСОСТООАССТСОССОСОССОССООСООСООСАОСООСООСОСССОТССА
ООССООТОССОАООАОАТСОТОСТОСАОСССАТСААООАОАТСТССООСАССОТСААОСТОССОО
ООТССААОТСОСТТТССААССООАТССТССТОСТСОССОСССТОТССОАООООАСААСАОТООТТС
АТААССТОТТОААСАОТОАСОАТОТССАСТАСАТОСТСООООССТТОАООАСТСТТСОТСТСТСТО
ТСОААОСООАСАААССТОССААААОАОСТОТАОТТОТТООСТОТООТООАААОТТСССАОТТОАО
САТТСТАААСАССААСТССАССТСТТСТТССССААТОСТСОААСТОСААТОСООССАТТОАСАОС
АОСТОТТАСТОСТОСТООТООАААТОСААСТТАСОТОСТТОАТООАОТАССААОААТОАООСАОА
ОАСССАТТООСОАСТТОаТТОТСООАТТОААОСАОСТТООТССАОАТОТТОАТТОТТТССТТООСА
СТОАСТОСССАССТОТТСОТОТСААТООААТСООАОООСТАССТООТООСААООТСААОСТОТСТО
ССТССАТСАССАОТСАСТАСТТОАОТОССТТОСТСАТСОСТОСТССТТТОССТСТТССООАТСТСС
АОАТТСАААТСАТТСАТАААТТААТСТССАТТСССТАСОТСОАААТСАСАТТСАСАТТОАТОСАСС
СТТТТСОТОТОАААССАОАОСАТТСТОАТАОСТОООАСАОАТТСТАСАТТААОООАООТСААААА
ТАСААОТССССТАААААТОССТАТОТТОААООТОАТОССТСААОСОСААОСТАТТТСТТООСТООТ
ОСТОСААТТАСТООАООСАСТОТОАСТОТООААООТТОТООСАССАССАОТТТОСАОООТОАТОТ
ОААСТТТОСТОАООТАСТООАСАТОАТССОАОССААООТТАСАТОСАССОАСАСТАОССТААСТО
ТТАСТСССССАССОСОСОАОССАТТТСОСАОСАААСАССТСААСССОАТТСАТСТСААСАТОААС
ААСАТСССТОАТСТСОССАТОАСТСТТОСТОТООТТОСССТСТТТОСССАТООСССОАСАОССАТС
АСАОАСОТООСТТССТОСАОАОТАААОСАОАССОАСАООАТОСТТОСОАТСССОАССОАОСТАА
ССААОСТОООАССАТСТОТТОАСОААОООССООАСТАСТОСАТСАТСАСОССОССООАОААОСТО
ААСОТОАСООСОАТСОАСАСОТАСОАССАССАСАООАТСОССАТООССТТСТСССТТОССОССТОТ
ССССАСОТСССССТОАССАТССОСОАСССТООСТССАСССОСААОАССТТССССОАСТАСТТСОАТ
СТОСТСАОСАСТТТСОТСААСААТТААТАААОСОТОСОАТАСТАССАСОСАОСТТОАТТОААСТОА
ТАСОСТТСТССТОАСОАААТАСАТТТСТТТТСТТСТОТТТТТТСТСТТТСАССООАТТААОТТТТСАО
ТСТОТААСОТТАОТТОТТТОТАОСААОТТТСТАТТТСООАТСТТААОТТТОТОСАСТОТААОССААА
ТТТСАТТТСААОАОТООТТСОТТаОААТААТААОААТААТАААТТАСОТТТСАОТООСТОТСААОС
СТОСТОСТАСОТТТТАОСАОАТОССАТТАСАСАТТСАТСАТСААСААСААТААААССТТТТАОССТ
САААСААТААТАОТСААСТТАТТТТТТАСТССТАААСААОТТОСАТТАООАТАТАОТТААААСАСА
АААОААОСТАААСТТАООСТТТАОАСАТОТОСАТАТТОТТТТССАТ (8Е<3 ГО N0:317).
Сконструировали двуцепочечный РНК-полинуклеотид длиной 240 пар оснований, одна из цепей
которого соответствовала последовательности ДНК
ТАСТТСАОТОССТТССТОАТООСТОСТССТТТОССТСТТООООАТОТООАОАТТОАААТСАТТСАТА ААТТААТСТССАТТССОТАСОТСОАААТОАСАТТОАОАТТОАТСОАОСОТТТТООТОТОАААОСАО АОСАТТСТОАТ АОСТОООАСАОАТТСТАСАТТААОООАООТСАА АААТ АСААОТССССТАА АААТ ОССТАТОТТОААООТОАТОССТСААОСОСААОСТАТТТСТТО (8ЕО ГО N0:318),
соответствующей 240-нуклеотидному сегменту, расположенному в положениях 937-1176 последо- 75 029482
вательности кДНК ΕΡδΡδ.
Семена 2еа таук (Сакре) проращивали на бумаге для проращивания. Проростки переносили в 4дюймовые горшки и выращивали растения в вегетационной камере. Три 17-дневных растения обрабатывали путем наружного нанесения полинуклеотидов, а три растения использовали в качестве контрольных. Два нижних листа каждого растения маркировали и затем подвергали предобработке, погружая в раствор 0,1% δ^ί^еί Ь-77. Приблизительно через 30 мин после предобработки поверхностно-активным веществом на верхнюю сторону каждого из двух предобработанных листьев наносили 20 микролитров раствора для обработки. Раствор для обработки состоял из смеси 100 микролитров 2Х буферного раствора, 90 микролитров воды, 10 микролитров раствора, содержавшего 4,6 микрограмма/микролитр дцРНК ΕΡδΡδ (одна цепь которого соответствовала δΕ^ ГО N0: 318); 2Х буферный раствор представлял собой смесь 200 микролитров 0,1% δ^ί^еί Ь-77, 200 микролитров 50-миллимолярного фосфата натрия, 146 микролитров 34% фосфата аммония и 454 микролитров воды. На 8 сутки после обработки два из трех растений, обработанных полинуклеотидом, останавливали рост при поврежденных или отмерших верхушечных листьях (аналогично фенотипу, наблюдавшемуся у аналогично обработанных полинуклеотидом ΕΡδΡδ растений №сойапа ЬепШатхапа), в то время как все три контрольных растения демонстрировали нормальный рост и морфологию (фиг. 37).
Пример 35
Исследовали эффективность различных веществ (включая соли, хелатирующий агент, увлажнитель и полиамины) в качестве транспортных агентов для полинуклеотидов или усилителей известных транспортных агентов для полинуклеотидов. Ранее показали, что сульфат аммония усиливал проницаемость растений для полинуклеотидов (см., например, пример 13). В табл. 26 перечислено действие сульфата аммония и ЭДТА в качестве добавок на гербицидную активность (представленную как процент контролируемых/погибших сорных растений и как высота растений) наружно наносимых растворов полинуклеотидов (РНК) для опрыскивания в 1% δι1\\τΊ Ь-77 по отношению к растениям амаранта Палмера, устойчивым к глифосату. В данном конкретном эксперименте обнаружили, что этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в концентрации 0,004% действовала в растворе для опрыскивания аналогично 2% сульфату аммония, повышая эффективность полинуклеотидов и стимулируя гербицидную активность глифосата.
Таблица 26
Обработка Амарант Палмера, контроль (%) Высота амаранта Палмера (см)
Без добавления 0 7,5
+ 2% сульфат аммония 43 1,8
+ 0,004% ЭДТА 45 1,0
В табл. 27 перечислено действие различных солей, включая неорганические соли (хлорид натрия, сульфат натрия, сульфат аммония, хлорид аммония) и органические соли (хлорид тетраметиламмония, хлорид тетраэтиламмония, бромид тетрапропиламмония и бромид тетрабутилфосфония) в качестве добавок на гербицидную активность (представленную как процент контролируемых/погибших сорных растений и как высота растений) наружно наносимых растворов полинуклеотидов (РНК) для опрыскивания в 1% δι1\\τΊ Ь-77 по отношению к растениям амаранта Палмера, устойчивым к глифосату. В данном конкретном эксперименте обнаружили, что хлорид аммония и бромид тетрабутилфосфония действовали в растворе для опрыскивания аналогично сульфату аммония, повышая эффективность полинуклеотидов и стимулируя гербицидную активность глифосата.
Таблица 27
Обработка Амарант Палмера, контроль (%) Высота амаранта Палмера (см)
Без добавления 0 16,0
+ 2% хлорид натрия 15 15,0
+ 2% сульфат натрия 7 17,0
+ 2% сульфат аммония 54 9,3
+ 2% хлорид аммония 52 10,3
+ 2% хлорид тетраметиламмония 19 15,0
+ 2% хлорид тетраэтиламмония 27 12,0
+ 2% бромид тетрапропиламмония 34 11,0
+ 2% бромид тетрабутилфосфония 19 13,3
+ 2% бромид тетрабутилфосфония 55 5,3
В табл. 28 перечислено действие увлажнителя - глицерина на гербицидную активность (представленную как процент контролируемых/погибших сорных растений и как высота растений) наружно наносимых полинуклеотидов (РНК) по отношению к растениям амаранта Палмера, устойчивым к глифосату. Обнаружено, что глицерин повышал эффективность полинуклеотидов, стимулируя гербицидну активность глифосата.
- 76 029482
Таблица 28
Обработка Амарант Палмера, контроль (%) Высота амаранта Палмера (см)
Без добавления 0 16,0
δΐίννβί Ь-77/СА (без глицерина) 54 9,3
δϊΚνβί Ь-77/СА + 0,5% глицерин 57 6,3
На фиг. 38 показано действие различных противоионов глифосата на гербицидную активность (представленную как процент контролируемых/погибших сорных растений и как высота растений) наружно наносимых полинуклеотидов (РНК) по отношению к растениям амаранта Палмера, устойчивым к глифосату. Смесь полинуклеотидов ΕΡδΡδ (ΣΌΤ [1] (δΕ^ ГО ΝΟ: 83-84), ГОТ [2] (δΕ^ ГО ΝΟ: 85-86), ГОТ [3] (δΕ^ ГО ΝΟ: 87-88) и ГОТ [4] (δΕ^ ГО ΝΟ: 89-90)) в 0,5% δι1\\Π Ь-77, 2% сульфате аммония в 10миллимолярном натрий-фосфатном буфере, рН 6,8 с 0,2% носителем Κουηάυρ® ШеаФегМах® (поверхностно-активное вещество ΜΟΝ56151 на основе смеси аминов твердых жиров (16-18С) и аминов жирных кислот кокосового масла (12-14С) в соотношении 55:45) и 1682 г кислотного эквивалента одной из солей глифосата (К+глифосата, изопропиламмоний+глифосата или моноэтаноламмоний+глифосата) на гектар при норме расхода 215 л/акр наносили с помощью опрыскивателя Μΐϊϊΐ в 3 повторностях на 4-6дюймовые растения амаранта Палмера, устойчивые к глифосату и содержащие 16 копий ΕΡδΡδ. Высоту растений оценивали на 21 сутки после обработки глифосатом. Результаты (представленные как процент контроля/гибели сорных растений и как высота растений) приведены в табл. 29. Соли глифосата и изопропиламмония и моноэтаноламмония обеспечивали лучшую гербицидную активность по сравнению с солью калия.
Таблица 29
Обработка Амарант Палмера, контроль(%) Высота амаранта Палмера (см)
Без добавления 0 16
К+ глифосат 23 12,3
К+ глифосат + полинуклеотиды ΕΡδΡδ 32 10,8
ИПА+ глифосат 9 14,5
ИПА+ глифосат + полинуклеотиды ΕΡδΡδ 66 5,5
МЭА+ глифосат 9 14,5
МЭА+ глифосат + полинуклеотиды ΕΡδΡδ 66 5,5
Исследовали действие полиаминных катионов спермина (Н№-бис-(3-аминопропил)бутан-1,4диамина) и спермидина (№(3-аминопропил)бутан-1,4-диамина) на гербицидную активность наружно наносимых полинуклеотидов (РНК) по отношению к растениям амаранта Палмера, устойчивым к глифосату. Растворы полинуклеотидов изготовили, используя смесь равных количеств четырех "коротких" молекул дцРНК олигонуклеотидного размера, описанных в примере 1, антисмысловая цепь которых гибридизуется с мРНК-транскриптом гена ΕΡδΡδ амаранта Палмера (δΕ^ ГО ΝΟ: 1) в положениях 14-38 (короткая дцРНК-1), положениях 153-177 (короткая дцРНК-2), 345-369 (короткая дцРНК-3) и 1105-1129 (короткая дцРНК-4), обозначенных подчеркнутыми нуклеотидами на фиг. 1; дцРНК несли двухнуклеотидный липкий конец на 3'-конце антисмысловой цепи и два дезоксинуклеотида в качестве конечных нуклеотидов на 3'-конце смысловой цепи. Растворы дцРНК-полинуклеотидов изготовили, используя 110-миллимолярные спермин или спермидин или 2% (мас./об.) сульфат аммония в 10-миллимолярном натрий-фосфатном буфере (рН 6,8). Контрольные растворы (без полинуклеотидов) изготовили, используя 1-10-миллимолярные спермин или спермидин или 2% (мас./об.) сульфат аммония в 10-миллимолярном натрий-фосфатном буфере (рН 6,8). Растения амаранта Палмера, устойчивые к глифосату (33, 36 или 57 копий ΕΡδΡδ), подвергали предварительному опрыскиванию 1% δί1\\Όΐ Ь-77. Раствор дцРНКполинуклеотидов (11,6 г/акр) или буферные растворы наносили в виде капель на четыре нижних полностью развившихся листа амаранта Палмера, устойчивого к глифосату, с помощью пипетки. Через двое суток после обработки полинуклеотидом растения опрыскивали глифосатом (3360 г кислотного эквивалента гербицида марки Κοπηάπρ® Шеа1Ие^ΜΑX® на гектар). Растения фотографировали на 14 сутки после обработки глифосатом; результаты показаны на фиг. 39. Обработка дцРНК и 10-миллимолярным спермином с последующей обработкой глифосатом приводила к гибели амаранта Палмера, устойчивого к глифосату и содержащего 33 копии ΕΡδΡδ, и вызывала тяжелые повреждения и замедление роста у амаранта Палмера, устойчивого к глифосату и содержащего 36 копий ΕΡδΡδ. Обработка только 10 мМ спермидином замедляла рост 33-копийного амаранта Палмера, устойчивого к глифосату. В данном конкретном эксперименте ни спермин, ни спермидин в концентрации от 1 до 10 миллимоль не обеспечивали
- 77 029482
производительности, аналогичной производительности 2% сульфата аммония.
Пример 36
Эффективность различных поверхностно-активных веществ в качестве транспортных агентов для полинуклеотидов тестировали, используя растворы полинуклеотидов для опрыскивания, наносимые на растения амаранта Палмера, устойчивые к глифосату. Поверхностно-активные вещества Вгеак-ТЕги получили от Буошк МшМез; поверхностно-активные вещества δΐ1\\·Όΐ получили от Мотепбуе. Растворы для опрыскивания изготавливали в день опрыскивания. Смесь полинуклеотидов ΕΡδΡδ (ГОТ [1] (δΕΡ ГО ЫО: 83-84), ГОТ [3] (δΕρ ГО ЫО: 87-88) и ГОТ [4] (δΕρ ГО ЫО: 89-90)) добавляли к растворам для опрыскивания за 15-50 мин до опрыскивания и 1-2 миллилитра наносили с помощью специализированного "тПИ" опрыскивателя с низким недействующим объемом на 1-4-дюймовые растения амаранта Палмера, устойчивые к глифосату (К-22), выращенные из черенков. Всего на каждое растение наносили от 10 до 225 микрограммов полинуклеотидов в зависимости от эксперимента; обычно на растение наносили всего 23 микрограмма полинуклеотидов. Обработанные растения помещали в вегетационный домик при температуре либо 26,7/21,1 °С или 29,4/21,1 °С в течение 14/10 ч и дополнительном световом дне. Через 2-3 суток растения опрыскивали глифосатом ("2Х Vтаx" или 1682 г кислотного эквивалента гербицида марки КоипсСир® VеаίΗе^МΑX® на гектар) с помощью обычного опрыскивателя (10 галлонов/акр) и возвращали в вегетационный домик. Количество видимых повреждений по сравнению с неопрысканными растениями, высота растений и изображения амаранта Палмера регистрировали через различные интервалы времени до 21 суток после обработки глифосатом. В последний момент времени регистрировали сырую массу надземных частей растений. Общую оценку повреждений растения от 0 до 3 присваивали каждому варианту обработки на основе объединенного анализа повреждений, высоты, сырой массы и видимого фенотипа растения, где оценка "3" соответствовала сильной гербицидной активности, "2" умеренной активности, "1" - слабой активности, а "0" - отсутствию наблюдаемой активности после коррекции видимых повреждений, вызванных обработкой только глифосатом; результаты показаны в табл. 30.
Кроме того, исследовали физические свойства различных поверхностно-активных веществ, перечисленные в табл. 30. В день измерений изготавливали семьдесят миллилитров раствора поверхностноактивного вещества (0,5% поверхностно-активного вещества в водном растворе, содержащем 2% сульфат аммония, буфер (20-миллимолярный фосфат калия, рН 6,8), с добавлением или без добавления полинуклеотида ΕΡδΡδ (ГОТ [2] (δΕΡ ГО ЫО: 85-86), 0,09 миллиграммов/миллилитр). Динамическое поверхностное натяжение измеряли при комнатной температуре (22-23 °С) на тензометре Кги88 ΒΡ100, используя методику максимального давления пузырьков, получая график поверхностного натяжения от возраста поверхности. Инструмент был настроен на автоматическое обнаружение поверхности и погружение капилляра на глубину 10 мм. Записывали измерение поверхностного натяжения для трех возрастов поверхности (приблизительно 20, 500 и 1250 мс). Поверхностное натяжение в динах на см в интервале 1250 мс записывали как приблизительную величину статического поверхностного натяжения, а изменение между 20 и 500 мс записывали как оценку динамического поверхностного натяжения. Значения гидролипидного баланса (ГЛБ) для поверхностно-активных веществ получали из справочников по поверхностноактивным веществам и информации о товаре.
Таблица 30
Название поверхностноактивного вещества Номер САЗ Химическая природа Поверхностноактивное вещество Тип Поверхностноактивное вещество Класс Оценк а повреж дений амаран та Палме ра Поверхностное натяжение ГЛБ
литерату ра 1250 мс изменен ие 20500 мс
Вгеак-ТЬги 8 321 н.д. полисилоксан, модифицированы ый полиэфиром ι кремнийоргани ческий неионогенный 3 н.д. 22,7 27,1 40,0
Вгеак-ТЬги 8 200 67674-67-3 полисилоксан, модифицированы ый полиэфиром кремнийоргани ческий неионогенный 3 22 26,9 23,0
Вгеак-ТЬги ОЕ 441 68937-55-3 полисилоксан, модифицированн ый полиэфиром кремнийоргани ческий неионогенный 1 н.д. 43,8 2,9 40,0
Вгеак-ТЬги 8 278 27306-78-1 полисилоксан, модифицированн ый полиэфиром кремнийоргани ческий неионогенный 2 21 24,2 23,4
Вгеак-ТЬги 8 243 н.д. полисилоксан, модифицированн ый полиэфиром кремнийоргани ческий неионогенный 2 47 50,3 7,7 16,7
8ϊ1\νβΙ Ь-77 27306-78-1 трисилоксан; полиметилсилок сан, модифицированн ый полиалкиленокс идом кремнийоргани ческий неионогенный 3 20,5 26,4 23,4 13,5
δϊίχνεί НЗ 429 н.д. гидролитически стабильное кремнийорганич еское соединение кремнийоргани ческий неионогенный 3 32-40 40,1 12,1
δϊίννβί НЗ 312 Н.Д. кремнийорганич еское соединение кремнийоргани ческий неионогенный 3 26,7 29,5 п,з
Вгеак-ТЬги 8 233 134180-760 трисилоксан кремнийоргани ческий неионогенный 3 23 26,1 10,0
- 78 029482
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> САММОНС, Роберт, Д.
ИВАШУТА, Сергей, И.
ЛЮ, Хун
ВАН, Дафу ФЭН, Пол, К. К.
КОУРАНОВ, Андрей, Ю.
АНДЕРСЕН, Скотт, Е.
<120> МОЛЕКУЛЫ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНОВ У РАСТЕНИЙ
<130> 38-21(56855)0000/РСТ
<140> пи11
<141> 2011-03-08
<150> 61/311,762
<151> 2010-03-08
<150> 61/349,807
<151> 2010-05-28
<150> 61/381,556
<151> 2010-09-10
<160> 320
<170> РабепбГп иегзбоп 3.5
<210> 1
<211> 1557
<212> ДНК
<213> АтагапбЬиз ра1тегг
<400> 1 абддсбсаад сбасбассаб саасаабддб дбссабасбд дбсааббдса ссабасббба 60
сссаааассс адббасссаа абсббсаааа асбсббаабб ббддабсааа сббдадаабб 120
бсбссааадб бсабдбсббб аассаабааа ададббддбд ддсаабсабс ааббдббссс 180
аадаббсаад сббсбдббдс бдсбдсадсб дадааассбб сабсбдбссс адаааббдбд 240
ббасаассса бсааададаб сбсбддбасб дббсааббдс сбдддбсааа дбсбббабсс 300
аабсдаабсс ббсббббадс бдсбббдбсб дадддсасаа садбддбсда саасббдсбд 360
бабадбдабд абаббсббба бабдббддас дсбсбсадаа сбсббддббб аааадбддад 420
дабдабадба садссаааад ддсадбсдба дадддббдбд дбддбсбдбб бссбдббддб 480
ааадабддаа аддаададаб бсаасббббс сббддбаабд саддаасадс дабдсдссса 540
ббдасадсбд сддббдссдб бдсбддадда ааббсаадбб абдбдсббда бддадбасса 600
адаабдаддд адсдссссаб бддддабсбд дбадсаддбс бааадсаасб бддббсадаб 660
дбадаббдбб ббсббддсас аааббдсссб ссбдббсддд бсаабдсбаа аддаддссбб 720
ссадддддса аддбсаадсб сбсбддабсд дббадбадсс аабабббаас бдсасббсбс 780
абддсбасбс сбббдддбсб бддадасдбд дадаббдада бадббдабаа аббдабббсб 840
- 79 029482
дЕассдЕаЕд ЕЕдаааЕдас ааЕааадЕЕд аЕддаасдсЕ ЕЕддадЕаЕс сдЕадаасаЕ 900
адЕдаЕадЕЕ дддасаддЕЕ сЕасаЕЕсда ддЕддЕсада ааЕасаааЕс ЕссЕддааад 960
дсаЕаЕдЕЕд адддЕдаЕдс ЕЕсаадЕдсЕ адсЕасЕЕсс Еадссддадс сдссдЕсасЕ 1020
ддЕдддасЕд ЕсасЕдЕсаа дддЕЕдЕдда асаадсадЕЕ ЕасадддЕда ЕдЕааааЕЕЕ 1080
дссдаадЕЕс ЕЕдадаадаЕ дддЕЕдсаад дЕсассЕдда сададааЕад ЕдЕаасЕдЕЕ 1140
асЕддассас ссадддаЕЕс аЕсЕддааад ааасаЕсЕдс дЕдсЕаЕсда сдЕсаасаЕд 1200
аасааааЕдс садаЕдЕЕдс ЕаЕдасЕсЕЕ дсадЕЕдЕЕд ссЕЕдЕаЕдс адаЕдддссс 1260
ассдссаЕса дадаЕдЕддс ЕадсЕддада дЕдааддааа ссдаасддаЕ даЕЕдссаЕЕ 1320
Едсасадаас ЕдадааадсЕ Еддддсааса дЕЕдаддаад даЕсЕдаЕЕа сЕдЕдЕдаЕс 1380
асЕссдссЕд аааадсЕааа ссссассдсс аЕЕдааасЕЕ аЕдасдаЕса ссдааЕддсс 1440
аЕддсаЕЕсЕ сЕсЕЕдсЕдс сЕдЕдсадаЕ дЕЕсссдЕса сЕаЕссЕЕда ЕссдддаЕдс 1500
асссдЕаааа ссЕЕсссдда сЕасЕЕЕдаЕ дЕЕЕЕадааа адЕЕсдссаа дсаЕЕда 1557
<210> 2
<211> 1761
<212> ДНК
<213> Ы1соЕ1апа ЬепЕЬашпапа
<400> 2
аЕдссссааа ЕсддасЕЕдЕ аЕсЕдсЕдЕЕ ааЕЕЕдадад ЕссааддЕаа ЕЕсадсЕЕаЕ 60
сЕЕЕддадсЕ сдаддЕсЕЕс дЕЕдддаасЕ дааадЕсаад аЕдЕЕЕдсЕЕ дсаааддааЕ 120
ЕЕдЕЕаЕдЕЕ ЕЕддЕадЕад сдасЕссаЕд дддсаЕаадЕ ЕааддаЕЕсд ЕасЕссаадЕ 180
дссасдассс даадаЕЕдас аааддасЕЕЕ ааЕссЕЕЕаа аддЕадЕсЕд саЕЕдаЕЕаЕ 240
ссаадассад адсЕадасаа ЕасадЕЕаас ЕаЕЕЕддадд сддсдЕЕаЕЕ аЕсаЕсаЕсд 300
ЕЕЕсдЕасЕЕ ссЕсасдссс аасЕааасса ЕЕддадаЕЕд ЕЕаЕЕдсЕдд ЕдсаддЕЕЕд 360
ддЕддЕЕЕдЕ сЕасадсааа аЕаЕсЕддса даЕдсЕддЕс асааассдаЕ аЕЕдсЕддад 420
дсаададаЕд ЕссЕаддЕдд дааддЕадсЕ дсаЕддааад аЕдаЕдаЕдд адаЕЕддЕас 480
дадасЕдддЕ ЕдсасаЕаЕЕ сЕЕЕддддсЕ ЕасссаааЕа ЕдсадаассЕ дЕЕЕддадаа 540
сЕадддаЕЕд аЕдаЕсддЕЕ дсадЕддаад даасаЕЕсаа ЕдаЕаЕЕЕдс даЕдссЕаас 600
аадссадддд адЕЕсадссд сЕЕЕдаЕЕЕЕ ссЕдаадсЕс ЕЕссЕдсдсс аЕЕаааЕдда 660
аЕЕЕЕддсса ЕасЕааадаа саасдаааЕд сЕЕасдЕддс ссдадааадЕ саааЕЕЕдсЕ 720
аЕЕддасЕсЕ ЕдссадсааЕ дсЕЕддаддд сааЕсЕЕаЕд ЕЕдаадсЕса адасддЕЕЕа 780
адЕдЕЕаадд асЕддаЕдад ааадсааддЕ дЕдссЕдаЕа дддЕдасада ЕдаддЕдЕЕс 840
аЕЕдссаЕдЕ саааддсасЕ ЕаасЕЕсаЕа аасссЕдасд адсЕЕЕсдаЕ дсадЕдсаЕЕ 900
ЕЕдаЕЕдсЕЕ ЕдаасадаЕЕ ЕсЕЕсаддад ааасаЕддЕЕ саааааЕддс сЕЕЕЕЕадаЕ 960
- 80 029482
ддйаасссйс сйдададасй ййдсайдссд аййдйддаас айаййдадйс ааааддйддс 1020
саадйсадас йааасйсасд аайаааааад айсдадсйда айдаддайдд аадйдйсааа 1080
йдййййайас йдаайаайдд садйасаайй аааддадайд сййййдйдйй йдссасйсса 1140
дйддайайсй йдаадсййсй йййдссйдаа дасйддааад адайсссайа йййссаааад 1200
ййддадаадс йадйдддадй йссйдйдайа аайдйссайа йайддйййда садаааасйд 1260
аадаасасай сйдайаайсй дсйсййсадс адаадсссдй йдсйсадйдй дйасдсйдас 1320
айдйсйдййа сайдйаадда айаййасаас сссаайсадй сйайдййдда аййддйаййй 1380
дсасссдсад аададйддай ааайсдйадй дасйсадааа ййаййдайдс йасаайдаад 1440
даасйадсда адсййййссс йдайдааайй йсддсадайс ададсааадс ааааайаййд 1500
аадйайсайд ййдйсаааас сссааддйсй дйййайаааа сйдйдссадд ййдйдаассс 1560
йдйсддсссй йдсааадайс сссйайадад ддйййййайй йадсйддйда сйасасдааа 1620
садаадйасй йддсййсаай ддааддйдсй дйсййайсад дааадсйййд йдсасаадсй 1680
аййдйасадд аййасдадйй асййсййддс сддадссада адайдййддс адаадсаадс 1740
дйадййадса йадйдаасйа а 1761
<210> 3
<211> 559
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 3
ддсссайадд ссйййййсйа ааайаддссс айййаадсйа ййаасаайсй йсаааадйас 60
сасайсдсйй аддйааадаа адсадсйдад йййайайайд дййададасд аадйадйдай 120
йдсдасдадс дасдйсйсдс ссйсайсдса айссасдсса ййдадсййда ддссаййддс 180
дасддссдад аддсддйсдс ййаадаййад сайдйссййд асдсддадйй сййссадасс 240
дййсайсасд дйсдссссйй ссдсдааддс ддсддсдаса дсдадаайсд дайаййсдйс 300
дайсайсдаа ддсдсдсддй сййссддсас сдйдасдсай ааасасддйд ссддаадасс 360
дсдсдссййс дайдайсдас даайайссда ййсйсдсйдй сдссдссдсс ййсдсддаад 420
дддсдассдй дайдаасддй сйддаадаас йссдсдйсаа ддааадсдас сдссйсйсдд 480
ссдйсдссаа йддссйсаад сйсаайддсд йддаййдсда йдадддсдад асдйсдсйсд 540
йсдййййййй йддсааааа 559
<210> 4
<211> 10
<212> ДНК
- 81 029482
10
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 4
ксссасаксд
<210> 5
<211> 13
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223>
Синтетическая конструкция
<400> 5
аадаккадса сдд
13
<210> 6
<211> 11
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223>
Синтетическая конструкция
<400> 6
асдсакаааа к
11
<210> 7
<211> 6
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 7
кккккк
<210> 8
<211> 20
<212> ДНК
<213> Атагапкбиз ра1тегт
<400> 8
ассскссасд аскдсссккк
20
<210> 9
<211> 19
<212> ДНК
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 9
дкккссккса скскссадс 19
- 82 029482
20
<210> 10
<211> 20
<212> ДНК
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 10
дкадсккдад ссаккаккдк
<210> 11
<211> 20
<212> ДНК
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 11
дккдакддка дкадсккдад
<210> 12
<211> 20
<212> ДНК
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 12
ассскссасд аскдсссккк
<210> 13
<211> 19
<212> ДНК
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 13
дкккссккса скскссадс
<210> 14
<211> 18
<212> ДНК
<213> Ногбеит. чи1даге
<400> 14
аадсддккда дсаскдаа
<210> 15
<211> 20
<212> ДНК
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 15
ассскссасд аскдсссккк
<210> 16
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 16
20
20
19
18
20
- 83 029482
ЕааЕасдасЕ сасЕаЕаддд саададаЕдЕ ссЕаддЕддд 40
<210> 17
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 17
ЕааЕасдасЕ сасЕаЕадда садаЕЕЕсЕЕ саддадааас аЕдд 44
<210> 18
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 18
дсаададаЕд ЕссЕаддЕдд д 21
<210> 19
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 19
асадаЕЕЕсЕ Есаддадааа саЕдд 25
<210> 20
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 20
ЕааЕасдасЕ сасЕаЕаддс аЕсЕссЕЕЕа аЕЕдЕасЕдс с 41
<210> 21
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 21
ЕааЕасдасЕ сасЕаЕаддЕ ЕЕааЕЕдЕас ЕдссаЕЕаЕЕ с 41
- 84 029482
<210> 22
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 22
саЕсЕссЕЕЕ ааЕЕдЕасЕд сс 22
<210> 23
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 23
ЕЕЕааЕЕдЕа сЕдссаЕЕаЕ Ес 22
<210> 24
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 24
сасЕЕссаЕс сЕсаЕЕсадс ЕсдаЕ 25
<210> 25
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 25
асассЕсаЕс ЕдЕсасссЕа Есад 24
<210> 26
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 26
