JP6321071B2 - 植物における遺伝子調節のためのポリヌクレオチド分子 - Google Patents

植物における遺伝子調節のためのポリヌクレオチド分子 Download PDF

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Description

「関連出願の相互参照および配列表の組み込み」
本出願は、本明細書においてそれらの全体が参照によって組み込まれる２０１０年３月８日に提出された米国仮特許出願第６１／３１１，７６２号、２０１０年５月２８日に提出された第６１／３４９，８０７号、および２０１０年９月１０日に提出された第６１／３８１，５５６号の優先権の利益を主張する。「３８−２１＿５６８５５＿Ｄ．ｔｘｔ」と題するファイル中に含まれる配列表は、サイズが１３３キロバイトで（オペレーティングシステムＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓにおいて測定）、２０１１年３月７日に作成されたものであるが、本明細書とともに提出され、参照によって本明細書において組み込まれる。
植物において遺伝子を調節するためのポリヌクレオチド分子およびそのような分子を作製し、かつ使用するための方法が本明細書において開示される。
除草剤が、抵抗性の雑草を制御しないのは、とりわけ、雑草よりも低い除草剤抵抗性を有し得る除草剤抵抗性作物の畑においてそのような雑草が成長している場合、問題となる。除草剤抵抗性の雑草は、様々な作用様式により同定される。アカザにおいて除草剤標的タンパク質を産生する遺伝子の複数のコピーの選択に起因する抵抗性は、Ｇａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １０７（３）：１０２９−１０３４によって報告されている。ヤエムグラ、プリックリーレタス（ｐｒｉｃｋｌｙ ｌｅｔｔｕｃｅ）、およびドクムギにおいて除草剤標的タンパク質を産生する遺伝子における突然変異に起因する抵抗性は、Ｂａｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １２９（３）：１２６５−１２７５； Ｐｒｅｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ８４（３）：２２７−２３５；およびＷａｋｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｗｅｅｄ Ｒｅｓ． （Ｏｘｆｏｒｄ）， ４６（５）：４３２−４４０によって報告されている。グリホサートの液胞隔離は、グリホサート抵抗性のヒメムカシヨモギにおいて観察されたメカニズムである；Ｇｅ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｃｉ．， ６６：５７６−５７６を参照されたい。ヘアリーメヒシバ（ｈａｉｒｙ ｃｒａｂｇｒａｓｓ）において除草剤を不活性な化学形に代謝する酵素の発現に起因する抵抗性は、Ｈｉｄａｙａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ５７（２）：１３７−１４６によって報告されている。Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， ５６（６）：２１２５−２１３０は、グリホサートにより処理された植物種におけるアミノメチルホスホン酸の蓄積を報告した。
本発明は、たとえば、遺伝子の浸透移行性の調節のためにＲＮＡを提供することによって、植物における遺伝子を調節するためのポリヌクレオチド分子および方法を提供する。本発明の様々な態様は、植物細胞における内因性遺伝子および導入遺伝子ならびにポリヌクレオチド分子を調節するためのポリヌクレオチド分子および方法を提供する。本明細書において開示されるポリヌクレオチド、組成物、および方法は、植物有害生物または病原体の内因性遺伝子を調節するのに有用である。本発明の態様では、ポリヌクレオチド分子は、内因性遺伝子もしくは導入遺伝子またはそれらの転写ＲＮＡの浸透移行性の遺伝子サイレンシングを開始するために、生きている植物組織の中に浸透することができるまたは吸収され得る組成物中に提供される。本発明のいくつかの態様では、ポリヌクレオチド分子は、最終的に、植物細胞における標的内因性遺伝子または標的導入遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができるＲＮＡを植物に提供しまたは植物中の細胞においてそのＲＮＡの生産を可能にし、それによって、標的遺伝子の調節、たとえば、標的遺伝子のサイレンシングまたは抑制を達成する。本発明の他の態様では、本明細書において開示されるポリヌクレオチド分子は、最終的に、植物の無脊椎有害生物またはウイルス病原体の細胞における標的遺伝子から転写されるＲＮＡに、生理学的条件下でハイブリダイズすることができるＲＮＡを植物に提供しまたは植物の細胞においてそのＲＮＡの生産を可能にし、それによって、標的遺伝子の調節、たとえば、標的遺伝子のサイレンシングまたは抑制を達成するのにも有用である。いくつかの態様では、標的遺伝子のサイレンシングまたは抑制は、標的遺伝子の発現によってそれ自体影響を与えられるまたは調節される他の遺伝子のアップレギュレーションを導く。
本発明の組成物および方法は、Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｖｏｉｎｎｅｔ （２００６）， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２２：２６８−２８０；Ｔｏｍａｒｉ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ （２００５） Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．， １９：５１７−５２９；Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ （２００６） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ２０：７５９−７７１；Ｍｅｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， ２１：２９７−３１８；およびＪｏｎｅｓ−Ｒｈｏａｄｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．， ５７：１９−５３による概説において全般的に記載されるように、ＲＮＡ媒介性の遺伝子抑制に関与する、いくつかの天然細胞経路のうち１つまたは複数を通じて作用すると考えられる。ＲＮＡ媒介性の遺伝子抑制は、一般に、単一のＲＮＡ分子内における分子内形成または２つのＲＮＡ分子の間における分子間形成による二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）中間体を含む。この長いｄｓＲＮＡの中間体は、ＲＮアーゼＩＩＩファミリーのリボヌクレアーゼ（ダイサーまたはダイサー様リボヌクレアーゼ）により処理されて１つまたは複数の短い二本鎖ＲＮＡとなり、これらのうちの一方の鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（「ＲＩＳＣ」）の中に組み込まれる。たとえば、ｓｉＲＮＡ経路には、長い二本鎖ＲＮＡの中間体を切断して、低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）としたものが含まれる。ｓｉＲＮＡのサイズは、約１９〜約２５塩基対の範囲にあると考えられるが、植物における最も一般的なクラスのｓｉＲＮＡには、２１塩基対または２４塩基対を有するものが含まれる。Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００２） ＥＭＢＯ Ｊ．， ２１：４６７１−４６７９を参照されたい。本明細書において使用されるように、「オリゴヌクレオチド」は、遺伝子サイレンシングメカニズムにおいて処理された低分子ＲＮＡ分子のサイズに類似する、１８〜２５ヌクレオチド長のポリヌクレオチド分子を意味する。本発明の様々な実施形態には、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドまたは両方の混合物を含む組成物が含まれる。
本発明の態様は、遺伝子の浸透移行性の調節のために植物細胞中に一本鎖ＲＮＡ分子；界面活性剤および植物細胞における内因性遺伝子の抑制のために一本鎖ＲＮＡを提供する植物致死剤を含む組成物を用いる除草剤処理；界面活性剤（たとえば有機シリコーン界面活性剤）および植物細胞における内因性遺伝子の抑制のためのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子を含む、植物表面上への局所的コーティング；（ａ）ポリヌクレオチドによる浸透に対する植物のコンディショニング剤および（ｂ）ポリヌクレオチド分子を含む、植物における標的遺伝子の浸透移行性サイレンシングを誘発するために局所的に適用される組成物；ならびに（ａ）ポリヌクレオチド分子による浸透に対する植物のコンディショニング剤、（ｂ）ポリヌクレオチド分子を含む組成物を用いる除草剤処理を提供するための組成物および方法を含む。任意選択で、これらの組成物は、非ヌクレオチド除草剤を含むことができる。
他の態様では、本発明は、除草剤抵抗性自生植物を制御する；遺伝子の浸透移行性の調節のために植物細胞中に一本鎖ＲＮＡ分子を提供するための組成物を成長中の植物の組織に適用することによって植物の内因性遺伝子を調整することにより、逆遺伝学を調査する；植物へのポリヌクレオチドの局所的な適用を含む、標的遺伝子の浸透移行性のサイレンシングを誘発する；（ａ）ポリヌクレオチドによる浸透に対する植物のコンディショニングおよび（ｂ）ポリヌクレオチドを植物に局所的に適用することによって、植物における標的遺伝子の浸透移行性のサイレンシングを誘発する；ポリヌクレオチド分子および該ポリヌクレオチド分子による浸透に対する植物のコンディショニング剤を含む、局所的に適用される組成物を生きている植物に局所的に適用することによって植物の内因性遺伝子を調整することにより、逆遺伝学を調査するための方法を提供する。
他の態様では、本発明は、内因性遺伝子を抑制するために植物に外因性ＤＮＡまたはＲＮＡを提供し、外因性ＤＮＡは、植物の染色体の中に統合されず、外因性ＲＮＡは、植物の染色体の中に統合されるＤＮＡから転写されず、内因性遺伝子は、植物へのポリヌクレオチドの局所的な適用によって抑制される。これらおよび本発明の他の態様は、以下の部においてより詳細に記載される。
配列番号１、パルマーアマランス（Ｐａｌｍｅｒ ａｍａｒａｎｔｈ）ＥＰＳＰＳをコードするヌクレオチド配列を示す図である。 合成Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子のヌクレオチド配列である配列番号３を示す図である。 ｄｓＲＮＡにより処理したパルマーアマランス植物の罹病を示す図である。図３Ａは、グリホサート処理の７日後の植物を示す。図３Ｂは、ｌｏｎｇ ｄｓＲＮＡ溶液で処理し、その後７２時間後にグリホサート処理した界面活性剤処理植物を示す。図３Ｃは、短いｄｓＲＮＡ溶液で処理し、その後、７２時間後にグリホサート処理した界面活性剤処理植物を示す。 ｄｓＲＮＡ組成物により処理したベンサミアナタバコ植物の脱色を示す図である。 ベンサミアナタバコのフィトエン不飽和化酵素のヌクレオチド配列である配列番号２を示す図である。 実施例９において記載されるように、グリホサート抵抗性のパルマーアマランスの葉に浸透する５’−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識アンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１５）を示す図である。 実施例９において記載されるように、ＥＰＳＰＳに対するアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドにより処理したグリホサート抵抗性のパルマーアマランスの葉において測定されたＥＰＳＰＳ ｍＲＮＡの結果を示す図である。棒グラフの棒は、＃１〜＃４の各処理（円で囲まれた番号により示され、各番号は表２に対応している）および対照（オオムギ種子タンパク質のアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１４）を浸透させ、グリホサートによりまたはグリホサートなしで処理した葉）についての反復実験を示す。 実施例９において記載されるように、ＥＰＳＰＳのアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドにより局所的に処理したグリホサート抵抗性のパルマーアマランスの葉において測定されたＥＰＳＰＳタンパク質の結果を示す図である。各処理は、円で囲まれた番号によって示され、表２に対応する。 実施例９において記載されるように、２つの実験において、ＥＰＳＰＳのアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドにより処理したグリホサート抵抗性のパルマーアマランスの葉において測定されたシキミ酸蓄積の結果を示す図である。各処理は、円で囲まれた番号によって示され、表２に対応する。 ベンサミアナタバコのフィトエン不飽和化酵素のヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２）。 実施例１０において記載されるように、フィトエン合成酵素配列（配列番号１６）に関して、アッセイしたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの配列（表３を参照されたい）の位置を概略的に示す図である。 実施例１０において記載されるように、緩衝液（「対照」）、配列番号２のヌクレオチド９１４〜１１１３から成るセグメントに対応するＲＮＡ配列を有する２００塩基長ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド（「２００ｎｔ ｄｓＲＮＡ」）、ならびに一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの組み合わせ（配列番号１６、１７、２０、２１、２４、２５、および２６）（「ｓｓＤＮＡオリゴ」）により局所的に処理したベンサミアナタバコ植物葉の先端の脱色を示す図である。 緩衝液（対照）、２００塩基長ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、およびｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドにより処理したベンサミアナタバコ植物から単離したＲＮＡのノーザンブロット解析の結果を示す図である。２００塩基長ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドによる処理前に、一晩、暗中、４摂氏度で保つことによりトレスをかけた植物から単離したＲＮＡもまた示す。 実施例１０において記載されるように、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの様々な組み合わせにより局所的に重複処理したベンサミアナタバコ植物葉の先端の脱色を示す図である（各番号は、表４に列挙される処理に対応する）。対照（表４における処理１３）植物は、示さない。 実施例１０において記載されるように、表５に列挙されるポリヌクレオチドで局所的に処理したベンサミアナタバコ植物葉の先端の脱色を示す図である。 ＰＤＳ ２１塩基長アンチセンスｓｓＤＮＡ（配列番号３４、「２１ｎｔ ＰＤＳアンチセンス」）またはＴ７プロモーターを有していないあらかじめアッセイしたＰＤＳアンチセンス２２塩基長オリゴヌクレオチド（配列番号２２および２３）（「ＰＤＳアンチセンス」）による局所的な処理後にベンサミアナタバコ植物において観察された葉の先端の脱色を示す図である。実施例１０において記載されるように、緩衝液のみまたはＰＤＳ ２１塩基長センスｓｓＤＮＡ（配列番号３６、「２１ｎｔ ＰＤＳセンス」）を用いた局所的処理の後には、葉の先端の脱色はほとんどまたはまったく目視観察されなかった。 実施例１１において記載されるように、約７１％の同一性（１２５２／１７６２）を示すパルマーアマランスおよびベンサミアナタバコＰＤＳ ＤＮＡ配列のアライメントを示す図である。 実施例１１において記載されるように、コーンルートワーム（ｃｏｒｎ ｒｏｏｔ ｗｏｒｍ）遺伝子の２６０塩基対ｄｓＲＮＡにより局所的に処理したパルマーアマランス植物ではなく、６７８ｂｐまたは１９８ｂｐパルマーＰＤＳ ｄｓＲＮＡにより局所的に処理したパルマーアマランス植物において観察された葉の先端の脱色を示す図である。 実施例１２において記載されるように、フィトエン不飽和化酵素の浸透移行性のサイレンシングを誘発するために、最初に界面活性剤溶液により、次いでｓｓＤＮＡ ＰＤＳオリゴヌクレオチドにより局所的に処理したベンサミアナタバコ植物の葉の先端、茎、および花の脱色を示す図である。 実施例１２において記載されるように、フィトエン不飽和化酵素の浸透移行性のサイレンシングを誘発するために、界面活性剤溶液によるコンディショニングありまたはなしで、ｓｓＤＮＡ ＰＤＳオリゴヌクレオチドにより局所的に処理したベンサミアナタバコ植物の葉の先端、茎、および花の脱色示す図である。 実施例１３において記載されるように、表６に列挙される条件で処理した異なるグリホサート抵抗性のパルマーアマランス系統に対するアッセイの結果を示す図である（反復実験当たり３つの植物）。写真は、グリホサート処理の７日後（実験１〜６）またはグリホサート処理の９日後（実験７〜９）に撮影したものである。 実施例１４において記載されるように、ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ処理パルマーアマランス植物に豊富に存在すると同定された２つの低分子ＲＮＡの位置を示す図であり、完全長ＥＰＳＰＳ（配列番号４０）の位置５６４〜５８８および７４３〜７６７のヌクレオチドを下線付きイタリック体として示した図である。ＥＰＳＰＳ配列はまた、実施例１において記載されるように、４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子（下線付き非イタリック体）および３つの「長い」二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド（太字）の位置を示す。 実施例１７において記載されるように、パルマーアマランス植物を界面活性剤で処理し、その後３つの適用量のうちの１つのｄｓＲＮＡで処理し、その後除草剤で処理する結果を示す図である。 実施例１７において記載されるように、畑から収集した種子から成長させたグリホサート抵抗性のパルマーアマランスに対して実施したアッセイ１の結果を示す図である。除草剤処理の８日および３０日後の植物が示されている。 実施例１８において記載されるように、脂肪アミン（ｔａｌｌｏｗａｍｉｎｅ）界面活性剤および硫酸アンモニウムによるまたはトランスフェクション試薬によるパルマーアマランスの処理から得られた結果を示す図である。 実施例１９において記載されるように、ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡまたはＥＰＳＰＳ ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれかによるグリホサート抵抗性のパルマーアマランス植物の処理の結果を示す図である。 実施例２０において記載されるように、ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡまたはＥＰＳＰＳ ｓｓＤＮＡポリヌクレオチドのいずれかによるグリホサート抵抗性のパルマーアマランス植物の処理の結果を示す図である。上の写真は、除草剤噴霧の８日後に撮影されたものであり、下の（棒）グラフは、除草剤噴霧の８日後に採点したグリホサート外傷（ＧＩ）として結果を示したものである。 実施例２１において記載されるように、パルマーＥＰＳＰＳ遺伝子の全コード配列ならびに５’および３’非翻訳領域の一部をそれぞれタイリング様式で網羅する、およそ２５０ｂｐのＤＮＡセグメントに対応する１２のｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを示す図である。実施例１および図１に記載される４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子は、それぞれ、タイリングセグメント２、３、４、および８中に位置し、それらのセグメント内で明るい灰色の棒で示されている。 これらのタイリングセグメントから設計されたｄｓＲＮＡまたは４つの「短い」ｄｓＲＮＡ分子または緩衝液によるグリホサート抵抗性のパルマーアマランス植物の処理の結果を示す。 実施例２２において記載されるように、グリホサート抵抗性のパルマーアマランス植物をグリホサートで処理し、その後１％のＳｉｌｗｅｔ Ｌ−７７を噴霧し、その後２％硫酸アンモニウム含有緩衝液中のＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡを適用する処理の結果を示す図である。未処理（「ＵＴ」）対照植物は、除草剤またはｄｓＲＮＡではなく、１％のＳｉｌｗｅｔ Ｌ−７７噴霧のみにより処理した。植物は、処理の１６日後に写真撮影し、評価した。 実施例２３において記載されるように、ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、界面活性剤、硫酸アンモニウム、および除草剤の２０×もしくは１００×量を含有する組成物により、または界面活性剤、硫酸アンモニウム、および除草剤を含有する組成物により、高コピー数のグリホサート抵抗性のパルマーアマランスの野外個体群の処理の結果を示す図である。各処理について、１フィート×５フィートの２つの複製栽培地が処理された。 実施例２４において記載されるように、処理の３７、４６、および６０日後（上段から下段へ）の、植物当たり１ナノモルｓｓＤＮＡにより処理したレタス植物の脱色および死滅の進行を示す図である。 実施例２４において記載されるように、ポリヌクレオチドによる局所的な処理の４日または１２日後に観察された脱色によって証明されたレタス植物における浸透移行性のサイレンシングを示す図である。 ４つの個別のアンチセンスｓｓＤＮＡ（「ＨＬ２８７」、配列番号４３；「ＨＬ２８８」、配列番号４４；「ＨＬ２８９」、配列番号４５；および「ＨＬ２９０」、配列番号４６）または４つすべてを含む混合物による局所的な処理の４後に観察された脱色によって証明された浸透移行性のサイレンシングを示す図である。 実施例２５において記載されるように、トマトフィトエン不飽和化酵素ポリヌクレオチドにより処理したトマト植物の葉（上段右側のパネル）および花（中段右側のパネル）の脱色を示す図である。図３０はまた、ＰＤＳポリヌクレオチドにより処理したトマト植物の発育阻止をも示す（下段のパネル）。 実施例２６において記載されるように、ＴＩＦポリヌクレオチドによる、ＥＰＳＰＳポリヌクレオチドの、低コピー数のパルマーアマランスにおけるグリホサート除草剤活性の増強を示すグラフであり、また、ＴＩＦポリヌクレオチド自体が除草剤活性を有することを示したグラフである。ＥＰＳＰＳポリヌクレオチド「１、３、４」は、図１でそれぞれ下線付きで提示したヌクレオチドであるが、位置１４〜３８（短いｄｓＲＮＡ−１）、３４５〜３６９（短いｄｓＲＮＡ−３）、および１１０５〜１１２９（短いｄｓＲＮＡ−４）でパルマーアマランスＥＰＳＰＳ遺伝子（配列番号１）から転写されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるアンチセンス鎖を有する「短い」ｄｓＲＮＡを指す（実施例１を参照されたい）。ＥＰＳＰＳ「５」は、ＩＤＴ［５］に当てはまる（表１１において記載される配列番号９１〜９２）。 実施例２６において記載されるように、ＴＩＦポリヌクレオチドによる、ＥＰＳＰＳポリヌクレオチドの、高コピー数のパルマーアマランスにおけるグリホサート除草剤活性の増強およびＴＩＦポリヌクレオチドが、それら自体、除草剤活性を有することを示す図である。ＥＰＳＰＳポリヌクレオチド「１、３、４」は、図１でそれぞれ下線付きで提示したヌクレオチドであるが、位置１４〜３８（短いｄｓＲＮＡ−１）、３４５〜３６９（短いｄｓＲＮＡ−３）、および１１０５〜１１２９（短いｄｓＲＮＡ−４）でパルマーアマランスＥＰＳＰＳ遺伝子（配列番号１）から転写されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるアンチセンス鎖を有する「短い」ｄｓＲＮＡを指す（実施例１を参照されたい）。ＥＰＳＰＳ「５」は、ＩＤＴ［５］に当てはまる（表１１に記載の配列番号９１〜９２）。 実施例２８において記載されるように、非ポリヌクレオチド除草剤およびポリヌクレオチドの指定された組み合わせによる処理後のパルマーアマランスに対する除草剤効果を示すグラフである。 実施例３０において記載されるように、ベンサミアナタバコＰＤＳ遺伝子座１プロモーター（配列番号３１９）およびＰＤＳ遺伝子座２プロモーター（配列番号３２０）のアライメントを示す図である。 実施例３０において記載されるように、ベンサミアナタバコＰＤＳ遺伝子座１および遺伝子座２プロモーターならびにポリヌクレオチドの混合物によって標的にされる領域を概略的に示す図である。 実施例３３において記載されるように、ＰＤＳアンチセンスポリヌクレオチド（図３６Ａ）、ＥＰＳＰＳアンチセンスポリヌクレオチド（図３６Ｂ）、またはＲｕＢｉｓＣＯアンチセンスポリヌクレオチド（図３６Ｃ）により処理した植物におけるベンサミアナタバコ植物の草高に対する効果を示すグラフである。 実施例３４において記載されるように、内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子を標的にするｄｓＲＮＡポリヌクレオチド（「ＥＰＳＰＳ ＤＮＡオリゴ」）、または対照として緩衝液単独で局所的処理を行った場合のトウモロコシ（Ｇａｓｐｅ）単子葉植物に対する効果を示す図である。 実施例３５において記載されるように、グリホサート抵抗性のパルマーアマランス植物に対する除草剤活性に対するグリホサート対イオンの様々な効果を示す図である。 実施例３５において記載されるように、ＥＰＳＰＳの３３、３６、または５７コピーを含有するグリホサート抵抗性のパルマーアマランスに対するポリアミンスペルミン（「ＳＰＭ」）およびスペルミジン（「ＳＰＭＤ」）または硫酸アンモニウム（「ＡＭＳ」）の効果を示す図である。「ｆｂ ４Ｘ ＷＭ」は、「その後に続く、グリホサート（Ｒｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤の１ヘクタール当たり３３６０ｇ酸相当量）による処理」を意味する。
特に明示されない限り、本明細書の本文における核酸配列は、左から右に読まれる場合、５’〜３’方向に示される。核酸配列は、指定されるように、ＤＮＡとしてまたはＲＮＡとして提供されてもよく、当業者に知られているように、一方の開示は、必然的に他方を定める。用語が単数形で提供される場合、本発明者らはまた、該用語の複数形によって記載される本発明の態様をも企図する。「転写不可の」ポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドが完全なポリメラーゼＩＩ転写単位を含まないことを意味する。本明細書で使用される「溶液」は、均一な混合物、ならびに懸濁液、コロイド、ミセル、および乳剤などのような不均一な混合物を指す。
（ポリヌクレオチド）
本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」は、複数のヌクレオチドを含有する核酸分子を指し、一般に、「オリゴヌクレオチド」（１８〜２５ヌクレオチド長のポリヌクレオチド分子）および２６以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドの両方を指す。本発明の実施形態は、１８〜２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド（たとえば１８塩基長、１９塩基長、２０塩基長、２１塩基長、２２塩基長、２３塩基長、２４塩基長、もしくは２５塩基長）または２６以上ヌクレオチド長の中程度の長さのポリヌクレオチド（たとえば２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、もしくは約３００ヌクレオチドのポリヌクレオチド長）または約３００超ヌクレオチド長の長鎖ポリヌクレオチド（たとえば、約３００〜約４００ヌクレオチド長、約４００〜約５００ヌクレオチド長、約５００〜約６００ヌクレオチド長、約６００〜約７００ヌクレオチド長、約７００〜約８００ヌクレオチド長、約８００〜約９００ヌクレオチド長、約９００〜約１０００ヌクレオチド長、約３００〜約５００ヌクレオチド長、約３００〜約６００ヌクレオチド長、約３００〜約７００ヌクレオチド長、約３００〜約８００ヌクレオチド長、約３００〜約９００ヌクレオチド長、または約１０００ヌクレオチド長またはさらに約１０００超ヌクレオチド長、たとえば、標的遺伝子のコード部分または非コード部分またはコード部分および非コード部分の両方を含む、最長は標的遺伝子の全長に至るまでのポリヌクレオチド）を含む組成物を含む。ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、その長さは、塩基対に関して同様に記載することができる。
本発明の様々な実施形態において使用されるポリヌクレオチド組成物は、ＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドもしくは両方の混合物または化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドもしくはその混合物を含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの組み合わせ、たとえば、主としてリボヌクレオチドから成るが、１つもしくは複数の末端のデオキシリボヌクレオチドを有する合成ポリヌクレオチド、または主としてデオキシリボヌクレオチドから成るが、１つもしくは複数の末端のジデオキシリボヌクレオチドを有する合成ポリヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、イノシン、チオウリジン、またはプソイドウリジンなどのような非標準的なヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの例は、当技術分野においてよく知られている；たとえばＶｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ （１９９８） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６７：９９−１３４を参照されたい。たとえば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの天然に発生するホスホジエステル主鎖は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾により部分的にまたは完全に修飾することができ、修飾ヌクレオシド塩基または修飾糖は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド合成において使用することができ、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、蛍光成分（たとえばフルオレセインもしくはローダミン）または他の標識（たとえばビオチン）により標識することができる。
ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドまたはその修飾類似体とすることができ、オリゴヌクレオチド長以上のものとすることができる。本発明のさらに具体的な実施形態では、植物細胞中に一本鎖ＲＮＡを提供するポリヌクレオチドは、（ａ）一本鎖ＲＮＡ分子、（ｂ）自己ハイブリダイズして、二本鎖ＲＮＡ分子を形成する一本鎖ＲＮＡ分子、（ｃ）二本鎖ＲＮＡ分子、（ｄ）一本鎖ＤＮＡ分子、（ｅ）自己ハイブリダイズして、二本鎖ＤＮＡ分子を形成する一本鎖ＤＮＡ分子、および（ｆ）ＲＮＡ分子に転写される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡ分子、（ｇ）二本鎖ＤＮＡ分子、（ｈ）ＲＮＡ分子に転写される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡ分子、（ｉ）二本鎖ハイブリダイズＲＮＡ／ＤＮＡ分子、またはその組み合わせから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、これらのポリヌクレオチドは、化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非標準的なヌクレオチドを含む。方法の実施形態では、ポリヌクレオチドは、分子内ハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖ＤＮＡ、分子間ハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖ＤＮＡ、分子内ハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖ＲＮＡ、または分子間ハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖ＲＮＡを含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、自己ハイブリダイズして、細胞の生理学的条件下で抑制標的遺伝子から転写されたＲＮＡにハイブリダイズするであろう少なくとも１つのセグメントを含む、少なくとも部分的に二本鎖構造を有するヘアピン構造を形成する一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡを含む。いかなるメカニズムによっても拘束されることを意図しないが、そのようなポリヌクレオチドは、細胞の生理学的条件下で抑制標的遺伝子から転写されたＲＮＡにハイブリダイズするであろう少なくとも１つのセグメントを有する一本鎖ＲＮＡを産生する、または産生するであろうと考えられている。その他の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロモーター、一般に、植物において機能的なプロモーター、たとえばｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＶプロモーター、またはｐｏｌ Ｖプロモーターをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド組成物は、核酸分子と結合することが知られている対イオンまたは他の分子、たとえばテトラアルキルアンモニウムイオン、トリアルキルアンモニウムイオン、スルホニウムイオン、リチウムイオン、およびスペルミン、スペルミジン、またはプトレッシンなどのようなポリアミンと共に配合される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド組成物は、非ポリヌクレオチド除草剤（たとえば、本明細書の中で「除草剤耐性タンパク質」と題した箇所で開示される化学的除草剤）と共に、または移送剤もしくは浸透性増強剤（「浸透性増強剤および処理」と題した箇所を参照されたい）と共に配合される。
ポリヌクレオチドは、植物における内因性遺伝子の浸透移行性の調節または抑制を誘発するように設計され、植物の内因性遺伝子の配列（コード配列もしくは非コード配列であり得る）または植物の内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有するように設計される。「本質的に同一である」または「本質的に相補的である」とは、ポリヌクレオチド（または二本鎖ポリヌクレオチドのうちの少なくとも一方の鎖）が、内因性遺伝子の調節または抑制を達成するために、植物の細胞における生理学的条件下で、内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡにハイブリダイズするように設計されることを意味する。
本発明において機能的な一本鎖ポリヌクレオチドの実施形態は、１００％である必要はないが、少なくとも、遺伝子サイレンシングメカニズムによる切断を可能にするために、標的遺伝子から転写されるＲＮＡへのハイブリダイゼーションを可能にし、植物細胞における生理学的条件下で二重鎖を形成するのに十分である配列相補性を有する。したがって、実施形態では、セグメントは、標的遺伝子または標的遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的であるように設計される。「本質的に同一である」とは、標的遺伝子または標的遺伝子から転写されるＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と比較した場合に、１００％の配列同一性または少なくとも約８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有することを意味し、「本質的に相補的である」とは、標的遺伝子または標的遺伝子から転写されるＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と比較した場合に、１００％の配列相補性または少なくとも約８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列相補性を有することを意味する。本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、所与の標的遺伝子の一つの対立遺伝子と１００％の配列同一性または相補性を有するように設計され（たとえば、除草剤耐性タンパク質遺伝子、除草剤不活性化タンパク質遺伝子、ストレス応答遺伝子、または必須遺伝子のコードまたは非コード配列）、他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、所与の標的遺伝子の複数の対立遺伝子と１００％の配列同一性または相補性を有するように設計される。
本発明の一態様では、ポリヌクレオチドは、修飾ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ遺伝子、たとえば、７ＳＬシグナル認識粒子ＲＮＡもしくはＵ６スプライセオソームＲＮＡを転写する遺伝子（Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子）または機能的Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列を含有するポリヌクレオチドである。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子によって本来転写されるＤＮＡ配列に取って代わる、調節用に同定された標的遺伝子のＲＮＡに対応するセンスおよびアンチセンスＤＮＡを含有する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子である。
本発明において有用なポリヌクレオチドは、典型的に、少なくとも１週間以上の処理植物が生存する間に、典型的には浸透移行性の様式で、遺伝子発現の制御または調節（たとえば抑制）を達成する。たとえば、本発明のポリヌクレオチド組成物を用いて植物の葉の処理を行った数日以内に、プライマリーｓｉＲＮＡおよび推移的ｓｉＲＮＡ1（ｔｒａｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ）は、処理された葉の側方および上部にある他の葉ならびに先端の組織において検出することができる。
ポリヌクレオチドを作製するための方法は、当技術分野においてよく知られている。オリゴヌクレオチドの市販の調製物は、センス鎖の３’末端上に２つのデオキシリボヌクレオチドを提供することが多い。長いポリヌクレオチド分子は、市販で入手可能なキットから合成することができ、たとえばＡｍｂｉｏｎ製キットはｄｓＲＮＡに構築可能なＲＮＡ鎖を作製する細菌Ｔ７ポリメラーゼプロモーターをコードする、５’末端上にＤＮＡをライゲーションする。その代わりに、ｄｓＲＮＡ分子は、調節されたまたは欠損したＲＮアーゼＩＩＩ酵素活性を有する細菌細胞において発現カセットから産生することができる。長いポリヌクレオチド分子はまた、複数のＲＮＡまたはＤＮＡ断片から構築することもできる。いくつかの実施形態では、ＲｅｙｎｏｌｄｓスコアおよびＴｕｓｃｈｌルールなどの設計パラメーターは、当技術分野において知られており、遺伝子サイレンシングにおいて有効なポリヌクレオチド配列を選択するのに使用される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列のランダム設計または経験的な選択は、遺伝子サイレンシングにおいて有効なポリヌクレオチド配列を選択するのに使用される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの配列は、他の遺伝子の意図しないサイレンシングを最小限にするよう意図された植物のゲノムＤＮＡに対してスクリーニングされる。
本発明のポリヌクレオチド組成物は、低濃度で、単独または他の成分と組み合わせて（たとえば界面活性剤、塩、および非ポリヌクレオチド除草剤）、混合の場合は同じ溶液かまたは別々に適用される溶液のいずれかによる、ポリヌクレオチド分子の溶液など、組成物において有用である。本発明の方法において有用となり得るポリヌクレオチド分子の濃度および適用量に上限はないが、効率性のためには、一般に、より低い有効濃度および適用量が求められるであろう。濃度は、植物の葉に適用される噴霧量を考慮して調節することができる。一実施形態では、２５塩基長オリゴヌクレオチド分子を使用する草本の処理に有用なのは、植物あたり約１ナノモル、たとえば、植物あたり約０．０５〜１ナノモルのオリゴヌクレオチド分子である。草本についての他の実施形態では、植物あたり約０．０５〜約１００ナノモルまたは約０．１〜約２０ナノモルまたは約１ナノモル〜約１０ナノモルのポリヌクレオチドが有用な範囲として含まれる。非常に大きな植物、木、またはつる植物は、相応して大量のポリヌクレオチドを必要としてもよい。複数のオリゴヌクレオチドに処理され得る長いｄｓＲＮＡ分子を使用する場合、より低い濃度を使用することができる。本発明の実施形態を示すための以下の実施例では、オリゴヌクレオチド分子に適用される場合の因子１×は、植物あたり０．８ナノモルのポリヌクレオチド分子、１０×は、植物あたり８ナノモルのポリヌクレオチド分子、および１００×は、植物あたり８０ナノモルのポリヌクレオチド分子の処理を意味するために任意に使用される。たとえば、実施例２３では、植物は、植物あたり、１００×処理のＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ（２６４マイクログラムまたは８０のナノモル）を含む水溶液を用いて処理した。
（一本鎖ＲＮＡ分子）
本発明は、植物細胞における遺伝子の浸透移行性の調節のために一本鎖ＲＮＡを提供するためのポリヌクレオチド分子を提供する。さらに具体的に、本発明はまた、標的遺伝子または標的遺伝子から転写されるＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続ヌクレオチド配列と本質的に同一または本質的に相補的であるヌクレオチド配列中にセグメントを有するポリヌクレオチド分子を植物へ局所的に適用することにより、植物における標的遺伝子の浸透移行性の調節（たとえば浸透移行性の抑制またはサイレンシング）を誘発し、それにより、組成物は植物の内部に浸透し、転写ＲＮＡ、たとえばメッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズする一本鎖ＲＮＡの作用による標的遺伝子の浸透移行性の調節を誘発するための組成物および方法をも提供する。ポリヌクレオチド分子は、単一の該セグメント、複数の該セグメント、複数の異なる該セグメント、またはそれらの組み合わせを有する１つまたは複数のポリヌクレオチド分子であり得る。
（移送剤、浸透性増強剤、および処理）
本発明の組成物および方法は、植物細胞の中へポリヌクレオチド分子を浸透に対して、植物組織、たとえば葉、茎、根、花、または果実の表面をコンディショニングするための移送剤または浸透性増強剤および処理を含むことができる。植物細胞の中へのポリヌクレオチドの移送は、植物組織への、ポリヌクレオチド移送剤の事前または同時適用により促進することができる。いくつかの実施形態では、移送剤は、ポリヌクレオチド組成物の適用に続いて適用される。ポリヌクレオチド移送剤により、ポリヌクレオチドが、クチクラワックスバリア、気孔、および／または細胞壁もしくは膜バリアを通じて植物細胞の中へ移送される経路を可能にする。植物細胞の中への組成物が移送されるのを促進するために適した剤には、植物の外面の浸透性を増加させる、またはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに対する植物細胞の浸透性を増加させる剤が含まれる。植物細胞の中への組成物移送を促進する該剤は、化学剤、物理剤、またはそれらの組み合わせを含む。コンディショニングのための化学剤は、（ａ）界面活性剤、（ｂ）有機溶媒もしくは水溶液もしくは有機溶媒の水性混合物、（ｃ）酸化剤、（ｅ）酸、（ｆ）塩基、（ｇ）油、（ｈ）酵素、またはそれらの組み合わせを含む。方法の実施形態は、任意選択で、インキュベーションステップ、中和ステップ（たとえば酸、塩基、もしくは酸化剤を中和するまたは酵素を不活性化する）、すすぎステップ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。ポリヌクレオチド浸透に対する植物コンディショニング剤または処理の実施形態は、乳剤、逆乳剤、リポソーム、および他のミセル様組成物を含む。ポリヌクレオチド浸透に対する植物コンディショニング剤または処理の実施形態は、核酸分子と結合することが知られている対イオンまたは他の分子、たとえば無機アンモニウムイオン類、アルキルアンモニウムイオン類、リチウムイオン類、およびスペルミン、スペルミジン、またはプトレッシンなどポリアミン類、および他の陽イオン類を含む。ポリヌクレオチド浸透に対して植物をコンディショニングするのに有用な有機溶媒は、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ピリジン、Ｎ−ピロリジン、ヘキサメチルホスホルアミド、アセトニトリル、ジオキサン、ポリプロピレングリコール、その他の水混和性溶媒または非水性系でホスホヌクレオチドを溶解するその他の溶媒（合成反応において使用されるなど）を含む。天然由来油または界面活性剤もしくは乳化剤を有するもしくは有していない合成油を使用することができ、たとえば、植物源の油、作物油（ｗｗｗ．ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ．ａｄｊｕｖａｎｔｓ．ｃｏｍで一般公開されている、９ｔｈ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓに列挙されているものなど）、たとえば、パラフィン系オイル類、ポリオール脂肪酸エステル類、またはポリエチレンイミンもしくはＮ−ピロリジンなどのアミドもしくはポリアミンで修飾された短鎖分子を有する油を使用することができる。
ポリヌクレオチド浸透に対する該植物コンディショニング剤は、任意の好都合な方法、たとえば、粉末、乳剤、懸濁液、または溶液で噴霧またはコーティングすることにより植物に適用される；同様に、ポリヌクレオチド分子は、任意の好都合な方法、たとえば、溶液、乳剤、または懸濁液を噴霧または塗布することにより植物に適用される。
有用な界面活性剤の例は、脂肪酸（脂肪または脂肪アミンまたはリン脂質など）のナトリウム塩またはリチウム塩および有機シリコーン界面活性剤を含む。他の有用な界面活性剤は、非イオン性有機シリコーン界面活性剤を含む有機シリコーン界面活性剤、たとえば、トリシロキサンエトキシレート界面活性剤またはポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンおよびアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルのコポリマー（ＣＡＳ番号２７３０６−７８−１およびＥＰＡ番号：ＣＡＬ．ＲＥＧ．ＮＯ．５９０５−５００７３−ＡＡを有するＳｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ−７７界面活性剤として市販、現在、Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社，Ａｌｂａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから入手可能である）などのシリコーンポリエーテルコポリマーを含む。Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７界面活性剤が植物の葉または他の表面への噴霧前処理として使用される場合、約０．０１５〜約２重量パーセント（ｗｔ ％）の範囲の濃度（たとえば約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．５ｗｔ ％）が、表面上へ局所的に適用し、植物細胞の中へポリヌクレオチド分子を移送させるために、葉または他の植物表面を調製するのに効果的である。
