KR20130010886A - 식물에서 유전자 조절을 위한 폴리뉴클레오타이드 분자 - Google Patents

식물에서 유전자 조절을 위한 폴리뉴클레오타이드 분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 예를 들면, 유전자의 전신계적 조절을 위한 RNA를 제공함으로써 식물에서 유전자를 조절하기 위한 폴리뉴클레오타이드 분자 및 방법을 제공한다. 본 발명의 각종 양태는 식물 세포 및 폴리뉴클레오타이드 분자에서 내인성 유전자 및 전이유전자를 조절하기 위한 폴리뉴클레오타이드 분자 및 방법을 제공한다.

Description

식물에서 유전자 조절을 위한 폴리뉴클레오타이드 분자{Polynucleotide Molecules for Gene Regulation in Plants}
본 출원은 2010년 3월 8일자로 출원된 미국 가특허원 제61/311,762호, 2010년 5월 28일자로 출원된 미국 가특허원 제61/349,807호, 및 2010년 9월 10일자로 출원된 미국 가특허원 제61/381,556호의 우선권의 이익을 청구하며, 이들은, 이들의 전문이 본원에 참조로 혼입된다. 133 킬로바이트(운용 시스템 MS-윈도우즈에서 측정)이고 2011년 3월 7일자로 생성된, 파일명 "38-21_56855_D.txt"의 파일에 함유된 서열 목록은 본원과 함께 출원되고 본원에 참조로 혼입된다.
본원에는 식물에서 유전자를 조절하기 위한 폴리뉴클레오타이드 분자 및 이러한 분자를 제조하고 사용하는 방법이 기재되어 있다.
내성 잡초(resistant weed)를 방제(control)하기 위한 제초제의 실패는, 이러한 잡초가 잡초보다 더 낮은 제조제 내성을 가질 수 있는 제초제 내성 작물의 지역(field)에서 성장하는 경우 특히 문제가 된다. 제초제 내성 잡초는 다양한 작용 방식으로 확인된다. 명아주에서 제초제 표적화된 단백질을 생산하는 유전자의 다중 카피를 위한 선택으로부터 생성되는 내성은 문헌[참조: Gaines et al . (2010) Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 107(3):1029-1034]에 보고되어 있다. 갈퀴덩쿨(goosegrass), 가시상추(prickly lettuce), 및 독보리(ryegrass)에서 제초제 표적화된 단백질을 생산하는 유전자에 있어서의 돌연변이로부터 생성된 내성은 문헌[참조: Baerson et al . (2002) Plant Physiol ., 129(3):1265-1275; Preston et al . (2006) Pesticide Biochem . Physiol ., 84(3):227-235; 및 Wakelin et al . (2006) Weed Res . ( Oxford ), 46(5):432-440]에 보고되어 있다. 글리포세이트의 액포 분리증(Vacuolar sequestration)은 글리포세이트 내성 쥐꼬리망초(horseweed)에서 관측된 메카니즘이다[참조: Ge et al . (2010) Pest Management Sci ., 66:576-576]. 바랭이(hairy crabgrass)에서 제초제를 불활성 화학물질 형태로 대사하는 효소의 발현으로부터 생성되는 내성은 문헌[참조: Hidayat et al. (1997) Pesticide Biochem . Physiol ., 57(2):137-146]에 보고되어 있다. 문헌[참조: Reddy et al. (2008) J. Agric . Food Chem ., 56(6):2125-2130]은 글리포세이트로 처리한 식물 종에서 아미노메틸포스폰산의 축적을 보고하였다.
발명의 요약
본 발명은, 예를 들면, 유전자의 전신계적 조절을 위해 RNA를 제공함으로써, 식물에서 유전자를 조절하기 위한 폴리뉴클레오타이드 분자 및 방법을 제공한다. 본 발명의 각종 양태는 식물 세포 및 폴리뉴클레오타이드 분자내에서 내인성 유전자 및 삽입유전자를 조절하기 위한 폴리뉴클레오타이드 분자 및 방법을 제공한다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 조성물, 및 방법은 식물 해충 또는 병원체의 내인성 유전자를 조절하는데 유용하다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 살아있는 식물 조직내로 침투하거나 흡수되어 내인성 유전자 또는 삽입유전자, 또는 이들의 전사된 RNA의 전신계적 유전자 사일런싱(systemic gene silencing)을 개시할 수 있는 조성물을 제공한다. 본 발명의 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 궁극적으로 식물에 제공하거나 식물내 세포내에서 식물 세포내 생리학적 조건하에서 식물 세포내 표적 내인성 유전자 또는 표적 삽입유전자로부터 전사된 RNA에 대해 하이브리드화하여 표적 유전자를 조절, 예를 들면, 표적 유전자를 사일런싱시키거나 억제할 수 있는 RNA를 생산하도록 한다. 본 발명의 다른 양태에서 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 분자는 무척추 해충 또는 식물의 바이러스 병원체의 세포내에서 표적 유전자로부터 전사된 RNA에 생리학적 조건하에서 하이브리드화하여 표적 유전자를 조절, 예를 들면, 표적 유전자를 사일런싱시키거나 억제할 수 있는 RNA를 식물에 궁극적으로 제공하거나, 식물의 세포내에서 생산하도록 하는데 유용하다. 일부 양태에서, 표적 유전자의 사일런싱 또는 억제는, 자체가 표적 유전자의 발현에 의해 영향받거나 조절되는 다른 유전자의 상향조절을 이끈다.
본 발명의 조성물 및 방법은 문헌[참조: reviews by Brodersen and Voinnet (2006), Trends Genetics , 22:268-280; Tomari and Zamore (2005) Genes & Dev ., 19:517-529; Vaucheret (2006) Genes Dev ., 20:759-771; Meins et al . (2005) Annu. Rev . Cell Dev . Biol ., 21:297-318; 및 Jones-Rhoades et al . (2006) Annu . Rev . Plant Biol ., 57:19-53]에 일반적으로 기술되어 있는 바와 같이, RNA 매개된 유전자 억제에 관여하는 몇가지 천연 세포 경로중 하나 이상을 통해 작동하는 것으로 여겨진다. RNA 매개된 유전자 억제는 일반적으로 단일 RNA 분자내에서 분자내적으로 또는 2개의 RNA 분자 사이의 분자내적으로 형성된 이중가닥 RNA(dsRNA) 중간체를 포함한다. 이러한 보다 긴 dsRNA 중간체는, 이중가닥 중 하나의 쇄가 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex: "RISC")내로 혼입되어 있는, 하나 이상의 보다 짧은 이중가닥 RNA에 대한 RNase Ⅲ 계열[다이서(Dicer) 또는 다이서 유사 리보뉴클레아제]에 의해 가공된다. 예를 들어, siRNA 경로는 보다 긴 이중가닥 RNA 중간체의 작은 방해(interfering) RNA("siRNAs")로의 분해를 포함한다. siRNA의 크기는 약 19 내지 약 25개 염기쌍의 범위인 것으로 여겨지지만, 식물에서 siRNA의 가장 일반적인 부류는 21개 염기쌍 또는 24개 염기쌍을 함유하는 것들을 포함하는 것으로 여겨진다[참조: Hamilton et al . (2002) EMBO J., 21:4671-4679]. 본원에 사용된 것으로서, "올리고뉴클레오타이드"는, 유전자 사일런싱 메카니즘에서 가공된 작은 RNA 분자의 크기와 유사한, 길이가 18 내지 25개 뉴클레오타이드인 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 본 발명의 각종 양태는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 이들 둘다의 혼합물을 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 양태들은 유전자의 전신계 조절; 식물 세포내에서 내인성 유전자의 억제를 위한 단일가닥 RNA를 제공하는 식물 치사제 및 표면활성제를 포함하는 조성물을 사용한 제초제 처리; 식물 세포내에서 내인성 유전자의 억제를 위한 표면활성제(예를 들면, 오가노실리콘 표면활성제) 및 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 식물 표면상의 국소 피복(topical coating); (a) 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대해 식물의 컨디셔닝용 제제 및 (b) 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 식물내에서 표적 유전자의 전신계 사일런싱을 유도하기 위한 국소 적용된 조성물; 및 (a) 폴리뉴클레오타이드 분자에 의한 침투에 대해 식물의 컨디셔닝(conditioning)용 제제 및 (b) 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 조성물을 사용한 제초제 처리를 위해 식물세포내에 단일가닥 RNA 분자를 제공하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 임의로, 이들 조성물은 비-뉴클레오타이드 제초제를 포함할 수 있다.
다른 양태에서 본 발명은 제초제 내성 자생 식물(volunteer plant)을 방제하고; 유전자의 전신계 조절을 위해 식물 세포내에서 단일가닥 RNA 분자를 제공하기 위한 조성물을 성장하는 식물의 조직 위에 적용시킴으로써 식물에서 내인성 유전자를 조절하여 역유전학(reverse genetics)을 시험하며; 폴리뉴클레오타이드의 식물로의 국소 적용을 포함하는 표적 유전자의 전신계 사일런싱을 유도하고; (a) 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝 및 (b) 폴리뉴클레오타이드의 식물로의 국소 적용에 의해 식물에서 표적 유전자의 전신계 사일런싱을 유도하며; 폴리뉴클레오타이드 분자 및 이러한 폴리뉴클레오타이드 분자에 의한 침투에 대해 식물을 컨디셔닝하기 위한 제제를 포함하는 국소 적용된 조성물을 살아있는 식물 위에 국소 적용함으로써 식물에서 내인성 유전자를 조절하여 역유전학을 조사하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 내인성 유전자를 억제하기 위한 외인성 DNA 또는 RNA를 지닌 식물을 제공하며, 여기서 외인성 DNA는 식물의 염색체 내로 통합되지 않으며, 외인성 RNA는 식물의 염색체 내로 통합된 DNA로부터 전사되지 않고, 내인성 유전자는 폴리뉴클레오타이드를 식물에 국소 적용시킴에 의해 억제된다. 본 발명의 이러한 및 다른 양태는 하기 단락에서 보다 상세히 기술된다.
도 1은 팔머 아마란쓰(Palmer amaranth) EPSPS를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 서열 번호: 1을 나타낸다.
도 2는 합성된 PolⅢ 유전자의 뉴클레오타이드 서열인, 서열 번호: 3을 나타낸다.
도 3은 dsRNA로 처리한 팔머 아마란쓰 식물의 이환률(morbidity)을 나타낸다. 도 3a는 글리포세이트 처리 후 7일째의 식물을 묘사한다. 도 3b는 긴 dsRNA 용액으로 처리한 후 72시간 후에 글리포세이트 처리한 표면활성제 처리된 식물을 묘사한다. 도 3c는 짧은 dsRNA 용액으로 처리한 후 72시간 후 글리포세이트 처리한 표면활성제 처리된 식물을 묘사한다.
도 4는 dsRNA 조성물로 처리한 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물에서 표백(bleaching)을 나타낸다.
도 5는 니코티아나 벤타미아나 파이토엔 데사투라제의 뉴클레오타이드 서열인 서열 번호: 2를 나타낸다.
도 6은 실시예 9에서 기술한 바와 같은 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 잎을 침투하는 5'-알렉사 플루오르 488-표지된 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드(서열 번호: 15)를 나타낸다.
도 7은 실시예 9에 기술된 바와 같은 EPSPS에 대한 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드로 처리한 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 잎에서 측정한 EPSPS mRNA의 결과를 묘사한다. 바아(bar)는 처리 #1 내지 #4 각각(원안에 포함된 수 및 표 2를 참조하여 나타냄) 및 대조군(글리포세이트의 존재 또는 부재하에서 처리한 보리 종자 단백질에 대한 서열 번호: 14의 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드가 투과된 잎)에 대한 복제 실험을 나타낸다.
도 8은 실시예 9에 기술된 바와 같은 EPSPS에 대한 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드로 국소 처리한 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 잎에서 측정한 EPSPS 단백질의 결과를 묘사하며; 처리 결과는 원 안의 수로 나타내고 표 2를 참조한다.
도 9는 실시예 9에서 기술된 바와 같은 2회의 실험에서 EPSOS에 대한 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드로 처리한 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 잎에서 측정한 쉬키메이트 축적(shikimate accumulation)의 결과를 묘사하며; 처리 결과는 원 안의 수로 나타내고 표 2를 참조한다.
도 10은 니코티아나 벤타미아나 파이토엔 데사투라제의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호:2)을 묘사한다.
도 11은 실시예 10에 기술된 바와 같은 파이토엔 신타제 서열(서열 번호: 16)과 관련하여 검정된 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 서열의 위치를 개략적으로 묘사한다(참조: 표 3).
도 12a는 실시예 10에 기술된 바와 같은 완충액("대조군"), 서열 번호: 2("200nt dsRNA")의 914 내지 1113번 뉴클레오타이드로 이루어진 분절(segment)에 상응하는 RNA 서열을 지닌 200-머(mer) dsRNA 폴리뉴클레오타이드, 및 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드의 조합물(서열 번호: 16, 17, 20, 21, 24, 25 및 26)("ssDNA 올리고")로 국소 처리한 니코티아나 벤타미아나 식물에서 정단 잎(apical leaf) 표백을 설명한다.
도 12b는 완충액(대조군), 200-머 dsRNA 폴리머뉴크레오타이드, 및 ssDNA 올릭고뉴클레오타이드로 처리한 니코티아나 벤타미아나 식물로부터 분리한 RNA의 노던 블롯 분석의 결과를 나타낸다. 또한 200-머 dsRNA 폴리머뉴클레오타이드로 처리하기 전에 암실에서 밤새 및 4℃에서 유지시킴으로써 스트레스가 제공된 식물로부터 분리한 RNA를 또한 나타낸다.
도 13은 실시예 10에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드(숫자는 표 4에 나열한 처리를 말함)의 각종 조합물로 중복 국소 처리한 니코티아나 벤타미아나 식물에서 정단 잎 표백을 나타낸다. 대조군(표 4에서 처리 13)은 나타내지 않는다.
도 14는 실시예 10에서 기술된 바와 같이 표 5에 나열한 폴리뉴클레오타이드로 국소 처리한 니코티아나 벤타미아나 식물에서 정단 잎 표백을 나타낸다.
도 15는 T7 프로모터(서열 번호: 22 및 23)("PDS 안티-센스")의 부재하에 PDS 21-머 안티-센스 ssDNA(서열번호: 34, "21nt PDS 안티-센스") 또는 앞서 검정한 PDS 안티-센스 22-머 올리고뉴클레오타이드로 국소 처리한 후 니코티아나 벤타미아나 식물에서 관찰한 정단 잎 표백을 나타낸다. 실시예 10에 기술된 바와 같이 PDS 21-머 센스 ssDNA(서열 번호: 36, "21nt PDS 센스")로 국소 처리한 후 또는 완충액 만으로 국소 처리한 후 관찰된 정단 잎의 가시적인 표백은 거의 없거나 없다.
도 16은 실시예 11에 기술된 바와 같이 약 71% 동질성(1252/1762)을 나타내는 팔머 아마란쓰 및 니코티아나 벤타미아나 PDS DNA 서열의 정렬을 나타낸다.
도 17은 실시예 11에 기술된 바와 같이, 678bp 또는 198bp 팔머 PDS dsRNA로 국소 처리한 팔머 아마란쓰 식물에서 정단 잎 표백이 관측되지만, 옥수수 뿌리 벌레 유전자의 260개 염기쌍 dsRNA로 국소 처리한 팔머 아마란쓰 식물에서는 관측되지 않음을 나타낸다.
도 18a는 실시예 12에 기술된 바와 같이 표면활성제 용액으로 우선 국소 처리한 후 ssDNA PDS 올리고뉴클레오타이드로 국소 처리하여 파이토엔 데사투라제의 전신계적 사일런싱(systemic silencing)을 유도한 니코티아나 벤타미아나 식물의 정단 잎, 줄기 및 꽃의 표백을 나타낸다. 도 18b는 실시예 12에 기술된 바와 같이, 표면활성제 용액을 사용한 컨디셔닝의 존재 또는 부재하에, ssDNA PDS 올리고뉴클레오타이드로 국소 처리하여 파이토엔 데사투라제의 전신계적 사일런싱을 유도한 니코티아나 벤타미아나 식물의 정단 잎, 줄기 및 꽃의 표백을 나타낸다.
도 19는 실시예 13에 기술된 바와 같이, 표 6에 나열한 조건으로 처리한 상이한 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 계통(복제당 3개 식물)에서의 검정 결과를 나타낸다. 사진은 글리포세이트 처리 후 7일째(실험 1 내지 6) 또는 글리포세이트 처리 후 9일째(실험 7 내지 9)에 촬영하였다.
도 20은 실시에 14에 기술된 바와 같이, EPSPS dSRNA 처리된 팔머 아마란쓰 식물에서 풍부한 것으로 확인되고 완전한 길이의 EPSPS(서열 번호: 40)의 564 내지 588번 및 743 내지 767번 위치에서 이탤릭체의 밑줄친 뉴클레오타이드로 나타낸 2개의 작은 RNA의 위치를 나타낸다. EPSPS 서열은 또한 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기 "짧은" EPSPS dsRNA 분자(밑줄친, 이탤리체화되지 않은 글씨) 및 3개의 "긴" 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드(실시예 1에 기술된 것으로서 굵은 글씨)의 위치를 또한 나타낸다.
도 21a는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 표면활성제에 이어 3개의 적용량 중 하나에서 dsRNA에 이어 제초제로 처리한 팔머 암란쓰 식물의 결과를 나타낸다. 도 21b는 실시예 17에 기술된 바와 같이, 현장-수집된 종자(field-collected seed))로부터의 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰에서 수행한 검정 1의 결과를 나타낸다; 식물은 제초제로 처리한 후 8일 및 30일째에 나타낸다.
도 22는 실시예 18에 기술된 바와 같은, 탈로우아민(tallowamine) 표면활성제 및 황산암모늄 또는 형질감염 시약으로 팔머 아마란쓰를 처리하여 수득한 결과를 나타낸다.
도 23은 실시예 19에 기술된 바와 같은, EPSPS dsRNA 또는 EPSPS DNA/RNA 하이브리드를 사용한 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물의 처리 결과를 나타낸다.
도 24는 실시예 20에 기술된 바와 같은, EPSPS dsRNA 또는 EPSPS ssDNA 폴리뉴클레오타이드로 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물을 처리한 결과를 나타낸다. 상부 사진은 제초제 분무 후 8일째에 촬영하였으며 하부(바아) 그래프는 제초제 분무 후 8일째에 기록한 글리포세이트 손상(GI)으로서의 결과를 나타낸다.
도 25a는 실시예 21에 기술된 것으로서, 팔머 EPSPS 유전자의 5' 및 3' 해독되지 않은 영역의 일부 및 전체 암호화 서열을 틸링(tiling) 방식으로 각각 포함하는 약 250bp의 DNA 분절에 상응하는 12개의 dsRNA 폴리뉴클레오타이드를 나타내며; 실시예 1 및 도 1에 기술된 것으로서 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기 "짧은" EPSPS dsRNA 분자는 각각 틸링 분절 2, 3, 4 및 8내에 위치하며, 이들 분절내에 담회색 바아로서 나타낸다. 도 25b 및 도 25c는 이들 틸링 분절 또는 4개의 짧은" dsRNA 분자 또는 완충액으로부터 설계된 dsRNA로 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물을 처리한 결과를 나타낸다.
도 26은 실시예 22에 기술된 것으로서, 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물을 처리한 후 1% Silwet L-77로 분무한 후 2% 황산암모늄을 함유하는 완충액 속에서 EPSPS dsRNA를 적용한 결과를 나타낸다. 처리되지 않은("UT") 대조군 식물은 1% Silwet L-77 분무만으로 처리하나 제초제 또는 dsRNA로 처리하지 않았다. 처리 후 16일 째에 식물을 사진을 찍어 평가하였다.
도 27은 실시예 23에 기술된 것으로서, 20X 또는 100X 양의 EPSPS dsRNA 폴리뉴클레오타이드, 표면활성제, 황산암모늄, 및 제초제로 또는, 표면활성제, 황산암모늄, 및 제초제를 함유하는 조성물로 고 카피 수(high copy number)의 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰의 현지 집단을 처리한 결과를 나타낸다. 각각의 처리에서, 1개 걸음×5개 걸음 구획의 2개 복제물을 처리하였다.
도 28은 실시예 24에 기술된 것으로서, 처리 후 37, 46, 및 60일째에 식물당 1 나노몰 ssDNA로 처리한 상추 식물의 표백 및 사멸의 진행(상부로부터 하부)을 나타낸다.
도 29a는 실시예 24에 기술된 것으로서, 폴리뉴클레오타이드로 국소 처리한 후 4 또는 12일째에 관측된 표백에 의해 입증된 상추 식물에서 전신계 사일런싱을 나타낸다. 도 29b는 4개의 개개의 안티-센스 ssDNA("HL287", 서열 번호:43; "HL288", 서열 번호: 44; "HL289", 서열 번호: 45; 및 "HL290", 서열 번호: 46) 또는 모든 4개의 혼합물로 국소 처리한 후 4일째에 관측된 표백에 의해 입증된 전신계 사일런싱을 나타낸다.
도 30은 실시예 25에 기술된 것으로서, 토마토 파이토엔 데사투라제 폴리뉴클레오타이드로 처리한 토마토 식물의 잎(우측 상부 패널) 및 꽃(우측 중간 패널)의 표백을 나타낸다. 도 30은 또한 PDS 폴리뉴클레오타이드로 처리한 토마토 식물의 성장방해(stunting)(하부 패널)를 나타낸다.