садЕсЕсдЕа ссааЕсЕсса ЕсаЕ 24
<210> 27
<211> 41
<212> ДНК
- 85 029482
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 27
йаайасдасй сасйайаддд айссайдайа йсдйдаасай с 41
<210> 28
<211> 38
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 28
йаайасдасй сасйайаддд дсааадаааа айдсдйсд 38
<210> 29
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 29
айссайдайа йсдйдаасай с 21
<210> 30
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 30
дсааадаааа айдсдйсд 18
<210> 31
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 31
йдййййайас йдаайаайдд садйасаайй аааддадайд 40
<210> 32
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
- 86 029482
15
<223> Синтетическая конструкция
<400> 32
саЕсЕссЕЕЕ ааЕЕд
<210> 33
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 33
саЕсЕссЕЕЕ ааЕЕдЕас 18
<210> 34
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 34
саЕсЕссЕЕЕ ааЕЕдЕасЕд с 21
<210> 35
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 35
саЕсЕссЕЕЕ ааЕЕдЕасЕд ссаЕЕаЕЕса дЕа 33
<210> 36
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 36
дсадЕасааЕ ЕаааддадаЕ д 21
<210> 37
<211> 1614
<212> ДНК
<213> АтагапЕИиз ра1тег1
<400> 37
ЕсааЕЕЕсаЕ сЕаЕЕддаад ЕдаЕЕЕЕЕЕд ддЕсаЕЕсЕд ЕдадаааЕЕЕ садЕдЕЕадЕ 60
ааадЕЕЕаЕд дадсааадса аадаааЕддд сасЕдсссЕЕ ЕаааддЕЕдЕ ЕЕдЕаЕадаЕ 120
- 87 029482
ЕаЕссЕаддс сададсЕЕда аадЕасаЕсс ааЕЕЕсЕЕдд аадссдссЕа сЕЕаЕсЕЕсЕ 180
асЕЕЕЕсдда аЕЕсдссЕсд ЕссЕсадаад ссаЕЕадаад ЕЕдЕааЕЕдс ЕддадсаддЕ 240
ЕЕддсЕддЕс ЕаЕссасддс ааадЕаЕЕЕа дсЕдаЕдсад дЕсасааасс саЕаЕЕдЕЕд 300
даадсасдад аЕдЕЕЕЕадд аддаааддЕЕ дсадсдЕдда аддаЕдадда ЕддЕдасЕдд 360
ЕаЕдадасЕд ддсЕасаЕаЕ аЕЕсЕЕЕддд дсаЕаЕссаа аЕдЕссаааа ЕсЕаЕЕЕдда 420
даасЕЕддЕа ЕаааЕдассд асЕдсааЕдд ааддадсасЕ сЕаЕдаЕЕЕЕ ЕдсааЕдссс 480
адсаадсссд дЕдааЕЕсад ЕсдсЕЕЕдаЕ ЕЕЕсссдааа ЕссЕдссЕдс ассаЕЕаааЕ 540
ддсаЕаЕддд сааЕссЕаад аааЕааЕдаа аЕдсЕаассЕ ддссадаааа ааЕсаадЕЕЕ 600
дссаЕЕддсЕ ЕдЕЕдссЕдс ЕаЕддсаддс ддасадЕсаЕ аЕдЕЕдаадс асаадаЕддЕ 660
ЕЕдадЕдЕсс аададЕддаЕ дадаааасаа ддадЕасссд аЕсдЕдЕаас ЕдаЕдаЕдЕд 720
ЕЕЕаЕЕдсса ЕдЕсаааддс асЕдаасЕЕс аЕаааЕсссд аЕдаасЕЕЕс ааЕдсадЕдс 780
аЕсЕЕдаЕЕд сЕсЕдаассд аЕЕссЕдсад дадааасаЕд дЕЕсЕаадаЕ ддссЕЕссЕа 840
дасддааасс сЕссададад дсЕдЕдсаЕд ссЕаЕЕдЕЕа аасасаЕсда дЕсасЕаддЕ 900
ддЕдаадЕЕа аасЕЕаасЕс ЕсдЕаЕасаа аадаЕЕсадЕ Еддассадад ЕддаадсдЕд 960
аададЕЕЕЕЕ ЕдсЕаааЕаа сдддадддаа аЕасдаддад аЕдссЕаЕдЕ ЕЕЕЕдссасс 1020
ссадЕЕдаса ЕсЕЕдаадсЕ дЕЕасЕассЕ даЕасЕЕдда аддаааЕсЕс аЕасЕЕсааа 1080
ааасЕЕдада ааЕЕадЕддд сдЕЕссЕдЕд аЕЕааЕдЕЕс асаЕаЕддЕЕ Едасадаааа 1140
ЕЕааадааЕа саЕаЕдасса ЕсЕасЕсЕЕс адсаддадЕс сЕсЕЕЕЕдад ЕдЕсЕаЕдсЕ 1200
даЕаЕдЕсдд адасаЕдсаа ддааЕаЕаад даЕссаааЕа даЕссаЕдсЕ ддааЕЕддЕЕ 1260
ЕЕЕдсасссд сддаддааЕд даЕЕЕсасда адсдасасЕд аЕаЕЕаЕада ддсаасааЕд 1320
ааададсЕЕд ссаадсЕЕЕЕ сссддаЕдаа аЕсдсЕдссд аЕддаадсаа ддссаадаЕс 1380
сЕсаааЕаЕс аЕдЕсдЕсаа аасЕссаадд ЕсддЕЕЕаЕа адасЕдЕасс ддаЕЕдЕдаа 1440
ссЕЕдЕсддс сдсЕдсааад аЕсассааЕа дадддЕЕЕсЕ аЕЕЕадсЕдд ЕдаЕЕасаса 1500
ааасаааааЕ аЕЕЕддсЕЕс ЕаЕддааддЕ дсЕдЕсЕЕаЕ сЕдддаадсЕ ЕЕдЕдсасад 1560
дсЕаЕсдЕас аддаЕЕаЕда ЕсЕдсЕдадЕ ЕсЕсдадсас ааададааЕЕ ддсд 1614
<210> 38
<211> 1761
<212> ДНК
<213> Г11соЕ1апа ЪепЕЬатпапа
<400> 38
аЕдссссааа ЕсддасЕЕдЕ аЕсЕдсЕдЕЕ ааЕЕЕдадад ЕссааддЕаа ЕЕсадсЕЕаЕ 60
сЕЕЕддадсЕ сдаддЕсЕЕс дЕЕдддаасЕ дааадЕсаад аЕдЕЕЕдсЕЕ дсаааддааЕ 120
ЕЕдЕЕаЕдЕЕ ЕЕддЕадЕад сдасЕссаЕд дддсаЕаадЕ ЕааддаЕЕсд ЕасЕссаадЕ 180
- 88 029482
дссасдассс даадаббдас аааддасббб аабссбббаа аддбадбсбд саббдаббаб 240
ссаадассад адсбадасаа басадббаас бабббддадд сддсдббабб абсабсабсд 300
бббсдбасбб ссбсасдссс аасбааасса ббддадаббд ббаббдсбдд бдсаддбббд 360
ддбддбббдб сбасадсааа абабсбддса дабдсбддбс асааассдаб аббдсбддад 420
дсаададабд бссбаддбдд дааддбадсб дсабддааад абдабдабдд адаббддбас 480
дадасбдддб бдсасабабб сбббддддсб басссаааба бдсадаассб дбббддадаа 540
сбадддаббд абдабсддбб дсадбддаад даасаббсаа бдабабббдс дабдссбаас 600
аадссадддд адббсадссд сбббдабббб ссбдаадсбс ббссбдсдсс аббааабдда 660
аббббддсса басбааадаа саасдааабд сббасдбддс ссдадааадб сааабббдсб 720
аббддасбсб бдссадсааб дсббддаддд саабсббабд ббдаадсбса адасддббба 780
адбдббаадд асбддабдад ааадсааддб дбдссбдаба дддбдасада бдаддбдббс 840
аббдссабдб саааддсасб баасббсаба аасссбдасд адсбббсдаб дсадбдсабб 900
ббдаббдсбб бдаасадабб бсббсаддад ааасабддбб сааааабддс сбббббадаб 960
ддбаасссбс сбдададасб ббдсабдссд аббдбддаас абаббдадбс ааааддбддс 1020
саадбсадас бааасбсасд аабаааааад абсдадсбда абдаддабдд аадбдбсааа 1080
бдббббабас бдаабаабдд садбасаабб аааддадабд сббббдбдбб бдссасбсса 1140
дбддабабсб бдаадсббсб бббдссбдаа дасбддааад адабсссаба бббссаааад 1200
ббддадаадс бадбдддадб бссбдбдаба аабдбссаба бабддбббда садаааасбд 1260
аадаасасаб сбдабаабсб дсбсббсадс адаадсссдб бдсбсадбдб дбасдсбдас 1320
абдбсбдбба сабдбаадда абаббасаас сссаабсадб сбабдббдда аббддбаббб 1380
дсасссдсад аададбддаб ааабсдбадб дасбсадааа ббаббдабдс басаабдаад 1440
даасбадсда адсббббссс бдабдааабб бсддсадабс ададсааадс ааааабаббд 1500
аадбабсабд ббдбсаааас сссааддбсб дбббабаааа сбдбдссадд ббдбдаассс 1560
бдбсддсссб бдсааадабс сссбабадад ддбббббабб бадсбддбда сбасасдааа 1620
садаадбасб бддсббсааб ддааддбдсб дбсббабсад дааадсбббд бдсасаадсб 1680
аббдбасадд аббасдадбб асббсббддс сддадссада адабдббддс адаадсаадс 1740
дбадббадса бадбдаасба а 1761
<210> 39
<211> 22
<212> ДНК
<213> Ы1соб1апа ЪепбЬашпапа
<400> 39
ддсадбасаа ббаааддада бд 22
- 89 029482
<210> 40 <211> 1557 <212> ДНК <213> АтагапЕйиз ра1тег1 <400> 40 аЕддсЕсаад сЕасЕассаЕ саасааЕддЕ дЕссаЕасЕд дЕсааЕЕдса ссаЕасЕЕЕа 60
сссаааассс адЕЕасссаа аЕсЕЕсаааа асЕсЕЕааЕЕ ЕЕддаЕсааа сЕЕдадааЕЕ 120
ЕсЕссааадЕ ЕсаЕдЕсЕЕЕ аассааЕааа ададЕЕддЕд ддсааЕсаЕс ааЕЕдЕЕссс 180
аадаЕЕсаад сЕЕсЕдЕЕдс ЕдсЕдсадсЕ дадааассЕЕ саЕсЕдЕссс адаааЕЕдЕд 240
ЕЕасаассса ЕсааададаЕ сЕсЕддЕасЕ дЕЕсааЕЕдс сЕдддЕсааа дЕсЕЕЕаЕсс 300
ааЕсдааЕсс ЕЕсЕЕЕЕадс ЕдсЕЕЕдЕсЕ дадддсасаа садЕддЕсда саасЕЕдсЕд 360
ЕаЕадЕдаЕд аЕаЕЕсЕЕЕа ЕаЕдЕЕддас дсЕсЕсадаа сЕсЕЕддЕЕЕ аааадЕддад 420
даЕдаЕадЕа садссаааад ддсадЕсдЕа дадддЕЕдЕд дЕддЕсЕдЕЕ ЕссЕдЕЕддЕ 480
ааадаЕддаа аддаададаЕ ЕсаасЕЕЕЕс сЕЕддЕааЕд саддаасадс даЕдсдссса 540
ЕЕдасадсЕд сддЕЕдссдЕ ЕдсЕддадда ааЕЕсаадЕЕ аЕдЕдсЕЕда ЕддадЕасса 600
адааЕдаддд адсдссссаЕ ЕддддаЕсЕд дЕадсаддЕс ЕааадсаасЕ ЕддЕЕсадаЕ 660
дЕадаЕЕдЕЕ ЕЕсЕЕддсас аааЕЕдсссЕ ссЕдЕЕсддд ЕсааЕдсЕаа аддаддссЕЕ 720
ссадддддса аддЕсаадсЕ сЕсЕддаЕсд дЕЕадЕадсс ааЕаЕЕЕаас ЕдсасЕЕсЕс 780
аЕддсЕасЕс сЕЕЕдддЕсЕ ЕддадасдЕд дадаЕЕдада ЕадЕЕдаЕаа аЕЕдаЕЕЕсЕ 840
дЕассдЕаЕд ЕЕдаааЕдас ааЕааадЕЕд аЕддаасдсЕ ЕЕддадЕаЕс сдЕадаасаЕ 900
адЕдаЕадЕЕ дддасаддЕЕ сЕасаЕЕсда ддЕддЕсада ааЕасаааЕс ЕссЕддааад 960
дсаЕаЕдЕЕд адддЕдаЕдс ЕЕсаадЕдсЕ адсЕасЕЕсс Еадссддадс сдссдЕсасЕ 1020
ддЕдддасЕд ЕсасЕдЕсаа дддЕЕдЕдда асаадсадЕЕ ЕасадддЕда ЕдЕааааЕЕЕ 1080
дссдаадЕЕс ЕЕдадаадаЕ дддЕЕдсаад дЕсассЕдда сададааЕад ЕдЕаасЕдЕЕ 1140
асЕддассас ссадддаЕЕс аЕсЕддааад ааасаЕсЕдс дЕдсЕаЕсда сдЕсаасаЕд 1200
аасааааЕдс садаЕдЕЕдс ЕаЕдасЕсЕЕ дсадЕЕдЕЕд ссЕЕдЕаЕдс адаЕдддссс 1260
ассдссаЕса дадаЕдЕддс ЕадсЕддада дЕдааддааа ссдаасддаЕ даЕЕдссаЕЕ 1320
Едсасадаас ЕдадааадсЕ Еддддсааса дЕЕдаддаад даЕсЕдаЕЕа сЕдЕдЕдаЕс 1380
асЕссдссЕд аааадсЕааа ссссассдсс аЕЕдааасЕЕ аЕдасдаЕса ссдааЕддсс 1440
аЕддсаЕЕсЕ сЕсЕЕдсЕдс сЕдЕдсадаЕ дЕЕсссдЕса сЕаЕссЕЕда ЕссдддаЕдс 1500
асссдЕаааа ссЕЕсссдда сЕасЕЕЕдаЕ дЕЕЕЕадааа адЕЕсдссаа дсаЕЕда 1557
<210> 41
<211> 250
- 90 029482
<212> ДНК
<213> АтагапбЬиз ра1тег1
<220>
<221> т1зс_£еабиге
<222> (27)..(27)
<223> п представляет собой а, с, д или б
<400> 41
сдссадддсб дсадасдсдб басдбапбсд дабссадааб бсдбдаббаа сдбсасадса 60
бдбсабдбаа аасасдсдаа бсадассддб ссасбсббдб бббаабббда дасааббббд 120
абдббдадбс абсссасасс аассссаааа ааббсаасаа сааасбсбба баабдаббсс 180
сбсбасбсба сбададбсба сассаассса сбббсбсббб дсссассааа асбббддббб 240
ддбаадаасб 250
<210> 42
<211> 244
<212> ДНК
<213> АтагапбЬиз ра1тег1
<400> 42 сассаассса сбббсбсббб дсссассааа асбббддббб ддбаадаасб аадсссбсбб 60
сбббсссббс бсбсбсббаа аадссбаааа бссассбаас бббббсадсс аасааасаас 120
дссаааббса даддаадааб аабдабддсб саадсбасба ссабсаасаа бддбдбссаб 180
асбддбсааб бдсассабас бббасссааа асссадббас ссааабсббс ааааасбсбб 240
аабб 244
<210> 43
<211> 250
<212> ДНК
<213> АтагапбЬиз ра1тег1
<400> 43 ссабасббба сссаааассс адббасссаа абсббсаааа асбсббаабб ббддабсааа 60
сббдадаабб бсбссааадб бсабдбсббб аассаабааа ададббддбд ддсаабсабс 120
ааббдббссс аадаббсаад сббсбдббдс бдсбдсадсб дадааассбб сабсбдбссс 180
адаааббдбд ббасаассса бсааададаб сбсбддбасб дббсааббдс сбдддбсааа 240
дбсбббабсс 250
<210> 44 <211> 250 <212> ДНК <213> АтагапбЬиз ра1тег1
<400> 44 бсааададаб сбсбддбасб дббсааббдс сбдддбсааа дбсбббабсс аабсдаабсс 60
- 91 029482
ййсййййадс йдсйййдйсй дадддсасаа садйддйсда саасййдсйд йайадйдайд 120
айаййсйййа йайдййддас дсйсйсадаа сйсййддййй аааадйддад дайдайадйа 180
садссаааад ддсадйсдйа дадддййдйд дйддйсйдйй йссйдййддй ааадайддаа 240
аддаададай 250
<210> 45 <211> 250 <212> ДНК <213> АтагапйЬиз ра1тег1
<400> 45 дадддййдйд дйддйсйдйй йссйдййддй ааадайддаа аддаададай йсаасййййс 60
сййддйаайд саддаасадс дайдсдссса ййдасадсйд сддййдссдй йдсйддадда 120
ааййсаадйй айдйдсййда йддадйасса адаайдаддд адсдссссай йддддайсйд 180
дйадсаддйс йааадсаасй йддййсадай дйадаййдйй ййсййддсас аааййдсссй 240
ссйдййсддд 250
<210> 46
<211> 250
<212> ДНК
<213> АтагапйЬиз ра1тег1
<400> 46
йддййсадай дйадаййдйй ййсййддсас аааййдсссй ссйдййсддд йсаайдсйаа 60
аддаддссйй ссадддддса аддйсаадсй сйсйддайсд дййадйадсс аайайййаас 120
йдсасййсйс айддсйасйс сйййдддйсй йддадасдйд дадаййдада йадййдайаа 180
аййдайййсй дйассдйайд ййдааайдас аайааадййд айддаасдсй ййддадйайс 240
сдйадаасай 250
<210> 47
<211> 250
<212> ДНК
<213> АтагапйЬиз ра1тег1
<400> 47
ййдааайдас аайааадййд айддаасдсй ййддадйайс сдйадаасай адйдайадйй 60
дддасаддйй сйасаййсда ддйддйсада аайасааайс йссйддааад дсайайдййд 120
адддйдайдс ййсаадйдсй адсйасййсс йадссддадс сдссдйсасй ддйдддасйд 180
йсасйдйсаа дддййдйдда асаадсадйй йасадддйда йдйааааййй дссдаадййс 240
ййдадаадай 250
<210> 48
<211> 250
<212> ДНК
- 92 029482
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 48
асаадсадкк касадддкда кдкааааккк дссдаадккс ккдадаадак дддккдсаад 60
дксасскдда сададаакад кдкааскдкк аскддассас ссадддаккс акскддааад 120
ааасакскдс дкдскаксда сдксаасакд аасаааакдс садакдккдс какдаскскк 180
дсадккдккд ссккдкакдс адакдддссс ассдссакса дадакдкддс кадскддада 240
дкдааддааа 250
<210> 49
<211> 250
<212> ДНК
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 49
адакдддссс ассдссакса дадакдкддс кадскддада дкдааддааа ссдаасддак 60
даккдссакк кдсасадаас кдадааадск кддддсааса дккдаддаад дакскдакка 120
скдкдкдакс аскссдсскд аааадскааа ссссассдсс аккдаааскк акдасдакса 180
ссдаакддсс акддсаккск сксккдскдс скдкдсадак дкксссдкса скакссккда 240
кссдддакдс 250
<210> 50
<211> 257
<212> ДНК
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 50
сксккдскдс скдкдсадак дкксссдкса скакссккда кссдддакдс асссдкаааа 60
сскксссдда скаскккдак дккккадааа адкксдссаа дсаккдакда дкадскакак 120
асдадаксск каааккдкас дссдааддкк ккдакккдад кскаакадка дакааааддс 180
какааакааа скддскккск дсккдадкаа ккакдааакк скккдкакка кдкккдкдад 240
акккдаадка дсккака 257
<210> 51
<211> 273
<212> ДНК
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 51
кааккакдаа аккскккдка ккакдкккдк дадакккдаа дкадсккака ааккасаакд 60
каскааадкс кадааакаад ккакдкакск кккаааксаа кдадааакдс акасккдааа 120
ддсккдасск кдкакккдкд асскааадад каскаасккк ддадккксса асксакккдк 180
ккаксксакк кккккккаак ккккдаккка ааккдкккак ккккакдадк ааксакдкак 240
сккксккакк скаассааак дкаакасксс ккс 273
- 93 029482
<210> 52
<211> 301
<212> ДНК
<213> АтагапЕЬиз ра1тег1
<400> 52
ЕаЕдадЕааЕ саЕдЕаЕсЕЕ ЕсЕЕаЕЕсЕа ассаааЕдЕа аЕасЕссЕЕс саасЕсЕсЕЕ 60
ЕааасдЕсса сасЕсЕдддс асададЕдЕа аЕадЕдЕддЕ ддЕЕддадЕс ЕЕЕЕаадЕда 120
ЕЕаЕааЕааЕ ЕдЕаааЕдЕд дЕадЕЕадаа ЕаЕЕЕЕаадЕ ааЕдЕаддЕд дддЕаЕЕаЕд 180
дЕсЕЕдЕЕда асаЕаддаЕа ЕЕЕаддЕааа аааЕсЕаЕдс ааааааадда аадЕаадсаа 240
аЕааадсдаа ЕЕдассЕдаа аадаааадЕд дасаЕдЕаЕа дЕдадЕЕдда ддаадЕаЕЕЕ 300
Е 301
<210> 53
<211> 1710
<212> ДНК
<213> ЬасЕиса заЕчча
<400> 53
аЕдЕсЕсЕдЕ ЕЕддаааЕдЕ ЕЕсЕдссаЕЕ аасЕсаадЕд дааадЕдЕаЕ адЕааЕдааЕ 60
сЕЕЕсаадса сасаааЕсас ЕЕсаададаЕ ЕдЕЕЕсаада ЕЕассЕсадд дсааааадаЕ 120
дЕЕЕЕдЕсаЕ ЕЕддаЕдсЕд ЕдаЕдсЕаЕд ддЕаасадаЕ ЕдсааЕЕссс аадЕдсЕсдЕ 180
ЕсЕЕЕЕасас саадаЕсааа даадааЕдЕс ЕссссЕсЕаа аддЕадЕЕЕд ЕдЕЕдаЕЕаЕ 240
ссаадассад аЕсЕЕдаЕаа сасаЕсЕааЕ ЕЕсЕЕддаад сЕдсЕсасЕЕ дЕсЕЕсаасс 300
ЕЕсадаасЕЕ ссссасдссс аЕсЕаадсса ЕЕдаадаЕЕд ЕааЕЕдсЕдд ЕдсаддЕЕЕа 360
дсЕддЕЕЕаЕ саасЕдсЕаа дЕаЕЕЕадсЕ даЕдсаддЕс асаадссааЕ ЕЕЕасЕадаа 420
дсаададаЕд ЕЕсЕЕддЕдд аааддЕддса дсЕЕддааад аЕдаЕдаЕдд адаЕЕддЕаЕ 480
дадасаддЕЕ ЕасасаЕаЕЕ сЕЕЕддадсЕ ЕасссаааЕд ЕасааааЕЕЕ аЕЕЕддадад 540
сЕаддааЕЕа аЕдаЕадаЕЕ асадЕддаад дадсаЕЕсЕа ЕдаЕаЕЕЕдс ааЕдссаааЕ 600
аадссЕддад ааЕЕЕадЕад дЕЕЕдасЕЕс ссадаЕдЕЕЕ ЕассЕдсасс аЕЕдааЕдда 660
аЕЕЕЕЕдсЕа ЕаЕЕдаддаа сааЕдаааЕд сЕдасдЕддс сЕдадааадЕ даадЕЕЕдса 720
аЕЕдддсЕдЕ ЕдссЕдсааЕ дЕЕаддЕдда саддсЕЕаЕд ЕЕдаддссса адаЕдддсЕЕ 780
адЕдЕЕсадд асЕддаЕдад ааадсааддЕ аЕассЕдаЕс дадЕЕасЕас ЕдаадЕдЕЕЕ 840
аЕЕдсааЕдЕ саааадсаЕЕ ааасЕЕЕаЕа ааЕссадаЕд аасЕЕЕсааЕ дсааЕдЕаЕЕ 900
сЕсаЕЕдсЕс ЕааассдЕЕЕ ЕсЕЕсаддаа аадсаЕддЕЕ ссаадаЕддс аЕЕЕЕЕадаЕ 960
дддадсссас садааадасЕ ЕЕдсаадсса аЕЕдЕЕдасс асаЕсдадЕс асЕсддЕддс 1020
саадЕсадад ЕсаасЕсасд ааЕасааааа аЕЕдадЕЕаа асааадасдд аасЕдЕссдд 1080
- 94 029482
аасбббсбаб бдадбдабдд даабдббсба даадсбдабд сббабдбббб сдсбассссб 1140
дббдасаббс бсаадсббсб бббасссдаа даабддааас сааббссаба бббсаааааа 1200
ббададаадб бадбсддбдб бссбдббаба аасдббсаба бабддбббда садааадсбд 1260
ааааасасаб абдабсасбб асббббсадб аддбсассбс бдсбдадбдб дбабдсбдас 1320
абдбсадбда сабдбаадда абаббабдаб ссдаабаадб саабдббдда дббддббсбб 1380
дсбссадсбд аддаабддаб ббсаадаадб дасасбдаба ббаббдабдс аасаабдадб 1440
даасбббсаа ддсбббббсс бдабдааабб дсадсбдабс ааадбааадс ааааабсббд 1500
ааабабааад ббдббаааас ассааддбсб дбббабаааа сбдббссада ббдбдаасса 1560
бдбсдасссс басааадабс бссааббсаа ддаббббабб бабсбддбда ббабасбааа 1620
саааадбабб бддсббсааб ддддддбдсб дббббабсбд дааааабббд бдсасаадсб 1680
аббббасаад аббабдадаб дсббдсбаса 1710
<210> 54
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 54
баабасдасб сасбабаддд бббддадсбб асссааабдб ас 42
<210> 55
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 55
баабасдасб сасбабаддд аддссасдбс адсабббсаб бдббс 45
<210> 56
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 56
ссаббсаабд дбдсаддбаа аас 23
<210> 57
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 95 029482
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 57
сайадаайдс йссййссасй д 21
<210> 58
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 58
сааайааайй ййдйасаййй дддйаадсйс саа 33
<210> 59
<211> 2349
<212> ДНК
<213> 5о1апит 1усорегз1сит
<400> 59 дддйййайсй сдсаадйдйд дсйайддйдд дасдйдйсаа аййййддайй дйадссааас 60
айдадайййд айййаааддд ааййддссаа айсассдааа дсаддсайсй йсайсайааа 120
ййадйййдйй йайййайаса дааййайасд сййййасйад ййайадсайй сддйайсййй 180
ййсйдддйаа сйдссааасс ассасааайй йсаадйййсс айййаасйсй йсаасййсаа 240
сссаассааа йййайййдсй йааййдйдса даассасйсс сйайайсййс йаддйдсййй 300
саййсдййсс дадйаааайд ссйсаааййд дасййдйййс йдсйдййаас ййдададйсс 360
ааддйадййс адсййайсйй йддадсйсда ддйсдйсййс йййдддаасй дааадйсдад 420
айддййдсйй дсаааддаай йсдййайдйй ййдсйддйад сдаайсаайд ддйсайаадй 480
йааадаййсд йасйссссай дссасдасса даадаййддй йааддасййд дддссйййаа 540
аддйсдйайд саййдаййай ссаадассад адсйддасаа йасадййаас йайййддадд 600
сйдсаййййй айсайсаасд ййссдйдсйй сйссдсдссс аасйааасса ййддадаййд 660
ййаййдсйдд йдсаддйййд ддйддйййдй сйасадсааа айайййддса дайдсйддйс 720
асааассдай асйдсйддад дсаадддайд ййсйаддйдд аааддйадсй дсайддааад 780
айдайдайдд адаййддйас дадасйддйй йдсайайайй сйййддддсй йасссааайа 840
ййсадаассй дйййддадаа ййадддаййа асдайсдайй дсаайддаад даасаййсаа 900
йдайайййдс аайдссаадс аадссаддад ааййсадссд сйййдайййс йссдаадсйй 960
йасссдсйсс йййааайдда аййййадсса йсййааадаа йаасдааайд сййасайддс 1020
сададааадй сааайййдса аййддасйсй йдссадсаай дсййддаддд саайсййайд 1080
ййдаадсйса адайдддайа адйдййаадд асйддайдад ааадсааддй дйдссддаса 1140
- 96 029482
дддЕдасада ЕдаддЕдЕЕс аЕЕдсЕаЕдЕ саааддсасЕ саасЕЕЕаЕа аасссЕдасд 1200
аасЕЕЕсааЕ дсадЕдсаЕЕ ЕЕдаЕсдсаЕ ЕдаасаддЕЕ ЕсЕЕсаддад ааасаЕддЕЕ 1260
саааааЕддс сЕЕЕЕЕадаЕ ддЕааЕссЕс сЕдададасЕ ЕЕдсаЕдссд аЕЕдЕЕдаас 1320
асаЕЕдадЕс ааааддЕддс саадЕсадас ЕдаасЕсасд ааЕаааааад аЕЕдадсЕда 1380
аЕдаддаЕдд аадЕдЕсаад адЕЕЕЕаЕас ЕдадЕдасдд ЕадЕдсааЕс дадддадаЕд 1440
сЕЕЕЕдЕдЕЕ ЕдссдсЕсса дЕддаЕаЕЕЕ ЕсаадсЕЕсЕ аЕЕдссЕдаа дасЕддааад 1500
адаЕЕссаЕа ЕЕЕссаааад ЕЕддадаадЕ ЕадЕсддадЕ ассЕдЕдаЕа ааЕдЕасаЕа 1560
ЕаЕддЕЕЕда садаааасЕд аадаасасаЕ аЕдаЕсаЕЕЕ дсЕсЕЕсадс адаадсЕсас 1620
ЕдсЕсадЕдЕ дЕаЕдсЕдас аЕдЕсЕдЕЕа саЕдЕаадда аЕаЕЕасаас сссааЕсадЕ 1680
сЕаЕдЕЕдда аЕЕддЕЕЕЕЕ дсассЕдсад аададЕддаЕ аЕсЕсдсадс дасЕсадааа 1740
ЕЕаЕЕдаЕдс аасдаЕдаад даасЕадсаа сдсЕЕЕЕЕсс ЕдаЕдаааЕЕ ЕсадсадаЕс 1800
ааадсааадс аааааЕаЕЕд аадЕассаЕд ЕЕдЕсаааас ЕссдаддЕсЕ дЕЕЕаЕаааа 1860
сЕдЕдссадд ЕЕдЕдаассс ЕдЕсддссЕЕ ЕасааадаЕс сссааЕадад дддЕЕЕЕаЕЕ 1920
ЕадссддЕда сЕасасдааа садаааЕасЕ ЕддсЕЕсааЕ ддааддсдсЕ дЕсЕЕаЕсад 1980
дааадсЕЕЕд ЕдсЕсаадсЕ аЕЕдЕасадд аЕЕаЕдадЕЕ асЕЕдЕЕдда сдЕадссааа 2040
адаадЕЕдЕс ддаадсаадс дЕадЕЕЕадс ЕЕЕдЕддЕЕа ЕЕаЕЕЕадсЕ ЕсЕдЕасасЕ 2100
аааЕЕЕаЕда Едсаадаадс дЕЕдЕасаса асаЕаЕадаа даададЕдсд аддЕдаадса 2160
адЕаддадаа аЕдЕЕаддаа адсЕссЕаЕа сааааддаЕд дсаЕдЕЕдаа даЕЕадсаЕс 2220
ЕЕЕЕЕааЕсс саадЕЕЕааа ЕаЕааадсаЕ аЕЕЕЕаЕдЕа ссасЕЕЕсЕЕ ЕаЕсЕддддЕ 2280
ЕЕдЕааЕссс ЕЕЕаЕаЕсЕЕ ЕаЕдсааЕсЕ ЕЕасдЕЕадЕ Еааааааааа аааааааааа 2340
аааасЕсда 2349
<210> 60
<211> 200
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 60
Есдсадсдас ЕсадаааЕЕа ЕЕдаЕдсаас даЕдааддаа сЕадсаасдс ЕЕЕЕЕссЕда 60
ЕдаааЕЕЕса дсадаЕсааа дсааадсааа ааЕаЕЕдаад ЕассаЕдЕЕд ЕсаааасЕсс 120
даддЕсЕдЕЕ ЕаЕаааасЕд ЕдссаддЕЕд ЕдаасссЕдЕ сддссЕЕЕас ааадаЕсссс 180
ааЕададддд ЕЕЕЕаЕЕЕад 200
<210> 61
- 97 029482
<211> <212> <213> 43 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 61
баабасдасб сасбабаддд бсдсадсдас бсадааабба ббд 43
<210> <211> <212> <213> 62 45 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 62
баабасдасб сасбабаддд дбаааддссд асадддббса саасс 45
<210> <211> <212> <213> 63 21 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 63
сиассаисаа сааиддидис с 21
<210> <211> <212> <213> 64 21 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 64
ддасассаии диидаиддиа д 21
<210> <211> <212> <213> 65 21 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 65
дисдасааси идсидиаиад и 21
<210> <211> <212> <213> 66 21 РНК Искусственная последовательность
- 98 029482
21
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 66
асиаиасадс аадиидисда с
<210> 67
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последователь
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 67
ддисассидд асададааиа д
<210> 68
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последователь
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 68
сиаиисисид иссаддидас с
<210> 69
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последователь
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 69
ааидссадаи диидсиаида с
<210> 70
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последователь
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 70
дисаиадсаа саисиддсаи . и
<210> 71
<211> 2827
<212> ДНК
<213> АтагапЕЬиз ра1тег1
<400> 71
21
21
21
21
аЕддсаасаа ЕддсЕЕсссЕ адЕдадЕЕЕд ддаадсЕсЕд дадсаасЕЕд сЕсадддсаа
60
- 99 029482
ЕЕддаддЕЕЕ ссЕЕЕЕсаЕЕ ддЕЕаадааа аЕЕасаЕЕдс сЕадаадааа ЕЕдЕадЕЕдс 120
ааЕЕЕЕаддс ааЕЕаддадд ддддаддада ЕддсдЕЕасд ЕЕЕсддЕдЕд ЕадасЕЕЕсЕ 180
дЕсасЕасЕд аЕЕаЕдЕЕЕс Едадсаадда ааЕдсЕдЕЕЕ сЕсЕЕдаааа ЕдсаЕаЕадЕ 240
дададЕааад аададддЕсЕ саЕсЕЕдаад ссЕЕсЕссЕа адссддЕЕЕЕ даааЕссддд 300
ЕсЕдаЕддаа аЕсддаааЕЕ ЕддддададЕ ЕсддЕддсдЕ ЕЕЕсдадЕаа ЕдддаааЕЕд 360
даЕааЕдЕад аддададдаа дааддЕЕаЕЕ даЕЕсаЕЕдд аЕдаддЕаЕЕ адааааддсс 420
дададаЕЕад ааасддсдаа сЕЕасаадса даЕааЕадаа аддаЕадсас аааЕдЕаааЕ 480
ааассдЕсЕс сдадЕдЕаад ЕадЕЕсаасс ааЕддЕааас сЕдЕаааЕаа ЕЕЕдаасааа 540
дддаадссЕа аадсЕдсдаа дадсдЕЕЕдд адааадддаа аЕссадЕЕЕс ЕасЕдЕдсаа 600
ааадЕадЕдс аадааЕсЕсс даадаЕЕдаа ааддЕЕдада дадЕддаадс Есдаасдасс 660
адссааЕсдЕ сЕдааасдаЕ аадассссса дЕдссасЕас ададдссЕда даЕЕаадЕЕд 720
саддсааадс сЕЕсЕасЕдс ЕссЕссассс аЕдссЕаада адссддЕЕЕЕ дааддаЕдЕд 780
дддаЕдЕссЕ ссададсЕда Едддааддас садЕсЕдЕда ааЕсЕааада даддаадссЕ 840
аЕЕсЕадЕдд асаааЕЕЕдс сассаадаад дсаЕсадЕЕд аЕссдЕсдаЕ ЕдсЕсаадса 900
дЕааЕЕдссс сассаааасс ЕдсЕаааЕЕЕ ссЕЕсЕддаа адЕЕЕааада ЕдаЕЕаЕсдд 960
аадаадддЕс ЕЕдсадсЕдд Едддссдаад аддсдЕаЕдд ЕсааЕдаЕда ЕдаЕаЕЕдаа 1020
аЕдсаЕдаад асасЕЕсада дсЕсддЕсЕЕ ЕсЕаЕЕссЕд дЕдсЕдсЕас ддсЕсддааа 1080
ддсаддаааЕ ддадЕааддс аадЕсдсаад дсЕдссадас дссаадсадс ЕададаЕдсс 1140
дсЕссЕдЕЕа аадЕддаааЕ сЕЕададдЕЕ даадаааадд дсаЕдЕсдас сдаадааЕЕа 1200
дсаЕасаасЕ ЕддсЕаЕЕад сдааддЕдаа аЕЕсЕЕдддЕ ассЕдЕаЕЕс ЕааддддаЕа 1260
ааассадаЕд дЕдЕдсааас ЕсЕЕдасаад дсааЕддЕаа адаЕдаЕаЕд ЕдааадаЕаЕ 1320
дасдЕддадд ЕЕЕЕддасдс асЕЕЕсЕдаа саааЕддаад аааЕддсЕсд ааадааддаа 1380
аЕЕЕЕсдасд аадаЕдассЕ ЕдасаадсЕЕ даадаЕаддс сЕссЕдЕдсЕ ЕасЕаЕааЕд 1440
ддЕсаЕдЕад аЕсаЕддсаа дасдасссЕЕ сЕддаЕЕаЕа Еасддаадад сааддЕЕдсЕ 1500
дсЕЕсЕдаад сЕддЕдддаЕ ЕасасааддЕ аЕЕддЕдсЕЕ аЕааадЕдда адЕассддЕЕ 1560
даЕддсаадЕ ЕдсЕдссЕЕд ЕдЕсЕЕЕсЕЕ дасасЕсссд дасасдаддс дЕЕсддддса 1620
аЕдадддсЕс дЕддадсаад адЕдасадаЕ аЕЕдсЕаЕЕа ЕадЕЕдЕадс ЕдсЕдасдаЕ 1680
дддаЕссдЕс сЕсааасааа ЕдаадссаЕа дсасаЕдсаа аадсадсЕдд ЕдЕассЕаЕЕ 1740
дЕддЕЕдсаа ЕЕааЕаадаЕ ЕдасааддаЕ ддддсЕааЕс сддассдЕдЕ даЕдсаадад 1800
сЕЕЕсаЕсаа ЕЕддЕсЕааЕ дссададдаЕ ЕддддЕддЕд аЕассссааЕ ддЕсаадаЕа 1860
адЕдсЕсЕаа ааддЕдаааа ЕдЕддасдад ЕЕасЕсдада садссаЕдсЕ ЕдЕсдссдад 1920
- 100 029482
ббдсаададб баааддсбаа бссбсададд аасдсбаадд дсасбдбааб бдаддсбддб 1980
сббсабаааб сааааддасс саббдссасб бббаббдбдс адаабддбас ссбсааасаа 2040
ддддабасбд бадбббдбдд ддаадсаббб дддааддббс дбдсссбабб бдабсасдда 2100
дддаабсдсд ббдабдаадс бддбссабсб аббсссдбдс аддббаббдд аббдаабааб 2160
дббссббббд ссддбдабда дббсдаддба дбдадббссс ббдабабадс бсдбдаааад 2220
дсададдбсс дбдсададбс бббасдаааб дадсдбабад сбдсбааддс сддадасдда 2280
ааддббасдс бдбсабссбб ддсабсддсб дбббсббсад ддаадабддс бддбббддаб 2340
ббдсассадб бааабабсаб бббдааддбб дабдббсадд дабсаабсда ддсаббдадд 2400
саадсбсбад аадббсббсс бсаадабаас дбсасбббда адбббсбсбб асаадсдасс 2460
ддадабдбба сбасаадбда бдббдабсбб дсадббдсба дбааадсбаб бабсббдддд 2520
ббсаабдбда аддсассадд ббсбдбсдаа аааббадсад абаасааадд бдббдааабб 2580
сддсбббаба аадбсаббба бдабсбаабб дасдасабдс ддадбдсааб ддааддаабд 2640
сбадабсссд ббдаддааса адббдсаабб ддббсадссд аадбдсдддс басаббсадб 2700
адбддбадбд дссдбдбсдс бддабдсабд дбдассдадд дааадаббас саааддсбдб 2760
дддаббсдад бдабасддаа дддааааасб дбссасдббд дадббсббда ббсдббдсдб 2820
сдадбаа 2827
<210> 72
<211> 200
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 72
бббсдадбаа бдддаааббд дабаабдбад аддададдаа дааддббабб даббсаббдд 60
абдаддбабб адааааддсс дададаббад ааасддсдаа сббасаадса дабаабадаа 120
аддабадсас ааабдбаааб ааассдбсбс сдадбдбаад бадббсаасс аабддбааас 180
сбдбааабаа бббдаасааа 200
<210> 73
<211> 160
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 73
иисдадиааи дддаааиидд аиааидиада ддададдаад ааддииаиид аиисаиидда 60
идаддиаииа дааааддссд ададаииада аасддсдаас ииасаадсад аиааиадааа 120
- 101 029482
ддаиадсаса ааидиаааиа аассдисисс дадидиаади 160