有用な物理的作因として、（ａ）カーボランダム、コランダム、砂、方解石、軽石、ざくろ石、およびその他同種のものなどのような研磨剤、（ｂ）カーボンナノチューブなどのナノ粒子、または（ｃ）物理的力を含み得る。カーボンナノチューブは、Ｋａｍ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２６ （２２）：６８５０−６８５１、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．， ９（３）：１００７−１０１０、およびＫｈｏｄａｋｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ． （２００９） ＡＣＳ Ｎａｎｏ， ３（１０）：３２２１−３２２７によって開示されている。物理的力作因として、加熱、冷却、陽圧の適用、または超音波処理が含まれ得る。方法の実施形態は、任意選択で、インキュベーションステップ、中和ステップ（たとえば酸、塩基、もしくは酸化剤を中和するまたは酵素を不活性化する）、すすぎステップ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。本発明の方法にはさらに、特定の遺伝子のサイレンシングによる効果の増強を有するであろう他の作用剤の適用が含まれ得る。たとえば、ポリヌクレオチドが除草剤抵抗性を提供する遺伝子を調節するように設計される場合、その後除草剤を適用すると、除草剤効能に対して劇的な効果を有し得る。
ポリヌクレオチド浸透に対する植物実験用コンディショニング因には、たとえば、化学剤の適用、酵素処理、加熱もしくは冷却、陽圧もしくは陰圧を用いる処理、または超音波処理が含まれる。畑における植物のコンディショニング剤には、界面活性剤および塩など化学剤が含まれる。
（標的遺伝子および必須遺伝子）
本発明の組成物および方法は、植物細胞における内因性またはトランスジェニック標的遺伝子の発現を調整するのに有用である。様々な実施形態では、標的遺伝子は、コード（タンパク質コードもしくは翻訳可能）配列、非コード（翻訳不可能）配列、またはコードおよび非コード配列の両方を含む。本発明の組成物は、複数の遺伝子、または１つもしくは複数の遺伝子の複数のセグメントを標的にするように設計されたポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含むことができる。標的遺伝子は、標的遺伝子の複数の連続するセグメント、標的遺伝子の複数の非連続セグメント、標的遺伝子の複数の対立遺伝子、または１つもしくは複数の種由来の複数の標的遺伝子を含むことができる。標的遺伝子の例は、植物細胞において発現される内因性植物遺伝子および導入遺伝子を含む。標的遺伝子の他の例は、植物ウイルス病原体の内因性遺伝子または植物無脊椎有害生物の内因性遺伝子を含む。
標的遺伝子は、除草剤耐性タンパク質をコードする遺伝子、調節ＲＮＡを含む非コード配列、および細胞生命の維持または有機体の再生を支持するのに必要な必須遺伝子を含むことができる。必須遺伝子の実施形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡ複製、遺伝子転写、ＲＮＡ媒介性の遺伝子調節、タンパク質合成、エネルギー生産、および細胞分裂に関与する遺伝子を含む。必須遺伝子の概略の１つの例は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３２：Ｄ２７１−Ｄ２７２に記載されており、ｔｕｂｉｃ．ｔｊｕ． ｅｄｕ．ｃｎ／ｄｅｇ／で入手可能である。バージョンＤＥＧ ５．４は、シロイヌナズナについての７７７の必須遺伝子を列挙している。必須遺伝子の例は、翻訳開始因子（ＴＩＦ）およびリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）を含む。標的遺伝子は、転写因子をコードする遺伝子、ならびに、これらに限定されないが、アミノ酸、脂肪酸および他の脂質、糖および他の炭水化物、生物学的ポリマー、ならびにアルカロイド、テルペノイド、ポリケチド、非リボソームペプチドを含む２次代謝産物、ならびに混合性の生合成起源の２次代謝産物などの植物における分子の生合成または異化に関与する酵素をコードする遺伝子を含むことができる。
（組成物および方法）
本発明の一本鎖ＲＮＡ分子は、ＲＮＡとして植物細胞に直接提供することができるか、または、たとえば、処理組成物におけるポリヌクレオチド分子が、標的遺伝子の転写物にハイブリダイズできる一本鎖ＲＮＡの生産を植物の細胞に引き起こす場合は間接的に提供することができる。多くの実施形態では、ポリヌクレオチド分子の組成物は、ポリヌクレオチド浸透に対する植物コンディショニング剤など、植物細胞中へのポリヌクレオチド分子移送を促進するための１つまたは複数の浸透性増強剤をさらに含む。本発明の態様では、方法は、ポリヌクレオチド組成物の１つまたは複数の適用、およびポリヌクレオチド浸透に対する植物コンディショニング用浸透性増強剤の１つまたは複数の適用を含む。浸透に対するコンディショニング剤が有機シリコーン界面活性剤である場合、ポリヌクレオチド分子の実施形態は、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド、化学的に修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、またはそれらの混合物である。
本発明の態様は、植物における標的遺伝子の浸透移行性サイレンシングを誘発するための方法であって、（ａ）ポリヌクレオチド浸透に対する植物のコンディショニングおよび（ｂ）植物へのポリヌクレオチド分子の局所的な適用を含み、ポリヌクレオチド分子は、アンチセンスまたはセンス配向のいずれかで、標的遺伝子からクローニングされたか、またはそうでなければそれから同定された１８以上の連続連続するヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを含み、それによって、ポリヌクレオチド分子は植物の内部に浸透し、標的遺伝子の浸透移行性サイレンシングを誘発する方法を提供する。コンディショニングおよびポリヌクレオチド適用は、別々にまたは単一のステップで実行することができる。コンディショニングおよびポリヌクレオチド適用を別々のステップで実行する場合、コンディショニングは、ポリヌクレオチド適用前でもまたは後でもよく、に数分、数時間、または数日以内に行い得る。いくつかの実施形態では、同じ植物に対して、複数のコンディショニングステップまたは複数のポリヌクレオチド分子適用を実行することができる。方法の実施形態では、セグメントは、（ａ）標的遺伝子のコード（つまりタンパク質コード）、（ｂ）非コード、または（ｃ）コード部分および非コード部分の両方からクローニングするかまたは同定することができる。非コード部分は、ＲＮＡ調節配列（たとえばプロモーター、イントロン、５’もしくは３’非翻訳領域、およびマイクロＲＮＡ、トランス作用性ｓｉＲＮＡ、天然のアンチセンスｓｉＲＮＡ、および調節機能を有する他の低分子ＲＮＡ）、または構造的もしくは酵素的機能を有するＲＮＡ（たとえばリボザイム、リボソームＲＮＡ、ｔ−ＲＮＡ、アプタマー、およびリボスイッチ）をコードするＤＮＡ（またはＤＮＡによってコードされるＲＮＡ）を含む。
植物における標的遺伝子の浸透移行性サイレンシングを誘発するための方法の様々な実施形態では、標的遺伝子は、（ａ）植物の内因性遺伝子、（ｂ）植物のウイルス病原体の内因性遺伝子、（ｃ）植物の無脊椎有害生物の内因性遺伝子、（ｄ）植物の無脊椎有害生物の共生生物の内因性遺伝子、または（ｅ）トランスジェニック植物に挿入された人工の遺伝子である。標的遺伝子が植物に対して内因性である実施形態では、標的遺伝子は、（ａ）植物の成長もしくは生命の維持にとって必須である植物の内因性遺伝子であり、（ｂ）植物に対して除草剤抵抗性を提供するタンパク質をコードし、または（ｃ）ＲＮＡ調節分子に転写される。植物における標的遺伝子の浸透移行性サイレンシングを誘発するための方法の実施形態では、コンディショニングは、化学剤、摩耗、創傷、酵素処理、加熱もしくは冷却の適用、陽圧もしくは陰圧を用いる処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、コンディショニングは、有機シリコーン界面活性剤などの界面活性剤、たとえば、ポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンおよびアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルのコポリマー（Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ−７７界面活性剤として市販で入手可能）などのシリコーンポリエーテルコポリマーの適用を含む。方法の実施形態では、コンディショニングは、（ａ）界面活性剤、（ｂ）有機溶媒または水溶液または有機溶媒の水性混合物、（ｃ）ポリプロピレングリコールまたは水溶液またはポリプロピレングリコールの水性混合物、（ｄ）ナノ粒子、（ｅ）酸化剤、（ｆ）酸もしくは塩基、または（ｇ）油またはそれらの組み合わせの適用を含む。方法の実施形態は、任意選択で、インキュベーションステップ、中和ステップ（たとえば酸、塩基、もしくは酸化剤を中和するまたは酵素を不活性化する）、すすぎステップ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
本発明は、植物における標的遺伝子の浸透移行性サイレンシングを誘発するための局所的な組成物であって、（ａ）ポリヌクレオチド浸透に対する植物コンディショニング剤および（ｂ）アンチセンスまたはセンス配向のいずれかで、標的遺伝子のヌクレオチド配列と本質的に同一であるかまたは相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを有するポリヌクレオチド分子を含む局所的組成物を提供する。該組成物は、植物における内因性遺伝子を調整することによって逆遺伝学を調査するための方法を含む、本明細書において開示される様々な方法のために、また、雑草防除および自生植物防除の開示された方法の除草剤組成物として使用することができる。本発明の他の態様では、内因性遺伝子を抑制するための外因性ＤＮＡまたはＲＮＡを含む植物が提供されるのであって、外因性ＤＮＡは、植物の染色体の中に統合されず、外因性ＲＮＡは、植物の染色体の中に統合されるＤＮＡから転写されず、内因性遺伝子は、植物へのポリヌクレオチドの局所的な適用によって抑制される。その代わりに、外因性ＤＮＡまたはＲＮＡは、植物有害生物または植物病の制御をもたらすように、有害生物または病原体への応答に関与する内因性植物遺伝子を抑制するよう設計され得る。該植物は、種子から成長させることができ、または切断、クローニング、または移植プロセスによって産生することができる（つまり種子から成長させない植物）。該植物は、条植え作物植物、果実、野菜、木、または観賞植物である。たとえば、本明細書において開示される本発明の実施形態では、植物は、条植え作物植物（たとえばトウモロコシ、ダイズ、綿、アブラナ、サトウダイコン、アルファルファ、サトウキビ、イネ、およびコムギ）または野菜（たとえばトマト、アマトウガラシ、トウガラシ、メロン、スイカ、キュウリ、ナス、カリフラワー、ブロッコリー、レタス、ホウレンソウ、タマネギ、エンドウ、ニンジン、トウモロコシ、ハクサイ、ニラ、ウイキョウ、ポンキン、カボチャもしくはヒョウタン、ラディッシュ、メキャベツ、オオブドウホオズキ、ソラマメ、ドライビーン、またはオクラ）または調理用の植物（たとえばバジル、パセリ、コーヒー、もしくは茶）または果実（たとえばリンゴ、セイヨウナシ、サクランボ、モモ、プラム、アプリコット、バナナ、オオバコ、食用のブドウ、ワイン用のブドウ、柑橘類、アボカド、マンゴー、もしくはベリー）または装飾用のもしくは商業利用のために成長させた木（たとえば果樹もしくは堅果のなる木）または観賞植物（たとえば装飾用の顕花植物もしくは低木もしくは芝草）である。切断、クローニング、または移植プロセスによって産生される植物（つまり種子から成長させない植物）の実施形態は、柑橘類、リンゴ、アボカド、トマト、ナス、キュウリ、メロン、スイカ、およびブドウならびに様々な観賞植物を含む果樹ならびに植物を含む。
（逆遺伝学調査法）
さらに他の態様では、本発明は、植物における内因性標的遺伝子を調節するまたは調整することによって、逆遺伝学の調査法を提供する。該方法には、植物細胞における遺伝子の浸透移行性調節のために、本発明の一本鎖ＲＮＡを（直接または間接的に）提供する組成物を成長中の植物の組織に適用することが含まれる。該方法の実施形態では、タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡまたは調節ＲＮＡ遺伝子を本発明のポリヌクレオチドによって標的にし、たとえば、ポリヌクレオチドの局所的適用によって付与することができる形質を同定するために、植物の生存中少なくとも１週間は遺伝子の調整を可能とする。本方法は、ストレスまたは処理に対する植物による応答を同定するために、さらなるステップ、たとえば、除草剤相互作用を同定するために一連の化合物に植物を暴露するステップまたは非生物的ストレス（たとえば水不足ストレス、栄養素不足ストレス、熱ストレス、寒冷ストレス、塩分ストレス）もしくは生物的な処理（たとえば、昆虫もしくは線虫有害生物またはウイルス、真菌、細菌病原体による攻撃、または化学化合物もしくは生物学的処理への暴露）に植物を暴露するステップをさらに含むことができる。本発明の他の態様では、一時的に沈黙させた様々な遺伝子を有する植物のライブラリーは、該化合物との相互作用を同定するために、化合物のライブラリー（たとえば除草剤、植物ホルモン、サリチル酸などの内因性もしくは外因性防御誘導因子、またはハーピン、窒素、亜リン酸、カリウム、硫黄、カルシウム、マグネシウム、鉄、および亜鉛などのような植物栄養素を提供する分子の欠失）に対してスクリーニングされる。該スクリーニングにおける有用な植物の例として、オオホナガアオゲイトウおよびベンサミアナタバコが含まれる。
（導入遺伝子サイレンシング法）
本発明のさらに他の態様では、本方法は、植物において発現されている導入遺伝子を沈黙させ、したがって、植物性能に対する導入遺伝子の寄与または形質に対する効果の事象非依存性測定である陰性対照を提供する。陰性対照効果を付与するには、植物の生活環の期間に本発明のポリヌクレオチド分子による複数の連続処理を必要とする場合がある。
（特定の適用）
関連する態様では、本発明の組成物および方法はまた、成長期にまたは収穫後の環境において、培養条件、環境上もしくは非生物的もしくは生物的ストレス、または市場需要の変化に応じて所望の表現型を達成するために、成長中の植物細胞または植物全体における１つまたは複数の遺伝子を一時的に沈黙させるのにも有用である。たとえば、本発明の組成物および方法は、作物植物産物の所望の栄養組成物などの、所望の表現型を有する植物または植物産物を産生するために、生合成または異化遺伝子を一時的に抑制する、たとえば、ダイズもしくはアブラナもしくは他の脂肪種子における所望の脂肪酸プロファイルを達成するためにＦＡＤ２遺伝子を抑制する、またはより容易に消化できる飼料植物を提供するためにＣＯＭＴおよびＣＣＯＭＴなどのリグニン生合成遺伝子を抑制するのに有用である。同様に、本発明の組成物および方法は、参照によって本明細書において組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００７０８９８号において開示されるように、内因性ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆物質、またはｍｉＲＮＡデコイなどのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または内因性ｍｉＲＮＡデコイなどのＲＮＡ調節分子を一時的に抑制するのに有用である。本発明の実施形態は、有害生物または病原体への応答に関与する内因性植物遺伝子を抑制し、したがって、植物有害生物または植物病の制御をもたらすのに有用である。本明細書において開示されるポリヌクレオチド、組成物、および送達方法は、たとえば、無脊椎動物の必須遺伝子または無脊椎有害生物の共生生物の遺伝子を標的にするＤＮＡまたはＲＮＡ分子の、作物植物、野菜、または果樹に対する局所的噴霧の使用により、植物の無脊椎有害生物、たとえば、植物からＲＮＡの摂取可能な鱗翅目または鞘翅目の有害生物の内因性標的遺伝子を抑制し、したがって、植物有害生物または有害生物誘発性疾患の制御をもたらすのにさらに有用である。本明細書において開示されるポリヌクレオチド、組成物、および送達方法は、たとえば、ウイルス遺伝子を標的にするＤＮＡまたはＲＮＡ分子の、作物植物、野菜、または果樹に対する局所的抗ウイルス噴霧の使用により、ウイルス病原体の制御をもたらすのにさらに有用である。
（除草剤組成物および方法）
本発明の態様は、植物細胞における内因性遺伝子（複数可）から転写されるＲＮＡに植物細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる、少なくとも１種類の一本鎖ＲＮＡを提供する植物致死剤としてポリヌクレオチド分子を含む液体除草剤組成物を提供する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、除草剤に対する耐性を提供するタンパク質をコードするか、または植物の成長もしくは生命の維持にとって必須遺伝子をコードする。液体除草剤組成物は、浸透性増強剤、非ヌクレオチド除草剤、またはその組み合わせをさらに含むことができ、別々に適用される非ヌクレオチド除草剤および／または浸透性増強剤により多段階処理で使用することができる。液体除草剤組成物の一実施形態は、浸透性増強剤としての有機シリコーン界面活性剤、および標的遺伝子のサイレンシングを達成するために植物細胞における標的遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる一本鎖ＲＮＡを植物の細胞に提供する植物致死剤としてのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む液体である。一実施形態では、グリホサート抵抗性植物に対して有効な液体除草剤組成物は、Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ−７７界面活性剤などのような有機シリコーン界面活性剤およびグリホサートに対する耐性を提供するＥＰＳＰＳタンパク質をコードする内因性またはトランスジェニックＥＰＳＰＳ遺伝子のＲＮＡ転写物に、植物細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる一本鎖ＲＮＡを提供するためのポリヌクレオチド分子を含む。ポリヌクレオチド分子が、植物の生長または生命維持にとって必須である、内因性タンパク質または非タンパク質コードＲＮＡをコード化するｍＲＮＡに、植物細胞における生理学的条件下でハイブリダイズするように、また、タンパク質の遺伝子サイレンシングおよび低下を達成するよう設計されている場合、ポリヌクレオチド分子は、植物致死剤、つまりヌクレオチド除草剤として機能することができる。ポリヌクレオチド分子を含む除草剤組成物は、成長中の植物の葉上へ局所的にコーティングするのに使用され得、または、たとえば、水耕法で成長させた植物もしくは鉢で成長させた植物の根もしくは切った茎上への適用するのに採用され得る。
本発明の態様は、浸透性増強剤、たとえば、有機シリコーン界面活性剤などの界面活性剤、および細胞における内因性植物遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる一本鎖ＲＮＡを（直接または間接的に）提供するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む、生きている植物の葉または他の表面上への局所的コーティングに適した組成物を提供する。一実施形態では、内因性植物遺伝子は、グリホサート、ジカンバ、またはスルホニル尿素などの除草剤に対する除草剤耐性を提供するタンパク質をコードする内因性植物遺伝子である。除草剤耐性を提供する該タンパク質の例は、下記の「除草剤耐性タンパク質」の箇所において開示される。
本発明の他の態様は、除草剤抵抗性作物植物の畑において、成長中の除草剤抵抗性自生植物を制御するための方法であって、自生植物の葉または他の表面上に、自生植物の細胞に対しまたは該細胞において、細胞における内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、自生植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる一本鎖ＲＮＡ分子を提供するまたはその産生を可能にする組成物を適用するステップを含み、内因性遺伝子は、（ｉ）自生植物の成長または生命の維持にとって必須遺伝子である、（ｉｉ）自生植物に対して除草剤抵抗性を提供するタンパク質をコードする、または（ｉｉｉ）ＲＮＡ調節剤（たとえばプロモーター、またｍｉＲＮＡ前駆物質、ｍｉＲＮＡ、トランス作用性ｓｉＲＮＡ、ならびにアプタマーおよびリボスイッチなどの調節機能を有する他の非コードＲＮＡ）に転写される方法を提供する。自生植物の細胞に対しまたは該細胞において、細胞における内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、自生植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる一本鎖ＲＮＡ分子を提供するまたは産生を可能にする組成物は、（ａ）一本鎖ＲＮＡ分子、（ｂ）自己ハイブリダイズして、二本鎖ＲＮＡ分子を形成する一本鎖ＲＮＡ分子、（ｃ）二本鎖ＲＮＡ分子、（ｄ）一本鎖ＤＮＡ分子、（ｅ）自己ハイブリダイズして、二本鎖ＤＮＡ分子を形成する一本鎖ＤＮＡ分子、および（ｆ）ＲＮＡ分子に転写される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡ分子、（ｇ）二本鎖ＤＮＡ分子、（ｈ）ＲＮＡ分子に転写される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡ分子、ならびに（ｉ）二本鎖ハイブリダイズＲＮＡ／ＤＮＡ分子から成る群から選択される、少なくとも１つのポリヌクレオチド分子を含む。自生植物に対して除草剤抵抗性を提供するタンパク質をコードする、自生植物の内因性遺伝子のサイレンシングまたは抑制のための実施形態では、本方法には、タンパク質が抵抗性を提供する対象の除草剤を一定量自生植物に対して適用することが含がまれ得る。本発明の組成物および方法は、作物畑、たとえば、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、アブラナ、サトウダイコン、アルファルファ、サトウキビ、イネ、コムギ、果実、および野菜作物などの除草剤抵抗性作物植物の畑において成長し得る除草剤耐性（抵抗性）の雑草または自生除草剤耐性（抵抗性）トランスジェニック植物を制御するのに有用である。いくつかの該実施形態では、雑草または自生植物は、アカザ（たとえばパルマーアマランス）および他のアマランス種、スギナモ（ヒメムカシヨモギ）、ウォーターヘンプ（ｗａｔｅｒｈｅｍｐ）、オオブタクサ、一般的なブタクサ、セイバンモロコシ、ヤエムグラ、ドクムギ、ヘアリーメヒシバ、プリックリーレタス、ベルベットリーフ、アルファルファ、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ、ワタ、サトウダイコン、サトウキビ、イネ、またはコムギである。いくつかの該実施形態では、内因性遺伝子は、除草剤耐性を提供するタンパク質をコードし、該タンパク質の例は、本明細書の「除草剤耐性タンパク質」の箇所において開示される。その他の該実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、他の植物ではなく特定の植物種における遺伝子を選択的に抑制し、その植物種の選択的な制御を可能にする。さらにその他の該実施形態では、非選択的一本鎖ＲＮＡ分子は、複数の植物種における共通の遺伝子を抑制し、植物の群または分類群にわたってより広汎な制御を可能にする。さらに具体的な実施形態では、本方法には、ＲＮＡ分子の標的であるタンパク質が抵抗性を提供し、ＲＮＡ分子の作用により標的タンパク質の産生を低下させ、非ヌクレオチド除草剤の作用により生成されるタンパク質の機能を阻害することを通じて作用の二重モードを可能とする、タンパク質の抵抗性提供対象である非ヌクレオチド除草剤を一定量（たとえばグリホサート、ジカンバ、グルホシネート、またはスルホニル尿素）、雑草または自生植物に適用することがさらに含まれる。、除草剤は、ヌクレオチド組成物とは別のステップで（前もしくは後に）、または同時に適用することができる。いくつかの場合、従来の非ヌクレオチド除草剤と同時に、またはその前に、ポリヌクレオチド組成物を適用することにより、雑草または自生植物防除に相乗効果を提供する（つまり、併用効果は、別々処理による効果の合計よりも大きい）。
（除草剤耐性タンパク質）
除草剤耐性（抵抗性）を示す天然（非トランスジェニック）植物およびトランスジェニック植物は、除草剤耐性を担うタンパク質をコードする遺伝子、たとえば、耐性を提供する導入遺伝子、耐性または除草剤によって通常標的にされる内因性遺伝子の複数コピーを提供する突然変異内因性遺伝子を有することが多い。そのような植物の制御のための戦略は、除草剤耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制または少なくとも低下させる剤を適用することである。除草剤に対する耐性を提供するタンパク質の例は、たとえば５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、グリホサートキシドレダクターゼ（ＧＯＸ）、グリホサートデカルボキシラーゼ、グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）、ジカンバモノオキシゲナーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ハロアリールニトリラーゼ、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエン不飽和化酵素、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、パラ−アミノ安息香酸シンターゼ、グルタミンシンターゼ、セルロースシンターゼ、ベータチューブリン、およびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを含む。
除草剤に耐性を与えるタンパク質をコードする核酸の例は、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ；たとえば米国特許第５，６２７，０６１号、第５，６３３，４３５号 ＲＥ３９２４７、第６，０４０，４９７号、および第５，０９４，９４５号ならびにＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ０４０７４４４３およびＷＯ０４００９７６１を参照されたい）、グリホサートキシドレダクターゼ（ＧＯＸ；米国特許第５，４６３，１７５号）、グリホサートデカルボキシラーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ０５００３３６２、米国特許第７，４０５，３４７号、および米国特許出願公開第２００４／０１７７３９９号）、グリホサートに対する耐性を与えるグリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ；米国特許第７，７１４，１８８号）；ジカンバなどオーキシン様除草剤に対する耐性を与えるジカンバモノオキシゲナーゼ（米国特許第７，１０５，７２４号）；ホスフィノトリシンまたはグルホシネートに対する耐性を与えるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔまたはｂａｒ）（米国特許第５，６４６，０２４号）；２，２−ジクロロプロピオン酸（ダラポン）に対する耐性を与える２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９９２７１１６）；スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾールピリミジン、ピリミジルオキシベンゾエート、およびフタリドなどアセト乳酸シンターゼ阻害剤に対する耐性を与えるアセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ（米国特許第６，２２５，１０５号）；ブロモキシニルに対する耐性を与えるためのハロアリールニトリラーゼ（Ｂｘｎ）（米国特許第４，８１０，６４８号）；シクロヘキサンジオン（セトキシジム）およびアリールオキシフェノキシプロピオネート（ハロキシホップ）に対する耐性を与えるための修飾アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（米国特許第６，４１４，２２２号）；スルホンアミド除草剤に対する耐性を与えるためのジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌ Ｉ）（米国特許第５，７１９，０４６号）；トリアジン系除草剤に対する耐性を与えるための３２ｋＤａ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２２：１３４６−１３４９）；５−メチルトリプトファンアミドに対する耐性を与えるためのアントラニル酸シンターゼ（米国特許第４，５８１，８４７号）；アミノエチルシステインに対する耐性を与えるためのジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐ Ａ）（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８９１１７８９）；ノルフルラゾンなどのピリダジノン除草剤に対する耐性を与えるためのフィトエン不飽和化酵素（ｃｒｔＩ）（日本特許ＪＰ０６３４３４７３）；イソキサフルトールなどのようなシクロプロピルイソオキサゾール除草剤に対する耐性を与えるためのヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、４−ヒドロキシフェニル酢酸酸オキシダーゼ、および４−ヒドロキシフェニル酢酸１−ヒドロラーゼ（米国特許第７，３０４，２０９号）（米国特許第６，２６８，５４９号）；プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤に対する耐性を与えるのための修飾プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ Ｉ（ｐｒｏｔｏｘ）（米国特許第５９３９６０２号）；アリールオキシアルカノエート成分を含有する除草剤に対する耐性を与えるためのアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１）（国際公開番号ＷＯ０５１０７４３７）；セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（米国特許出願公開第２００８／０１５５７１６号）、グルホシネート耐性グルタミンシンターゼ（米国特許出願公開第２００９／００１８０１６号）を含む。該除草剤の例は、フェノキシオーキシン（２，４−Ｄおよびジクロルプロップなど）、ピリジルオキシオーキシン（フルロキシピルおよびトリクロピルなど）、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＡＯＰＰ）アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤（ハロキシホップ、キザロホップ、およびジクロホップなど）、ならびに５−置換フェノキシ酢酸プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩＸ阻害剤（ピラフルフェンおよびフルミクロラックなど）を含む。本段落において引用される米国特許および特許出願公開において開示される除草剤耐性タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列および除草剤耐性タンパク質の配列は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明の態様は、植物に対して致死的となるレベルまたは少なくとも除草剤耐性を低下させるレベルで、該除草剤耐性タンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡを植物細胞に直接または間接的に提供するポリヌクレオチドおよび方法を提供する。除草剤耐性タンパク質をコードするＤＮＡの配列縮重により、特定の植物において特に有効である、本発明での使用のためのポリヌクレオチドを設計することが可能である。多くの植物のＤＮＡドメインを保存しているため、様々な植物に対して有効である、本発明での使用のためのポリヌクレオチドを設計することが可能である。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、除草剤活性の改善を提供することによって除草剤の活性を強化するために、対応する除草剤と混合される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、除草剤と別々にであるが、前処理または後処理として除草剤と組み合わせて利用される。実施形態では、有機シリコーン界面活性剤は、除草剤およびポリヌクレオチドと好都合に組み合わせられ、組成物が連続的な方法で適用される場合、一方または他方と組み合わせられる。温室設定の植物は、０．２５ＭＰａ圧力で、決定された速度（たとえば１４０Ｌ／ｈａ）で、試料溶液を送達するために、１１００１ＸＲスプレーノズルを有するトラック噴霧器または実験用の噴霧器を使用して処理することができる。畑において、処理溶液は、０．２５ＭＰａ噴霧圧で、カスタマイズされたシングルノズルアセンブリー（廃棄物を最小限にするために）を有する１１０１５フラットファンスプレーノズルを有する、適切な比率の組成物を送達するために調整されたＣＯ２加圧バックパック噴霧器により適用することができ、シングルノズル噴霧器は、３〜１２インチの高さの成長期植物の草冠上に６０ｃｍの有効な噴霧幅（ｓｐｒａｙ ｓｗａｔｈ）を提供する。
本開示において示される先の記載および実施例は、以下のローマ数字の項目において記載される態様および実施形態を含む本発明の主題を記載するが、これらに限定されない：（Ｉ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含む方法。（ＩＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、局所的にコーティングされたもの以外の植物細胞において標的内因性遺伝子の発現を調節することを含む方法。（ＩＩＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、少なくとも１つの植物器官において、浸透移行的に標的内因性遺伝子の発現を調節することを含む方法。（ＩＶ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該ポリヌクレオチド組成物は、標的内因性遺伝子の抑制を誘発する方法。（Ｖ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該ポリヌクレオチド組成物は、成長中の植物または植物器官において所望の表現型を達成する方法。（ＶＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該ポリヌクレオチド組成物は、成長中の植物または植物器官において、酵素、構造タンパク質、または植物調節タンパク質の発現を抑制する方法。（ＶＩＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該ポリヌクレオチド組成物は、植物致死剤である方法。（ＶＩＩＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該標的内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質をコードする方法。（ＩＸ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該標的内因性遺伝子は、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−アミノ安息香酸シンターゼ、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、グルホシネート耐性グルタミンシンターゼ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５‐リン酸（ＤＯＸＰ）シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）シンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、シトクロムＰ４５０、セルロースシンターゼ、ベータチューブリン、およびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼから成る群から選択される方法。（Ｘ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該標的内因性遺伝子は、成長中の植物の成長の維持にとって必須のタンパク質をコードする方法。（ＸＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該標的内因性遺伝子は、ＲｕＢｉｓＣＯ、翻訳開始因子、およびフィトエン不飽和化酵素から成る群から選択される方法。（ＸＩＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、標的内因性遺伝子は、除草剤に対する耐性を提供するタンパク質をコードする方法。（ＸＩＩＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該標的内因性遺伝子は、スルホニル尿素およびイミダゾリノン除草剤に対する抵抗性を与える突然変異体アセト乳酸シンターゼ酵素またはアリールオキシフェノキシプロピオネート除草剤に対する抵抗性を与える突然変異体ＡＣＣａｓｅをコードする方法。（ＸＩＶ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長
中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該ポリヌクレオチド組成物は、第２の標的内因性遺伝子または第２の標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する第２のポリヌクレオチドをさらに含む方法。（ＸＶ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該ポリヌクレオチド組成物はさらに第２のポリヌクレオチドを含み、該第２ポリヌクレオチドは、第２の標的内因性遺伝子または第２の標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡの１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有し、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物または植物器官における内因性ＥＰＳＰＳ遺伝子の１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一でありまたは本質的に相補的であり、該第２ポリヌクレオチドは、成長中の植物または植物器官における内因性翻訳開始因子遺伝子の１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である方法。（ＸＶＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該標的内因性遺伝子は、非コード配列、コード配列、または非コード配列およびコード配列の組み合わせである方法。（ＸＶＩＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該ポリヌクレオチド組成物は、成長中の植物の器官上にコーティングされる方法。（ＸＶＩＩＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該ポリヌクレオチド組成物は、成長中の植物の葉、茎、種子、果実、または花上にコーティングされる方法。（ＸＩＸ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該ポリヌクレオチド組成物は、標的内因性遺伝子の異なるセグメントまたはその少なくとも１つのポリヌクレオチド以外の標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する第２のポリヌクレオチドをさらに含む方法。（ＸＸ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、成長中の該植物が田畑または温室にある方法。（ＸＸＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該ポリヌクレオチドは成長中の植物の染色体の中に統合されない方法。（ＸＸＩＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該移送剤は、界面活性剤および塩から成る群から選択される方法。（ＸＸＩＩＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該移送剤は、有機シリコーン界面活性剤および塩から成る群から選択される方法。（ＸＸＩＶ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および塩から成る群から選択される方法。（ＸＸＶ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および塩から成る群から選択され、シリコーンポリエーテルコポリマーは、ポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンおよびアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルのコポリマーである方法。（ＸＸＶＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該移送剤は、界面活性剤および塩から成る群から選択され、該塩は、有機塩または無機塩である方法。（ＸＸＶＩＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該移送剤は、界面活性剤、有機アンモニウ
ム塩、および無機アンモニウム塩から成る群から選択される方法。（ＸＸＶＩＩＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該移送剤は、界面活性剤および硫酸アンモニウムから成る群から選択される方法。（ＸＸＩＸ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該移送剤は、界面活性剤および塩から成る群から選択され、湿潤剤またはキレート剤をさらに含む方法。（ＸＸＸ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該ポリヌクレオチド組成物は、噴霧装置によって成長中の植物または植物器官上にコーティングされる方法。（ＸＸＸＩ）成長中の植物または植物器官において標的内因性遺伝子の発現を調節するための方法であって、成長中の植物または植物器官上に、標的内因性遺伝子または標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤から成るポリヌクレオチド組成物を局所的にコーティングし、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的内因性遺伝子の発現を調節することを含み、該ポリヌクレオチドは、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、およびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドから成る群から選択される方法。（ＸＸＸＩＩ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化する方法。（ＸＸＸＩＩＩ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該内因性遺伝子は、除草剤標的遺伝子または除草剤非活性化遺伝子であるタンパク質を発現させる方法。（ＸＸＸＩＶ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該内因性遺伝子は、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−アミノ安息香酸シンターゼ、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、グルホシネート耐性グルタミンシンターゼ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５‐リン酸（ＤＯＸＰ）シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）シンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、シトクロムＰ４５０、セルロースシンターゼ、ベータチューブリン、およびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼから成る群から選択される除草剤標的遺伝子または除草剤非活性化遺伝子であるタンパク質を発現させる方法。（ＸＸＸＶ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該ポリヌクレオチド組成物および除草剤は、別々にまたは同じ溶液において適用される方法。（ＸＸＸＶＩ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該ポリヌクレオチドは、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、およびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドから成る群から選択される方法。（ＸＸＸＶＩＩ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該ポリヌクレオチド組成物は、標的内因性遺伝子の異なるセグメントまたはその少なくとも１つのポリヌクレオチド以外の標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する第２のポリヌクレオチドをさらに含む方法。（ＸＸＸＶＩＩＩ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該ポリヌクレオチド組成物は、それぞれ、標的内因性遺伝子の異なるセグメントまたはその少なくとも１つのポリヌクレオチド以外の標的内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡにおける１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補