도 31은 실시예 26에 기술된 것으로서, TIF 폴리뉴클레오타이드에 의한 EPSPS 폴리뉴클레오타이드의 저-카피 수 팔머 아마란쓰에 있어서 글리포세이트 제초제 활성의 향상, 및 TIF 폴리뉴클레오타이드가 자체의 제초 활성을 가짐을 나타낸다. EPSPS 폴리뉴클레오타이드 "1, 3, 4"는 도 1에서 밑줄친 뉴클레오타이드에 의해 각각 나타낸 것으로서 14 내지 38번(짧은 dsRNA-1), 345 내지 369번(짧은 dsRNA-3), 및 1105 내지 1129번(짧은 dsRNA-4) 위치에서 팔머 아마란쓰 EPSPS 유전자(서열 번호: 1)로부터 전사된 mRNA에 하이브리드화할 수 있는 안티-센스 쇄를 갖는 "짧은" dsRNA를 말한다(참조: 실시예 1). EPSPS "5"는 IDT [5](표 11에 기술된 것으로서 서열 번호: 91 및 92)를 말한다.
도 32는 실시예 26에 기술된 것으로서, TIF 폴리뉴클레오타이드에 의한 EPSPS 폴리뉴클레오타이드의 고-카피 수 팔머 아마란쓰에 있어서의 글리포세이트 제초 활성의 향상 및 TIF 폴리뉴클레오타이드가 자체의 제초 활성을 가짐을 나타낸다. EPSPS 폴리뉴클레오타이드 "1, 3, 4"는 도 1에서 밑줄친 뉴클레오타이드에 의해 각각 나타낸 것으로서 14 내지 38번(짧은 dsRNA-1), 345 내지 369번(짧은 dsRNA-3), 및 1105 내지 1129번(짧은 dsRNA-4) 위치에서 팔머 아마란쓰 EPSPS 유전자(서열 번호: 1)로부터 전사된 mRNA에 하이브리드화할 수 있는 안티-센스 쇄를 갖는 "짧은" dsRNA를 말한다(참조: 실시예 1). EPSPS "5"는 IDT [5]를 말한다(표 11에 기술된 것으로서 서열 번호: 91-92).
도 33은 실시예 28에 기술된 것으로서, 비-폴리뉴클레오타이드 제초제 및 폴리뉴클레오타이드의 나타낸 조합물로 처리한 후 팔머 아마란쓰에 대한 제초 효과를 나타낸다.
도 34는 실시예 30에 기술된 것으로서, 니코티아나 벤타미아나(니코티아나 벤타미아나) PDS 유전자자리 1 프로모터(서열 번호: 319) 및 PDS 유전자자리 2 프로모터(서열 번호: 320)의 정렬을 나타낸다.
도 35는 실시예 30에 기술된 것으로서, 니코티아나 벤타미아나 PDS 유전자자리 1 및 유전자자리 2 프로모터, 및 폴리뉴클레오타이드의 혼합물에 의해 표적화된 영역을 개략적으로 나타낸다.
도 36은 실시예 33에 기술된 것으로서, PDS 안티-센스 폴리뉴클레오타이드(도 36a), EPSPS 안티-센스 폴리뉴클레오타이드 (도 36B), 또는 RuBisCO 안티-센스 폴리뉴클레오타이드(도 36C)로 처리한 식물에서 니코티아나 벤타미아나에 있어서 식물 높이에 대한 효과를 나타낸다.
도 37은 실시예 34에 기술된 것으로서, 대조군으로 완충액만으로, 또는 내인성 EPSPS 유전자를 표적화하는 dsRNA 폴리뉴클레오타이드("EPSPS DNA 올리고")로 국소 처리한 제아 마이스(Zea mays )(Gaspe) 단자엽 식물에 대한 효과를 나타낸다.
도 38은 실시예 35에 기술된 것으로서, 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물에서 제초 활성에 대한 변화하는 글리포세이트 역-이온의 효과를 나타낸다.
도 39는 실시예 35에 기술된 것으로서, EPSPS의 33, 36 또는 57 카피를 함유하는 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰에 대한 폴리아민 스페르민("SPM") 및 스페르미딘("SPMD") 또는 황산암모늄("AMS")의 효과를 나타낸다. "fb 4X WM"은 "글리포세이트(헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명의 제초제의 3360 g의 산 당량체)로 처리한 후"를 의미한다.
발명의 상세한 설명
달리 기술하지 않는 한, 당해 명세서의 내용에서 핵산 서열은 좌측에서 우측으로 판독하는 경우 5' 내지 3' 방향으로 제공된다. 핵산 서열은 기술된 바와 같이 DNA 또는 RNA로서 제공될 수 있으며; 하나의 기재내용은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 다른 것을 본질적으로 정의한다. 용어가 단수로 제공되는 경우, 발명자들은 또한 해당 용어의 복수에 의해 기술된 본 발명의 양태를 고려한다. "전사가능하지 않은" 폴리뉴클레오타이드는, 폴리뉴클레오타이드가 완전한 폴리머라제 Ⅱ 전사 단위를 포함하지 않음을 의미한다. 본원에 사용된 것으로서 "용액"은 현탁액, 콜로이드, 미셀(micelle) 및 유액과 같은 균질한 혼합물 또는 비-균질한 혼합물을 말한다.
폴리뉴클레오타이드
본원에 사용된 것으로서, "폴리뉴클레오타이드"는 다수의 뉴클레오타이드를 함유하는 핵산 분자를 말하며 일반적으로 "올리고뉴클레오타이드"(길이가 18 내지 25개 뉴클레오타이드인 폴리뉴클레오타이드 분자) 및 26개 이상의 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 둘다를 말한다. 본 발명의 양태는, 길이가 18 내지 25개 뉴클레오타이드(예를 들면, 18-머, 19-머, 20-머, 21-머, 22-머, 23-머, 24-머, 또는 25-머)인 올리고뉴클레오타이드, 또는 길이가 26개 이상의 뉴클레오타이드인 중간-길이 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 약 250, 약 260, 약 270, 약 280, 약 290, 또는 약 300개 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드), 또는 길이가 약 300개 뉴클레오타이드인 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 길이가, 약 300 내지 약 400개 뉴클레오타이드, 약 400 내지 약 500개 뉴클레오타이드, 약 500 내지 약 600개 뉴클레오타이드, 약 600 내지 약 700개 뉴클레오타이드, 약 700 내지 약 800개 뉴클레오타이드, 약 800 내지 약 900개 뉴클레오타이드, 약 900 내지 약 1000개 뉴클레오타이드, 약 300 내지 약 500개 뉴클레오타이드, 약 300 내지 약 600개 뉴클레오타이드, 약 300 내지 약 700개 뉴클레오타이드, 약 300 내지 약 800개 뉴클레오타이드, 약 300 내지 약 900개 뉴클레오타이드, 또는 약 1000개 뉴클레오타이드이거나, 또는 길이가 약 1000개보다 훨씬 큰 뉴클레오타이드인, 예를 들면, 표적 유전자의 암호화 또는 비-암호화 또는 암호화 및 비-암호화 부위 둘다를 암호화함을 포함하는 표적 유전자의 전체 길이 이하인 폴리뉴클레오타이드)를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드가 이중가닥인 경우, 이의 길이는 염기쌍 측면에서 유사하게 기술될 수 있다.
본 발명의 각종 양태에서 사용된 폴리뉴클레오타이드 조성물은 RNA 또는 DNA 또는 RNA/DNA 하이브리드 또는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 이들 둘다의 혼합물을 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 및 데옥시리보뉴클레오타이드, 예를 들면, 주로 리보뉴클레오타이드로 이루어지지만 하나 이상의 말단 데옥시리보뉴클레오타이드를 지닌 합성 폴리뉴클레오타이드 또는, 주로 데옥시리보뉴클레오타이드로 이루어지지만 하나 이상의 말단 디데옥시리보뉴클레오타이드를 지닌 합성 폴리뉴클레오타이드의 조합물일 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 이노신, 티오우리딘, 또는 슈도우리딘과 같은 비-기본형 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 예는 당해 분야에 잘 공지되어 있다; 참조: 예를 들면, Verma and Eckstein (1998) Annu . Rev. Biochem ., 67:99-134. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 천연적으로 발생한 포스포디에스테르 골격은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드내 연결 변형으로 부분적으로 또는 완전히 변형될 수 있거나, 변형된 뉴클레오사이드 염기 또는 변형된 당은 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 합성에 사용될 수 있고, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 형광성 잔기(예를 들면, 플루오레세인 또는 로다민) 또는 다른 표지(예를 들면, 바이오틴)로 표지될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 단일가닥- 또는 이중가닥 RNA 또는 단일가닥- 또는 이중가닥 DNA 또는 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 또는 이의 변형된 유사체일 수 있고, 올리고뉴클레오타이드 길이 이상일 수 있다. 본 발명의 보다 구체적인 양태에서, 식물 세포내에서 단일가닥 RNA를 제공하는 폴리뉴클레오타이드는 (a) 단일가닥 RNA 분자, (b) 자가-하이브리드화하여 이중가닥 RNA 분자를 형성하는 단일가닥 RNA 분자, (c) 이중가닥 RNA 분자, (d) 단일가닥 DNA 분자, (e) 자가-하이브리드화하여 이중가닥 DNA 분자를 형성하는 단일가닥 DNA 분자, 및 (f) RNA 분자에 전사되는 변형된 Pol Ⅲ 유전자를 포함하는 단일가닥 DNA 분자, (g) 이중가닥 DNA 분자, (h) RNA 분자로 전사되는 변형된 Pol Ⅲ 유전자를 포함하는 이중가닥 DNA 분자, (i) 이중가닥, 하이브리드화된 RNA/DNA 분자, 또는 이의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 양태에서, 이들 폴리뉴클레오타이드는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 또는 비-기본형 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 분자간 하이브리드화에 의해 형성된 이중가닥 DNA, 분자간 하이브리드화에 의해 형성된 이중가닥 DNA, 분자간 하이브리드화에 의해 형성된 이중가닥 RNA, 또는 분자간 하이브리드화에 의해 형성된 이중가닥 RNA를 포함한다. 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 자가-하이브리드화하여, 억제를 위해 표적화된 유전자로부터 전사된 RNA에 대해 세포내 생리학적 조건하에서 하이브리드화될 적어도 하나의 분절을 포함하는 적어도 부분적으로 이중가닥 구조를 갖는 헤어핀 구조를 형성하는 단일가닥 DNA 또는 단일가닥 RNA를 포함한다. 어떠한 메카니즘에 얽메일 의도는 아니지만, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 억제를 위해 표적화된 유전자로부터 전사된 RNA에 대해 세포내 생리학적 조건하에서 하이브리드화할 적어도 하나의 분절을 갖는 단일가닥 RNA이거나 이를 생산할 것으로 여겨진다. 특정의 다른 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 프로모터, 일반적으로 식물에서 작용적인 프로모터, 예를 들면, pol Ⅱ 프로모터, pol Ⅲ 프로모터, pol IV 프로모터, 또는 pol V 프로모터를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드 조성물은 핵산 분자와 연합되는 것으로 공지된 다른 분자 또는 역이온, 예를 들면, 테트라알킬 암모늄 이온, 트리알킬 암모늄 이온, 설포늄 이온, 리튬 이온 및 폴리아민, 예를 들면, 스페르민, 스페르미딘 또는 푸트레스신과 함께 제형화된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드 조성물은 비-폴리뉴클레오타이드 제초제(예를 들면, 제목이 "제초제 내성 단백질"인 단락에서 본원에 기재된 화학적 제초제) 또는 전달제 또는 투과성-증진제(참조: 제목이 "투과성-증진제 및 처리"인 단락)와 함께 제형화된다.
폴리뉴클레오타이드는 식물에서 내인성 유전자의 전신계적 조절 또는 억제를 유도하도록 설계되며 식물의 내인성 유전자의 서열(이는 암호화 서열 또는 비-암호화 서열일 수 있다) 또는 식물의 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열에 대해 본질적으로 동일하거나 본질적으로 상보적인 서열을 갖도록 설계된다. "본질적으로 동일한" 또는 "본질적으로 상보적인"은, 폴리뉴클레오타이드(또는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드의 적어도 하나의 쇄)가 식물의 세포내 생리학적 조건하에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 내인성 유전자를 조절하거나 억제하도록 설계된다.
본 발명에서 작용적인 단일가닥 폴리뉴클레오타이드의 양태는 표적 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화를 허용하기에 100%일 필요는 없지만 적어도 충분한 서열 상보성을 가짐으로써 식물 세포내에서 생리학적 조건하에 이중쇄(duplex)를 형성하여 유전자 사일런싱 메카니즘에 의해 분해되도록 한다. 따라서, 양태들에서 분절은 표적 유전자 또는 표적 유전자로부터 전사된 전령(messenger) RNA 내에서 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드(contiguous nucleotide)의 서열에 본질적으로 동일하거나, 또는 본질적으로 상보성이도록 설계된다. "본질적으로 동일한"은 표적 유전자로부터 전사된 표적 유전자 또는 RNA 내에서 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 비교하여 100% 서열 동질성 또는 적어도 약 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 서열 동질성을 가짐을 의미하며; "본질적으로 상보적인"은 표적 서열 또는 표적 서열로부터 전사된 RNA 내에서 100% 서열 상보성 또는 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 비교하는 경우 적어도 약 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 서열 상보성을 가짐을 의미한다. 본 발명의 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 제공된 표적 유전자의 하나의 대립형질(예를 들면, 제초제 내성 단백질, 제초제-탈활성화 단백질, 스트레스-반응 유전자, 또는 필수 유전자에 대한 암호화 또는 비-암호화 서열)에 대해 100% 서열 동질성 또는, 상보성을 가지도록 설계되며; 다른 양태에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 제공된 표적 유전자의 다수 대립형질에 대해 100% 서열 상동성을 가지거나 다수 대립형질에 대해 상보성을 가지도록 설계된다.
본 발명의 하나의 양태에서 폴리뉴클레오타이드는 변형된 RNA 폴리머라제 Ⅲ 유전자, 예를 들면, 7SL 시그날 인식 입자 RNA 또는 U6 스플라이스오소말(spliceosomal) RNA (Pol Ⅲ 유전자)를 전사하는 유전자 또는 기능성 Pol Ⅲ 프로모터 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 원래 전사된 DNA 서열을 Pol Ⅲ 유전자로 대체하는 조절을 위해 확인된 표적화된 유전자의 RNA에 상응하는 센스 및 안티-센스 DNA를 함유하는 변형된 Pol Ⅲ 유전자이다.
본 발명에 유용한 폴리뉴클레오타이드는 처리된 식물의 생명 동안 적어도 1주 이상의 기간 동안에 및 전형적으로 전신계적 방식으로 유전자 발현을 조절 또는 조정(예를 들면, 억제)한다. 예를 들면, 식물 잎을 본 발명의 폴리뉴클레오타이드조성물로 처리하는 일수 내에서, 주요 및 전이(transitive) siRNA는 처리된 잎에 대해 측면 및 상단 및 정단 조직의 다른 잎에서 검출될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 올리고뉴클레오타이드의 시판되는 제제는 또한 센스 쇄의 3' 말단에 2개의 데옥시리보뉴클레오타이드를 흔히 제공한다. 긴 폴리뉴클레오타이드 분자는 시판되는 키트(kit), 예를 들면, dsRNA로 조립될 수 있는 RNA 쇄를 제조하는 세균 T7 폴리머라제 프로모터를 암호화하는 5' 말단에 연결된 DNA를 갖는 암비온(Ambion)으로부터의 키트로부터 합성될 수 있다. 대안적으로, dsRNA 분자는 조절되거나 결핍성인 RNase Ⅲ 효소 활성을 갖는 세균 세포내에서 발현 카세트로부터 생산될 수 있다. 긴 폴리뉴클레오타이드 분자는 또한 다수의 RNA 또는 DNA 단편으로부터 조립될 수 있다. 일부 양태에서 레이놀즈 점수(Reynolds score) 및 투스츨 규칙(Tuschl rule)과 같은 설계 매개변수는 당해 분야에 공지되어 있으며 유전자 사일런싱에 효과적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 선택하는데 사용된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드 서열의 무작위적 설계 또는 실험적 선택이 유전자 사일런싱에 효과적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 선택하는데 사용된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드의 서열은 의도된 식물의 게놈성 DNA에 대해 스크리닝되어 다른 유전자의 의도되지 않은 사일런싱을 최소화한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 저 농도에서 폴리뉴클레오타이드 분자 단독 또는 다른 성분(예를 들면, 표면활성제, 염, 및 비-폴리뉴클레오타이드 제초제)와 함께, 동일한 용액 또는 별도로 적용된 용액으로, 폴리뉴클레오타이드 분자의 용액과 같은 조성물에 유용하다. 본 발명의 방법에 유용할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 분자의 농도 및 용량에 있어서 상한치는 없지만, 보다 적은 유효 농도 또는 용량이 일반적으로 효능을 위해 고려될 것이다. 농도는 식물 잎에 적용된 분무 용적을 고려하여 조절될 수 있다. 하나의 구현예에서, 25-머 올리고뉴클레오타이드 분자를 사용한 허브 식물에 대한 유용한 처리는 식물당 약 1 나노몰의 올리고뉴클레오타이드 분자, 예를 들면, 식물 당 약 0.05 내지 1 나노몰이다. 허브 식물에 대한 다른 양태는 식물당 약 0.05 내지 약 100 나노몰, 또는 약 0.1 내지 약 20 나노몰, 또는 약 1 나노몰 내지 약 10 나노몰의 폴리뉴클레오타이드이다. 거대한 식물, 나무 또는 덩굴식물은 상응하게 다량인 폴리뉴클레오타이드를 필요로 할 수 있다. 다수 올리고뉴클레오타이드로 가공될 수 있는 긴 dsRNA 분자를 사용하는 경우, 보다 적은 농도를 사용할 수 있다. 본 발명의 양태를 설명하기 위한 하기에 대한 실시예에서 인자 1X는 올리고뉴클레오타이드 분자에 적용되는 경우 식물당 0.8 나노몰의 폴리뉴클레오타이드 분자; 10X, 식물당 8 나노몰의 폴리뉴클레오타이드 분자; 및 100X, 식물 당 80 나노몰의 폴리뉴클레오타이드 분자의 처리를 나타내기 위해 임의로 사용된다. 예를 들면, 실시예 23에서, 식물은 식물당 EPSPS dsRNA(264 마이크로그람 또는 80 나노몰)의 100X 처리를 포함하는 수용액으로 처리되었다.
단일가닥 RNA 분자
본 발명은 식물 세포에서 유전자의 전신계적 조절을 위한 단일가닥 RNA를 제공하기 위한 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 또한 식물에 표적 유전자로서 또는 표적 유전자로부터 전사된 RNA로서 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나, 본질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열내 분절을 지닌 폴리뉴클레오타이드 분자를 국소 적용함으로써 식물내 표적 유전자의 전신계적 조절(예를 들면, 전신계적 억제 또는 사일런싱)을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 제공하며, 이에 의해 조성물은 식물의 내부를 침투하여 전사된 RNA, 예를 들면, 전령 RNA에 하이브리드화하는 단일가닥 RNA의 작용에 의해 표적 유전자의 전신계적 조절을 유도한다. 폴리뉴클레오타이드 분자는 이러한 분절 1개, 이러한 분절 다수, 다수의 상이한 이러한 분절, 또는 이의 조합을 지닌 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자일 수 있다.
전달제 , 침투성 -증진제 및 처리
본 발명의 조성물 및 방법은 폴리뉴클레오타이드 분자에 의한 식물 세포내로의 침투에 대해 식물 조직, 예를 들면, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 과일의 표면을 컨디셔닝시키기 위한 전달제 또는 침투성-증진제 및 처리를 포함할 수 있다. 식물 세포내로의 폴리뉴클레오타이드의 전이는 식물 조직으로 폴리뉴클레오타이드-전달제의 적용 전 또는 동시 적용에 의해 촉진될 수 있다. 일부 양태에서 전달제는 폴리뉴클레오타이드 조성물의 적용에 대해 후속적으로 적용된다. 폴리뉴클레오타이드 전달제는 외피 왁스 장벽(cuticle wax barrier), 기공 및/또는 세포 벽 또는 막 장벽을 통한 및 식물 세포내로의 폴리뉴클레오타이드에 대한 경로를 가능하도록 한다. 조성물의 식물 세포내로의 전이를 촉진시키기에 적합한 제제는 식물의 외부의 투과성을 증가시키거나 식물 세포의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로의 투과성을 증가시키는 제제를 포함한다. 조성물의 식물 세포내로의 전이를 촉진시키는 이러한 제제는 화학적 제제 또는 물리적 제제, 또는 이의 조합물을 포함한다. 컨디셔닝용 화학적 제제는 (a) 표면활성제, (b) 유기 용매 또는 수용액 또는 유기 용매들의 수성 혼합물, (c) 산화제, (e) 산, (f) 염기, (g) 오일, (h) 효소, 또는 이의 조합물을 포함한다. 당해 방법의 양태는 항온처리 단계, 중화 단계(예를 들면, 산, 염기 또는 산화제를 중화시키거나 효소를 불활성화시키는 단계), 세정 단계, 또는 이의 조합을 임의로 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝용 제제 또는 처리의 양태는 유액, 역 유액, 리포좀, 및 다른 미셀 유사 조성물을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝용 제제 또는 처리의 양태는 역-이온 또는 핵산 분자와 연합되는 것으로 공지된 다른 분자, 예를 들면, 무기 암모늄 이온, 알킬 암모늄 이온, 리튬 이온, 스페르민, 스페르미딘 또는 푸트레스신과 같은 폴리아민, 및 다른 양이온을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대해 식물을 컨디셔닝하는데 유용한 유기 용매는 DMSO, DMF, 피리딘, N-피롤리딘, 헥사메틸포스포르아미드, 아세토니트릴, 디옥산, 폴리프로필렌 글리콜, 물과 혼화성이거나 포스포뉴클레오타이드를 비-수성 시스템(예를 들면, 합성 반응에 사용된 것) 속에 용해할 다른 용매를 포함한다. 표면활성제 또는 유화제의 존재 또는 부재하에 천연적으로 기원한 오일 또는 합성 오일, 예를 들면, 식물-공급된 오일이 사용될 수 있으며, 작물 오일(예를 들면, 9th Compendium of Herbicide Adjuvants, www.Herbicide.adjuvants.com에서 온라인 상으로 공개적으로 이용가능함), 예를 들면, 파라핀성 오일, 폴리올 지방산 에스테르, 또는 폴리에틸렌이민 또는 N-피롤리딘과 같은 폴리아민 또는 아미드로 변형된 단쇄 분자를 갖는 오일이 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대해 식물을 컨디셔닝하는 이러한 제제는 어떠한 통상의 방법, 예를 들면, 분말, 유액, 현탁액 또는 용액을 사용한 분무 또는 피복에 의해서도 식물에 적용되며; 유사하게, 폴리뉴클레오타이드 분자는 식물에, 어떠한 통상의 방법, 예를 들면, 용액, 유액 또는 현탁액의 분무 또는 와이핑(wiping)에 의해 적용된다.