<210> 74
<211> 160
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 74
асииасасис ддадасддии иаиииасаии идидсиаисс ииисиаииаи сидсиидиаа 60
диисдссдии исиааисиси сддссиииис иааиассиса иссааидааи сааиаассии 120
сииссисисс исиасаииаи ссааиииссс аииасисдаа 160
<210> <211> <212> <213> 75 22 ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 75
аЬЬЬсЬссаа асдсЬсЬЬсд са
<210> 76
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 76
аЬссааЬЬЬс ссаЬЬасЬсд аа
<210> 77
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 77
дЬЬЬсЬааЬс ЬсЬсддссЬЬ ьь
<210> 78
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
22
22
22
- 102 029482
<400> 78
ЕЕдаасЕасЕ ЕасасЕсдда д 21
<210> 79
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 79
ЕаассЕЕсЕЕ ссЕсЕссЕсЕ а 21
<210> 80
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 80
дЕссЕЕссса ЕсадсЕсЕдд а 21
<210> 81
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 81
сдЕадсадса ссаддааЕад 20
<210> 82
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 82
садсадсЕас аасЕаЕааЕа д 21
<210> 83
<211> 25
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 83
сиассаисаа сааиддидис саиас 25
- 103 029482
<210> <211> <212> <213> 84 27 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 84
диаиддасас саиидиидаи ддиадиа 27
<210> <211> <212> <213> 85 23 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 85
адииддиддд сааисаисаа иид 23
<210> <211> <212> <213> 86 27 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 86
аасааиидаи даиидсссас саасиси 27
<210> <211> <212> <213> 87 24 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 87
ддисдасаас иидсидиаиа дида 24
<210> <211> <212> <213> 88 27 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 88
аисасиаиас адсаадииди сдассис 27
<210> 89
- 104 029482
<211> <212> <213> 24 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 89
идсааддиса ссиддасада дааа 24
<210> <211> <212> <213> 90 27 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 90
иаиисисиди ссаддидасс иидсаас 27
<210> <211> <212> <213> 91 21 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 91
аасаидааса аааидссада и 21
<210> <211> <212> <213> 92 21 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 92
аисиддсаии иидиисаиди и 21
<210> <211> <212> <213> 93 27 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 93
диаиддасас саиидиидаи ддиадиа 27
<210> <211> <212> <213> 94 27 РНК Искусственная последовательность
- 105 029482
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 94
иасиассаис аасааиддид иссаиас
<210> 95
<211> 27
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 95
ааиааиидаи даиидсссас саасиси
<210> 96
<211> 27
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 96
ададииддид ддсааисаис ааииаии
<210> 97
<211> 27
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 97
аисасиаиас адсаадииди сдассас
<210> 98
<211> 27
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 98
диддисдаса асиидсидиа . иадидаи
<210> 99
<211> 27
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
27
27
27
27
27
- 106 029482
<400> 99
иаиисисиди ссаддидасс иидсаас 27
<210> <211> <212> <213> 100 27 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 100
диидсаадди сассиддаса дадааиа 27
<210> <211> <212> <213> 101 29 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 101
ддиаиддаса ссаиидиида иддиадиас 29
<210> <211> <212> <213> 102 29 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 102
дсиассаиса асааиддиди ссаиассас 29
<210> <211> <212> <213> 103 29 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 103
даадааиида идаиидссса ссаасисас 29
<210> <211> <212> <213> 104 29 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 104
дадииддидд дсааисаиса аииаиисас 29
- 107 029482
<210> 105
<211> 27
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 105
даисасиаиа садсаадиид исдасас
<210> 106
<211> 27
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 106
дисдасааси идсидиаиад идаисас
<210> 107
<211> 29
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 107
диаиисисид иссаддидас сиидсасас
<210> 108
<211> 29
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 108
дидсааддис ассиддасад адааиасас
<210> 109
<211> 58
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 109
диаиддасас саиидиидаи . ддиадиадаа аиасиассаи
<210> 110
27
27
29
29
58
- 108 029482
58
<211> 58
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 110
ааиааиидаи даиидсссас саасисидаа аададиидди дддсааисаи сааииаии
<210> 111
<211> 58
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 111
аисасиаиас адсаадииди сдассасдаа адиддисдас аасиидсиди аиадидаи
<210> 112
<211> 58
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 112
иаиисисиди ссаддидасс иидсаасдаа адиидсаадд исассиддас ададааиа
<210> 113
<211> 168
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 113
даисасаааи иидссддиии аидаисаааи асддаасаиа адасадаиас асиидаасас
саидаиисдс аиидддддид иддииасисд исдиисидда диаиисссис адиидаидса
ддидаадиаи дасидсааиа ааидиддддс иаиссиддди сссиииии
<210> 114
<211> 168
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 114
ааааадддас ссаддаиадс сссасаиииа иидсадисаи асиисассид саисаасида
дддааиасис садаасдасд адиаассаса сссссааидс дааисаидди диисаадиди
58
58
60
120
168
60
120
- 109 029482
аисидисииа идииссдиаи иидаисаиаа ассддсаааи иидидаис 168
<210> <211> <212> <213> 115 25 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 115
иииисиааиа ссисаиссаа идааи 25
<210> <211> <212> <213> 116 25 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 116
аиисаиидда идаддиаииа даааа 25
<210> <211> <212> <213> 117 25 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 117
иаисидсиид иаадиисдсс дииис 25
<210> <211> <212> <213> 118 25 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 118
дааасддсда асииасаадс адаиа 25
<210> <211> <212> <213> 119 25 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 119
ддадасддии иаиииасаии идидс 25
- 110 029482
<210> 120
<211> 25
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 120
дсасаааиди аааиааассд исисс 25
<210> 121
<211> 25
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 121
иаиииасадд иииассаиид диида 25
<210> 122
<211> 25
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 122
исаассааид диааассиди аааиа 25
<210> 123
<211> 185
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 123
дасддааасс сиссададад дсидидсаид ссиаиидииа аасасаисда дисасиадди 60
ддидаадииа аасииаасис исдиаиасаа аадаиисади иддассадад иддаадсдид 120
аададиииии идсиаааиаа сдддадддаа аиасдаддад аидссиаиди иииидссасс 180
ссади 185
<210> <211> <212> <213> 124 185 РНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
- 111 029482
<400> 124
асиддддидд сааааасаиа ддсаисисси сдиаиииссс исссдииаии иадсаааааа 60
сисиисасдс ииссасисид диссаасида аисиииидиа иасдададии аадиииааси 120
исассассиа дидасисдаи дидиииааса аиаддсаидс асадссисис иддадддиии 180
ссдис 185
<210> 125
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 125
дЕдаЕаЕЕас сЕссаасасд аЕ 22
<210> 126
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 126
аЕадЕаадса саддаЕсдда д 21
<210> 127
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 127
сЕЕЕсааЕсс асЕдЕсаасс д 21
<210> 128
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 128
аЕсаадсдЕЕ сдаадассЕс аЕ 22
<210> 129
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 112 029482
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 129
садсааЬддс ддЬаддЬаас а 21
<210> 130
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 130
дсааЬЬдссс дааЬссЬЬЬЬ а 21
<210> 131
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 131
ЬадсЬсааЬа ЬсааддЬссЬ а 21
<210> 132
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 132
ЬсаЬаадсас ссЬсЬаЬаса с 21
<210> 133
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 133
ЬЬсЬЬаассЬ сдЬсдадаЬд 20
<210> 134
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
- 113 029482
<400> 134
а5асссдад5 а5сс55дсаа а 21
<210> 135
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 135
5адддсссас ддсс55ддад 5 21
<210> 136
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 136
адсдда5а5а асс5садс5а д 21
<210> 137
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 137
с55сд5ддсс саасдаа5да с 21
<210> 138
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 138
саадс5сддд 5ссс5дс55д с 21
<210> 139
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 139
ддаадд5ада 5даса5дад5 5 21
- 114 029482
<210> 140
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 140
дабддсабад ббассасбдб с 21
<210> 141
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 141
бссдбадсбб асабассдаа д 21
<210> 142
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 142
бссаадбдаа баддадааас а 21
<210> 143
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 143
адсадсббсб дсдбсббсба с 21
<210> 144
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 144
асадсасдса сдссаадасс д 21
<210> 145
<211> 21
- 115 029482
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 145
сдабдбаадд аабббддбаа а 21
<210> 146
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 146
сдаддддабб дсадсадаад а 21
<210> 147
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 147
дбаддадааб асддбдаадб а 21
<210> 148
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 148
дассссаада ааабсдбсбд с 21
<210> 149
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 149
дбсббасаад ддббсбсаа 19
<210> 150
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 116 029482
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 150
аЕсЕаЕдЕЕс ассЕсссЕдЕ д 21
<210> 151
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 151
аЕааассаЕЕ адсЕЕЕсссд д 21
<210> 152
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 152
ЕЕЕаЕЕддаа саадсддадЕ Е 21
<210> 153
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 153
ЕаЕадсасса сЕЕсссдаЕа д 21
<210> 154
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 154
дсассасдад даЕсасаада а 21
<210> 155
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
- 117 029482
<400> 155
ссасссдада аассбсбсса а 21
<210> 156
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 156
садбсббдас дадбдаббсс б 21
<210> 157
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 157
дббсббсадд дсбааабсдд да 22
<210> 158
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 158
дббсаададс ббсаасдада ас 22
<210> 159
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 159
абасааасбс саасдсдбсс ад 22
<210> 160
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 160
сбсббддааа дсабсадбас са 22
- 118 029482
<210> 161
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 161
сЕадааадаЕ асссасссаа ЕЕ 22
<210> 162
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 162
асЕадааЕЕс ааасасссас сс 22
<210> 163
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 163
ЕЕЕсЕдсЕса ЕЕсаасЕссЕ сс 22
<210> 164
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 164
ЕаЕдЕаЕдЕд сссддЕЕадс ЕЕ 22
<210> 165
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 165
ЕсаЕаЕссаа дссадаЕссЕ с 21
<210> 166 <211> 21
- 119 029482
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 166
кдсаксасас аксассаада к 21
<210> 167
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 167
дкасксскдк ксаакдссак а 21
<210> 168
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 168
аккдакасса дсакададас а 21
<210> 169
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 169
адсааккскс кскадаакдк а 21
<210> 170
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 170
саксакксск саксдаскка д 21
<210> 171
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 120 029482
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 171
сйсйсдййдс ссйсйссайа а 21
<210> 172
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 172
саасдсссса ддадааадйй с 21
<210> 173
<211> 195
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 173
сидаадсидд идааддидаа даиддасдаа идаааисидс даииддааии дддасссиис 60
иисаддаидд сиидддадаи асдаисаддд идисисиаас адаассасса даададдада 120
иадасссиид садааддиид дсаааисиид даасаааадс адсидаааии садсааддад 180
иддсассаии идаад 195
<210> 174
<211> 195
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 174
сиисаааидд идссасисси идсидааиии садсидсиии идииссаада ииидссаасс 60
иисидсаадд дисиаисисс исиисиддид диисидииад адасасссид аисдиаисис 120
ссаадссаис сидаадаадд дисссааиис сааисдсада ииисаиисди ссаисиисас 180
сиисассадс иисад 195
<210> <211> <212> <213> 175 183 РНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
- 121 029482
<400> 175
исссаисааа диисссиаса аааиаидидс адиииссиаи сииссиидсс дссаиисаиа 60
сааасиаиди идаиидиаса аддиддсиид дидаииииди исииисиаад адидиидаса 120
аидадаииди асидидддад ссааииаида аддадсааис иссиддадад ддиисадиид 180
аса 183
<210> 176
<211> 183
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 176
идисаасида асссисисса ддадаиидси ссиисаиааи иддсисссас адиасааиси 60
саиидисаас асисииадаа адаасааааи сассаадсса ссиидиасаа исаасаиади 120
иидиаидааи ддсддсаадд аадаиаддаа асидсасаиа иииидиаддд аасииидаид 180
дда 183
<210> 177
<211> 143
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 177
иидидсииаа аасаисдасс адасадасаа иаииисиисс идиидиидда сиадиидаис 60
сидаиасдси дааассидди даиииадиид дидисаасаа адаиадииаи сииаиссидд 120
асасисидсс дисддааиаи дай 143
<210> 178
<211> 143
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 178
аисаиаиисс дасддсадад идиссаддаи аадаиаасиа исииидиида сассаасиаа 60
аисассадди иисадсдиаи саддаисаас иадиссааса асаддаадаа аиаиидисид 120
исиддисдаи дииииаадса саа 143
<210> 179
<211> 159
<212> РНК
- 122 029482
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 179
сдсидсадии ддидаадиад аисссддсаа ддддаиииса сиссддииис сасдисидди 60
исдиаиссда даддаиаааи сиссададда сдссасаиса исидадсадд иддсддаиаи 120
диасадаиси саадсаааса аиссасассд сааааадад 159
<210> 180
<211> 159
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 180
сисииииидс ддидиддаии дииидсиида даисидиаса иаиссдссас сидсисадаи 60
даидиддсди ссисиддада иииаиссиси сддаиасдаа ссадасдидд ааассддади 120
даааисссси идссдддаис иасиисасса асидсадсд 159
<210> 181
<211> 159
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 181
иааадаиддс ддаааааисд асиаидаиаа аиидаиидас аааиисддси дисадсдаси 60
идаиииаисд сисаиисада дааиидадсд саисасидси сдиссидсис аидиаиииси 120
исдссдсаас диииисиисд сисассдида ииидааида 159
<210> 182
<211> 159
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 182
исаиисаааи сасддидадс даадаааасд иидсддсдаа даааиасаид адсаддасда 60
дсадидаидс дсисааииси сидааидадс даиаааисаа дисдсидаса дссдааииид 120
исааисааии иаисаиадис даиииииссд ссаисиииа 159
<210> 183
<211> 150
- 123 029482
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 183
идаадсидаи дсидааддаа аддаиаиида идсиадидаа диадиисдсс саадддидсс
аииадаадси идссиадсиа дсиасисадс иссддаддад дидаиддаси исиасадсас
идсаиидаад дсаааддсаа сидсиасааа
<210> 184
<211> 150
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 184
ииидиадсад иидссииидс сиисааидса дидсидиада адиссаисас сиссиссдда
дсидадиадс иадсиаддса адсиисиааи ддсасссиид ддсдаасиас иисасиадса
исааиаисси ииссиисадс аисадсииса
<210> 185
<211> 155
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 185
асассидссс иаасаисисд дддиииисис даадаадаии иидииааади ддссдадиаи
ииидаидсид сидииаадси ддсисиаааа аисааддсид асасаааадд аасааадиид
ааддасиисд иидссассии дсадисидди дииии
<210> 186
<211> 155
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 186
аааасассад асидсаадди ддсаасдаад иссиисааси иидииссиии идидисадсс
иидаиииииа дадссадсии аасадсадса исааааиаси сддссасиии аасааааиси
исиисдадаа аассссдада идииадддса ддиди
60
120
150
60
120
150
60
120
155
60
120
155
<210> 187
- 124 029482
<211> 159
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 187
идаасиасда адсаддсааа иисиссаааа диаааддсаи иддадиииии дддааидасд 60
ссаадааиис иааиаиасси диадаадиди ддадаиасиа исидсиааса аасаддссид 120
аддиаисада сасаиидиис асиидддсдд аисиисаад 159
<210> 188
<211> 159
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 188
сиидаадаис сдсссаадид аасааидиди сидаиассис аддссидиии дииадсадаи 60
адиаисисса сасиисиаса ддиаиаииад ааиисииддс дисаииссса аааасиссаа 120
идссиииаси иииддадааи иидссидсии сдиадииса 159
<210> <211> <212> <213> 189 24 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 189
ксссаксксс сасакдддкк аскд
24
<210> <211> <212> <213> 190 24 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 190
садкаассса кдкдддадак ддда
<210> <211> <212> <213> 191 22 ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
24
- 125 029482
<400> 191
ддсбдабдаа аббсаадбдс ба 22
<210> 192
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 192
ааасбдадсб бддааабааб с 21
<210> 193
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 193
даасссаааа ббдбсасббб бб 22
<210> 194
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 194
абдсасббдб ббабасбсбб дбса 24
<210> 195
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 195
абббаббадб дббсбааада а 21
<210> 196
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 196
бдбадбадсб бабаадабба дсбб 24
- 126 029482
<210> 197
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 197
д55д5ссс55 55а5ддд5с5 55 22
<210> 198
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 198
сссд5дсаа5 55с5дддаад с 21
<210> 199
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 199
а55ад55555 5а5асасдаа ада5 24
<210> 200
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 200
а5с555сд5д 5а5аааааас 5аа5 24
<210> 201
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 201
55дд5дд555 ддссас55сс д5 22
<210> 202 <211> 21
- 127 029482
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 202
ЕЕЕдЕЕЕдсЕ аЕЕЕадсЕдд а 21
<210> 203
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 203
сааЕЕЕдсад саасЕсдсас Едда 24
<210> 204
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 204
ЕсссассаЕЕ ддсЕаЕЕссд ас 22
<210> 205
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 205
сЕдЕсЕсЕсЕ ЕЕЕЕааЕЕЕс Е 21
<210> 206
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 206
ссасЕЕЕдса сасаЕсЕссс асЕЕ 24
<210> 207
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 128 029482
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 207
даддаЬссас дЬаЬадЬадЬ ад 22
<210> 208
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 208
ЬЬЬаааЬааа даааЬЬаЬЬЬ а 21
<210> 209
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 209
ЬааЬасдасЬ сасЬаЬаддд сЬЬдадЬЬЬа ЬаасдаадсЬ 40
<210> 210
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 210
ЬааЬасдасЬ сасЬаЬаддд сЬЬсЬааЬЬЬ Ьсааддасд 39
<210> 211
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 211
адсЬЬсЬааЬ ЬЬЬсааддас даЬа 24
<210> 212
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
- 129 029482
<400> 212
дбсабдбдас бссасбббда ббббд 25
<210> 213
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 213
сбсааббссд абааабббаа даааб 25
<210> 214
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 214
сдаадсбабб ддассдассб аабббс 26
<210> 215
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 215
ддааббдадд дсббсссада ааббдс 26
<210> 216
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 216
абдасббббб даббддбдаа асбаа 25
<210> 217
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 217
баабасдасб сасбабаддб ддаасбссаа сасасааааа абббс 45
- 130 029482
<210> 218
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 218
баабасдасб сасбабаддб бдааааабаа бсабаабббб а 41
<210> 219
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 219
дсабаабаба ббдабссддб аб 22
<210> 220
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 220
сбдааадббс абасабаддб асбс 24
<210> 221
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 221
ддбасбссаа ббббсадбаб аб 22
<210> 222
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 222
сбдааааббд дадбассбаб дбаб 24
<210> 223
<211> 27
- 131 029482
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 223
аЕдЕаЕдаас ЕЕЕсадааЕа ЕЕаЕасс 27
<210> 224
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 224
ЕассддаЕса аЕаЕаЕЕаЕд сЕ 22
<210> 225 <211> 647 <212> ДНК <213> АтагапЕЬиз ра1тег1
<400> 225 ЕЕсааааЕда аЕЕЕааааЕЕ аЕаЕаааааЕ сааЕаЕддас асаадассдд аЕаЕсааЕсс 60
дасссдаааЕ адЕЕдасЕЕд аааЕсаассЕ даЕдасссда аЕдаасассЕ сЕадЕЕаЕса 120
сЕаасааддд ЕсадаЕЕдсд ЕасаЕсааас сссЕсаааЕс сЕдсЕЕаддЕ дддадсЕЕдЕ 180
сааЕддсЕЕа ддддЕаасдд дааЕдЕдЕдЕ дсЕаЕдЕаса ЕЕдЕдсаЕсЕ аЕЕсЕЕаЕдс 240
ЕЕаЕЕЕаЕдЕ ЕдадЕЕадЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕдд аЕсаааЕаЕа аададсЕЕаа сЕЕЕЕдЕаЕЕ 300
ЕЕсЕЕдаЕдЕ ддЕдЕадЕдд ЕдаЕдаадаЕ саддсЕдада дааЕсЕаааЕ ЕддссааааЕ 360
ЕсЕдададаа саадаадЕда дЕЕсадсссЕ ЕсдЕдсЕдсЕ ддЕдЕЕддЕд ЕдаЕЕадЕЕд 420
саЕсаЕасад ададаЕдаад ддсдаасЕсс даЕдаддсаЕ ЕсаЕЕсЕаЕЕ ддЕсадсада 480
аааасааЕаЕ ЕаЕадЕдадд адссЕЕЕасЕ асдЕсаЕЕЕд даасссссЕс ЕаЕсЕаЕдЕа 540
ЕсЕсдадсЕд дЕасЕадЕсЕ сЕдаассдаЕ ЕдссЕЕЕсЕЕ сЕдсЕЕЕдЕЕ аЕЕЕЕдЕдЕд 600
аЕаЕЕЕсдас ЕЕаадЕсЕаа ЕЕЕасаЕсдЕ ЕЕЕдЕасаЕЕ ЕдЕЕаЕс 647
<210> 226
<211> 738
<212> ДНК
<213> АтагапЕЬиз ра1тег1
<400> 226
ЕЕЕЕдсЕЕЕЕ ЕЕасЕаЕЕаЕ ЕЕссЕЕсЕЕЕ ЕсааддаЕЕЕ дадЕЕдЕЕЕа ЕЕдсЕдасЕд 60
сЕЕссЕаЕдЕ аЕЕасссаЕа ЕдЕсЕсЕдЕа ЕаддсаЕЕас дддадсЕдЕа ссЕасаЕсЕа 120
асЕссЕаЕас аасдЕдЕдаа ЕаЕЕдсссдд саЕссЕааЕс дссссасЕЕЕ ЕсЕЕдассас 180
- 132 029482
д5а55садса 5сасадаааа дд555с5да5 55а55а5аа5 5555д5са55 5д5а55сас5 240
с55саа5ааа д5аса5сса5 5а5саа5с55 5асддадд55 д55сасасаа с55с55д555 300
са5555дса5 аа55ад555д 5ддаас5аса 5ддада5сд5 дс5дд55а5д а5дассс5дс 360
5а5ад55ас5 ддсс55дд5а сда5ада5дд 5аддсд55а5 а5д55са55д д5са5саааа 420
дддаадааа5 асдааддааа а5а55дсасд даа555сддд а5дсс5ас5с с5са5ддд5а 480
аа5дс555ас 5а5аа5д555 5ас555аа55 5аа55асс5а 5д55а555ад да5даааа5д 540
аа5ас5555с 55а55ас5а5 5ас55адд55 сс5аа5дсас ааааассд5а а55а55аа5д 600
5ассс5аа5д даа55аасас а5дд5аа55а адс5с5ссдс 555д5д5аа5 5аа5ссаа55 660
5555ададад 5сааа5ад55 садд55ааас 5ададс5555 са5асссааа 5аа5аааасс 720
ааддд5ааа5 55ссаааа 738
<210> 227
<211> 880
<212> ДНК
<213> Атагап5Ьиз ра1тег1
<400> 227
а5д5да5саа 55ааадаааа ад5с5аа55а 5а5дадсссд 5с5сасад5д асддадс5а5 60
са5ададссс а5дддд5сас д5дссс55сд ддд55555ад аааааа55са аад5а5ас55 120
55с5а55аа5 аадад5аааа а5д5аааа55 аа5а55ааас 5с5555да5а а5ааа5ас5с 180
5с5сас555а д5аа5555д5 с55а555а55 5а5555а5с5 са5д5д555а а5аадд5сад 240
55дас55а55 55д55сса55 55с5555а5д д5а5дссд5а 555аааа555 5адсаад5аа 300
ада5аааа5а д55д55аа5с 55асааа5аа аас5с5а5сд ааа555са5с са55ад55аа 360
5д5ссссааа аад5ссдаас 5асааа5сда ссас5д5са5 саса5дд5да да5ад5с5са 420
5а5аааасда д55сад55а5 5аааддаааа 5аддааасас дааасад55а а555аддсдд 480
ддсс5а5д5а 55а5ссааа5 д5да5ас5сс ад5ссаса55 ас5сад5сс5 5ссаа55даа 540
сад55ддс55 аа5с5ассаа дсдсд5ддсс а5ааа5дсс5 с5аасас555 5саа5с5с5с 600
ада5аас5с5 сасассас55 а5са5сасаа 55сасаа55а с5с5аа55с5 5555а55сс5 660
55сса5д5сд с5аа5555с5 ас5да55сад д5555а55с5 садс5555а5 саа5555а55 720
5са5дс5555 5а5д5саа55 5с55д555сд са5555д5с5 5ссас55дс5 д5с5д5555а 780
55аа5саа55 55д5а5да55 д55ддаа5аа 55д5а5д5а5 5555са5да5 555сс5с55а 840
5ддадд55са 5аа5д5а55д с5ада555д5 55ас555сас 880
<210> 228 <211> 453 <212> ДНК <213> Атагап5Ьиз ра1тег1
- 133 029482
<400> 228
аайййдадсд ддаааайййй аайайсаййа аайадйсййй дсйййадйай айадаайадй 60
йааааййаай адйсааасйй аййдйаайад сайдсасйаа йсйайаайаа йсййайссйд 120