的である配列を有する複数のポリヌクレオチドをさらに含む方法。（ＸＸＸＩＸ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該移送剤は、界面活性剤および塩から成る群から選択される方法。（ＸＬ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該移送剤は、有機シリコーン界面活性剤および塩から成る群から選択される方法。（ＸＬＩ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および塩から成る群から選択される方法。（ＸＬＩＩ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および塩から成る群から選択され、シリコーンポリエーテルコポリマーは、ポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンおよびアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルのコポリマーである方法。（ＸＬＩＩＩ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該移送剤は、界面活性剤および塩から成る群から選択され、塩は、有機塩または無機塩である方法。（ＸＬＩＶ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該移送剤は、界面活性剤、有機アンモニウム塩、および無機アンモニウム塩から成る群から選択される方法。（ＸＬＶ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、該移送剤は、界面活性剤および硫酸アンモニウムから成る群から選択される方法。（ＸＬＶＩ）成長中の植物において除草剤の活性を強化するための方法であって、（ａ）植物の内因性遺伝子における１８以上の連続するヌクレオチドの配列と本質的に相補的である１８以上の連続するヌクレオチドの配列と本質的に同一であるまたは本質的に相補的である配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該内因性遺伝子は、除草剤と相互作用するタンパク質を発現させる少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが成長中の植物の内部に浸透するのを可能にするための有効量の移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を成長中の植物の表面上に局所的にコーティングすることならびに（ｂ）成長中の植物に対して除草剤を適用することを含み、それによって、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、成長中の植物の内部に浸透し、内因性遺伝子の抑制を誘発し、それによって、成長中の植物における除草剤の活性を強化し、移送剤は、界面活性剤および塩から成る群から選択され、該移送剤は、湿潤剤またはキレート剤をさらに含む方法。（ＸＬＶＩＩ）液体において、界面活性剤および少なくとも１つの植物致死剤を含む、成長中の植物の外面上への局所的なコーティングに適した除草剤組成物であって、該植物致死剤は、植物遺伝子の配列または植物遺伝子の転写ＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、植物遺伝子についてのプローブにハイブリダイズする低分子ＲＮＡの浸透移行性の産生を達成する改善物である。（ＸＬＶＩＩＩ）液体において、非ポリヌクレオチド除草剤を含む除草剤組成物であって、該組成物は、植物遺伝子の配列または植物遺伝子の転写ＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有するポリヌクレオチドをさらに含む改善物である。（ＸＬＩＸ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物。（Ｌ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成り、該移送剤は、界面活性剤および塩から成る群から選択される組成物。（ＬＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成り、該移送剤は、有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択される組成物。（ＬＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成り、移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択される組成物。（ＬＩＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的であ
る配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成り、移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択され、シリコーンポリエーテルコポリマーは、ポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンおよびアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルのコポリマー（Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ−７７界面活性剤として入手可能）である組成物。（ＬＩＶ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）非ポリヌクレオチド除草剤分子をさらに含む、植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物。（ＬＶ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、植物遺伝子は、除草剤耐性を提供するタンパク質をコードし、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−アミノ安息香酸シンターゼ、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、グルホシネート耐性グルタミンシンターゼ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５‐リン酸（ＤＯＸＰ）シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）シンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、シトクロムＰ４５０、セルロースシンターゼ、ベータチューブリン、またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼである組成物。（ＬＶＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物。（ＬＶＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、界面活性剤および塩から成る群から選択される組成物。（ＬＶＩＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択される組成物。（ＬＩＸ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択される組成物。（ＬＸ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択され、シリコーンポリエーテルコポリマーは、ポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンおよびアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルのコポリマー（Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ−７７界面活性剤として入手可能）である組成物。（ＬＸＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）非ポリヌクレオチド除草剤分子をさらに含む、植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物。（ＬＸＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、植物遺伝子は、除草剤耐性を提供するタンパク質をコードし、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−アミノ安息香酸シンターゼ、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、グルホシネート耐性グルタミンシンターゼ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５‐リン酸（ＤＯＸＰ）シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）シンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、シトクロムＰ４５０、セルロースシンターゼ、ベータチューブリン、またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼである組成物。（ＬＸＩＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物。（ＬＸＩＶ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、界面活性剤および塩から成る群から選択される組成物。（ＬＸＶ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択される組成物。（ＬＸＶＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択される組成物。（ＬＸＶＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの
溶液であって、該二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択され、シリコーンポリエーテルコポリマーは、ポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンおよびアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルのコポリマー（Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ−７７界面活性剤として入手可能）である組成物。（ＬＸＶＩＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）非ポリヌクレオチド除草剤分子をさらに含む、植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物。（ＬＸＩＸ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、植物遺伝子は、除草剤耐性を提供するタンパク質をコードし、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−アミノ安息香酸シンターゼ、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、グルホシネート耐性グルタミンシンターゼ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５‐リン酸（ＤＯＸＰ）シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）シンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、シトクロムＰ４５０、セルロースシンターゼ、ベータチューブリン、またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼである組成物。（ＬＸＸ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物。（ＬＸＸＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、界面活性剤および塩から成る群から選択される組成物。（ＬＸＸＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択される組成物。（ＬＸＸＩＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択される組成物。（ＬＸＸＩＶ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択され、シリコーンポリエーテルコポリマーは、ポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンおよびアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルのコポリマー（Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ−７７界面活性剤として入手可能）である組成物。（ＬＸＸＶ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）非ポリヌクレオチド除草剤分子をさらに含む、植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物。（ＬＸＸＶＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、植物遺伝子は、除草剤耐性を提供するタンパク質をコードし、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−アミノ安息香酸シンターゼ、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、グルホシネート耐性グルタミンシンターゼ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５‐リン酸（ＤＯＸＰ）シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）シンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、シトクロムＰ４５０、セルロースシンターゼ、ベータチューブリン、またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼである組成物。（ＬＸＸＶＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物。（ＬＸＸＶＩＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、界面活性剤および塩から成る群から選択される組成物。（ＬＸＸＩＸ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択される組成物。（ＬＸＸＸ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機
シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択される組成物。（ＬＸＸＸＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、該移送剤は、シリコーンポリエーテルコポリマー有機シリコーン界面活性剤および無機塩から成る群から選択され、シリコーンポリエーテルコポリマーは、ポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンおよびアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルのコポリマー（Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ−７７界面活性剤として入手可能）である組成物。（ＬＸＸＸＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）非ポリヌクレオチド除草剤分子をさらに含む、植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物。（ＬＸＸＸＩＩＩ）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるまたは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物であって、植物遺伝子は、除草剤耐性を提供するタンパク質をコードし、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−アミノ安息香酸シンターゼ、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、グルホシネート耐性グルタミンシンターゼ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５‐リン酸（ＤＯＸＰ）シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）シンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、シトクロムＰ４５０、セルロースシンターゼ、ベータチューブリン、またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼである組成物。（ＬＸＸＸＩＶ）除草剤抵抗性作物植物の畑において、成長中の標的除草剤抵抗性自生植物を選択的に制御するための方法であって、（ｉ）自生植物の成長または生命の維持にとって必須遺伝子である、（ｉｉ）自生植物に対して除草剤抵抗性を提供するタンパク質をコードする、または（ｉｉｉ）ＲＮＡ調節剤に転写される内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡに、自生植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる浸透移行性一本鎖ＲＮＡを自生植物の細胞中に提供するポリヌクレオチドオリゴマーを含む組成物を自生植物の葉上に適用することを含む方法。（ＬＸＸＸＶ）除草剤抵抗性作物植物の畑において、成長中の標的除草剤抵抗性自生植物を選択的に制御するための方法であって、（ｉ）自生植物の成長または生命の維持にとって必須遺伝子である、（ｉｉ）自生植物に対して除草剤抵抗性を提供するタンパク質をコードする、または（ｉｉｉ）ＲＮＡ調節剤に転写される内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡに、自生植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる浸透移行性の一本鎖ＲＮＡを自生植物の細胞中に提供するポリヌクレオチドオリゴマーを含む組成物を自生植物の葉上に適用することを含み、該組成物は、界面活性剤ならびに一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、および二本鎖ハイブリダイズＲＮＡ／ＤＮＡから成る群から選択されるオリゴマーを含み、オリゴマーは、内因性遺伝子のメッセンジャーＲＮＡと本質的に同一であるまたは相補的である配列を有し、内因性遺伝子は、天然の遺伝子または組換え導入遺伝子である方法。（ＬＸＸＸＶＩ）除草剤抵抗性作物植物の畑において、成長中の標的除草剤抵抗性自生植物を選択的に制御するための方法であって、（ｉ）自生植物の成長または生命の維持にとって必須遺伝子である、（ｉｉ）自生植物に対して除草剤抵抗性を提供するタンパク質をコードする、または（ｉｉｉ）ＲＮＡ調節剤に転写される内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡに、自生植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる浸透移行性の一本鎖ＲＮＡを自生植物の細胞中に提供するポリヌクレオチドオリゴマーを含む組成物を自生植物の葉上に適用することを含み、該自生植物は、アカザ、ベルベットリーフ、ウォーターヘンプ、プリックリーレタス、タンポポ、アルファルファ、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ、ワタ、サトウダイコン、サトウキビ、コムギ、イネ、または野菜である方法。（ＬＸＸＸＶＩＩ）除草剤抵抗性作物植物の畑において、成長中の標的除草剤抵抗性自生植物を選択的に制御するための方法であって、（ｉ）自生植物の成長または生命の維持にとって必須遺伝子である、（ｉｉ）自生植物に対して除草剤抵抗性を提供するタンパク質をコードする、または（ｉｉｉ）ＲＮＡ調節剤に転写される内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡに、自生植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる浸透移行性の一本鎖ＲＮＡを自生植物の細胞中に提供するポリヌクレオチドオリゴマーを含む組成物を自生植物の葉上に適用することを含み、該作物植物は、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、アブラナ、サトウダイコン、アルファルファ、サトウキビ、イネ、コムギ、または果実もしくは野菜作物である方法。（ＬＸＸＸＶＩＩＩ）除草剤抵抗性作物植物の畑において、成長中の標的除草剤抵抗性自生植物を選択的に制御するための方法であって、（ｉ）自生植物の成長または生命の維持にとって必須遺伝子である、（ｉｉ）自生植物に対して除草剤抵抗性を提供するタンパク質をコードする、または（ｉｉｉ）ＲＮＡ調節剤に転写される内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡに、自生植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる浸透移行性の一本鎖ＲＮＡを自生植物の細胞中に提供するポリヌクレオチドオリゴマーを含む組成物を自生植物の葉上に適用することを含み、該内因性遺伝子は、自生植物に対して除草剤抵抗性を提供するタンパク質をコードし、タンパク質は、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−アミノ安息香酸シンターゼ、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、グルホシネート耐性グルタミンシンターゼ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５‐リン酸（ＤＯＸＰ）シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）シンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、シトクロムＰ４５０、セルロースシンターゼ、ベータチューブリン、またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼである方法。（ＬＸＸＸＩＸ）除草剤抵抗性作物植物の畑において、成長中の標的除草剤抵抗性自生植物を選択的に制御するための方法であって、（ｉ）自生植物の成長または生命の維持にとって必須遺伝子である、（ｉｉ）自生植物に対して除草剤抵抗性を提供するタンパク質をコードする、または（ｉｉｉ）ＲＮＡ調節剤に転写される内因性遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡに、自生植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる浸透移行性の一本鎖ＲＮＡを自生植物の細胞中に提供するポリヌクレオチドオリゴマーを含む組成物を自生植物の葉上に適用することを含み、該内因性遺伝子は、自生植物に対して除草剤抵抗性を提供するタンパク質をコードし、タンパク質は、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−アミノ安息香酸シンターゼ、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、グルホシネート耐性グルタミンシンターゼ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５‐リン酸（ＤＯＸＰ）シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）シンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、シトクロムＰ４５０、セルロースシンターゼ、ベータチューブリン、またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼであり、タンパク質が抵抗性を提供する対象の除草剤を一定量、自生植物に対して適用することをさらに含む方法。（ＸＣ）植物における内因性標的遺伝子を調整することによって、逆遺伝学を調査するための方法であって、（１）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（２）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（３）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖
ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（４）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（５）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物を成長中の植物の組織上に適用することを含む方法。（ＸＣＩ）植物における内因性標的遺伝子を調整することによって、逆遺伝学を調査するための方法であって、（１）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（２）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（３）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（４）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（５）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物を成長中の植物の組織上に適用することを含み、該組成物は、植物の生存の間の少なくとも１週間の期間の間に標的遺伝子の修飾を達成する方法。（ＸＣＩＩ）植物における内因性標的遺伝子を調整することによって、逆遺伝学を調査するための方法であって、（１）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（２）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（３）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（４）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（５）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物を成長中の植物の組織上に適用することを含み、該細胞において転写されるＲＮＡは、タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡまたは調節ＲＮＡである方法。（ＸＣＩＩＩ）植物における内因性標的遺伝子を調整することによって、逆遺伝学を調査するための方法であって、（１）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（２）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（３）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（４）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（５）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物を成長中の植物の組織上に適用することを含み、除草剤相互作用を同定するために一連の化合物に植物を暴露することをさらに含む方法。（ＸＣIV）植物における内因性遺伝子を調整することによって、逆遺伝学を調査するための方法であって、（１）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該
二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（２）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（３）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（４）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの溶液であって、該一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物または（５）（ａ）植物の内因性遺伝子の配列もしくは内因性遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一であるもしくは相補的である配列を有する転写不可二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの溶液であって、該二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のサイレンシングを達成するために内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡに、植物の細胞における生理学的条件下でハイブリダイズすることができる溶液および（ｂ）植物の表面から細胞の中へ二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチド移送を促進するのに有効な移送剤から本質的に成る組成物を生きている植物の組織上に局所的に適用することを含む方法。（ＸＣＶ）（ａ）ポリヌクレオチドオリゴマー浸透に対する植物コンディショニング剤および（ｂ）アンチセンスまたはセンス配向のいずれかで、植物の内因性遺伝子の１８以上の連続するヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖を含むポリヌクレオチドオリゴマーの水溶液を含む除草剤組成物であって、該内因性遺伝子は、化学的除草剤に対する抵抗性を植物に提供するタンパク質をコードするまたは必須遺伝子である除草剤組成物。（ＸＣＶＩ）（ａ）ポリヌクレオチドオリゴマー浸透に対する植物コンディショニング剤および（ｂ）アンチセンスまたはセンス配向のいずれかで、植物の内因性遺伝子の１８以上の連続するヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖を含むポリヌクレオチドオリゴマーの水溶液を含む除草剤組成物であって、該内因性遺伝子は、化学的除草剤に対する抵抗性を植物に提供するタンパク質をコードしまたは必須遺伝子であり、化学的除草剤をさらに含む除草剤組成物。（ＸＣＶＩＩ）（ａ）ポリヌクレオチドオリゴマー浸透に対する植物コンディショニング剤および（ｂ）アンチセンスまたはセンス配向のいずれかで、植物の内因性遺伝子の１８以上の連続するヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖を含むポリヌクレオチドオリゴマーの水溶液を含む除草剤組成物であって、該内因性遺伝子は、化学的除草剤に対する抵抗性を植物に提供するタンパク質をコードしまたは必須遺伝子であり、グリホサート、ジカンバ、ホスフィノトリシン、ブロモキシニル、イオキシニル、またはクロルスルフロン除草剤化合物を含む化学的除草剤をさらに含む除草剤組成物。（ＸＣＶＩＩＩ）（ａ）ポリヌクレオチドオリゴマー浸透に対する植物コンディショニング剤および（ｂ）アンチセンスまたはセンス配向のいずれかで、植物の内因性遺伝子の１８以上の連続するヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖を含むポリヌクレオチドオリゴマーの水溶液を含む除草剤組成物であって、該内因性遺伝子は、化学的除草剤に対する抵抗性を植物に提供するタンパク質をコードしまたは必須遺伝子であり、グリホサート化合物、シリコーンポリエーテルコポリマー界面活性剤、およびポリヌクレオチドオリゴマーを含む化学的除草剤をさらに含む除草剤組成物。（ＸＣＩＸ）内因性遺伝子を抑制するための外因性ＤＮＡまたはＲＮＡを含む植物であって、該外因性ＤＮＡは、植物の染色体の中に統合されず、該外因性ＲＮＡは、植物の染色体の中に統合されるＤＮＡから転写されず、該内因性遺伝子は、植物が種子から発生した後に、植物へのポリヌクレオチドの局所的な適用によって抑制される植物。（Ｃ）植物細胞の外面へポリヌクレオチドを局所的に適用することにより植物細胞の内部にポリヌクレオチドを送達するための方法であって、有機シリコーン界面活性剤とポリヌクレオチドを組み合わせることを含む方法。（ＣＩ）植物細胞の外面へポリヌクレオチドを局所的に適用することにより植物細胞の内部にポリヌクレオチドを送達するための方法であって、有機シリコーン界面活性剤とポリヌクレオチドを組み合わせることを含み、有機シリコーン界面活性剤は、シリコーンポリエーテルコポリマーである方法。（ＣＩＩ）植物細胞の外面へポリヌクレオチドを局所的に適用することにより植物細胞の内部にポリヌクレオチドを送達するための方法であって、有機シリコーン界面活性剤とポリヌクレオチドを組み合わせることを含み、該有機シリコーン界面活性剤は、シリコーンポリエーテルコポリマーであり、シリコーンポリエーテルコポリマーは、ポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンおよびアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルのコポリマーである方法。（ＣＩＩＩ）植物細胞の外面へポリヌクレオチドを局所的に適用することにより植物細胞の内部にポリヌクレオチドを送達するための方法であって、有機シリコーン界面活性剤および有機または無機塩とポリヌクレオチドを組み合わせることを含む方法。（ＣＩＶ）植物細胞の外面へポリヌクレオチドを局所的に適用することにより植物細胞の内部にポリヌクレオチドを送達するための方法であって、有機シリコーン界面活性剤および有機または無機塩とポリヌクレオチドを組み合わせることを含み、該塩はアンモニウム塩である方法。（ＣＶ）植物細胞の外面へポリヌクレオチドを局所的に適用することにより植物細胞の内部にポリヌクレオチドを送達するための方法であって、有機シリコーン界面活性剤および有機または無機塩とポリヌクレオチドを組み合わせることを含み、該塩はアンモニウム塩であり、該アンモニウム塩は硫酸アンモニウムである方法。（ＣＶＩ）植物細胞の外面へポリヌクレオチドを局所的に適用することにより植物細胞の内部にポリヌクレオチドを送達するための方法であって、有機シリコーン界面活性剤とポリヌクレオチドを組み合わせることを含み、該ポリヌクレオチド組成物は、噴霧装置によって成長中の植物または植物器官上にコーティングされる方法。
実施例１
本実施例は、除草剤耐性雑草の制御における本発明のポリヌクレオチド分子の有用性を説明する。グリホサート耐性パルマーアマランス（の遺伝子型は、除草剤処理においてグリホサート化合物により標的とされる５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子の例えば４−１００コピーを超える複数コピーを有すると同定された。
図１に示される配列番号１に関して、４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ｄｓＲＮＡ分子は、図１の下線付きのヌクレオチドに示される、位置１４−３８（短いｄｓＲＮＡ-１）、位置１５３−１７７（短いｄｓＲＮＡ-２）、３４５−３６９（短いｄｓＲＮＡ-３）および１１０５−１１２９（短いｄｓＲＮＡ-４）のパルマーアマランスＥＰＳＰＳ遺伝子から転写されるｍＲＮＡにハイブリダイズ可能なアンチセンス鎖と設計した。４つの設計された短いｄｓＲＮＡは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＩＤＴ）から購入した；ｄｓＲＮＡはアンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドの突出を有し、センス鎖の３’末端に末端ヌクレオチドとして２つのデオキシヌクレオチドを有した。
配列番号１および図１に関して、３つの「長い」二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドは、図１の太字のヌクレオチドに示される、位置１６−１７０（長いｄｓＲＮＡ-１）、４５１−７２２（長いｄｓＲＮＡ-２）および１１０９−１３２８（長いｄｓＲＮＡ-３）のパルマーアマランスＥＰＳＰＳ遺伝子から転写されるｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な１つの鎖と設計した。３つの設計された長いｄｓＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉキット、Ｃａｔ． Ｎｏ． １６２６を用いて作製された。
ＥＰＳＰＳをコードする１６コピーの内在性遺伝子を有するグリホサート耐性パルマーアマランスの植物性のクローン（Ｇａｉｎｅｓ、 ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０７（３）：１０２９-１０３４）を、３．５ｋｇ／立方メートルのＯｓｍｏｃｏｔｅ（登録商標）１４-１４-１４成長促進剤を含むＳｕｎＧｒｏ（登録商標）Ｒｅｄｉ-ｅａｒｔｈ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｍｉｘを含む３．５平方インチのポットで、温室の中で、明期１４時間および日中温度摂氏３０度ならびに夜間温度摂氏２０度で栽培した；必要に応じて植物に脱イオン化水を与えた。
葉の浸漬用の前処理界面活性剤溶液を、Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７ブランド有機シリコン界面活性剤を蒸留水で０．１％（ｖ／ｖ）に希釈することにより調製した。前処理５％（ｗ／ｖ）カーボランダム溶液を、２ｇのカーボランダム（４００グリット）を４０ｍｌの蒸留水に混合することにより調整した。処理緩衝液を、ＤＥＰＣ水（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ-Ｔｅｋ）中、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．０１％（ｖ／ｖ）Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７有機シリコン界面活性剤で調製し、ｐＨ６．８に調整した。短いｄｓＲＮＡ溶液を、４つの短いｄｓＲＮＡ（上記に同定した）の各々を当モル量、処理緩衝液中、１マイクロリットルあたり短いｄｓＲＮＡを各々０．００５ナノモルの濃度で調整した。長いｄｓＲＮＡ溶液を、３つの長いｄｓＲＮＡの各々を当モル量、処理緩衝液中、１マイクロリットルあたり長いｄｓＲＮＡを各々０．０００６ナノモルの濃度で調整した。混合（短い／長い）ｄｓＲＮＡ溶液を１マイクロリットルあたり４つの短いｄｓＲＮＡの各々を０．００５ナノモルおよび３つの長いｄｓＲＮＡの各々を０．０００６ナノモルで調製した。
ｄｓＲＮＡ移送または浸透用の葉のコンディショニングのため、ＥＰＳＰＳをコードする１６コピーの内在性遺伝子を有するグリホサート耐性パルマーアマランスの植物性のクローンをカーボランダム溶液または界面活性剤溶液で前処理した。カーボランダム溶液について、前処理の葉の剥離は、葉の上面の０．５ｍｌのカーボランダム溶液を優しく擦りつけ、水で洗い流し、拭きとり乾燥させることで達成された。界面活性剤溶液前処理ついて、４つの完全に開いた成熟源の葉を界面活性剤溶液に浸漬し、乾燥させた。カーボランダム溶液または界面活性剤溶液による葉の前処理の後、条件付けられた葉を、緩衝液（対照として）または４０マイクロリットルのｄｓＲＮＡ溶液（一植物あたり４枚の各葉に１０マイクロリットルのｄｓＲＮＡ溶液を適用）で処理した。短いｄｓＲＮＡ溶液での処理は、約０．８ナノモルの短いｄｓＲＮＡ分子（各０．２ナノモルの短いｄｓＲＮＡ）を各々処理された植物に適用した。長いｄｓＲＮＡ溶液での処理は、約０．０７２ナノモルの長いｄｓＲＮＡ分子（各０．０２４ナノモルの長いｄｓＲＮＡ）を各々処理された植物に適用した。混合（短い／長い）ｄｓＲＮＡ溶液での処理は、約０．８ナノモルの短いｄｓＲＮＡ分子および約０．０７２ナノモルの長いｄｓＲＮＡ分子を各々の処理された植物に適用した。対照以外は、ｄｓＲＮＡ処理の直後、４８時間後または７２時間後に、すべての植物にグリホサート除草剤溶液（１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）を噴霧し、グリホサート処理後少なくとも７日後に評価した。
（結果）
６つの界面活性剤処理された対照植物（ｄｓＲＮＡ分子未処理）はグリホサート処理に生存した。グリホサート処理後７日目の植物の写真については図３Ａを参照。
４つのカーボランダム研磨剤処理された対照植物（ｄｓＲＮＡ分子未処理）のうち２つは、グリホサート処理により枯れた。
混合（短い／長い）ｄｓＲＮＡ溶液適用直後にグリホサート処理された６つの界面活性剤処理された植物は生存したが成長が阻害された。
混合（短い／長い）ｄｓＲＮＡ溶液でのみ処理した、グリホサート未処理の６つの界面活性剤処理された植物は生存した。混合（短い／長い）ｄｓＲＮＡ溶液で処理され続いてグリホサート処理された６つの界面活性剤処理された植物のうち５つは枯れた。
混合（短い／長い）ｄｓＲＮＡ溶液の適用後４８時間にグリホサート処理された６つの界面活性剤処理された植物のうち５つは枯れた。
混合（短い／長い）ｄｓＲＮＡ溶液の適用後４８時間でグリホサート処理された４つのカーボランダム処理された植物のうち３つは枯れた。
長いｄｓＲＮＡ溶液で処理され、続いて７２時間後グリホサート処理された６つの界面活性剤処理された植物のうち５つは枯れた；図３Ｂを参照。短いｄｓＲＮＡ溶液で処理され、続いて７２時間後グリホサート処理された６つの界面活性剤処理された植物のうち６つは枯れた；図３Ｃを参照。
実施例２
本実施例は、グリホサート除草剤感受性雑草の制御の改良ための本発明のポリヌクレオチド分子の有用性を説明する。実施例１で調整された混合（短い／長い）ｄｓＲＮＡ溶液を、実施例１で使用された界面活性剤溶液で前処理されたグリホサート感受性のベルベットリーフ植物（２枚の葉に全量４０マイクロリットルを適用）に適用した。対照植物を界面活性剤溶液で前処理後、緩衝液のみで処理した。ｄｓＲＮＡ処理４８時間後、植物を、グリホサート除草剤溶液（１ヘクタールあたり５３ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド グリホサート除草剤）で処理した。植物の成長の観察（植物の背丈で測定された）により推定される時、緩衝液および除草剤で処理された対照植物と比較して、ポリヌクレオチド組成物および除草剤で処理された植物でグリホサート活性の２倍の上昇が観察された。ポリヌクレオチド組成物および除草剤で処理された植物は、深刻な成長阻害の状態で生存した；緩衝液および除草剤で処理された対照植物は、生存し、完全に回復した。同様の結果が、他のグリホサート除草剤感受性の雑草、つまり、グリホサート除草剤感受性のウォーターヘンプ（ｗａｔｅｒｈｅｍｐ）、アオビユ、オオブタクサ、トゲチシャ、タバコ、およびタンポポで得られた。
実施例３
本実施例は、トランスジェニックグリホサート耐性作物中の雑草を制御するための、本発明のポリヌクレオチド分子の有用性を説明する。細菌性のＥＰＳＰＳ（グリホサート耐性「クラスＩＩ」ＥＰＳＰＳ遺伝子の説明のために米国特許第ＲＥ３９，２４７号を参照）を発現する組み換えＤＮＡを有するトランスジェニックアルファルファ、キャノーラ、トウモロコシ、ワタ、米、大豆、サトウキビ、サトウダイコン、および小麦の植物を、（ａ）実施例１で使用された界面活性剤溶液、（ｂ）実施例１で調整された混合（短い／長い）ｄｓＲＮＡ溶液、および（ｃ）ｄｓＲＮＡ処理後４８時間にグリホサート除草剤溶液（１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標））で処理した。３０日後、すべてのトランスジェニックグリホサート耐性作物は生存し、成長阻害を示さない。
実施例４
本実施例は、本発明のポリヌクレオチド分子の除草剤除草剤としての有用性を説明する。２つのｄｓＲＮＡポリヌクレオチド分子を、タバコ（ベンサミアナタバコ）のフィトエン不飽和化酵素をコードするｍＲＮＡの重複断片を標的とするように設計した。配列番号２および図５に関して、ｍＲＮＡの１９２ｎｔ長（図５に太字で示される）および６８５ｎｔ長（図５に下線で示される）を標的とするｄｓＲＮＡを、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）キットを用いて作製した。別々のｄｓＲＮＡ溶液を調製した。タバコ植物の葉を実施例１で調整された界面活性剤溶液で前処理し、その後、一植物あたり約０．６マイクロモルのｄｓＲＮＡを適用してｄｓＲＮＡ溶液のいずれか一つで処理した。ｄｓＲＮＡ処理後９日目に、フィトエン不飽和化酵素サイレンシングは、葉の先端における目に見える葉の退色から明らかであった；図４参照。ｄｓＲＮＡでの処理後１５日目に、処理した植物の半分は枯れているように見え、植物の残りの半分は地上組織のほとんどが退色していた。ノザンブロット分析により、処理に使用されたｄｓＲＮＡに対応するｓｉＲＮＡの存在が示される。
実施例５
本実施例はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子の除草性薬剤としての有用性を説明する。ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチド分子を以下の各植物のＥＰＳＰＳをコードするＲＮＡを標的とするように設計する。すなわち、ブタクサ（アンブロシア・アルテミシフォリア（Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ））、オオブタクサ（アンブロシア・トリフィダ（Ａｍｂｒｏｓｉａ ｔｒｉｆｉｄａ））、ジョンソングラス（ソルガム・ハルペンス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ））、アレチノギク（コニザ・ボナリエンシス（Ｃｏｎｚｙａ ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ））、サワーグラス（ジギタリア・インスラリス（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ ｉｎｓｕｌａｒｉｓ））、リバーシードグラス（ウロコロア・パニコイデス（Ｕｒｏｃｈｌｏａ ｐａｎｉｃｏｉｄｅｓ））、トウダイグサ（エウフォルビア・へテロフィラ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ））、ワセビエ（エキノクロア・コロナ（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｃｏｌｏｎａ））、シロザ（ケノポディウム・アルバム（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ））、エノコログサ（セタリア・ヴィリディス（ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ））、アワ（セタリア・イタリック（ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃ））、イヌビエ（エキノコロア・クルス-ガリ（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｃｒｕｓ-ｇａｌｌｉ））、メヒシバ（ジギタリア・サンギナリス（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ ｓａｎｇｕｉｎａｌｉｓ））、オナモミ（キサンチウム・ストルマリウム（Ｘａｎｔｈｉｕｍ ｓｔｒｕｍａｒｉｕｍ））、ノスズメノテッポウ（アロペクラス・ミオスロイデス（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ ｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ））、カラスムギ（アベナ・ファツア（Ａｖｅｎａ ｆａｔｕａ））、エビスグサ（センナ・オブツシフォリア（Ｓｅｎｎａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ））、アサガオ（イポメア種（Ｉｐｏｍｏｅａ ｓｐ．））、セイヨウヒルガオ（コンボルブルス・アルベンシス（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ ａｒｖｅｎｓｉｓ））、モロコシ（ソルガム・ビコロル（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ））、ツユクサ（コメリナ（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ））、ムラサキツユクサ（トラデスカンチア種（Ｔｒａｄｅｓｃａｎｔｉａ ｓｐ．））、ドクムギ（ロリウム種（Ｌｏｌｉｕｍ ｓｐ．））、オヒシバ（エレウシネ・インディカ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｉｎｄｉｃａ））、ヒメムカシヨモギ（コニザ・カナデンシス（Ｃｏｎｚｙａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ））、ヘラオオバコ（プランタゴ・ランセオラータ（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ））、オオホナガアオゲイトウ（アマランサス・パルメリ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ））、ヒユモドキ（アマランサス・ツバキュラタス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ））、ヒメシロビユ（アマランサス・アルブス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ａｌｂｕｓ））、ホソアオゲイトウ（アマランサス・ハイブリダス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｈｙｂｒｉｄｕｓ））、アオビユ（アマランサス・レトロフレクサス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｒｅｔｒｏｆｌｅｘｕｓ））、ウォーターヘンプ（ｗａｔｅｒｈｅｍｐ）（アマランサス・ルディス／ツバキュラタス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｒｕｄｉｓ／ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ））、ホナガイヌビユ（アマランサス・ビリディス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｖｉｒｉｄｉｓ））、トゥーンベリのアマランス（Ｔｈｕｎｂｅｒｇ'ｓ ａｍａｒａｎｔｈ）（アマランサス・ツンベルギー（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｈｕｍｂｅｒｇｉｉ））、ハリビユ（アマランサス・スピノシス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｓｐｉｎｏｓｉｓ））、（アマランサス・ルブラ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｒｕｂｒａ））、（アマランサス・リビダス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｌｉｖｉｄｕｓ））、アメリカビユ（アマランサス・グラエキザンス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｇｒａｅｃｉｚａｎｓ））、ホナガアオゲイトウ（アマランサス・クロロスタッキス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃｈｌｏｒｏｓｔａｃｈｙｓ））、イガホビユ（アマランサス・ポーウェリー（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐｏｗｅｌｌｉｉ））、アメリカビユ・イヌヒメシロビユ（アマランサス・ブリトイデス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｂｌｉｔｏｉｄｅｓ））、ホウキギ（コチア・スコパリア（Ｋｏｃｈｉａ ｓｃｏｐａｒｉａ））、イガヤグルマギク（セントウレア・スティチアリス（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ ｓｏｌｓｔｉｔｉａｌｉｓ））、およびイチビ（アブチロン・セオフラスチ（Ａｂｕｔｉｌｏｎ ｔｈｅｏｐｈｒａｓｔｉ））である。植物の葉を実施例１のように調整された界面活性剤溶液で前処理し、一植物あたり約１ナノモルの処理で、ｄｓＲＮＡ溶液により処理した。１５日後、処理された植物は枯れている、枯れかけている、または成長が阻害される。