유용한 표면활성제의 예는 지방산의 나트륨 또는 리튬 염(예를 들면, 수지(tallow) 또는 수지아민 또는 인지질) 및 오가노실리콘 표면활성제를 포함한다. 다른 유용한 표면활성제는 비이온성 오가노실리콘 표면활성제, 예를 들면, 트리실록산 에톡실레이트 표면활성제 또는 실리콘 폴리에테르 공중합체, 예를 들면 폴리알킬렌 옥사이드 변형된 헵타메틸 트리실록산 및 알릴옥시폴리프로필렌 글리콜 메틸에테르의 공중합체(CAS 번호 27306-78-1 및 EPA 번호: CAL.REG.NO. 5905-50073-AA를 갖는 Silwet? L-77로서 시판, 뉴욕 알바니 소재의 Momentive Performance Materials로부터 현재 이용가능)를 포함한다. Silwet L-77 표면활성제가 식물 잎 또는 다른 표면의 예비-분무 처리로 사용되는 경우, 약 0.015 내지 약 2 중량%(wt %) (예를 들면, 약 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.5 wt %)의 범위의 농도가 표면에서 국소 적용으로부터 폴리뉴클레오타이드 분자를 식물 세포내로 전이시키기 위한 잎 또는 다른 식물 표면을 제조하는데 효과적이다.
유용한 물리적 제제는 (a) 카르보룬둠, 코룬둠, 모래, 방해석, 부석, 석류석 등과 같은 연마제, (b) 탄소 나노튜브와 같은 나노입자 또는 (c) 물리력을 포함할 수 있다. 탄소 나노튜브는 문헌[참조: Kam et al . (2004) J. Am . Chem . Soc ., 126 (22):6850-6851, Liu et al . (2009) Nano Lett ., 9(3):1007-1010, 및 Khodakovskaya et al . (2009) ACS Nano , 3(10):3221-3227]에 기재되어 있다. 물리력 제제는 가열, 급냉, 양성 압력의 적용 또는 초음파 처리를 포함할 수 잇다. 당해 방법의 양태는 항온처리 단계, 중화 단계(예를 들면, 산, 염기, 또는 산화제를 중화시키거나, 효소를 불활성화시키는 단계), 세정 단계, 또는 이의 조합을 임의로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 특정 유전자의 사일런싱에 기인한 향상된 효과를 가질 다른 제제의 적용을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드가, 제초제 내성을 제공하는 유전자를 조절하도록 설계된 경우, 제초제의 후속적인 적용은 제초 효능에 있어 현저한 효과를 가질 수 있다.
폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대해 식물의 실험실적 컨디셔닝을 위한 제제는 예를 들면, 화학적 제제의 적용, 효소적 처리, 가열 또는 급냉, 양성 또는 음성 압력의 처리, 또는 초음파 처리를 포함한다. 현지에서 식물을 컨디셔닝하기 위한 제제는 표면활성제 및 염과 같은 화학적 제제를 포함한다.
표적 유전자 및 필수 유전자
본 발명의 조성물 및 방법은 식물 세포내에서 내인성 또는 유전자이식 표적 유전자의 발현을 조절하는데 유용하다. 각종 양태에서, 표적 유전자는 암호화(단백질-암호화 또는 해독가능한) 서열, 비-암호화(비-해독가능한) 서열, 또는 암호화 및 비-암호화 서열 둘다를 포함한다. 본 발명의 조성물은 다수이 유전자, 또는 하나 이상의 유전자의 다수의 분절을 표적화하도록 설계된 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 유전자는 표적 유전자의 다수의 연속된 분절, 표적 유전자의 다수의 비-연속된 분절, 표적 유전자의 다수의 대립형질, 또는 하나 이상의 종으로부터의 다수의 표적 유전자를 포함할 수 있다. 표적 유전자의 예는 식물 세포내에서 발현된 내인성 식물 유전자 및 전이유전자를 포함한다. 표적 유전자의 다른 예는 식물 바이러스 병원체의 내인성 유전자 또는 무척추 식물 해충의 내인성 유전자를 포함한다.
표적 유전자는 제초제 내성 단백질을 암호화하는 유전자, 조절성 RNA를 포함하는 비-암호화 서열, 및 세포 생명을 지속시키거나 유기체의 재생을 지지하는데 필수적인 유전자인 필수 유전자를 포함할 수 있다. 필수 유전자의 양태는 DNA 또는 RNA 복제, 유전자 전사, RNA 매개된 유전자 조절, 단백질 합성, 에너지 생산, 및 세포 분열에 포함된 유전자를 포함한다. 필수 유전자의 개요서의 하나의 예는 문헌[참조: Zhang et al . (2004) Nucleic Acids Res ., 32:D271-D272]에 기술되어 있으며 tubic.tju. edu.cn/deg/; version DEG 5.4 lists 777 essential genes for Arabidopsis thaliana]에서 이용가능하다. 필수 유전자의 예는 해독 개시 인자(TIF) 및 리불로즈-1,5-비스포스페이트 카복실라제 옥시게나제(RuBisCO)를 포함한다. 표적 유전자는 전사 인자를 암호화하는 유전자, 및 아미노산, 지방산 및 다른 지질, 당 및 다른 탄수화물, 생물학적 중합체, 및 알칼로이드, 테르페노이드, 폴리케타이드, 비-리보소옴 펩타이드 및 혼합된 생합성 기원의 2차 대사물질을 포함하는 2차 대사물질과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 식물내 분자의 생합성 또는 이화작용에 포함된 효소를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다.
조성물 및 방법
본 발명의 단일가닥 RNA 분자는 식물 세포에 RNA로서 직접 제공되거나 예를 들면, 치료 조성물내 폴리뉴클레오타이드 분자가 표적 유전자의 전사체에 하이브리드화할 수 있는 단일가닥 RNA의 생산을 식물 세포내에서 유발하는 경우, 간접적으로 제공될 수 있다. 많은 양태에서, 폴리뉴클레오타이드 분자의 조성물은 식물 세포내로 폴리뉴클레오타이드 분자의 전이를 촉진하는 하나 이상의 투과능 향상제, 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝용 제제를 추가로 포함한다. 본 발명의 양태에서 방법은 폴리뉴클레오타이드 조성물의 하나 이상의 적용 및 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝용 침투성-향상제의 하나 이상의 적용을 포함한다. 침투에 대한 컨디셔닝용 제제가 오가노실리콘 표면활성제인 경우, 폴리뉴클레오타이드 분자의 양태는 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드, 단일가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드, 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드, 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드, 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드, 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드, 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드, 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드, 화학적으로 변형된 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 혼합물이다.
본 발명의 양태는 (a) 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝 및 (b) 식물에 대한 폴리뉴클레오타이드 분자의 국소 적용을 포함하는, 식물내 표적 유전자의 전신계적 사일런싱을 유도하는 방법을 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오타이드 분자는 안티-센스 또는 센스 배향으로 표적 유전자로부터 클로닝되거나 기타의 경우 확인된 18개 이상의 연속 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 포함함으로써, 폴리뉴클레오타이드 분자는 식물의 내부로 침투하여 표적 유전자의 전신계적 사일런싱을 유도한다. 컨디셔닝 및 폴리뉴클레오타이드 적용은 별도로 또는 단일 단계로 수행할 수 있다. 컨디셔닝 및 폴리뉴클레오타이드 적용이 별도의 단계로 수행되는 경우, 컨디셔닝이 선행되거나 수분, 수시간 또는 수일내 폴리뉴클레오타이드 적용을 수반할 수 있다. 일부 양태에서, 하나 이상의 컨디셔닝 단계 또는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자 적용은 동일한 식물에서 수행될 수 있다. 당해 방법의 양태에서, 분절은 (a) 암호화(즉, 단백질-암호화), (b) 비-암호화, 또는 (c) 표적 유전자의 암호화 및 비-암호화 부분 둘다로부터 클로닝되거나 확인될 수 있다. 비-암호화 부분은 RNA 조절 서열(예를 들면, 프로모터, 인트론, 5' 또는 3' 해독되지 않는 영역, 및 마이크로RNA, 트랜스-작용(trans-acting) siRNA, 천연 안티-센스 siRNA, 및 조절 기능을 지닌 다른 작은 RNA)를 암호화하거나 구조적 또는 효소적 기능[예를 들면, 리보자임, 리보소옴 RNA, t-RNA, 아프타머(aptamer), 및 리보스위치(riboswitch)]을 갖는 RNA를 암호화하는 DNA를 포함한다.
식물에서 표적 유전자의 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 방법의 각종 양태에서 표적 유전자는 (a) 식물의 내인성 유전자, (b) 식물의 바이러스 병원체의 내인성 유전자, (c) 식물의 무척추동물 해충의 내인성 유전자, (d) 식물의 무척추동물 해충의 공생자의 내인성 유전자, 또는 (e) 유전자이식 식물내로 삽입된 인공(man-made) 유전자이다. 표적 유전자가 식물에 대해 내인성인 양태에서, 표적 유전자 (a)는 식물의 성장 또는 생명을 유지하는데 필수적인 식물의 내인성 유전자이거나, (b) 식물에 대해 제초제 내성을 제공하는 단백질을 암호화하거나, (c) RNA 조절 분자로 전사한다. 식물내에서 표적 유전자의 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 방법의 양태에서, 컨디셔닝은 화학적 제제, 마모, 상처, 효소 처리, 가열 또는 급냉의 적용, 양성 또는 음성 압력을 사용한 처리, 초음파 처리, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 컨디셔닝은 오가노실리콘 표면활성제와 같은 표면활성제, 예를 들면, 폴리알킬렌 옥사이드 변형된 헵타메틸 트리실록산 및 알릴옥시폴리프로필렌 글리콜 메틸에테르의 공중합체(Silwet? L-77 표면활성제로 시판)와 같은 실리콘 폴리에테르 공중합체를 포함한다. 당해 방법의 양태에서, 컨디셔닝은 (a) 표면활성제, (b) 유기 용매 또는 유기 용매의 수용액 또는 수성 혼합물, (c) 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜의 수용액 또는 수성 혼합물, (d) 나노입자, (e) 산화제, (f) 산 또는 염기, 또는 (g) 오일, 또는 이의 조합물의 적용을 포함한다. 당해 방법의 양태는 항온처리 단계, 중화 단계(예를 들면, 산, 염기, 또는 산화제를 중화시키거나, 효소를 불활성화시키는 단계), 세정 단계, 또는 이의 조합을 임의로 포함할 수 있다.
본 발명은 (a) 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝용 제제 및 (b) 안티-센스 또는 센스 배향의 표적 유전자의 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 상보성인 18개 이상의 연속 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 지닌 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 식물내 표적 유전자의 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 국소 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 식물내에서 내인성 유전자를 조절함으로써 역유전학을 시험하기 위한 방법을 포함하는 본원에 기재된 각종 방법, 및 잡초 방제의 기재된 방법 및 자생 식물 대조군에 대한 제초제 조성물로서 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태는 내인성 유전자를 억제하기 위한 외인성 DNA 또는 RNA를 포함하는 식물을 제공하며, 여기서 외인성 DNA는 식물의 염색체 내로 통합되지 않고 외인성 RNA는 식물의 염색체 내로 통합된 DNA로부터 전사되지 않으며, 여기서 내인성 유전자는 식물에 폴리뉴클레오타이드를 국소 적용함으로써 억제된다. 대안적으로, 외인성 DNA 또는 RNA는 식물 해충 또는 질병의 방제를 제공하기 위한 해충 또는 병원체에 대한 반응시 포함된 내인성 식물 유전자를 억제하기 위해 설계될 수 있다. 이러한 식물은 종자로부터 성장하거나, 절단, 클로닝, 또는 이식 공정에 의해 생산될 수 있다(즉, 종자로부터 성장하지 않는 식물). 이러한 식물은 줄뿌림 작물(row crop plant), 과일, 야채, 나무 또는 장식용 식물이다. 예를 들면, 본원에 기재된 본 발명의 양태에서 식물은 줄뿌림 작물(예를 들면, 옥수수, 대두, 면화, 카놀라, 사탕무, 알파파, 사탕수수, 벼 및 밀)이거나, 야채[예를 들면, 토마토, 후추, 고추, 멜론, 수박, 오이, 가지, 꽃양배추, 브로콜리, 상추, 시금치, 양파, 완두콩, 당근, 사탕 옥수수, 배추, 리크(leek), 회향, 호박(pumpkin, squash) 또는 박, 무, 방울다다기양배추, 토마틸로(tomatillo), 강낭콩, 콩(dry bean) 또는 오크라]이거나, 요리 식물(예를 들면, 바질(basil), 파슬리, 커피 또는 차)이거나, 과일[예를 들면, 사과, 배, 체리, 복숭아, 자두, 살구, 바나나, 질경이, 생식용 포도, 와인용 포도, 감귤류, 아보카도, 망고 또는 베리(berry)]이거나, 장식용 또는 시판용으로 성장시킨 나무(예를 들면, 과일 또는 견과 나무)이거나, 장식 식물(예를 들면, 장식용 현화식물 또는 관목 또는 잔디)이다. 절단, 클로닝, 또는 이식 공정으로 생산된 식물(즉, 종자로부터 성장하지 않은 식물)의 양태는 과일 나무, 및 감귤류, 사과, 아보카도, 토마토, 가지, 오이, 멜론, 수박, 및 포도를 포함하는 식물, 및 또한 각종 장식용 식물을 포함한다.
역유전학을 시험하기 위한 방법
다른 양태에서, 본 발명은 식물에서 내인성 표적 유전자를 조절하거나 조정함으로써 역유전학을 조사하는 방법을 제공하며; 이러한 방법은 성장하는 식물의 조직위에 식물 세포내에서 유전자의 전신계적 조절을 위한 본 발명의 단일가닥 RNA를 제공(직접 또는 간접적으로)하기 위한 조성물을 적용하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 양태에서, 단백질 또는 조절 RNA 유전자를 암호화하는 전령 RNA는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 표적화되어, 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드의 국소 적용에 의해 부여될 수 있는 특성을 확인하기 위해, 식물의 생애 동안 적어도 1주의 기간 동안에 유전자를 조정한다. 당해 방법은 또한 추가의 단계, 예를 들면, 식물을 화합물의 배열에 노출시켜 제초제 상호작용을 확인하거나 식물을 비생물적 스트레스(예를 들면, 물 결핍 스트레스, 영양분 결핍 스트레스, 열 스트레스, 냉 스트레스, 염분 스트레스)에 대해 또는 생물제 처리(예를 들면, 곤충 또는 선충 해충 또는 바이러스, 진균 또는 세균 병원체를 사용한 챌린지 또는 화학적 화합물 또는 생물학적 처리에 대한 노출)에 노출시켜 스트레스 또는 처리에 대해 식물에 의한 반응을 확인하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서 다양한 일시적으로 사일런싱된 유전자를 사용한 식물의 라이브러리를 화합물의 라이브러리[예를 들면, 제초제, 식물호르몬, 내인성 또는 외인성 방어 유출자, 예를 들면, 살리실산 또는 하르핀(harpin), 질소, 인, 칼륨, 황, 칼슘, 마그네슘, 철 및 아연과 같은 식물 영양소를 제공하는 분자의 결핍성]에 대해 스크리닝하여 이러한 화합물과의 상호작용을 확인한다. 이러한 스크리닝에 유용한 식물의 예는 아마란투스 팔머리(Amaranthus palmeri) 및 니코티아나 벤타미아나(니코티아나 벤타미아나)를 포함한다.
트랜스유전자 사일런싱을 위한 방법
본 발명의 다른 양태에서, 당해 방법은 식물에서 발현되는 전이유전자를 사일런싱하는데 사용될 수 있으므로, 식물 수행능 또는 특성에 있어서의 효과에 대한 전이유전자의 기여의 현상-독립적인 측정(event-independent measurement)인 음성 대조군을 제공한다. 음성 대조군 효과의 부여는 식물의 생애 주기 동안 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자를 사용한 다수의 성공적인 처리를 필요로 할 수 있다.
구체적인 적용
관련 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 성장하는 식물 세포 또는 전체 식물에서 하나 이상의 유전자를 일시적으로 사일런싱하여 성장하는 계절 동안 또는 수거-후 환경에서 배양 조건, 환경적 또는 비생물적 또는 생물적 스트레스, 또는 시장 요구도에 있어서의 변화에 대한 반응시 목적하는 표현형을 시행하는데 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 조성물 및 방법은 작물 생성물의 목적하는 영양 조성물과 같은 목적하는 표현형을 가진 식물 또는 식물 생생물을 생산하기 위하여 이화작용 유전자 또는 생합성 유전자를 일시적으로 억제, 예를 들면, 대두 또는 카놀라 또는 다른 오일종자에서 목적하는 지방산 프로파일을 수행하기 위해 FAD2 유전자를 억제하거나 보다 용이하게 섭취가능한 목초 식물을 제공하기 위하여 COMT 및 CCOMT와 같은 리그닌 생합성 유전자를 억제하는데 유용하다. 유사하게, 본 발명의 조성물 및 방법은 마이크로RNA (miRNA) 또는 내인성 miRNA 데코이(decoy), 예를 들면, 본원에 참조로 혼입된 미국 특허원 공보 제2009/0070898호에 기재된 바와 같은 내인성 miRNA, miRNA 전구체, 또는 miRNA 데코이를 일시적으로 억제하는데 유용하다. 본 발명의 양태는 해충 또는 병원체에 대한 반응에 포함된 내인성 식물 유전자를 억제함으로써, 식물 해충 또는 질병의 방제를 제공하는데 유용하다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 조성물, 및 전달 방법은 또한 예를 들면, 작물, 야채 또는 과일 나무에 대해 무척추동물 필수 유전자 또는 무척추동물 해충의 공생자의 유전자를 표적화하는 DNA 또는 RNA 분자를 사용한 국소 분무의 사용에 의해, 식물의 조절을 제공할 수 있는 인시류 또는 딱정벌레 해충의 무척추동물 해충, 예를 들면, 식물로부터 RNA를 분해하여 식물 해충 또는 해충-유도된 질병의 내인성 표적 유전자를 억제하는데 유용하다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 조성물, 및 전달 방법은 또한 작물, 야채 또는 과일 나무에 대해, 바이러스 유전자를 표적화하는 DNA 또는 RNA 분자를 사용한 국소 항-바이러스 분무를 사용함으로써 바이러스 병원체의 방제를 제공하는데 유용하다.
제초제 조성물 및 방법
본 발명의 양태는 식물 세포내에서 생리학적 조건하에 식물 세포내 내인성 유전자(들)로부터 전사된 RNA에 하이브리드화할 수 있는 단일가닥 RNA의 적어도 하나의 종을 제공하는 식물 치사제로서 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 액체 제초제 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 표적 유전자는 식물의 성장 또는 생명을 유지하는데 필수적인 유전자를 암호화하거나 제초제에 대해 내성을 제공하는 단백질을 암호화한다. 액체 제초제 조성물은 또한 침투능-향상제, 비-뉴클레오타이드 제초제, 또는 이의 조합물을 포함하며 별도로 적용된 비-뉴클레오타이드 제초제 및/또는 침투능-항상제를 사용한 다-단계 처리에서 사용될 수 있다. 액체 제초제 조성물의 양태는 침투능-향상제로서 오가노실리콘 표면활성제 및 식물 세포내에서 생리학적 조건하에 식물 세포내 표적 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 표적 유전자의 사일런싱을 시행하는 식물 단일가닥 RNA의 세포를 제공하는 식물 치사제로서 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 액체이다. 하나의 구현예에서, 글리포세이트 내성 식물에 대해 효과적인 액체 제초제 조성물은 Silwet? L-77 표면활성제와 같은 오가노실리콘 표면활성제 및 식물 세포내 생리학적 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 단일가닥 RNA를 글리포세이트에 대한 내성을 제공하는 EPSPS 단백질을 암호화하는 내인성 또는 유전자이식 EPSPS 유전자의 RNA 전사체에 하이브리드화할 수 있는 단일가닥 RNA를 제공하기 위한 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 분자가 식물 세포내 생리학적 조건하에서 식물 성장 또는 생명을 유지하는데 필수적인 RNA를 암호화하는 내인성의, 단백질 또는 비-단백질을 암호화하는 mRNA에 하이브리드화하도록 설계되어, 필수적인 단백질의 유전자 사일런싱 및 감소를 시행하는 경우, 폴리뉴클레오타이드 분자는 식물 치사제, 예를 들면, 뉴클레오타이드 제초제로서 기능할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 이들 제초제 조성물은 예를 들면, 수경 성장시키거나 화분-성장한 식물의 뿌리 또는 절단 줄기에 적용하거나 성장하는 식물의 잎 위에 국소 피복하도록 채택될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태는 침투능-향상제를 포함하는 생존 식물의 잎 또는 다른 표면, 예를 들면, 식물 세포내에서 생리학적 조건하에 세포내 내인성 식물 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화할 수 있는 단일가닥 RNA를 (직접 또는 간접적으로) 제공하는, 오가노실리콘 표면활성제와 같은 표면활성제, 및 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 국소 피복하기 위해 채택된 조성물을 제공한다. 하나의 양태에서 내인성 식물 유전자는 제초제에 제초 내성을 제공하는 단백질, 예를 들면, 글리포세이트, 디캄바 또는 설포닐우레아를 암호화하는 내인성 식물 유전자이다. 제초제 내성을 제공하는 이러한 단백질의 예는 하기 "제초제 내성 단백질" 단락에 기재되어 있다.