ааадсйайаа йааааййайа аааааайайа йдйдааааас йаайййдадс дддааааййй 180
йаассааддд сйаасасдйа йсаййааайа дйсйййасйй йадйайайад аайдайаайй 240
аасдайсайа ааасаааайй дйсасйййса дйадсааасй йасаааайда дсададйасс 300
йсайайсайа аааййдсййс йййсйсаййй дййдйдййдс йсйсаййййа ддадййсайс 360
дйййайайсд йсдйсййасс асйсаайсас ййййадаййй аййадйадса сййссйсаай 420
сйасадсадс аайййсйаса дййсаасаас сйс 453
<210> 229
<211> 3953
<212> ДНК
<213> АтагапйЬиз ра1тег1
<400> 229
ддаааайййа ссйадаайаа йссаайййай йсдйдайййй йсйасааайй ссаасййсаа 60
ддддйайййд ссйааадйаа ййааасййдд айассссдай дассйдсйай адйадайаай 120
ййассадааа аййааааайд ааааййаайй йааааййада дааааайййй дааайййсай 180
айаааааайй ййааайаайа ааааааайай аааййййййй даасаййййа ййййаайсйа 240
йсййййййда ааааайаааа сййадййайа дсаадйдайс йддйсассдд дйййасйсйа 300
ддаааайайс ссйсааадйй дадаййаййс айддййаайа аайаддйдад аййаййайад 360
аааааййасд аайаааййдд аййаййдййд дйаайййййй йййсаааасй айсссйадда 420
аддассййай йадйдаййсй сссйсйасйй йддаддадйа йаййдйддас ййсссайсйй 480
ссййааййдй аййдйаасйй ййаасйаййд аййсйййааа ааааадаасй йайааааййд 540
йадддййаай аааайсйаад аййййайсйа айййсасййй даййаййссд аййййдйайй 600
сасаййаййй йааайдасай йсдйсааайа аааааааайа дйййсаййдс аййссааййй 660
йдййдасйад ддддаййааа дааадаайад йайсаайаай сдйаайдйад саадйадйас 720
аааадаадйа йайййсаайа йдйсааасйй йдайсйсдйй дйаасййдйа айййдйасда 780
йдсддйдйда айдасайасй йсассййййй саййаййййа йасйддйадй дасайдддай 840
йаййаййдсд айайййдсад йаайдаааай ййййййддйй дййдсййййа сааасааааа 900
ййсйассдаа ййййййаййа айййааййса асасдййддй дййасссайд айййайаддй 960
сйдддйссдс сасйдсйадс йаасаййааа саайййааса аасйсаайас ассаассйаа 1020
ааайаааайй йййййддсса йаайййййад ааййййадйй йййааасайй айайййддда 1080
аййййййййс сййййайайа йайаааайаа ааааааайсс аааааадддд асасасаййа 1140
айасасасйй дааадсайсд айдайайсда адааааасса дайддддйдс ссааййайсй 1200
- 134 029482
бсдбсбссбб сдабаббабс дааббсабба асаасаббаб абсааааасс аассааабба 1260
ссаасбббсд ааассаабаб бсдссдбабб бббсбсбабб саасаабссс басаабддсд 1320
дсаббдссад сббсббсббс бссбдсаабб бсддаабсас ссасббдсаа ббббсббссб 1380
аббсаааааа бсасбассас бсдсбббсба аддбббсабб сддббббасб сссаадссба 1440
аабббддссб бббсбссаад дбббаббббс бабсбсбббб ббааббддбб аабсааббдд 1500
аббдббдааб ббббсадддб ббаасддбаб аабабббдбд ддббббббсд адбасаббсб 1560
дддбббдбад баббддаббб ддсаббдсбб ббаабббббд адаббдддбб ббббдддббб 1620
бабббддббс ббдбдаббса аддббаббда бббдсбдсаб бааасбдбаб ббабддаабд 1680
абдбсаабба асбдббасаб басаббдсбб бабддббббс абсабдсбда ббадбдабба 1740
сбдбдбббда абсбсббдсб бсбсбабдба сбабббаабс бдабасааса адбасаассб 1800
адаааасадд ббааадддаа абсбабаадс ббадбааабб аасасббдаа адаадсбааб 1860
дасддадада ддддбсбббб бддадааддс адббббсаба ббаббдсбса дббсбсбадб 1920
дсадсбббас ббсасббада сасбсббаад бададдбсаб аддбдббсад аабадабсса 1980
аадасссдаб абббассдда сбббдбааас аасббаассс дасббсаааа бдаабббаса 2040
абсабабааа адсаабабдд асббааассд аббббдаасс дассббдасс ддббдабссд 2100
аабдаабдсс бсбасбсбба адсабдбсаа сбдбаабабд ааабадаабб абаабабааа 2160
сбаадббсаб дббббсббса асбасааабд аааббббабд асссааабаа бдбдбдааба 2220
сссссадсаа баддббдааб ддсабббадб бсадббдабб ббадсадасс асабсбдссс 2280
бсабаббсса ббдббсадбб бадббдббад бадсбдбаса баабадасба аббаадббдб 2340
саббббдабс сабдббабдд ббдбсбддда бааасддабб ддааббдбаб аабаааадбб 2400
бдддббадбб баббббдсбс баддаддддб бабдбсабаб дбдсасбсбд ббддсаассс 2460
дасаабдсаа аасаббббса басббддбас дббдббдсдб дббббдбдсс сббсдбаббб 2520
бдбаасбдбб дабдаабдбд бааааабаба сбасабдабс абабдсбадб аддбсббсбб 2580
сассбадбаа адаааббббб сбаасасдад аадббсаааа сабаббссса ббассаббаб 2640
ссаасабсад басссдадбс саадбаасаб адддбдбссс бббабдабад бабаадаабб 2700
ддбдсабдаа ааасдсдбда ббдбадсдад дабадбаддс дддададдба саддабббда 2760
аааббббдаа ббдсбаааас дсбабсадда бсббдббббб сббасбббда бдббдсбббб 2820
ббдааабббд абссаааббд ббаааббабб дадасбаабб ссбдббдабс сбдбсдбдаа 2880
сбббдбадаа бсбббсаддс сдсаббсбса садбдааддс бсааббааас ааддбдадбс 2940
бббббббдбс ббаасбсбба бдсадббсаб бабсбсббсб асбдабдада ааассасбаб 3000
ббддссбааб бсбаабббсс ббсбаддббд сбббддабдд ббсааабсаб дсбссабсас 3060
- 135 029482
сййсдсасда аааайсйддд сйассадссс аадаааадаа даасдайдад ссдйсйадйд 3120
аайсййсйсс йдсадсайса дйдйсйдаад аасдадйсйс сдааййсййд адссаадййд 3180
ссддйсййдй саадйайдйа асаййсйййа ййййсаййсй йссасасасй сдсаайййдд 3240
айаасдадай дйсйййадад асдйсйдддд аасаадддад ааайдадйсй ададдййдсй 3300
адададаасд адайааайас йаайайайай даайайййса йаайссасай йааааааайа 3360
сааййдаайй йдсаййайдд йдаасйасса аадаайсдаа йаййййййаа йасйссайдй 3420
йййдйддйсй адасййдйдд аййсйадада саййдйадад ййдсааййаа аасаасйдда 3480
сйдйдадайа ййдайссдса адсаддаадс йаййссйсаа ссасаааййс сйаайссйас 3540
асайдйсдйй дсаайдсаас сассассасс йдсйдйадсд йсйдссссад сйсссдйсйс 3600
ййсассадсс асйссйсдйс сйдсдййасс Йдссссадсд ссйдсйдсса сдйсадсйаа 3660
дссайсасйй ссассйсйса ададсссйай дйсаддсаса ййсйассдйа дйссадсйсс 3720
Йддсдадссд ссйййсдйда аддйаадйдй айассссййй йййадйдййд йайййсйдйд 3780
ййайайсаай ййййдсаййй йдйдаадсйд аааайааайс йййсаййййс сайаддййдд 3840
адайааадйй аадаааддас аадйсайайд саййайсдад дсйайдаадй йдайдаайда 3900
аайсдаддйа сдйайдййай йдсйййааас ййсайдссйй аддссдйдаа дйй 3953
<210> 230
<211> 595
<212> ДНК
<213> АтагапйЬиз раТтегг
<400> 230 асааааадса саааййсаай аайайасйсй ййаадйййдй ййайсййсйа аййадййсдд 60
ййаааасддй йссссасййй сййсйссдас йсйсасаайй айсййссссй аййсаййййй 120
сййссасссй сйсйаайддс ддсйдйййсс ййсаайайса айддйддааа даййддаасй 180
ййайдййсаа дасасдаайй сдйййдйддд йййдйаадаа аайййсаййй йадаасйсай 240
асййсйайай ййдаааааса йайдссаааа асййсааддй ййааадсаай ддаадйййсй 300
дсааайдсаа садйааайай адййссйдйй йсадсйсайй сйаддйаайй ййайййсйсд 360
аааайййссд айййасаайй аааййаайсй йдййййдйад дйаайдаайй дсадаадааа 420
йадайддайй сййайййдйй йаййддйайй йдйййайааа йййййдйййа йаййадйййс 480
йдааййдйда ййаййсйдай йдйайдйсаа ддйййаддйй дййаййаайа аайдйааайй 540
ддаййдаййд аадййдсаай ааддйдайдд сдйдайдсйд аййдййдйаа айййй 595
<210> 231 <211> 667 <212> ДНК
<213> АтагапйЬиз раТтегФ
- 136 029482
<400> 231
саасааЬдад ааЬЬЬадааЬ ссаЬаЬсааЬ сЬЬдаЬаЬЬс аадддЬаЬЬЬ аадЬааЬЬаа 60
адаасаасса ЬЬдЬЬаадсд ссЬссасЬаЬ сЬЬсЬЬссЬЬ сЬсаЬЬсЬсс аЬЬсЬсдсЬЬ 120
адсЬЬЬссЬс ЬсдсасЬааЬ ЬассЬссаЬЬ ЬдсаассЬЬЬ саадсЬЬЬса асааЬддсдЬ 180
ссасЬЬсЬЬс ааасссасса ЬЬЬЬссЬсЬЬ ЬЬасЬааасс ЬаасааааЬс ссЬааЬсЬдс 240
ааЬсаЬссаЬ ЬЬасдсЬаЬс ссЬЬЬдЬсса аЬЬсЬсЬЬаа асссасЬЬсЬ ЬсЬЬсЬЬсаа 300
ЬссЬссдссд сссссЬЬсаа аЬсЬсаЬсаЬ сЬЬсЬЬсЬса аЬсассЬааа ссЬааассЬс 360
сЬЬссдсЬас ЬаЬаасЬсаа ЬсассЬЬсаЬ сЬсЬсассда ЬдаЬааассс ЬсЬЬсЬЬЬЬд 420
ЬЬЬсссдаЬЬ ЬадсссЬдаа даасссадаа ааддЬЬдсда ЬдЬЬсЬсдЬЬ даадсЬсЬЬд 480
аасдЬдаадд ЬдЬЬассдаЬ дЬЬЬЬЬдсЬЬ асссЬддЬдд адсаЬссаЬд даааЬссаЬс 540
аадсЬсЬЬас ЬсдЬЬсЬааЬ аЬсаЬЬадаа аЬдЬЬсЬЬсс ЬсдасаЬдаа сааддЬдддд 600
ЬЬЬЬсдсЬдс ЬдааддсЬас дсЬсдЬдсЬа сЬддасдсдЬ ЬддадЬЬЬдЬ аЬЬдссасЬЬ 660
сЬддЬсс 667
<210> 232
<211> 2415
<212> ДНК
<213> АтагапЬЬиз ра1тег1
<400> 232
аЬЬЬддаЬаа сЬЬЬЬЬссЬЬ ЬдаЬЬсдааЬ сддаЬЬаЬЬЬ ЬЬааЬасадЬ аЬЬаЬдаасЬ 60
даЬЬЬааЬда аадЬддадда адЬЬЬсааЬЬ ЬЬЬааадЬЬд ЬаддЬдЬааЬ дЬЬЬЬсЬсаЬ 120
ЬЬЬддаЬаЬд ааадЬддадд аадЬЬЬсааЬ ЬЬсдааЬсаЬ дЬЬЬдссадЬ ЬдаЬЬсааЬд 180
ааЬдсЬсЬЬд даааЬдасса ададЬЬсаад дсЬЬсЬЬдЬЬ аЬаааасаЬЬ ЬсааЬЬЬЬда 240
ЬсЬаадааЬд аасЬаЬЬЬад аасЬЬааадЬ ааЬЬаааЬЬа ЬЬадЬЬаЬаа сЬЬаЬааааа 300
ааЬЬсааЬЬЬ ЬаассЬЬааа ЬЬЬаЬаааЬЬ аЬдассЬЬаа ааадаЬсаад ЬаЬЬдаасдс 360
аЬаЬЬЬадаа аааЬЬаЬааЬ ЬсддсЬЬаЬс адЬсЬсаЬаЬ ЬдадасддЬс ЬсдЬссаада 420
саадЬЬдЬаЬ саЬЬЬаЬаЬа аЬсаааЬаЬа аЬЬаЬдадЬд ЬаЬЬсаЬдЬа ддЬЬЬсаасЬ 480
ЬЬааадссЬа ддЬдааадаЬ аЬдЬЬдЬадс аЬсЬЬЬдЬда аадЬсадссЬ аЬаасЬЬддЬ 540
ЬсЬааааЬЬЬ ЬдаадсаЬаа ссаЬаЬадЬс ссЬсдааЬЬс аЬЬсаадЬЬд ЬссааЬЬЬас 600
ЬЬЬЬЬЬаЬас ЬЬдссдадас аасаЬЬЬааа сссЬЬааЬаЬ ЬЬсЬааЬЬаа ЬсЬЬааЬЬаа 660
аааЬЬаЬдаа ааЬЬЬдаЬаЬ ЬааЬааЬсЬЬ ЬдЬаЬЬдааа сдааЬЬЬаас аадаЬсЬсас 720
аЬдасЬаЬдЬ ЬЬЬаасЬЬаЬ адаЬЬааааа ааааЬасааа ЬЬаададЬда ЬаадЬдааЬа 780
дЬдссссааа асаааЬддда саасЬЬадаЬ дааЬЬддадд ЬааЬаЬЬадд ЬадсаадЬда 840
ЬсасЬЬЬаас аЬсааааЬЬд аЬсасЬЬаЬа ддЬЬсаааЬЬ дааасЬЬЬЬа сЬЬЬааЬЬда 900
ЬаЬдЬЬЬааа ЬасЬасЬЬЬа ааЬЬдаааЬЬ даЬаЬЬЬЬЬа аддЬсааааЬ ЬдааассЬЬЬ 960
- 137 029482
аадаббабаа ббдааааббд дсадаадааа аасааадада аадаабабаа дасасдсааа 1020
ббдбассдаб сбасбсббаб ббсаабббда дасддбсбсд сссаадасба дабдббсддб 1080
сабссбасас саассссааа аааббсааса асааадбсбб абаабдаббс ссбсбаабсб 1140
асбасадбсб асассаассс асбббсбсбб бдсссассаа аасбббддбб бддбаадаас 1200
баадсссбсб бсбббсссбб сбсбсбсбсб баааадссбд ааааабссас сбаасббббб 1260
бббаадссаа сааасаасдс саааббсада дааадаабаа бддсбсаадс басбассабс 1320
аасаабддбд бссааасбдд бсааббдсас сабасбббас ссааабссса дббасссааа 1380
бсббсааааа сбсббааббб бддабсааас ббдадааббб сбссааадбб сабдбсббба 1440
ассаабаааа аададббддб дддсаабсаб бсааббдббс ссаадаббса адсббсбдбб 1500
дсбдсбдсад сбдадааасс ббсабсбдбс ссадаааббд бдббасаасс сабсааадад 1560
абсбсбддба сбдббсаабб дссбдддбса аадбсбббаб ссаабсдааб ссббсбббба 1620
дсбдсбббдб сбдаддбабб бабббсбсаа сбдсдаааас аабсбсбабб бдабаббдда 1680
абббабабба сабасбссаб сббдббдбаа ббдсаббадб адабасббаб дббббдассб 1740
ббдббсаббб дбббдббдаа ббддбадбдб бдадаабббд аабдбаабба бббдбббббс 1800
сабдбдаабб баабсбдабб ааабссасбб сббабббабд ббаадббдса абдабдбббд 1860
ссааабддбб абсаббдаад дабаадбббд ссбасббббд асссбсссаа сббсдсддбд 1920
дбададссаб бббабдббаб бдддддаааб бадааадабб бабббдбббб дссбббсдаа 1980
абадбадсдб бсдбдаббсб дабббдддбд бсбббабада бабдабабаб дддббаббса 2040
бдбаабдбдб аддбббабдс аббабдббдд абдсабдбсб ддбдббаббд сбдбааабдд 2100
абдаабдббд ббабббддад асаббббббс аббсаббббб бсссббббба аббддаасбд 2160
даададддаа адббаббддд адбааббааа аддббдбдад ббсдабасас бдсабсааад 2220
асдаадаасб бдасабадаб дббдааддсб аабссббабс асбдсббдаа ббсаабабдб 2280
абсбдааааб бббассссбс бабабдсабс бдбббббдсб аабааадбдб ббббддасба 2340
бсабдббббд бдабдсббаа дадддбдаба ббасбдадаб ааабддаааб абсаааабаа 2400
сабсбаббдб даадб 2415
<210> 233
<211> 3049
<212> ДНК
<213> АтагапбЬиз ра1тег1
<400> 233
саадсббсаа ббабсдбббб саааабаадб абббсааадб сбабааадаб аббдбабаад 60
ббббадббса аабббаабаа дббббббббб бббббббббб бббббббббд аааабссааа 120
ббдаабаадб баабагббаа аббабдасаб абааббабда сабабааббб дассабдаба 180
- 138 029482
ЕЕЕЕасааЕс ЕаасЕЕааЕЕ ЕЕдаасЕЕаЕ ЕаЕЕЕсЕааЕ аЕЕсааЕЕаЕ сдЕЕсЕаааа 240
аЕаадЕаЕЕЕ аааЕЕдЕаЕа даЕаЕаЕЕдЕ аЕаасаЕЕЕа дЕЕсаааЕЕЕ ааЕЕаЕЕдаЕ 300
адЕЕЕЕаЕЕд асЕаЕЕЕаЕЕ ЕддкдЕЕЕда ааЕЕсаЕсса ЕадааЕдаЕа дааЕаасасс 360
аЕЕЕЕЕЕаЕа ЕаасЕЕсдЕЕ сЕааааЕЕЕЕ даадсаЕаас саЕаЕасЕсс сЕссааЕЕса 420
ЕссаадЕЕдЕ ссааЕЕЕасЕ ЕЕЕЕсаЕасЕ Едссдаддса асаЕЕЕааас ссЕЕааЕаЕЕ 480
ЕсЕааЕЕааЕ дЕЕааЕЕааа ааЕЕаЕдааа аЕЕЕдаЕаЕЕ ааЕааЕссЕЕ дЕаЕЕдааас 540
аааЕсЕааса адаЕсссаса ЕдасЕаЕдЕЕ ЕЕаасЕЕаЕа даЕЕаадааЕ ааааЕасааа 600
ЕЕаададЕаа ЕаадЕдааЕа дЕдЕсссааа асаааЕадда саасЕЕддаЕ дааЕЕддадд 660
ЕадЕаЕЕадд ЕадсаадЕда ЕсасЕЕЕаас аЕсааааЕЕд аЕсадЕЕаса ддЕЕсаааЕЕ 720
дааасЕЕЕЕа сЕЕЕааЕЕда ЕаЕдЕЕЕааа ЕасЕасЕЕЕа ааЕЕдаааЕЕ даЕаЕЕсЕЕа 780
аддЕсааааЕ ЕдаааасЕЕЕ аадаЕЕаЕаа ЕЕдаааааЕд сссадаадаЕ даааааасад 840
ададааадса ЕдЕаадасас дсаааЕЕдаа ссадЕсЕасЕ сЕЕдЕЕЕсаа ЕЕЕдадасдд 900
ЕсЕсдсссаа дассадаЕдЕ ЕсадЕсаЕсс Еасассаасс ссааааааЕЕ саасаасааа 960
сЕсЕЕаЕааЕ даЕЕсссЕсЕ ааЕсЕасЕад адЕсЕасасс аасссасЕЕЕ сЕсЕЕЕдссс 1020
ассаааасЕЕ ЕддЕЕЕддЕд адаасЕаадс ссЕсЕЕсЕЕЕ сссЕЕсЕсЕс ЕсЕЕаааадс 1080
сЕаааассса ссаасЕЕЕЕЕ садссаадаа асаасдсдаа аЕЕсададда адааЕааЕдд 1140
сЕсаадсЕас ЕассаЕсаас ааЕддЕдЕсс аЕасЕддЕса аЕЕдсассаЕ асЕЕЕассса 1200
ааасссадЕЕ асссаааЕсЕ ЕсааааасЕс ЕЕааЕЕЕЕдд аЕсааасЕЕд адааЕЕЕсЕс 1260
сааадЕЕсаЕ дЕсЕЕЕаасс ааЕаааадад ЕЕддЕдддса аЕсаЕсааЕЕ дЕЕсссаада 1320
ЕЕсаадсЕЕс ЕдЕЕдсЕдсЕ дсадсЕдада аассЕЕсаЕс ЕдЕсссадаа аЕЕдЕдЕЕас 1380
аасссаЕсаа ададаЕсЕсЕ ддЕасЕдЕЕс ааЕЕдссЕдд дЕсааадЕсЕ ЕЕаЕссааЕс 1440
дааЕссЕЕсЕ ЕЕЕадсЕдсЕ ЕЕдЕсЕдадд дсасаасадЕ ддЕсдасаас ЕЕдсЕдЕаЕа 1500
дЕдаЕдаЕаЕ ЕсЕЕЕаЕаЕд ЕЕддасдсЕс ЕсадаасЕсЕ ЕддЕЕЕаааа дЕддаддаЕд 1560
аЕадЕасадс саааадддса дЕсдЕададд дЕЕдЕддЕдд ЕсЕдЕЕЕссЕ дЕЕддЕааад 1620
аЕддааадда ададаЕЕсаа сЕЕЕЕссЕЕд дЕааЕдсадд аасадсдаЕд сдсссаЕЕда 1680
садсЕдсддЕ ЕдссдЕЕдсЕ ддаддаааЕЕ саадЕЕаЕдЕ дсЕЕдаЕдда дЕассаадаа 1740
Едадддадсд ссссаЕЕддд даЕсЕддЕад саддЕсЕааа дсаасЕЕддЕ ЕсадаЕдЕад 1800
аЕЕдЕЕЕЕсЕ ЕддсасаааЕ ЕдсссЕссЕд ЕЕсдддЕсаа ЕдсЕааадда ддссЕЕссад 1860
ддддсааддЕ саадсЕсЕсЕ ддаЕсддЕЕа дЕадссааЕа ЕЕЕаасЕдса сЕЕсЕсаЕдд 1920
сЕасЕссЕЕЕ дддЕсЕЕдда дасдЕддада ЕЕдадаЕадЕ ЕдаЕаааЕЕд аЕЕЕсЕдЕас 1980
сдЕаЕдЕЕда ааЕдасааЕа аадЕЕдаЕдд аасдсЕЕЕдд адЕаЕссдЕа даасаЕадЕд 2040
- 139 029482
абадббддда саддббсбас аббсдаддбд дбсадаааба сааабсбссб ддаааддсаб 2100
абдббдаддд бдабдсббса адбдсбадсб асббссбадс сддадссдсс дбсасбддбд 2160
ддасбдбсас бдбсаадддб бдбддаасаа дсадбббаса ддбабаабдб баасссббас 2220
ссббсасабб дббсбдсбаа аббсбададд асссбббсаа ббсбдддбдд дабаадсасд 2280
дсаабббдас сдсааааааа ббдсаааабб аббсбдсбда бадаасабсб сдадабдада 2340
бсабаббдад ббббддсдбс аасабааасс баабсаааба абдаааааба сааасабсаб 2400
абддбббсбб ббдбсбббаб дасбадасас бсбсбаббаб бссббдаббд ддабсббабб 2460
бдаааббдсб дбдбадссба сассбсабдб бсадаббббд ббсдбабасс адасббббсб 2520
бдаббдддаб сббабббдбс сссбддаббб бдсабадддб дабдбааааб ббдссдаадб 2580
бсббдадаад абдддббдса аддбсассбд дасададааб адбдбаасбд ббасбддасс 2640
асссадддаб бсабсбддаа адааасабсб дсдбдсбабс дасдбсааса бдаасааааб 2700
дссадабдбб дсбабдасбс ббдсадббдб бдссббдбаб дсадабдддс ссассдссаб 2760
сададабдбд дсбадсбдда дадбдаадда аассдаасдд абдаббдсса бббдсасада 2820
асбдадааад сббддддсаа садббдадда аддабсбдаб басбдбдбда бсасбссдсс 2880
бдаааадсба аассссассд ссаббдааас ббабдасдаб сассдаабдд ссабддсабб 2940
сбсбсббдсб дссбдбдсад абдббсссдб сасбабссбб дабссдддаб дсасссдбаа 3000
аассббсссд дасбасбббд абдббббада ааадббсдсс аадсаббда 3049
<210> 234
<211> 1113
<212> ДНК
<213> АтагапбЬиз ра1тег1
<400> 234
бсббаабббд баббббабба ббаабсбаба адббааааса бадбсаадбд адабсббдбб 60
бдаббсдбсб сбабдсаадд аббббсабаб саасббббса баабббббда ббабасасаа 120
ббасааабаб баасдаасда абаадбдсаб бааааададб дсааааадса аабдддасас 180
ббдбдббдаа баддадддад бабасаббаа дабдаабсба асдадабсбс асабддабаб 240
аабббдбсбб сбабабабдб сбаааааабс ббдабсаааб ббсбсбббсс аааабадааб 300
аббсбааабд ддаадаасаб баадааасдд адддадбасб бабаадббаа дабадббддд 360
ддбабббадд бааааааабс бабдссаааа дбадааадбд дасааббада дбдасбббас 420
бааабаадда аадбддасаб ббаааабдаа бсддадддад сабаббаасб ббаббббсаа 480
адбдбдааас абаабсабаб ббаддбаааа аааббабсаа бббаасдбса аааббдабса 540
сааабаддбб ааааббдааа ббббббабдб бааббдабсб аббдббсасб ббаааббдаа 600
аббдабабсс бббааддбба аааббаабас сбсбаааабб ааааббабба ааддсссада 660
- 140 029482
ааайаааааа аааадаадас аддсйаййад йааааййайй аадйайдйаа ддййдайаса 720
сдсдсдаайй дадссддссс асййййадйй йсаайййдаа асадйсйсаа йсаадассаа 780
ййайййаййа ййййаййайй ййаййдйййй аадсйсаайд ддййддасйй дайаааййай 840
аййййдадда дасдддсйай йадйаааайй аайадййдда айсййййййд айайасйайа 900
аааададдйа йсйддйддад ссййааайсй дсдсааййда адйссйсаай асасайсйсд 960
сйсййсййай йсйсйййсай сйайййссйс сйййдайсаа асйасдссай дйсйсйсййа 1020
аайдайсйсд ййаассййаа йсйсйсйдаа асйассдайа адаййайсдс йдаайасайа 1080
йддйаайаса асаайссййс сйсйййййса ййй 1113
<210> 235
<211> 882
<212> ДНК
<213> АтагапйЬиз ра1тегт
<220>
<221> т1зс_£еайиге <222> (451)..(459) <223> п представляет собой а, с, д или й
<400> 235 аааааассдй сййайййдйа даааайаааа аасйааааад йадйайсаас ййййадасйа 60
дйсайаадйд адйддсайса аасййдййсй айаааааддд аададййссй саасййдада 120
ййсайайййй ййдйдайййс йааайадаад аасайасйса йсййссасйй сйсййаййса 180
йсаааййййа йййдййсссс ааааааасай дйсйсййсйй асадайсйса йсаайсййаа 240
йсйййсйдас йссасйдада адайсаййдс йдаайасайа йддйсадййй йсайсссййй 300
йййййассйй йаайсссасй ййййдййййй асссассайй йййййсайсй аййййсйсйй 360
ааадаййййа асйййййасй йййййдйдйа йайаасаййс аййййййсаа ййдддйаддй 420
йадааааййй сйайааайаа айааайааай пппппппппй ассййаайсс сасйййййдй 480
ййсйасссас сайййййййс айсааййййй сййааадайй ййаасййййй ййаасййййй 540
сййддййййй дйдйайайас саайсайййа ййййсасйад йдйаддййаа аааайайсйа 600
аааайааайа ааайадаайа аааайдйаай сасйадаййа асссайдаай йайййсссйй 660
дйййййасйс ааасйййййа сссййдййаа ааааайаайд айайааайаа айййййдадд 720
дйййдййааа сссайайдйа айсйайайсд ааааааййад айадсдддйй ййдййдйдда 780
сааасйааай аасааайййа ддаайааасй йййдадддйй йаййдааааа айаасссайа 840
йййаайсйай айсдаааааа йдайадсдад сйййдйайад ай 882
<210> 236
<211> 1083
<212> ДНК
- 141 029482
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 236
сдксдаадка даадасдсдд аадскдсккк каасаксадс дккксдсакд дддскакксс 60
скдкдкккск сскакксаак кддаааасдд кдксдкккка кскдаддккс акккакакдд 120
ддакдккдкд скксддкакд каадскасдд ааакдаакдк ддддакдкдк кккккскксс 180
кдддкккдад дааакдссдд аддааксакс дкккададда сккдаккккд дсакксдаад 240
дккддаксак дскдкаддда акдкссскда дккддсксск дсааккдскк акккдаадаа 300
дкккаскддд ккксакдадк ккдскдадкк касадскдаа дакдккддда сдадкдааад 360
кддаккдаак ксадссдкак кддсааасаа кдакдааакд дкдккдкккс сдакдаакда 420
асскдкдкак дддасааааа ддаададсса аакксаааск какккддадс акаакдаадд 480
ддскддкдка садсакккдд скккдакдад кдаадасака ккккддаскк каадддадак 540
даддаадада адкдкксккд дкдддкккда дкккакдссд ксдссдсскс сдасккакка 600
ссддаакккд аддаасадад скдскдакдк аккдадкдад дадсадакда аддадкдкда 660
ададккдддд аккккддкдд акааадакда ксадддсаск ккдскксааа кскксассаа 720
асскаккдда дасаддкааа ккккаакскк дсккксаакк дсккккдскк дакддаккда 780
скадсааакк кдаксдсакк ккдккдскка какдасккда кдакаскксс кскдккксда 840
аакасксдск асакксдска саккккдккк кдкдсаскак ксаксдккса адсккакккк 900
асакаккдсд аскаакдкдк ааскааааак акадксаадк дддаксккдк ккдааксдкс 960
каакддсака сккксаксак аккааакккк какааккккк адаккадкдк адкккаадак 1020
аккаакдскс ааааккдкдс аккддаккдс дкаааааадк дааакдкадс аадкаккакд 1080
ааа 1083
<210> 237
<211> 788
<212> ДНК
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 237
аааассааад дааакаадкк акаддкадда ааааккдкка ккдаадккаа кдкадкааас 60
кадкааскка ааскдкдака ссссддаккк адсккааааа дадаккдака даскасксак 120
аксаасаадд кдсаксккск кккскаддда дсссакккдс каадааскск асадккаадс 180
дкдсккддкд дддадсаакс ккаддакддд кдассксскд ддаадккккс скдддкдсдс 240
асдддкдадд ссааадкдсд ккааааадас ккдкдккддк скдкддддск кдкскасадк 300
скссакдадк адксассддс ддкасдадад дссддддкдк касакаааса дасксааадд 360
сдскаадсса адкадссаак адсаасакдк дкддсскдсд дасадксаса аааасасаса 420
аккксккакк кккаскскск кккакскскк ккаддсккка дссаксааса акаааасаас 480
- 142 029482
аЬдаЬааадс ааЬЬсаЬЬЬа сЬдсЬаааЬЬ ссаасааЬЬЬ ддЬсссЬЬЬЬ ЬссЬдЬЬсЬЬ 540
ЬсадЬЬЬсас аЬасссЬсЬЬ аЬсааЬсЬаЬ аЬссаааасЬ аЬЬЬсаЬЬЬЬ ссааасЬсЬЬ 600
ЬЬааасссаа аааЬсаааас ЬЬЬЬдаЬЬда адаасааасЬ ЬЬдддддЬЬЬ ЬддааааЬда 660
дЬсаЬЬЬЬдд аЬаЬдсЬЬдЬ дсЬасЬсааЬ ссасаЬсаад аЬаЬдЬЬсЬЬ ЬЬаддаааЬЬ 720
саааЬаассс сасЬЬсааЬЬ ЬсаЬсЬаЬЬд даадЬдаЬЬЬ ЬЬЬдддЬсаЬ ЬсЬдЬдадаа 780
аЬЬЬсадЬ 788
<210> 238
<211> 2631
<212> ДНК
<213> АтагапЬЬиз ра1тег1
<400> 238
ЬддЬассЬас ссЬдЬЬЬаса ЬЬЬЬсааЬЬЬ сссссЬЬЬЬЬ ЬсЬсЬасЬас ЬссЬасЬЬЬа 60
ЬЬдаЬЬсЬЬа ЬссаЬдЬдЬд ЬЬсЬаЬддда аЬЬдасаЬЬа аЬЬдЬЬсадд ЬдЬдЬаЬдсЬ 120
ддЬдаЬссЬЬ сЬаадЬЬдад ЬаЬдааадсЬ дсаЬЬЬддаа аддЬсЬддас сЬЬададсаа 180
аадддЬддЬа дЬаЬсаЬЬдс сддЬасасЬс аааасЬаЬЬс аддаааддаа дааЬааЬссЬ 240
ссассдссЬс дадасссдЬс сдЬааЬсасс аЬЬасЬсаЬЬ дсЬЬЬссЬЬс ассЬЬдЬаЬс 300
ЬЬассЬЬааЬ аЬасаЬдЬаЬ ЬЬааЬЬдаЬа аЬдЬсасаЬЬ дссЬсаЬЬЬд садссдссЬЬ 360
ссЬааассЬа адддссадас ЬдЬЬддаЬсс ЬЬЬаддааад ддсЬсаЬЬаЬ дЬЬассЬасс 420
дссаЬЬдсЬд сЬаддЬаЬсЬ ЬЬЬдасЬсЬс аааЬсЬЬааа ЬаЬЬЬсЬсаЬ сЬЬсЬссЬЬс 480
ЬдсЬааЬасЬ адЬаЬдЬЬЬа ссаЬсЬЬЬЬЬ аЬЬЬЬЬЬЬад дсЬЬддсадЬ ааадЬсааас 540
ЬаЬсдЬддас асЬЬЬсЬааЬ аЬЬдаЬаадЬ сдсЬсааЬдд ЬдааЬасааЬ сЬсасЬЬаЬс 600
ааасасссда ЬддассддЬЬ ЬсЬдЬЬадда ссааадсддЬ ЬдЬсаЬдасЬ дЬсссЬЬсаЬ 660
асаЬЬдсаад ЬадссЬдсЬЬ сдЬссдсЬсЬ садЬдадЬаЬ саЬЬсЬЬЬсс ЬЬсаЬЬЬсЬЬ 720
ЬЬсдЬЬЬаЬЬ дЬЬдЬссааЬ дЬсЬЬдЬЬаа асассадЬЬЬ ддссЬЬдЬдс ЬсдЬдааЬЬа 780
ЬддсЬасааЬ дЬЬаасЬдаЬ ЬсаддсасЬд ЬдддадаЬдс сЬаадЬЬЬсЬ аааассЬсЬд 840
сдсаЬааЬдЬ ЬЬдЬЬЬддаЬ дЬЬаддааЬЬ дсаЬЬдаааа аЬЬдсЬЬЬЬд ЬдаЬдЬЬдаЬ 900
дЬЬааЬасса аЬЬасаадЬд ЬдЬЬсЬЬсаа сЬЬсЬдсааЬ ассЬЬдЬЬсд адЬдадсЬЬд 960
адддддЬЬЬа даЬЬадЬдЬс сааЬдЬдааа сЬадсаааЬд аасЬссаадс дсЬдддаЬад 1020
дЬссЬЬддда ЬддадссссЬ даЬасссаад асадЬаЬЬса аасссЬсЬаа дЬададЬдад 1080
адаЬсаадда аадааасЬдд дЬддЬЬссЬс аааЬсдЬааа аааЬдааЬас адЬдЬсаЬда 1140
ЬЬдсЬааЬсЬ ЬаЬсасаааЬ сдЬааааааЬ дааЬЬаЬддЬ сдаЬЬЬЬдда сЬаЬЬЬЬЬдд 1200
дЬсаЬЬЬЬда дЬдааЬсЬсд аасЬЬааааа дсдадЬсЬЬс ЬадсадЬЬсЬ ЬдЬЬасадсд 1260
дддсаЬасаЬ аддЬаддааЬ ЬЬддЬЬЬЬЬЬ асЬаЬЬЬдад ссЬЬЬЬдасЬ дЬЬдЬддссд 1320
- 143 029482
дЕааЕаЕдда аЕадЕсЕадс асЕЕсЕдсдЕ дЕдЕасаасЕ адЕаЕЕЕаЕЕ дЕааЕЕаЕдЕ 1380
даЕсдсасЕЕ аасЕсЕсада ЕаааассЕЕа адсасЕааса ЕЕЕЕдЕЕЕЕд дЕЕдааддаа 1440
Есаддаддаа адааааЕЕда дддаЕЕЕдЕЕ ддЕаЕаЕада ЕЕссЕЕЕдЕЕ ЕддаЕаасаа 1500
ааЕЕддадЕд дададаЕЕЕд дааддаадаа ЕЕЕЕаЕаддд аЕЕадЕЕссс аЕЕасасЕЕа 1560
ЕдЕЕдаЕЕас ааааЕЕЕсЕс саааадЕдда аадаЕЕЕЕда дЕдааааЕдЕ ЕЕЕЕЕаЕЕЕс 1620
ЕсЕЕссЕсЕс ссЕЕЕсЕЕЕс ссЕсЕЕааас ааасааддаа адЕЕааЕсЕЕ аЕсаЕЕссдЕ 1680
ассЕЕссссЕ ЕсЕдЕЕсЕЕЕ ЕЕЕЕЕсЕсЕс сааааЕЕсЕЕ аЕссЕаасдЕ адЕдЕЕаЕЕд 1740
ЕсасЕдЕсЕЕ аЕдаасдада аЕЕсЕЕЕЕсЕ ЕссЕааЕасЕ дсЕЕдЕдЕЕд сасадЕсааЕ 1800
даЕЕЕадсЕа даЕсаЕсЕЕЕ ддЕЕадсЕас ЕсааааЕаЕЕ ЕасаЕааааЕ асЕЕдЕадаа 1860
аЕаааЕасса аЕаддЕсЕЕд ЕсаадаадЕа дЕЕЕсааЕдс ЕаЕаадЕЕЕЕ аассааЕссЕ 1920
сааааЕЕЕас ассаЕддада ЕаЕсЕдсдда ЕаадаасЕад ЕаасЕдЕадс адсЕдЕаасЕ 1980
дЕЕдсааЕса дЕЕЕЕаЕддЕ ЕЕдссЕЕдса ааЕсааасЕЕ ЕддаЕдЕЕдЕ ЕЕдссЕЕаса 2040
аЕЕЕдЕЕасЕ аЕЕасдЕдаа дЕЕЕадЕдЕЕ сдсссЕЕсас аЕЕдЕасЕЕЕ ддЕЕЕЕЕдЕЕ 2100
ЕЕссЕЕдсаа ЕЕЕдсЕсЕЕЕ даадЕаЕааа дЕдсЕдадЕд сЕдадЕдсЕд адЕдсЕдасс 2160
ЕЕЕссЕдсЕс аддаЕдЕЕдс ЕдсадаЕЕсЕ сЕЕЕсЕсааЕ ЕЕЕасЕаЕсс ассадЕсдса 2220
дсадЕдЕссс ЕЕЕсЕЕаЕсс сааадаадса аЕЕадассад ааЕдсЕЕдаЕ сдаЕддадаа 2280
сЕааааддаЕ ЕсдддсааЕЕ дсаЕссЕсдс адссадддЕд ЕддааассЕЕ дддЕаЕаЕдс 2340
ЕсссаЕЕсаа сЕаЕаЕсЕса аЕЕЕЕЕаЕда дЕаЕЕЕЕЕсЕ ЕЕсЕсЕдааЕ ЕаЕЕсааЕЕЕ 2400
ддЕдасдЕЕа ааЕЕЕЕдаЕЕ дЕасЕсдаса ддаасааЕЕЕ аЕадЕЕсаЕс ЕсЕЕЕЕсссЕ 2460
ддЕсдадсас сассЕддЕад дассЕЕдаЕс ЕЕдадсЕаса ЕЕддаддЕдс ЕасаааЕдЕЕ 2520
ддсаЕаЕЕас ааааддсаад ЕсаЕЕЕаЕас ааЕЕаЕаЕсЕ дЕЕдЕаЕссЕ саааЕаадЕд 2580
ддЕаЕсааЕс сЕдасдасаЕ дсЕЕдсЕЕдЕ аЕсдаЕдсад адЕдаадаЕд а 2631
<210> 239
<211> 23
<212> ДНК
<213> ЕирЬогЫа ЬеЕегорЬу11а
<400> 239
адЕЕЕасадд дадаЕдЕааа дЕЕ 23
<210> 240
<211> 23
<212> ДНК
<213> ЕирЬогЫа ЬеЕегорЬу11а
<400> 240
адЕЕЕдсадд дадаЕдЕдаа аЕЕ 23
- 144 029482
<210> 241
<211> 23
<212> ДНК
<213> АтЬгозча 5Γί£ίάο.
<400> 241
ад555асадд ддда5д5ааа д55 23
<210> 242
<211> 23
<212> ДНК
<213> АЬиЪИоп 5ЬеорЬгаз5ч
<400> 242
ад555дсадд д5да5д5ааа а55 23
<210> 243
<211> 23
<212> ДНК
<213> Хап5Ыит з5гит.аг1ит
<400> 243
ад555дсадд д5да5д5даа а55 23
<210> 244
<211> 23
<212> ДНК
<213> 1ротоеа Ье+егасеа
<400> 244
ад555асадд ддда5д55аа д55 23
<210> 245
<211> 23
<212> ДНК
<213> СЬепороЛит а1Ьит
<400> 245
ад555асадд д5да5д5ааа а55 23
<210> 246
<211> 23
<212> ДНК
<213> В1д15аг1а запдЛпаИз
<400> 246
ад555дсадд д5да5д5даа а55 23
<210> 247
<211> 23
<212> ДНК
<213> Зеппа оЬ5из1£оИа
<400> 247
ад555асадд дада5д5ааа а55 23
- 145 029482
<210> 248
<211> 23
<212> ДНК
<213> АтагапЕЬиз гиД1з/ЕиЬегси1аЕиз
<400> 248
адЕЕЕасадд дЕдаЕдЕааа аЕЕ 23
<210> 249
<211> 23
<212> ДНК
<213> АтагапЕЬиз ра1тег1
<400> 249
адЕЕЕасадд дЕдаЕдЕааа аЕЕ 23
<210> 250
<211> 23
<212> ДНК
<213> АтагапЕЬиз ра1тег1
<400> 250
адЕЕЕасадд дЕдаЕдЕааа аЕЕ
23
<210> 251
<211>
<212>
54
ДНК
<213> ЕирЬогЫа ЬеЕегорЬу11а
<400> 251
ЕсдаЕдЕдаа саЕдаасааа аЕдссадаЕд ЕсдсЕаЕдас аЕЕддсЕдЕд дЕЕд
54
<210>
<211>
<212>
252
55
ДНК
<213> ЕирЬогЫа ЬеЕегорЬу11а
<400> 252
ЕсдаЕдЕдаа ЕаЕдаасааа аЕдссадаЕд ЕЕдсЕаЕдас аЕЕадсЕдЕд дЕЕдс
55
<210> 253
<211> 55
<212> ДНК
<213> АтЬгозча ЕгтЩДа
<400> 253
ЕсдаЕдЕЕаа саЕдаасааа аЕдссадаЕд ЕЕдссаЕдас дсЕЕдсадЕс дЕЕдс
55
<210> 254
<211> 55
<212> ДНК
<213> АЬиЕНоп ЕЬеорЬгазЕ!