実施例６
本実施例はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子の除草剤としての有用性を説明する。ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチド分子を、実施例５に記載の各々の植物のアセト乳酸合成酵素およびフィトエン不飽和化酵素をコードするＲＮＡを標的とするように設計した。植物の葉を実施例１のように調整された界面活性剤溶液で前処理し、一植物あたり約１ナノモルの処理で、ｄｓＲＮＡ溶液により処理した。１５日後、処理された植物は枯れている、枯れかけている、または成長が阻害される。
実施例７
本実施例はさらに本発明のポリヌクレオチド分子の除草剤としての有用性を説明する。パルマーアマランスの以下の各々のタンパク質をコードするＲＮＡを標的とするように設計された短いｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを提供するために実施例４の方法を繰り返した。すなわち、５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ、ジヒドロプテロイン酸合成酵素、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、グルタミン合成酵素、Ｄ１タンパク質、翻訳開始因子（ＴＩＦ）、リブロース-１、５-二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）、およびＤＮＡ依存性ＡＴＰ分解酵素（ｄｄＡＴＰａｓｅ）である。別々のグリホサート耐性パルマーアマランス植物の葉を、実施例１のように調整された界面活性剤溶液で処理し、および、一植物あたり１ナノモルの処理で、実施例１の様式で、各ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチド分子を別々に用いて処理する。３０日後、処理された植物は枯れている、枯れかけている、または成長が阻害される。
実施例８
本実施例は、本発明の組成物および方法での合成Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子の使用の有用性を説明する。配列番号３および図２に関して、２コピーのＲＧＣＣＣＲ要素（太字および下線）、配列「ＴＣＣＣＡＣＡＴＣＧ」（配列番号４、太字および下線）を有する上流の配列要素（ＵＳＥ）、ＴＡＴＡボックス（太字および下線）、「Ｇ」ヌクレオチド（太字および下線）、トランスジェニックトウモロコシ植物に発現される際にグリホサート除草剤に耐性を与えるＥＰＳＰＳタンパク質（米国特許第ＲＥ３９，２４７号参照）をコードする細菌性のＤＮＡに対応するアンチセンスＤＮＡ（イタリック）、アンチセンスＤＮＡに埋め込まれた「ＡＡＧＡＴＴＡＧＣＡＣＧＧ」要素（配列番号５、太字および下線）、センスＤＮＡ（小文字）が後に続く「ＡＣＧＣＡＴＡＡＡＡＴ」要素（配列番号６、太字および下線）および「ＴＴＴＴＴＴ」終止要素（配列番号７、太字および下線）を含むｄｓＤＮＡ分子を提供するために、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６ｓｎＲＮＡ遺伝子由来の因子を使用して合成Ｐｏｌ ＩＩＩ遺伝子を作製する。０．１重量％のＳｉｌｗｅｔ Ｌ-７７ブランド有機シリコン界面活性剤溶液およびｄｓＤＮＡ分子の複数コピーの溶液を、グリホサート耐性大豆植物の畑に成長する自生のグリホサート耐性トウモロコシ植物の葉に噴霧し、続いて７日後にＲｏｕｎｄｕｐ ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランドグリホサート除草剤で処理した。１５日後、トウモロコシ植物は枯れており、大豆植物は、増殖している；界面活性剤およびグリホサート除草剤のみで処理された対照のグリホサート耐性トウモロコシ植物は増殖している。
実施例９
本実施例は本発明の一態様を説明する。本実施例では、ポリヌクレオチド分子を植物組織に適用し浸透させ、よって、浸透移行性の調節、つまり標的遺伝子（内在性のＥＰＳＰＳ）の発現抑制を誘導する。より詳細には、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドを含む組成物は、グリホサート耐性パルマーアマランス（（アマランサス・パルメリ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ））中の内在性ＥＰＳＰＳの発現を抑制した。
アンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＩＤＴＳｃｉＴｏｏｌｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／Ｓｃｉｔｏｏｌｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／Ａｎｔｉ-ｓｅｎｓｅ／Ａｎｔｉ-ｓｅｎｓｅ．ａｓｐｘより入手可能）を用いて設計した。オリゴヌクレオチドには、表１に示されるように、アマランサス・パルメリ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ）ＥＰＳＰＳにアンチセンスの４つのｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号８、９、１０、および１１）、アマランサス・パルメリ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ）ＥＰＳＰＳにアンチセンスの２つの化学的に修飾された（ホスホロチオエート修飾）ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１２および１３）、制御遺伝子にアンチセンスの制御ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、大麦（ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））種子タンパク質、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ Ｘ９７６３６（配列番号１４）、およびアマランサス・パルメリ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ）ＥＰＳＰＳにアンチセンスの化学的に修飾された（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８での５’-標識化された）ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１５）が含まれる。
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オリゴヌクレオチドの取り込みを、蛍光標識されたｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１５）で実証し、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの葉の組織への浸透を確認した。グリホサート耐性パルマーアマランスの分離した葉の葉柄を蛍光標識されたｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１５）を含む２００ｍＭショ糖溶液に入れた。葉の画像を、葉柄を通じた取り込み後４時間から最大４８時間まで、４８８ｎｍのレーザーを装備したＢｉｏ-Ｒａｄ ＰｈａｒｏｓＦＸ ｉｍａｇｅｒで撮った。２００ｍＭショ糖のみでインキュベーションされた葉を対照とした。蛍光標識されたｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドのわずかに時間依存的な維管束への取り込みが観察された（図６参照）。蛍光標識されたｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、処理後早くも８時間で、維管束の組織から細胞へ放出され、２４時間と４８時間で、葉の端での蓄積が確認され、蒸散効果が示唆された。
ＥＰＳＰＳ抑制をグリホサート耐性パルマーアマランスのつんだ葉で葉柄取り込み技術を使用して実証した。グリホサート耐性パルマーアマランスのつんだ葉の葉柄を、表２に記載の処理に従って、オリゴヌクレオチドを含む２００ｍＭショ糖溶液に入れた。対照の葉をアンチセンスコントロール（配列番号１４）で浸透させ、さらに５０マイクログラム／ｍＬのグリホサートと共に、またはなしで処理した。ＥＰＳＰＳ ｍＲＮＡ、ＥＰＳＰＳタンパク質およびシキミ酸レベルを４８時間のインキュベーションの後、測定した。ＥＰＳＰＳ ｍＲＮＡに対するアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、葉の全ＲＮＡを単離し、ＥＰＳＰＳｍＲＮＡレベルを比較するために定量的リアルタイムＲＴ-ＰＣＲを実施した。ＥＰＳＰＳタンパク質に対するアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、葉の全可溶性タンパク質を単離し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離し、ＥＰＳＰＳタンパク質のレベルをトウモロコシＥＰＳＰＳ＿ＴＩＰＡに対する抗体を用いたウエスタンブロットにより測定した。ＥＰＳＰＳ抑制の指標として、シキミ酸蓄積に対するアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの効果を２つの実験で評価した：実験１では、オリゴヌクレオチド処理された葉を、さらに４８時間、葉柄取り込みにより５０マイクログラム／ｍＬのグリホサートとインキュベーションした（対照の葉はアンチセンスコントロール（配列番号１４）を浸透させ、さらに、５０マイクログラム／ｍＬのグリホサートと共にまたはなしで処理された）；実験２では、リーフディスクアッセイをオリゴヌクレオチド処理された葉に実施し、シキミ酸レベルをＨＰＬＣで測定した（この場合の対照は、オリゴヌクレオチドで処理されないが、５０マイクログラム／ｍＬのグリホサートと共にインキュベーションされた葉である）。
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ＥＰＳＰＳ ｍＲＮＡの発現、ＥＰＳＰＳタンパク質レベルおよびシキミ酸レベルの結果を、各々、図７、８および９に示す。これらの結果は、アンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドでの処理が、標的遺伝子の転写（ＥＰＳＰＳ ｍＲＮＡ）または植物組織の標的遺伝子によりコード化されるタンパク質（ＥＰＳＰＳ）のレベルの減少により、浸透移行的に標的遺伝子を調節または抑制することを実証した。この特定の実験において、処理＃１および＃６は、シキミ酸蓄積の増加により明らかなように、ＥＰＳＰＳ ｍＲＮＡならびにタンパク質のレベルの抑制およびグリホサートの有効性を上げることにさらに効果的なようであった。これらの結果はまた、グリホサート耐性パルマーアマランスのＥＰＳＰＳ ｍＲＮＡおよびタンパク質の抑制により、グリホサートの有効性が改良されたことも示す。
実施例１０
本実施例は本発明の一態様を説明する。本実施例において、（ａ）ポリヌクレオチド浸透のための植物用コンディショニング剤および（ｂ）アンチセンスまたはセンス配向のいずれかで標的遺伝子の１８以上の連続するヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖を含むポリヌクレオチドを含む、植物の標的遺伝子の浸透移行性サイレンシングを誘導するための組成物を成長期植物に局所的に適用して処理した。さらに詳細には、タバコ（ベンサミアナタバコ）植物を、（ａ）ポリヌクレオチド浸透に対し植物をコンディショニングするために局所的に適用される界面活性剤溶液、および（ｂ）アンチセンスまたはセンス配向のいずれかで標的遺伝子の１８以上の連続するヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを含む少なくとも１つの鎖を有する局所的に適用されるＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物で処理し、それにより標的遺伝子（フィトエン不飽和化酵素、「ＰＤＳ」）の浸透移行性の調節または抑制が達成された。
使用した標的遺伝子は、図１０に示されるように、ニコチナ・ベンタミアナ（ベンサミアナタバコ）のフィトエン不飽和化酵素（配列番号２）であった；配列番号２のヌクレオチド４２１−１１２０（図１０の下線付き箇所）からなるセグメントを７００-ｍｅｒのｄｓＲＮＡポリヌクレオチド（「ＰＤＳ ７００-ｍｅｒ」）を設計するために使用し、配列番号２のヌクレオチド９１４−１１１３（図１０の太字で下線付き箇所）からなるセグメントを２００-ｍｅｒのｄｓＲＮＡポリヌクレオチド（「ＰＤＳ ２００-ｍｅｒ」）を設計するために使用した。処理に使用される他のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチの配列を表３に記載する。フィトエン合成酵素（配列番号２）配列に関連する、これらオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの配列の部位を図１１に模式的に示す。トウモロコシの根切り虫（「ＣＲＷ」）から取得した非植物配列、すなわち配列番号２７、２８、２９、および３０を非相同対照として使用した。いくつかのポリヌクレオチドには、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターであるＴ７プロモーター配列（表３で小文字により示される）が含まれた。
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以下の工程を本実施例に記載されるすべてのアッセイに対して使用する。４週令のベンサミアナタバコ植物をすべてのアッセイに使用した。新たにｄｄＨ２Ｏで作られた０．１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７溶液で植物を処理した。一植物あたり２枚の完全に開いた葉（１枚は子葉、１枚は本葉）を数秒間ＳｉｌｗｅｔＬ-７７溶液に浸漬し、ポリヌクレオチド組成物の適用前１５−３０分間乾燥させた。特段記載されない限りは各オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最終濃度は２５マイクロＭ（０．０１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８中）であった。２０マイクロリットルの溶液を２枚の前処理された各葉の上面に適用し、各植物に全量４０マイクロリットル（１ｎｍｏｌオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）を与えた。葉の退色を処理後３日目に観察した。
図１２Ａに、「ＰＤＳの２００-ｍｅｒ」セグメント（配列番号２のヌクレオチド９１４−１１１３）に対応するＲＮＡ配列を含む２００-ｍｅｒのｄｓＲＮＡポリヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド（配列番号１６、１７、２０、２１、２４、２５、および２６）の組み合わせを別々にタバコ植物に適用したアッセイの結果を説明する。２００-ｍｅｒのｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを０．６マイクロＭの濃度で適用した。葉の先端の退色がポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドでの局所処理後に観察され、標的フィトエン不飽和化酵素遺伝子の浸透移行性の調節または抑制を示唆した。
図１２Ｂは、緩衝液（対照）、２００-ｍｅｒのｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、およびｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドで処理されたベンサミアナタバコ植物から単離されたＲＮＡのノザンブロット分析の結果を説明する。２００-ｍｅｒのｄｓＲＮＡポリヌクレオチドでの処理の前に、摂氏４度、一晩中暗闇で維持することによってストレスを与えた植物から単離されたＲＮＡも示す。
図１３は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの１２の組み合わせに由来する効果を試験する別のアッセイにおいて、処理後１２日目に観察された表現型を説明する（表４参照）。表４に処理後５日目の目視可能な植物の退色の観察および処理後７日目ならびに１２日目に採取された葉緑素の測定の結果も列挙する。葉緑素の測定は、標的遺伝子フィトエン不飽和化酵素の抑制の指標であり、測定を先端領域の６点で行い、目視可能な退色した葉、または（目視可能な退色のない植物では）植物の相当箇所にある葉に着目した；より低い葉緑素測定値は、フィトエン不飽和化酵素の抑制を示唆する。これらの結果は、処理２、３、４、８、および１１におけるオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの組み合わせが、処理された植物において標的遺伝子の浸透移行性調節（抑制）に効果的であったことを示す；処理１も、程度は低いが、標的遺伝子の浸透移行性調節（抑制）をもたらした。２００-ｍｅｒのｄｓＲＮＡポリヌクレオチドは、処理された植物において標的遺伝子の浸透移行性調節（抑制）にも効果的であった。
非相同的（トウモロコシの根切り虫）遺伝子由来のオリゴヌクレオチド（処理５および６）は標的フィトエン不飽和化酵素遺伝子を抑制しなかった。これらの結果は、センスおよびアンチセンス双方の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが、処理された植物において標的遺伝子の浸透移行性調節（抑制）に効果的であったことを実証する。この特定の実施例において、Ｔ７プロモーターを含むセンスオリゴヌクレオチド（処理１）はフィトエン不飽和化酵素遺伝子の弱い浸透移行性調節をもたらしたが、Ｔ７プロモーターを含まないセンスオリゴヌクレオチド（処理７）はフィトエン不飽和化酵素遺伝子を抑制しなかった。この特定の実施例において、Ｔ７プロモーターを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（処理２）およびＴ７プロモーターを含まないアンチセンスオリゴヌクレオチド（処理８）の両方は強い退色をもたらし、標的フィトエン不飽和化酵素遺伝子の強い浸透移行性調節を示唆した。．
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表５は、６つのポリヌクレオチドを示す：「ＰＤＳの７００-ｍｅｒ」の最も５’側の４０ヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド１０８１−１１２０）からなる４０-ｍｅｒのセグメント（「ＰＤＳの４０-ｍｅｒのセンスｓｓＤＮＡ」、配列番号３１）ならびに「ＰＤＳの４０-ｍｅｒのセンスｓｓＤＮＡ」配列（配列番号３１）に基づき合成された４つのアンチセンス１本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドおよび１つのセンス一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド。図１４にポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドでタバコ植物を局所処理した結果を説明する。標的遺伝子フィトエン不飽和化酵素の浸透移行性の調節または抑制を示す葉の先端の強い退色が、ＰＤＳの２１-ｍｅｒのアンチセンスｓｓＤＮＡおよびＰＤＳの３３-ｍｅｒのアンチセンスｓｓＤＮＡでの局所処理後ならびにＰＣＲ増幅およびカラム精製された７００-ｍｅｒのｄｓＲＮＡポリヌクレオチド（「ＰＤＳの７００-ｍｅｒのｄｓＲＮＡ」）、先にアッセイされたＴ７プロモーターを含むＰＤＳのアンチセンス２２-ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（配列番号２０および２１）（「ＰＤＳＴ７アンチセンス」）、または、先にアッセイされたＴ７プロモーターを含まないＰＤＳのアンチセンス２２-ｍｅｒオリゴヌクレオチド（配列番号２２および２３）（「ＰＤＳアンチセンス」）での局所処理後に観察された。緩衝液のみ（「緩衝液」）での局所処理後、または熱変性（摂氏９５度で５分、その後氷上保存）した７００-ｍｅｒのｄｓＲＮＡポリヌクレオチド（「加熱されたＰＤＳの７００-ｍｅｒのｄｓＲＮＡ」）、ＰＤＳの１５-ｍｅｒのアンチセンスｓｓＤＮＡ、またはＰＤＳの１８-ｍｅｒのアンチセンスｓｓＤＮＡでの局所処理後には、葉の先端の目視可能な退色は殆ど観察されなかったか、または、まったく観察されなかった。。
Figure 0006321071
別のアッセイの結果を図１５に示す。標的遺伝子フィトエン不飽和化酵素の浸透移行性の調節または抑制を示唆する葉の先端の強い退色が、ＰＤＳの２１-ｍｅｒのアンチセンスｓｓＤＮＡ（配列番号３４、「２１ｎｔのＰＤＳのアンチセンス」）または以前にアッセイされたＴ７プロモーターを含まないＰＤＳのアンチセンスの２２-ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（配列番号２２および２３）（「ＰＤＳアンチセンス」）での局所処理後に観察された。緩衝液のみ（「対照：緩衝液」）の局所処理後またはＰＤＳの２１-ｍｅｒのセンスｓｓＤＮＡ（配列番号３６、「２１ｎｔのＰＤＳのセンス」）の局所処理後には、葉の先端の目視可能な退色はほとんど観察されなかったか、またはまったく観察されなかった。
実施例１１
本実施例は、（ａ）ポリヌクレオチド浸透のための植物用コンディショニング剤および（ｂ）アンチセンスまたはセンス配向のいずれかで標的遺伝子の１８以上の連続するヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖を含むポリヌクレオチドを含む、植物の標的遺伝子の浸透移行性のサイレンシングを誘導するための組成物を成長期植物に局所的に適用する処理を説明する。さらに詳細には、本実施例は、ポリヌクレオチドの標的特異性（配列特異性）を実証する。
パルマーアマランスフィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）は、以下の配列を有する。すなわち、ＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＣＡＴＴＣＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＴＴＣＡＧＴＧＴＴＡＧＴＡＡＡＧＴＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＴＴＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＡＴＣＣＴＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＡＣＴＴＡＴＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＴＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＴＣＧＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＧＧＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＡＧＣＴＧＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣＡＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＧＣＡＣＧＡＧＡＴＧＴＴＴＴＡＧＧＡＧＧＡＡＡＧＧＴＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＧＡＧＡＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＴＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＡＴＡＴＣＣＡＡＡＴＧＴＣＣＡＡＡＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＴＧＧＴＡＴＡＡＡＴＧＡＣＣＧＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＣＡＣＴＣＴＡＴＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＴＣＣＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＴＧＧＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＡＴＣＣＴＡＡＧＡＡＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＧＣＴＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＧＣＴＴＧＴＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＡＣＡＧＴＣＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＴＧＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＣＣＧＡＴＣＧＴＧＴＡＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＧＡＡＣＴＴＣＡＴＡＡＡＴＣＣＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＡＴＧＣＡＧＴＧＣＡＴＣＴＴＧＡＴＴＧＣＴＣＴＧＡＡＣＣＧＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴＡＡＧＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴＡＧＡＣＧＧＡＡＡＣＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＴＧＴＧＣＡＴＧＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＣＡＣＡＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＣＴＣＴＣＧＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＡＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴＴＴＧＣＴＡＡＡＴＡＡＣＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＡＣＧＡＧＧＡＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＣＣＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＡＣＴＡＣＣＴＧＡＴＡＣＴＴＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＣＴＣＡＴＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＡＣＴＴＧＡＧＡＡＡＴＴＡＧＴＧＧＧＣＧＴＴＣＣＴＧＴＧＡＴＴＡＡＴＧＴＴＣＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＴＣＴＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣＴＡＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧＴＣＧＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＡＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＣＡＣＣＣＧＣＧＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＴＣＡＣＧＡＡＧＣＧＡＣＡＣＴＧＡＴＡＴＴＡＴＡＧＡＧＧＣＡＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＡＧＣＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴＧＣＣＧＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＴＧＴＣＧＴＣＡＡＡＡＣＴＣＣＡＡＧＧＴＣＧＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＣＴＧＴＡＣＣＧＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＡＡＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＴＡＧＡＧＧＧＴＴＴＣＴＡＴＴＴＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＡＴＣＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＡＧＧＣＴＡＴＣＧＴＡＣＡＧＧＡＴＴＡＴＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧ（配列番号３７）である。配列番号３７の位置３１７−９９４（下線付き箇所として示される）のヌクレオチドによりコードされるＲＮＡにハイブリダイズできるアンチセンス鎖を含む６７８塩基対のｄｓＲＮＡポリヌクレオチドおよび配列番号３７の位置７９７−９９４（イタリック体および下線付き箇所として示される）のヌクレオチドによりコードされるＲＮＡにハイブリダイズできるアンチセンス鎖を含む１９８塩基対のｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを合成した。
ベンサミアナタバコフィトエン不飽和化酵素は、以下の配列を有する。すなわち、ＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＣＧＧＡＣＴＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧＧＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴＴＣＧＴＴＧＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴＧＴＴＴＴＧＧＴＡＧＴＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＧＧＡＴＴＣＧＴＡＣＴＣＣＡＡＧＴＧＣＣＡＣＧＡＣＣＣＧＡＡＧＡＴＴＧＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＡＡＴＣＣＴＴＴＡＡＡＧＧＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＴＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＴＴＣＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＣＧＣＣＣＡＡＣＴＡＡＡＣＣＡＴＴＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＣＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＣＴＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＴＧＧＴＡＣＧＡＧＡＣＴＧＧＧＴＴＧＣＡＣＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＧＧＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＣＧＡＴＧＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＧＣＣＡＴＴＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＧＧＣＣＡＴＡＣＴＡＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＡＡＡＴＧＣＴＴＡＣＧＴＧＧＣＣＣＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＡＡＴＴＴＧＣＴＡＴＴＧＧＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＧＴＴＴＡＡＧＴＧＴＴＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＴＡＡＣＴＴＣＡＴＡＡＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＣＧＡＴＧＣＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＧＡＴＴＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＡＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＣＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＴＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧＡＧＡＧＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＣＣＧＡＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＴＧＡＧＴＣＡＡＡＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＣＴＡＡＡＣＴＣＡＣＧＡＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＡＣＴＧＡＡＴＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＡＴＴＡＡＡＧＧＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＴＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＴＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡＴＣＴＧＡＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＴＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＣＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＴＣＡＧＴＣＴＡＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＴＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＴＡＡＡＴＣＧＴＡＧＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＴＣＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＴＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡＴＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＴＴＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＧＣＣＣＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＴＡＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＴＡＣＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＡＴＣＡＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＡＡＧＣＴＡＴＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＴＡＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＣＴＴＧＧＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＴＡＧＣＡＴＡＧＴＧＡＡＣＴＡＡ（配列番号３８）である。配列番号３８の位置４２１−１１０５（下線付き箇所として示される）のヌクレオチドにコードされるＲＮＡにハイブリダイズできるアンチセンス鎖を含む６８５塩基対のｄｓＲＮＡポリヌクレオチドおよび配列番号３８の位置９１４−１１０５（イタリックおよび下線のテキストとして示される）のヌクレオチドにコードされるＲＮＡにハイブリダイズできるアンチセンス鎖を含む１９２塩基対のｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを合成した。
パルマーアマランスとベンサミアナタバコＰＤＳのＤＮＡ配列の配列比較をｇｌｏｂａｌ ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ）を使用して実施し、図１６に図示する；この方法で、２つの配列は約７１％の配列同一性を示した（１２５２／１７６２）。
１６コピーのＥＰＳＰＳを有し、５−８インチの高さのパルマーアマランス植物を新たにｄｄＨ２Ｏで作製した０．１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７溶液で処理した。一植物あたり４枚の完全に開いた葉を数秒間Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７溶液に浸漬し、ポリヌクレオチド組成物の適用前３０分−１時間、乾燥させた。それぞれのポリヌクレオチド溶液を６７８ｂｐのＰａｌｍｅｒ ＰＤＳのｄｓＲＮＡ、１９８ｂｐのＰａｌｍｅｒ ＰＤＳのｄｓＲＮＡ、６８５ｂｐのベンサミアナタバコ（のＰＤＳ ｄｓＲＮＡ、および１９２ｂｐのベンサミアナタバコのＰＤＳ ｄｓＲＮＡのそれぞれに対して作製した（０．０１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８中０．６マイクロモル濃度のポリヌクレオチド）。１０マイクロリットルのポリヌクレオチド溶液（または対照としての緩衝液）を一植物あたり各４枚の前処理した葉の上面に適用し、各植物あたり全量４０マイクロリットルを与えた。植物をグロースチャンバー中に維持し、葉の退色を処理後３日目に観察した。６７８ｂｐのＰａｌｍｅｒ ＰＤＳのｄｓＲＮＡまたは１９８ｂｐのＰａｌｍｅｒ ＰＤＳのｄｓＲＮＡで局所的に処理された植物は、葉の退色を示した（内在性のフィトエン不飽和化酵素のサイレンシングを示唆する）が、６８５ｂｐのベンサミアナタバコのＰＤＳ ｄｓＲＮＡまたは１９２ｂｐのベンサミアナタバコ（のＰＤＳ ｄｓＲＮＡで局所的に処理されたパルマーアマランス植物は葉の退色を示さなかった。この配列特異性は、本発明のポリヌクレオチド組成物および方法が、特異的な標的遺伝子配列を有する与えられた種または分類群の選択的制御に、例えば、同じ除草剤に耐性のある作物の畑に成長する除草剤耐性の自生植物を制御するのに有用であることが実証された。
別のアッセイにおいて、６７８ｂｐのＰａｌｍｅｒ ＰＤＳ ｄｓＲＮＡ（ラベル付けされた「７００ｎｔのｄｓＲＮＡのＰＤＳ」）または１９８ｂｐのＰａｌｍｅｒ ＰＤＳ ｄｓＲＮＡ（ラベル付けされた２００ｎｔのｄｓＲＮＡ ＰＤＳ））で局所的に処理されたパルマーアマランス植物は、葉の退色（内在性のフィトエン不飽和化酵素のサイレンシングを示す）を示したが、無脊椎動物の遺伝子の２６０塩基対のｄｓＲＮＡ遺伝子（トウモロコシの根切り虫ディアブロティカ・ビルジフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）由来のラベル付けされた「２６０ｎｔのｄｓＲＮＡ ＤＶ４９」）で局所的に処理されたパルマーアマランス植物は、退色の表現型にはならず、内在性のフィトエン不飽和化酵素のサイレンシングがないことを示唆した（図１７）。この配列特異性は、本発明のポリヌクレオチド組成物および方法が、与えられた種または分類群の選択的制御に有用であることを実証する。
実施例１２
本実施例は、植物の標的遺伝子の浸透移行性のサイレンシングを誘導するために、アンチセンスまたはセンス配向のいずれかで標的遺伝子の１８以上の連続するヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖を含む組成物の局所的適用の使用を説明する。詳細には、本実施例は、葉、茎および花を含む異なる植物組織中の浸透移行性サイレンシングを誘導するための、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）オリゴヌクレオチドでの単回処理の使用を実証する。
４週令のタバコ（ベンサミアナタバコ（植物をすべての処理で使用した。２枚の完全に開いた葉（１枚は子葉、１枚は本葉）を新たに作製した界面活性剤溶液（再蒸留水中０．１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７）に数秒間浸漬することにより条件付けし、１５分間−３０分間乾燥させた。ベンサミアナタバコ（フィトエン不飽和化酵素（配列番号２）の位置１０９９−１１２０のヌクレオチドに対応する配列ＧＧＣＡＧＴＡＣＡＡＴＴＡＡＡＧＧＡＧＡＴＧ（配列番号３９）を含む一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）２２-ｍｅｒオリゴヌクレオチドの２０マイクロリットルを、一植物あたり全量４０マイクロリットル（１ナノモルのオリゴヌクレオチド）となるように、条件付けられた各葉の上面に、５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８中０．０１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７中の２５マイクロモル濃度の溶液として適用した。対照植物をＤＮＡオリゴヌクレオチドを含まないＳｉｌｗｅｔ溶液で処理した。処理後３日目に植物を退色に関して観察した。ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドで処理された植物の葉の先端、茎および花すべては退色を示し、ＰＤＳの浸透移行性サイレンシングを示唆した（図１８Ａ）。
対照植物およびｓｓＤＮＡ処理された植物の双方の花に結実させた。種子を成熟した果実から回収し、重量を測定し、発芽させた。種子の重量は同じで（１００種子あたり約１１ｍｇ）、種子の形態はｓｓＤＮＡ処理された植物も対照の植物も同じように見えた。対照の植物由来の果実あたりの種子の量および種子の発芽率（１００個のうち９５個の種子が発芽した）と比較して、ｓｓＤＮＡ処理された植物由来の種子において、果実あたりに産生される種子の減少した量および発芽率の減少（１００個のうち４個が発芽した）が観察された。
同様の工程を用いた別のアッセイで、タバコ植物を再蒸留水中の０．１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７への浸漬により条件付けし、１５分−３０分間乾燥させ、一植物あたり全量４０マイクロリットル（１ナノモルのオリゴヌクレオチド）となるように、５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８中０．０１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７中の２５マイクロモル濃度の溶液として、条件付けられた各葉の上面に適用されるＰＤＳ ｓｓＤＮＡ ２２-ｍｅｒ（配列番号３９）で処理した。他の植物は界面活性剤処理で条件付けせず、５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８中０．０１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７中の２５マイクロモル濃度の溶液としてまたは５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８中の２５マイクロモル濃度の溶液（界面活性剤なし）として、無針注射器での浸潤（図１８Ｂに示す）または液滴の手での適用により葉の表面へ適用される（図１８Ｂに示さない）１ナノモルのＰＤＳ ｓｓＤＮＡ ２２-ｍｅｒ（配列番号３９）でのみ処理した。ネガティブ対照植物を、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含まないＳｉｌｗｅｔ緩衝液で処理した。結果を図１８Ｂに示す。ＰＤＳ ｓｓＤＮＡの直接適用でのみ（Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７界面活性剤処理による条件付けなしに）処理されたすべての植物は、浸潤による適用であれ、手動による液滴適用であれ、ＰＤＳの浸透移行性サイレンシングを示唆する、葉の先端、茎および花の退色を示した。
実施例１３
本実施例は、ポリヌクレオチド浸透のための植物用コンディショニング剤の使用を含む、浸透移行性サイレンシングの誘導のための方法および局所的に適用される組成物を説明する。より詳細には、本実施例は除草剤耐性パルマーアマランスを制御するための本発明のポリヌクレオチドの使用を説明する。