본 발명의 다른 양태는 자생 식물의 잎 또는 다른 표면위에 자생 식물의 세포내에서 자생 식물의 세포내 생리학적 조건하에 세포내 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화할 수 있는 단일가닥 RNA 분자의 생산을 허용하거나 이를 제공하는 제공된 조성물을 적용시킴을 포함하여, 제초제 내성 작물의 현지에서 성장하는 제초제 내성 자생 식물을 방제하는 방법을 제공하며, 여기서 내인성 유전자는 (i) 자생 식물의 성장 또는 생명을 유지하기 위한 필수 유전자이거나, (ⅱ) 자생 식물에 제초제 내성을 제공하는 단백질을 암호화하거나, (ⅲ) RNA 조절제(예를 들면, 프로모터, 또한 miRNA 전구체, miRNA, 트랜스-작용 siRNA, 및 아프타머(aptamer) 및 리보스위치(riboswitche)와 같은 조절 기능을 갖는 다른 비-암호화 RNA)에 대해 전사한다. 자생 식물의 세포내에서 자생 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 세포내 내인성 유전자로부터 전사된 RNA로 하이브리드화할 수 있는 단일가닥 RNA 분자의 생산을 허용하거나 이를 제공하는 조성물은 (a) 단일가닥 RNA 분자, (b) 자가-하이브리드화하여 이중가닥 RNA 분자를 형성하는 단일가닥 RNA 분자, (c) 이중가닥 RNA 분자, (d) 단일가닥 DNA 분자, (e) 자가-하이브리드화하여 이중가닥 DNA 분자를 형성하는 단일가닥 DNA 분자, 및 (f) RNA 분자로 전사되는 변형된 Pol Ⅲ 유전자를 포함하는 단일가닥 DNA 분자, (g) 이중가닥 DNA 분자, (h) RNA 분자로 전사되는 변형된 Pol Ⅲ 유전자를 포함하는 이중가닥 DNA 분자, 및 (i) 이중가닥의, 하이브리드화된 RNA/DNA 분자로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하며; 자생 식물에게 제초제 내성을 제공하는 단백질을 암호화하는 자생 식물의 내인성 유전자의 사일런싱 또는 억제를 위한 양태에서, 당해 방법은, 단백질이 내성을 제공하는 제초제의 양을 자생 식물 위에 적용시킴을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 경작지, 예를 들면, 옥수수, 대두, 면화, 카놀라, 사탕무우, 자주개자리, 사탕수수, 벼, 밀, 및 또한 과일 및 야채 작물과 같은 제초제 내성 작물의 현지에서 성장할 수 있는 자원 제초제 저항성(내성) 유전자이식 식물 또는 제초제 저항성(내성) 잡초를 방제하는데 유용하다. 일부 이러한 양태에서, 잡초 또는 자생 식물은 명아주(예를 들면, 팔머 아마란쓰) 및 다른 아마란쓰 종, 쇠뜨기말(쥐꼬리망초), 워터헴프(waterhemp), 돼지풀, 일반적인 돼지풀, 존슨그래스(johnsongrass), 갈퀴덩굴, 독보리, 바랭이, 가시상추, 벨벳리프(velvetleaf), 알팔파, 옥수수, 대두, 카놀라, 면화, 사탕무우, 사탕수수, 벼 또는 밀이다. 일부 이러한 양태에서 내인성 유전자는 제초제 저항성을 제공하는 단백질을 암호화하며; 이러한 단백질의 예는 "제초제 저항성 단백질" 단락에서 본원에 기재되어 있다. 다른 이러한 양태에서, 단일가닥 RNA 각각은 특수한 식물 종에서 유전자를 선택적으로 억제하지만 다른 것에서는 억제하지 않음으로써, 식물 종의 선택적인 방제를 허용한다. 여전히 다른 이러한 양태에서, 비-선택적인, 단일가닥 RNA 분자는 다수 식물 종에서 일반적인 유전자를 억제하여, 식물의 그룹 또는 분류군에 따른 광범위한 방제를 허용한다. 보다 구체적인 양태에서, 당해 방법은 또한, RNA 분자에 의해 표적화된 단백질이 RNA 분자의 작용에 의해 표적 단백질의 생산을 감소시키고 비-뉴클레오타이드 제초제의 작용에 의해 생산된 단백질의 기능을 억제함을 통해 작용의 이중 양식을 허용하는 내성을 제공하는 양의 비-뉴클레오타이드 제초제(예를 들면, 글리포세이트, 디캄바, 글루포시네이트 또는 설포닐우레아)를 자생 식물 또는 잡초 위에 적용시킴을 추가로 포함하며; 여기서 제초제는 뉴클레오타이드 조성물과는 별도(먼저 또는 나중에)로, 또는 이와 함께 적용될 수 있다. 일부 경우에 통상의 비-뉴클레오타이드 제초제의 적용과 동시에 또는 이후에, 폴리뉴클레오타이드 조성물을 적용하는 것은 상승 효과(즉, 조합된 효과가 별도로 이루어진 처리의 효과의 합보다 큰 경우)로 잡초 또는 자생 식물 방제를 제공한다.
제초제 저항성 단백질
제초제 저항성(내성)을 나타내는 천연(비-유전자이식) 및 유전자이식 식물은 흔히 제초제 내성에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자, 예를 들면, 저항성을 제공하는 전이유전자, 저항성을 제공하는 돌연변이된 내인성 유전자 또는 제초제에 의해 일반적으로 표적화되는 내인성 유전자의 다중 카피에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는다. 이러한 식물의 방제 전략은 제초제 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 억제하거나, 적어도 감소시키는 제제를 적용하는 것이다. 제초제에 대한 저항성을 제공하는 단백질의 예는 예를 들면, 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS), 글리포세이트 옥시도리덕타제 (GOX), 글리포세이트 데카복실라제, 글리포세이트-N-아세틸 트랜스퍼라제 (GAT), 디캄바 모노옥시게나제, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 2,2-디클로로프로피온산 데할로게나제, 아세토하이드록시산 신타제, 아세토락테이트 신타제, 할로아릴니트릴라제, 아세틸-보조효소 A 카복실라제, 디하이드로프테로에이트 신타제, 파이토엔 데사투라제, 프로토포르피린 IX 옥시게나제, 하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제, 파라-아미노벤조에이트 신타제, 글루타민 신타제, 셀룰로즈 신타제, 베타-투불린, 및 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제를 포함한다.
제초제에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 암호화하는 핵산의 예는 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPS; 참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,627,061호, 제5,633,435호, 제RE39247호, 제6,040,497호, 및 제5,094,945호, 및 PCT 국제 특허 공보 제WO04074443호 및 제WO04009761호), 글리포세이트 옥시도리덕타제(GOX; 미국 특허 제5,463,175호), 글리포세이트 데카복실라제 (PCT 국제 특허 공보 제WO05003362호, 미국 특허 제7,405,347호, 및 미국 특허원 공보 제2004/0177399호), 글리포세이트에 대해 저항성을 부여하는 글리포세이트-N-아세틸 트랜스퍼라제 (GAT; 미국 특허 제7,714,188호); 옥신 유사 제초제, 예를 들면, 디캄바에 대해 저항성을 부여하는 디캄바 모노옥시게나제(미국 특허 제7,105,724호); 포스피노트리신 또는 글루포시네이트에 대해 내성을 부여하는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제[패트(pat) 또는 바아](미국 특허 제5,646,024호); 2,2-디클로로프로피온산(달라폰)에 대해 저항성을 부여하는 2,2-디클로로프로피온산 데할로게나제(PCT 국제 특허원 공보 제WO9927116호); 설포닐우레아, 이미다졸리논, 트리아졸로피리미딘, 피리미딜옥시벤조에이트 및 프탈리드와 같은 아세토락테이트 신타제 억제제에 대해 저항성을 부여하는 아세토하이드록시산 신타제 또는 아세토락테이트 신타제(미국 특허 제6,225,105호); 브로목시닐에 대해 내성을 부여하기 위한 개질된 할로아릴니트릴라제(Bxn)(미국 특허 제4,810,648호); 사이클로헥산디온(세톡시딤) 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트(할록시포프)에 대해 내성을 부여하기 위한 아세틸-보조효소 A 카복실라제(미국 특허 제6,414,222호); 설폰아미드 제초제에 대해 내성을 부여하기 위한 디하이드로프테로에이트 신타제(sul I)(미국 특허 제5,719,046호); 트리아진 제초제에 저항성을 부여하기 위한 32 kDa 광시스템 Ⅱ 폴리펩타이드(psbA)(참조: Hirschberg et al ., 1983, Science, 222:1346-1349); 5-메틸트립토판에 대해 저항성을 부여하기 위한 안트라닐레이트 신타제(미국 특허 제4,581,847호); 아미노에틸 시스테인에 대해 저항성을 부여하기 위한 디하이드로디피콜린산 신타제(dap A)(PCT 국제 특허 공보 제WO8911789호); 노르플루라존과 같은 피리다지논 제초제에 대해 저항성을 부여하기 위한 파이토엔 데사투라제(crtI)(일본 특허 제JP06343473호); 이속사플루톨(미국 특허 제6,268,549)과 같은 사이클로프로필이속사졸 제초제에 대해 저항성을 부여하기 위한 하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제, 4-하이드록시페닐아세트산 옥시다제 및 4-하이드록시페닐아세틱 1-하이드롤라제(미국 특허 제7,304,209호); 프로토포르피리노겐 옥시다제 억제제에 대해 저항성을 부여하기 위한 개질된 프로토포르피리노겐 옥시다제 I(프로톡스)(미국 특허 제5939602호); 아릴옥시알카노에이트 잔기를 함유하는 제초제에 대해 저항성을 부여하기 위한 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 (AAD-1)(제WO05107437호); 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제(미국 특허원 공보 제2008/0155716호), 글루포시네이트 저항성 글루타민 신타제(미국 특허원 공보 제2009/0018016호)를 포함한다. 이러한 제초제의 예는 페녹시 옥신(예를 들면, 2,4-D 및 디클로로프로프), 피리딜옥시 옥신(예를 들면, 플루르옥시피르 및 트리클로피르)), 아릴옥시페녹시프로피오네이트(AOPP) 아세틸-보조효소 A 카복실라제(ACCase) 억제제(예를 들면, 할록시포프, 퀴잘로포프, 및 디클로포프), 및 5-치환된 페녹시아세테이트 프로토포르피리노겐 옥시다제 IX 억제제(예를 들면, 피라플루펜 및 플루미클로락)을 포함한다. 본 단락에서 인용된 미국 특허 및 특허원 공보에 기재된 것으로서, 제초제 저항성 단백질을 암호화하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열 및 제초제 내성 단백질의 서열은 참조함으로써 본원에 통합된다.
본 발명의 양태는 식물에 치명적인 수준 또는 적어도 제초제 저항성을 감소시키기 위한 수준에서 이러한 제초제 저항성 단백질을 암호화하는 RNA에 하이브리드화하는 RNA를 식물 세포에 직접 또는 간접적으로 제공하는 폴리뉴클레오타이드 및 방법을 제공한다. 제초제 저항성 단백질을 암호화하는 DNA의 서열 축퇴성(degeneracy)으로 인하여, 특수 식물에 특이적으로 효과적인 본 발명에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드를 설계하는 것이 가능하다. 다수의 식물 중에서 DNA의 도메인의 보존으로 인해, 각종 식물에 걸쳐 효과적인 본 발명에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드를 설계하는 것이 가능하다.
하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 개선된 제초 활성을 제공함으로써 제초제의 활성을 강화시키기 위해 상응하는 제초제와 혼합된다. 하나의 양태에서 폴리뉴클레오타이드는 제초제로부터 별도로, 그러나 처리-전 또는 처리-후로서 제초제의 적용과 함께 이용된다. 양태에서 오가노실리콘 표면활성제는 제초제 및 폴리뉴클레오타이드와 유리하게 조합되거나 조성물이 연속 방식으로 적용되는 경우 서로 조합된다. 온실 셋팅에서 식물은 11001XR 분무 노즐을 사용한 트랙 분무기 또는 실험실 분무기를 사용하여 처리함으로써 0.25 MPa 압력에서 예정된 속도(예를 들면, 140 L/ha)로 동일한 용액을 전달한다. 현지에서 처리 용액은 0.25MPa의 분무 압에서 통상화된 단일 노즐 조립체(낭비를 최소화하기 위함)가 장착된 11015 평편 팬 분무 노즐을 사용하여 적절한 비율의 조성물을 전달하도록 조정된 CO2 가압 백팩 문무기를 사용하여 적용시킬 수 있으며; 단일 노즐 분무기는 3 내지 12 인치 크기로 성장하는 식물의 덮개 위 60cm의 효과적인 분무 구획(spray swath)을 제공한다.
본 명세서에서 제공된 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 요지를 기재하고 있고, 이 요지는 이들 로마 숫자 조항에서 측면 및 양태를 비제한적으로 포함한다: (I) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함한다. (Ⅱ) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 국소 피복된 것 이외의 식물 세포에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함한다. (Ⅲ) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 전신성으로 조절함을 포함한다. (IV) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 표적 내인성 유전자의 억제를 유도한다. (V) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 원하는 표현형을 수행한다. (VI) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 효소, 구조 단백질 또는 식물 조절 단백질의 발현을 억제한다. (VⅡ) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 식물 치사제이다. (VⅢ) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 표적 내인성 유전자는 제초제와 상호작용하는 단백질을 암호화한다. (IX) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 표적 내인성 유전자는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS), 아세토하이드록시산 합성효소 또는 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 아세틸-코엔자임 A 카복실라아제 (ACCase), 디하이드로프테로에이트 합성효소, 파이토엔 데사투라제 (PDS), 프로토포르피린 IX 옥사게나아제 (PPO), 하이드록시페닐피루베이트 디옥사게나아제 (HPPD), 파라-아미노벤조에이트 합성효소, 글루타민 합성효소 (GS), 글루포시네이트 내성 글루타민 합성효소, 1-데옥시-D-자일루로즈 5-포스페이트 (DOXP) 합성효소, 디하이드로프테로에이트 (DHP) 합성효소, 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), 글루타티온 S-트랜스페라제 (GST), 광화학계 Ⅱ의 D1 단백질, 모노-옥사게나아제, 사이토크롬 P450, 셀룰로스 합성효소, 베타-튜불린, 및 세린 하이드록시메틸트랜스페라제. (X) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 표적 내인성 유전자는 성장하는 식물의 성장을 유지하는데 필수적인 단백질을 암호화한다. (XI) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 표적 내인성 유전자는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: RuBisCO, 번역 개시 인자, 및 파이토엔 데사투라제. (XⅡ) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 표적 내인성 유전자는 제초제에 내성을 제공하는 단백질을 암호화한다. (XⅢ) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 표적 내인성 유전자는 설포닐우레아 및 이미다졸리논 제초제에 내성을 부여하는 돌연변이체 아세토락테이트 합성효소 효소 또는 아릴옥시페녹시 프로피오네이트 제초제에 내성을 부여하는 돌연변이체 ACCase를 암호화한다. (XIV) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 제2 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 내인성 유전자 또는 상기 제2 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는다. (XV) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 제2 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 내인성 유전자 또는 상기 제2 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 가지며, 여기서 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 내인성 EPSPS 유전자의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적이고 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 내인성 번역 개시 인자 유전자의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적이다. (XVI) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 표적 내인성 유전자는 비-코딩 서열, 코딩 서열, 또는 비-코딩 서열 및 코딩 서열의 조합이다. (XVⅡ) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 성장하는 식물의 기관 상에 피복된다. (XVⅢ) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 성장하는 식물의 잎, 줄기, 씨, 과일, 또는 꽃 상에 피복된다. (XIX) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 제2 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드보다 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA의 상이한 분절의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열과 본질적으로 상보적인 서열을 갖는다. (XX) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 성장하는 식물은 개방 현장 또는 온실에 있다. (XXI) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 염색체에 통합되지 않는다. (XXⅡ) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 성장하는 식물 또는 식물 기관 상에 폴리뉴클레오타이드 조성물을 국소 피복하는 것을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하고, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (XXⅢ) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 전달제는 오르가노실리콘 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (XXIV) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (XXV) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 상기 실리콘 폴리에테르 코폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드 개질된 헵타메틸 트리실록산 및 알릴옥시폴리프로필렌 글리콜 메틸에테르의 코폴리머이다. (XXVI) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 성장하는 식물 또는 식물 기관 상에 폴리뉴클레오타이드 조성물을 국소 피복하는 것을 포함하고, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 상기 염은 유기 또는 무기 염이다. (XXVⅡ) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 전달제는 표면활성제, 유기 암모늄 염, 및 무기 암모늄 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (XXVⅢ) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 암모늄 설페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (XXIX) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 보습제 또는 킬레이트제를 추가로 포함한다. (XXX) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 분무 장치에 의해 성장하는 식물 또는 식물 기관 상에 피복된다. (XXXI) 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 ssDNA, dsDNA, ssRNA, dsRNA 및 RNA/DNA 하이브리드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (XXXⅡ) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시킨다. (XXXⅢ) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부로 침투하여 상기 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 상기 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 내인성 유전자는 제초제 표적 유전자 또는 제초제 불활성화 유전자인 단백질을 발현시킨다. (XXXIV) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 내인성 유전자는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제초제 표적 유전자 또는 제초제 불활성화 유전자인 단백질을 발현시킨다: 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS), 아세토하이드록시산 합성효소 또는 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 아세틸-코엔자임 A 카복실라아제 (ACCase), 디하이드로프테로에이트 합성효소, 파이토엔 데사투라제 (PDS), 프로토포르피린 IX 옥사게나아제 (PPO), 하이드록시페닐피루베이트 디옥사게나아제 (HPPD), 파라-아미노벤조에이트 합성효소, 글루타민 합성효소 (GS), 글루포시네이트 내성 글루타민 합성효소, 1-데옥시-D-자일루로즈 5-포스페이트 (DOXP) 합성효소, 디하이드로프테로에이트 (DHP) 합성효소, 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), 글루타티온 S-트랜스페라제 (GST), 광화학계 Ⅱ의 D1 단백질, 모노-옥사게나아제, 사이토크롬 P450, 셀룰로스 합성효소, 베타-튜불린, 및 세린 하이드록시메틸트랜스페라제. (XXXV) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 상기 제초제는 따로따로 또는 동일한 용액에서 적용된다. (XXXVI) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 ssDNA, dsDNA, ssRNA, dsRNA 및 RNA/DNA 하이브리드 로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (XXXVⅡ) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 제2 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드보다 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA의 상이한 분절의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열과 본질적으로 상보적인 서열을 갖는다. (XXXVⅢ) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물을 복수의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 상기 복수의 폴리뉴클레오타이드 각각은 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드보다 표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA의 상이한 분절의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열과 본질적으로 상보적인 서열을 갖는다. (XXXIX) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (XL) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 전달제는 오르가노실리콘 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (XLI) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (XLⅡ) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 상기 실리콘 폴리에테르 코폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드 개질된 헵타메틸 트리실록산 및 알릴옥시폴리프로필렌 글리콜 메틸에테르의 코폴리머이다. (XLⅢ) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 상기 염은 유기 또는 무기 염이다. (XLIV) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 성장하는 식물의 표면 상에 폴리뉴클레오타이드 조성물을 국소 피복하여 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 스며들도록 하는 단계, 상기 조성물은 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현시키는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 유효량의 전달제를 포함함, 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용하는 단계; 이로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 전달제는 표면활성제, 유기 암모늄 염, 및 무기 암모늄 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (XLV) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 암모늄 설페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (XLVI) 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법, 상기 방법은, (a) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및 (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 스며들고 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키고, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 상기 전달제 보습제 또는 킬레이트제를 추가로 포함한다. (XLVⅡ) 표면활성제 및 적어도 하나의 식물 치사제를 포함하는, 성장하는 식물의 외부 표면 위에 국소 피복하도록 조정된 액상의 제초제 조성물로서, 당해 식물 치사제가, 식물 유전자의 서열 또는 식물 유전자의 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 식물 유전자에 대한 프로브(probe)에 하이브리드화하는 작은 RNA의 전신계적 생산을 수행하는 것을 개선점으로 하는 액상의 제초제 조성물. (XLVⅢ) 비-뉴클레오타이드 제초제를 포함하는 액상의 제초제 조성물로서, 당해 조성물이, 식물 유전자의 서열 또는 식물 유전자의 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 것을 개선점으로 하는 액상의 제초제 조성물. (XLIX) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물. (L) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LI) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LⅡ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LⅢ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 