<400> 254
ЕЕдаЕдЕсаа саЕдаасааа аЕдссадаЕд ЕЕдссаЕдас ЕсЕсдсЕдЕЕ дЕЕдс
55
- 146 029482
<210> 255
<211> 55
<212> ДНК
<213> ХапбЫиш. збгитагГит.
<400> 255
ббдабдбсаа сабдаасааа абдссбдабд бсдсаабдас бсббдсбдбд дббдс 55
<210> 256
<211> 55
<212> ДНК
<213> 1ротоеа ЬеЬегасеа
<400> 256
ббдабдбсаа сабдаасааа абдссадабд ббдссабдас бсббдсбдба дббдс 55
<210> 257
<211> 55
<212> ДНК
<213> СЬепороЫит а1Ьит
<400> 257
ббдабдбсаа сабдаасааа абдссадабд бсдсаабдас бсббдсбдбб дббдс 55
<210> 258
<211> 55
<212> ДНК
<213> В1д1баг1а запдичпаИз
<400> 258
ббдасдбсаа сабдаасааа абдссбдабд бсдсаабдас бсббдсбдбд дббдс 55
<210> 259
<211> 55
<212> ДНК
<213> Зеппа оЬбизЖоНа
<400> 259
ббдабдбсаа сабдаасаад абдссадабд ббдссабдас дсббдсбдба дббдс 55
<210> 260
<211> 55
<212> ДНК
<213> АтагапбЬиз гиЫз/биЬегси1абиз
<400> 260
бсдасдбсаа сабдаабааа абдссадабд ббдсбабдас бсббдсадбб дббдс 55
<210> 261
<211> 55
<212> ДНК
<213> АтагапбЬиз ра1тег1
<400> 261
бсдасдбсаа сабдаасааа абдссадабд ббдсбабдас бсббдсадбб дббдс 55
- 147 029482
55
<210> 262
<211> 55
<212> ДНК
<213> Атагапкбиз ра1тег1
<400> 262
ксдасдксаа сакдаасааа акдссадакд ккдскакдас ксккдсадкк дккдс
<210> 263
<211> 55
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<221> т1зс_£еакиге
<222> (2)..(2)
<223> п представляет собой а, с, д или к
<220>
<221> т1зс_£еакиге
<222> (5)..(5)
<223> п представляет собой а, с, д или к
<220>
<221> т1зс_£еакиге
<222> (32)..(32)
<223> п представляет собой а, с, д или к
<220>
<221> т1зс_£еакиге
<222> (35)..(35)
<223> п представляет собой а, с, д или к
<220>
<221> т1зс_£еакиге
<222> (41)..(41)
<223> п представляет собой а, с, д или к
<220>
<221> т1зс_£еакиге
<222> (47)..(47)
<223> п представляет собой а, с, д или к
<220>
<221> т1зс_£еакиге
<222> (50)..(50)
<223> п представляет собой а, с, д или к
<400> 263
кпдапдксаа сакдаасааа акдссадакд кпдспакдас псккдспдкп дккдс 55
<210> 264
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
- 148 029482
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 264
аасаидааса аааидссада . и
<210> 265
<211> 21
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 265
аисиддсаии иидиисаиди . и
<210> 266
<211> 22
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 266
аасаидааса аааидссада ид
<210> 267
<211> 22
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 267
саисиддсаи ииидиисаид ии
<210> 268
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 268
саасаидаас ааааидссад аиди
<210> 269
<211> 24
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
21
21
22
22
24
- 149 029482
<400> 269
асаисиддса иииидиисаи диид 24
<210> <211> <212> <213> 270 35 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 270
исдасдисаа саидаасааа аидссадаид иидси 35
<210> <211> <212> <213> 271 35 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 271
адсаасаиси ддсаииииди исаидиидас дисда 35
<210> <211> <212> <213> 272 45 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 272
исдасдисаа саидаасааа аидссадаид иидсиаидас исиид 45
<210> <211> <212> <213> 273 45 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 273
саададисаи адсаасаиси ддсаииииди исаидиидас дисда 45
<210> <211> <212> <213> 274 55 РНК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
<400> 274
исдасдисаа саидаасааа аидссадаид иидсиаидас исиидсадии диидс 55
- 150 029482
<210> 275
<211> 55
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 275
дсаасаасид саададисаи адсаасаиси ддсаииииди исаидиидас дисда 55
<210> 276
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 276
ЬааЬасдасЬ сасЬаЬаддд сЬЬЬаЬЬдаа ЬЬЬадсЬаЬд ЬааЬс 45
<210> 277
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 277
ЬааЬасдасЬ сасЬаЬаддд ЬЬЬаЬсаасс аааЬдЬдсад с 41
<210> 278
<211> 49
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 278
ЬааЬасдасЬ сасЬаЬаддд ЬЬдЬсЬдЬас аЬааЬЬдЬда даЬЬЬдЬдд 49
<210> 279
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 279
сЬдЬдаЬсаЬ саЬаЬдЬаЬс а 21
<210> 280 <211> 21
- 151 029482
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 280
ссййаасйсй ссадсйадса а 21
<210> 281
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 281
садсссдсаа айдйййсайй с 21
<210> 282
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 282
дссдйсаайд дссдсаййдс й 21
<210> 283
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 283
йссййсссйс адааадддса д 21
<210> 284
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 284
ййдссйсайд сйдсйаайсй д 21
<210> 285
<211> 789
<212> ДНК
<213> Ычсойчапа ЬепйИатцапа
- 152 029482
<400> 285
с55а5а5д5д с55аадсс5а асд5дсассс ддсссс55аа ссссадсад5 555саа5с5а 60
сс5ассд5с5 с5асса5555 с55с5ад55д д5даааа555 с5аас555да даааасаадс 120
сааад55555 д555с5аада асдсаааа5д ад5дааа555 555дсадсаа 5ддсасада5 180
5адсадса5д аддсааддда 5асадасссс 5аа5с55аа5 5сс5а5555с с5аааассса 240
ааадд55сс5 с555555сдс а55с5а5с55 с555дда5са аадаааа5аа сссаааа55с 300
адсаааа5с5 55д5ддд5д5 д5аадааада 55сад5555д аддд5ддсаа ад5сасс555 360
5адда555д5 дса5сад5дд ссас5дсаса даадсссаас дада55д5дс 5дсаассса5 420
сааада5а5а 5саддсас5д 55ааа55дсс 5дд55с5ааа 5ссс555сса ассд5а55с5 480
сс55с55дс5 дссс555с5д адддааддас 5д55д55дас аа555ас5да д5ад5да5да 540
са55са55ас а5дс55дд5д сд55даааас ас55ддас55 са5д5адаад а5дасаа5да 600
ааассаасда дсаа55д5дд аадд55д5дд 5дддсад555 сс5д5сддсд адаад5с5да 660
ддаадааа5с саас5а55сс 55ддааа5дс аддаасадса а5дсддсса5 5дасддсадс 720
ад55ас5д5а дс5ддаддас а55саада5а 5д5ас55да5 ддад55сс5а дда5дадада 780
дадассда5 789
<210> 286
<211> 799
<212> ДНК
<213> Г-Т1со51апа Ьеп5Ьат1апа
<400> 286 сас5дасд55 дда55ададд 5аддс5сс55 а5а5д5дс55 аадсс5аасд 5дсадссддс 60
ссссаасссс адсад5555с аа5с5асс5а ссд5с5с5ас са5555с55а 5ад5ад55да 120
ааа555с5аа с555дадааа асаадссааа д5555д555с 5аадаасаса аадддад5да 180
аа555555дс адсаа5ддса сада55адса дса5даддса аддда5асад асссс5аа5с 240
55аа55сс5а 5555сс5ааа асссаааадд 55сс5с5555 55сдса55с5 а5с55са55д 300
да5сааадаа аа5аасссаа аа55садсаа аа5с555д5д дд5д5д5аад ааада55сад 360
5555даддд5 ддсааад5са сс5555адда 555д5дса5с ад5ддссас5 дсасадаадс 420
с5аасдада5 5д5дс5дсаа сс5а5сааад а5а5а5садд сас5д55ааа 55асс5дд55 480
с5ааа5ссс5 55ссаа5сд5 а55с5сс55с 55дс5дссс5 55с5даддда аддас5д55д 540
55дасаа555 ас5дад5ад5 да5даса55с а55аса5дс5 5дд5дса55д аааасас55д 600
дас55са5д5 адаада5дас аа5даааасс аасдадсаа5 сд5адаадд5 5д5дд5дддс 660
ад555сс5д5 сддсаадаад 5с5даддаад ааа5ссаас5 а55сс55дда аа5дсаддаа 720
садсаа5дсд дсса55дасд дсадсад55а с5д5адс5дд 5ддаса55с5 ада5а5д5ас 780
55да5ддад5 5сс5адда5 799
- 153 029482
<210> 287
<211> 845
<212> ДНК
<213> Г-НсоЕтапа ЬепЕИатдапа
<400> 287
аааЕЕсЕЕдд ЕЕсдаддадд ЕсадаадЕас аадЕсЕссЕд даааадсаЕа ЕдЕЕдаадда 60
даЕдссЕсаа дЕдсЕадсЕа сЕЕЕЕЕддсд ддЕдсадсЕд ЕсасаддЕдд аасЕдЕсасЕ 120
дЕЕдааддЕЕ дЕддаасаад садЕЕЕасад ддддаЕдЕЕа адЕЕЕдсЕда ддЕссЕсдаа 180
аадаЕддддд садаадЕЕас аЕддасадад аасадЕдЕса сддЕЕааадд ассЕссаадд 240
аасЕсЕЕсЕд дааЕдаааса ЕЕЕдсдддсЕ дЕЕдасдЕЕа асаЕдаасаа ааЕдссадаЕ 300
дЕЕдссаЕда сЕсЕЕдсЕдЕ адЕЕдсасЕЕ ЕЕЕдсЕдаЕа дЕссЕасЕдс саЕаададаЕ 360
дЕЕдсЕадсЕ ддададЕЕаа ддааасЕдад сддаЕдаЕЕд ссаЕаЕдсас адаасЕЕадд 420
аадЕЕдддЕд саасадЕЕдЕ адаадддсса дасЕасЕдса ЕааЕсасЕсс ассЕдаааад 480
ЕЕаааадЕад сддаааЕЕда ЕасаЕаЕдаЕ даЕсасадаа ЕддссаЕддс ЕЕЕсЕсЕсЕЕ 540
дсддсЕЕдЕд сЕдаЕдЕЕсс адЕсассаЕЕ ааддассссд дЕЕдЕасЕсд саааассЕЕс 600
сссаасЕасЕ ЕЕдасдЕЕсЕ ссадсадЕаЕ ЕссаадсаЕЕ ааассасЕЕЕ ссаЕЕаадаа 660
ЕЕЕЕдааааа дададасЕЕЕ дасаасааЕд дЕдЕсаЕасс ддаададааа адсЕЕЕдаЕс 720
саадсЕЕЕса асЕссЕЕЕЕс аЕЕЕдЕсаЕд ЕдаЕдаЕсаЕ ЕдЕаЕЕЕдЕЕ даадЕЕдадс 780
ЕдсЕЕЕЕсЕЕ ЕЕдЕссадаа дасаЕдЕаЕд даЕасЕаЕЕа сЕаЕаЕадЕЕ ааддЕдаасЕ 840
садса 845
<210> 288
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 288
ссасаЕддЕс садЕаЕсЕдс с 21
<210> 289
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 289
саадсаадда асссаЕссаЕ Е 21
- 154 029482
<210> 290
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 290
ддссасассЬ дсаЬдсаЬЬд с 21
<210> 291
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 291
дЬдЬЬсасдд ЬадасаааЬс с 21
<210> 292
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 292
ЬдсасЬдсас ЬЬдасдсасд Ь 21
<210> 293
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 293
аасЬдаЬдса ЬЬдсасЬЬда с 21
<210> 294
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 294
саааЬсадда аддЬаЬдада д 21
<210> 295
<211> 21
<212> ДНК
- 155 029482
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 295
бдбсааддбб ббдбббссбд д 21
<210> 296
<211> 543
<212> ДНК
<213> Г-Т1соб1апа ЪепбЬатЛапа
<400> 296
дсаабддсбб ссбсадббсб ббссбсадса дсадббдсса сссдсадсаа бдббдсбсаа 60
дсбаасабдд ббдсассббб сасаддбсбб аадбсбдсбд ссбсаббссс бдбббсаада 120
аадсаааасс ббдасабсас ббссаббдсс адсаасддсд даададбдса абдсабдсад 180
дбдбддссас сааббаасаб даадаадбаб дадасбсбсб сабассббсс сдабббдадс 240
саддадсааб бдсбсбссда ааббдадбас сббббдаада абддабдддб бссббдсббд 300
дааббсдада сбдадааадд абббдбсбас сдбдаасасс асаадбсасс аддабасбаб 360
дабддсадаб асбддассаб дбддаадсба ссбабдббсд дабдсасбда бдссасссаа 420
дбдббддсбд аддбдддада ддсдаадаад даабасссас аддссбдддб ссдбабсабб 480
ддабббдаса асдбдсдбса адбдсадбдс абсадбббса ббдссбссаа дссбдасддс 540
бас 543
<210> 297
<211> 543
<212> ДНК
<213> Ы1соб1апа ЪепбЬатЛапа
<400> 297
асаабддсбб ссбсадббсб ббссбсадса дсадббдсса сссдсадсаа бдббдсбсаа 60
дсбаасабдд ббдсассббб сасбддбсбб аадбсадсбд ссбббббссс бдбббсаадд 120
аадсаааасс ббдасабсас ббссаббдсс адсаасддсд даададбдса абдсабдсад 180
дбдбддссас сааббаасаа даадаадбас дадасбсбсб сабассббсс бдабсбдадс 240
дбддадсааб бдсббадсда ааббдадбас сбсббдаааа абддабдддб бссббдсббд 300
дааббсдада сбдадсдсдд абббдбсбас сдбдаасасс асаадбсасс дддабасбаб 360
дасддсадаб асбддассаб дбддаадббд ссбабдббсд дабдсасбда бдссасссаа 420
дбдббддссд аддбддаада ддсдаадаад дсабасссас аддссбддаб ссдбаббабб 480
ддаббсдаса асдбдсдбса адбдсадбдс абсадбббса ббдссбасаа дссадааддс 540
бас 543
- 156 029482
<210> 298
<211> 486
<212> ДНК
<213> Н1сой1апа ЪепйНат+апа
<400> 298
саадссааса йддййдсасс сййсасйддс сйсаадйссд ссйссйссйй сссйдййасс 60
аддааасааа ассййдасай йассйссайй дсйадсаайд дйддаададй йсаайдсайд 120
саддйдйддс сассааййаа сайдаадаад йасдадасас йсйсайассй йссйдайййд 180
адссаддадс ааййдсййад йдаадййдад йассййййда аааайддайд ддййссййдс 240
ййддааййсд адасйдадсд йддаййсдйс йассдйдаас ассасаасйс ассаддайас 300
йасдайддса дайасйддас сайдйддаад ййдсссайдй йсдддйдсас йдайдссасй 360
саддйдййдд сйдаддйсда ддаддсааад ааддсййасс сасаадссйд ддййадаайс 420
аййддаййсд асаасдйссд йсаадйдсаа йдсайсадйй ййайсдссйс саадссадаа 480
ддсйас 486
<210> 299
<211> 537
<212> ДНК
<213> Ы1сой1апа ЪепйЬатдапа
<400> 299
ддсйсадййа йдйссйсадс йдссдсйдйй йссассддсд ссаайдсйдй йсаадссадс 60
айддйсдсас ссййсасйдд ссйсааддсс дссйссйссй йсссддйййс саддааасаа 120
аассййдаса ййасййссай йдсйадааай ддйддаадад йссаайдсай дсаддйдйдд 180
ссдссааййа асаадаадаа дйасдадаса сйсйсайасс ййссйдаййй дадсдйддад 240
сааййдсййа дсдаааййда дйассййййд ааааайддай дддййссййд сййддааййс 300
дадасйдадс айддаййсдй сйассдйдаа сассассасй сассаддайа сйасдайддс 360
адайасйдда сдайдйддаа дййдсссайд ййсдддйдса ссдайдссас йсаддйсййд 420
дсйдаддйад аддаддссаа дааддсййас ссасаадссй дддйсадаай саййддаййс 480
дасаасдйсс дйсаадйдса айдсайсадй ййсайсдссй асаадсссда аддсйай 537
<210> 300
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 300
ддаддсаааа йасдадссйс а 21
<210> 301
- 157 029482
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 301
сасбаабсбб аабассааас б 21
<210> 302
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 302
бабдддбсаб бадсабаддс аббаб 25
<210> 303
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 303
бсбсаадааб абсасдсбсс с 21
<210> 304
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 304
сссббдддда сдсбддсадд бсас 24
<210> 305
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223>
Синтетическая конструкция
<400> 305
баабасдасб сасбабаддд ддадададсб адабсббббд
<210>
<211>
<212>
<213>
306
41
ДНК
Искусственная последовательность
40
- 158 029482
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 306
баабасдасб сасбабаддс асадбабббс ббссбссаас с 41
<210> 307
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 307
ббдсбсабсб бааабасабд б 21
<210> 308
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 308
бсабсббааа басабдбббб дбса 24
<210> 309
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 309
ббабсббсад ддабасабба дс 22
<210> 310
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 310
аабасбдсбб дсбсабсбба ааба 24
<210> <211> <212> <213> 311 21 ДНК Искусственная последовате
<220> <223> Синтетическая конструкция
- 159 029482
<400> 311
дасааЕЕсса адЕЕсадЕЕЕ с 21
<210> 312
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 312
ссдЕЕЕЕада ЕсассаЕааа дада 24
<210> 313
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 313
ЕЕдЕсЕддЕа аЕаЕсасааЕ с 21
<210> 314
<211> 2937
<212> ДНК
<213> ЫгсоЕгапа ЬепЕкатЛапа
<400> 314 аЕддЕдадда ададдадаас ЕдадЕЕассЕ ддЕЕсЕддЕд ададсЕсЕдд дЕсЕсаадаа 60
асЕддсддас адддЕсдЕдд ссадсаЕсса садсадсЕдс ассаадсЕас сЕсссадасЕ 120
ссаЕаЕсааа сЕдсааЕдас ЕасЕсадсса аЕассЕЕаЕд саадассаас ЕдааасаЕсс 180
ЕссдаадсЕд дЕЕссЕсаЕс ЕсадссассЕ дадсаддсад сЕсЕасаадЕ дасасаасад 240
ЕЕссадсаас ЕЕдсЕЕЕдса асаадаадсд дсЕасаасдс аадсадЕЕсс ассЕдсаЕса 300
адсаааЕЕас ЕааддЕЕЕсс ссЕдсдЕсса дддаадддда дсааЕддЕаЕ дадаЕдсаЕа 360
дЕсааадсса аЕсасЕЕсЕЕ сдсададсЕд ссЕдасааад асЕЕдсасса дЕаЕдаЕдЕс 420
асааЕЕЕсЕс сададдЕдЕс аЕсасдЕддс дЕсаассдЕд сЕдЕсаЕддс дсаасЕддЕд 480
аадсЕдЕасс аадааЕсЕса ЕсЕЕдддаад адасЕЕссад саЕаЕдаЕдд ааддаааадЕ 540
сЕаЕасасЕд садддссссЕ ЕссаЕЕЕдЕЕ сааааадасЕ ЕсааааЕаас ЕсЕЕаЕЕдаЕ 600
даЕдаддаЕд ддссЕддЕдд ЕдсЕадаадд дааадддааЕ ЕЕааадЕЕдЕ даЕсаааЕЕд 660
дсЕдсссдЕд сЕдаЕсЕЕса ЕсасЕЕддда аЕдЕЕЕЕЕад аадддаааса ддсЕдаЕдса 720
ссЕсаададд сдсЕЕсаадЕ ЕсЕддаЕаЕЕ дЕЕсЕдсдЕд адЕЕдссаас аЕсЕаддЕЕЕ 780
ЕдЕссЕдЕдд дЕсдЕЕсЕЕЕ сЕаЕЕсссдЕ даЕЕЕадддс дааадсаасс аЕЕдддЕдаа 840
- 160 029482
ддЕЕЕадааа дЕЕддсдЕдд дЕЕсЕаЕсаа адсаЕЕсдсс ссасасаааЕ дддсЕЕаЕса 900
сЕдаасаЕсд аЕаЕдЕсЕЕс сасЕдсаЕЕс аЕЕдадссас ЕдссадЕсаЕ ЕдаЕЕЕЕдЕд 960
асасадсЕЕс Едаассдада ЕдЕдссаЕсЕ адассасЕдЕ сЕдаЕдсЕдд ссдЕдЕааад 1020
аЕааааааад сЕсЕдададд ЕдЕдааддЕд даддЕЕасЕс аЕсдЕддааа ЕаЕдсддадд 1080
аадЕассдса ЕЕЕсдддЕЕЕ аасаЕсЕсаа дсаасаадад адЕЕдассЕЕ сссЕдЕЕдаЕ 1140
дааааЕддЕа садЕдаааЕс ЕдЕааЕЕдад ЕаЕЕЕЕсдад ааасаЕаЕдд дЕЕЕдЕааЕЕ 1200
садсаЕасЕс адЕддссЕЕд ЕсЕасаадЕЕ ддаааЕсадс ададассЕаа ЕЕасЕЕдсса 1260
аЕддаадЕсЕ дсаадаЕЕдЕ ддадддасаа аддЕасЕсаа адсдсЕЕдаа Едададасад 1320
аЕЕасЕдсас ЕЕсЕдааадЕ дассЕдссад сдЕссссаад ддадддадсд ЕдаЕаЕЕсЕЕ 1380
дадассдЕас аЕсаЕааЕдс сЕаЕдсЕааЕ дасссаЕаЕд ссааддадЕЕ ЕддЕаЕЕаад 1440
аЕЕадЕдаса адЕЕддсаса адЕЕдаддсЕ сдЕаЕЕЕЕдс сЕссассЕсд дсЕЕаааЕаЕ 1500
саЕдаЕаасд дЕсдадаааа ддасЕдссЕд ссасаадЕЕд дссааЕддаа ЕаЕдаЕдааЕ 1560
аадааааЕдд ЕаааЕддадд дасддЕдаас ааЕЕддаЕсЕ дсаЕааасЕЕ сЕсЕсдсааЕ 1620
дЕдсаадаЕа дЕдЕЕдсЕса ЕдддЕЕЕЕдс ЕсЕдадсЕЕд сасаааЕдЕд ссадаЕаЕсЕ 1680
ддсаЕдааЕЕ ЕсааЕссааа ЕссЕдЕЕсЕд ссассЕЕсда дЕдсасдссс ЕдаЕсаддЕс 1740
дааададЕаЕ ЕдаааасЕсд аЕЕЕсаЕдаЕ дсЕаЕдасЕа адЕЕдсадсЕ дсаЕдддада 1800
дадсЕЕдаЕЕ ЕдсЕадЕЕдЕ саЕсЕЕдсса дасааЕааЕд даЕсЕсЕЕЕа ЕддЕдаЕсЕд 1860
аадсдсаЕЕЕ дЕдадасЕда асЕаддадЕс дЕсЕсасадЕ дсЕдЕЕЕдас аааасаЕдЕа 1920
ЕЕЕаадаЕда дсааасадЕа ЕсЕадссааЕ дЕадсдсЕда аааЕсааЕдЕ дааддЕддда 1980
дддадаааса сЕдЕдсЕЕдЕ ЕдаЕдсааЕа Есдаддсдаа ЕЕссЕсЕЕдЕ садсдассдд 2040
ссЕассаЕса ЕЕЕЕЕддЕдс адаЕдЕсасс сасссЕсасс сЕддддадда сЕсЕадссса 2100
ЕссаЕЕдссд сддЕддЕЕдс ЕЕсЕсаадаЕ ЕддссЕдада ЕЕасааадЕа ЕдсЕддЕсЕа 2160
дЕЕЕсЕдсЕс аадсссаЕад дсаададсЕЕ аЕЕсаддаЕс ЕдЕасасдас ЕаддсаадаЕ 2220
ссЕдЕЕаадд ддасадЕЕдс ЕддЕддааЕд аЕЕааддасЕ ЕасЕЕаЕаЕс сЕЕссдаада 2280
дсЕасЕддас аааадсссса дадааЕааЕЕ ЕЕсЕаЕаддд аЕддЕдЕЕад Едааддасаа 2340
ЕЕЕЕаЕсаад ЕдсЕЕсЕдЕЕ сдаасЕЕдаЕ дсдаЕссдса аадсаЕдЕдс дЕсЕЕЕддад 2400
ссаааЕЕаЕс адсссссадЕ сасаЕЕЕдЕЕ дЕддЕЕсада аасдасаЕса сасааддсЕЕ 2460
ЕЕЕдссааЕа ассассдЕда садаааЕдса дЕЕдасадда дсдддаасаЕ ЕаЕассЕддЕ 2520
асЕдЕЕдЕад аЕЕсааадаЕ аЕдссасссд асададЕЕЕд аЕЕЕсЕаЕсЕ ЕЕдЕадссаЕ 2580
дссддсаЕас адддЕасдад ссдЕссадсЕ сасЕассаЕд ЕЕсЕаЕддда сдадаасааа 2640
ЕЕсасадссд аЕдсдсЕдса дЕсЕЕЕдасс аасаассЕсЕ дсЕаЕасаЕа ЕдсааддЕдс 2700
асдсдЕЕссд ЕсЕссаЕсдЕ ЕсссссЕдса ЕаЕЕаЕдсас аЕЕЕддсадс ЕЕЕссдЕдсЕ 2760
- 161 029482
сдаЬЬЬЬаЬа Ьддадссдда дасаЬсЬдас ддЬддЬЬсад ЬаасаадЬдд ддсЬдсЬддЬ 2820
ддсададддд дЬддЬдсадд адсЬдсЬдда аддаасассс дадссссаад ЬдсЬддЬдсЬ 2880
дсЬдЬЬадас сЬсЬЬссЬдс дсЬсааддаЬ ааЬдЬдаада дддЬЬаЬдЬЬ сЬасЬдс 2937
<210> 315 <211> 3274 <212> ДНК <213> ЫтсоЬтапа ЪепЬЬашпапа
<400> 315 сассЬаЬсас ЬсЬсЬЬЬсЬс ЬсЬсЬасааа саЬаЬсдЬдс сдЬЬЬсЬсЬс ЬсддссЬсЬс 60
ЬЬсдЬдЬЬЬЬ адддсассдЬ ддЬддЬЬддЬ аЬссаддсдд сддЬЬЬЬдад ЬЬаЬЬассаЬ 120
ддЬдсддаад аададдасЬд аЬдЬЬссЬдд ЬддЬдсЬдад адЬЬЬЬдадЬ сссаЬдааас 180
Ьддаддддса сдаддЬддЬд сссаасдссс аЬсасадсад садсаасаЬс адсаЬсадса 240
аддсддадда ададдсЬддд сассЬсадса ЬддаддасаЬ ддЬддссдЬд дЬддЬддддд 300
адсЬссасдЬ ддЬддааЬдд ссссЬсааса аЬссЬаЬддЬ ддассЬссЬд ааЬасЬасса 360
асадддсадд ддаасЬсаас адЬаЬсаасд аддЬддадда саассссадс дссдЬддЬдд 420
саЬддддддс сдЬддддсас ддссассадЬ асссдадсЬд сассаадсаа сссадасЬсс 480
асаЬсадссЬ дЬассаЬаЬд даадассаЬс адааасаЬас ЬсададдсЬд дЬЬссЬсдЬс 540
ЬсадссассЬ даассаасда сасадсаадЬ дасЬсадсаа ЬЬссадсаас ЬЬдЬЬдЬдса 600
дссадаадса дсЬдсаассс аадсааЬаса ассадсаЬсд адсаадЬсда ЬдаддЬЬЬсс 660
асЬссддсса ддааадддЬа дЬасЬддЬаЬ ЬадаЬдсаЬа дЬЬааддсса аЬсасЬЬсЬЬ 720
ЬдссдадЬЬа ссЬдасааад аЬсЬдсасса дЬаЬдаЬдЬЬ ЬсааЬЬасЬс сЬдаддЬсдс 780
сЬсЬсддддЬ дЬсаассддд ссдЬсаЬдда дсадсЬддЬд аадсЬЬЬаЬа дадааЬссса 840
ЬсЬЬдддаад аддсЬЬссад ссЬаЬдасдд аадааааадЬ сЬаЬасасад садддссссЬ 900
сссЬЬЬЬдЬЬ сааааддаЬЬ ЬЬааааЬсас ЬсЬааЬЬдаЬ даЬдаЬдаЬд дассЬддЬдд 960
ЬдсЬаддадд дааадададЬ ЬЬааадЬЬдЬ даЬсаадсЬд дсддсЬсдЬд сЬдаЬсЬЬса 1020
ЬсасЬЬдддд аЬдЬЬсЬЬас аадддадаса ддсЬдаЬдса ссдсаадаад сасЬЬсаддЬ 1080
дсЬддаЬаЬЬ дЬдсЬасдЬд адЬЬдссаас аЬсЬаддЬаЬ ЬдЬссЬдЬдд дссдсЬсЬЬЬ 1140
сЬаЬЬссссЬ саЬЬЬаддас даадасаасс асЬдддЬдаа ддЬЬЬадада дсЬддсдЬдд 1200
сЬЬсЬаЬсаа адЬаЬЬсдЬс сЬасасадаЬ дддаЬЬаЬсс сЬдааЬаЬЬд аЬаЬдЬсЬЬс 1260
сасддсЬЬЬс аЬЬдадссас ЬдссдаЬЬаЬ ЬдасЬЬсдЬд адссадсЬЬс ЬдааЬсддда 1320
ЬаЬсЬсЬЬсЬ адассасЬдЬ сЬдаЬдсЬда ссдсдЬЬаад аЬааадаадд сасЬдададд 1380
ЬдЬаааддЬд ддддЬсасЬс аЬсдЬддааа ЬаЬдсддадд аадЬаЬсдса ЬЬЬсЬддсЬЬ 1440
дасдЬсЬсаа дсаасаадад адЬЬдасЬЬЬ ЬссЬдЬсдаЬ даааддддЬа сдаЬдааадс 1500
- 162 029482
бдббдбддаа баббббсддд ааассбабдд ббббдбсабб сддсабассс адбддссббд 1560
бсббсаадбб ддааабасдс ададдссааа ббасббдсса абддаадбаб дбаадаббдб 1620
ададддасад адабасбсаа адсдсббдаа бдададдсад абаасадсас ббсбаааадб 1680
дассбдссаа сдбссбсаад адададаасд бдабаббсбб садасбдббс абсасаабдс 1740
ббабдсбдаб дасссабабд сдааддадбб бддбаббаад абсадбдадд адсббдсбса 1800
адббдаддсб сдсдббббдс сбдсассббд дсббааабас сабдабасад дбсдададаа 1860
адасбдбсбд ссасаадбдд дссадбддаа бабдабдааб аадаааабдд ббаабддадд 1920
аасадбдаас аасбддабсб дбдбааасбб ббсбсдсааб дбдсаадаса садббдсасд 1980
бддаббббдб бссдадсббд сасааабдбд сабдабабсс ддаабдаасб бсаабсссаа 2040
бссбдббсба ссассадбда дбдсбсдссс бдабсаадбб дадададбсб бдаааасбсд 2100
абббсасдаб дсбабдасаа адббдсадсс ааабдддада дадсбадабс ббббдаббдб 2160
дабаббасса дасаабаасд дсбсбсббба бддбдабсба ааасддаббб дбдааасбда 2220
асббддаабб дбсбсасааб дсбдсббдас аааасабдба бббаадабда дсаадсадба 2280
бббадсбааб дбабсссбда адабааабдб дааддббдда ддаадаааба сбдбдсбддб 2340
бдабдсдсбс бсбадасдаа ббссссббдб садсдассдс ссаасбабса бббббддбдс 2400
адабдбсасс сабссссасс сбддддадда ббсбадсссд бсааббдсбд сддбддббдс 2460
ббсбсаадаб бддссбдааа ббасааадба бдсбддбббд дбббсбдсбс аадсдсабад 2520
дсаададсбб абасаадабс бдбасаадас ббддсаадаб ссадббадад дассбдбдас 2580
бддбддсабд абаааддааб басббабббс сббссдбсда дсаасбддас адаадссдса 2640
дадааббаба ббсбасадад абддбдббад бдааддасаа ббббассаад ббсббсбббб 2700
бдаасббдаб дсаабссдса аддсабдбдс абсбббадаа сссаасбабс адсссссддб 2760
басдбббдбб дбддбссада аасддсабса басбаддббд бббдссааба ассассасда 2820
садааабдса дббдабсдда дбдддаасаб бббдссбддб ассдббдбад аббсааадаб 2880
абдссасссб асбдаабббд абббсбабсб сбдбадссаб дссддсабас адддбасбад 2940
ссдсссадсб саббабсабд ббсбдбддда бдадаасааб бббасбдсбд асдсссбдса 3000
дбсбббдасб аасаабсббб дсбабасаба бдсбаддбдб асбсдббсбд бсбссаббдб 3060
бссассадса баббабдсас абббддсадс бббссдбдсб сддббббаса бддадссада 3120
дасабсбдаб аабддабсад бсасаадсдс адсбдсббса аасададдад дбббаддадс 3180
бабдддаадд адсасдсдад сассаддбдс бддбдсбдсб дбааддсссс ббссбдсбсб 3240
сааддадааб дббаададдд ббабдбббба ббдб 3274
<210> 316
- 163 029482
<211> 3907 <212> ДНК <213> Ьеа тауз
<400> 316 ассбасббсс сссбсдсссс бсбсабддбс бсбсбсдсдс ссадабсбдс басбадасдд 60
сассдсбдса дсдсдбсдбд бсдсдддддб бддбддсадд садсдададс ббдссдббсс 120
бсбсбсбсад ббдбсаддбс сбаддсбсас сбсассддсб сссадсссдс ббсбабббсб 180
бссбссссда ссссдбдсад дбддсадбсс адбссасдсс ассаассдсд аддсдаасса 240
аассаассса сбсбссссаа ссссдсдсдс ссаддссдсс сдсссбасса ассабсддсд 300
бсддсаабдд сддссабддс дассааддсс дссдсдддса ссдбдбсдсб ддассбсдсс 360
дсдссдссдд сддсддсадс ддсддсддсд дбдсаддсдд дбдссдадда дабсдбдсбд 420
садсссабса аддадабсбс сддсассдбс аадсбдссдд ддбссаадбс дсбббссаас 480
сддабссбсс бдсбсдссдс ссбдбссдад дбдадсдабб ббддбдсббд сбдсдсбдсс 540
сбдбсбсасб дсбассбааа бдббббдссб дбсдаабасс абддаббсбс ддбдбаабсс 600
абсбсасдаб садабдсасс дсабдбсдса бдссбадсбс бсбсбааббб дбсбадбадб 660
ббдбабасдд аббаабаббд абааабсддб ассдсаааад сбаддбдбаа абааасасба 720
дааааббдда бдббссссба бсддссбдба сбсддсбасб сдббсббдбд абддсабдсб 780
дбсбсббсбб ддбдбббддб даасаассбб абдааабббд ддсдсааада асбсдсссбс 840
аадддббдаб сббабдссаб сдбсабдаба аасадбддад сасддасдаб ссбббасдбб 900
дбббббааса аасбббдбса даааасбадс абсаббаасб бсббаабдас дабббсасаа 960
сааааааадд баассбсдсб асбаасабаа саааабасбб дббдсббабб ааббабабдб 1020
бббббаабсб ббдабсаддд дасаасадбд дббдабаасс бдббдаасад бдаддабдбс 1080
сасбасабдс бсддддссбб даддасбсбб ддбсбсбсбд бсдаадсдда сааадсбдсс 1140
аааададсбд бадббдббдд сбдбддбдда аадббсссад ббдаддаббс бааададдаа 1200
дбдсадсбсб бсббддддаа бдсбддаасб дсаабдсддс саббдасадс адсбдббасб 1260
дсбдсбддбд дааабдсаас дбабдбббсс бсбсбббсбс бсбасаабас ббдсбддадб 1320
бадбабдааа сссабдддба бдбсбадбдд сббабддбдб аббддббббб даасббсадб 1380
басдбдсббд абддадбасс аадаабдадд дададассса ббддсдасбб ддббдбсдда 1440
ббдаадсадс ббддбдсада бдббдаббдб ббссббддса сбдасбдссс ассбдббсдб 1500
дбсаабддаа бсддадддсб ассбддбддс ааддббадсб асбаадддсс асабдббаса 1560
ббсббсбдба аабддбасаа сбаббдбсда дсббббдсаб ббдбааддаа адсаббдабб 1620
дабсбдаабб бдабдсбаса ссасааааба бссбасаааб ддбсабсссб аасбадсааа 1680
саабдаадба абасббддса бдбдбббабс аааббааббб ссабсббсбд дддсаббдсс 1740
- 164 029482
бдббббсбад бсбаабадса бббдббббба дсаббаабба дсбсббасаа ббдббабдбб 1800
сбасаддбса адсбдбсбдд сбссабсадс адбсадбасб бдадбдссбб дсбдабддсб 1860
дсбссбббдд сбсббдддда бдбддадабб дааабсаббд абаааббааб сбссаббссс 1920
басдбсдааа бдасаббдад аббдабддад сдббббддбд бдааадсада дсаббсбдаб 1980
адсбдддаса даббсбасаб баадддаддб сааааабаса адбаадсбсб дбаабдбабб 2040
бсасбасббб дабдссаабд бббсадбббб садббббсса аасадбсдса бсаабабббд 2100
аабадабдса сбдбадаааа аааабсаббд садддааааа сбадбасбда дбаббббдас 2160
бдбаааббаб бббассадбс ддаабабадб садбсбаббд дадбсаадад сдбдаассда 2220
аабадссадб бааббабссс аббабасада ддасаассаб дбабасбабб дааасббддб 2280
ббабаадада абсбаддбад сбддасбсдб адсбдсббдд сабддабасс ббсббабсбб 2340
баддаааада сасббдаббб бббббббсбд бддсссбсба бдабдбдбда ассбдсббсб 2400
сбаббдсббб адааддабаб абсбабдбсд ббабдсааса бдсббсссбб адссабббдб 2460
асбдааабса дбббсабаад ббсдббадбд дббсссбааа сдааассббд бббббсбббд 2520
саабсаасад дбссссбааа аабдссбабд ббдааддбда бдссбсаадс дсаадсбабб 2580
бсббддсбдд бдсбдсаабб асбддаддда сбдбдасбдб ддааддббдб ддсассасса 2640
дбббдсаддб ааадабббсб бддсбддбдс басаабаасб дсббббдбсб ббббддбббс 2700
адсаббдббс бсададбсас бааабаасаб бабсабсбдс ааабдбсааа бадасабасб 2760
баддбдаабб сабдбаассд бббссббаса аабббдсбда аассбсаддд бдабдбдаад 2820
бббдсбдадд басбддадаб дабдддадсд ааддббасаб ддассдадас бадсдбаасб 2880
дббасбддсс сассдсддда дссабббддд аддааасасс бсааддсдаб бдабдбсаас 2940
абдаасаада бдссбдабдб сдссабдасб сббдсбдбдд ббдсссбсбб бдссдабддс 3000
ссдасадсса бсададасдд баааасаббс бсадсссбас аассабдссб сббсбасабс 3060
асбасббдас аадасбаааа асбаббддсб сдббддсадб ддсббссбдд ададбааадд 3120
адассдадад дабддббдсд абссддасдд адсбаассаа ддбааддсба сабасббсас 3180
абдбсбсасд бсдбсбббсс абадсбсдсб дссбсббадс ддсббдссбд сддбсдсбсс 3240
абссбсддбб дсбдбсбдбд ббббссасад сбдддадсаб сбдббдадда адддссддас 3300
басбдсабса бсасдссдсс ддадаадсбд аасдбдасдд сдабсдасас дбасдасдас 3360
сасаддабдд ссабддссбб сбсссббдсс дссбдбдссд аддбссссдб дассабссдд 3420
дасссбдддб дсасссддаа дассббсссс дасбасббсд абдбдсбдад сасбббсдбс 3480
аадааббааб ааадсдбдсд абасбассас дсадсббдаб бдаадбдаба ддсббдбдсб 3540
даддааабас абббсббббд ббсбдббббб бсбсбббсас дддаббаадб бббдадбсбд 3600
баасдббадб бдбббдбадс аадбббсбаб ббсддабсбб аадбббдбдс асбдбаадсс 3660
- 165 029482
аааЕЕЕсаЕЕ ЕсаададЕдд ЕЕсдЕЕддаа ЕааЕаадааЕ ааЕаааЕЕас дЕЕЕсадЕдд 3720
сЕдЕсаадсс ЕдсЕдсЕасд ЕЕЕЕаддада ЕддсаЕЕада саЕЕсаЕсаЕ саасаасааЕ 3780
аааассЕЕЕЕ адссЕсааас ааЕааЕадЕд аадЕЕаЕЕЕЕ ЕЕадЕссЕаа асаадЕЕдса 3840