低コピー数（３０未満）の５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）を有するパルマーアマランス植物は、ＥＰＳＰＳのサイレンシングのために設計されたｄｓＲＮＡでの処理、続いてグリホサートでの処理に感受性がある（実施例１に詳細を参照）。しかしながら、高コピー数のＥＰＳＰＳ（つまり、コピー数３０以上のＥＰＳＰＳ）を有するパルマーアマランス植物は、グリホサート処理に耐性があり、雑草耐性管理にとって課題である。例えば、実施例１に記載の処理と同様であるが、ここで、ｄｓＲＮＡの用量を最大１０倍まで増加させる（つまり一植物あたり８ナノモルの実施例１に記載の短いｄｓＲＮＡ）か、または牛脂アミン界面活性剤と組み合わせた商標により保護されているグリホサート配合（「Ｒｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤」）を使用する処理を用いたグリホサート耐性高コピーのパルマーアマランスに対するあるアッセイでは（データは示さない）、グリホサート活性は改良された（植物の背丈として測定された植物の成長を観察することにより推定された）が、耐性植物は枯れなかった。
３つの異なるグリホサート耐性高コピーパルマーアマランス系統（一反復あたり３つの植物）を表６に記載の処理条件（ここで、ｄｓＲＮＡ運搬体、透過処理またはコンディショニング剤および工程の順番を変化させた）を用いてｄｓＲＮＡで処理した。結果を図１９に示す。「４×」グリホサート単独での処理（つまり、１ヘクタールあたり８４０ｇ酸当量である標準的な適用割合の４倍にあたる、１ヘクタールあたり３３６０ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤での処理）は、３５コピー（実験３）または５７コピー（実験６）のパルマーアマランスを枯らさなかった。
ある実験において１−３、表６）、０．１％牛脂アミン界面活性剤および１０％グリセロール（実験２）を含む水溶性のｄｓＲＮＡ送達体中に２％硫酸アンモニウムを含むことで、４×グリホサート適用が続くｄｓＲＮＡの１０倍用量の有効性を改善した。グリホサート適用が続く１０倍用量のｄｓＲＮＡの改善された有効性はまた、硫酸アンモニウムが牛脂アミン界面活性剤なしでｄｓＤＮＡ送達体に含まれる際にも観察された（実験８）。
別の実験において（４−６、表６）、硫酸アンモニウムを含む送達体中のｄｓＲＮＡを適用する前にＳｉｌｗｅｔ Ｌ-７７界面活性剤を適用することは効果的であったが、Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７界面活性剤を硫酸アンモニウムを含むｄｓＲＮＡ送達体のｄｓＲＮＡと組み合わせることは効果的ではなかった。ｄｓＲＮＡでの処理後４８時間でグリホサート（「Ｒｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤」）を適用する（実験２）よりも処理後７２時間でグリホサート適用する（実験７）方が、効果が低かった。
Figure 0006321071
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 ＊グリホサート（市販の「Ｒｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤」配合で、成分として、５５：４５の比率での牛脂アミン（１６-１８Ｃ）とココアミン（１２-１４Ｃ））のＭＯＮ５６１５１牛脂アミン界面活性剤混合物を含む担体中に６６０ｇ／ＬのグリホサートＫ＋塩が含まれる）に関しては、使用された量（１×＝１ヘクタールあたり８４０ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤、４×＝１ヘクタールあたり３３６０ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）およびｄｓＲＮＡの適用後の時間が記載されている。
実施例１４
本実施例は、ポリヌクレオチド浸透に対する植物用コンディショニング剤の使用を含む浸透移行性サイレンシングを誘導するための方法および局所的に適用される組成物を説明する。
低分子ＲＮＡ配列決定を通じて同定された２つの低分子ＲＮＡは、実施例１に記載されるような４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子で処理されたパルマーアマランス植物中に大量に存在し、独特であることが見い出された。これら２つの低分子ＲＮＡは、それぞれ、図２０（配列番号４０）に示される配列を有する完全長のＥＰＳＰＳのヌクレオチド位置７４３−７６４および５６６−５８５に位置づけられた。２つの２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ｄｓＲＮＡ分子を、パルマーアマランスＥＰＳＰＳ遺伝子から転写される、図２０記載の配列番号４０（これには４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子（下線付き、非イタリック体箇所）および３つの「長い」二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド（実施例１に記載のような太字箇所）も示す）に下線のイタリック体のヌクレオチドによって示されるヌクレオチド位置７４３−７６７（「短いｄｓＲＮＡ-５」）および５６４−５８８（「短いｄｓＲＮＡ-６」）とハイブリダイズできるアンチセンス鎖と設計した。
４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子（実施例１に記載される）の混合物の適用に続いて、実施例１に記載される処理の手順を再現するグリホサートの適用により、１６コピーのＥＰＳＰＳを有する４つのパルマーアマランス植物のうち４つが枯れた。同じ処理手順を使用するが、短いｄｓＲＮＡ-５および短いｄｓＲＮＡ-６を共に適用することにより、４つのパルマーアマランス植物のうち枯れたのは０個であった。短いｄｓＲＮＡ-５および短いｄｓＲＮＡ-６のいずれか、もしくは、両方の、４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子（実施例１に記載される）の混合物への添加により、４つのパルマーアマランス植物のうち４つが枯れた。つまり、短いｄｓＲＮＡ-５および短いｄｓＲＮＡ-６の拮抗的な効果は観察されなかった。
実施例１５
本実施例は、ポリヌクレオチド浸透に対する植物用コンディショニング剤の使用を含む浸透移行性サイレンシングを誘導するための方法および局所的に適用される組成物を説明する。さらに詳細には、本実施例はサリチル酸およびポリヌクレオチドの使用を説明する。
サリチル酸（ＳＡ）はタバコにおいてウイルス耐性を誘導する；例えばＣｈｉｖａｓａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １９：５４７−５５７を参照。ＥＰＳＰＳの４９または６３コピーを有するグリホサート耐性パルマーアマランス植物を１５ミリモル濃度のＳＡで前処理した。４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子（実施例１に記載される）の溶液をＳＡで処理後１、５、または２４時間目に動で適用し、続いて７２時間後、グリホサート（１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）を噴霧した。ｄｓＲＮＡおよびグリホサート活性（植物の背丈として測定される植物の成長を観察することにより推定される）の効果の改善はグリホサート処理後７日目にＳＡ処理したいずれにも全く観察されなかった。
実施例１６
本実施例は、ポリヌクレオチド浸透のための植物用コンディショニング剤の使用を含む浸透移行性サイレンシングを誘導するための方法および局所的に適用される組成物を説明する。さらに詳細には、本実施例はポリヌクレオチドおよび界面活性剤溶液の適用の順番およびタイミングの変化を説明する。
これらのアッセイを、以下の工程、すなわち、１）牛脂アミン界面活性剤およびグリセロールを含む溶液中のｄｓＲＮＡ（実施例１に記載の４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子の溶液）の適用；（２）１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７シリコン界面活性剤の適用；および（３）グリホサートの適用（１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）を含むプロトコールを使用して、高コピー数（５６、６３、または１００コピー）のＥＰＳＰＳを有するパルマーアマランス植物に実施した。ポリヌクレオチドの適用およびＳｉｌｗｅｔの適用のタイミングの間隔を、ｄｓＲＮＡ溶液の適用後３０分、１時間または２時間に適用されるＳｉｌｗｅｔ噴霧で評価した。このセットのアッセイにおいて、Ｓｉｌｗｅｔ溶液適用の３つの異なる時間すべては、同様の結果、つまり、牛脂アミン界面活性剤およびグリセロールのみを含む対照溶液で処理された対照の高コピー植物と比較して、ｄｓＲＮＡ溶液で処理された高コピー植物のほとんどは成長が阻害された。
実施例１７
本実施例は、ポリヌクレオチド浸透のための植物用コンディショニング剤の使用を含む浸透移行性サイレンシングを誘導するための方法および局所的に適用される組成物を説明する。さらに詳細には、本実施例は低容量噴霧による本発明のポリヌクレオチドの適用およびシリコン界面活性剤および硫酸アンモニウムの使用を説明する。
２％硫酸アンモニウムを含む溶液中のｄｓＲＮＡ溶液（実施例１に記載の４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子の溶液）を１６コピーのＥＰＳＰＳを有するパルマーアマランスに低容量噴霧により適用し、続いてグリホサート（１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）を噴霧し、パルマー・アマランス植物は枯れた。
一処理あたり６つのパルマーアマランス植物を、低容量噴霧を用いた３工程の手順で処理した。すなわち、（１）１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７を噴霧；（２）実施例１に記載の４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子当量を含むｄｓＲＮＡ溶液を２ミリリットルで、３つの用量（一植物あたり１×または０．８ナノモル、一植物あたり２×または１．６ナノモルもしくは一植物あたり４×または３．２ナノモル）のうち１つで噴霧；および（３）１５９リットル／エーカーの割合でグリホサート（１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）を噴霧した。グリホサート噴霧後９日目に４×（一植物あたり３．２ナノモル）ｄｓＲＮＡを噴霧された６つすべての植物は枯れ、２×（一植物あたり１．６ナノモル）ｄｓＲＮＡまたは１×（一植物あたり０．８ナノモル）ｄｓＲＮＡを噴霧された植物は成長が阻害された（図２１Ａ）。
いくつかのアッセイを、畑で回収した種子から栽培したグリホサート耐性パルマーアマランスに実施した。植物を以下に記載される様々なプロトコールで処理し、いくつかの植物ではｄｓＲＮＡ溶液で局所的に処理し、対照植物では緩衝液（ｄｓＲＮＡ運搬体）で処理した；低容量噴霧により適用した。特に断りのない限り、ｄｓＲＮＡ溶液は、緩衝液中、実施例１に記載の４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子を当量、「４×」用量（一植物あたり３．２ナノモル）で含んだ；緩衝液は、ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）水（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ-Ｔｅｋ）中１０ミリモル濃度のリン酸ナトリウムおよび０．０１％（ｖ／ｖ）のＳｉｌｗｅｔＬ-７７有機シリコン界面活性剤からなり、ｐＨ６．８に調整された；除草剤は１５９リットル／エーカーの割合で、１ヘクタールあたり８４０ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤で適用されるグリホサート除草剤であった。結果を表７に提供する。
アッセイ１および２：これらのアッセイを、既知のグリホサート耐性パルマーアマランス群落に位置する農地由来の土壌サンプルから入手された種子から栽培したグリホサート耐性パルマーアマランスに実施した。アッセイ１について、一処理あたり１０個の植物を以下のように処理した：（１）１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７を噴霧；（２）２ミリリットルのｄｓＲＮＡ溶液を噴霧；および（３）グリホサートを噴霧。アッセイ２について、一処理あたり１８の植物をアッセイ１と同じ手順を用いて処理した。
アッセイ３：本アッセイは異なる発生上のステージで適用された処理を比較し、Ｍａｃｏｎ Ｃｏｕｎｔｙ、ＧＡの土地由来のパルマーアマランスの種子から栽培した実生を用い、グリホサート耐性を選択した。緩衝液は２％硫酸アンモニウムを含んだ。一処理あたり１２個の小さな（３葉期）または１２の巨大な（５葉期）実生を以下のように処理した。すなわち、（１）１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７を噴霧；（２）２ミリリットルのｄｓＲＮＡ溶液を噴霧；（３）グリホサートを噴霧。本処理は巨大な実生と比較して小さな実生に対してより良い制御（より多くの植物を枯らす）をもたらした。処理後１６日目にすべてのグリホサート耐性植物を枯らさなかったが、ｄｓＲＮＡ処理は、緩衝液および除草剤での処理よりもより多くのグリホサート耐性植物を枯らし、または成長を阻害した。
アッセイ４および５：これらのアッセイはＰｅｍｉｓｃｏｔ、ＭＯの農地由来の土壌の種子から栽培したパルマーアマランス植物を使用した。緩衝液は２％硫酸アンモニウムを含んだ。一処理あたり１１個の小さな（３葉期）実生を以下のように処理した：（１）１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７を噴霧；（２）ｄｓＲＮＡ溶液の２ミリリットルを噴霧；（３）グリホサートを噴霧。アッセイ５について、一処理あたり１２個の植物をアッセイ４と同じ手順を用いて処理した。
アッセイ６：本アッセイでは、「Ｉｖｙ２」農地由来の土壌の種子から栽培したパルマーアマランス植物を使用した。緩衝液は２％硫酸アンモニウムを含んだ。一処理あたり１８個の小さな（３葉期）の実生を以下のように処理した。すなわち、（１）１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７を噴霧；（２）ｄｓＲＮＡ溶液の２ミリリットルを手または噴霧により適用、；（３）グリホサートを噴霧した。本アッセイでは適用方法（手動滴下または噴霧）は同様の結果をもたらした。
アッセイ７：本アッセイにはグリホサート耐性のために選択され、またアッセイ１−６の植物よりもグリホサート耐性の強いＦ３種子から成長した３−４葉期のパルマーアマランスの実生を使用した。緩衝液は２％硫酸アンモニウムを含んだ。一処理あたり１８個の植物を以下のように処理した。すなわち、（１）１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７を噴霧；（２）ｄｓＲＮＡ溶液の２ミリリットルを噴霧；（３）グリホサートを噴霧した。
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実施例１８
本実施例は、ポリヌクレオチド浸透のための植物用コンディショニング剤の使用を含む浸透移行性サイレンシングを誘導するための方法および局所的に適用される組成物を説明する。
これらのアッセイにおいて、ｄｓＲＮＡ溶液は、０．２％牛脂アミン界面活性剤および２％硫酸アンモニウム（図２２に「牛脂アミン／ＡＭＳ」として同定される）か、または以下のトランスフェクション試薬の１つのいずれかを含む溶液で「１０×」用量（一植物あたり８ナノモル）で、実施例１に記載の４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子当量を含んだ。トランスフェクション試薬は、（ａ）ポリアミン（ＪｅｔＰＲＩＭＥ（商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ-ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）、（ｂ）磁性ナノ粒子（ＳｉｌｅｎｃｅＭａｇ、ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、（ｃ）ペプチド（Ｎ-ＴＥＲ（商標）Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、（ｄ）脂質（ｓｉＰＯＲＴ（商標）ＮｅｏＦＸ（商標）、Ａｍｂｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、または（ｅ）陽イオン脂質／ポリマー（ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）である。植物を以下のように処理した。すなわち、（１）ｄｓＲＮＡ溶液を手で適用；（２）１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７を噴霧；（３）１ヘクタールあたり８４０ｇ酸当量で適用されるＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤を適用されるグリホサートを１５９リットル／エーカーの割合で噴霧。牛脂アミン界面活性剤／硫酸アンモニウム溶液中のｄｓＲＮＡと使用される際、本プロトコールは３５コピーのＥＰＳＰＳを有するグリホサート耐性パルマーアマランスを枯らす。結果を図２２に示す。植物の成長阻害または死滅は、ポリアミン（ＪｅｔＰＲＩＭＥ（商標））、ペプチド（Ｎ-ＴＥＲ（商標）Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、陽イオン脂質／ポリマー（ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標））、または牛脂アミン界面活性剤／硫酸アンモニウムを含む溶液中のｄｓＲＮＡで処理された植物に観察された。
実施例１９
本実施例は、植物の浸透移行性サイレンシングを誘導するために、局所的に適用されるポリヌクレオチドを含む組成物を用いる方法を説明する。さらに詳細には、本実施例は浸透移行性サイレンシングを誘導する異なるタイプのポリヌクレオチドの使用を記載する。
パルマーアマランスＥＰＳＰＳ遺伝子の位置１４−３８、位置１５３−１７７、３４５−３６９、および１１０５−１１２９（図１中、下線付きヌクレオチドにより示される）に対応するセンス一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡｓ）およびアンチセンス一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡｓ）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より購入した。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを産生するため、センスｓｓＤＮＡおよびアンチセンスｓｓＲＮＡは、当モルの混合されたｓｓＤＮＡおよびｓＲＮＡを５分間、摂氏９５度に熱し、１．５−２時間超でゆっくりと室温まで冷却することによりアニーリングさせた。
１６-コピーのグリホサート耐性パルマーアマランス（植物を以下手順の使用によるアッセイで使用した。すなわち、（１）１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７を噴霧；（２）おのおのの植物の４枚の成熟した葉に全量０．８ナノモルのＰａｌｍｅｒＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ（実施例１に記載されるような）またはＰａｌｍｅｒＥＰＳＰＳＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを手で適用、および（３）１５９リットル／エーカーの割合で、１ヘクタールあたり８４０ｇ酸当量で適用されるＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤のグリホサートを噴霧するという手順である。
結果を図２３に示す。除草剤噴霧後７日目に、６つのｄｓＲＮＡ処理された植物のうち４つは枯れており、残りの２つは枯れかけていた一方、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを噴霧された植物は、対照と比較して成長が阻害された（グリホサート損傷）。
実施例２０
本実施例は、植物の浸透移行性サイレンシングを誘導するために、局所的に適用されるポリヌクレオチドを含む組成物を用いる方法を説明する。さらに詳細には、本実施例は浸透移行性サイレンシングを誘導する異なるタイプのポリヌクレオチドの使用を記載する。
１６コピーのＥＰＳＰＳを有するグリホサート耐性パルマーアマランス）植物を一処理あたり６つを本アッセイに使用した。植物の一処理あたり０．８ナノモル（「１×」）のｄｓＲＮＡ、１０倍多い量（植物の一処理あたり８ナノモル、「１０×」）のｓｓＤＮＡポリヌクレオチド（実施例１９に記載される）および対照として緩衝液のみを、別々の植物に対し２％硫酸アンモニウムを含む緩衝液中手動で適用し、続いて４８時間後、１ヘクタールあたり８４０ｇ酸当量で適用されるＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤のグリホサートを１５９リットル／エーカーの割合で噴霧した。図２４に結果を示す。緩衝液および除草剤のみで処理された植物と比較して、両方のポリヌクレオチド処理はパルマーアマランスのよりよい制御を与えた。１０×ｓｓＤＮＡ処理で処理された植物のうち、６つのうち２つは枯れ、残りの４つは３０％成長が阻害された。１×ｄｓＲＮＡ処理で処理された植物のうち、６つすべての植物はＷＭ噴霧後８日目またはｄｓＲＮＡ処理後１０日目までに枯れた。
実施例２１
本実施例は、植物の浸透移行性サイレンシングを誘導するために、局所的に適用されるポリヌクレオチドを含む組成物を用いる方法を説明する。さらに詳細には、本実施例は植物に浸透移行性サイレンシングを誘導するためのポリヌクレオチド配列の選択を説明する。
各々約２５０ｂｐで、配列番号４１−５２（表８）のＥＰＳＰＳのタイリングされたＤＮＡ配列に対応する一本鎖を有する１２個のｄｓＲＮＡを、図２５Ａに示すように、パルマーアマランスのＥＰＳＰＳ遺伝子の全コーディング配列および５’ならびに３’の非翻訳領域の部分を網羅するように、タイリング様式で設計した。
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実施例１および図１に記載される、４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子は、それぞれタイリングセグメント２、３、４、および８に位置し、それらのセグメント内の薄い灰色のバーとして示される。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位に挿入されたＥＰＳＰＳポリヌクレオチドを有するｐＢＲ３２２ベクターを使用して、ポリヌクレオチドをインビトロ転写により合成した。プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ ｐｒｅｐ ｋｉｔで単離し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で切断した。切断されたＤＮＡ溶液を更なる精製なしに植物の処理に使用した。
１６コピーのＥＰＳＰＳを有するグリホサート耐性パルマーアマランス植物を以下のように処理した。すなわち、１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７を噴霧；（２）ｄｓＲＮＡ溶液（１２個のタイリングセグメントまたは実施例１に記載の４つの「短い」ｄｓＲＮＡ分子から選択されたポリヌクレオチドを、植物あたり０．０１ナノモルＤＮＡの割合で含む）または対照として手動で緩衝液を適用；および（３）４８時間後、１ヘクタールあたり８４０ｇ酸当量で適用されるＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤のグリホサートを１５９リットル／エーカーの割合で噴霧した。処理された植物の地上の高さを除草剤処理後１１日目に観察し、枯れているまたは枯れかけている植物に高さ０を割り当てた。結果は図２５Ｂおよび２５Ｃに示した。本アッセイにおいて、最も高い有効性を示したｄｓＲＮＡポリヌクレオチドの組み合わせには、実施例１に記載の４つの「短い」ｄｓＲＮＡ分子、タイリングセグメント２、５、８、ならびに１１の組み合わせ、およびタイリングセグメント７、８ならびに９の組み合わせが含まれた。
実施例２２
本実施例は、植物に浸透移行性サイレンシングを誘導するために局所的に適用されるポリヌクレオチドを含む組成物を用いる方法を説明する。さらに詳細には、本実施例は植物への除草剤の適用に続くポリヌクレオチドの局所適用を記載する。
あるアッセイでは、１６コピーのＥＰＳＰＳを有するグリホサート耐性パルマーアマランス植物に、１ヘクタールあたり８４０ｇ酸当量で適用されるＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤のグリホサートを１５９リットル／エーカーの割合で噴霧した。除草剤適用後２時間または２４時間で、１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７の噴霧により植物を処理した。Ｓｉｌｗｅｔ処理後１５分−２０分に、２％硫酸アンモニウムを含む緩衝液中一植物あたり０．８ナノモル（「１×」）の実施例１に記載の４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子またはまたは２％硫酸アンモニウムを含む緩衝液の手での適用により植物を処理した。本アッセイでは、未処理（「ＵＴ」）の対照植物を１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７噴霧でのみ処理し、除草剤またはｄｓＲＮＡでは処理しなかった。結果を図２６に示す。本アッセイでは、１％Ｓｉｌｗｅｔの適用は、除草剤噴霧後２時間で適用される際には６０％、除草剤噴霧後２４時間で適用される際には２０％グリホサート活性が改善した。本アッセイでは、１％Ｓｉｌｗｅｔに続くＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡの適用は除草剤噴霧後２時間で適用される際少なくとも８０％、除草剤噴霧後２４時間で適用される際は２０％、グリホサート活性が改善した。
別のアッセイでは、Ｍａｃｏｎ、ＧＡの農地由来の土壌中の種子から栽培したパルマーアマランスに、１ヘクタールあたり８４０ｇ酸当量で適用されるＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤のグリホサートを１５９リットル／エーカーの割合で噴霧した。除草剤処理後３日目に、４０の植物のうち９つが枯れ、３つが深刻に成長を阻害された。生存した植物には１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７を噴霧し、続いて一植物あたり８ナノモル（「１０×」）の実施例１に記載の４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子または対照として緩衝液を手動で局所適用した。３日後、ｄｓＲＮＡ処理した群のさらに３つの植物が枯れており、緩衝液処理した群のさらに２つの植物が枯れていた。この時点で（最初の除草剤処理後６日目およびＳｉｌｗｅｔ／ｄｓＲＮＡまたは緩衝液処理後３日目）、各々の群の生存した植物の半分にグリホサートの２回目の適用を噴霧した（一回目の適用と同じ用量を適用した）。この２回目の除草剤処理後２週間で、残りのｄｓＲＮＡ処理された植物は８０％の損傷を、残りの緩衝液処理された植物は４０％の損傷を示した。
実施例２３
本実施例は、植物の浸透移行性サイレンシングを誘導するために、局所的に適用されるポリヌクレオチドを含む組成物を用いる方法を説明する。さらに詳細には、本実施例は、除草剤耐性の雑草を制御するためのポリヌクレオチド、界面活性剤および除草剤を含む単一組成物の一工程局所適用を説明する。
本アッセイを非常に高コピー数のＥＰＳＰＳを有することが知られているグリホサート耐性パルマーアマランス植物の野外個体群（本研究場由来の植物は、Ｇａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０７：１０２９-１０３４により、５−１６０超コピー数のＥＰＳＰＳを有することが報告されている）に対して実施した。本アッセイに使用されたポリヌクレオチドは実施例１に記載の４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ分子の等モル濃度混合物であった。
１フィート×５フィートの処理エリアの４−６インチの高さの植物に、単回処理で、１％ＳｉｌｗｅｔＬ-７７界面活性剤、２％硫酸アンモニウム、およびグリホサート（１５９リットル／エーカーの割合で、１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量を適用されるＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）も含む溶液中２６４マイクログラム（「１００×」）または５２．８マイクログラム（「２０×」）のＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡを噴霧した。比較のため、１フィート×５フィートの処理エリアの他の植物に、同じ割合で適用されるグリホサート（１％ＳｉｌｗｅｔＬ-７７界面活性剤および２％硫酸アンモニウムも含む溶液中）を噴霧した。
結果を図２７に示す。Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７および硫酸アンモニウムも含む溶液中の（１５９リットル／エーカーの割合で、１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量を適用されるＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）グリホサートのみで処理した植物は、約７０％制御（植物の死）であった。２０×ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、界面活性剤、硫酸アンモニウム、および除草剤を含む組成物を使用する一工程処理では、グリホサート耐性パルマーアマランスの約８０−８５％制御になり、これは、１５９リットル／エーカーの割合で、１ヘクタールあたり６７２０ｇ酸当量を適用される、Ｒｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤のグリホサート（つまり、１５９リットル／エーカーの割合で、１ヘクタールあたり約８４０ｇ酸当量である標準的適用割合の８倍のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）を噴霧して得られた近似の制御割合である。１００×ＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド、界面活性剤、硫酸アンモニウム、および除草剤を含む組成物を使用した一工程処理はグリホサート耐性パルマーアマランスの約９０−９５％制御になり、これは、１５９リットル／エーカーの割合で、１ヘクタールあたり１３４４０ｇ酸当量を適用される、Ｒｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤のグリホサート（つまり、１５９リットル／エーカーの割合で、１ヘクタールあたり約８４０ｇ酸当量である標準的適用割合の１６倍のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）を噴霧して得られる近似の制御割合である。
実施例２４
本実施例は、標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡ中の１８以上の連続する核酸の配列に対し本質的に同一または本質的に相補的なヌクレオチド配列を有するセグメントを含むポリヌクレオチド分子を野菜に局所適用することにより、野菜植物の標的遺伝子の浸透移行性の調節を誘導するための方法（それにより分子が野菜植物の内部に浸透し、標的遺伝子の浸透移行性の調節を誘導する）を説明する。本実施例では、（ａ）ポリヌクレオチド浸透のための植物用コンディショニング剤（ｂ）アンチセンスまたはセンス方向で標的遺伝子の１８以上の連続するヌクレオチドの少なくとも１つのセグメント含む少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖を含むポリヌクレオチドを含む、野菜または果物の作物の標的遺伝子の浸透移行性サイレンシングを誘導するための組成物を成長期野菜植物に局所的に適用して処理した。さらに詳細には、本実施例は、野菜作物、つまりレタス（ラクチュカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ））のフィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）遺伝子の浸透移行性サイレンシングを誘導するために局所的に適用によるポリヌクレオチドの使用を実証した。
レタスＰＤＳは、以下の配列を有する。すなわち、ＡＴＧＴＣＴＣＴＧＴＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＡＴＴＡＡＣＴＣＡＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＡＴＡＧＴＡＡＴＧＡＡＴＣＴＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＴＧＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＡＣＡＧＡＴＴＧＣＡＡＴＴＣＣＣＡＡＧＴＧＣＴＣＧＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴＡＡＡＧＧＴＡＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＴＡＡＣＡＣＡＴＣＴＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＴＧＧＴＴＴＡＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＧＴＡＴＴＴＡＧＣＴＧＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＴＴＴＴＡＣＴＡＧＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＴＧＧＴＡＴＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＣＡＣＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＡＣＣＣＡＡＡＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＣＴＡＧＧＡＡＴＴＡＡＴＧＡＴＡＧＡＴＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＧＣＡＴＴＣＴＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＣＡＡＡＴＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＡＧＴＡＧＧＴＴＴＧＡＣＴＴＣＣＣＡＧＡＴＧＴＴＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＧＣＴＡＴＡＴＴＧＡＧＧＡＡＣＡＡＴＧＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＧＴＧＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＴＧＣＡＡＴＴＧＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＴＴＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＡＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＧＧＧＣＴＴＡＧＴＧＴＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＡＴＴＡＡＡＣＴＴＴＡＴＡＡＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＡＴＧＣＡＡＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴＴＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＧＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＴＴＴＧＣＡＡＧＣＣＡＡＴＴＧＴＴＧＡＣＣＡＣＡＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＣＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＡＡＣＴＣＡＣＧＡＡＴＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＧＡＣＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＧＧＡＡＣＴＴＴＣＴＡＴＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＣＧＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＧＡＧＡＡＧＴＴＡＧＴＣＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＣＧＴＴＣＡＴＡＴＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＣＴＴＡＣＴＴＴＴＣＡＧＴＡＧＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＧＡＧＴＧＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＣＣＧＡＡＴＡＡＧＴＣＡＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＡＡＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＡＡＣＡＡＴＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＴＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＴＧＡＡＡＴＡＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡＴＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＣＧＡＣＣＣＣＴＡＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＧＧＧＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＡＣＡＡＧＣＴＡＴＴＴＴＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴＴＧＣＴＡＣＡ（配列番号５３）である。以下の配列を有する２１−４５ヌクレオチド長のポリヌクレオチド一本鎖ＤＮＡを合成した。すなわち、ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｔｔｔｇｇａｇｃｔｔａｃｃｃａａＡＴＧｔａｃ（「ＨＬ２８６」、センス方向、配列番号５４）、ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇｇｃｃａｃｇｔｃａｇｃａｔｔｔｃａｔｔｇｔｔｃ（「ＨＬ２８７」、アンチセンス方向、配列番号５５）、ｃｃａｔｔｃａＡＴＧｇｔｇｃａｇｇｔａａａａｃ（「ＨＬ２８８」、アンチセンス方向、配列番号５６）、ｃａｔａｇａＡＴＧｃｔｃｃｔｔｃｃａｃｔｇ（「ＨＬ２８９」、アンチセンス方向、配列番号５７）、およびｃａａａｔａａａｔｔｔｔｇｔａｃａｔｔｔｇｇｇｔａａｇｃｔｃｃａａ（「ＨＬ２９０」、アンチセンス方向、配列番号５８）である。ｓｓＤＮＡ溶液を５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８中０．０１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７中、５つすべてのポリヌクレオチドの当量混合物で作製した。
レタスの変種ＬＳ４９「グリーンタワー（Ｇｒｅｅｎ Ｔｏｗｅｒ）」を本アッセイに使用した。各植物の２枚の完全に開いた葉を、数秒間、新たに作製した再蒸留水溶液中０．１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７溶液に浸漬した。葉を１５−３０分間乾燥させた。その後、２枚のＳｉｌｗｅｔ処理された葉の上面に２０マイクロリットルのｓｓＤＮＡ溶液を適用することにより各植物を処理した（一植物あたり全４０マイクロリットル）。表９に使用されたアッセイの条件およびｓｓＤＮＡポリヌクレオチドで局所的に処理された植物の観察された退色を列挙する。図２８は、一植物あたり１ナノモルのｓｓＤＮＡで処理されたレタス植物（先端から下端まで）の処理後３７、４６および６０日目の退色の進行および死滅を示す。
Figure 0006321071
アッセイを一植物あたり２または４ナノモルのｓｓＤＮＡの適用で繰り返した。図２９Ａにポリヌクレオチドでの局所処理後４日目または１２日目に観察される退色により証明される浸透移行性サイレンシングを示す。
アッセイはそれぞれのアンチセンスｓｓＤＮＡ（「ＨＬ２８７」、配列番号５５；「ＨＬ２８８」、配列番号５６；「ＨＬ２８９」、配列番号５７；および「ＨＬ２９０」、配列番号５８）を用いて、一植物あたり８ナノモルのポリヌクレオチドの適用で繰り返された。ポジティブ制御植物を、おのおの２ナノモルの４つのそれぞれのアンチセンスｓｓＤＮＡｓの混合物で処理し（一植物あたり全量で８ナノモルのポリヌクレオチドを適用した）、ネガティブ制御植物を、緩衝液のみで処理した。図２９ＢはアンチセンスｓｓＤＮＡの局所処理後４日目に観察される退色により証明される浸透移行性サイレンシングを示す。
実施例２５
本実施例は本発明の一態様を説明する。本実施例では、植物中の標的遺伝子の浸透移行性サイレンシングを誘導するために、（ａ）ポリヌクレオチド浸透のための植物用コンディショニング剤および（ｂ）アンチセンスまたはセンス配向のいずれかで標的遺伝子の１８以上の連続するヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖を含むポリヌクレオチドを含む局所的に適用される組成物で成長期植物を処理した。さらに詳細には、本実施例は野菜作物つまりトマト（ソヌラム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））のフィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）遺伝子の浸透移行性サイレンシングを誘導するための局所的に適用されるポリヌクレオチドの使用を実証した。
トマトＰＤＳは、以下の配列を有する。すなわち、ＧＧＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＧＧＡＣＧＴＧＴＣＡＡＡＴＴＴＴＧＧＡＴＴＧＴＡＧＣＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＡＡＴＴＧＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＣＡＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＡＡＴＴＡＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＴＡＴＡＣＧＣＴＴＴＴＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＣＡＴＴＣＧＧＴＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＡＡＣＴＧＣＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＣＴＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＡＴＡＴＣＴＴＣＴＡＧＧＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＣＧＴＴＣＣＧＡＧＴＡＡＡＡＴＧＣＣＴＣＡＡＡＴＴＧＧＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＡＣＴＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧＧＴＡＧＴＴＣＡＧＣＴＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＴＧＴＴＴＴＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＡＡＴＣＡＡＴＧＧＧＴＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＡＴＧＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＧＣＧＣＣＣＡＡＣＴＡＡＡＣＣＡＴＴＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＣＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＴＧＴＴＣＴＡＧＧＴＧＧＡＡＡＧＧＴＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＴＧＧＴＡＣＧＡＧＡＣＴＧＧＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＡＡＴＡＴＴＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＧＧＡＴＴＡＡＣＧＡＴＣＧＡＴＴＧＣＡＡＴＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＣＴＴＴＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＴＣＴＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＡＡＴＴＴＧＣＡＡＴＴＧＧＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＧＡＴＡＡＧＴＧＴＴＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＣＡＡＣＴＴＴＡＴＡＡＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＡＣＴＴＴＣＡＡＴＧＣＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＧＡＴＣＧＣＡＴＴＧＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＣＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＡＧＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＣＣＧＡＴＴＧＴＴＧＡＡＣＡＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＡＡＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＧＡＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＴＴＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＴＡＣＴＧＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＣＡＡＴＣＧＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴＴＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＧＣＣＴＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＴＡＧＴＣＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴＡＣＡＴＡＴＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＴＣＡＧＴＣＴＡＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＴＣＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＡＡＣＧＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＧＣＡＡＣＧＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＧＴＴＧＴＣＡＡＡＡＣＴＣＣＧＡＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡＴＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＴＴＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＣＣＣＣＡＡＴＡＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＡＣＴＡＣＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧＧＡＡＧＧＣＧＣＴＧＴＣＴＴＡＴＣＡＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＡＧＣＴＡＴＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＴＡＴＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＣＧＴＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＧＧＡＡＧＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＴＴＡＧＣＴＴＴＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡＧＣＴＴＣＴＧＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＣＧＴＴＧＴＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＡＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴＧＴＴＡＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＧＡＴＧＧＣＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＴＴＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＣＣＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＧＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣＣＡＣＴＴＴＣＴＴＴＡＴＣＴＧＧＧＧＴＴＴＧＴＡＡＴＣＣＣＴＴＴＡＴＡＴＣＴＴＴＡＴＧＣＡＡＴＣＴＴＴＡＣＧＴＴＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡ（配列番号５９）である。