상기 실리콘 폴리에테르 코폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드 개질된 헵타메틸 트리실록산 및 알릴옥시폴리프로필렌 글리콜 메틸에테르의 코폴리머이다 (Silwet? L-77 표면활성제로부터 이용가능). (LIV) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 이는 비-폴리뉴클레오타이드 제초 분자를 추가로 포함한다. (LV) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 식물 유전자는 제초제 내성을 제공하고 하기인 단백질을 암호화한다: 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS), 아세토하이드록시산 합성효소 또는 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 아세틸-코엔자임 A 카복실라아제 (ACCase), 디하이드로프테로에이트 합성효소, 파이토엔 데사투라제 (PDS), 프로토포르피린 IX 옥사게나아제 (PPO), 하이드록시페닐피루베이트 디옥사게나아제 (HPPD), 파라-아미노벤조에이트 합성효소, 글루타민 합성효소 (GS), 글루포시네이트 내성 글루타민 합성효소, 1-데옥시-D-자일루로즈 5-포스페이트 (DOXP) 합성효소, 디하이드로프테로에이트 (DHP) 합성효소, 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), 글루타티온 S-트랜스페라제 (GST), 광화학계 Ⅱ의 D1 단백질, 모노-옥사게나아제, 사이토크롬 P450, 셀룰로스 합성효소, 베타-튜불린, 또는 세린 하이드록시메틸트랜스페라제. (LVI) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물. (LVⅡ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LVⅢ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LIX) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LX) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 상기 실리콘 폴리에테르 코폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드 개질된 헵타메틸 트리실록산 및 알릴옥시폴리프로필렌 글리콜 메틸에테르의 코폴리머이다 (Silwet? L-77 표면활성제로부터 이용가능). (LXI) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 이는 비-폴리뉴클레오타이드 제초 분자를 추가로 포함한다. (LXⅡ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 식물 유전자는 제초제 내성을 제공하고 하기인 단백질을 암호화한다: 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS), 아세토하이드록시산 합성효소 또는 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 아세틸-코엔자임 A 카복실라아제 (ACCase), 디하이드로프테로에이트 합성효소, 파이토엔 데사투라제 (PDS), 프로토포르피린 IX 옥사게나아제 (PPO), 하이드록시페닐피루베이트 디옥사게나아제 (HPPD), 파라-아미노벤조에이트 합성효소, 글루타민 합성효소 (GS), 글루포시네이트 내성 글루타민 합성효소, 1-데옥시-D-자일루로즈 5-포스페이트 (DOXP) 합성효소, 디하이드로프테로에이트 (DHP) 합성효소, 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), 글루타티온 S-트랜스페라제 (GST), 광화학계 Ⅱ의 D1 단백질, 모노-옥사게나아제, 사이토크롬 P450, 셀룰로스 합성효소, 베타-튜불린, 또는 세린 하이드록시메틸트랜스페라제. (LXⅢ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물. (LXIV) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LXV) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LXVI) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LXVⅡ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 상기 실리콘 폴리에테르 코폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드 개질된 헵타메틸 트리실록산 및 알릴옥시폴리프로필렌 글리콜 메틸에테르의 코폴리머이다 (Silwet? L-77 표면활성제로부터 이용가능). (LXVⅢ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 이는 비-폴리뉴클레오타이드 제초 분자를 추가로 포함한다. (LXIX) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 식물 유전자는 제초제 내성을 제공하고 하기인 단백질을 암호화한다: 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS), 아세토하이드록시산 합성효소 또는 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 아세틸-코엔자임 A 카복실라아제 (ACCase), 디하이드로프테로에이트 합성효소, 파이토엔 데사투라제 (PDS), 프로토포르피린 IX 옥사게나아제 (PPO), 하이드록시페닐피루베이트 디옥사게나아제 (HPPD), 파라-아미노벤조에이트 합성효소, 글루타민 합성효소 (GS), 글루포시네이트 내성 글루타민 합성효소, 1-데옥시-D-자일루로즈 5-포스페이트 (DOXP) 합성효소, 디하이드로프테로에이트 (DHP) 합성효소, 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), 글루타티온 S-트랜스페라제 (GST), 광화학계 Ⅱ의 D1 단백질, 모노-옥사게나아제, 사이토크롬 P450, 셀룰로스 합성효소, 베타-튜불린, 또는 세린 하이드록시메틸트랜스페라제. (LXX) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물. (LXXI) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LXXⅡ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LXXⅢ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LXXIV) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 상기 실리콘 폴리에테르 코폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드 개질된 헵타메틸 트리실록산 및 알릴옥시폴리프로필렌 글리콜 메틸에테르의 코폴리머이다 (Silwet? L-77 표면활성제로부터 이용가능). (LXXV) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 이는 비-폴리뉴클레오타이드 제초 분자를 추가로 포함한다. (LXXVI) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 식물 유전자는 제초제 내성을 제공하고 하기인 단백질을 암호화한다: 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS), 아세토하이드록시산 합성효소 또는 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 아세틸-코엔자임 A 카복실라아제 (ACCase), 디하이드로프테로에이트 합성효소, 파이토엔 데사투라제 (PDS), 프로토포르피린 IX 옥사게나아제 (PPO), 하이드록시페닐피루베이트 디옥사게나아제 (HPPD), 파라-아미노벤조에이트 합성효소, 글루타민 합성효소 (GS), 글루포시네이트 내성 글루타민 합성효소, 1-데옥시-D-자일루로즈 5-포스페이트 (DOXP) 합성효소, 디하이드로프테로에이트 (DHP) 합성효소, 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), 글루타티온 S-트랜스페라제 (GST), 광화학계 Ⅱ의 D1 단백질, 모노-옥사게나아제, 사이토크롬 P450, 셀룰로스 합성효소, 베타-튜불린, 또는 세린 하이드록시메틸트랜스페라제. (LXXVⅡ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물. (LXXVⅢ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LXXIX) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LXXX) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. (LXXXI) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 전달제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머 오르가노실리콘 표면활성제 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 상기 실리콘 폴리에테르 코폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드 개질된 헵타메틸 트리실록산 및 알릴옥시폴리프로필렌 글리콜 메틸에테르의 코폴리머이다 (Silwet? L-77 표면활성제로부터 이용가능). (LXXXⅡ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 이는 비-폴리뉴클레오타이드 제초 분자를 추가로 포함한다. (LXXX Ⅲ) (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물, 여기서 상기 식물 유전자는 제초제 내성을 제공하고 하기인 단백질을 암호화한다: 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS), 아세토하이드록시산 합성효소 또는 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 아세틸-코엔자임 A 카복실라아제 (ACCase), 디하이드로프테로에이트 합성효소, 파이토엔 데사투라제 (PDS), 프로토포르피린 IX 옥사게나아제 (PPO), 하이드록시페닐피루베이트 디옥사게나아제 (HPPD), 파라-아미노벤조에이트 합성효소, 글루타민 합성효소 (GS), 글루포시네이트 내성 글루타민 합성효소, 1-데옥시-D-자일루로즈 5-포스페이트 (DOXP) 합성효소, 디하이드로프테로에이트 (DHP) 합성효소, 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), 글루타티온 S-트랜스페라제 (GST), 광화학계 Ⅱ의 D1 단백질, 모노-옥사게나아제, 사이토크롬 P450, 셀룰로스 합성효소, 베타-튜불린, 또는 세린 하이드록시메틸트랜스페라제. (LXXXIV) 자생 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 (i) 당해 자생 식물의 성장 또는 생애를 유지시키기 위한 필수 유전자이거나, (ⅱ) 상기 자생 식물에 대해 내성인 제초제를 제공하는 단백질을 암호화하거나, (ⅲ) RNA 조절제로 전사하는 내인성 유전자로부터 전사되는 전령 RNA에 하이브리드화할 수 있는 전신계적인 단일가닥 RNA를 상기 자생 식물의 세포내에 제공하는 폴리뉴클레오타이드 올리고머를 포함하는 조성물을 상기 자생 식물의 잎 위에 적용함을 포함하여, 제초제 내성 작물의 현지(field)에서 성장하는 표적화된 제초제 내성 자생 식물을 선택적으로 방제하기 위한 방법. (LXXXV) 자생 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 (i) 당해 자생 식물의 성장 또는 생애를 유지시키기 위한 필수 유전자이거나, (ⅱ) 상기 자생 식물에 대해 내성인 제초제를 제공하는 단백질을 암호화하거나, (ⅲ) RNA 조절제로 전사하는 내인성 유전자로부터 전사되는 전령 RNA에 하이브리드화할 수 있는 전신계적인 단일가닥 RNA를 상기 자생 식물의 세포내에 제공하는 폴리뉴클레오타이드 올리고머를 포함하는 조성물을 상기 자생 식물의 잎 위에 적용함을 포함하여, 제초제 내성 작물의 현지(field)에서 성장하는 표적화된 제초제 내성 자생 식물을 선택적으로 방제하기 위한 방법, 여기서 상기 조성물은 표면활성제, 및 단일가닥 RNA, 이중가닥 RNA, 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA, 및 이중가닥, 하이브리드화된 RNA/DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 올리고머를 포함하고, 여기서 상기 올리고머는 내인성 유전자의 전령 RNA와 본질적으로 동일하거나 그 서열과 상보적인 서열을 가지며; 여기서 상기 내인성 유전자는 타고난 유전자 또는 재조합 이식유전자이다. (LXXXVI) 자생 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 (i) 당해 자생 식물의 성장 또는 생애를 유지시키기 위한 필수 유전자이거나, (ⅱ) 상기 자생 식물에 대해 내성인 제초제를 제공하는 단백질을 암호화하거나, (ⅲ) RNA 조절제로 전사하는 내인성 유전자로부터 전사되는 전령 RNA에 하이브리드화할 수 있는 전신계적인 단일가닥 RNA를 상기 자생 식물의 세포내에 제공하는 폴리뉴클레오타이드 올리고머를 포함하는 조성물을 상기 자생 식물의 잎 위에 적용함을 포함하여, 제초제 내성 작물의 현지(field)에서 성장하는 표적화된 제초제 내성 자생 식물을 선택적으로 방제하기 위한 방법, 여기서 상기 자생 식물은 명아주, 무명벨벳, 물대마, 가시상추, 서양민들레, 자주개자리, 옥수수, 대두, 캐놀라, 목화, 사탕무, 사탕수수, 밀, 쌀, 또는 야채이다. (LXXXVⅡ) 자생 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 (i) 당해 자생 식물의 성장 또는 생애를 유지시키기 위한 필수 유전자이거나, (ⅱ) 상기 자생 식물에 대해 내성인 제초제를 제공하는 단백질을 암호화하거나, (ⅲ) RNA 조절제로 전사하는 내인성 유전자로부터 전사되는 전령 RNA에 하이브리드화할 수 있는 전신계적인 단일가닥 RNA를 상기 자생 식물의 세포내에 제공하는 폴리뉴클레오타이드 올리고머를 포함하는 조성물을 상기 자생 식물의 잎 위에 적용함을 포함하여, 제초제 내성 작물의 현지(field)에서 성장하는 표적화된 제초제 내성 자생 식물을 선택적으로 방제하기 위한 방법, 여기서 상기 작물은 옥수수, 대두, 목화, 캐놀라, 사탕무, 자주개자리, 사탕수수, 쌀, 밀, 또는 과일 또는 야채 농작물이다. (LXXXVⅢ) 제초제 내성 작물의 현지에서 성장하는 표적화된 제초제 내성 자생 식물을 선택적으로 방제하는 방법, 상기 방법은 자생 식물의 잎 상에, 생리학적 조건하에 자생 식물의 세포에서 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA로 하이브리드화할 수 있는 전신의 단일가닥 RNA를 자생 식물의 세포에서 제공하는 폴리뉴클레오타이드 올리고머를 포함하는 조성물을 적용하는 것을 포함하며, 상기 내인성 유전자는 (i) 자생 식물의 성장 또는 생애를 유지하기 위한 필수 유전자이고, (ⅱ) 제초제 내성을 자생 식물에 제공하는 단백질을 암호화하고, 또는 (ⅲ) RNA 조절제로 전사되고, 여기서 상기 내인성 유전자는 제초제 내성을 자생 식물에 제공하는 단백질을 암호화하고, 이 단백질은 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS), 아세토하이드록시산 합성효소 또는 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 아세틸-코엔자임 A 카복실라아제 (ACCase), 디하이드로프테로에이트 합성효소, 파이토엔 데사투라제 (PDS), 프로토포르피린 IX 옥사게나아제 (PPO), 하이드록시페닐피루베이트 디옥사게나아제 (HPPD), 파라-아미노벤조에이트 합성효소, 글루타민 합성효소 (GS), 글루포시네이트 내성 글루타민 합성효소, 1-데옥시-D-자일루로즈 5-포스페이트 (DOXP) 합성효소, 디하이드로프테로에이트 (DHP) 합성효소, 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), 글루타티온 S-트랜스페라제 (GST), 광화학계 Ⅱ의 D1 단백질, 모노-옥사게나아제, 사이토크롬 P450, 셀룰로스 합성효소, 베타-튜불린, 또는 세린 하이드록시메틸트랜스페라제이다. (LXXXIX) 자생 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 (i) 당해 자생 식물의 성장 또는 생애를 유지시키기 위한 필수 유전자이거나, (ⅱ) 상기 자생 식물에 대해 내성인 제초제를 제공하는 단백질을 암호화하거나, (ⅲ) RNA 조절제로 전사하는 내인성 유전자로부터 전사되는 전령 RNA에 하이브리드화할 수 있는 전신계적인 단일가닥 RNA를 상기 자생 식물의 세포내에 제공하는 폴리뉴클레오타이드 올리고머를 포함하는 조성물을 상기 자생 식물의 잎 위에 적용함을 포함하여, 제초제 내성 작물의 현지(field)에서 성장하는 표적화된 제초제 내성 자생 식물을 선택적으로 방제하기 위한 방법, 여기서 상기 내인성 유전자는 제초제 내성을 자생 식물에 제공하는 단백질을 암호화하고, 이 단백질은 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS), 아세토하이드록시산 합성효소 또는 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 아세틸-코엔자임 A 카복실라아제 (ACCase), 디하이드로프테로에이트 합성효소, 파이토엔 데사투라제 (PDS), 프로토포르피린 IX 옥사게나아제 (PPO), 하이드록시페닐피루베이트 디옥사게나아제 (HPPD), 파라-아미노벤조에이트 합성효소, 글루타민 합성효소 (GS), 글루포시네이트 내성 글루타민 합성효소, 1-데옥시-D-자일루로즈 5-포스페이트 (DOXP) 합성효소, 디하이드로프테로에이트 (DHP) 합성효소, 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL), 글루타티온 S-트랜스페라제 (GST), 광화학계 Ⅱ의 D1 단백질, 모노-옥사게나아제, 사이토크롬 P450, 셀룰로스 합성효소, 베타-튜불린, 또는 세린 하이드록시메틸트랜스페라제이고, 또한, 상기 방법은 자생 식물 상에, 단백질이 내성을 제공하는 제초제의 양을 적용하는 것을 포함한다. (XC) 식물에서 내인성 표적 유전자를 조절하여 역유전학을 연구하는 방법, 상기 방법은 성장하는 식물의 조직 상에 하기를 적용하는 것을 포함한다: (1) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (2) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (3) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (4) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (5) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 식물의 표면으로부터 식물의 세포로 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제. (XCI) 식물에서 내인성 표적 유전자를 조절하여 역유전학을 연구하는 방법, 상기 방법은 성장하는 식물의 조직 상에 하기를 적용하는 것을 포함한다: (1) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (2) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (3) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (4) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (5) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 식물의 표면으로부터 식물의 세포로 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 여기서 상기 조성물은 적어도 1주 기간 동안 식물의 생존 동안 표적 유전자의 조절을 수행한다. (XCⅡ) 식물에서 내인성 표적 유전자를 조절하여 역유전학을 연구하는 방법, 상기 방법은 성장하는 식물의 조직 상에 하기를 적용하는 것을 포함한다: (1) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (2) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (3) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (4) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (5) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 식물의 표면으로부터 식물의 세포로 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 여기서 세포에서 전사된 RNA는 단백질 또는 조절 RNA를 암호화하는 전령 RNA이다. (XCⅢ) 식물에서 내인성 표적 유전자를 조절하여 역유전학을 연구하는 방법, 상기 방법은 성장하는 식물의 조직 상에 하기를 적용하는 것을 포함한다: (1) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (2) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (3) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (4) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (5) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 식물의 표면으로부터 식물의 세포로 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 제초제 상호작용을 확인하기 위해 식물을 화합물의 어레이에 노출하는 것을 추가로 포함한다. (XCIV) 식물에서 내인성 유전자를 조절하여 역유전학을 연구하는 방법, 상기 방법은 생존 식물의 조직 상에 하기를 국소적으로 적용하는 것을 포함한다: (1) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (2) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (3) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (4) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제; 또는 (5) 하기로 본질적으로 이루어진 조성물: (a) 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드는 생리학적 조건하에 식물의 세포에서 내인성 유전자 또는 내인성 유전자로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하여 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있음; 및 (b) 식물의 표면으로부터 식물의 세포로 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제. (XCV) (a) 폴리뉴클레오타이드 올리고머에 의한 침투에 대해 식물을 컨디셔닝하기 위한 제제, 및 (b) 상기 식물에 화학적 제초제에 내한 내성을 제공하는 단백질을 암호화하거나 필수 유전자인, 안티-센스 또는 센스 배향의 상기 식물의 내인성 유전자의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 올리고머의 수용액을 포함하는 제초제 조성물. (XCVI) (a) 폴리뉴클레오타이드 올리고머에 의한 침투에 대해 식물을 컨디셔닝하기 위한 제제, 및 (b) 상기 식물에 화학적 제초제에 내한 내성을 제공하는 단백질을 암호화하거나 필수 유전자인, 안티-센스 또는 센스 배향의 상기 식물의 내인성 유전자의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 올리고머의 수용액을 포함하는 제초제 조성물, 여기서 상기 내인성 유전자는 식물 내성을 화학 제초제에 제공하는 단백질을 암호화하거나 필수 유전자이고, 화학 제초제를 추가로 포함한다. (XCVⅡ) (a) 폴리뉴클레오타이드 올리고머에 의한 침투에 대해 식물을 컨디셔닝하기 위한 제제, 및 (b) 상기 식물에 화학적 제초제에 내한 내성을 제공하는 단백질을 암호화하거나 필수 유전자인, 안티-센스 또는 센스 배향의 상기 식물의 내인성 유전자의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 올리고머의 수용액을 포함하는 제초제 조성물, 여기서 상기 내인성 유전자는 식물 내성을 화학 제초제에 제공하는 단백질을 암호화하거나 필수 유전자이고, 글라이포세이트, 디캄바, 포스피노트리신, 브로목시닐, 이옥시닐, 또는 클로르설푸론 제초제 화합물을 포함하는 화학 제초제를 추가로 포함한다. (XCVⅢ) (a) 폴리뉴클레오타이드 올리고머에 의한 침투에 대해 식물을 컨디셔닝하기 위한 제제, 및 (b) 상기 식물에 화학적 제초제에 내한 내성을 제공하는 단백질을 암호화하거나 필수 유전자인, 안티-센스 또는 센스 배향의 상기 식물의 내인성 유전자의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 올리고머의 수용액을 포함하는 제초제 조성물, 여기서 상기 내인성 유전자는 식물 내성을 화학 제초제에 제공하는 단백질을 암호화하거나 필수 유전자이고, 글라이포세이트 화합물, 실리콘 폴리에테르 코폴리머 표면활성제 및 폴리뉴클레오타이드 올리고머를 포함하는 화학 제조제를 추가로 포함한다. (XCIX) 식물이 종자로부터 생긴 후 당해 식물에 대한 폴리뉴클레오타이드의 국소 적용에 의해 억제되는 내인성 유전자를 억제하기 위한 외인성 DNA 또는 RNA로서, 상기 식물의 염색체 내로 통합되지 않는 외인성 DNA 또는 상기 식물의 염색체 내로 통합된 DNA로부터 전사되지 않는 외인성 RNA를 포함하는 식물. (C) 폴리뉴클레오타이드를 오가노실리콘 표면활성제와 조합함을 포함하여, 식물 세포의 외부에 상기 폴리뉴클레오타이드를 국소 적용함으로써 식물 세포의 내부로 상기 폴리뉴클레오타이드를 전달하기 위한 방법. (CI) 상기 폴리뉴클레오타이드의 상기 식물 세포의 외부에의 국소 적용에 의해 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포의 내부에 전달하는 방법, 상기 방법은 상기 폴리뉴클레오타이드를 오르가노실리콘 표면활성제와 조합하는 것을 포함하고, 여기서 상기 오르가노실리콘 표면활성제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머이다. (CⅡ) 상기 폴리뉴클레오타이드의 상기 식물 세포의 외부에의 국소 적용에 의해 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포의 내부에 전달하는 방법, 상기 방법은 상기 폴리뉴클레오타이드를 오르가노실리콘 표면활성제와 조합하는 것을 포함하고, 여기서 상기 오르가노실리콘 표면활성제는 실리콘 폴리에테르 코폴리머이고, 여기서 상기 실리콘 폴리에테르 코폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드 개질된 헵타메틸 트리실록산 및 알릴옥시폴리프로필렌 글리콜 메틸에테르의 코폴리머이다. (CⅢ) 상기 폴리뉴클레오타이드의 상기 식물 세포의 외부에의 국소 적용에 의해 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포의 내부에 전달하는 방법, 상기 방법은 상기 폴리뉴클레오타이드를 오르가노실리콘 표면활성제 및 유기 또는 무기 염과 조합하는 것을 포함한다. (CIV) 상기 폴리뉴클레오타이드의 상기 식물 세포의 외부에의 국소 적용에 의해 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포의 내부에 전달하는 방법, 상기 방법은 상기 폴리뉴클레오타이드를 오르가노실리콘 표면활성제 및 유기 또는 무기 염과 조합하는 것을 포함하고, 여기서 상기 염은 암모늄 염이다. (CV) 상기 폴리뉴클레오타이드의 상기 식물 세포의 외부에의 국소 적용에 의해 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포의 내부에 전달하는 방법, 상기 방법은 상기 폴리뉴클레오타이드를 오르가노실리콘 표면활성제 및 유기 또는 무기 염과 조합하는 것을 포함하고, 여기서 상기 염은 암모늄 염이고, 여기서 상기 암모늄 분무 염은 암모늄 설페이트이다. (CVI) 상기 폴리뉴클레오타이드의 상기 식물 세포의 외부에의 국소 적용에 의해 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포의 내부에 전달하는 방법, 상기 방법은 상기 폴리뉴클레오타이드를 오르가노실리콘 표면활성제와 조합하는 것을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드 조성물은 분무 장치에 의해 성장하는 식물 또는 식물 기관 상에 피복된다.