ЕЕаддаЕаЕа дЕЕаааасас аааадаадсЕ ааадЕЕаддд ЕЕЕадасаЕд ЕддаЕаЕЕдЕ 3900
ЕЕЕссаЕ 3907
<210> 317
<211> 2149
<212> ДНК <213> Ьеа <400> 317 ассЕасЕЕсс тауз сссЕсдсссс ЕсЕсаЕддЕс ЕсЕсЕсдсдс ссадаЕсЕдс ЕасЕадасдд 60
сассдсЕдса дсдсдЕсдЕд ЕсдсдддддЕ ЕддЕддсадд садсдададс ЕЕдссдЕЕсс 120
ЕсЕсЕсЕсад ЕЕдЕсаддЕс сЕаддсЕсас сЕсассддсЕ сссадсссдс ЕЕсЕаЕЕЕсЕ 180
ЕссЕссссда ссссдЕдсад дЕддсадЕсс адЕссасдсс ассаассдсд аддсдаасса 240
аассаассса сЕсЕссссаа ссссдсдсдс ссаддссдсс сдсссЕасса ассаЕсддсд 300
ЕсддсааЕдд сддссаЕддс дассааддсс дссдсдддса ссдЕдЕсдсЕ ддассЕсдсс 360
дсдссдссдд сддсддсадс ддсддсддсд дЕдсаддсдд дЕдссдадда даЕсдЕдсЕд 420
садсссаЕса аддадаЕсЕс сддсассдЕс аадсЕдссдд ддЕссаадЕс дсЕЕЕссаас 480
сддаЕссЕсс ЕдсЕсдссдс ссЕдЕссдад дддасаасад ЕддЕЕдаЕаа ссЕдЕЕдаас 540
адЕдаддаЕд ЕссасЕасаЕ дсЕсддддсс ЕЕдаддасЕс ЕЕддЕсЕсЕс ЕдЕсдаадсд 600
дасааадсЕд ссаааададс ЕдЕадЕЕдЕЕ ддсЕдЕддЕд дааадЕЕссс адЕЕдаддаЕ 660
ЕсЕааададд аадЕдсадсЕ сЕЕсЕЕдддд ааЕдсЕддаа сЕдсааЕдсд дссаЕЕдаса 720
дсадсЕдЕЕа сЕдсЕдсЕдд ЕддаааЕдса асЕЕасдЕдс ЕЕдаЕддадЕ ассаадааЕд 780
адддададас ссаЕЕддсда сЕЕддЕЕдЕс ддаЕЕдаадс адсЕЕддЕдс адаЕдЕЕдаЕ 840
ЕдЕЕЕссЕЕд дсасЕдасЕд сссассЕдЕЕ сдЕдЕсааЕд дааЕсддадд дсЕассЕддЕ 900
ддсааддЕса адсЕдЕсЕдд сЕссаЕсадс адЕсадЕасЕ ЕдадЕдссЕЕ дсЕдаЕддсЕ 960
дсЕссЕЕЕдд сЕсЕЕдддда ЕдЕддадаЕЕ даааЕсаЕЕд аЕаааЕЕааЕ сЕссаЕЕссс 1020
ЕасдЕсдааа ЕдасаЕЕдад аЕЕдаЕддад сдЕЕЕЕддЕд Едааадсада дсаЕЕсЕдаЕ 1080
адсЕдддаса даЕЕсЕасаЕ ЕаадддаддЕ саааааЕаса адЕссссЕаа аааЕдссЕаЕ 1140
дЕЕдааддЕд аЕдссЕсаад сдсаадсЕаЕ ЕЕсЕЕддсЕд дЕдсЕдсааЕ ЕасЕддаддд 1200
асЕдЕдасЕд ЕддааддЕЕд Еддсассасс адЕЕЕдсадд дЕдаЕдЕдаа дЕЕЕдсЕдад 1260
дЕасЕддада ЕдаЕдддадс дааддЕЕаса Еддассдада сЕадсдЕаас ЕдЕЕасЕддс 1320
ссассдсддд адссаЕЕЕдд даддааасас сЕсааддсда ЕЕдаЕдЕсаа саЕдаасаад 1380
- 166 029482
акдсскдакд ксдссакдас ксккдскдкд дккдссскск ккдссдакдд сссдасадсс 1440
аксададасд кддскксскд дададкааад дадассдада ддакддккдс дакссддасд 1500
дадскаасса адскдддадс акскдккдад даадддссдд аскаскдсак саксасдссд 1560
ссддадаадс кдаасдкдас ддсдаксдас асдкасдасд ассасаддак ддссакддсс 1620
кксксссккд ссдсскдкдс сдаддксссс дкдассаксс дддассскдд дкдсасссдд 1680
аадасскксс ссдаскаскк сдакдкдскд адсасккксд ксаадаакка акааадсдкд 1740
сдакаскасс асдсадсккд аккдаадкда каддсккдкд скдаддааак асаккксккк 1800
кдккскдккк кккскскккс асдддаккаа дккккдадкс кдкаасдкка дккдкккдка 1860
дсаадкккск аккксддакс ккаадкккдк дсаскдкаад ссааакккса ккксаададк 1920
ддкксдккдд аакаакаада акаакааакк асдккксадк ддскдксаад сскдскдска 1980
сдккккадда дакддсакка дасакксакс аксаасааса акаааасскк ккадссксаа 2040
асаакаакад кдаадккакк ккккадксск ааасаадккд саккаддака кадккаааас 2100
асаааадаад скааадккад ддкккадаса кдкддакакк дккккссак 2149
<210> 318 <211> 240 <212> ДНК <213> Беа тауз
<400> 318 касккдадкд ссккдскдак ддскдсксск ккддсксккд дддакдкдда даккдааакс 60
аккдакааак каакскссак кссдкасдкс дааакдасак кдадаккдак ддадсдкккк 120
ддкдкдааад сададсаккс кдакадскдд дасадаккск асаккааддд аддксааааа 180
касаадкссс скааааакдс скакдккдаа ддкдакдсск саадсдсаад скаккксккд 240
<210> 319
<211> 297
<212> ДНК
<213> Ыгсокгапа Ьепкбатгапа
<400> 319 дскдкаксак акскксккск ккадаасаск аакаааккаа аскксдадак аакдакккск 60
дасаададка кааасаадкд сакскакдаа дакккдаддк кдкссааааа адкдасаакк 120
ккдддкксск акаааскдка кккасаккак кдккакккдс ааскакаааа аккккадакк 180
акккссаадс ксадкккскк саасккааак дааддкадса сккдаакккс аксадсскск 240
акдасссадк аасссакдкд ддадакддда дсааадкддк саааскккад ааддаак 297
<210> 320
<211> 269
<212> ДНК
- 167 029482
<213> Пбсоббапа ЬепбЬатбапа
<400> 320
дбабдаасбб бсадаабабб абассддабс аабабаббаб дсбдааабаб ббббсддасб 60
ббааабаабб бсбббаббба аабббабббб бабасааааа баасбааабб бсааббасбб 120
ббааааббаб даббаббббб сааббассас ббабасабсс бдсбаббббд аабббсассс 180
дааадаасба сбасбабасд бддабссбса абдасссадб аасссаадбд ддадабдбдб 240
дсааадбддб сааабсббад ааддаабда 269

Claims (12)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ замедления роста растения путем подавления экспрессии гена-мишени в указанном растении, включающий местное нанесение на внешнюю поверхность указанного растения:
    (a) по меньшей мере одного нетранскрибируемого двуцепочечного полинуклеотида РНК (дсРНК), имеющего последовательность, которая идентична или комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов указанного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом указанного гена-мишени; и
    (b) эффективного количества транспортного агента,
    где указанный ген-мишень является эндогенным геном, трансгеном или обоими из них и (ί) представляет собой ген, который является необходимым для поддержания роста или жизнеспособности указанного растущего растения; (ίί) кодирует белок, обеспечивающий указаному растущему растению устойчивость к гербицидам; или (ίίί) транскрибируется в регуляторный РНК-агент, где указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и катионного липида, и позволяет указанному по меньшей мере одному нетранскрибируемому полинуклеотиду дсРНК проникать с внешней поверхности указанного растения по крайней мере в одну клетку указанного растения, и
    где указанный по меньшей мере один нетранскрибируемый полинуклеотид дсРНК подавляет экспрессию указанного гена-мишени, тем самым замедляя рост указанного растения.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную экспрессию указанного гена-мишени регулируют в растительных клетках, отличающихся от клеток, подвергнутых наружной обработке;
    при этом указанный ген-мишень кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из 5енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ЕР8Р8), синтазы ацетогидроксикарбоновой кислоты или ацетолактатсинтазы (АБ8), ацетил-кофермент А-карбоксилазы (АССаке), дигидроптероатсинтазы, фитоиндесатуразы (РИ8), оксигеназы протопорфирина IX (РРО), гидроксифенилпируватдиоксигеназы (ИРРИ), парааминобензоатсинтазы, глутаминсинтазы (08), 1-дезокси-8-ксилулозо-5-фосфатсинтазы (ИОХР), дигидроптероатсинтазы (ИНР), фенилаланинаммиаклиазы (РАЬ), глутатион-8-трансферазы (08Т), белка И1 фотосистемы II, монооксигеназы, цитохрома Р450, целлюлозосинтазы, бета-тубулина, КИВ18СО, фактора инициации трансляции, фитоиндесатуразы, аденозинтриполифосфатазы двуцепочечной ДНК (ДДАТР), и любой их комбинации;
    указанное поверхностно-активное вещество содержит кремнийорганическое соединение; указанное растение растет на открытом поле или в вегетационном домике; или способ включает комбинацию одного или более из вышеуказанного.
  3. 3. Способ по п.1, где указанный ген-мишень экспрессирует белок, который обеспечивает устойчивость к химическим гербицидам, выбранный из 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ЕР8Р8), оксидоредуктазы глифосата (ООХ), декарбоксилазы глифосата, глифосат-И-ацетилтрансферазы (0АТ), монооксигеназы дикамбы, фосфинотрицинацетилтрансферазы, дегалогеназы 2,2-дихлоропропионовой кислоты, синтазы ацетогидроксикарбоновой кислоты, ацетолактатсинтазы, галоарилнитрилазы, ацетилкофермент А-карбоксилазы, дигидроптероатсинтазы, фитоиндесатуразы, оксигеназы протопорфирина IX, гидроксифенилпируватдиоксигеназы, парааминобензоатсинтазы, глутаминсинтазы, целлюлозосинтазы, бета-тубулина и серингидроксиметилтрансферазы, причем способ дополнительно включает нанесение указанного химического гербицида на указанное растение, и где указанный по меньшей мере один нетранскрибируемый полинуклеотид дсРНК стимулирует активность указанного химического гербицида в указанном растении.
  4. 4. Композиция для замедления роста растения путем доставки нетранскрибируемого двуцепочечного полинуклеотида РНК (дсРНК) в клетки указанного растения местным нанесением композиции на внешнюю поверхность указанного растения, содержащая:
    (а) по меньше мере один нетранскрибируемый полинуклеотид дсРНК, имеющий последователь- 168 029482
    ность, которая идентична или комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов указанного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом указанного генамишени в указанном растении; и
    (б) транспортный агент,
    где указанный ген-мишень является эндогенным геном, трансгеном или обоими из них, и указанный ген-мишень (ί) представляет собой ген, который является необходимым для поддержания роста или жизнеспособности указанного растущего растения; (ΐΐ) кодирует белок, обеспечивающий указанному растущему растению устойчивость к гербицидам; или (ΐΐΐ) транскрибируется в регуляторный РНК-агент, и
    где указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и катионного липида, и позволяет указанному по меньшей мере одному нетранскрибируемому полинуклеотиду дсРНК проникать с внешней поверхности указанного растения по крайней мере в одну клетку указанного растения.
  5. 5. Композиция по п.4, где указанный ген-мишень кодирует белок, который обеспечивает указанному растению устойчивость к химическим гербицидам, выбранный из 5-енолпирувилшикимат-3фосфатсинтазы (ΕΡδΡδ), оксидоредуктазы глифосата (ΟΘΧ), декарбоксилазы глифосата, глифосат-Νацетилтрансферазы (ОЛТ), монооксигеназы дикамбы, фосфинотрицинацетилтрансферазы, дегалогеназы 2,2-дихлоропропионовой кислоты, синтазы ацетогидроксикарбоновой кислоты, ацетолактатсинтазы, галоарилнитрилазы, ацетил-кофермент А-карбоксилазы, дигидроптероатсинтазы, фитоиндесатуразы, оксигеназы протопорфирина IX, гидроксифенилпируватдиоксигеназы, парааминобензоатсинтазы, глутаминсинтазы, целлюлозосинтазы, бета-тубулина и серингидроксиметилтрансферазы, и где указанная композиция дополнительно содержит указанный химический гербицид, к которому ген-мишень обеспечивает устойчивость.
  6. 6. Композиция по п.4, представляющая собой жидкую гербицидную композицию.
  7. 7. Композиция по п.4, где указанное поверхностно-активное вещество представляет собой кремнийорганическое поверхностно-активное вещество.
  8. 8. Композиция по п.7, где указанное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество представляет собой кремнийорганический полиэфирный сополимер.
  9. 9. Композиция по п.8, где указанный кремнийорганический полиэфирный сополимер представлет собой сополимер гептаметилтрисилоксана, модифицированного полиалкиленоксидом, и метилового эфира аллилоксиполипропиленгликоля.
  10. 10. Композиция по любому из пп.4-9, отличающаяся тем, что указанный ген-мишень кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (ΕΡδΡδ), синтазы ацетогидроксикарбоновой кислоты или ацетолактатсинтазы (ΑΕδ), ацетил-кофермент А-карбоксилазы (ЛССаке), дигидроптероатсинтазы, фитоиндесатуразы (ΡΌδ), оксигеназы протопорфирина IX (РРО), гидроксифенилпируватдиоксигеназы (ΗΡΡΌ), парааминобензоатсинтазы, глутаминсинтазы (Οδ), 1-дезоксиО-ксилулозо-5-фосфатсинтазы (ΌΘΧΡ-), дигидроптероатсинтазы (ΌΗΡ), фенилаланинаммиаклиазы (ΡΑΕ), глутатиона-трансферазы (ΟδΤ), белка Ό1 фотосистемы II, монооксигеназы, цитохрома Р450, целлюлозосинтазы, бета-тубулина, КИВКСО, фактора инициации трансляции, фитоиндесатуразы и аденозинтриполифосфатазы двуцепочечной ДНК (άάΑΤΡ) или любой их комбинации.
  11. 11. Способ селективной борьбы с устойчивым к гербицидам сорным растением или самосевным растением, включающий нанесение на внешнюю поверхность указанного растения транспортного агента и по меньшей мере одного нетранскрибируемого двуцепочечного полинуклеотида (дсРНК), имеющего последовательность, которая идентична или комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов указанного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом указанного гена-мишени в указанном растении,
    где указанный ген-мишень является эндогенным геном, трансгеном или обоими из них, и (ί) представляет собой ген, необходимый для поддержания роста или жизнедеятельности указанного сорного растения или самосевного растения, (ΐΐ) кодирует белок, обеспечивающий устойчивость указанного растения к гербицидам, или (ΐΐΐ) транскрибируется в регуляторный РНК-агент, и
    где указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и катионного липида, и позволяет указанному по меньшей мере одному нетранскрибируемому полинуклеотиду дсРНК проникать с внешней поверхности указанного растения по крайней мере в одну клетку растения.
  12. 12. Растение, включающее экзогенный полинуклеотид для супрессии гена-мишени,
    где указанный ген-мишень подавляется путем местного нанесения транспортного агента и экзогенного полинуклеотида на внешнюю поверхность указанного растения,
    где указанный экзогенный полинуклеотид содержит по меньшей мере один нетранскрибируемый двуцепочечный полинуклеотид (дсРНК), имеющий последовательность, которая идентична или комплементарна непрерывной последовательности из 18 или более нуклеотидов указанного гена-мишени или матричной РНК, являющейся транскриптом указанного гена-мишени, где указанный ген-мишень является эндогенным геном, трансгеном или обоими из них, и указанный ген-мишень (ί) представляет собой
    - 169 029482
    ген, который является необходимым для поддержания роста или жизнеспособности указанного растения; (ϋ) кодирует белок, обеспечивающий указанному растению устойчивость к гербицидам; или (ΐΐΐ) транскрибируется в регуляторный РНК-агент; и
    где указанный транспортный агент выбирают из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества и катионного липида, и позволяет указанному экзогенному полинуклеотиду проникать с внешней поверхности указанного растения по крайней мере в одну клетку указанного растения.
    АТС6СТСААССТАСТАССАТСААСААТ00Т0ТССАТАСТ6СТСААТТССАССАТАСТТТАСССАААА
    СССАСТТАСССАААТСТТСАААААСТСТТААТТТТССАТСАААСТТСАСААТТТСТССАААСТТСАТ
    СТСТТТААССААТААААСАеТТООТеббСААТСАТСААТТСТТСССААСАТТСААССТТСТСТТССТ
    ССТССАССТСА6АААССТТСАТСТ6ТСССА6АААТТСТСТТАСААСССАТСАААСАСАТСТСТССТА
    СТСТТСААТТСССТСССТСАААСТСТТТАТССААТССААТССТТСТТТТАССТбСТТТСТСТСАССС
    САСААСАСТСбТСбАСААСТтеСТСТАТАбТбАТСАТАТТСТТТАТАТСТТдОАСОСТСТСАОААСТ
    СТТе0ТТТААААСТСеАССАТеАТАСТАСАСССААААССеСАСТССТА6А66<ЭТТеТС6Т66ТСТ6Т
    ТТССТСТТССТАААСАТССАААССААСАСАТТСААСТТТТССТТ66ТААТ6САССААСАСССАТССС
    СССАТТСАСАССТССССТТССССТТССТССАСеАААТТСААСТТАТСТССТТСАТССАСТАССААСА
    АТСАСССАССбССССАТТССССАТСТСОТАбСАССТСТАААССААСТТбеТТСАСАТСТАОАТТСТТ
    ТТСТТСССАСАААТТеСССТССТСТТССССТСААТССТАААССАССССТТССАСССбССААССТСАА
    ССТСТСТССАТСОСТТАСТАСССААТАТТТААСТССАСТТСТСАТббСТАСТССТТТСеСТСТТССА
    САССТеСАеАТТСАеАТАеТТСАТАААТТСАТТТСТеТАСССТАТСТТСАААТеАСААТАААСТТСА
    Т6СААС6СТТТССА0ТАТСССТАСААСАТАСТСАТАСТТС66АСАССТТСТАСАТТС6АССТе0ТСА
    6АААТАСАААТСТССТССААА6ССАТАТСТТСА0СОТ6АТ6СТТСААСТССТАССТАСТТССТАССС
    СбАСССеСССТСАСТССТСбСАСТСТСАСТСТСААСССТТбТССААСААССАСТТТАСАСССТСАТС
    ТААААТТТССС0ААСТТСТТ0АСААСАТ605ТТ0САА65ТСАССТ6САСА6А6ААТА6Т6ТААСТ6Т
    ТАСТССАССАСССАСССАТТСАТСТССАААСАААСАТСТСССТССТАТССАССТСААСАТСААСААА
    АТбССАСАТбТТбСТАТеАСТСТТбСАбТТбТТбССТТбТАТеСАбАТеббСССАССеССАТСАОАб
    АТеТСССТАССТбеАСАСТСААСОАААСССААСССАТбАТТСССАТТТССАСАСААСТСАСАААОСТ
    ТССббСААСАеТТОАОСААебАТСТбАТТАСТОТеТСАТСАСТСССССТСААААбСТАААССССАСС
    СССАТТбАААСТТАТСАССАТСАСССААТСаССАТСССАТТСТСТСТТССТСССТбТССАСАТСТТС
    ССеТСАСТАТССТТСАТСССССАТССАСССбТААААССТТСССССАСТАСТТТСАТеТТТТАСАААА
    СТТССССААССАТТСА
    8Е<2 ГО N0:1
EA201201264A 2010-03-08 2011-03-08 Молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений EA029482B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31176210P 2010-03-08 2010-03-08
US34980710P 2010-05-28 2010-05-28
US38155610P 2010-09-10 2010-09-10
PCT/US2011/027528 WO2011112570A1 (en) 2010-03-08 2011-03-08 Polynucleotide molecules for gene regulation in plants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201201264A1 EA201201264A1 (ru) 2013-03-29
EA029482B1 true EA029482B1 (ru) 2018-04-30

Family

ID=44563804

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201201264A EA029482B1 (ru) 2010-03-08 2011-03-08 Молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений
EA201792402A EA201792402A3 (ru) 2010-03-08 2011-03-08 Молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201792402A EA201792402A3 (ru) 2010-03-08 2011-03-08 Молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений

Country Status (27)

Country Link
US (4) US9121022B2 (ru)
EP (2) EP2545182B1 (ru)
JP (3) JP5925701B2 (ru)
KR (1) KR101982126B1 (ru)
CN (1) CN102822350B (ru)
AR (1) AR080389A1 (ru)
AU (3) AU2011224570B2 (ru)
BR (1) BR112012022570A2 (ru)
CA (1) CA2790211C (ru)
CL (1) CL2012002474A1 (ru)
CO (1) CO6592096A2 (ru)
DK (1) DK3231872T3 (ru)
EA (2) EA029482B1 (ru)
ES (2) ES2809679T3 (ru)
HK (1) HK1177230A1 (ru)
HU (1) HUE033056T2 (ru)
IL (1) IL221709B (ru)
MX (1) MX2012010479A (ru)
MY (1) MY163887A (ru)
NZ (2) NZ601784A (ru)
PE (2) PE20130649A1 (ru)
PL (1) PL2545182T4 (ru)
SG (1) SG183407A1 (ru)
UA (1) UA115023C2 (ru)
UY (1) UY33267A (ru)
WO (1) WO2011112570A1 (ru)
ZA (1) ZA201206683B (ru)

Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
WO2011112570A1 (en) 2010-03-08 2011-09-15 Monsanto Technology Llc Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
BR122019027736B1 (pt) * 2010-12-28 2021-04-27 Incorporated Administrative Agency, National Agriculture And Food Research Organization Vetor e processo para a produção de uma planta
CA2842709A1 (en) 2011-08-16 2013-02-21 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for introduction of exogenous dsrna into plant cells
WO2013040005A1 (en) * 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
BR112014005954A2 (pt) * 2011-09-13 2020-12-01 Monsanto Technology Llc métodos e composições químicas agrícolas para controle de planta, método de redução de expressão de um gene dhps em uma planta, cassete de expressão microbiana, método para fazer um polinucleotídeo, método de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação de expressão do gene dhps
BR112014005795A2 (pt) * 2011-09-13 2020-12-08 Monsanto Technology Llc métodos de controle de plantas, de redução da expressão de um gene de hppd de uma planta, de preparação de um nucleotídeo, e de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação da expressão do gene de hppd no tratamento externo de uma planta, composições e cassete de expressão microbiana
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP3434780A1 (en) * 2011-09-13 2019-01-30 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
EP2755467B1 (en) * 2011-09-13 2017-07-19 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CN104160028A (zh) * 2011-09-13 2014-11-19 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
BR112014005951A2 (pt) * 2011-09-13 2017-04-04 Monsanto Technology Llc métodos e composições para controle de erva daninha
UA116089C2 (uk) * 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
JP6011759B2 (ja) * 2011-09-16 2016-10-19 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 サイレンシング抑制因子およびその取得方法
EP2791341A4 (en) * 2011-12-12 2015-07-29 Chuanxin Sun USE OF OLIGONUCLEOTIDES IN PLANT BIOLOGY
CN104114696B (zh) 2011-12-21 2017-05-03 阿普斯有限责任公司 使用具有对水解酶抗性的衣壳的vlp的方法
MX360866B (es) * 2012-05-24 2018-11-09 A B Seeds Ltd Composiciones y métodos para silenciar la expresión genética.
ITNA20120046A1 (it) 2012-08-02 2014-02-03 No Self S R L Uso di acidi nucleici di sistemi biologici parassiti, patogeni e infestanti per l'inibizione e/o controllo degli stessi sistemi
EP2885411B1 (en) 2012-08-16 2018-12-05 VIB vzw Means and methods for altering the lignin pathway in plants
AU2013317586B2 (en) 2012-09-24 2017-12-07 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for extending shelf life of plant products
WO2014062775A2 (en) * 2012-10-16 2014-04-24 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for controlling plant viral infection
CN104870647A (zh) * 2012-10-18 2015-08-26 孟山都技术公司 用于植物害虫控制的方法和组合物
WO2014064704A2 (en) 2012-10-28 2014-05-01 A.B. Seeds Ltd. Transgenic plants with modified sugar content and methods of generating same
WO2014084884A1 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Monsanto Technology Llc Transgenic plants with enhanced traits
UY35251A (es) 2013-01-01 2014-07-31 Seeds Ltd Ab MOLÉCULAS DE dsRNA AISLADAS Y MÉTODOS PARA USARLAS PARA SILENCIAR MOLÉCULAS DIANA DE INTERÉS
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
EP2945484A4 (en) * 2013-01-15 2017-03-29 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for plant pest control
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
BR112015017830A2 (pt) 2013-01-29 2017-11-21 Bayer Cropscience Lp processos e meios para aumentar a tolerância ao estresse e a biomassa em plantas
US10351867B2 (en) 2013-03-01 2019-07-16 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for targeting RNA polymerases and non-coding RNA biogenesis to specific loci
UY35379A (es) * 2013-03-13 2014-09-30 Monsanto Technology Llc ?métodos y composiciones para el control de malezas?.
WO2014164797A2 (en) * 2013-03-13 2014-10-09 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
US20160007597A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-14 Suntory Holdings Limited Treating agent for plant cell walls, substance delivery method using treating agent, and substance delivery system
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20160044913A1 (en) * 2013-03-15 2016-02-18 Monsanto Technology Llc Compositions and Methods for Delaying Senescence in Cut Flower
BR112015023424A2 (pt) * 2013-03-15 2017-11-28 Monsanto Technology Llc construto de expressão engenheirado, método para aprimoramento de produção de rna ou proteína, vetor, célula, hospedeira bacteriana, sistema de cultura de célula para síntese in vivo de dsrna, composição e método para controlar uma infestação de pragas de invertebrados ou para inibir a propagação de uma doença viral em uma população de plantas, e terminador transcricional
AU2014234265B2 (en) 2013-03-21 2020-01-30 Universiteit Gent Means and methods for the reduction of photorespiration in crops
WO2014167514A1 (en) * 2013-04-09 2014-10-16 Tuttle Chris Formulations and methods for control of weedy species
DK3222274T3 (da) 2013-06-19 2020-11-02 Apse Llc Sammensætninger og fremgangsmåder under anvendelse af capsider, der er resistente over for hydrolaser
UA122386C2 (uk) 2013-07-01 2020-11-10 Байєр Кропсаєнс Нв Спосіб прискорення цвітіння, розвитку насіння або уповільнення проростання насіння у однодольних рослин
MX359191B (es) 2013-07-19 2018-09-18 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa.
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
US20150089870A1 (en) * 2013-10-01 2015-04-02 Wayne State University Population control of invasive plant species and restoration of native plant communities
BR112016008172B1 (pt) 2013-10-16 2021-06-15 The Australian National University Método para modulação do crescimento de plantas
UA120426C2 (uk) 2013-11-04 2019-12-10 Монсанто Текнолоджі Елелсі Композиція та спосіб для боротьби з членистоногими паразитами та зараженням шкідниками
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
EP3116303B1 (en) * 2014-01-15 2020-07-22 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control using epsps polynucleotides
WO2015116680A1 (en) 2014-01-30 2015-08-06 Two Blades Foundation Plants with enhanced resistance to phytophthora
WO2015153339A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
WO2015171603A1 (en) 2014-05-06 2015-11-12 Two Blades Foundation Methods for producing plants with enhanced resistance to oomycete pathogens
US10106807B2 (en) * 2014-06-05 2018-10-23 Ut-Battelle, Llc Transcription factor which regulates flavonoid, phenylpropanoid, tyrosine, and tryptophan pathways
CA2953347A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference
EP3161138A4 (en) * 2014-06-25 2017-12-06 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
US20170159065A1 (en) 2014-07-08 2017-06-08 Vib Vzw Means and methods to increase plant yield
AU2015288157A1 (en) * 2014-07-11 2017-01-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
CN114009454A (zh) 2014-07-29 2022-02-08 孟山都技术公司 用于控制昆虫害虫的组合物和方法
EP3202907A1 (en) * 2014-08-06 2017-08-09 Valagro S.p.A. Method for modulating plant processes
WO2016050512A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Bayer Cropscience Nv Methods and means for increasing stress tolerance and biomass in plants
PL3256589T3 (pl) 2015-01-22 2022-02-21 Monsanto Technology Llc Kompozycje i sposoby kontrolowania leptinotarsa
AU2016270870A1 (en) 2015-06-02 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
AU2016270913A1 (en) * 2015-06-03 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
US20180237790A1 (en) * 2015-08-13 2018-08-23 Forrest Innovation Ltd. Formulations and compositions for delivery of nucleic acids to plant cells
CN108513579B (zh) 2015-10-09 2022-10-04 孟山都技术公司 新颖的rna导向性核酸酶及其用途
CN115216459B (zh) 2015-12-29 2024-06-28 孟山都技术公司 新型crispr相关转座酶及其用途
BR102017001164A2 (pt) 2016-01-26 2019-03-06 Embrapa - Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária Composições de rna de fita dupla para controle de diaphorina citri e métodos de uso.