配列ＴＣＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＡＡＣＧＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＧＣＡＡＣＧＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＧＴＴＧＴＣＡＡＡＡＣＴＣＣＧＡＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡＴＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＴＴＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＧＣＣＴＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＣＣＣＣＡＡＴＡＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧ（配列番号６０）（トマトＰＤＳ遺伝子配列（配列番号５９）から転写されたｍＲＮＡの位置１７２４−１９２３のヌクレオチドに対応する）でコードされるＲＮＡにハイブリダイズできるアンチセンス鎖を有する２０１ヌクレオチドのｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを、配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＣＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号６１、センスプライマー）およびＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＣＡＣＡＡＣＣ（配列番号６２、アンチセンスプライマー）を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＴＰＣＲにより合成した。２．５マイクロモル濃度のｄｓＲＮＡ溶液を５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８中０．０１％ＳｉｌｗｅｔＬ-７７中に２０１ヌクレオチドｄｓＲＮＡポリヌクレオチド（配列番号６０）で作製した。
３週令のトマト実生を以下のように処理した。２枚の完全に開いた葉を、数秒間、新たに作製した再蒸留水中０．１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７溶液に浸漬した。葉を３０分−１時間乾燥させた。その後、２枚のＳｉｌｗｅｔ処理された葉の上面に２０マイクロリットルのｓｓＤＮＡ溶液を適用することにより各植物を処理した（一植物あたり全４０マイクロリットル）。対照植物を緩衝液で処理した。植物を観察のためにグロースチャンバー中に維持した。図３０は局所処理後３０日目にｄｓＲＮＡ処理された植物の退色により証明される標的遺伝子ＰＤＳの浸透移行性サイレンシングを示す。ｄｓＲＮＡで処理された植物は対照植物と比較して深刻に成長が阻害された。
実施例２６
本実施例は、成長期植物の外面の局所コーティングに適当な除草性組成物の改良を説明し、植物致死性薬剤には、１つ以上の植物遺伝子の配列または植物遺伝子から転写されたＤＮＡの配列に本質的に同一または相補的な配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。ポリヌクレオチドは、局所のポリヌクレオチド適用を受けた植物の器官または組織以外の植物の器官または組織において植物遺伝子の浸透移行性抑制をもたらす。さらに詳細には、本実施例は、界面活性剤ならびに、パルマーアマランスの５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）遺伝子、転写開始因子（ＴＩＦ）およびＤＮＡ依存性ＡＴＰ分解酵素（ｄｄＡＴＰａｓｅ）を標的とする配列を有するポリヌクレオチドの組み合わせを含む、少なくとも１つの植物致死性薬剤から成る成長期植物の外面に局所的なコーティングするのに適当な除草性組成物を説明する。
除草性の組成物には、以下の２１塩基対の二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つが含まれる：
（１）ｎＤｓＲＮＡ１：センス鎖ＣＵＡＣＣＡＵＣＡＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＣＣ（配列番号６３）およびアンチセンス鎖ＧＧＡＣＡＣＣＡＵＵＧＵＵＧＡＵＧＧＵＡＧ（配列番号６４）
（２）ｎＤｓＲＮＡ３：センス鎖ｇＵＣＧＡＣＡＡＣＵＵＧＣＵＧＵＡＵＡＧＵ（配列番号６５）およびアンチセンス鎖ＡＣＵＡＵＡＣＡＧＣＡＡＧＵＵＧＵＣＧＡＣ（配列番号６６）
（３）ｎＤｓＲＮＡ４：センス鎖ｇＧＵＣＡＣＣＵＧＧＡＣＡＧＡＧＡＡＵＡＧ（配列番号６７）およびアンチセンス鎖ＣＵＡＵＵＣＵＣＵＧＵＣＣＡＧＧＵＧＡＣＣ（配列番号６８）
（４）ｎＤｓＮＡ５：センス鎖 ＡＡＵＧＣＣＡＧＡＵＧＵＵＧＣＵＡＵＧＡＣ（配列番号６９）およびアンチセンス鎖ＧＵＣＡＵＡＧＣＡＡＣＡＵＣＵＧＧＣＡＵＵ（配列番号７０）
複数のポリヌクレオチドの混合物は、処理された植物の耐性の選択を妨げるために有利である。ある実施形態において、除草性組成物には配列番号６３−７０を有する上記のｄｓＲＮＡポリヌクレオチドの４つすべての混合物が含まれる。別の実施形態では、除草性組成物には、ｄｓＲＮＡ配列配列番号６３−７０の１つ以上に対応するデオキシリボヌクレオチド配列を含む一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドが含まれる。別の実施形態では、除草性組成物には１つ以上のｄｓＲＮＡ配列配列番号６３−７０に対応するヌクレオチド配列を含むＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが含まれる。別の実施形態では、安定化のために、除草性組成物には２’水酸基がメチル化されるｄｓＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。
除草性組成物には、Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７のような界面活性剤（または実施例３６に提供される他の効果的な界面活性剤）が含まれる。任意選択的に、除草性組成物には、例えば植物内部へのポリヌクレオチド移送を強化する、ポリヌクレオチドの有効性を増強する、または非ポリヌクレオチド除草剤の除草性の活性を増強することによって除草能を改善するために、塩、キレート剤または吸湿剤（実施例３５に提供されるような）のような１つ以上の添加剤が含まれ得る。
任意選択的に、除草性組成物には植物の複数の遺伝子を制御するように設計されたポリヌクレオチドが含まれる。ある実施形態では、除草性組成物には、第二の遺伝子の配列または第二の遺伝子から転写されるＲＮＡ配列と本質的に同等または相補的な配列を有するポリヌクレオチドが含まれ、ここで第二の遺伝子の制御により組成物の除草性活性の相乗的な増加がもたらされる。
ある実施形態では、除草性組成物には、パルマーアマランスの内在性５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）遺伝子の配列、または、内在性ＥＰＳＰＳ遺伝子から転写されたＲＮＡの配列に実質的に同一または相補的な配列を有するポリヌクレオチド、および、内在性のＰａｌｍｅｒ翻訳開始因子（ＴＩＦ）遺伝子の配列または内在性のＴＩＦ遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と本質的に同一または相補的な配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。翻訳開始因子（ＴＩＦ）は、タンパク質合成の開始に必須で植物全体に発現される核コード化葉緑体タンパク質である。アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）はＡＴ１Ｇ１７２２０．１という名称のオルソログを有する（ウエブサイトｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｓｅｒｖｌｅｔｓ／ＴａｉｒＯｂｊｅｃｔ？ｔｙｐｅ＝ｌｏｃｕｓ＆ｎａｍｅ＝ＡＴ１Ｇ１７２２０で一般公開されているデータベースＴｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅに記載され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：１８６４７８５７３が割り当てられ、これは細菌性の翻訳開始因子２との類似性を有する葉緑体局在性タンパク質として同定された；本遺伝子の説明に関してＭｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １９：１３１３-１３２８ も参照）。ＴＩＦ配列はパルマーアマランス（アマランサスパルメリ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ）））から同定された；あるＴＩＦ遺伝子は配列番号７１の配列を有することが同定された。アマランサスパルメリの該ＴＩＦ遺伝子抑制のためのポリヌクレオチドの例は表１０に記載される。
Figure 0006321071
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ある実施形態において、除草性組成物には、配列番号６３−７０を有する上記のＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドのうち少なくとも２つを有する混合物、および表１０に提供されるような、内在性のＰａｌｍｅｒ翻訳開始因子（ＴＩＦ）遺伝子の配列または内在性のＴＩＦ遺伝子から転写されるＲＮＡ配列に本質的に同一または相補的な配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドも含まれる。特定の実施形態において、除草性組成物には、配列番号６３−７０を有する４つのＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドならびに以下のセンス配列およびアンチセンス配列を有する１６０塩基対のＴＩＦ二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの混合物が含まれる。すなわち、ＵＵＣＧＡＧＵＡＡＵＧＧＧＡＡＡＵＵＧＧＡＵＡＡＵＧＵＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＵＵＡＵＵＧＡＵＵＣＡＵＵＧＧＡＵＧＡＧＧＵＡＵＵＡＧＡＡＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＧＡＵＵＡＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＡＣＵＵＡＣＡＡＧＣＡＧＡＵＡＡＵＡＧＡＡＡＧＧＡＵＡＧＣＡＣＡＡＡＵＧＵＡＡＡＵＡＡＡＣＣＧＵＣＵＣＣＧＡＧＵＧＵＡＡＧＵ（配列番号７３）のセンス配列およびＡＣＵＵＡＣＡＣＵＣＧＧＡＧＡＣＧＧＵＵＵＡＵＵＵＡＣＡＵＵＵＧＵＧＣＵＡＵＣＣＵＵＵＣＵＡＵＵＡＵＣＵＧＣＵＵＧＵＡＡＧＵＵＣＧＣＣＧＵＵＵＣＵＡＡＵＣＵＣＵＣＧＧＣＣＵＵＵＵＣＵＡＡＵＡＣＣＵＣＡＵＣＣＡＡＵＧＡＡＵＣＡＡＵＡＡＣＣＵＵＣＵＵＣＣＵＣＵＣＣＵＣＵＡＣＡＵＵＡＵＣＣＡＡＵＵＵＣＣＣＡＵＵＡＣＵＣＧＡＡ（配列番号７４）のアンチセンス配列である。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは複数の標的遺伝子を調節するために設計され、その結果、除草剤活性への相乗効果が生じる。例えば、除草剤活性に対する相乗的な効果は、翻訳開始因子（ＴＩＦ）および５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）を抑制するように設計されたポリヌクレオチドでの植物の処理、続いて非ポリヌクレオチド除草剤グリホサートでの処理により得られた。
表１１に記載のポリヌクレオチドを合成またはインビトロ転写により作製した。
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ポリヌクレオチドの溶液を調整し、表１２に記載のプロトコールを使用してパルマー・アマランス（Ｐａｌｍｅｒ ａｍａｒａｎｔｈ）の葉に適用した。
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表１３に示されるようにポリヌクレオチドの組み合わせをテストした。
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 ＊複数コピー数が記載されている場合、処理された植物はコピー数の混合物であった。
＊＊ＤＡＴ＝処理後の日数；「０％制御」は処理された植物と対照植物に違いが観察されなかったことを意味する；成長阻害％は［１００-（試験植物の平均の高さ／対照植物の平均の高さ）＊１００］のように計算される。
アマランサスパルメリのＴＩＦ遺伝子の抑制のための二本鎖２５-ｍｅｒ ＲＮＡポリヌクレオチド配列を、表１４に記載されるように設計した。
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ＴＩＦ ２５-ｍｅｒ ｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを高コピー（１１２）および低コピー（１６）のＥＰＳＰＳグリホサート耐性パルマー・アマランス（Ｐａｌｍｅｒ ａｍａｒａｎｔｈ）双方に対して試験した。
１１．５グラム／エーカーの４つの短いＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ（実施例１に記載の短いｄｓＲＮＡ-１、短いｄｓＲＮＡ-３、短いｄｓＲＮＡ-４、およびＩＤＴ［５］（表１１に記載の配列番号９１−９２））ならびに５．８グラム／エーカーの１つのＴＩＦ ｄｓＲＮＡとの混合物で、または、５．８グラム／エーカーの各ＴＩＦ ２５ｍｅｒ ｄｓＲＮＡで、高コピー植物を処理した。ポリヌクレオチド溶液を２％硫酸アンモニウムおよび１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７を含む１０ミリモル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に製剤した。ポリヌクレオチド処理後３０分で、植物にグリホサート（１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）を噴霧、または噴霧しなかった。
０．２３グラム／エーカーの４つの短いＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ（実施例１に記載の短いｄｓＲＮＡ-１、短いｄｓＲＮＡ-３、短いｄｓＲＮＡ-４、およびＩＤＴ［５］（表１１に記載の配列番号９１−９２））ならびに５．８グラム／エーカーの１つのＴＩＦ ｄｓＲＮＡとの混合物で、または、５．８グラム／エーカーの各ＴＩＦ ２５ｍｅｒ ｄｓＲＮＡで低コピー植物を処理した。ポリヌクレオチド溶液を２％硫酸アンモニウムおよび１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７を含む１０ミリモル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に製剤した。ポリヌクレオチド処理後３０分で、植物にグリホサート（１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）を噴霧、または噴霧しなかった。
結果を図３１および３２に示し、ＴＩＦポリヌクレオチドがＥＰＳＰＳポリヌクレオチドの活性を増強しＴＩＦポリヌクレオチドが除草性の活性をそれ自身有することを示す。
実施例２７
本発明の態様には、植物中の非ポリヌクレオチド除草剤活性を増強するためのポリヌクレオチド組成物および使用方法が含まれる。例えば、除草剤の標的遺伝子または除草剤の不活性化遺伝子またはストレス応答遺伝子またはそのような標的遺伝子の組み合わせを制御するように設計されたポリヌクレオチド組成物を、雑草または自生の植物に、非ポリヌクレオチド除草剤（典型的な通常の化学的除草剤）の適用と同時に、または、その後に、またはその前に適用し、非ポリヌクレオチド除草剤の活性を増強する。ポリヌクレオチド組成物と非ポリヌクレオチド除草剤（例えば、通常の化学的除草剤）の組み合わせは、相乗的な効果をもたらす。つまり組み合わせの除草性の効果は、ポリヌクレオチド組成物の除草性の効果と非ポリヌクレオチド除草剤の除草性の効果の合計よりも高い。
通常の化学的除草剤の例およびその対応する除草剤標的遺伝子を表１５に提供する。
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通常の化学的除草剤およびその対応する除草剤の不活性化遺伝子の例を表１６に提供する。
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実施例２８
本実施例は、標的内在性遺伝子または標的内在性遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡの１８以上連続したヌクレオチド配列に本質的に同一もしくは本質的に相補的な配列を有するポリヌクレオチドを、成長期植物の葉に局所的にコーティング、それによりポリヌクレオチドが成長期植物の内部に浸透し標的内在性遺伝子の浸透移行性の調節を誘導することを含む、成長期植物中の標的内在性遺伝子の浸透移行性調節を誘導するための方法を説明する。
二本鎖ＲＮＡまたはアンチセンスｓｓＤＮＡポリヌクレオチドを、除草剤標的遺伝子５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）およびグルタミン合成酵素（ＧＳ）に対して設計した。各除草剤標的遺伝子に対して、０．５％ＳｉｌｗｅｔＬ-７７噴霧（１０ガロン／エーカー）適用後１０ミリモル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８中２％硫酸アンモニウム中に８つのアンチセンスｓｓＤＮＡポリヌクレオチドの混合物を含む溶液を２．３２ｇ／エーカーの割合で適用した。試験されたポリヌクレオチドおよび結果の表現型の観察を表１７に記載する。
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パルマー・アマランス（Ｐａｌｍｅｒ ａｍａｒａｎｔｈ）に除草剤メソトリオン、ホメサフェン、およびアトラジンを組み合わせて使用する際の、酵素４-ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰＤ）およびプロトポルフィリノーゲン酸化酵素（ＰＰＯ）、および転写開始因子（ＴＩＦ）を標的とするｓｓＤＮＡポリヌクレオチドの除草性活性、およびその除草性の活性に対する効果を研究した。本実験で使用されるポリヌクレオチドは８つのＨＰＰＤアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１４１−１４８）、８つのＰＰＯアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１２５−１３２）、および８つのＴＩＦアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号７５−８２、実施例２６を参照）であった。
グリホサート感受性のパルマーアマランス（アマランサスパルメリ）植物を３．５ｋｇ／立方メートルのＯｓｍｏｃｏｔｅ（登録商標）１４-１４-１４成長促進剤を含むＳｕｎＧｒｏ（登録商標）Ｒｅｄｉ-ｅａｒｔｈ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｍｉｘを含む４平方インチのポット中、温室で、明期１４時間および日中温度摂氏３０度、夜間温度摂氏２０度で栽培した；必要な際に植物に地下灌漑した。
１０−１５ｃｍの高さの植物を手動で４０マイクロリットル（４枚の完全に開いた成熟した葉を、各植物の葉あたり１０マイクロリットルの溶液で処理した）の緩衝液-界面活性剤溶液（対照として；０．５％ＳｉｌｗｅｔＬ-７７および２％硫酸アンモニウム）または緩衝液-界面活性剤-ｓｓＤＮＡポリヌクレオチド混合物（ＨＰＰＤ、ＰＰＯ、またはＴＩＦを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物）で前処理した。いくつかの植物を未処理のままにして対照として使用した。２４時間後、未処理の植物、緩衝液-界面活性剤処理された植物および緩衝液-界面活性剤-ｓｓＤＮＡ処理された植物を、９５０１Ｅノズルを装備し、１ヘクタールあたり９３リットルの溶液（表１８に示されるようなＨＰＰＤ阻害剤、メソトリオン（１ガロンあたり４ポンドの活性成分；）、またはＰＰＯ阻害剤、ホメサフェン（１ガロンあたり２ポンドの活性成分）、または光化学系ＩＩ阻害剤、アトラジン（９０％活性成分）を含む）を送達するように較正したトラック噴霧器（ｔｒａｃｋ-ｓｐｒａｙｅｒ）を用いて処理した。１％の濃縮作物油（ｃｒｏｐ ｏｉｌ ｃｏｎｃｅｔｒａｔｅ）（ＣＯＣ）をすべての除草剤の処置に添加した。低い割合の各除草剤を（メソトリオン：推奨される現場の割合の１／８に相当する１エーカーあたり１３ｇ；ホメサフェン：推奨される現場の割合の１／２２に相当する１エーカーあたり１６ｇおよびアトラジン：推奨される現場の割合の１／８に相当する１エーカーあたり１７０ｇ）オリゴヌクレオチド混合物による除草性の活性のいかなる改良も検出できるように使用した。
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植物の背丈を除草剤処理後４日目に決定した。１つの実験から一処理あたり４回の反復でデータを収集した。結果（緩衝液-界面活性剤溶液、ｓｓＤＮＡ、および除草剤処理の組み合わせに影響を受けたパルマーアマランス植物の背丈として表現される）を表１９および図３３に示す。ＨＰＰＤアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＰＰＯアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＴＩＦアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドで処理された植物は成長阻害を示し、それぞれ、１２５、１５３、および１１５ｍｍを測定したが、一方で、緩衝液-界面活性剤（対照）で処理された植物は１８５ｍｍ（図３３）を測定した。ＨＰＰＤアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＰＰＯアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、およびＴＩＦアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドでの処理は、緩衝液-界面活性剤対照と比較して、それぞれ３２％、１８％、および３８％成長減少を引き起こした。
緩衝液-界面活性剤、続いて除草剤で処理された植物および除草剤のみで処理された植物の背丈に大きな差は観察されなかった。ＨＰＰＤアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、続いてメソトリオンで処理された植物は、植物の成長において最大の減少を示し、背丈は１００ｍｍで、緩衝液-界面活性剤処理された植物と比較して４６％の減少を測定した。ＰＰＯアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、続いてホメサフェンで処理された植物は１２６ｍｍで、緩衝液-界面活性剤処理された植物と比較して３２％の減少を測定した。ＴＩＦアンチセンスｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、続いてアトラジンで処理された植物は１２１ｍｍで、緩衝液-界面活性剤処理された植物と比較して３４％の減少を測定した。
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実施例２９
本実施例は、試験された配列が観察可能な表現型に及ぼす効果を確認するために、異なる必須遺伝子に対して設計された二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドの試験された配列を説明する。各必須遺伝子について、０．５％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７噴霧（１０ガロン／エーカー）の適用後、２％硫酸アンモニウムの１０ミリモル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８にｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを含む溶液を、一植物あたり２４０ピコモルの割合でパルマーアマランスに適用した。試験されたポリヌクレオチドおよびその結果として発生した表現型の観察を表２０に列挙する。
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実施例３０
本実施例は、特定の低い配列相同性領域を標的とするように設計されるポリヌクレオチド、および、例えば標的遺伝子の特定の対立遺伝子または特定の種の遺伝子を選択するために有用なポリヌクレオチドを説明する。非コード配列を標的とするように設計されたポリヌクレオチドは、遺伝子制御に関与する非コードＲＮＡを制御するのに、例えば、ＲＮＡｉ制御経路においてプロセシングされてｓｉＲＮＡになる非コードＲＮＡの制御に有用である。図３４にベンサミアナタバコＰＤＳ遺伝子座１プロモーター（配列番号３１９）およびＰＤＳ遺伝子座２プロモーター（配列番号３２０）の配列比較を示す。複数の転写開始点を含む遺伝子座１では、本配列比較で使用されるプロモーター配列は、最も５’の転写開始点を有する配列である。ベンサミアナタバコＰＤＳ１およびＰＤＳ２遺伝子はプロモーター領域には低い配列相同性しか有しないが、コーディング領域には高い配列相同性を有することが見い出された。
表２１にＰＤＳ１およびＰＤＳ２プロモーターの異なる部分を標的とするように設計されたポリヌクレオチドを列挙する。
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表２１に記載または図３５に説明されるポリヌクレオチド（適用ポリヌクレオチド毎に１ナノモル／植物）の６つの異なる組み合わせを４週令のベンサミアナタバコ植物に実施例１２に記載の手順と同様の工程を用いて試験した。ポリヌクレオチド溶液を５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８中０．０１％（ｖ／ｖ）Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７および２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウムに調整した。一植物あたり２枚の完全に開いた葉を新たにｄｄＨ２Ｏで作製した０．１％ＳｉｌｗｅｔＬ-７７溶液に数秒間浸漬し、乾燥させた。約３０分後、２０マイクロリットルのポリヌクレオチド溶液を２枚の前処理した各葉に適用した。ポジティブ制御の植物をＰＤＳ１およびＰＤＳ２のコード領域の保存セグメントを標的とするＤＮＡオリゴヌクレオチドで同様に処理した。ネガティブ制御の植物を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現抑制するように設計されたＤＮＡオリゴヌクレオチドで同様に処理した。ＰＤＳ１またはＰＤＳ２プロモーター領域を標的とするように設計されたポリヌクレオチドの６つすべての組み合わせは、退色により証明されるように、処理された植物の浸透移行性サイレンシングを誘導した。約２００ｂｐでＰＤＳ１またはＰＤＳ２プロモーター領域を標的とするｄｓＲＮＡまたはｄｓＤＮＡポリヌクレオチドでの処理も、退色により証明されるように処理された植物の浸透移行性サイレンシングを誘導した。
表２２に記載の以下の付加的なゲノム配列（プロモーターならびに転写されたイントロンおよびエクソン配列を含む）は、局所適用のためのポリヌクレオチドを設計する際に使用するために、アマランサス・パルメリ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ）遺伝子に関して同定されたものである。
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実施例３１
本実施例は、複数の植物種において遺伝子発現を制御するポリヌクレオチド配列を説明する。異なる雑草種由来のＥＰＳＰＳ配列中の２ヶ所の非常によく保存された領域が同定され、表２３に「領域１」および「領域２」配列として示された。
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表２４では、領域２のＥＰＳＰＳコンセンサス配列、すなわち、ＴＮＧＡＮＧＴｃＡＡｃＡＴＧＡＡｃＡＡａＡＴＧＣＣａＧＡＴＧＴＮＧＣＮＡＴＧＡＣＮｃＴｔＧＣＮＧＴＮＧＴＴＧＣ（配列番号２６３）のに基づき設計された２１-、２２-、２４-、３５-、４５-、および５５-ｍｅｒのｄｓＲＮＡポリヌクレオチド配列を列挙する。
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ＥＰＳＰＳコンセンサスｄｓＲＮＡポリヌクレオチドをインビトロ転写により合成し、未精製のＲＮＡ調製物として局所的に適用した。グリホサート耐性の雑草（１６-コピーのパルマーアマランスおよびヒメムカシヨモギ）を６つそれぞれの（２１-、２２-、２４-、３５-、４５-、５５-ｍｅｒ）コンセンサス ｄｓＲＮＡで処理した。非-グリホサート耐性の雑草（ウォーターヘンプ（ｗａｔｅｒｈｅｍｐ）、エビスグサ、メヒシバ、アサガオ、シロザ、トウダイグサ）を３つそれぞれの短い（２１-、２２-、２４-ｍｅｒ）コンセンサスｄｓＲＮＡで処理した。ポリヌクレオチドでの処理後、グリホサート耐性の植物をグリホサート（１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）で処理し、非グリホサート耐性植物をグリホサート（１ヘクタールあたり１０５ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）で処理した。処理後７日目に、６つのＥＰＳＰＳ領域２コンセンサスｄｓＲＮＡポリヌクレオチドすべてはグリホサート耐性パルマーアマランスの１００％制御（枯れた植物）を与えることが見い出された；グリホサート単独で処理された対照のパルマーアマランスは枯れなかった。処理後７日目に、それぞれ試験された３つの短い（２１-、２２-、２４-ｍｅｒ）ＥＰＳＰＳ領域２コンセンサスｄｓＲＮＡポリヌクレオチドは、それぞれ、ウォーターヘンプ（ｗａｔｅｒｈｅｍｐ）の９５％、８０％および６５％制御を与えることが見い出された。グリホサートのみで処理されたウォーターヘンプ（ｗａｔｅｒｈｅｍｐ）植物は約４０％制御（枯れた植物と損傷した植物を合わせた）を与えた。そして３つの短い（２１-、２２-、２４-ｍｅｒ）コンセンサスｄｓＲＮＡポリヌクレオチド全てを含む混合物はグリホサート単独とほぼ同じ制御を与えた。ＥＰＳＰＳ領域２コンセンサスｄｓＲＮＡポリヌクレオチドは、試験された他の雑草種（ヒメムカシヨモギ、エビスグサ、メヒシバ、アサガオ、シロザ、トウダイグサ）に観察可能な効果をもたらさなかった。
実施例３２
本実施例は、所望の表現型をもたらすために、植物中の遺伝子を一時的に発現抑制するための局所ポリヌクレオチド処理の使用を説明する。植物組織中のポリフェノール酸化酵素の発現抑制は、切断または損傷をうけた植物組織の褐変を阻害し、褐変への耐性が所望の形質である果実および野菜の有用な形質でる。
表２５に示される配列のアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを、レタス由来の３つのポリフェノール酸化酵素遺伝子（ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、およびＰＰＯ３）を標的とするように設計した。下線付き箇所はアンチセンスポリヌクレオチドに含まれるＴ７配列を示す。
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３週令のレタス植物（変種ＳＶＲ３６０３ Ｌ４）を以下のように処理した。各植物の２ヶ所の供給源の葉（より古く、成熟サイズの−６０％の葉）を０．１％（ｖ／ｖ）Ｓｉｌｗｅｔ-Ｌ-７７で前処理し、乾燥させた（−１５分間）。各葉に対して、５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８中０．０１％（ｖ／ｖ）Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７および２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム溶液中のポリフェノール酸化酵素アンチセンスポリヌクレオチドの混合物を２０マイクロリットル液滴として適用した。各植物を６．７ナノモルの３つの各ポリヌクレオチドＨＨ０７、ＨＨ０９およびＨＨ１１（一植物あたり全量２０ナノモル）で処理した。対照植物を、無関係のポリヌクレオチドＨＨ０２-０５（フィトエン不飽和化酵素に対するアンチセンス）または緩衝液単独（５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８中０．０１％（ｖ／ｖ）Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７および２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム）で処理した。
局所的なポリヌクレオチド処理後約３週間で、「未処理」のレタスの葉（つまり、局所的なポリヌクレオチドで処理されていない葉）を水中でレタスの結球から切断し５％エタノール中１．３３ミリモル濃度のジャスモン酸メチルの入ったカップの中でインキュベーションした。中央の葉脈の褐変について葉を調べ、２４時間毎に写真を撮った。サンプルを残りの植物から採取し、低分子ＲＮＡおよびｍＲＮＡ分析のために凍結させた。
ポリフェノール酸化酵素アンチセンスポリヌクレオチドＨＨ０７、ＨＨ０９、およびＨＨ１１で処理された植物は、ジャスモン酸メチル処理後、中央の葉脈の褐変に有意な低下を示した。対照としてＨＨ０２-０５（フィトエン不飽和化酵素に対するアンチセンス）で処理された植物は、緩衝液処理された対照と比較して中央の葉脈の褐変に少しの低下を示した。
実施例３３
本実施例は、成長期植物の外面の局所コーティングに適当な、界面活性剤および少なくとも１つの植物の致死性薬剤を含む除草性組成物を説明し、植物の致死性薬剤が植物遺伝子の配列または植物遺伝子の転写されたＲＮＡの配列に対して本質的に同一または相補的な配列を有するポリヌクレオチド、植物遺伝子の浸透移行性抑制をもたらすポリヌクレオチドを含む改良を説明する。さらに詳細には、本実施例は、成長期植物の外面に局所コーティングするのに適当な、界面活性剤および少なくとも１つの植物の致死性薬剤を含む除草性の組成物を説明し、植物の致死性薬剤がベンサミアナタバコ由来の内在性フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）、５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）、またはリブロース-１、５-二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）遺伝子の抑制をもたらすポリヌクレオチドを含む改良を説明する。本実施例はまた、植物中、高度に発現する遺伝子（リブロース-１、５-二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ）を抑制するために局所的に適用されるポリヌクレオチドの使用も説明する。
配列ＣＡＴＣＴＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧＴＡＣＴＧＣ（配列番号３４）を有するアンチセンスポリヌクレオチドは、以下のｃＤＮＡ配列断片を有する、内在性のベンサミアナタバコフィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）遺伝子のために設計された。すなわち、
ＡＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＣＧＧＡＣＴＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧＧＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴＴＣＧＴＴＧＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＡＴＧＴＴＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴＧＴＴＴＴＧＧＴＡＧＴＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＧＧＡＴＴＣＧＴＡＣＴＣＣＡＡＧＴＧＣＣＡＣＧＡＣＣＣＧＡＡＧＡＴＴＧＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＡＡＴＣＣＴＴＴＡＡＡＧＧＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＴＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＴＴＣＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＣＧＣＣＣＡＡＣＴＡＡＡＣＣＡＴＴＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＡＡＣＣＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＣＴＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＴＧＧＴＡＣＧＡＧＡＣＴＧＧＧＴＴＧＣＡＣＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＧＧＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＣＧＡＴＧＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＧＣＣＡＴＴＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＧＧＣＣＡＴＡＣＴＡＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＡＡＡＴＧＣＴＴＡＣＧＴＧＧＣＣＣＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＡＡＴＴＴＧＣＴＡＴＴＧＧＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＧＴＴＴＡＡＧＴＧＴＴＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＴＡＡＣＴＴＣＡＴＡＡＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＣＧＡＴＧＣＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＧＡＴＴＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＡＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＣＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＴＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧＡＧＡＧＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＣＣＧＡＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＴＧＡＧＴＣＡＡＡＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＣＴＡＡＡＣＴＣＡＣＧＡＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＡＣＴＧＡＡＴＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＡＴＴＡＡＡＧＧＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＴＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＴＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡＴＣＴＧＡＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＴＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＣＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＴＣＡＧＴＣＴＡＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＴＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＴＡＡＡＴＣＧＴＡＧＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＴＣＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＴＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡＴＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＴＴＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＧＣＣＣＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＴＡＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＴＡＣＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＡＴＣＡＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＡＡＧＣＴＡＴＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＴＡＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＣＴＴＧＧＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＴＡＧＣＡＴＡＧＴＧＡＡＣＴＡＡ（配列番号３８）である。配列ＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＣＡ（配列番号２７９）、ＣＣＴＴＡＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＴＡＧＣＡＡ（配列番号２８０）、ＣＡＧＣＣＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＴＣＡＴＴＣ（配列番号２８１）、ＧＣＣＧＴＣＡＡＴＧＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＴ（配列番号２８２）、ＴＣＣＴＴＣＣＣＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＡＧ（配列番号２８３）およびＴＴＧＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＡＴＣＴＧ（配列番号２８４）を有するアンチセンスポリヌクレオチドは、内在性のベンサミアナタバコ５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）遺伝子のために、、ニコチアナ・ベンサミアナベンサミアナタバコＥＰＳＰＳｃＤＮＡ配列に基づき設計された。すなわち、ＣＴＴＡＴＡＴＧＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣＴＡＡＣＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＣＣＴＴＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴＣＡＡＴＣＴＡＣＣＴＡＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＡＡＧＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＧＡＧＴＧＡＡＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＴＡＣＡＧＡＣＣＣＣＴＡＡＴＣＴＴＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＣＡＴＴＣＴＡＴＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＡＧＧＧＴＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＣＣＴＴＴＴＡＧＧＡＴＴＴＧＴＧＣＡＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＡＴＣＡＧＧＣＡＣＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＣＣＴＧＧＴＴＣＴＡＡＡＴＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＴＣＴＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＴＡＣＴＧＡＧＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧＴＧＣＧＴＴＧＡＡＡＡＣＡＣＴＴＧＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＡＧＣＡＡＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＴＴＡＣＴＧＴＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＡＴＡＴＧＴＡＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＡＧＧＡＴＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＧＡＴ（配列番号２８５）、ＣＡＣＴＧＡＣＧＴＴＧＧＡＴＴＡＧＡＧＧＴＡＧＧＣＴＣＣＴＴＡＴＡＴＧＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣＴＡＡＣＧＴＧＣＡＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴＣＡＡＴＣＴＡＣＣＴＡＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＡＧＴＡＧＴＴＧＡＡＡＡＴＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＧＧＡＧＴＧＡＡＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＴＡＣＡＧＡＣＣＣＣＴＡＡＴＣＴＴＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＣＡＴＴＣＴＡＴＣＴＴＣＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＡＧＧＧＴＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＣＣＴＴＴＴＡＧＧＡＴＴＴＧＴＧＣＡＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＡＡＣＧＡＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＡＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＡＴＣＡＧＧＣＡＣＴＧＴＴＡＡＡＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＡＡＡＴＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＴＣＧＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＴＣＴＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＴＡＣＴＧＡＧＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＴＴＧＡＡＡＡＣＡＣＴＴＧＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＡＧＣＡＡＴＣＧＴＡＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＴＴＡＣＴＧＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＴＴＣＴＡＧＡＴＡＴＧＴＡＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＡＧＧＡＴ（配列番号２８６）、および