실시예 1
당해 실시예는 제초제 내성 잡초를 방제하는데 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자의 유용성을 나열한다. 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰의 유전형은 제초제 처리에서 글리포세이트 화합물에 의해 표적화되는 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS)를 암호화하는 유전자의 다수 카피, 예를 들면, 4 내지 100개 이상의 카피를 가진 것으로 확인되었다.
도 1에 나타낸 서열 번호: 1을 참조하여, 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" dsRNA 분자를 도 1에서 밑줄친 뉴클레오타이드에 의해 나타난 바와 같이, 14 내지 38번 위치(짧은 dsRNA-1), 153 내지 177번 위치(짧은 dsRNA-2), 345 내지 369번 위치(짧은 dsRNA-3), 및 1105 내지 1129번 위치(짧은 dsRNA-4)에서 팔머 아마란쓰 EPSPS 유전자로부터 전사된 mRNA에 하이브리드화할 수 있는 안티-센스 쇄를 사용하여 설계하였다. 4개의 설계된 짧은 dsRNA는 업자[Integrated DNA Technologies(IDT)]로부터 시판되며; dsRNA는 안티-센스 쇄의 3' 말단에서 2개 뉴클레오타이드 오우버행(overhang)을 가졌고 센스 쇄의 3' 말단에서 말단 뉴클레오타이드로서 2개의 데옥시뉴클레오타이드를 가졌다.
서열 번호: 1 및 도 1을 참조하여, 3개의 "긴" 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드를 도 1에서 굵은 활자체의 뉴클레오타이드에 의해 나타낸 것으로서 16 내지 170번 위치(긴 dsRNA-1), 451 내지 722번 위치(긴 dsRNA-2), 및 1109 내지 1328번 위치(긴 dsRNA-3)에서 팔머 아마란쓰 EPSPS 유전자로부터 전사된 mRNA에 하이브리드화할 수 있는 하나의 쇄를 사용하여 설계하였다. 3개의 설계된 긴 dsRNA는 Ambion MEGAscript? RNAi 키트, 제품 번호 1626을 사용하여 제조하였다.
EPSPS를 암호화하는 내인성 유전자 중 16개 카피를 갖는 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰의 식물생장 클론[참조: Gaines, et al . (2010) Proceedings of the National Academy of Sciences 107(3): 1029-1034]을 3.5 kg/m3의 Osmocote? 14-14-14 비료를 함유하는 SunGro? Redi-토양 파종 혼합물을 사용하여 3.5 제곱인치 사각 화분 속에서 14-시간 광주기 및 30℃의 낮 온도 및 20℃의 밤 온도를 갖는 온실에서 성장시켰으며; 식물은 필요할 경우 탈이온수로 급수하였다.
잎 침지를 위한 예비처리 표면활성제 용액은 Silwet L-77 상표명 오가노실리콘 표면활성제를 증류수로 0.1% (v/v)가지 희석시켜 제조하였다. 예비처리 5% (w/v) 카르보룬둠 용액은 2 g의 카르보룬둠(400 그릿)을 40 ml 증류수 속에 혼합하여 제조하였다. 처리 완충 용액은 DEPC 물(Omega Bio-Tek) 속에서 10 mM 인산나트륨 및 0.01 % (v/v) Silwet L-77 오가노실리콘 표면활성제를 사용하여 제조하고 pH 6.8로 조절하였다. 짧은 dsRNA 용액은 등몰량의 각각의 4개의 짧은 dsRNA (위에서 확인됨)을 처리 완충 용액 속에서 마이크로리터당 0.005나노몰의 각각의 짧은 dsRNA의 농도로 사용하여 제조하였다. 긴 dsRNA 용액은 처리 완충액 속에서 등몰량의 3개의 긴 dsRNA 각각을 마이크로리터당 0.0006나노몰의 각각의 긴 dsRNA의 농도에서 사용하여 제조하였다. 혼합된(짧은/긴) dsRNA 용액은 마이크로리터당 0.005나노몰의 각각의 4개의 짧은 dsRNA 및 0.0006나노몰의 각각의 3개의 긴 dsRNA를 사용하여 제조하였다.
EPSPS를 암호화하는 내인성 유전자의 16개 카피를 갖는 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰의 식물생장 클론을 카르보룬둠 용액 또는 표면활성제 용액으로 예비 처리하여 dsRNA를 전달 또는 침투시키기 위해 잎을 컨디셔닝하였다. 카르보룬둠 용액의 경우 예비 처리 잎 마모는 잎의 상부 표면위에 0.5 ml의 카르보룬둠 용액을 온화하게 문질러서 시행하였다. 표면활성제 용액의 경우 예비 처리는 4개의, 완전히-확장된 성숙한 공급원 잎을 표면활성제 용액 속에 침지시키고, 건조시켰다. 카르보룬둠 용액 또는 표면활성제 용액에 의한 잎 예비 처리 후, 컨디셔닝된 잎을 완충액 용액(대조군으로서) 또는 40마이크로리터의 dsRNA 용액(식물당 각각 4개의 잎 위에서 10 마이크로리터의 dsRNA 용액을 적용시킴)으로 처리하였다. 짧은 dsRNA 용액을 사용한 처리는 약 0.8나노몰의 짧은 dsRNA 분자(0.2나노몰의 각각의 짧은 dsRNA)를 각각의 처리된 식물에 적용하였다. 긴 dsRNA 용액을 사용한 처리는 약 0.072나노몰의 긴 dsRNA 분자(0.024나노몰의 각각의 긴 dsRNA)를 각각의 처리된 식물에 적용하였다. 혼합된(짧은/긴) dsRNA 용액을 사용한 처리는 약 0.8나노몰의 짧은 dsRNA 분자 및 약 0.072나노몰의 긴 dsRNA 분자를 각각의 처리된 식물에 적용시켰다. 대조군을 제외하고, 모든 식물에 글리포세이트 제초제 용액(헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 1682 g의 산 당량)을 dsRNA 처리 직후, 48시간 후, 또는 72시간 후 분무하고 글리포세이트 처리한지 적어도 7일 후에 평가하였다.
결과:
6개의 표면활성제 처리된, 대조군 식물(dsRNA 분자 처리 안됨)은 글리포세이트 처리에서 생존하였다. 글리포세이트 처리 후 7일째 식물의 사진에 대해 도 3a를 참조한다.
4개의 카르보룬둠 마모제 처리된, 대조군 식물(dsRNA 분자 처리 안함) 중의 2개는 글리포세이트 처리에 의해 사멸하였다.
혼합된(짧은/긴) dsRNA 용액의 적용 직후 글리포세이트로 처리한 6개의 표면활성제 처리된 식물은 생존하였으나 성장이 저해되었다.
혼합된 (짧은/긴) dsRNA 용액 만으로 처리하고 글리포세이트를 처리하지 않은 6개의 표면활성제 처리된 식물은 생존하였다. 혼합된 (짧은/긴) dsRNA 용액으로 처리한후 글리포세이트 처리한 6개의 표면활성제 처리된 식물 중 5개는 사멸하였다.
혼합된 (짧은/긴) dsRNA 용액의 적용 후 48시간째에 글리포세이트로 처리한 6개의 표면활성제 처리된 식물 중 5개는 사멸하였다.
혼합된 (짧은/긴) dsRNA 용액의 적용 후 48시간 째에 글리포세이트로 처리한 4개의 카르보룬둠 처리된 식물 중 3개는 사멸하였다.
긴 dsRNA 용액에 이어 72시간 후 글리포세이트 처리한 6개의 표면활성제 처리된 식물 중 5개는 사멸하였다; 도 3b 참조. 짧은 dsRNA 용액에 이어서, 72시간 후 글리포세이트 처리한 6개의 표면활성제 처리된 식물 중 6개는 사멸하였다; 도 3c 참조.
실시예 2
당해 실시예는 글리포세이트 제초제 민감성 잡초의 방제를 개선시키기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자의 유용성을 설명한다. 실시예 1에서 제조한 혼합된 (짧은/긴) dsRNA 용액을 실시예 1에서 사용된 표면활성제 용액으로 예비 처리한 글리포세이트 민감성 벨벳리프(velvetleaf) 식물(총 40 마이크로리터를 2개의 잎에 적용함)에 적용하였다. 대조군 식물을 완충액 만으로 처리하고 이어서 표면활성제 용액으로 예비 처리하였다. dsRNA 처리 48시간 후 식물을 글리포세이트 제초제 용액 (헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상품명 글리포세이트 제초제의 53 g의 산 당량)으로 처리하였다. 식물 성장(식물 높이로 측정함)을 관찰함으로써 평가한 것으로서 글리포세이트 활성에 있어서 2배 증가가 완충액 및 제초제로 처리한 대조군 식물과 비교하여 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 제초제로 처리한 식물에서 관찰되었다. 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 제초제로 처리한 식물은 심각한 발육저지를 지니면서 생존하였으며; 완충액 및 제초제로 처리한 대조군 식물은 생존하여 완전 회복하였다. 유사한 결과가 다른 글리포세이트 제초제 민감성 잡초, 즉, 글리포세이트 제초제 민감성 워터헴프, 명아주, 돼지풀, 가시상추, 담배, 및 민들레를 사용하여 수득되었다.
실시예 3
당해 실시예는 유전자이식 글리포세이트 내성 작물에서 잡초를 방제하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자의 유용성을 설명한다. 세균 EPSPS를 발현시키기 위한 재조합체 DNA를 갖는 유전자이식 알팔파, 카놀라, 옥수수, 면화, 벼, 대두, 사탕 수수, 사탕무 및 밀 식물(참조: 글리포세이트 내성 "Ⅱ 부류" EPSPS 유전자의 기술에 대해 미국 특허 제RE39,247호)을 (a) 실시예 1에서 사용된 표면활성제 용액, (b) 실시예 1에서 제조한 혼합된(짧은/긴) dsRNA 용액, 및 (c) 글리포세이트 제초제 용액(헥타르당 Roundup? WeatherMAX?의 1682 g의 산 당량)으로 dsRNA 처리 후 48시간 째에 처리한다. 30일 후, 모든 유전자이식 글리포세이트 내성 작물은 생존하며 발육 저지는 나타내지 않았다.
실시예 4
당해 실시예는 제초제로서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자의 유용성을 설명한다. 2개의 dsRNA 폴리뉴클레오타이드 분자를 설계하여 담배[(니코티아나 벤타미아나(니코티아나 벤타미아나)]에서 파이토엔 데사투라제를 암호화하는 mRNA의 오우버랩핑 분절을 표적화하였다. 서열 번호: 2 및 도 5를 참조하여, mRNA의 192 nt 길이(도 5에 굵은 활자체로 나타냄) 및 685 nt 길이(도 5에 밑줄로 나타냄)를 표적화하는 dsRNA를 Ambion? MEGAscript?키트를 사용하여 제조하였다. 별도의 dsRNA 용액을 제조하였다. 담배 식물 잎을 실시예 1에서와 같이 표면활성제 용액으로 예비처리한 후 식물당 약 0.6 마이크로몰의 dsRNA를 적용시키는 dsRNA 용액 중 하나로 처리하였다. dsRNA 처리 후 9일 째에 파이토엔 데사투라제 사일런싱이 정단 잎에서 가시적인 잎 표백으로부터 명백하였다: 참조: 도 4. dsRNA로 처리한 후 15일 째에 처리된 식물의 반은 사멸한 것으로 나타났으며 식물의 나머지 반은 땅위 조직 대부분이 표백되었다. 노던 블롯 분석은 처리에 사용된 dsRNA에 상응하는 siRNA의 존재를 나타낸다.
실시예 5
당해 실시예는 제초제로서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자의 유용성을 추가로 설명한다. dsRNA 올리고뉴클레오타이드 분자를 설계하여 다음 식물 각각에 대해 EPSPS를 암호화하는 RNA를 표적화한다: 돼지풀[ragweed(암브로시아 아르테미스티이폴리아(Ambrosia artemisⅱfolia)], 거대 돼지풀[암브로시아 트리피다(Ambrosia trifida)], 존슨그래스[소르굼 할레펜세(Sorghum halepense)], 헤어리 플레아반(hairy fleabane)[콘지아 보나리엔시스(Conzya bonariensis)], 소우어그래스(sourgrass)[디기타리아 인술라리스(Digitaria insularis)], 리버시드글래스(liverseedgrass)[우로크로아 파니코이데스(Urochloa panicoides)], 등대풀속(euphorbia)[유포르비아 헤테로필라(Euphorbia heterophylla)], 포아풀(junglerice)[에쉬노클로아 콜로나(Echinochloa colona)], 명아주[체노포디움 알붐(Chenopodium album)], 강아지풀[세타리아 비리디스(Setaria viridis)], 조[세타리아 이탈릭(Setaria italic)], 돌피(barnyard grass)[에치노클로아 크루스-갈리(Echinochloa crus - galli)], 바랭이[디기타리아 산구이날리스(Digitaria sanguinalis)], 우엉[크산티움 스트루마리움(Xanthium strumarium)], 블랙그래스(blackgrass)[알로페쿠루스 마이오수로이데스(Alopecurus myosuroides)], 야생형 귀리[아베나 파투아(Avena fatua)], 시클포드(sicklepod)[센나 오브투시폴리아(Senna obtusifolia)], 나팔꽃[인포모에아 아종(Ipomoea sp.)], 서양메꽃[콘볼불루스 아르벤시스(Convolvulus arvensis)], 샤터칸(shattercane)[소르굼 비콜로르(Sorghum bicolor)], 자주달개비(dayflower)[콤멜리나(Commelina)], 자주달개비(Spiderwort)[트라데스칸티아 아종(Tradescantia sp.)], 독보리[롤리움 아종(Lolium sp.)], 갈퀴덩굴[엘레우신 인디카(Eleusine indica)], 쥐꼬리망초[콘지아 카나덴시스(Conzya canadensis)], 질경이(buckhorn plantain)[플란타고 란세올라타(Plantago lanceolata)], 명아주(pigweed)[아마란투스 팔머리(Amaranthus palmeri)], 거친-과일 아마란쓰(rough-fruit amaranth)[아마란투스 투베르쿨라투스(Amaranthus tuberculatus)], 텀블 명아주(tumble pigweed)[아마란투스 알부스(Amaranthus albus)], 부드러운 명아주(smooth pigweed)[아마란투스 하이브리두스(Amaranthus hybridus)], 레드루트 명아주(redroot pigweed)[아마란투스 레트로플렉수스(Amaranthus retroflexus)], 워터헴프[아마란투스 루디스/투베르쿨라투스(Amaranthus rudis / tuberculatus)], 슬렌더 아마란쓰(slender amaranth)[아마란투스 비리디스(Amaranthus viridis)], 툰베르그 아마란쓰(Thunberg's amaranth)[아마란투스 툼베르기이(Amaranthus thumbergⅱ)], 스피니 아마란쓰(spiny amaranth)[아마란투스 스피노시스(Amaranthus spinosis)], [아마란투스 루브라(Amaranthus rubra)], [아마란투스 리비두스(Amaranthus lividus)], 메디테라네안 아마란쓰(Mediterranean amaranth)[아마란투스 그라에시잔스(Amaranthus graecizans)], 거친 아마란쓰(rough amaranth)[아마란투스 클로로스타키스(Amaranthus chlorostachys)], 포웰 아마란쓰(Powell amaranth)[아마란투스 포웰리이(Amaranthus powellⅱ)], 마트 아마란쓰(Mat amaranth)[아마란투스 브리토이데스(Amaranthus blitoides)], 댑싸리[콜치아 스코파리아(Kochia scoparia)], 옐로우 수레국화속(Yellow starthistle)[센타우레아 솔스티티알리스(Centaurea solstitialis)], 및 벨벳리프(Velvetleaf)[아부틸론 테오프라스티(Abutilon theophrasti)]. 식물 잎은 실시예 1에서와 같이 제조한 표면활성제 용액으로 예비처리하고 식물당 약 1 나노몰의 처리로 dsRNA 용액으로 처리한다. 15일 후 처리된 식물이 사멸되거나, 죽어가거나 발육저지된다.
실시예 6
당해 실시예는 제초제로서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자의 유용성을 설명한다. dsRNA 올리고뉴클레오타이드 분자를 설계하여 실시예 5에 나열된 식물 각각에 대해 아세토락테이트 신타제 및 파이토엔 데사투라제를 암호화하는 RNA를 표적화한다. 식물 잎을 실시예 1에서와 같이 제조한 표면활성제 용액으로 예비처리하고 dsRNA 용액을 식물당 약 1 나노몰의 처리로 처리하였다. 15일 후 처리된 식물은 사멸하거나, 죽어가거나 발육정지된다.
실시예 7
당해 실시예는 제초제로서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자의 유용성을 설명한다. 실시예 4의 방법을 반복하여 팔머 아마란쓰에서 다음 단백질 각각을 암호화하는 RNA를 표적화하도록 설계된 짧은 dsRNA 올리고뉴클레오타이드를 제공한다: 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS), 아세틸-보조효소 A 카복실라제, 디하이드로프테로에이트 신타제, 프로토포르피린 IX 옥시게나제, 하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제, 글루타민 신타제, D1 단백질, 해독 개시 인자(TIF), 리불로즈-1,5-비스포스페이트 카복실라제 옥시게나제 (RuBisCO), 및 DNA-의존성 ATPase(ddATPase). 별도의 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물의 잎을 실시예 1에서와 같이 제조한 표면활성제 용액 및 별도로 dsRNA 올리고뉴클레오타이드 분자 각각을 실시예 1의 방식으로 식물당 1 나노몰의 dsRNA의 처리로 처리하였다. 30일 후 처리된 식물은 사멸하거나, 죽어가거나 발육정지된다.
실시예 8
당해 실시예는 본 발명의 조성물 및 방법에서 합성 Pol Ⅲ 유전자를 사용하는 유용성을 설명한다. 서열 번호: 3 및 도 2를 참조하여, 합성 Pol Ⅲ 유전자를 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) U6 snRNA 유전자로부터의 성분을 사용하여 생성시킴으로써 RGCCCR 성분의 2개 카피(굵은 활자체 및 밑줄), 서열 "TCCCACATCG"(서열 번호: 4, 굵은 활자체 및 밑줄), TATA 박스(굵은 활자체 및 밑줄), "G" 뉴클레오타이드(굵은 활자체 및 밑줄), 유전자이식 옥수수 식물내에서 발현시 글리포세이트 제초제에 대해 저항성을 부여하는 EPSPS 단백질(참조: 미국 특허 제RE39,247호)을 암호화하는 세균 DNA에 상응하는 안티-센스 DNA(이탤릭체), 안티-센스 DNA 내에 봉매된(embedded) "AAGATTAGCACGG" 성분(서열 번호: 5, 굵은 활자체 및 밑줄), "ACGCATAAAAT" 성분(서열 번호: 6, 굵은 활자체 및 밑줄)에 이어 센스 DNA(하부 경우) 및 "TTTTTT" 종결인자 성분(서열 번호: 7, 굵은 활자체 및 밑줄)을 갖는 dsDNA 분자를 제공한다. 0.1 중량%의 Silwet L-77 상표명 오가노실리콘 표면활성제 및 dsDNA 분자의 다수 카피의 용액을 글리포세이트 내성 대두 식물의 현지에서 성장하는 자원 글리포세이트 내성 옥수수 식물의 잎 위에 분무한 후 7일 째에, Roundup WeatherMAX? 상표명 글리포세이트 제초제로 처리한다. 15일 후, 옥수수 식물은 사멸하고 대두 식물은 무성하며; 표면활성제와 글리포세이트 제초제만으로 처리된 대조군 글리포세이트 내성 옥수수 식물은 무성하다.
실시예 9
당해 실시예는 본 발명의 하기의 양태를 설명한다. 당해 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드 분자를 식물 조직에 적용하고 침투시킴으로써 전신계적 조절, 즉, 표적 유전자(내인성 EPSPS)의 사일런싱을 유도하였다. 보다 구체적으로, 단일가닥 DNA (ssDNA) 올리고뉴클레오타이드을 포함하는 조성물은 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰(아마란투스 팔머리)에서 내인성 EPSPS의 발현을 억제하였다.
안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드를 IDT SciTools 소프트웨어(idtdna.com/Scitools/Applications/Anti-센스/Anti-센스.aspx에서 시판)를 사용하여 설계하였다. 올리고뉴클레오타이드는 표 1에 나타낸 바와 같이, 아마란투스 팔머리 EPSPS(서열 번호: 8, 9, 10, 및 11)에 대한 4개의 ssDNA 올리고뉴클레오타이드 안티-센스, 아마란투스 팔머리 EPSPS에 대한 2개의 화학적으로 변형된(포스포로티오에이트 변형된) ssDNA 올리고뉴클레오타이드 안티-센스(서열 번호: 12 및 13), 대조군 유전자에 대한 대조군 ssDNA 올리고뉴클레오타이드 안티-센스, 보리(호르데운 불가레) 종자 단백질, 진뱅크(GenBank) 확인번호 X97636 (서열 번호: 14), 및 아마란투스 팔머리 EPSPS(서열 번호: 15)에 대한 화학적으로 변형된 (Alexa Fluor 488로 5'-표지됨(제조원: Invitrogen)) ssDNA 올리고뉴클레오타이드 안티-센스를 포함하였다.