CN108884462B (zh) * 2016-01-26 2022-11-25 日产化学株式会社 单链寡核苷酸
EP3228187A1 (en) * 2016-04-06 2017-10-11 Kws Saat Se Novel means and methods for cereal pathogen resistance
CA3023041A1 (en) 2016-05-03 2017-11-09 University Of Manitoba Plants and methods for controlling fungal plant pathogens
WO2017205837A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 The Regents Of The Univeristy Of California Methods and compositions for targeting rna polymerases and non-coding rna biogenesis to specific loci
BR112019008856A2 (pt) 2016-11-07 2019-07-09 nanoSUR LLC rnas de fita dupla quimicamente modificados pós-transcricionalmente
US10392620B2 (en) * 2016-11-10 2019-08-27 Dow Agrosciences Llc Cytochrome B (CYTB) nucleic acid molecules that control pathogens
CN115927437A (zh) 2017-05-11 2023-04-07 中国科学院遗传与发育生物学研究所 抗除草剂基因的产生及其用途
US11802289B2 (en) * 2017-08-03 2023-10-31 Plantform Corporation Transient silencing of ARGONAUTE1 and ARGONAUTE4 to increase recombinant protein expression in plants
CN111566121A (zh) 2018-01-12 2020-08-21 巴斯夫欧洲公司 小麦7a染色体上决定每穗小穗数QTL的基因
CN108034657A (zh) * 2018-01-31 2018-05-15 山东省葡萄研究院 一种葡萄snRNA U6 基因及其引物和应用
CN108841843B (zh) * 2018-07-24 2021-07-16 重庆科技学院 一种颠茄AbPDS基因及其应用
EP3841213A4 (en) * 2018-08-24 2022-06-08 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING PLANTS
CN109810991B (zh) * 2019-03-02 2021-11-12 昆明理工大学 二氢蝶酸合酶基因folP的用途
AU2020358862A1 (en) 2019-10-02 2022-04-14 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Staphylococcus peptides and methods of use
WO2021186433A1 (en) * 2020-03-16 2021-09-23 Imi Tami Institute For Research & Development Ltd. Topical application of polynucleotide molecules for improving yield traits of plants
JP2024532413A (ja) 2021-08-31 2024-09-05 ナノスール エルエルシー 高分子量修飾ｄｓＲＮＡ組成物
WO2023131616A1 (en) 2022-01-05 2023-07-13 Vib Vzw Means and methods to increase abiotic stress tolerance in plants
WO2023131637A1 (en) 2022-01-06 2023-07-13 Vib Vzw Improved silage grasses
WO2023144199A1 (en) 2022-01-26 2023-08-03 Vib Vzw Plants having reduced levels of bitter taste metabolites
WO2024187037A1 (en) * 2023-03-07 2024-09-12 Greenlight Biosciences, Inc. Protection of plants against pathogens by induction of systemic or localized protective responses in plants

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1416049A1 (en) * 2001-07-06 2004-05-06 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Method of interfering with a virus infection in plants
WO2007039454A1 (en) * 2005-09-20 2007-04-12 Basf Plant Science Gmbh Methods for controlling gene expression using ta-siran

Family Cites Families (554)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE288618C (ru) 1911-10-16 1915-11-10
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5094945A (en) 1983-01-05 1992-03-10 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use
US5304732A (en) 1984-03-06 1994-04-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US5331107A (en) 1984-03-06 1994-07-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4581847A (en) 1984-09-04 1986-04-15 Molecular Genetics Research And Development Tryptophan overproducer mutants of cereal crops
DE3587548T2 (de) 1984-12-28 1993-12-23 Bayer Ag Rekombinante DNA, die in pflanzliche Zellen eingebracht werden kann.
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
CA1313830C (en) 1985-08-07 1993-02-23 Dilip Maganlal Shah Glyphosate-resistant plants
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5273894A (en) 1986-08-23 1993-12-28 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5605011A (en) 1986-08-26 1997-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5013659A (en) 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5378824A (en) 1986-08-26 1995-01-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5312910A (en) 1987-05-26 1994-05-17 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US4971908A (en) 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US5145783A (en) 1987-05-26 1992-09-08 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-endolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5922602A (en) 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5258300A (en) 1988-06-09 1993-11-02 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Method of inducing lysine overproduction in plants
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
GB8825402D0 (en) 1988-10-31 1988-11-30 Cambridge Advanced Tech Sulfonamide resistance genes
US5310667A (en) 1989-07-17 1994-05-10 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US5286634A (en) 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
DD288618A5 (de) 1989-10-23 1991-04-04 Adl Fz Fuer Bodenfruchtbarkeit Muenchberg,De Verfahren zur selektiven verringerung der produktion eines isoenzyms der glutamin-synthase von medicago sativa l.
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
WO1991010725A1 (en) 1990-01-22 1991-07-25 Dekalb Plant Genetics Fertile transgenic corn plants
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5837848A (en) 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU655197B2 (en) 1990-06-25 1994-12-08 Monsanto Technology Llc Glyphosate tolerant plants
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
PT98562B (pt) 1990-08-03 1999-01-29 Sanofi Sa Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
EP0549686A4 (en) 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
US5866775A (en) 1990-09-28 1999-02-02 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US5767366A (en) 1991-02-19 1998-06-16 Louisiana State University Board Of Supervisors, A Governing Body Of Louisiana State University Agricultural And Mechanical College Mutant acetolactate synthase gene from Ararbidopsis thaliana for conferring imidazolinone resistance to crop plants
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
USRE36449E (en) 1991-03-05 1999-12-14 Rhone-Poulenc Agro Chimeric gene for the transformation of plants
FR2673642B1 (fr) 1991-03-05 1994-08-12 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere comprenant un promoteur capable de conferer a une plante une tolerance accrue au glyphosate.
ATE207126T1 (de) 1991-05-15 2001-11-15 Monsanto Technology Llc Verfahren zur schöpfung einer transformierten reispflanze
US5731180A (en) 1991-07-31 1998-03-24 American Cyanamid Company Imidazolinone resistant AHAS mutants
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
JPH0557182A (ja) 1991-09-03 1993-03-09 Central Glass Co Ltd 二酸化炭素吸収剤
US5518908A (en) 1991-09-23 1996-05-21 Monsanto Company Method of controlling insects
FR2684354B1 (fr) 1991-11-29 1995-01-20 Oreal Dispositif distributeur pour un recipient contenant un produit liquide a pateux.
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
EP0604662B1 (en) 1992-07-07 2008-06-18 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
WO1994001382A1 (en) 1992-07-10 1994-01-20 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Gas generating agent and gas generator for automotive airbag
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
US5339107A (en) 1992-08-19 1994-08-16 Hewlett-Packard Company Color optical scanner with rotating color filter assembly
WO1994013491A1 (en) 1992-12-14 1994-06-23 Sony Corporation Water-based ink fixing composition, thermally transferred image covering film using the same, and thermal transfer image recording medium
US5721138A (en) 1992-12-15 1998-02-24 Sandford University Apolipoprotein(A) promoter and regulatory sequence constructs and methods of use
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US6414222B1 (en) 1993-02-05 2002-07-02 Regents Of The University Of Minnesota Gene combinations for herbicide tolerance in corn
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
CA2159629A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4314274C2 (de) 1993-04-30 1995-11-30 Foerster Inst Dr Friedrich Verfahren und Vorrichtung zur automatischen Durchmesserverstellung von an einem rotierend angetriebenen Prüfkopf vorgesehenen Gebern von Meß- und/oder Prüfeinrichtungen
JP3759628B2 (ja) 1993-06-08 2006-03-29 麒麟麦酒株式会社 ブリーチング除草剤耐性植物の製造
US5393175A (en) 1993-06-18 1995-02-28 Courville; Leo Diamond core drill
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
EP0643221B1 (en) 1993-09-14 1998-04-22 Lucas Industries Public Limited Company Fuel Supply Apparatus
US6969782B2 (en) 1993-10-06 2005-11-29 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing transgenic plants having improved amino acid composition
GB9403941D0 (en) 1994-03-01 1994-04-20 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5558071A (en) 1994-03-07 1996-09-24 Combustion Electromagnetics, Inc. Ignition system power converter and controller
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5767373A (en) 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US5939602A (en) 1995-06-06 1999-08-17 Novartis Finance Corporation DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
US5392910A (en) 1994-07-21 1995-02-28 Transidyne General Corporation Package for a device having a sharp cutting edge
BR9508620A (pt) 1994-08-19 1997-11-25 Monsanto Co Liberação de substâncias quimicas exógenas para tecidos de plantas
DE4430307A1 (de) 1994-08-26 1996-02-29 Bayer Ag Verfahren und Vorrichtung zur gleichzeitigen Dispergierung und Zerstäubung von mindestens zwei Flüssigkeiten
US5631152A (en) 1994-10-26 1997-05-20 Monsanto Company Rapid and efficient regeneration of transgenic plants
US5550398A (en) 1994-10-31 1996-08-27 Texas Instruments Incorporated Hermetic packaging with optical
US5830430A (en) * 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
US5853973A (en) 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
BR9604993B1 (pt) 1995-04-20 2009-05-05 dna mutante codificando uma proteìna ahas mutante de sìntese de ácido acetohidróxi e proteìnas ahas mutantes.
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
US6084155A (en) 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
EP0832271B8 (en) 1995-06-07 2005-03-02 INEX Pharmaceuticals Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
DE69634875T2 (de) 1995-12-27 2006-04-27 Japan Tobacco Inc. Kälteindusierbare promotorsequenzen
US5739180A (en) 1996-05-02 1998-04-14 Lucent Technologies Inc. Flat panel displays and methods and substrates therefor
EP0856060A2 (en) 1996-06-21 1998-08-05 Monsanto Company METHODS FOR THE PRODUCTION OF STABLY-TRANSFORMED, FERTILE WHEAT EMPLOYING $i(AGROBACTERIUM)-MEDIATED TRANSFORMATION AND COMPOSITIONS DERIVED THEREFROM
JP2000513228A (ja) 1996-06-27 2000-10-10 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー ｐ―ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの植物遺伝子
FR2751347B1 (fr) 1996-07-16 2001-12-07 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides
JP4191250B2 (ja) 1996-08-16 2008-12-03 モンサント・テクノロジー・エルエルシー 外因性化学物質で植物を処置するための順次適用方法
US6140078A (en) 1996-09-05 2000-10-31 Unilever Patent Holdings Salt-inducible promoter derivable from a lactic acid bacterium, and its use in a lactic acid bacterium for production of a desired protein
JPH10117776A (ja) 1996-10-22 1998-05-12 Japan Tobacco Inc インディカイネの形質転換方法
DE19652284A1 (de) 1996-12-16 1998-06-18 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Neue Gene codierend für Aminosäure-Deacetylasen mit Spezifität für N-Acetyl-L-Phosphinothricin, ihre Isolierung und Verwendung
WO1998031822A1 (en) 1997-01-20 1998-07-23 Plant Genetic Systems, N.V. Pathogen-induced plant promoters
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US6040497A (en) 1997-04-03 2000-03-21 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
US7105724B2 (en) 1997-04-04 2006-09-12 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
US7022896B1 (en) 1997-04-04 2006-04-04 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
WO1999014348A1 (en) 1997-09-12 1999-03-25 Performance Plants, Inc. In planta transformation of plants
US6245968B1 (en) 1997-11-07 2001-06-12 Aventis Cropscience S.A. Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
FR2770854B1 (fr) 1997-11-07 2001-11-30 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un tel gene, tolerantes aux herbicides
US6069115A (en) 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops
IL122270A0 (en) 1997-11-20 1998-04-05 Yeda Res & Dev DNA molecules conferring to plants resistance to a herbicide and plants transformed thereby
ES2249848T3 (es) 1997-11-26 2006-04-01 Kamterter Ii, L.L.C. Acondicionamiento de semillas en matriz solida.
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6421956B1 (en) 1997-12-29 2002-07-23 Van Dok Ijsbrand Method and apparatus for priming seed
US20030027173A1 (en) 1998-01-16 2003-02-06 Della-Cioppa Guy Method of determining the function of nucleotide sequences and the proteins they encode by transfecting the same into a host
US6303848B1 (en) 1998-01-16 2001-10-16 Large Scale Biology Corporation Method for conferring herbicide, pest, or disease resistance in plant hosts
US5914451A (en) 1998-04-06 1999-06-22 Monsanto Company Efficiency soybean transformation protocol
US6906245B1 (en) 1998-04-30 2005-06-14 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing transgenic plants resistant to weed control compounds which disrupt the porphyrin pathways of plants
US6307123B1 (en) 1998-05-18 2001-10-23 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for transgene identification
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
JP2002518521A (ja) 1998-06-20 2002-06-25 ワシントン・ユニバーシティ 医用画像解析、診断および治療のための膜透過性ペプチド錯体
EP1092011A1 (en) 1998-06-22 2001-04-18 Regents Of The University Of Minnesota DNA ENCODING OAT ACETYL CoA CARBOXYLASE
JP2000083680A (ja) 1998-07-16 2000-03-28 Nippon Paper Industries Co Ltd 光誘導型プロモ―タ―の制御下に置かれた不定芽再分化遺伝子を選抜マ―カ―遺伝子とする植物への遺伝子導入方法及びこれに用いる植物への遺伝子導入用ベクタ―
US6121513A (en) 1998-07-20 2000-09-19 Mendel Biotechnology, Inc. Sulfonamide resistance in plants
US6717034B2 (en) 2001-03-30 2004-04-06 Mendel Biotechnology, Inc. Method for modifying plant biomass
US6506599B1 (en) 1999-10-15 2003-01-14 Tai-Wook Yoon Method for culturing langerhans islets and islet autotransplantation islet regeneration
AU2037700A (en) 1998-12-03 2000-06-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant vitamin e biosynthetic enzymes
US6642435B1 (en) 1998-12-18 2003-11-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plant folate biosynthetic genes
WO2000042207A2 (en) 1999-01-14 2000-07-20 Monsanto Technology Llc Soybean transformation method
IL128207A (en) 1999-01-24 2005-03-20 Bio Oz Advanced Biotechnologic Multi-barrel plant inoculation gun
WO2000044914A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
JP2000247810A (ja) 1999-02-26 2000-09-12 Meiji Seika Kaisha Ltd 農薬の薬理効果促進剤
US6271359B1 (en) 1999-04-14 2001-08-07 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
US6992237B1 (en) 1999-04-16 2006-01-31 Pioneer Hi-Bred International Inc. Regulated expression of genes in plant seeds
US6207879B1 (en) 1999-05-14 2001-03-27 Dekalb Genetics Corporation Maize RS81 promoter and methods for use thereof
US6232526B1 (en) 1999-05-14 2001-05-15 Dekalb Genetics Corp. Maize A3 promoter and methods for use thereof
US6194636B1 (en) 1999-05-14 2001-02-27 Dekalb Genetics Corp. Maize RS324 promoter and methods for use thereof
US6713077B1 (en) 1999-07-28 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Control of shoot/foliar feeding pests with pesticide seed treatments
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
DE60033959T2 (de) 1999-12-07 2007-11-22 Monsanto Technology Llc Regenerierung und transformation von zuckerrüben
DE10000600A1 (de) 2000-01-10 2001-07-12 Bayer Ag Substituierte Oxazolyl- und Thiazolyl-uracile
IL134830A0 (en) 2000-03-01 2001-05-20 Chay 13 Medical Res Group N V Peptides and immunostimulatory and anti-bacterial pharmaceutical compositions containing them
JP2001253874A (ja) 2000-03-10 2001-09-18 Ishihara Sangyo Kaisha Ltd ピリミジン系化合物、それらの製造方法及びそれらを含有する除草剤
US6444615B1 (en) 2000-04-18 2002-09-03 Dow Agrosciences Llc Herbicidal imidazolidinetrione and thioxo-imidazolidinediones
US8106174B2 (en) 2000-05-08 2012-01-31 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
US6768044B1 (en) 2000-05-10 2004-07-27 Bayer Cropscience Sa Chimeric hydroxyl-phenyl pyruvate dioxygenase, DNA sequence and method for obtaining plants containing such a gene, with herbicide tolerance
CA2445398A1 (en) 2000-05-10 2001-11-15 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Resistance to acetohydroxyacid synthase-inhibiting herbicides
JP2002080454A (ja) 2000-06-26 2002-03-19 Nippon Nohyaku Co Ltd ピリジン−２，３−ジカルボン酸ジアミド誘導体及び除草剤
US7354707B2 (en) 2000-06-27 2008-04-08 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Nucleic acid probes, method for determining concentrations of nucleic acid by using the probes, and method for analyzing data obtained by the method
US7109393B2 (en) 2000-08-15 2006-09-19 Mendel Biotechnology, Inc. Methods of gene silencing using inverted repeat sequences
BR0003908A (pt) 2000-08-18 2002-06-18 Suzano Papel & Celulose Método para transformação genética de eucalyptus spp
US6453609B1 (en) 2000-09-06 2002-09-24 University Of Iowa Research Foundation Method for uptake of a substance into a seed
US7008904B2 (en) * 2000-09-13 2006-03-07 Monsanto Technology, Llc Herbicidal compositions containing glyphosate and bipyridilium
JP2002138075A (ja) 2000-10-30 2002-05-14 Nippon Soda Co Ltd ３−アミノアクリル酸誘導体及び除草剤
FR2815969B1 (fr) 2000-10-30 2004-12-10 Aventis Cropscience Sa Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique
US7462481B2 (en) 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
CN1162542C (zh) 2000-11-03 2004-08-18 中国科学院微生物研究所 一种植物外源凝集素基因
JP2002145707A (ja) 2000-11-10 2002-05-22 Sankyo Co Ltd Ｎ−置換ジヒドロピロール誘導体を含有する除草剤
EP1347056B1 (en) 2000-11-29 2008-06-04 Kumiai Chemical Industry Co., Ltd. Gene encoding acetolactate synthase
AU2002214158B2 (en) 2000-12-07 2007-01-18 Syngenta Limited Plant derived hydroxy phenyl pyruvate dioxygenases (HPPD) resistant against triketone herbicides and transgenic plants containing these dioxygenases
EP2233605B1 (en) 2000-12-12 2012-09-26 Konica Corporation Optical film comprising an anti-reflection layer
US7151204B2 (en) 2001-01-09 2006-12-19 Monsanto Technology Llc Maize chloroplast aldolase promoter compositions and methods for use thereof
JP2002220389A (ja) 2001-01-26 2002-08-09 Hokko Chem Ind Co Ltd ピリジルベンズオキサジン誘導体、除草剤および中間体
EP1362059A2 (de) 2001-02-16 2003-11-19 Metanomics GmbH &amp; Co. KGaA Verfahren zur identifizierung von substanzen mit herbizider wirkung
WO2002066439A1 (fr) 2001-02-20 2002-08-29 Sagami Chemical Research Center Derives de pyrazole, intermediaires associes, procedes de production associes et herbicide contenant lesdits derives en tant qu'ingredient actif
EP1238586A1 (en) 2001-03-09 2002-09-11 Basf Aktiengesellschaft Herbicidal 2-alkynyl-pyri(mi)dines
DE10116399A1 (de) 2001-04-03 2002-10-10 Bayer Ag Substituierte Azolazin(thi)one
US6743905B2 (en) 2001-04-16 2004-06-01 Applera Corporation Mobility-modified nucleobase polymers and methods of using same
US20070021360A1 (en) 2001-04-24 2007-01-25 Nyce Jonathan W Compositions, formulations and kit with anti-sense oligonucleotide and anti-inflammatory steroid and/or obiquinone for treatment of respiratory and lung disesase
JP2003064059A (ja) 2001-06-14 2003-03-05 Nippon Soda Co Ltd ピリミジン化合物、製造方法および除草剤
DE10130397A1 (de) 2001-06-23 2003-01-09 Bayer Cropscience Gmbh Herbizide substituierte Pyridine, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Herbzide und Pflanzenwachstumsregulatoren
ITMI20011497A1 (it) 2001-07-13 2003-01-13 Isagro Ricerca Srl Nuovi derivati di aniline sostituite ad attivita' erbicida
AU2002329667A1 (en) 2001-07-30 2003-02-17 Uta Griesenbach Specific inhibition of gene expression by small double stranded rnas
AR035087A1 (es) 2001-08-09 2004-04-14 Syngenta Participations Ag Piridil-alquinos y piridil-n-oxido-alquinos herbicidas activos, procedimiento para su preparacion, composicion herbicida y para inhibir el crecimiento de plantas, metodo para el control del crecimiento de plantas indeseables , y metodo para la inhibicion del crecimiento de plantas
UA104990C2 (ru) 2001-08-09 2014-04-10 Юніверсіті Оф Саскачеван Растение пшеницы с повышенной резистентностью к имидазолиноновому гербициду
US20040198758A1 (en) 2001-08-17 2004-10-07 Rapado Liliana Parra N-heterocyclyl substituted thienyloxy-pyrimidines used as herbicides
CA2453215A1 (en) 2001-08-28 2003-03-13 Syngenta Participations Ag Sulfonylamino derivatives useful as herbicides
WO2003020025A2 (en) 2001-08-31 2003-03-13 The Dow Chemical Company Nucleic acid compositions conferring insect control in plants
EP1423004A1 (en) 2001-09-06 2004-06-02 Syngenta Participations AG Herbicidal n-alkylsulfonamino derivatives
JP2005510464A (ja) 2001-09-07 2005-04-21 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト ４−アルキル−置換チエニルオキシピリジン類
CA2459359A1 (en) 2001-09-07 2003-03-20 Basf Aktiengesellschaft Pyrazolyl-substituted thienyloxypyridines
JP2003096059A (ja) 2001-09-21 2003-04-03 Otsuka Chem Co Ltd チアゾール化合物及び除草剤組成物
WO2003029243A2 (de) 2001-09-24 2003-04-10 Basf Aktiengesellschaft 2-aryloxy-6-pyrazolyl-pyridine
US7550578B2 (en) 2001-09-26 2009-06-23 Syngenta Participations Ag Rice promoters for regulation of plant expression
AU2002212806B2 (en) 2001-11-01 2006-06-08 Dongbu Farm Hannong Co., Ltd. Optically active herbicidal (R)-phenoxypropionic acid-N-methyl-N-2-fluorophenyl amides
DE10154075A1 (de) 2001-11-02 2003-05-15 Bayer Cropscience Ag Substituierte Pyrimidine
US20030150017A1 (en) 2001-11-07 2003-08-07 Mesa Jose Ramon Botella Method for facilitating pathogen resistance
WO2003077648A2 (en) 2001-11-08 2003-09-25 Paradigm Genetics, Inc. Methods for the identification of herbicides and the modulation of plant growth
US6766613B2 (en) 2001-11-16 2004-07-27 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for controlling pests
WO2003045878A2 (en) 2001-11-29 2003-06-05 Basf Aktiengesellschaft 2,w-diaminocarboxylic acid compounds
DE10256354A1 (de) 2001-12-06 2003-06-18 Syngenta Participations Ag Neue Herbizide
DE10256353A1 (de) 2001-12-06 2003-06-18 Syngenta Participations Ag Neue Herbizide
DE10256367A1 (de) 2001-12-06 2003-06-26 Syngenta Participations Ag Neue Herbizide
AR037754A1 (es) 2001-12-11 2004-12-01 Syngenta Participations Ag Herbicidas
DE10161765A1 (de) 2001-12-15 2003-07-03 Bayer Cropscience Gmbh Substituierte Phenylderivate
CA2470156A1 (en) 2001-12-19 2003-06-26 Basf Aktiengesellschaft .beta.-amino-.alpha.-cyanoacrylates and their use as herbicides
CN1606543A (zh) 2001-12-19 2005-04-13 巴斯福股份公司 α－氰基丙烯酸酯
ATE529512T1 (de) 2002-02-01 2011-11-15 Life Technologies Corp Doppelsträngige oligonukleotide
DE10204951A1 (de) 2002-02-06 2003-08-14 Basf Ag Phenylalaninderivate als Herbizide
US7576262B2 (en) 2002-03-14 2009-08-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization Modified gene-silencing RNA and uses thereof
AU2003218758A1 (en) 2002-03-14 2003-09-22 Syngenta Participations Ag Derivatives of 1-phenyl-3-phenylpyrazole as herbicides
US7319013B2 (en) 2002-03-20 2008-01-15 Basf Aktiengesellschaft Serine hydroxymethyltransferase as a target for herbicides
US7166771B2 (en) 2002-06-21 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs
CN102212537B (zh) 2002-03-29 2013-08-14 组合化学工业株式会社 编码乙酰乳酸合酶的基因
AR039208A1 (es) 2002-04-03 2005-02-09 Syngenta Participations Ag Compuestos de fenil- y piridilalquinos, composicion herbicida que los contiene, procedimiento de preparacion de aquellos y procedimiento para combatir el crecimiento de plantas indeseadas
KR20040102153A (ko) 2002-04-25 2004-12-03 바스프 악티엔게젤샤프트 제초제로서 사용되는 3-헤테로아릴 치환된 5-메틸옥시메틸이속사졸린
BR0309522A (pt) 2002-04-26 2005-02-09 Ishihara Sangyo Kaisha Compostos piridina ou sais destes e herbicidas contendo os mesmos
US6645914B1 (en) * 2002-05-01 2003-11-11 Ndsu-Research Foundation Surfactant-ammonium sulfate adjuvant composition for enhancing efficacy of herbicides
DE10219435A1 (de) 2002-05-02 2003-11-13 Bayer Cropscience Ag Substituierte Pyrazolo-pyrimidin-4-one
JP2004051628A (ja) 2002-05-28 2004-02-19 Ishihara Sangyo Kaisha Ltd ピリジン系化合物又はその塩、それらの製造方法及びそれらを含有する除草剤
AR040413A1 (es) 2002-05-31 2005-04-06 Syngenta Participations Ag Heterociclilalquinos activos como herbicidas
WO2003106636A2 (en) 2002-06-14 2003-12-24 Mirus Corporation Novel methods for the delivery of polynucleotides to cells
AR041181A1 (es) 2002-07-01 2005-05-04 Syngenta Participations Ag Tienilalquinos herbicidas y procedimiento de preparacion de tales compuestos
AR041182A1 (es) 2002-07-01 2005-05-04 Syngenta Participations Ag Derivados de fenoxipropenilfenilo y su uso como herbicidas
BR0312580A (pt) 2002-07-10 2006-10-10 Univ Kansas State composições e métodos para controlar nematódeos parasitas
CA2492711A1 (en) 2002-07-17 2004-01-22 Sepro Corporation Herbicide-resistant plants, and polynucleotides and methods for providing same
BR0312771A (pt) 2002-07-18 2005-05-03 Monsanto Technology Llc Métodos para usar polinucleotìdeos artificiais e composições destes para reduzir silenciamento de transgene
EP1526774B1 (en) 2002-07-24 2008-05-21 Basf Se Synergistically acting herbicidal mixtures
DE10234875A1 (de) 2002-07-25 2004-02-05 Bayer Cropscience Gmbh 4-Trifluormethylpyrazolyl substituierte Pyridine und Pyrimidine
DE10234876A1 (de) 2002-07-25 2004-02-05 Bayer Cropscience Gmbh 4-Trifluormethylpyrazolyl substituierte Pyridine und Pyrimidine
AU2003252259A1 (en) 2002-07-26 2004-02-16 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Novel haloalkylsulfonanilide derivatives, herbicides and usage thereof
US20040029275A1 (en) 2002-08-10 2004-02-12 David Brown Methods and compositions for reducing target gene expression using cocktails of siRNAs or constructs expressing siRNAs
FR2844415B1 (fr) 2002-09-05 2005-02-11 At & T Corp Systeme pare-feu pour interconnecter deux reseaux ip geres par deux entites administratives differentes
US20040053289A1 (en) 2002-09-09 2004-03-18 The Regents Of The University Of California Short interfering nucleic acid hybrids and methods thereof
JP2004107228A (ja) 2002-09-17 2004-04-08 Nippon Nohyaku Co Ltd 双環性ピリミジノン誘導体及びこれを有効成分とする除草剤
AR044743A1 (es) 2002-09-26 2005-10-05 Nihon Nohyaku Co Ltd Herbicida, metodo de emplearlo, derivados de tienopirimidina sustituida,compuestos intermediarios, y procedimientos que se utilizan para producirlos,
CA2502148A1 (en) 2002-10-16 2005-02-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for increasing the efficacy of biologically-active ingredients
WO2004035563A1 (en) 2002-10-17 2004-04-29 Syngenta Participations Ag 3-heterocyclylpyridine derivatives useful as herbicides
AU2003274025A1 (en) 2002-10-17 2004-05-04 Syngenta Participations Ag Pyridine derivatives useful as herbicides
AU2003301443A1 (en) 2002-10-18 2004-05-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Azolecarboxamide herbicides
JP4398866B2 (ja) 2002-10-18 2010-01-13 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア １−フェニルピロリジン−２−オン−３−カルボキサミド
DK2284266T3 (da) 2002-11-14 2014-01-13 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53
GB0228326D0 (en) 2002-12-04 2003-01-08 Syngenta Ltd Method of controlling unwanted vegitation
CN1745173B (zh) 2002-12-18 2012-11-28 阿则耐克斯公司 能赋予除草剂抗性的基因
US20040123347A1 (en) 2002-12-20 2004-06-24 Hinchey Brendan S. Water-deficit-inducible plant promoters
US20040133944A1 (en) 2003-01-08 2004-07-08 Delta And Pine Land Company Seed oil suppression to enhance yield of commercially important macromolecules
WO2004062351A2 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Gene encoding resistance to acetolactate synthase-inhibiting herbicides
CN1521165A (zh) 2003-01-30 2004-08-18 拜尔农作物科学股份公司 噻吩衍生物
DE10303883A1 (de) 2003-01-31 2004-08-12 Bayer Cropscience Ag Substituierte Pyrimidine
AU2004213818B2 (en) 2003-02-18 2008-06-05 Monsanto Technology Llc Glyphosate resistant class I 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS)
CN1526704A (zh) 2003-03-06 2004-09-08 拜尔农作物科学股份公司 取代的三唑甲酰胺化合物
WO2005003362A2 (en) 2003-03-10 2005-01-13 Athenix Corporation Methods to confer herbicide resistance
WO2004089061A2 (en) 2003-04-11 2004-10-21 Bio-Oz Biotechnologies Ltd. Liquid discharge apparatus particularly useful as a portable inoculation gun for anti-virus inoculation of plants
US7682829B2 (en) 2003-05-30 2010-03-23 Monsanto Technology Llc Methods for corn transformation
US7578598B2 (en) 2006-11-13 2009-08-25 Black & Decker Inc. Battery charging work light
CA2528012C (en) 2003-06-02 2015-11-24 University Of Massachusetts Methods and compositions for controlling efficacy of rna silencing
JP2005008583A (ja) 2003-06-20 2005-01-13 Nippon Soda Co Ltd グアニジン化合物、除草剤および植物成長調節剤
JP2005015390A (ja) 2003-06-26 2005-01-20 Bayer Cropscience Ag アゾリジン誘導体及び除草剤
US7525013B2 (en) 2003-06-30 2009-04-28 United Soybean Board Soybean selection system based on AEC-resistance
CN1208325C (zh) 2003-07-04 2005-06-29 中国科学院上海有机化学研究所 2－嘧啶氧基－n－脲基苯基苄胺类化合物、制备方法及其用途
WO2005007627A1 (ja) 2003-07-18 2005-01-27 Nihon Nohyaku Co., Ltd. フェニルピリジン誘導体、その中間体及びこれを有効成分とする除草剤
KR100568457B1 (ko) 2003-07-22 2006-04-07 학교법인 성균관대학 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 ｒｎａ전달 기법
US7371927B2 (en) 2003-07-28 2008-05-13 Arborgen, Llc Methods for modulating plant growth and biomass
JP2007502676A (ja) 2003-08-21 2007-02-15 アイシェム コーポレイション 血管プラーク検出および分析のための自動化方法およびシステム
US8090164B2 (en) 2003-08-25 2012-01-03 The University Of North Carolina At Chapel Hill Systems, methods, and computer program products for analysis of vessel attributes for diagnosis, disease staging, and surgical planning
WO2005040152A1 (en) 2003-10-20 2005-05-06 E.I. Dupont De Nemours And Company Heteroyclylphenyl-and heterocyclylpyridyl-substituted azolecarboxamides as herbicides
WO2005047233A1 (en) 2003-10-31 2005-05-26 Syngenta Participations Ag Novel herbicides
WO2005047281A1 (en) 2003-11-13 2005-05-26 Syngenta Participations Ag Novel herbicides
PL1687435T3 (pl) 2003-11-17 2012-02-29 Bayer Cropscience Nv Odporność na owady z użyciem hamowania ekspresji genów
CN1894202A (zh) 2003-12-19 2007-01-10 巴斯福股份公司 苯甲酰基取代的苯基丙氨酸酰胺
UA81567C2 (en) 2003-12-19 2008-01-10 Basf Ag Heteroaroyl-substituted phenylalanine amides
GT200500013A (es) 2004-01-23 2005-08-10 Amidas herbicidas
US7297541B2 (en) 2004-01-26 2007-11-20 Monsanto Technology Llc Genes encoding 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) enzymes for plant metabolic engineering
US7622301B2 (en) 2004-02-24 2009-11-24 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods using RNA interference for control of nematodes
JP4596795B2 (ja) 2004-02-27 2010-12-15 住友林業株式会社 ピペリトールもしくはその誘導体を有効成分とする植物抑制剤
DE102004011705A1 (de) 2004-03-10 2005-09-29 Bayer Cropscience Gmbh Substituierte 4-(4-Trifluormethylpyrazolyl)-Pyrimidine
BRPI0509244A (pt) 2004-03-27 2007-09-04 Bayer Cropscience Gmbh combinação herbicida
MXPA06011412A (es) 2004-03-30 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Metodos para controlar patogenos en plantas utilizando n-fosfonometilglicina.
WO2005095335A1 (ja) 2004-03-31 2005-10-13 Kureha Corporation イリド化合物、その製造方法、除草剤および医薬品中間体としての利用
JP2005314407A (ja) 2004-03-31 2005-11-10 Nippon Nohyaku Co Ltd 新規なハロアルキルスルホンアニリド誘導体、除草剤及びその使用方法並びにその中間体
CN102524294B (zh) 2004-04-09 2018-04-06 孟山都技术有限公司 用于在植物中控制昆虫侵袭的组合物和方法
EP2308977B2 (en) 2004-04-30 2017-04-26 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance gene
KR20070085113A (ko) 2004-05-11 2007-08-27 가부시키가이샤 알파젠 Rna간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 이용한유전자발현억제 방법
WO2006006569A1 (ja) 2004-07-12 2006-01-19 Nihon Nohyaku Co., Ltd. フェニルピリジン類又はその塩類、これらを有効成分とする除草剤及びその使用方法
EP2311953A1 (en) 2004-08-04 2011-04-20 Riken Bone/joint disease susceptibility gene and use thereof
WO2006023431A2 (en) 2004-08-19 2006-03-02 Monsanto Technology Llc Glyphosate salt herbicidal composition
US20060135758A1 (en) 2004-08-31 2006-06-22 Kunsheng Wu Soybean polymorphisms and methods of genotyping
WO2006026738A2 (en) 2004-08-31 2006-03-09 Qiagen North American Holdings, Inc. Methods and compositions for rna amplification and detection using an rna-dependent rna-polymerase
BRPI0514880A (pt) 2004-09-03 2008-06-24 Syngenta Ltd composto, processo para a preparação do mesmo, composição herbicida, e, método para controlar gramas e ervas daninhas em culturas de plantas úteis
JP2008513392A (ja) 2004-09-16 2008-05-01 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア ベンゾイル置換セリンアミド
MX2007001836A (es) 2004-09-16 2007-04-23 Basf Ag Serinamidas sustituidas por heteroaroilo.