ＡＡＡＴＴＣＴＴＧＧＴＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＣＣＴＣＡＡＧＴＧＣＴＡＧＣＴＡＣＴＴＴＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＴＣＡＣＧＧＴＴＡＡＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＡＧＧＡＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＧＧＣＴＧＴＴＧＡＣＧＴＴＡＡＣＡＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＴＴＧＣＴＧＴＡＧＴＴＧＣＡＣＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＴＡＧＴＣＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＴＴＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＧＧＡＴＧＡＴＴＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＧＧＡＡＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＣＡＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＧＴＡＧＣＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＧＣＧＧＣＴＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＴＡＡＧＧＡＣＣＣＣＧＧＴＴＧＴＡＣＴＣＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴＴＡＡＡＣＣＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＡＡＴＧＧＴＧＴＣＡＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＴＧＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＧＡＴＡＣＴＡＴＴＡＣＴＡＴＡＴＡＧＴＴＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＣＡＧＣＡ（配列番号２８７）に基づいて設計した。配列ＣＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＡＧＴＡＴＣＴＧＣＣ（ＡＫ１９５、ＲＢＣＳ＿１-２-３-４、配列番号２８８）、ＣＡＡＧＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＡＴＣＣＡＴＴ（ＡＫ１９６、ＲＢＣＳ＿１-２-３-４、配列番号２８９）、ＧＧＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＣＡＴＴＧＣ（ＡＫ１９７、ＲＢＣＳ＿１-２-３-４、配列番号２９０）、ＧＴＧＴＴＣＡＣＧＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣ（ＡＫ１９８、ＲＢＣＳ＿１-２、配列番号２９１）、ＴＧＣＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＧＣＡＣＧＴ（ＡＫ１９９、ＲＢＣＳ＿１-２、配列番号２９２）、ＡＡＣＴＧＡＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣ（ＡＫ２００、ＲＢＣＳ＿３-４、配列番号２９３）、ＣＡＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＧＴＡＴＧＡＧＡＧ（ＡＫ２０１、ＲＢＣＳ＿３-４、配列番号２９４）、およびＴＧＴＣＡＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧ（ＡＫ２０２、ＲＢＣＳ＿３-４、配列番号２９５）を有するアンチセンスポリヌクレオチドは、内在性のベンサミアナタバコリブロース-１，５-二リン酸カルボキシラーゼ オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）遺伝子のために、ベンサミアナタバコ葉緑体のＲｕＢｉｓＣＯ ｓｍａｌｌ ｃｈａｉｎ ２Ａ ｃＤＮＡ配列断片に基づき設計された。すなわち、
ＧＣＡＡＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＧＣＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＣＴＣＡＡＧＣＴＡＡＣＡＴＧＧＴＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＴＴＡＡＧＴＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＧＡＣＡＴＣＡＣＴＴＣＣＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＡＴＴＡＡＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＴＣＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＴＴＧＣＴＣＴＣＣＧＡＡＡＴＴＧＡＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＴＧＴＣＴＡＣＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＡＡＧＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＡＣＴＡＴＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＣＴＡＣＣＴＡＴＧＴＴＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＴＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴＧＧＡＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧＴＧＣＧＴＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＴＡＣ（配列番号２９６）、
ＡＣＡＡＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＧＣＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＣＴＣＡＡＧＣＴＡＡＣＡＴＧＧＴＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＴＡＡＧＴＣＡＧＣＴＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＧＴＴＴＣＡＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＧＡＣＡＴＣＡＣＴＴＣＣＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＡＴＴＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＣＴＣＴＣＴＣＡＴＡＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＴＧＣＴＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＧＡＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴＴＴＧＴＣＴＡＣＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＡＡＧＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＡＣＴＡＴＧＡＣＧＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＡＴＧＴＴＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＴＧＣＧＴＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＣ（配列番号２９７）、
ＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧＧＴＴＧＣＡＣＣＣＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＣＴＴＧＡＣＡＴＴＡＣＣＴＣＣＡＴＴＧＣＴＡＧＣＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＡＴＧＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＡＴＴＡＡＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＴＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＴＴＧＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＴＴＣＧＴＣＴＡＣＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＡＣＴＡＣＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＣＣＡＴＧＴＴＣＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＡＴＧＣＣＡＣＴＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＣＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＴＡＧＡＡＴＣＡＴＴＧＧＡＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＴＣＣＧＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＴＧＣＡＴＣＡＧＴＴＴＴＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＣ（配列番号２９８）、および
ＧＧＣＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＡＡＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＴＣＧＣＡＣＣＣＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＧＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＣＴＴＧＡＣＡＴＴＡＣＴＴＣＣＡＴＴＧＣＴＡＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＴＧＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＡＡＴＴＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＴＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＴＴＧＣＴＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＧＡＧＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＧＴＣＴＡＣＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＡＣＴＡＣＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＡＣＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＣＣＡＴＧＴＴＣＧＧＧＴＧＣＡＣＣＧＡＴＧＣＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＴＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＴＴＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＴＣＡＴＴＧＧＡＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＴＣＣＧＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＴＧＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＴ（配列番号２９９）に基いて設計した。
ベンサミアナタバコ植物を実施例１２に記載された手順と同様の手順を用いて処理した。ポリヌクレオチド溶液（または、ＥＰＳＰＳおよびＲｕＢｉｓＣＯの場合には混合ポリヌクレオチド）を５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８中０．０１％（ｖ／ｖ）Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７および２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム中に調製した。一植物あたり２枚の完全に開いた葉を、数秒間、新たにｄｄＨ２Ｏで作製した０．１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７溶液に浸漬し、乾燥させた。約３０分後、２枚の前処理された各葉のに２０マイクロリットルのポリヌクレオチド溶液を適用した。ＰＤＳについては、５つの各植物が２５ナノモルのＰＤＳアンチセンスポリヌクレオチド（配列番号３４）を受け、ＥＰＳＰＳについては、５つの各植物が５０ナノモルの各々のＥＰＳＰＳアンチセンスポリヌクレオチド（配列番号２７９−２８４）を受けた。ＲｕＢｉｓＣＯについては、５つの各植物が５０ナノモルの各ＲｕＢｉｓＣＯアンチセンスポリヌクレオチド（配列番号２８８−２９５）を受けた。対の対照植物を緩衝液（５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８中０．０１％（ｖ／ｖ）Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７および２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム）で処理した。処理後１２日目（ＰＤＳおよびＥＰＳＰＳ）または１０日目（ＲｕＢｉｓＣＯ）に植物の背丈として計測された結果を図３６Ａ−３６Ｂに示す。ＰＤＳアンチセンスポリヌクレオチドで処理された植物は深刻な成長阻害（図３６Ａ）および退色を示した。ＥＰＳＰＳアンチセンスポリヌクレオチドで処理された植物は、深刻な成長阻害（図３６Ｂ）および分裂組織ならびに茎組織に深刻な損傷を示した。ＲｕＢｉｓＣＯアンチセンスポリヌクレオチドで処理された植物は深刻な成長阻害（図３６Ｃ）および先端組織の奇形を示した。
植物の内在性のＲＮＡｉサイレンシング経路の成分のサイレンシング効果を研究するために、第２の実験が設計された。アルゴノート（ＡＧＯ）タンパク質はＲＮＡｉサイレンシング過程の低分子ＲＮＡに結合するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の成分である。アルゴノートの抑制からＲＮＡｉサイレンシング過程起因の観察される表現型の効果を減少させることが期待し得る。配列ＧＧＡＧＧＣＡＡＡＡＴＡＣＧＡＧＣＣＴＣＡ（ＨＬ５１０、配列番号３００）、ＣＡＣＴＡＡＴＣＴＴＡＡＴＡＣＣＡＡＡＣＴ（ＨＬ５１１、配列番号３０１）、ＴＡＴＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＣＡＴＡＧＧＣＡＴＴＡＴ（ＨＬ５１２、配列番号３０２）、ＴＣＴＣＡＡＧＡＡＴＡＴＣＡＣＧＣＴＣＣＣ（ＨＬ５１３、配列番号３０３）、ＣＣＣＴＴＧＧＧＧＡＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＣ（ＨＬ５１４、配列番号３０４）、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＣＴＡＧＡＴＣＴＴＴＴＧ（ＨＬ５１５、配列番号３０５）、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＣＡＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣ（ＨＬ５１６、配列番号３０６）、ＴＴＧＣＴＣＡＴＣＴＴＡＡＡＴＡＣＡＴＧＴ（ＨＬ５１７、配列番号３０７）、ＴＣＡＴＣＴＴＡＡＡＴＡＣＡＴＧＴＴＴＴＧＴＣＡ（ＨＬ５１８、配列番号３０８）、ＴＴＡＴＣＴＴＣＡＧＧＧＡＴＡＣＡＴＴＡＧＣ（ＨＬ５１９、配列番号３０９）、ＡＡＴＡＣＴＧＣＴＴＧＣＴＣＡＴＣＴＴＡＡＡＴＡ（ＨＬ５２０、配列番号３１０）、ＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＴＣ（ＨＬ５２１、配列番号３１１）、ＣＣＧＴＴＴＴＡＧＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＧＡＧＡ（ＨＬ５２２、配列番号３１２）、ＴＴＧＴＣＴＧＧＴＡＡＴＡＴＣＡＣＡＡＴＣ（ＨＬ５２３、配列番号３１３）を有するＡＧＯ１アンチセンスポリヌクレオチドは、内在性のベンサミアナタバコ（アルゴノート-１（ＡＧＯ１）遺伝子のために、２つのベンサミアナタバコＡＧＯ１-２部分ｃＤＮＡ配列に基づき設計された。すなわち、
ＡＴＧＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧＡＧＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＴＡＴＣＡＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＡＣＴＡＣＴＣＡＧＣＣＡＡＴＡＣＣＴＴＡＴＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＣＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＧＴＧＡＣＡＣＡＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＴＣＡＡＧＣＡＡＡＴＴＡＣＴＡＡＧＧＴＴＴＣＣＣＣＴＧＣＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＣＡＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＡＴＧＣＡＴＡＧＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＴＴＣＴＴＣＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＣＴＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＴＣＡＴＣＡＣＧＴＧＧＣＧＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＴＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＴＣＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＣＣＴＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＣＡＡＡＡＴＡＡＣＴＣＴＴＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＴＧＴＧＡＴＣＡＡＡＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＴＣＡＡＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＧＴＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴＣＣＴＧＴＧＧＧＴＣＧＴＴＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＣＣＧＴＧＡＴＴＴＡＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＡＡＧＴＴＧＧＣＧＴＧＧＧＴＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＴＴＣＧＣＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＡＴＣＡＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＡＧＴＣＡＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＣＣＧＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＴＡＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＡＴＡＴＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＡＴＴＴＣＧＧＧＴＴＴＡＡＣＡＴＣＴＣＡＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＴＧＴＡＡＴＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＣＧＡＧＡＡＡＣＡＴＡＴＧＧＧＴＴＴＧＴＡＡＴＴＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＣＴＡＡＴＴＡＣＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＴＴＧＴＧＧＡＧＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＣＴＴＧＡＡＴＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＡＣＴＧＣＡＣＴＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＣＣＣＣＡＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＴＧＡＴＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡＣＣＧＴＡＣＡＴＣＡＴＡＡＴＧＣＣＴＡＴＧＣＴＡＡＴＧＡＣＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＧＧＴＡＴＴＡＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＣＴＣＧＴＡＴＴＴＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＡＡＴＡＴＣＡＴＧＡＴＡＡＣＧＧＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＧＡＣＴＧＣＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＡＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＡＡＡＴＧＧＡＧＧＧＡＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡＴＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＴＡＡＡＣＴＴＣＴＣＴＣＧＣＡＡＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＡＧＴＧＴＴＧＣＴＣＡＴＧＧＧＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣＡＣＡＡＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＡＴＣＴＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＴＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＴＴＣＴＧＣＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＴＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＴＣＧＡＡＡＧＡＧＴＡＴＴＧＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＣＴＡＴＧＡＣＴＡＡＧＴＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＧＣＴＴＧＡＴＴＴＧＣＴＡＧＴＴＧＴＣＡＴＣＴＴＧＣＣＡＧＡＣＡＡＴＡＡＴＧＧＡＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＧＣＧＣＡＴＴＴＧＴＧＡＧＡＣＴＧＡＡＣＴＡＧＧＡＧＴＣＧＴＣＴＣＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＴＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＴＧＴＡＴＴＴＡＡＧＡＴＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＡＴＣＴＡＧＣＣＡＡＴＧＴＡＧＣＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＡＡＣＡＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＴＡＴＣＧＡＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＣＡＧＣＧＡＣＣＧＧＣＣＴＡＣＣＡＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＴＣＴＡＧＣＣＣＡＴＣＣＡＴＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＧＣＣＴＧＡＧＡＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＴＧＣＴＧＧＴＣＴＡＧＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＡＧＣＣＣＡＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＣＧＡＣＴＡＧＧＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＴＴＡＡＧＧＧＧＡＣＡＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＡＴＴＡＡＧＧＡＣＴＴＡＣＴＴＡＴＡＴＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＧＡＧＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＧＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＴＴＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＧＡＡＣＴＴＧＡＴＧＣＧＡＴＣＣＧＣＡＡＡＧＣＡＴＧＴＧＣＧＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＣＡＡＡＴＴＡＴＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＣＡＧＡＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＣＡＣＡＡＧＧＣＴＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＡＧＧＡＧＣＧＧＧＡＡＣＡＴＴＡＴＡＣＣＴＧＧＴＡＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＧＣＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣＡＴＡＣＡＧＧＧＴＡＣＧＡＧＣＣＧＴＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＡＣＣＡＴＧＴＴＣＴＡＴＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣＡＡＡＴＴＣＡＣＡＧＣＣＧＡＴＧＣＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＧＴＴＣＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＣＡＴＡＴＴＡＴＧＣＡＣＡＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴＴＴＣＣＧＴＧＣＴＣＧＡＴＴＴＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＣＧＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＡＣＡＡＧＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＣＣＣＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＡＧＡＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＧＣＴＣＡＡＧＧＡＴＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＧＧＧＴＴＡＴＧＴＴＣＴＡＣＴＧＣ（配列番号３１４）および
ＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＣＧＴＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＣＴＴＣＧＴＧＴＴＴＴＡＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＣＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＴＴＧＡＧＴＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＡＧＴＴＴＴＧＡＧＴＣＣＣＡＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＡＣＡＡＴＣＣＴＡＴＧＧＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＡＡＴＡＣＴＡＣＣＡＡＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＡＡＡＣＡＴＡＣＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＴＣＧＴＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＣＡＡＣＧＡＣＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＣＴＣＡＧＣＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＡＴＧＡＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＧＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＡＧＴＡＣＴＧＧＴＡＴＴＡＧＡＴＧＣＡＴＡＧＴＴＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＡＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＴＡＣＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＴＴＴＣＡＡＴＴＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＣＴＣＧＧＧＧＴＧＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＣＧＴＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＡＧＡＧＡＡＴＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＡＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＴＣＴＡＴＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＣＣＴＣＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＡＡＡＡＧＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＣＡＣＴＣＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＡＧＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＧＴＴＧＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＧＴＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＣＴＴＧＧＧＧＡＴＧＴＴＣＴＴＡＣＡＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＣＧＴＧＡＧＴＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＴＡＧＧＴＡＴＴＧＴＣＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧＣＴＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＣＣＣＴＣＡＴＴＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＡＧＣＴＧＧＣＧＴＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＴＡＴＴＣＧＴＣＣＴＡＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＴＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＴＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＣＧＧＧＡＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＡＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＴＡＡＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＣＡＣＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＡＴＡＴＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＴＡＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＧＧＣＴＴＧＡＣＧＴＣＴＣＡＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＣＴＴＴＴＣＣＴＧＴＣＧＡＴＧＡＡＡＧＧＧＧＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＡＴＴＴＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴＣＧＧＣＡＴＡＣＣＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＴＣＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＣＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＧＡＴＴＧＴＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＴＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＣＴＴＧＡＡＴＧＡＧＡＧＧＣＡＧＡＴＡＡＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＡＡＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＡＣＧＴＣＣＴＣＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＡＴＡＴＴＣＴＴＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＴＣＡＣＡＡＴＧＣＴＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＴＡＴＧＣＧＡＡＧＧＡＧＴＴＴＧＧＴＡＴＴＡＡＧＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＣＴＣＧＣＧＴＴＴＴＧＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＴＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＣＧＣＡＡＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＡＣＡＧＴＴＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＣＡＣＡＡＡＴＧＴＧＣＡＴＧＡＴＡＴＣＣＧＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＧＣＴＣＧＣＣＣＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＧＡＧＡＧＡＧＴＣＴＴＧＡＡＡＡＣＴＣＧＡＴＴＴＣＡＣＧＡＴＧＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＧＣＴＡＧＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＴＧＴＧＡＴＡＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＧＧＣＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＴＣＴＡＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＴＴＧＴＣＴＣＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＴＧＴＡＴＴＴＡＡＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＴＡＴＴＴＡＧＣＴＡＡＴＧＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＧＣＴＣＴＣＴＡＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＴＧＴＣＡＧＣＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＴＡＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＣＴＡＧＣＣＣＧＴＣＡＡＴＴＧＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＡＧＣＧＣＡＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＴＴＡＴＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＡＣＴＴＡＴＴＴＣＣＴＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＣＡＧＡＧＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＴＴＴＴＡＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＧＣＡＡＧＧＣＡＴＧＴＧＣＡＴＣＴＴＴＡＧＡＡＣＣＣＡＡＣＴＡＴＣＡＧＣＣＣＣＣＧＧＴＴＡＣＧＴＴＴＧＴＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＡＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＴＡＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＴＧＡＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴＧＴＡＧＡＴＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＡＣＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＴＡＧＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣＡＴＡＣＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＣＣＧＣＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＴＧＴＴＣＴＧＴＧＧＧＡＴＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＴＧＡＣＴＡＡＣＡＡＴＣＴＴＴＧＣＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＡＣＴＣＧＴＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＡＴＴＡＴＧＣＡＣＡＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴＴＴＣＣＧＴＧＣＴＣＧＧＴＴＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＡＴＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＴＣＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＡＣＧＣＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＡＧＧＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＧＡＧＧＧＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴ（配列番号３１５）に基づき設計した。