Figure pct00001
올리고뉴클레오타이드 흡수는 형광적으로 표지된 ssDNA 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호: 15)로 입증하였으며 ssDNA 올리고뉴클레오타이드가 잎 조직을 침투하였음을 입증하였다. 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰의 탈착된 잎의 잎꼭지를 형광적으로 표지된 ssDNA 올리고뉴클레오타이드(서열 번호: 15)가 들어있는 200mM 슈크로즈 용액 속에 두었다. 잎 영상을 488 nm 레이저가 장착된 Bio-Rad PharosFX 영상기로 잎꼭지를 통한 흡수 후 4시간 부터 48시간 까지 취하였다. 형광적으로 표지된 ssDNA 올리고뉴클레오타이드의 약간의 시간-의존성 혈관 흡수가 관찰되었다(참조: 도 6). 형광적으로 표지된 ssDNA 올리고뉴클레오타이드는 처리 후 8시간으로 빨리 혈관 조직으로부터 세포내로 방출되었으며 24시간 및 48시간째 잎 가장자리에 축적되는 것으로 관찰되었으며, 이는 증산 효과를 제시한다.
EPSPS 억제는 잎꼭지 흡수 기술을 사용하여 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰의 탈착된 잎으로 입증하였다. 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰의 탈착된 잎의 잎 꼭지를 표 2에 나열된 처리에 따라 올리고뉴클레오타이드가 들어있는 200 mM 슈크로즈 용액 속에 두었다. 대조군 잎을 안티-센스 대조군(서열 번호: 14)으로 침투시키고, 50 마이크로그람/mL 글리포세이트의 존재 또는 부재하에 추가로 처리하였다. EPSPS mRNA, EPSPS 단백질, 및 시키메이트 수준을 48시간 항온처리 후 측정하였다. EPSPS mRNA에서 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 전체 잎 RNA를 분리하고 정량적 실시간 RT-PCR을 수행하여 EPSPS mRNA 수준을 비교하였다. EPSPS 단백질에 대한 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 전체 잎 가용성 단백질을 분리하고, SDS-PAGE로 분리하고, EPSPS 단백질 수준을 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 옥수수 EPSPS_TIPA에 대한 항체를 사용하여 측정하였다. EPSPS의 억제의 지표로서 시키메이트 축적에 대한 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드의 효과를 2개 시험으로 평가하였다: 실험 1에서, 올리고뉴클레오타이드 처리된 잎을 50 마이크로그람/mL의 글리포세이트와 함께 추가로 48시간 동안 잎꼭지 흡수(대조군 잎은 안티-센스 대조군(서열 번호: 14)으로 침투시켰고, 추가로 50 마이크로그람/mL 글리포세이트의 존재 또는 부재하에 처리하였다)에 의해 항온처리하였으며; 실험 2에서, 잎 디스크 검정을 올리고뉴클레오타이드 처리된 잎에서 수행하고, 시키메이트 수준을 HPLC(당해 경우에 대조군은 올리고뉴클레오타이드로 처리되지 않았지만 50 마이크로그람/mL의 글리포세이트와 함께 항온처리되었다)로 측정하였다.
Figure pct00002
EPSPS mRNA 발현, EPSPS 단백질 수준, 및 시키메이트 수준에 대한 결과를 도 7, 8, 및 9에 각각 나타낸다. 이들 결과는, 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리가 식물 조직내 표적 유전자 전사체(EPSPS mRNA) 또는 표적 유전자에 의해 암호화된 단백질 (EPSPS)의 수준을 가소시킴에 의해 표적 유전자를 전신계적으로 조절하거나 억제함을 입증한다. 당해 특수 실험에서, 처리 #1 및 #6는 EPSPS mRNA 및 단백질의 수준을 억제하고 시키메이트의 증가된 축적에 의해 입증되는 바와 같이 글리포세이트 효능을 증가시키는데 보다 효과적인 것으로 나타난다. 이들 결과는 또한, 글리포세이트 효능이 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰에서 EPSPS mRNA 및 단백질을 억제함으로써 개선됨을 나타낸다.
실시예 10
당해 실시예는 본 발명의 하기의 양태를 설명한다. 당해 실시예에서, 성장하는 식물은 (a) 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝용 제제 및 (b) 표적 유전자의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 안티-센스 또는 센스 배향으로 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물내에서 표적 유전자의 전신계 사일런싱을 유도하기 위한 국소 적용된 조성물로 처리하였다. 보다 구체적으로, 담배(니코티아나 벤타미아나) 식물을 (a) 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝용의 국소 적용된 표면활성제 용액 및 (b) 표적 유전자의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 안티-센스 또는 센스 배향으로 포함하는 적어도 하나의 쇄를 갖는 국소 적용된 DNA 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물로 처리함으로써, 표적 유전자(파이토엔 데사투라제, "PDS")의 전신계적 조절 또는 억제를 수행한다.
사용된 표적 유전자는 도 10에 나타낸 니코티아나 벤타미아나 파이토엔 데사투라제(서열 번호: 2); 서열 번호: 2의 뉴클레오타이드 421 내지 1120번으로 이루어진 분절(도 10에서 밑줄친 내용)을 사용하여 700-머 dsRNA 폴리뉴클레오타이드("PDS 700-머") 및 서열 번호: 2의 뉴클레오타이드 914 내지 1113(도 10에서 굵은 활자체와 밑줄친 내용)을 사용하여 200-머 dsRNA 폴리뉴클레오타이드("PDS 200-머")를 설계하였다. 처리시 사용된 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 서열은 표 3에 나열한다. 도 11은 파이토엔 신타제 (서열 번호: 2) 서열과 관련하여 이들 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 위치를 개략적으로 묘사한다. 옥수수 외잎버레(corn rootworm)로부터 수득한 비-식물 서열("CRW"), 서열 번호: 27, 28, 29, 및 30을 비-동종 대조군으로 사용하였다. 폴리뉴클레오타이드 중 일부는 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제에 의해 인식된 T7 프로모터인 T7 프로모터 서열(표 3에서 하부-경우 내용으로 나타냄)을 포함하였다.
Figure pct00003
다음 과정을 본 실시예에 기술된 모든 검정에 대해 사용하였다. 4주된 니코티아나 벤타미아나 식물을 모든 검정에서 사용하였다. 식물을 ddH2O를 사용하여 새로이 제조한 0.1% Silwet L-77 용액으로 처리하였다. 식물(단자엽, 1개의 본엽)당 2개의 완전히 확장된 잎을 Silwet L-77 용액 내로 수초 동안 침지시키고 15 내지 30분 동안 건조시킨 후 폴리뉴클레오타이드 조성물에 적용시켰다. 각각의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 대한 최종 농도는 달리 기술하지 않는 한, 25 마이크로M(0.01% Silwet L-77중, 5 mM 인산나트륨 완충액, pH 6.8)이었다. 20 마이크로리터의 용액을 2개의 예비 처리된 잎 각각의 상부 표면에 적용하여 총 40 마이크로리터(1 nmol 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)를 각각의 식물에 제공하였다. 잎 표백이 처리 3일 후에 관측되었다.
도 12a는, "PDS 200-머" 분절(서열 번호: 2의 뉴클레오타이드 914 내지 1113번)에 상응하는 RNA 서열을 지닌 200-머 dsRNA 폴리뉴클레오타이드 및 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드 (서열 번호: 16, 17, 20, 21, 24, 25, 및 26)의 조합을 별도로 담배 식물에 적용하였다. 200-머 dsRNA 폴리뉴클레오타이드를 0.6 마이크로M의 농도에서 적용하였다. 정단 잎의 표백은 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드로 국소 처리한 후 관찰되었으며, 표적 파이토엔 데사투라제 유전자의 전신계적 조절 또는 억제를 나타낸다.
도 12b는 완충액(대조군), 200-머 dsRNA 폴리뉴클레오타이드, 및 ssDNA 올리고뉴클레오타이드로 처리한 니코티아나 벤타미아나 식물로부터 분리된 RNA의 노던 블롯 분석의 결과를 나타낸다. 또한, 4℃에서 유지시키고 200-머 dsRNA 폴리뉴클레오타이드로 처리하기 전 암실에서 밤새 유지시킴으로써 스트레스를 제공받은 식물로부터 분리한 RNA를 나타낸다.
도 13은 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 12개 조합물로부터의 효과의 다른 검정에서 처리 후 12일째 관측된 표현형을 나타낸다(참조: 표 4). 표 4는 또한 처리후 5일째에 식물의 가시적인 표백의 관찰 및 처리 후 7 및 12일째에 취한 클로로필 측정 결과를 나열한다. 클로로필 측정은 표적 유전자 파이토엔 데사투라제의 억제의 지표이며, 측정은 가시적으로 표백된 잎 또는 (가시적인 표백이 없는 식물에서) 식물의 동일한 위치의 잎에 중점을 둔 정단 부위에서 6개 점에서 수행하였다; 보다 낮은 클로로필 측정 값은 파이토엔 데사투라제의 억제를 나타낸다. 당해 결과는, 처리 2, 3, 4, 8, 및 11에서 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 조합물이 처리된 식물에서 표적 유전자를 전신계적으로 조절(억제)하는데 효과적이었음을 나타내며; 처리 1은 또한 표적 유전자의 전신계적 조절(억제)를 보다 적은 정도로 수행하였다. 200-머 dsRNA 폴리뉴클레오타이드는 또한 처리된 식물에서 표적 유전자를 전신계적으로 조절(억제)하는데 효과적이었다. 비-동종(옥수수 외잎벌레) 유전자로부터의 올리고뉴클레오타이드(처리 5 및 6)는 표적 파이토엔 데사투라제 유전자를 억제하지 않았다. 당해 결과는, 센스 및 안티-센스 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 둘다가 처리된 식물에서 표적 유전자를 전신게적으로 조절(억제)하는데 효과적이었음을 입증한다. 특수 실시예에서, T7 프로모터(처리 1)를 지닌 센스 올리고뉴클레오타이드는 파이토엔 데사투라제 유전자의 약한 전신계적 억제를 수행한 반면, T7 프로모터의 부재하에서의 센스 올리고뉴클레오타이드(처리 7)는 파이토엔 데사투라제 유전자를 억제하지 않았다. 당해 특수 실시예에서, T7 프로모터를 지닌 안티-센스 올리고뉴클레오타이드(처리 2) 및 또한 T7 프로모터가 부재한 안티-센스 올리고뉴클레오타이드(처리 8) 둘다는 강력한 표백을 제공하였으며, 이는 표적 파이토엔 데사투라제 유전자의 강력한 전신계적 조절을 나타낸다.
Figure pct00004
표 5는 6개의 폴리뉴클레오타이드: "PDS 700-머"의 5'-최대 40개 뉴클레오타이드(서열 번호: 2의 뉴클레오타이드 1081 내지 1120번), 및 "PDS 40-머 센스 ssDNA" 서열(서열 번호: 31)를 기준으로 합성된 4개의 안티-센스 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드 및 하나의 센스 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 40-머 분절("PDS 40-머 센스 ssDNA", 서열 번호: 31)을 나타낸다. 도 14는 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드로 담배 식물의 국소 처리 결과를 나타낸다. 정단 잎의 강력한 표백은, 표적 유전자 파이토엔 데사투라제의 전신계적 조절 또는 억제가 PDS 21-머 안티-센스 ssDNA 및 PDS 33-머 안티-센스 ssDNA의 국소 처리 후, 및 또한 PCR-증폭되고 컬럼-정제된 700-머 dsRNA 폴리뉴클레오타이드 ("PDS 700-머 dsRNA"), T7 프로모터를 지닌 앞서 검정된 PDS 안티-센스 22-머 올리고뉴클레오타이드(서열 번호: 20 및 21)("PDS T7 안티-센스"), 또는 앞서 검정된 T7 프로모터를 지닌 PDS 안티-센스 22-머 올리고뉴클레오타이드(서열 번호: 22 및 23)("PDS 안티-센스")를 사용한 국소 처리 후 관찰되었음을 나타낸다. 정단 잎의 거의 없거나 가시적이지 않은 표백이 완충액("완충액") 만을 사용한 국소 처리 후, 또는 열-변성된(95℃에서 5분에 이어, 빙상에 저장) 700-머 dsRNA 폴리뉴클레오타이드("PDS 700-머 dsRNA 가열됨"), PDS 15-머 안티-센스 ssDNA, 또는 PDS 18-머 안티-센스 ssDNA를 사용한 국소 처리 후 관찰되었다.
Figure pct00005
다른 검정의 결과를 도 15에 나타내며, 정단 잎의 강력한 표백은, 표적 유전자 파이토엔 데사투라제의 전신계적 조절 또는 억제가, PDS 21-머 안티-센스 ssDNA (서열 번호: 34, "21nt PDS 안티-센스") 또는 앞서 검정된 T7 프로모터가 부재한 PDS 안티-센스 22-머 올리고뉴클레오타이드(서열 번호: 22 및 23)("PDS 안티-센스")를 사용한 국소 처리 후 관측되었음을 나타낸다. 정단 잎의 거의 없거나 가시적이지 않은 표백이 완충액("대조군: 완충액") 만을 사용한 국소 처리 후, 또는 PDS 21-머 센스 ssDNA(서열 번호: 36, "21nt PDS 센스")를 사용한 국소 처리 후 관측되었다.
실시예 11
당해 실시예는 (a) 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝을 위한 제제 및 (b) 표적 유전자의 18개 이상의 연속 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 안티-센스 또는 센스 배향으로 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물에서 표적 유전자의 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 국소 적용된 조성물을 사용한 성장하는 식물의 처리를 설명한다. 보다 구체적으로, 당해 실시예는 폴리뉴클레오타이드의 표적 특이성(서열 특이성)을 입증한다.
팔머 아마란쓰 파이토엔 데사투라제 (PDS)는 서열 TCAATTTCATCTATTGGAAGTGATTTTTTGGGTCATTCTGTGAGAAATTTCAGTGTTAGTAAAGTTTATGGAGCAAAGCAAAGAAATGGGCACTGCCCTTTAAAGGTTGTTTGTATAGATTATCCTAGGCCAGAGCTTGAAAGTACATCCAATTTCTTGGAAGCCGCCTACTTATCTTCTACTTTTCGGAATTCGCCTCGTCCTCAGAAGCCATTAGAAGTTGTAATTGCTGGAGCAGGTTTGGCTGGTCTATCCACGGCAAAGTATTTAGCTGATGCAGGTCACAAACCCATATTGTTGGAAGCACGAGATGTTTTAGGAGGAAAGGTTGCAGCGTGGAAGGATGAGGATGGTGACTGGTATGAGACTGGGCTACATATATTCTTTGGGGCATATCCAAATGTCCAAAATCTATTTGGAGAACTTGGTATAAATGACCGACTGCAATGGAAGGAGCACTCTATGATTTTTGCAATGCCCAGCAAGCCCGGTGAATTCAGTCGCTTTGATTTTCCCGAAATCCTGCCTGCACCATTAAATGGCATATGGGCAATCCTAAGAAATAATGAAATGCTAACCTGGCCAGAAAAAATCAAGTTTGCCATTGGCTTGTTGCCTGCTATGGCAGGCGGACAGTCATATGTTGAAGCACAAGATGGTTTGAGTGTCCAAGAGTGGATGAGAAAACAAGGAGTACCCGATCGTGTAACTGATGATGTGTTTATTGCCATGTCAAAGGCACTGAACTTCATAAATCCCGATGAACTTTCAATGCAGTGCATCTTGATTGCTCTGA ACCGATTCCTGCAGGAGAAACATGGTTCTAAGATGGCCTTCCTAGACGGAAACCCTCCAGAGAGGCTGTGCATGCCTATTGTTAAACACATCGAGTCACTAGGTGGTGAAGTTAAACTTAACTCTCGTATACAAAAGATTCAGTTGGACCAGAGTGGAAGCGTGAAGAGTTTTTTGCTAAATAACGGGAGGGAAATAC GAGGAGATGCCTATGTTTTTGCCACCCCAGTTGACATCTTGAAGCTGTTACTACCTGATACTTGGAAGGAAATCTCATACTTCAAAAAACTTGAGAAATTAGTGGGCGTTCCTGTGATTAATGTTCACATATGGTTTGACAGAAAATTAAAGAATACATATGACCATCTACTCTTCAGCAGGAGTCCTCTTTTGAGTGTCTATGCTGATATGTCGGAGACATGCAAGGAATATAAGGATCCAAATAGATCCATGCTGGAATTGGTTTTTGCACCCGCGGAGGAATGGATTTCACGAAGCGACACTGATATTATAGAGGCAACAATGAAAGAGCTTGCCAAGCTTTTCCCGGATGAAATCGCTGCCGATGGAAGCAAGGCCAAGATCCTCAAATATCATGTCGTCAAAACTCCAAGGTCGGTTTATAAGACTGTACCGGATTGTGAACCTTGTCGGCCGCTGCAAAGATCACCAATAGAGGGTTTCTATTTAGCTGGTGATTACACAAAACAAAAATATTTGGCTTCTATGGAAGGTGCTGTCTTATCTGGGAAGCTTTGTGCACAGGCTATCGTACAGGATTATGATCTGCTGAGTTCTCGAGCACAAAGAGAATTGGCG (서열 번호: 37)을 갖는다. 서열 번호: 37에서 317 내지 994번 위치(밑줄친 내용으로 나타냄)에서 뉴클레오타이드에 의해 암호화된 RNA에 하이브리드화할 수 있는 안티-센스 쇄를 지닌 678개 염기쌍 dsRNA 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호: 37에서 797 내지 994번 위치(이탤릭체 및 밑줄친 내용으로 나타냄)에서 뉴클레오타이드에 의해 암호화된 RNA에 하이브리드화할 수 있는 안티-센스 쇄를 갖는 198개 염기쌍 dsRNA 폴리뉴클레오타이드를 합성하였다.
니코티아나 벤타미아나 파이토엔 데사투라제는 서열 ATGCCCCAAATCGGACTTGTATCTGCTGTTAATTTGAGAGTCCAAGGTAATTCAGCTTATCTTTGGAGCTCGAGGTCTTCGTTGGGAACTGAAAGTCAAGATGTTTGCTTGCAAAGGAATTTGTTATGTTTTGGTAGTAGCGACTCCATGGGGCATAAGTTAAGGATTCGTACTCCAAGTGCCACGACCCGAAGATTGACAAAGGACTTTAATCCTTTAAAGGTAGTCTGCATTGATTATCCAAGACCAGAGCTAGACAATACAGTTAACTATTTGGAGGCGGCGTTATTATCATCATCGTTTCGTACTTCCTCACGCCCAACTAAACCATTGGAGATTGTTATTGCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCTACAGCAAAATATCTGGCAGATGCTGGTCACAAACCGATATTGCTGGAGGCAAGAGATGTCCTAGGTGGGAAGGTAGCTGCATGGAAAGATGATGATGGAGATTGGTACGAGACTGGGTTGCACATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATGCAGAACCTGTTTGGAGAACTAGGGATTGATGATCGGTTGCAGTGGAAGGAACATTCAATGATATTTGCGATGCCTAACAAGCCAGGGGAGTTCAGCCGCTTTGATTTTCCTGAAGCTCTTCCTGCGCCATTAAATGGAATTTTGGCCATACTAAAGAACAACGAAATGCTTACGTGGCCCGAGAAAGTCAAATTTGCTATTGGACTCTTGCCAGCAATGCTTGGAGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGACGGTTTAAGTGTTAAGGACTGGATGAGAAAGCAAGGTGTGCCTGATAGGGTGACAGATGAGGTGTTCATTGCCATGTCAAAGGCACTTAACTTCATAAACCCTGACGAGCTTTCGATGCAGTGCATTTTGATTGCTTTGA ACAGATTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAACCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCGATTGTGGAACATATTGAGTCAAAAGGTGGCCAAGTCAGACTAAACTCACGAATAAAAAAGATCGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAATGTTTTATACTGAATAATGGCAGTA CAATTAAAGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCACTCCAGTGGATATCTTGAAGCTTCTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATCCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGCTAGTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCCATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAGAACACATCTGATAATCTGCTCTTCAGCAGAAGCCCGTTGCTCAGTGTGTACGCTGACATGTCTGTTACATGTAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTATTTGCACCCGCAGAAGAGTGGATAAATCGTAGTGACTCAGAAATTATTGATGCTACAATGAAGGAACTAGCGAAGCTTTTCCCTGATGAAATTTCGGCAGATCAGAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTATCATGTTGTCAAAACCCCAAGGTCTGTTTATAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCCTTGCAAAGATCCCCTATAGAGGGTTTTTATTTAGCTGGTGACTACACGAAACAGAAGTACTTGGCTTCAATGGAAGGTGCTGTCTTATCAGGAAAGCTTTGTGCACAAGCTATTGTACAGGATTACGAGTTACTTCTTGGCCGGAGCCAGAAGATGTTGGCAGAAGCAAGCGTAGTTAGCATAGTGAACTAA (서열 번호: 38)을 갖는다. 서열 번호: 38에서 421 내지 1105번 위치(밑줄친 내용으로 나타냄)에서 뉴클레오타이드에 의해 암호화된 RNA에 하이브리드화할 수 있는 안티-센스 쇄를 갖는 685개 염기쌍 dsRNA 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호: 38에서 914 내지 1105번 위치(이탤릭체 및 밑줄친 내용으로 나타냄)번에서 뉴클레오타이드에 의해 암호화된 RNA에 하이브리드화할 수 있는 안티-센스 쇄를 갖는 192개 염기쌍 dsRNA 폴리뉴클레오타이드를 합성하였다.