US20060247197A1 (en) 2004-10-04 2006-11-02 Van De Craen Marc Method for down-regulating gene expression in fungi
ATE450517T1 (de) 2004-10-05 2009-12-15 Syngenta Ltd Isoxazolinderivate und ihre verwendung als herbizide
WO2006046148A2 (en) 2004-10-25 2006-05-04 Devgen Nv Rna constructs
DE102004054665A1 (de) 2004-11-12 2006-05-18 Bayer Cropscience Gmbh Substituierte bi- und tricyclische Pyrazol-Derivate Verfahren zur Herstellung und Verwendung als Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren
DE102004054666A1 (de) 2004-11-12 2006-05-18 Bayer Cropscience Gmbh Substituierte Pyrazol-3-carboxamide, Verfahren zur Herstellung und Verwendung als Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren
CA2527439C (en) 2004-11-19 2013-10-01 Dow Agrosciences Llc Methylidene mevalonates and their use as herbicides
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
US8314290B2 (en) 2004-12-21 2012-11-20 Monsanto Technology Llc Temporal regulation of gene expression by MicroRNAs
US8404927B2 (en) 2004-12-21 2013-03-26 Monsanto Technology Llc Double-stranded RNA stabilized in planta
EP1838144B1 (en) 2005-01-07 2016-08-31 Oregon State University Method to trigger rna interference
JP2006232824A (ja) 2005-01-27 2006-09-07 Sagami Chem Res Center イミダゾール誘導体、それらの製造方法及びそれらを有効成分として含有する除草剤
JP5268365B2 (ja) 2005-02-04 2013-08-21 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ 脈管幾何形状及び流れ特性を決定するシステム
FR2882062B1 (fr) 2005-02-14 2007-06-15 Commissariat Energie Atomique Vecteurs d'expression stable et de longue duree de sirna et leurs applications
US8088976B2 (en) 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
WO2006090792A1 (ja) 2005-02-24 2006-08-31 Nihon Nohyaku Co., Ltd. 新規なハロアルキルスルホンアニリド誘導体、除草剤及びその使用方法
JP2006282552A (ja) 2005-03-31 2006-10-19 Nippon Nohyaku Co Ltd フェニルへテロアリール類又はその塩類及びこれらを有効成分とする除草剤
DE102005014638A1 (de) 2005-03-31 2006-10-05 Bayer Cropscience Gmbh Substituierte Pyrazolyloxyphenylderivate als Herbizide
DE102005014906A1 (de) 2005-04-02 2006-10-05 Bayer Cropscience Gmbh Substituierte N-[Pyrimidin-2-yl-methyl]carboxamide und ihre Verwendung als Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren
US9085774B2 (en) 2005-04-19 2015-07-21 Basf Plant Science Gmbh Methods controlling gene expression
ES2372971T3 (es) 2005-05-09 2012-01-30 Kumiai Chemical Industry Co., Ltd. Procedimiento de transformación que usa un gen de una acetolactato-sintasa mutante.
GB0510151D0 (en) 2005-05-18 2005-06-22 Syngenta Ltd Novel herbicides
CA2609243A1 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Basf Aktiengesellschaft Heteroaroyl-substituted serine amides
EP1888509B1 (de) 2005-05-25 2013-05-15 Basf Se Benzoylsubstituierte serin-amide
JPWO2006132270A1 (ja) 2005-06-10 2009-01-08 国立大学法人京都大学 除草剤抵抗性遺伝子
US20070130653A1 (en) 2005-06-17 2007-06-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for gene silencing
RU2291613C1 (ru) 2005-06-29 2007-01-20 Алексей Борисович Сохликов Состав для борьбы с паразитическими клещами медоносных пчел
DE102005031412A1 (de) 2005-07-06 2007-01-11 Bayer Cropscience Gmbh 3-[1-Halo-1-aryl-methan-sulfonyl]-und 3-[1-Halo-1-heteroaryl-methan-sulfonyl]-isoxazolin-Derivate, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung als Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren
WO2007007316A1 (en) * 2005-07-07 2007-01-18 Cbd Technologies Ltd. Compositions and methods comprising stinging capsules/cells for delivering a biologically active agent into a plant cell
US7702116B2 (en) 2005-08-22 2010-04-20 Stone Christopher L Microphone bleed simulator
AP2008004392A0 (en) 2005-08-24 2008-04-30 E I Du Pomt De Nemours And Com Compositions providing tolerance to multiple herbicides and methods of use thereof
US7842856B2 (en) 2005-08-25 2010-11-30 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Herbicide resistance gene, compositions and methods
US7671254B2 (en) 2005-08-25 2010-03-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Herbicide resistance gene, compositions and methods
JPWO2007026834A1 (ja) 2005-09-01 2009-03-12 クミアイ化学工業株式会社 ピラゾール誘導体及び農園芸用除草剤
EP3508582B1 (en) 2005-09-16 2021-01-13 Monsanto Technology LLC Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof
PT2275562E (pt) 2005-09-16 2016-01-26 Devgen Nv Métodos com base em plantas transgénicas para infestações em plantas utilizando arn de interferência¿
EP2270182B1 (en) 2005-09-16 2016-02-10 deVGen N.V. DSRNA as insect control agent
WO2007038788A2 (en) 2005-09-29 2007-04-05 The Cleveland Clinic Foundation Small interfering rnas as non-specific drugs
EP3339441A1 (en) 2005-10-13 2018-06-27 Monsanto Technology LLC Methods for producing hybrid seed
WO2007050715A2 (en) 2005-10-26 2007-05-03 Integrated Plant Genetics, Inc. Compositions and methods for safe delivery of biologically-active plant transformation agents using non-fibrous silicon carbide powder
EP1948196B1 (de) 2005-11-03 2012-12-26 Zoser B. Salama Verwendung von tetraorganosilizium-verbindungen
JP2007161701A (ja) 2005-11-15 2007-06-28 Hokko Chem Ind Co Ltd アリールオキシ‐ｎ‐（オキシイミノアルキル）アルカン酸アミド誘導体および用途
AU2006315102A1 (en) 2005-11-21 2007-05-24 Johnson & Johnson Research Pty Limited Multitargeting interfering RNAs having two active strands and methods for their design and use
JP2007153847A (ja) 2005-12-08 2007-06-21 Hokko Chem Ind Co Ltd フェノキシアルカン酸アミド誘導体および除草剤
WO2007070389A2 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 Syngenta Participations Ag Control of parasitic weeds
GB0526044D0 (en) 2005-12-21 2006-02-01 Syngenta Ltd Novel herbicides
US9060516B2 (en) 2005-12-23 2015-06-23 Basf Se Method for controlling aquatic weeds
AR058408A1 (es) 2006-01-02 2008-01-30 Basf Ag Compuestos de piperazina con accion herbicida
JP5015174B2 (ja) 2006-01-05 2012-08-29 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 除草作用を有するピペラジン化合物
JP2007182404A (ja) 2006-01-10 2007-07-19 Hokko Chem Ind Co Ltd アリールオキシ−ｎ−（アルコキシアルキル）アルカン酸アミド誘導体および除草剤
US20090298787A1 (en) * 2006-01-12 2009-12-03 Devgen N.V. Dsrna as Insect Control Agent
EP2347759B1 (en) 2006-01-12 2017-10-18 deVGen N.V. Methods for controlling pests using RNAi
WO2008063203A2 (en) 2006-01-27 2008-05-29 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for efficient gene silencing in plants
US20080022423A1 (en) 2006-02-03 2008-01-24 Monsanto Technology Llc IN PLANTA RNAi CONTROL OF FUNGI
CA2637665A1 (en) 2006-02-10 2007-08-23 Monsanto Technology Llc Identification and use of target genes for control of the plant parasitic nematodes heterodera glycines
CN101384721A (zh) 2006-02-13 2009-03-11 孟山都技术有限公司 选择和稳定dsRNA构建体
BRPI0707909A2 (pt) 2006-02-16 2011-05-17 Basf Se composto, processo para a preparação de compostos, agente, processos para a preparação de agentes, e para o combate de vegetação indesejada, e, uso de compostos
JP2009526804A (ja) 2006-02-16 2009-07-23 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア ヘテロアロイル置換アラニン
GB0603891D0 (en) 2006-02-27 2006-04-05 Syngenta Ltd Novel herbicides
US20070214515A1 (en) 2006-03-09 2007-09-13 E.I.Du Pont De Nemours And Company Polynucleotide encoding a maize herbicide resistance gene and methods for use
US20100068172A1 (en) 2006-03-16 2010-03-18 Devgen N.V. Nematode Control
TWI375669B (en) 2006-03-17 2012-11-01 Sumitomo Chemical Co Pyridazinone compound and use thereof
US20070281900A1 (en) 2006-05-05 2007-12-06 Nastech Pharmaceutical Company Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR LIPID AND POLYPEPTIDE BASED siRNA INTRACELLULAR DELIVERY
WO2008015692A2 (en) 2006-05-09 2008-02-07 Reliance Life Sciences Pvt Ltd MOLECULAR CLONING AND SEQUENCING OF ACETYL CoA CARBOXYLASE (ACCase) GENE FROM JATROPHA CURCAS
US20090215628A1 (en) 2006-05-19 2009-08-27 Basf Se Benzoyl-Substituted Alanines
BRPI0710930A2 (pt) 2006-05-19 2012-02-14 Basf Se composto processo para preparar um composto, composição, processos para preparar composições e para combater vegetação indesejada, e, uso do composto
US7884262B2 (en) 2006-06-06 2011-02-08 Monsanto Technology Llc Modified DMO enzyme and methods of its use
EP2436769B1 (en) 2006-06-07 2015-04-01 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Plant expression constructs and methods of utilizing same
EP2024494B1 (en) 2006-06-08 2013-04-17 Athenix Corporation Bacterial glutamine synthetases and methods of use
GB0613901D0 (en) 2006-07-13 2006-08-23 Univ Lancaster Improvements in and relating to plant protection
GB0614471D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Syngenta Ltd Herbicidal Compounds
JP2008074841A (ja) 2006-08-23 2008-04-03 Nippon Nohyaku Co Ltd 新規なハロアルキルスルホンアニリド誘導体、除草剤及びその使用方法
JP2008074840A (ja) 2006-08-23 2008-04-03 Nippon Nohyaku Co Ltd 新規なハロアルキルスルホンアニリド誘導体、除草剤及びその使用方法
GB0617575D0 (en) 2006-09-06 2006-10-18 Syngenta Ltd Herbicidal compounds and compositions
US20090306181A1 (en) 2006-09-29 2009-12-10 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for evaluating and treating heart failure
ES2633352T3 (es) 2006-10-12 2017-09-20 Monsanto Technology Llc microARN de plantas y procedimientos de uso de los mismos
US7897846B2 (en) 2006-10-30 2011-03-01 Pioneer Hi-Bred Int'l, Inc. Maize event DP-098140-6 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
TW200829171A (en) 2006-11-17 2008-07-16 Nihon Nohyaku Co Ltd Haloalkyl sulfonanilide derivatives or salts thereof, herbicide using it as effective constituent and use-method thereof
JP2008133207A (ja) 2006-11-28 2008-06-12 Hokko Chem Ind Co Ltd オキサゾリノン誘導体、その製造方法および除草剤
JP2008133218A (ja) 2006-11-28 2008-06-12 Hokko Chem Ind Co Ltd フェノキシ酪酸アミド誘導体および除草剤
GB0624760D0 (en) 2006-12-12 2007-01-17 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
GB0625598D0 (en) 2006-12-21 2007-01-31 Syngenta Ltd Novel herbicides
JP2008169121A (ja) 2007-01-09 2008-07-24 Bayer Cropscience Ag ジャスモン酸誘導体及び除草剤並びに除草効力増強剤
EP2121583B1 (de) 2007-01-11 2010-09-22 Basf Se Heteroaroylsubstituierte serin-amide
CL2008000376A1 (es) 2007-02-09 2008-08-18 Du Pont Compuestos derivados de n-oxidos de piridina; composicion herbicida; y metodo para controlar el crecimiento de vegetacion indeseada.
JPWO2008102908A1 (ja) 2007-02-23 2010-05-27 日産化学工業株式会社 ハロアルキルスルホンアニリド誘導体
WO2010058398A2 (en) 2007-03-08 2010-05-27 Sync-Rx, Ltd. Image processing and tool actuation for medical procedures
DE102007012168A1 (de) 2007-03-12 2008-09-18 Bayer Cropscience Ag 2-[Heteroarylalkyl-sulfonyl]-thiazol-Derivate und 2-[Heteroarylalkyl-sulfinyl]-thiazol-Derivate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren
RU2337529C1 (ru) 2007-03-26 2008-11-10 Центр "Биоинженерия" Ран РЕКОМБИНАНТНАЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩАЯ УНИКАЛЬНЫЙ ТРАНСФОРМАЦИОННЫЙ АКТ МЕЖДУ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИЕЙ, ВКЛЮЧАЮЩЕЙ ГЕН cryIIIA, И ГЕНОМНОЙ ДНК КАРТОФЕЛЯ СОРТА ЛУГОВСКОЙ, ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ И СОДЕРЖАЩИЕ ЭТУ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТКА, ТРАНСГЕННОЕ РАСТЕНИЕ И ЕГО ПОТОМСТВО
CN101279950B (zh) 2007-04-06 2010-08-11 中国中化股份有限公司 2-嘧啶氧(硫)基苯甲酸基乙酰胺类化合物及其应用
CN101279951B (zh) 2007-04-06 2010-09-01 中国中化股份有限公司 2-嘧啶氧(硫)基苯甲酸基烯酸酯类化合物及其应用
GB0709710D0 (en) 2007-05-21 2007-06-27 Syngenta Ltd Herbicidal compositions
EP1997381A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 Commissariat à l'Energie Atomique Use of a compound having a monogalactosyldiacylglycerol synthase inhibitory activity as herbicide or algaecide, herbicide and algaecide compositions
BRPI0814244B1 (pt) 2007-06-07 2018-10-09 Agriculture And Agri Food Canada método para obtenção de uma planta geneticamente engenheirada
AR068074A1 (es) 2007-06-12 2009-11-04 Basf Se Compuestos de piperazina con accion herbicida. proceso de preparacion
KR20100018065A (ko) 2007-06-12 2010-02-16 바스프 에스이 제초 작용을 가지는 피페라진 화합물
BRPI0812084A2 (pt) 2007-06-22 2014-11-25 Basf Se Composto de piperazina, composição, e, processo para combater vegetação indesejada
NL2000719C2 (nl) 2007-06-22 2008-12-23 Synthesis B V Werkwijze en inrichting voor het behandelen van plantaardige zaden.
KR100884933B1 (ko) 2007-07-03 2009-02-23 주식회사경농 광활성 (ｒ)-알릴옥시프로피온산 아마이드 화합물 및 이를포함하는 제초제 조성물
US20130084243A1 (en) 2010-01-27 2013-04-04 Liliane Goetsch Igf-1r specific antibodies useful in the detection and diagnosis of cellular proliferative disorders
US8188155B2 (en) 2007-08-14 2012-05-29 Rubber-Regen Llp Rubber de-vulcanisation
EA019834B1 (ru) 2007-08-16 2014-06-30 Басф Се Применение композиции, композиция для обработки семян, способ обработки семян и семена, обработанные композицией
JP2010537640A (ja) 2007-08-27 2010-12-09 ボストン バイオメディカル， インコーポレイテッド マイクロｒｎａ模倣剤または阻害剤としての非対称性ｒｎａ二重鎖の組成物
JP2009067739A (ja) 2007-09-14 2009-04-02 Sumitomo Chemical Co Ltd 除草用組成物
CL2008002703A1 (es) 2007-09-14 2009-11-20 Sumitomo Chemical Co Compuestos derivados de 1,4-dihidro-2h-piridazin-3-ona; composicion herbicida que comprende a dichos compuestos; metodo de control de malezas; uso de dichos compuestos para el control de malezas; y compuestos intermediarios.
EP2594647A3 (en) 2007-09-21 2013-07-24 BASF Plant Science GmbH Plants with increased yield
US8362325B2 (en) 2007-10-03 2013-01-29 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant characteristics
US8722410B2 (en) * 2007-10-05 2014-05-13 Dow Agrosciences, Llc. Methods for transferring molecular substances into plant cells
US20110015084A1 (en) 2007-10-25 2011-01-20 Monsanto Technology Llc Methods for Identifying Genetic Linkage
US20110152346A1 (en) 2007-11-05 2011-06-23 Baltic Technology Development Ltd. Use of Oligonucleotides with Modified Bases in Hybridization of Nucleic Acids
AU2008324066A1 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Baltic Technology Development, Ltd. Use of oligonucleotides with modified bases as antiviral agents
JP2009114128A (ja) 2007-11-07 2009-05-28 Hokko Chem Ind Co Ltd アミノ酸アミド誘導体および除草剤
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
GB0722472D0 (en) 2007-11-15 2007-12-27 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
JP2009126792A (ja) 2007-11-20 2009-06-11 Sagami Chem Res Center ５−置換フェニル−２−トリフルオロメチルピリミジン−６（１ｈ）−オン誘導体及びその製造方法並びに該誘導体を有効成分として含有する除草剤
EP2065374A1 (de) 2007-11-30 2009-06-03 Bayer CropScience AG 2-(Benzyl- und 1H-pyrazol-4-ylmethyl)sulfinyl-Thiazol-Derivate als Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren
EP2065373A1 (de) 2007-11-30 2009-06-03 Bayer CropScience AG Chirale 3-(Benzylsulfinyl)-5,5-dimethyl-4,5-dihydroisoxazol-Derivate und 5,5-Dimethyl-3-[(1H-pyrazol-4-ylmethyl) sulfinyl]-4,5-dihydroisoxazol-Derivate, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren
JP2009137851A (ja) 2007-12-04 2009-06-25 Sagami Chem Res Center ２−トリフルオロメチルピリミジン−６（１ｈ）−オン誘導体及びその製造方法並びに該誘導体を有効成分として含有する除草剤
WO2009085982A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Monsanto Technology Llc Method to enhance yield and purity of hybrid crops
CL2008003785A1 (es) 2007-12-21 2009-10-09 Du Pont Compuestos derivados de piridazina; composiciones herbicidas que comprenden a dichos compuestos; y método para controlar el crecimiento de la vegetación indeseada.
GB0800856D0 (en) 2008-01-17 2008-02-27 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
GB0800855D0 (en) 2008-01-17 2008-02-27 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
UA102840C2 (ru) 2008-02-20 2013-08-27 Сингента Партисипейшнс Аг Гербицидный состав, способ его получения и способ борьбы с нежелательной растительностью
WO2009110924A1 (en) 2008-03-03 2009-09-11 Ms Technologies Llc Antibodies immunoreactive with mutant 5-enolpyruvlshikimate-3-phosphate synthase
WO2009116151A1 (ja) 2008-03-19 2009-09-24 アグロカネショウ株式会社 １-フェニル-５-ジフルオロメチルピラゾール-４-カルボキサミド誘導体及びこれを有効成分とする除草剤
GB0805318D0 (en) 2008-03-20 2008-04-30 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
US8802923B2 (en) 2008-04-10 2014-08-12 A.B. Seeds Ltd. Compositions and methods for enhancing oil content in plants
CA2724670C (en) 2008-04-14 2017-01-31 Bayer Bioscience N.V. New mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, dna sequence and isolation of plants which are tolerant to hppd inhibitor herbicides
US8271857B2 (en) 2008-05-13 2012-09-18 International Business Machines Corporation Correcting errors in longitudinal position (LPOS) words
EP2235177B1 (en) 2008-06-13 2012-07-18 RiboxX GmbH Method for enzymatic synthesis of chemically modified rna
EP2135865A1 (de) 2008-06-17 2009-12-23 Bayer CropScience AG Substituierte 1-(Diazinyl) pyrazol-4-yl-essigsäuren, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung als Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren
GR1006569B (el) 2008-06-20 2009-10-13 ΚΑΤΕΡΙΝΟΠΟΥΛΟΣ (κατά ποσοστό 25%) ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ Χρηση του κοστικου οξεος (costic acid) και αλλων συστατικων του φυτου dittrichia viscosa (κοινως ακονιζα) και των συγγενων υποειδων του στην καταπολεμηση της δρασης του ακαρεως varroa destructor ως παρασιτου των μελισσων
WO2009158258A1 (en) 2008-06-25 2009-12-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Herbicidal dihydro oxo six-membered azinyl isoxazolines
TWI455944B (zh) 2008-07-01 2014-10-11 Daiichi Sankyo Co Ltd 雙股多核苷酸
BRPI0913657A2 (pt) 2008-07-01 2020-08-04 Monsanto Technology Llc constructos de dna recombinante e métodos para a modulação da expressão de um gene-alvo
CA2730203C (en) 2008-07-10 2016-12-13 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Complement antagonists and uses thereof
EP2147919A1 (de) 2008-07-24 2010-01-27 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Heterocyclisch substituierte Amide, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung als Herbizide
JP2011529464A (ja) 2008-07-29 2011-12-08 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 除草活性を有するピペラジン化合物
CA2734225A1 (en) 2008-08-15 2010-02-18 Georgetown University Fluorescent regulators of rassf1a expression and human cancer cell proliferation
AU2009281311A1 (en) 2008-08-15 2010-02-18 Zoser B. Salama Carrier system for biological agents containing organosilicon compounds and uses thereof
WO2010026989A1 (ja) 2008-09-02 2010-03-11 日産化学工業株式会社 オルト置換ハロアルキルスルホンアニリド誘導体及び除草剤
CN104224703A (zh) 2008-09-25 2014-12-24 赛福伦公司 苯达莫司汀的液体配制品
WO2010034153A1 (zh) 2008-09-25 2010-04-01 沈阳化工研究院 2-嘧啶氧（硫）基苯甲酸基烯酸酯类化合物及其应用
PL2346321T5 (pl) 2008-09-30 2022-10-17 Basf Se Kompozycja polepszająca skuteczność herbicydów
US20100099561A1 (en) 2008-10-15 2010-04-22 E.I. Du Pont De Nemours And Company Heterobicyclic alkylthio-bridged isoxazolines
JP2012506885A (ja) 2008-10-29 2012-03-22 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 除草作用を有する置換ピリジン
MX2011003616A (es) 2008-10-30 2011-08-15 Pioneer Hi Bred Int Manipulacion de glutamina sintetasas (gs) para mejorar la eficiencia de uso de nitrogeno y rendimiento de grano en plantas superiores.
US20110209253A1 (en) 2008-10-31 2011-08-25 Basf Se Method for Improving Plant Health
CN102203114A (zh) 2008-10-31 2011-09-28 巴斯夫欧洲公司 具有除草作用的哌嗪化合物
WO2010049414A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Basf Se Method for improving plant health
EP2194052A1 (de) 2008-12-06 2010-06-09 Bayer CropScience AG Substituierte 1-(Thiazolyl)- und 1-(Isothiazolyl)pyrazol-4-yl-essigsäuren, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung als Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren
US20110251063A1 (en) 2008-12-18 2011-10-13 Dschun Song Heterocyclic diketone derivatives with herbicidal action
DE102008063561A1 (de) 2008-12-18 2010-08-19 Bayer Cropscience Ag Hydrazide, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung als Herbizide und Insektizide
EP2204366A1 (de) 2008-12-19 2010-07-07 Bayer CropScience AG Herbizid und insektizid wirksame phenylsubstituierte Pyridazinone
WO2010093788A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
WO2010099016A1 (en) 2009-02-25 2010-09-02 Worcester Polytechnic Institute Automatic vascular model generation based on fluid-structure interactions (fsi)
CA2792354A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Bio-Tree Systems, Inc. Vascular analysis methods and apparatus
JP2010235603A (ja) 2009-03-13 2010-10-21 Sumitomo Chemical Co Ltd ピリダジノン化合物及びその用途
EP2229813A1 (de) 2009-03-21 2010-09-22 Bayer CropScience AG Pyrimidin-4-ylpropandinitril-derivate, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Herbizide und Pflanzenwachstumsregulatoren
GB0905441D0 (en) 2009-03-30 2009-05-13 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
EP2756845B1 (en) 2009-04-03 2017-03-15 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of KRAS by asymmetric double-stranded RNA
EP2417132B1 (en) 2009-04-06 2013-04-17 Syngenta Limited Herbicidal quinoline and 1,8-naphthyridine compounds
CA2757729A1 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Masanori Kai Haloalkylsulfonanilide derivative
EP2421978A1 (en) 2009-04-21 2012-02-29 BASF Plant Science Company GmbH Rna-mediated induction of gene expression in plants
GB0908293D0 (en) 2009-05-14 2009-06-24 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
CA2766918A1 (en) 2009-06-30 2011-01-06 Ilan Sela Introducing dna into plant cells
WO2011003776A2 (de) 2009-07-09 2011-01-13 Basf Se Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung
US20110028412A1 (en) 2009-08-03 2011-02-03 Cappellos, Inc. Herbal enhanced analgesic formulations
US20120157512A1 (en) 2009-08-21 2012-06-21 Monsanto Technology Llc Preventing and Curing Beneficial Insect Diseases Via Plant Transcribed Molecules
TW201113376A (en) 2009-09-01 2011-04-16 Basf Agrochemical Products Bv Herbicide-tolerant plants
ES2428104T3 (es) 2009-09-25 2013-11-05 Bayer Cropscience Ag N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas y su uso como herbicidas
CA2777448C (en) 2009-10-14 2023-02-28 Ilan Sela Compositions for controlling varroa mites in bees
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
DE102010042864A1 (de) 2009-10-30 2011-06-01 Basf Se Substituierte Thioamide mit herbizider Wirkung
US8329619B2 (en) 2009-11-03 2012-12-11 Basf Se Substituted quinolinones having herbicidal action
WO2011059934A2 (en) 2009-11-10 2011-05-19 Wake Forest University Health Sciences Tissue tensioning devices and related methods
US9145562B2 (en) 2009-11-20 2015-09-29 Alberta Innovates—Technology Futures Variegation in plants
EP2503872B1 (en) 2009-11-23 2018-05-09 Monsanto Technology LLC Transgenic maize event mon 87427 and the relative development scale
JP2011195561A (ja) 2009-11-24 2011-10-06 Sumitomo Chemical Co Ltd ケトン化合物及びそれを含有する除草剤
WO2011067745A2 (en) 2009-12-06 2011-06-09 Rosetta Green Ltd. Compositions and methods for enhancing plants resistance to abiotic stress
AU2010334808B2 (en) 2009-12-23 2015-07-09 Bayer Intellectual Property Gmbh Plants tolerant to HPPD inhibitor herbicides
EP2519097B1 (en) 2009-12-28 2016-03-02 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
WO2011094199A1 (en) 2010-01-26 2011-08-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Polynucleotide and polypeptide sequences associated with herbicide tolerance
WO2011112570A1 (en) * 2010-03-08 2011-09-15 Monsanto Technology Llc Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
EP2385129A1 (en) 2010-05-03 2011-11-09 BASF Plant Science Company GmbH Enhanced methods for gene regulation in plants
BR112012033544A2 (pt) 2010-06-30 2015-09-08 Basf Plant Science Co Gmbh molécula de ácido nucleíco isolada, constructo, vetor, planta, célula vegetal ou semente de planta, métodos, uso e processo
CN101892247B (zh) 2010-07-21 2012-12-12 河北大学 一种除草剂抗性基因及其应用
EP2418283A1 (en) * 2010-08-07 2012-02-15 Nomad Bioscience GmbH Process of transfecting plants
CN101914540A (zh) 2010-08-09 2010-12-15 大连大学 一种将rna干扰引入植物的方法
EP2633056A1 (en) 2010-10-25 2013-09-04 A.B. Seeds Ltd. ISOLATED POLYNUCLEOTIDES EXPRESSING OR MODULATING MICRORNAs OR TARGETS OF SAME, TRANSGENIC PLANTS COMPRISING SAME AND USES THEREOF IN IMPROVING NITROGEN USE EFFICIENCY, ABIOTIC STRESS TOLERANCE, BIOMASS, VIGOR OR YIELD OF A PLANT
US8828961B2 (en) 2010-10-27 2014-09-09 Harrisvaccines Methods and compositions to protect aquatic invertebrates from disease
BR122021012776B1 (pt) 2010-12-17 2022-08-16 Monsanto Technology Llc Método para melhorar a competência de uma célula de planta para transformação mediada por bactérias
US8987552B2 (en) 2010-12-30 2015-03-24 Dow Agrosciences, Llc. Nucleic acid molecules that target the vacuolar ATPase H subunit and confer resistance to coleopteran pests
CN102154364A (zh) 2010-12-31 2011-08-17 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室 一种根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化方法
WO2012156342A1 (en) 2011-05-18 2012-11-22 Syngenta Participations Ag Methods for controlling varroa mites
EP2530159A1 (en) 2011-06-03 2012-12-05 Sandoz Ag Transcription terminator sequences
RU2691697C2 (ru) 2011-07-18 2019-06-17 Девген Нв Растения, устойчивые к насекомым-вредителям
CA2842709A1 (en) 2011-08-16 2013-02-21 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for introduction of exogenous dsrna into plant cells
US9974508B2 (en) 2011-09-01 2018-05-22 Ghassan S. Kassab Non-invasive systems and methods for determining fractional flow reserve
CN104160028A (zh) 2011-09-13 2014-11-19 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
EP3434780A1 (en) 2011-09-13 2019-01-30 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
WO2013040005A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
BR112014005795A2 (pt) * 2011-09-13 2020-12-08 Monsanto Technology Llc métodos de controle de plantas, de redução da expressão de um gene de hppd de uma planta, de preparação de um nucleotídeo, e de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação da expressão do gene de hppd no tratamento externo de uma planta, composições e cassete de expressão microbiana
BR112014005951A2 (pt) * 2011-09-13 2017-04-04 Monsanto Technology Llc métodos e composições para controle de erva daninha
UA116089C2 (uk) 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
BR112014005954A2 (pt) * 2011-09-13 2020-12-01 Monsanto Technology Llc métodos e composições químicas agrícolas para controle de planta, método de redução de expressão de um gene dhps em uma planta, cassete de expressão microbiana, método para fazer um polinucleotídeo, método de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação de expressão do gene dhps
EP2755467B1 (en) * 2011-09-13 2017-07-19 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
US10034614B2 (en) 2012-02-29 2018-07-31 General Electric Company Fractional flow reserve estimation
US8548778B1 (en) 2012-05-14 2013-10-01 Heartflow, Inc. Method and system for providing information from a patient-specific model of blood flow
MX360866B (es) 2012-05-24 2018-11-09 A B Seeds Ltd Composiciones y métodos para silenciar la expresión genética.
US20130324842A1 (en) 2012-05-29 2013-12-05 The Johns Hopkins University Method for Estimating Pressure Gradients and Fractional Flow Reserve from Computed Tomography Angiography: Transluminal Attenuation Flow Encoding
AU2013296321B2 (en) 2012-08-03 2019-05-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified RNAi agents
UY35251A (es) 2013-01-01 2014-07-31 Seeds Ltd Ab MOLÉCULAS DE dsRNA AISLADAS Y MÉTODOS PARA USARLAS PARA SILENCIAR MOLÉCULAS DIANA DE INTERÉS
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
WO2014164797A2 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
UY35379A (es) 2013-03-13 2014-09-30 Monsanto Technology Llc ?métodos y composiciones para el control de malezas?.
US9920316B2 (en) 2013-03-14 2018-03-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
US10568328B2 (en) * 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
BR112015023424A2 (pt) 2013-03-15 2017-11-28 Monsanto Technology Llc construto de expressão engenheirado, método para aprimoramento de produção de rna ou proteína, vetor, célula, hospedeira bacteriana, sistema de cultura de célula para síntese in vivo de dsrna, composição e método para controlar uma infestação de pragas de invertebrados ou para inibir a propagação de uma doença viral em uma população de plantas, e terminador transcricional
MX359191B (es) 2013-07-19 2018-09-18 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa.
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
UA120426C2 (uk) 2013-11-04 2019-12-10 Монсанто Текнолоджі Елелсі Композиція та спосіб для боротьби з членистоногими паразитами та зараженням шкідниками
WO2015134528A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 Donald Danforth Plant Science Center New generation of artificial micrornas
WO2015151255A1 (ja) 2014-04-03 2015-10-08 日立マクセル株式会社 導光板及び導光板を用いた装置
EP3161138A4 (en) 2014-06-25 2017-12-06 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
US20170211085A1 (en) 2016-01-27 2017-07-27 Rutgers, The State University Of New Jersey Gigantus1 (gts1) gene and methods of use thereof for improving biomass accumulation and higher yield in plants

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1416049A1 (en) * 2001-07-06 2004-05-06 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Method of interfering with a virus infection in plants
WO2007039454A1 (en) * 2005-09-20 2007-04-12 Basf Plant Science Gmbh Methods for controlling gene expression using ta-siran

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARTMYMOVICH. Using RNA interference to increase crop yield and decrease pest damage. MMG445. Basic Biotech. 10 December 2009. Vol 5. No 1. Pages 7-12. Entire review *
LI et al. The FAST technique: a simplified Agrobacterium-based transformation method for transient gene expression analysis in seedlings of Arabidopsis and other plant species. Plant Methods. 20 May 2009. Vol 5. No 6. Pages 1-15. Especially abstract *
ZHANG et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc ePub. 29 June 2006. Vol 1. No 2. Pages 641-646. Especially abstract, pg 1, right col para 1. *

Also Published As

Publication number Publication date
PL2545182T3 (pl) 2017-10-31
EA201201264A1 (ru) 2013-03-29
CO6592096A2 (es) 2013-01-02
US20110296556A1 (en) 2011-12-01
WO2011112570A1 (en) 2011-09-15
EP3231872A1 (en) 2017-10-18
CA2790211C (en) 2020-06-09
MX2012010479A (es) 2012-10-09
ES2809679T3 (es) 2021-03-05
AU2014262189A1 (en) 2014-12-11
UA115023C2 (uk) 2017-09-11
UY33267A (es) 2011-10-31
AR080389A1 (es) 2012-04-04
JP6321071B2 (ja) 2018-05-09
EA201792402A3 (ru) 2018-09-28
EP2545182B1 (en) 2017-05-03
JP6581238B2 (ja) 2019-09-25
AU2017203572B2 (en) 2019-08-22
US9988634B2 (en) 2018-06-05
JP5925701B2 (ja) 2016-05-25
AU2017203572A1 (en) 2017-06-22
EP3231872B1 (en) 2020-05-06
EA201792402A2 (ru) 2018-03-30
AU2014262189B2 (en) 2017-03-02
SG183407A1 (en) 2012-09-27
CN102822350A (zh) 2012-12-12
PL2545182T4 (pl) 2017-11-30
ES2641642T3 (es) 2017-11-10
US20140018241A1 (en) 2014-01-16
NZ627060A (en) 2016-01-29
US20140057789A1 (en) 2014-02-27
CA2790211A1 (en) 2011-09-15
BR112012022570A2 (pt) 2015-10-06
EP2545182A4 (en) 2013-11-06
MY163887A (en) 2017-11-15
JP2013521777A (ja) 2013-06-13
PE20171378A1 (es) 2017-09-15
HUE033056T2 (hu) 2017-11-28
US11812738B2 (en) 2023-11-14
DK3231872T3 (da) 2020-07-20
HK1177230A1 (en) 2013-08-16
US9121022B2 (en) 2015-09-01
JP2016182120A (ja) 2016-10-20
NZ601784A (en) 2014-08-29
CN102822350B (zh) 2015-05-06
IL221709B (en) 2019-08-29
KR20130010886A (ko) 2013-01-29
EP2545182A1 (en) 2013-01-16
ZA201206683B (en) 2013-05-29
AU2011224570A1 (en) 2012-09-06
US20130047297A1 (en) 2013-02-21
CL2012002474A1 (es) 2013-01-11
PE20130649A1 (es) 2013-07-13
AU2011224570B2 (en) 2014-08-14
JP2018134087A (ja) 2018-08-30
KR101982126B1 (ko) 2019-05-27
AU2014262189C1 (en) 2018-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA029482B1 (ru) Молекулы полинуклеотидов для регуляции генов у растений
US10435701B2 (en) Methods and compositions for plant pest control
US10844398B2 (en) Methods and compositions for plant pest control
US20180346923A1 (en) Methods and Compositions for Plant Pest Control
US20150247153A1 (en) Method for Improving Shelf Life by Regulating Expression of Polyphenol Oxidase
US20190008156A1 (en) Methods and Compositions for Plant Pest Control
US10428338B2 (en) Methods and compositions for increasing invertase activity in plants