ベンサミアナタバコ植物を実施例１２に記載の手順と同様の手順を用いて処理した。ポリヌクレオチド溶液（ＡＧＯ１の場合には混合ポリヌクレオチド）を５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８中０．０１％（ｖ／ｖ）Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７および２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウムに調整した。一植物あたり２枚の完全に開いた葉を、数秒間、新たにｄｄＨ２Ｏで作製した０．１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７溶液に浸漬し、乾燥させた。約３０分後、２枚の前処理された各葉に２０マイクロリットルのポリヌクレオチド溶液を適用した。ＰＤＳについては、５つの各植物が２５ナノモルのＰＤＳアンチセンスポリヌクレオチド（配列番号３４）を受け；ＡＧＯ１については、５つの各植物が５０ナノモルの１４個各々のＡＧＯ１アンチセンスポリヌクレオチド（配列番号３００−３１３）を受けた。ＰＤＳおよびＡＧＯの併用処理については、５つの各植物が２５ナノモルのＰＤＳアンチセンスポリヌクレオチド（配列番号３４）および５０ナノモルの１４個の各ＡＧＯ１アンチセンスポリヌクレオチド（配列番号３００−３１３）を別々の葉に適用された。対の対照植物を緩衝液（５ミリモル濃度のリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８中０．０１％（ｖ／ｖ）ＳｉｌｗｅｔＬ-７７および２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム）で処理した。ＡＧＯ１アンチセンスポリヌクレオチドで処理された植物と緩衝液のみで処理された植物に違いは観察されなかった。ＰＤＳアンチセンスポリヌクレオチドで処理された植物は浸透移行性退色を示した。ＰＤＳアンチセンスポリヌクレオチドおよび別に適用されたＡＧＯ１アンチセンスポリヌクレオチドの両方で処理された植物は浸透移行性退色を示さず、このことはＡＧＯ１の抑制がサイレンシングシグナルの浸透移行性広がりを阻害したことを示唆する。
実施例３４
本実施例は、成長期植物の葉に、標的内在遺伝子または標的内在遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡの１８以上の連続する配列に本質的に同一または本質的に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを局所的にコーティングすることを含み、それにより、ポリヌクレオチドが該成長期植物の中へ浸透し、該標的内在遺伝子の浸透移行性サイレンシングを誘導することを含む、成長期植物の標的内在遺伝子の浸透移行性調節を誘導する方法を説明する。さらに詳細には、本実施例は、少なくとも一時的に内在性のジーアメイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）遺伝子の浸透移行性の調節を誘導するために、界面活性剤およびポリヌクレオチドを含む組成物の使用を説明する。
内在性のジーアメイズ５-エノイルピルビニルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）遺伝子のゲノム配列は、以下のように同定された。すなわち、
ＡＣＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＣＴＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＴＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＧＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＴＣＧＣＧＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＴＧＣＣＧＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＧＴＣＡＧＧＴＣＣＴＡＧＧＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＣＧＡＣＣＣＣＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＴＣＣＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＧＣＧＡＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＣＡＡＣＣＡＴＣＧＧＣＧＴＣＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＴＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＣＡＡＧＴＣＧＣＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＣＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＣＴＴＧＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＡＣＴＧＣＴＡＣＣＴＡＡＡＴＧＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＣＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＣＧＧＴＧＴＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＴＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＧＣＡＴＧＴＣＧＣＡＴＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧＴＡＧＴＴＴＧＴＡＴＡＣＧＧＡＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＡＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＡＧＣＴＡＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＡＡＣＡＣＴＡＧＡＡＡＡＴＴＧＧＡＴＧＴＴＣＣＣＣＴＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＣＴＣＧＴＴＣＴＴＧＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＴＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＧＧＣＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＧＣＣＣＴＣＡＡＧＧＧＴＴＧＡＴＣＴＴＡＴＧＣＣＡＴＣＧＴＣＡＴＧＡＴＡＡＡＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＣＧＧＡＣＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＧＴＴＧＴＴＴＴＴＡＡＣＡＡＡＣＴＴＴＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＡＧＣＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＴＴＡＡＴＧＡＣＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＧＧＴＡＡＣＣＴＣＧＣＴＡＣＴＡＡＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＣＴＴＡＴＴＡＡＴＴＡＴＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＧＧＴＴＧＡＴＡＡＣＣＴＧＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＣＴＡＣＡＴＧＣＴＣＧＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧＣＧＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＡＡＡＡＧＡＧＣＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＴＴＣＣＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＴＴＣＴＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴＡＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＡＣＡＡＴＡＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＡＡＣＣＣＡＴＧＧＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＴＧＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＴＴＡＣＧＴＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＴＧＡＧＧＧＡＧＡＧＡＣＣＣＡＴＴＧＧＣＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＧＧＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＧＡＴＴＧＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＴＣＧＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＧＴＴＡＧＣＴＡＣＴＡＡＧＧＧＣＣＡＣＡＴＧＴＴＡＣＡＴＴＣＴＴＣＴＧＴＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡＡＣＴＡＴＴＧＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＡＣＡＣＣＡＣＡＡＡＡＴＡＴＣＣＴＡＣＡＡＡＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＴＡＡＣＴＡＧＣＡＡＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＴＴＧＧＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＴＧＴＴＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＡＴＡＧＣＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡＴＴＡＧＣＴＣＴＴＡＣＡＡＴＴＧＴＴＡＴＧＴＴＣＴＡＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＴＡＣＴＴＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＡＧＡＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＧＡＴＡＡＡＴＴＡＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＧＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡＣＡＴＴＡＡＧＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＧＴＡＡＧＣＴＣＴＧＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴＣＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＴＧＣＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＣＣＡＡＡＣＡＧＴＣＧＣＡＴＣＡＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＡＧＡＴＧＣＡＣＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＡＣＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＴＡＣＣＡＧＴＣＧＧＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＡＡＣＣＧＡＡＡＴＡＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＴＡＴＣＣＣＡＴＴＡＴＡＣＡＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＴＧＡＡＡＣＴＴＧＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＧＡＡＴＣＴＡＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＣＴＣＧＴＡＧＣＴＧＣＴＴＧＧＣＡＴＧＧＡＴＡＣＣＴＴＣＴＴＡＴＣＴＴＴＡＧＧＡＡＡＡＧＡＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＣＣＴＣＴＡＴＧＡＴＧＴＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＡＴＣＴＡＴＧＴＣＧＴＴＡＴＧＣＡＡＣＡＴＧＣＴＴＣＣＣＴＴＡＧＣＣＡＴＴＴＧＴＡＣＴＧＡＡＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＧＴＴＣＧＴＴＡＧＴＧＧＴＴＣＣＣＴＡＡＡＣＧＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＡＡＡＡＴＧＣＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＣＴＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＴＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＴＡＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＡＡＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＧＴＣＡＣＴＡＡＡＴＡＡＣＡＴＴＡＴＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＡＴＡＧＡＣＡＴＡＣＴＴＡＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＡＣＣＧＴＴＴＣＣＴＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＴＧＴＧＡＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＧＧＴＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＡＣＡＴＧＧＡＣＣＧＡＧＡＣＴＡＧＣＧＴＡＡＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＡＴＴＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＧＡＴＧＴＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＣＣＴＧＡＴＧＴＣＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＧＣＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＧＡＴＧＧＣＣＣＧＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＧＡＣＧＧＴＡＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＣＡＴＣＡＣＴＡＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＧＧＣＴＣＧＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＴＧＧＴＴＧＣＧＡＴＣＣＧＧＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＣＣＡＡＧＧＴＡＡＧＧＣＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＡＣＡＴＧＴＣＴＣＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＴＡＧＣＴＣＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＣＧＧＣＴＴＧＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＡＴＣＴＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＣＡＣＧＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣＣＧＣＣＴＧＴＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＴＴＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＧＣＧＴＧＣＧＡＴＡＣＴＡＣＣＡＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴＧＡＴＡＧＧＣＴＴＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＧＧＧＡＴＴＡＡＧＴＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＴＡＧＴＴＧＴＴＴＧＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＧＧＡＴＣＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＴＧＧＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＴＡＡＴＡＡＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＡＣＧＴＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＧＴＴＴＴＡＧＧＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＧＡＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＡＧＣＣＴＣＡＡＡＣＡＡＴＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＧＴＣＣＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＧＣＡＴＴＡＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＴＧＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴ（配列番号３１６）として同定され、５’非翻訳領域はヌクレオチド位置１−３０６に位置し、３’非翻訳領域はヌクレオチド位置３４９０−３９０７に位置する。ＥＰＳＰＳｃＤＮＡ配列は以下のように同定された。すなわち、
ＡＣＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＣＴＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＴＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＧＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＴＣＧＣＧＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＴＧＣＣＧＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＧＴＣＡＧＧＴＣＣＴＡＧＧＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＣＧＡＣＣＣＣＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＴＣＣＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＧＣＧＡＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＣＡＡＣＣＡＴＣＧＧＣＧＴＣＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＴＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＣＡＡＧＴＣＧＣＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＧＧＴＴＧＡＴＡＡＣＣＴＧＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＣＴＡＣＡＴＧＣＴＣＧＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧＣＧＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＡＡＡＡＧＡＧＣＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＴＴＣＣＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＴＴＣＴＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＧＴＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＴＧＡＧＧＧＡＧＡＧＡＣＣＣＡＴＴＧＧＣＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＧＧＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＧＡＴＴＧＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＴＣＧＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＴＡＣＴＴＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＡＧＡＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＧＡＴＡＡＡＴＴＡＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＣＴＡＣＧＴＣＧＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡＣＡＴＴＡＡＧＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＡＡＡＡＴＧＣＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＣＴＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＴＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＴＡＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＴＧＴＧＡＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＧＧＴＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＡＣＡＴＧＧＡＣＣＧＡＧＡＣＴＡＧＣＧＴＡＡＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＡＴＴＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＧＡＴＧＴＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＣＣＴＧＡＴＧＴＣＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＧＣＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＧＡＴＧＧＣＣＣＧＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＣＣＧＡＧＡＧＧＡＴＧＧＴＴＧＣＧＡＴＣＣＧＧＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＡＴＣＴＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＡＣＡＣＧＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣＣＧＣＣＴＧＴＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＴＴＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＧＣＧＴＧＣＧＡＴＡＣＴＡＣＣＡＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴＧＡＴＡＧＧＣＴＴＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＧＧＧＡＴＴＡＡＧＴＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＴＡＧＴＴＧＴＴＴＧＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＧＧＡＴＣＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＴＧＧＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＴＡＡＴＡＡＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＡＣＧＴＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＧＴＴＴＴＡＧＧＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＧＡＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＴＡＧＣＣＴＣＡＡＡＣＡＡＴＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＧＴＣＣＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＧＣＡＴＴＡＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＡＧＡＣＡＴＧＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴ（配列番号３１７）として同定された。２４０塩基対の二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを、ＥＰＳＰＳｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置９３７−１１７６に位置する２４０ヌクレオチドセグメントに対応する以下のＤＮＡ配列に対応する一本鎖で設計した。すなわち、
ＴＡＣＴＴＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＡＧＡＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＧＡＴＡＡＡＴＴＡＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＧＴＡＣＧＴＣＧＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡＣＡＴＴＡＡＧＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＡＡＡＡＴＧＣＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＣＴＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＴＡＴＴＴＣＴＴＧ（配列番号３１８）に対応する一本鎖で設計した。
ジーアメイズ（Ｇａｓｐｅ）種子を発芽紙（ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｐａｐｅｒ）上に発芽させた。実生を４インチのポットに移し、生育箱で植物を栽培した。３つの１７日令植物をポリヌクレオチドで局所処理し、３つの植物を対照として使用した。各植物のより低い位置にある２枚の葉に印をつけ、その後、０．１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７溶液に浸漬することにより前処理した。界面活性剤前処理後約３０分で、２枚の前処理した葉の各々の上面に２０マイクロリットルの処理溶液を適用した。処理溶液は、１００マイクロリットルの２×緩衝液、９０マイクロリットルの水、１０マイクロリットルの４．６マイクログラム／マイクロリットルのＥＰＳＰＳ ｄｓＲＮＡ溶液（配列番号３１８に対応する一本鎖を含む）の混合物から成った。２×緩衝液は２００マイクロリットルの０．１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７、２００マイクロリットルの５０ミリモル濃度のリン酸ナトリウム、１４６マイクロリットルの３４％リン酸アンモニウム、および４５４マイクロリットルの水の混合物であった。処理後８日目に、ポリヌクレオチド処理された３つの植物うち２つは、葉の先端に損傷を受けるかまたは枯れた状態で成長が阻害され（同様にＥＰＳＰＳポリヌクレオチド処理されたベンサミアナタバコ植物に観察された表現型と類似）、一方、３つの対照植物は全て正常な成長および形態を有した（図３７）。
実施例３５
ポリヌクレオチド移送剤として、または既知のポリヌクレオチド移送剤の増強剤として、異なる物質（塩、キレート剤、吸湿剤およびポリアミンを含む）の効果を研究した。硫酸アンモニウムは、従来より、ポリヌクレオチドに対する植物の浸透性を増強することが示されてきた（例えば実施例１３参照）。表２６はグリホサート耐性パルマーアマランス植物に局所適用されたポリヌクレオチド（ＲＮＡ）の１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７噴霧溶液に対する添加剤として、硫酸アンモニウムおよびＥＤＴＡの除草性活性（雑草制御／致死の割合として、および植物の背丈として示す）への効果を列挙する。この特定の実験において、０．００４％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が、噴霧溶液中の２％硫酸アンモニウムと同様に作用し、ポリヌクレオチドの有効性を向上させし、グリホサートの除草性活性を増強することが見い出された。
Figure 0006321071
表２７に、グリホサート耐性パルマーアマランス植物に局所的に適用されるポリヌクレオチド（ＲＮＡ）の１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７噴霧溶液への添加物として、無機塩（塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム）ならびに有機塩（塩化テトラメチルアンモニウム、塩化テトラエチルアンモニウム、臭化テトラプロピルアンモニウムおよび臭化テトラブチルホスホニウム）を含む様々な塩の除草性活性に対する効果（雑草制御／致死の割合として、および植物の背丈として示す）を列挙する。この特定の実験において、塩化アンモニウムおよび臭化テトラブチルホスホニウムは、噴霧溶液中の硫酸アンモニウムと同様に作用し、ポリヌクレオチドの有効性を向上させ、グリホサートの除草性の活性を増強することが見い出された。
Figure 0006321071
表２８に、グリホサート耐性パルマーアマランス植物に局所的に適用されたポリヌクレオチド（ＲＮＡ）の除草性活性（雑草制御／致死の割合として、および植物の背丈として示す）に対する吸湿剤グリセリンの効果を列挙する。グリセリンが、ポリヌクレオチドの効果を向上させ、グリホサートの除草性活性を増強することが見い出された。
Figure 0006321071
図３８に、グリホサート耐性パルマーアマランス植物に局所的に適用されたポリヌクレオチドの除草性活性に対する、様々なグリホサートの対イオンの効果（雑草制御／致死の割合として、および植物の背丈として示す）を示す。０．２％Ｒｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭａｘ（登録商標）担体（牛脂アミン（１６-１８Ｃ）およびｃｏｃｏａｍｉｎｅ（１２-１４Ｃ）が５５：４５の比率のＭＯＮ５６１５１牛脂アミン界面活性剤混合物）および１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量のグリホサート塩のうちの１つ；Ｋ＋グリホサート、イソプロピルアンモニウム＋グリホサートまたはモノエタノールアンモニウム＋グリホサートを含む１０ミリモル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８中０．５％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７、２％硫酸アンモニウム中のＥＰＳＰＳポリヌクレオチドの混合物（ＩＤＴ［１］（配列番号８３−８４）、ＩＤＴ［２］（配列番号８５−８６）、ＩＤＴ［３］（配列番号８７−８８）およびＩＤＴ［４］（配列番号８９−９０））を、１６コピーのＥＰＳＰＳを含む４−６インチのグリホサート耐性パルマーアマランスの３つの複製物に、ミリ（Ｍｉｌｌｉ）噴霧器で、２１５リットル／エーカーで適用した。植物の背丈をグリホサート処理後２１日目に評価した。表２９に結果（雑草制御／致死の百分率として、および植物の背丈として示す）を与える。グリホサートのイソプロピルアンモニウムおよびモノエタノールアンモニウム塩はカリウム塩と比較してより高い除草性活性をもたらした。
Figure 0006321071
グリホサート耐性パルマーアマランス植物に局所的に適用されたポリヌクレオチド（ＲＮＡ）の除草性活性に対する、ポリアミンカチオンスペルミン（Ｎ，Ｎ’-ビス（３-アミノプロピル）ブタン-１，４-ジアミン）およびスペルミジン（Ｎ-（３-アミノプロピル）ブタン-１，４-ジアミン）の効果について研究した。ポリヌクレオチド溶液を、実施例１に記載の４つのオリゴヌクレオチドサイズの「短い」ｄｓＲＮＡ分子の当量混合物を用いて調整した。該分子は、図１の下線付きヌクレオチドに示されるように、位置１４−３８（短いｄｓＲＮＡ-１）、位置１５３−１７７（短いｄｓＲＮＡ-２）、３４５−３６９（短いｄｓＲＮＡ-３）、および１１０５−１１２９（短いｄｓＲＮＡ-４）で、パルマーアマランスＥＰＳＰＳ遺伝子（配列番号１）から転写されたｍＲＮＡにハイブリダイズするように設計されたアンチセンス鎖を有し、ｄｓＲＮＡはアンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチド突出を有し、センス鎖の３’末端に末端ヌクレオチドとして２つのデオキシヌクレオチドを有する。ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド溶液を１０ミリモル濃度のリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）緩衝液中１もしくは１０ミリモル濃度のスペルミンもしくはスペルミジンのいずれか、または２％硫酸アンモニウムで調整した。対照溶液（ポリヌクレオチドなし）を１０ミリモル濃度のリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）緩衝液中１もしくは１０ミリモル濃度のスペルミンもしくはスペルミジンのいずれか、または２％硫酸アンモニウムで調整した。グリホサート耐性パルマーアマランス植物（３３、３６、または５７コピーのＥＰＳＰＳ）を１％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ-７７で前噴霧した。ｄｓＲＮＡポリヌクレオチド溶液（１１．６グラム／エーカー）または緩衝液を、グリホサート耐性パルマーアマランス（の４枚のより低い位置にある完全に開いた葉にピペッティングにより液滴として適用した。ポリヌクレオチド処理後２日目に、植物にグリホサート（１ヘクタールあたり３３６０ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）を噴霧した。グリホサート処理後１４日目に植物の写真を撮った。結果を図３９に示す。ｄｓＲＮＡおよび１０ミリモル濃度のスペルミンでの処理、それに続くグリホサート処理は、３３コピーのＥＰＳＰＳを含むグリホサート耐性パルマーアマランスを枯らし、３６コピーのＥＰＳＰＳを含むグリホサート耐性パルマーアマランスに深刻なダメージを与え、成長を阻害した。１０ｍＭスペルミジン単独での処理は、３３-コピーのグリホサート耐性パルマーアマランスの成長を阻害した。．この特定の実験において、１または１０ミリモル濃度のスペルミンもスペルミジンも、２％硫酸アンモニウムほど機能しなかった。
実施例３６
ポリヌクレオチド移送剤として異なる界面活性剤の効果を、グリホサート耐性パルマーアマランスに適用されるポリヌクレオチド噴霧液で試験した。Ｂｒｅａｋ-Ｔｈｒｕ界面活性剤はＥｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社から入手し、Ｓｉｌｗｅｔ界面活性剤はＭｏｍｅｎｔｉｖｅ社から入手した。噴霧溶液は、噴霧する当日に調整した。ＥＰＳＰＳポリヌクレオチド（ＩＤＴ［１］（配列番号８３−８４）、ＩＤＴ［３］（配列番号８７−８８）およびＩＤＴ［４］（配列番号８９−９０））の混合物を、噴霧の１５−５０分前に噴霧溶液に添加し、挿し木から成長した１−４インチのグリホサート耐性（Ｒ-２２）パルマーアマランス植物に、特注の低死容量の（「ミリ（Ｍｉｌｌｉ）」）噴霧器を用いて１−２ミリリットル適用した。１０−２２５マイクログラムの全ポリヌクレオチドを各々の植物に適用したが、適用量は実験によった。典型的には２３マイクログラムの全ポリヌクレオチドを一植物あたり適用した。処理された植物は、摂氏２６．７／２１．１度または摂氏２９．４／２１．１度のいずれかで、１４／１０時間温度、補足的な照光スケジュールにセットされた温室に入れた。２−３日後、植物を通常の噴霧器により（１０ガロン／エーカー）グリホサート（「２×ＷｍａＸ」または１ヘクタールあたり１６８２ｇ酸当量のＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）ブランド除草剤）で噴霧し、温室に戻した。パルマーアマランスの未噴霧処理に対する制御（目に見える損傷）の量、植物の背丈、および写真撮影をグリホサート処理後最大２１日目まで、異なる時間間隔で集めた。地上部の植物物質の新鮮重を最後に収集した。制御、背丈、新鮮重および目視可能な植物表現型の複合解析に基づき、各処理に０−３の総合的な植物損傷スコアを与えた。グリホサート単独処理による、観察された任意の損傷に対して、「３」は強い除草性活性、「２」は中程度活性、「１」は軽度活性、および「０」は、較正後に活性が観察されなかったことを示す。結果をは表３０に示した。
異なる界面活性剤の物理的特性も研究し、表３０に列挙した。ＥＰＳＰＳポリヌクレオチド（ＩＤＴ［２］（配列番号８５−８６）、０．０９ミリグラム／ミリリットル）を追加、または追加しない、７０ミリリットルの界面活性剤溶液（２％硫酸アンモニウムを含む０．５％界面活性剤水溶液、緩衝液（２０ミリモル濃度リン酸カリウム、ｐＨ６．８））、を測定当日に調整した。動的表面張力を、環境室温（摂氏２２−２３度）で、表面寿命に対し表面張力をプロッティングする最大気泡圧力法を用いて、Ｋｒｕｓｓｂｐ１００張力計で測定した。該装置は、自動的に表面を検出し、キャピラリーを１０ｍｍの深さまで沈めるようにセットされた。３つの表面寿命（約２０、５００および１２５０ｍｓ）に対する表面張力測定を記録した。表面張力の単位は１ｃｍあたりのダインとし、１２５０ｍｓ間隔で静的表面張力の近似として報告した。また、２０−５００ｍｓの変化を動的表面張力の推定として報告した。界面活性剤に対する親水性親油性バランス（ＨＬＰ）値は、界面活性剤の参考文献および製品情報から入手した。
Figure 0006321071

Claims (14)

  1. ポリヌクレオチドを送達する方法であって、
    標的遺伝子または該標的遺伝子から転写されるＲＮＡのいずれかの１８以上の連続したヌクレオチドの配列に同一または相補的な配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を、植物または植物器官に局所的に適用することを含み、
    ここに、該移送剤は、有機シリコーン界面活性剤および陽イオン脂質から選択され、かつ、少なくとも１つの該ポリヌクレオチドを該植物または植物器官の染色体に統合しないように、該植物または植物器官の内部に少なくとも１つの該ポリヌクレオチドが浸透するのを可能にすることを特徴とする該方法。
  2. 転写不可のポリヌクレオチドを送達する方法であって、
    標的遺伝子または該標的遺伝子から転写されるＲＮＡのいずれかの１８以上の連続したヌクレオチドの配列に同一または相補的な配列を有する少なくとも１つの転写不可のポリヌクレオチド、および移送剤を含むポリヌクレオチド組成物を、植物または植物器官に局所的に適用することを含み、
    ここに、該移送剤は、該植物または植物器官の内部に少なくとも１つの該ポリヌクレオチドが浸透するのを可能にする物理的研磨剤であることを特徴とする該方法。
  3. 少なくとも１つの該ポリヌクレオチドが、標的遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
  4. 成長期植物における除草剤の活性を増強する方法であって：
    （ａ）該成長期植物の表面に、
    （ｉ）除草剤と相互作用するタンパク質を発現する内在性遺伝子、または該内在性遺伝子から転写されたＲＮＡの１８以上の連続するヌクレオチドの配列に同一または相補的な配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド：および
    （ｉｉ）移送剤
    を含むポリヌクレオチド組成物を局所的に適用すること、ならびに
    （ｂ）該除草剤を該成長期植物に適用することを含み、
    ここに、該移送剤は、有機シリコーン界面活性剤および陽イオン脂質から選択され、かつ、少なくとも１つの該ポリヌクレオチドが該成長期植物の内部に浸透するのを可能にし、少なくとも１つの該ポリヌクレオチドは、内在性遺伝子の抑制を誘導し、それにより、該成長期植物における該除草剤活性を増強することを特徴とする該方法。
  5. 成長期植物における除草剤の活性を増強する方法であって：
    （ａ）該成長期植物の表面に、
    （ｉ）除草剤と相互作用するタンパク質を発現する内在性遺伝子、または該内在性遺伝子から転写されたＲＮＡの１８以上の連続するヌクレオチドの配列に同一または相補的な配列を有する少なくとも１つの転写不可のポリヌクレオチド：および
    （ｉｉ）移送剤
    を含むポリヌクレオチド組成物を局所的に適用すること、ならびに
    （ｂ）該除草剤を該成長期植物に適用することを含み、
    ここに、該移送剤は、少なくとも１つの転写不可の該ポリヌクレオチドが該成長期植物の内部に浸透するのを可能にする物理的研磨剤であり、少なくとも１つの転写不可の該ポリヌクレオチドは、内在性遺伝子の抑制を誘導し、それにより、該成長期植物における該除草剤活性を増強することを特徴とする該方法。
  6. 少なくとも１つの該ポリヌクレオチドが、転写不可のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または３記載の方法。
  7. （ａ）標的遺伝子または該標的遺伝子から転写されるＲＮＡの１８以上の連続したヌクレオチドの配列に同一または相補的な配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド、および
    （ｂ）移送剤
    を含む組成物であって、
    少なくとも１つの該ポリヌクレオチドは、転写不可の一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり、
    該移送剤は、有機シリコーン界面活性剤および陽イオン脂質から選択され、かつ、植物または植物器官の内部に少なくとも１つの該ポリヌクレオチドが浸透するのを可能にする該組成物。
  8. （ａ）標的遺伝子または該標的遺伝子から転写されるＲＮＡの１８以上の連続したヌクレオチドの配列に同一または相補的な配列を有する少なくとも１つの転写不可のポリヌクレオチド、および
    （ｂ）移送剤
    を含む組成物であって、
    少なくとも１つの転写不可の該ポリヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり、
    該移送剤は、植物または植物器官の内部に少なくとも１つの該ポリヌクレオチドが浸透するのを可能にする物理的研磨剤である該組成物。
  9. 成長期植物の外面に局所適用するのに適合し、移送剤ならびに少なくとも１つの植物致死薬剤を含む組成物であって、
    該移送剤は、有機シリコーン界面活性剤および陽イオン脂質から選択され、かつ、成長期植物の内部に少なくとも１つの該ポリヌクレオチドが浸透するのを可能にし、
    少なくとも１つの植物致死薬剤は、標的遺伝子または該標的遺伝子から転写されるＲＮＡのいずれかの１８以上の連続したヌクレオチドの配列に同一または相補的な配列を有する少なくとも１つの該ポリヌクレオチドを含み、
    少なくとも１つの該ポリヌクレオチドは、該標的遺伝子に対するプローブにハイブリダイズする低分子ＲＮＡの浸透移行性生成をもたらす該組成物。
  10. 成長期植物の外面に局所適用するのに適合し、移送剤ならびに少なくとも１つの植物致死薬剤を含む組成物であって、
    少なくとも１つの植物致死薬剤は、標的遺伝子または該標的遺伝子から転写されるＲＮＡのいずれかの１８以上の連続したヌクレオチドの配列に同一または相補的な配列を有する少なくとも１つの転写不可のポリヌクレオチドを含み、
    該移送剤は、成長期植物の内部に少なくとも１つの転写不可の該ポリヌクレオチドが浸透するのを可能にする物理的研磨剤であり、
    少なくとも１つの転写不可の該ポリヌクレオチドは、該標的遺伝子に対するプローブにハイブリダイズする低分子ＲＮＡの浸透移行性生成をもたらす該組成物。
  11. さらに、除草剤を含む請求項７〜１０のいずれか１記載の組成物。
  12. 内在性遺伝子を抑制するための外因性のＤＮＡまたはＲＮＡを含む植物であって、
    該外因性のＤＮＡは該植物の染色体に組み込まれず、該外因性のＲＮＡは該植物の染色体に組み込まれたＤＮＡから転写されず、該内在性遺伝子は該植物が種子から発生した後、該植物へのポリヌクレオチドならびに物理的研磨剤の局所適用により抑制される該植物。
  13. 物理的研磨剤が、カーボランダム、コランダム、砂、方解石、軽石およびざくろ石から選択される請求項２もしくは５に記載の方法または請求項８もしくは１０記載の組成物。
  14. 該標的遺伝子が、５-エノイルピルビルシキミ酸-３-リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸合成酵素、またはアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ジヒドロプテロイン酸合成酵素、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラアミノ安息香酸合成酵素、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、１-デオキシ-Ｄ-キシルロース-５-リン酸（ＤＯＸＰ）合成酵素、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）合成酵素、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、チトクロムＰ４５０、セルロース合成酵素、ベータチューブリン、ＲＵＢＩＳＣＯ、翻訳開始因子、フィトエン不飽和化酵素、および二本鎖ＤＮＡアデノシントリポリホスファターゼ（ｄｄＡＴＰ）から成る群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１〜６のいずれか１記載の方法または請求項７〜１１のいずれか１記載の組成物。
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