팔머 아마란쓰 및 니코티아나 벤타미아나 PDS DNA 서열의 정렬을 전반적인 쌍 방식의 정렬(stretcher)을 사용하여 수행하고 도 16에 설명하며; 당해 방법에서 2개 서열은 약 71% 동질성(1252/1762)을 나타내었다.
EPSPS의 16개 카피를 갖고 높이가 5 내지 8인치인 팔머 아마란쓰 식물에 ddH2O를 사용하여 새로이 제조한 0.1% Silwet L-77 용액으로 처리하였다. 식물당 4개의 완전히 확장된 잎을 Silwet L-77 용액 내로 수초 동안 침지시키고, 30분 내지 1시간 동안 건조시킨 후 폴리뉴클레오타이드 조성물을 적용시켰다. 개개의 올리고뉴클레오타이드 용액은 678bp 팔머 PDS dsRNA, 198 bp 팔머 PDS dsRNA, 685 bp 니코티아나 벤타미아나 PDS dsRNA, 및 192 bp 니코티아나 벤타미아나 PDS dsRNA(0.01% Silwet L-77, 5 mM 인산나트륨 완충액, pH 6.8 중의 0.6 마이크로몰 폴리뉴클레오타이드) 각각에 대해 제조하였다. 10 마이크로리터의 폴리뉴클레오타이드 용액(또는 대조군으로서 완충액)을 식물당 4개의 예비 처리된 잎 각각의 상부 표면에 적용시켜 각각의 식물당 총 40 마이크로리터를 제공하였다. 식물을 성장 체임버내에 유지시키고, 잎 표백을 처리 후 3일째에 관측하였다. 678 bp 팔머 PDS dsRNA 또는 198 bp 팔머 PDS dsRNA로 국소 처리한 식물은 잎의 표백(내인성 파이토엔 데사투라제의 사일런싱을 나타냄)을 나타내지만 685 bp 니코티아나 벤타미아나 PDS dsRNA 또는 192 bp 니코티아나 벤타미아나 PDS dsRNA로 처리한 팔머 아마란쓰 식물은 잎의 표백을 나타내지 않았다. 당해 서열 특이성은, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 방법이 특이적인 표적 유전자 서열을 갖는 제공된 종 또는 탁손의 선택적인 조절, 예를 들면, 동일한 제초제에 대해 내성인 작물의 현지에서 성장하는 제초제 내성 자생 식물을 방제하는데 있어 유용함을 입증한다.
별도의 검정에서, 678 bp 팔머 PDS dsRNA(표지된 "700nt dsRNA PDS") 또는 198 bp 팔머 PDS dsRNA(표지된 "200 nt dsRNA PDS")로 국소 처리한 팔머 아마란쓰 식물은 잎의 표백(내인성 파이토엔 데사투라제의 사일런싱을 나타냄)을 나타내었으나 무척추동물 유전자(표지된 "260 nt dsRNA DV49", 옥수수 뿌리 잎벌레 디아브로티카 비르기페라로부터 기원)의 260개 염기쌍 dsRNA로 국소 처리한 팔머 아마란쓰 식물은 표백 표현형을 생성하지 않았으며, 이는 내인성 파이토엔 데사투라제의 사일런싱이 없음을 나타낸다(도 17). 당해 서열 특이성은, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 방법이 제공된 종 또는 탁손의 선택적인 방제에 유용함을 입증한다.
실시예 12
당해 실시예는 표적 유전자의 18개 이상의 연속 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 안티-센스 또는 센스 배향으로 포함함으로써 식물에서 표적 유전자의 전신계적 사일런싱을 유도하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 국소 적용된 조성물의 용도를 기술한다. 보다 구체적으로 당해 실시예는 잎, 줄기 및 꽃을 포함하는 상이한 식물 기관에서 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 파이토엔 데사투라제 (PDS) 올리고뉴클레오타이드를 사용한 단일 처리를 사용하여 입증한다.
4주된 담배(니코티아나 벤타미아나) 식물을 모든 처리에서 사용하였다. 2개의 완전히 확장된 잎(단자엽, 하나의 본엽)을 새로이 제조된 표면활성제 용액 (이중-증류수 중 0.1% Silwet L-77)내로 수초 동안 침지시켜 컨디셔닝하고 15 내지 30분 동안 건조하도록 하였다. 니코티아나 벤타미아나 파이토엔 데사투라제(서열 번호: 2)의 1099 내지 1120번 위치의 뉴클레오타이드에 상응하는 서열 GGCAGTACAATTAAAGGAGATG (서열 번호: 39)를 갖는 20 마이크로리터의 단일가닥 DNA (ssDNA) 22-머 올리고뉴클레오타이드(서열 번호: 2)를 5 밀리몰 인산나트륨 완충액, pH 6.8 중 0.01% Silwet L-77 중 25 마이크로몰 용액으로서 식물당 총 40 마이크로리터(1 나노몰 올리고뉴클레오타이드)에 대해 각각의 컨디셔닝된 잎의 상부 표면에 적용하였다. 대조군 식물을 DNA 올리고뉴클레오타이드의 부재하에 Silwet 용액으로 처리하였다. 식물을 처리 후 3일째에 표백에 대해 관찰하였다. ssDNA 올리고뉴클레오타이드로 처리한 식물의 정단 잎, 줄기 및 꽃 모두는 PDS의 전신계적 사일런싱을 나타내는 표백을 나타내었다(도 18a).
대조군 및 ssDNA 처리된 식물 둘다의 꽃을 종자가 맺도록 하였다. 종자를 성숙한 과일로부터 수집하고, 칭량하고, 싹이 트도록 하였다. 종자 중량은 동일하였으며(100개 종자당 약 11 mg) 종자 형태학은 ssDNA 처리된 식물과 대조군 식물 사이에서 유사하게 나타났다. 과일당 생산된 종자의 감소량 및 발아율에 있어서의 감소(100개 종자중 4개가 발아됨)가 과일당 종자의 양 및 대조군 식물로부터의 종자의 발아율(발아된 100개의 종자 중 95개)과 비교하여 ssDNA 처리된 식물로부터의 종자에서 관찰되었다.
유사한 과정을 사용하는 별도의 검정에서, 담배 식물을 이중-증류수 중 0.1% Silwet L-77 속에 침지시켜 컨디셔닝하고 15 내지 30분 동안 건조되도록 하고, 5 밀리몰 인산나트륨 완충액, pH 6.8 중 0.01% Silwet L-77 중 25 마이크로몰 용액으로 적용된 PDS ssDNA 22-머 (서열 번호: 39)로 식물당 총 40 마이크로리터(1 나노몰 올리고뉴클레오타이드)에 대해 각각의 컨디셔닝된 잎의 상부 표면에 처리하였다. 다른 식물은 표면활성제 처리로 컨디셔닝되지 않았으나, 무침 주사기를 사용한 침윤(도 18b에 나타냄)에 의해 또는 잎 표면에 점적의 수동 적용(도 18b에 나타내지 않음), 및 5 밀리몰 인산나트륨, pH 6.8(표면활성제 부재) 중 0.01% Silwet L-77 중 25 마이크로몰 용액으로서 적용하였다. 음성 대조군 식물을 DNA 올리고뉴클레오타이드가 들어있지 않은 Silwet 완충액 용액으로 처리하였다. 결과는 도 18b에 묘사한다. PDS ssDNA(Silwet L-77 표면활성제 처리로 컨디셔닝하지 않음)를 단지 직접 적용하여 처리한 모든 식물은, 침윤에 의해 또는 점적의 수동 적용에 의해 적용한 것에 상관없이, 정단 잎, 줄기 및 꽃의 표백을 나타내었으며, 이는 PDS의 전신계적 사일런싱을 나타낸다.
실시예 13
당해 실시예는 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대해 식물의 컨디셔닝을 위한 제제의 용도를 포함하는 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 방법 및 국소 적용된 조성물을 설명한다. 보다 구체적으로, 당해 실시예는 제초제 내성 팔머 아마란쓰를 방제하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드이 용도를 기술한다.
낮은(30 미만) 카피 수의 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS)를 갖는 팔머 아마란쓰 식물은 EPSPS를 사일런싱시키도록 설계된 dsRNA를 사용한 처리에 이은 글리포세이트를 사용한 처리에 대해 민감성이다(참조: 실시예 1에서 세부사항). 그러나, 고 카피 수의 EPSPS(즉, 30개 이상의 카피의 EPSPS)를 갖는 팔머 아마란쓰 식물은 글리포세이트 처리에 대해 내성이며 잡초 내성 관리를 위한 챌린지이다. 예를 들면, 실시예 1에 기술된 것과 유사한 처리를 사용하지만 dsRNA의 투여량이 10-배 이하(즉, 식물당 실시예 1에 기술된 8 나노몰의 짧은 dsRNA)로 증가되거나 탈로우아민 표면활성제와 조합된 등록 글리포세이트 제형("Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제")가 사용된 경우, 글리포세이트 내성 고 카피 팔머 아마란쓰에서의 하나의 검정(결과를 나타내지 않음)에서, 글리포세이트 활성은 증진(식물 높이로 측정된 관측되는 식물 성장에 의해 평가됨)되었지만 내성 식물은 사멸되지 않았다.
3개의 상이한 글리포세이트 내성 고-카피 팔머 아마란쓰 주(복제물당 3개 식물)를 표 6에 나열된 처리 조건을 사용하여 dsRNA로 처리하였으며, 여기서 dsRNA 전달 비히클, 예비침투제 또는 컨디셔닝제, 및 단계들의 순서는 변하였다. 결과는 도 19에 묘사한다. "4X" 글리포세이트(즉, 헥타르당 840g 산 당량의 적용의 표준 율의 4배인 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 3360 g 산 당량으로 처리) 단독을 사용한 처리는 35-카피(실험 3) 또는 57-카피(실험 6)의 팔머 아마란쓰를 사멸시키지 않았다.
0.1% 탈로우아민 표면활성제 및 10% 글리세롤(실험 2)을 포함하는 수성 dsRNA 전달 비히클내 2% 황산암모늄을 포함하는 실험(1 내지 3, 표 6)의 하나의 세트에서 10배 투여량의 dsRNA에 이어 4X 글리포세이트 적용의 효능이 개선되었다. 10배 투여량의 dsRNA에 이은 글리포세이트 적용의 개선된 효능은, 황산암모늄을 탈로우아민 표면활성제의 부재하에 dsRNA 전달 비히클에 포함시킨 경우 관측되었다(실험 8).
실험(4 내지 6, 표 6)의 다른 세트에서, 황산암모늄을 함유하는 전달 비히클내 dsRNA를 적용하기 전 Silwet L-77 표면활성제를 적용하는 것은 효과적이었던 반면, 황산암모늄을 함유하는 dsRNA 전달 비히클내에서 Silwet L-77 표면활성제와 dsRNA의 조합은 효과적이지 않았다. 72시간째(실험 7)에 글리포세이트 ("Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제")의 적용은 dsRNA를 처리한 후 48시간 째(실험 2)에서 글리포세이트 적용보다 덜 효과적이었다.
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*글리포세이트(55:45의 비의 탈로우아민 (16-18C) 및 코코아민(12-14C)의 MON56151 탈로우아민 표면활성제 블렌드를 함유하는 캐리어 중의 660 g/L 글리포세이트 K+ 염을 함유하는 시판 제형 "Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제")를 사용된 양(여기서 1X = 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 840 g의 산 당량, 4X = 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 3360 g의 산 당량)으로 및 dsRNA의 적용 후 시간으로 나열한다.
실시예 14
본 실시예는 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대해 식물의 컨디셔닝용 제제를 사용함을 포함하는 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 방법 및 국소 적용된 조성물을 설명한다.
작은 RNA 서열분석을 통해 확인된 2개의 작은 RNA는 실시예 1에 기술된 바와 같이 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자로 처리한 팔머 아마란쓰 식물에서 풍부하며 유일한 것으로 밝혀졌다. 이들 2개의 작은 RNA 각각을 도 20에 나타낸 서열(서열 번호: 40)을 갖는 완전한 길이의 EPSPS의 743 내지 764 및 566 내지 585번 뉴클레오타이드 위치에 맵핑(mapping)하였다. 2개의 25개 뉴클레오타이드 길이의 "짧은" dsRNA 분자를 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자(밑줄침, 비-이탤릭체 내용) 및 3개의 "긴" 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드(실시예 1에 기술된 바와 같은 굵은 활자체 내용)을 또한 나타내는, 도 20에 나타낸 서열 번호: 40에서 이탤릭체의 밑줄친 뉴클레오타이드로 나타낸 바와 같이, 743 내지 767번("짧은 dsRNA-5") 및 564 내지 588번("짧은 dsRNA-6") 뉴클레오타이드 위치에서 팔머 아마란쓰 EPSPS 유전자로부터 전사된 mRNA에 하이브리드화할 수 있는 안티-센스 쇄를 사용하여 설계하였다.
4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자(실시예 1에서 기술된 바와 같음)의 혼합물의 적용에 이은 실시예 1에 기술된 처리 과정을 반복하는 글리포세이트의 적용으로 16개 카피의 EPSPS를 지닌 4개의 팔머 아마란쓰 식물 중 4개에서 사멸을 생성하였다. 동일한 처리 과정을 사용하지만 짧은 dsRNA-5 및 짧은 dsRNA-6를 함께 적용시키는 경우 4개의 팔머 아마란쓰 식물 중 어느 것도 사멸되지 않았다. 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자(실시예 1에서 기술됨)의 혼합물에 대한 짧은 dsRNA-5 및 짧은 dsRNA-6 중 어느 것 또는 둘다의 첨가로 4개의 팔머 아마란쓰 식물 중 4개가 사멸하였으며, 즉, 짧은 dsRNA-5 및 짧은 dsRNA-6의 길항 효과가 관측되었다.
실시예 15
본 실시예는 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝용 제제를 사용함을 포함하는 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 방법 및 국소 적용된 조성물을 설명한다. 보다 상세하게, 당해 실시예는 살리사이클산 및 폴리뉴클레오타이드의 용도를 기술한다.
살리사이클산(SA)은 담배에서 바이러스 내성을 유도한다; 참조, 예를 들면, Chivasa et al . (1997) Plant Cell , 19:547 - 557. 49개 또는 63개 카피의 EPSPS를 갖는 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물을 15 밀리몰 SA로 예비처리하였다. 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자(실시예 1에 기술됨)의 용액을 SA를 사용한 처리 후 1, 5 또는 24시간 째에 이어서 72시간 후에 글리포세이트(헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 1682 g의 당량)를 분무함으로써 적용하였다. dsRNAs 및 글리포세이트 활성(식물 높이로 측정된 식물 성장을 관찰하여 평가)의 효과의 개선은 글리포세이트 처리 후 7일 째에 SA 처리들 중 어느 것에 대해서도 관찰되지 않았다.
실시예 16
본 실시예는 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대해 식물의 컨디셔닝용 제제의 사용을 포함하는 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 방법 및 국소 적용된 조성물을 설명한다. 보다 상세하게, 당해 실시예는 폴리뉴클레오타이드 및 표면활성제 용액의 적용 순서 및 시기선택에 있어서의 변화를 기술한다.
당해 검정은 다음 단계를 포함하는 프로토콜을 사용하여, EPSPS의 고 카피 수(56, 63 또는 100개 카피)를 지닌 팔머 아마란쓰 식물에서 수행하였다: (1) 탈로우아민 표면활성제 및 글리세롤을 함유하는 용액 중 dsRNA(실시예 1에 기술된 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자의 용액)의 적용; (2) 1% Silwet L-77 실리콘 표면활성제의 적용; 및 (3) 글리포세이트(헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 1682 g의 당량)의 적용. 폴리뉴클레오타이드 적용 및 Silwet 적용의 시기선택의 간격을 dsRNA 용액의 적용 후 30분, 1시간 또는 2시간째에 적용한 Silwet 분무로 평가하였다. 당해 검정 세트에서, Silwet 용액 적용의 3개의 상이한 시간 모두는 유사한 결과, 즉, 탈로우아민 표면활성제 및 글리세롤 만을 함유하는 대조군 용액으로 처리한 고 카피 식물을 방제하는 것과 비교하여, dsRNA 용액으로 처리한 고 카피 식물중 대부분의 성장의 발육 정지를 생산하였다.
실시예 17
본 실시예는 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝용 제제의 사용을 포함하는 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 방법 및 국소 적용된 조성물을 설명한다. 보다 상세하게, 당해 실시예는 저-용적 분무 및 실리콘 표면활성제 및 황산암모늄의 사용에 의한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 적용을 기술한다.
2% 황산암모늄을 함유하는 용액 중의 dsRNA(실시예 1에서 기술한 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자의 용액)의 용액을 16개 카피의 EPSPS를 갖는 팔머 아마란쓰에 저-용적 분무에 이어서 글리포세이트(헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 1682 g의 산 당량)를 분무하여 적용시킴으로써, 팔머 아마란쓰 식물을 사멸시켰다.
처리당 6개의 팔머 아마란쓰 식물을 저-용적 분무를 사용하는 3단계 과정으로 처리하였다: (1) 1% Silwet L-77의 분무; (2) 실시예 1에 기술된 등량의 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자를 3회 투여량 중 하나(식물 당 1X 또는 0.8 나노몰, 식물당 2X 또는 1.6 나노몰, 또는 식물당 4X 또는 3.2 나노몰)로 분무; 및 (3) 글리포세이트(헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 1682 g의 산 당량)를 159리터/에이커(acre)의 비율로 분무. 글리포세이트 분무 후 9일째에, 4X(식물 당 3.2 나노몰) dsRNA를 분무한 모든 6개의 식물이 사멸하였고, 2X(식물 당 1.6 나노몰) dsRNA 또는 1X (식물 당 0.8 나노몰) dsRNA를 분무한 식물은 발육정지되었다(도 21a).
몇가지 검정을 현지-수집한 종자로부터 성장시킨 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰에서 수행하였다. 식물을 하기 기술한 각종 프로토콜로 처리하며, 일부 식물은 dsRNA 용액으로 국소 처리하고 대조군 식물은 완충액(dsRNA 비히클)로 처리하였으며; 적용은 저-용적 분무로 수행하였다. 달리 주목하기 않는 한, dsRNA 용액은 "4X" 투여량(식물당 3.2 나노몰)으로 완충액 속에 실시예 1에 기술된 등량의 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자를 함유하였고; 완충액은 디에틸피로카보네이트(DEPC) 물(제조원: Omega Bio-Tek) 속에 10밀리몰 인산나트륨 및 0.01 % (v/v) Silwet L-77 오가노실리콘 표면활성제로 이루어졌으며 pH 6.8로 조절되었고; 제초제는 159리터/에이커의 비율로 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 840 g의 산 당량에서 적용된 글리포세이트 제초제이었다. 결과는 표 7에 제공된다.
검정 1 및 2: 이들 검정은 공지된 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰가 서있는 농장 위치로부터의 토양 시료로부터 수득한 종자로부터 성장한 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰에서 수행하였다. 검정 1의 경우, 처리당 10개 식물을 다음과 같이 처리하였다. (1) 1% Silwet L-77의 분무; (2) 2 밀리리터의 dsRNA 용액의 분무; 및 (3) 글리포세이트의 분무. 검정 2의 경우, 처리당 18개 식물을 검정 1에서와 동일한 과정을 사용하여 처리하였다.
검정 3: 당해 검정은 상이한 발달 단계에서 적용시킨 처리와 비교하였으며 조지아주 마콘 카운티 현지로부터의 팔머 아마란쓰 종자로부터 성장시킨 묘목을 사용하여 글리포세이트 내성에 대해 선택하였다. 완충액은 2% 황산암모늄을 함유하였다. 처리당 12개의 작은(3개-잎 단계) 또는 12개의 큰(5개-잎 단계) 묘목을 다음과 같이 처리하였다: (1) 1% Silwet L-77의 분무; (2) 2 밀리리터의 dsRNA 용액의 분무; 및 (3) 글리포세이트의 분무. 당해 처리는 보다 큰 묘목과 비교하여 작은 묘목에서 보다 우수한 방제(보다 많은 식물을 사멸시킴)를 제공하였다. 비록 처리한 후 16일째에 dsRNA 처리된 식물 모두가 사멸하지는 않았으나, dsRNA 처리는 성취된 완충액 및 제초제를 사용한 처리보다 더 많은 글리포세이트 내성 식물을 사멸시키거나 발육정지시켰다.
검정 4 및 5: 당해 검정을 미주리주 페미스코트 농장으로부터 토양속 종자로부터 성장시킨 팔머 아마란쓰 식물을 사용하였다. 완충액은 2% 황산암모늄을 포함하였다. 처리당 11개의 작은(3개-잎 단계) 묘목을 다음과 같이 처리하였다: (1) 1% Silwet L-77의 분무; (2) 2 밀리리터의 dsRNA 용액의 분무; 및 (3) 글리포세이트의 분무. 검정 5의 경우, 처리당 12개의 식물을 검정 4에서와 동일한 과정을 사용하여 처리하였다.
검정 6: 당해 검정은 "Ivy2" 농장으로부터의 토양 속 종자로부터 성장한 팔머 아마란쓰 식물을 사용하였다. 완충액은 2% 황산암모늄을 포함하였다. 처리당 18개의 작은(3개-잎 단계) 묘목을 다음과 같이 처리하였다: (1) 1% Silwet L-77의 분무; (2) 2 밀리리터의 dsRNA 용액의 수동 또는 분무에 의한 분무; 및 (3) 글리포세이트의 분무. 당해 검정에서, 적용 방법(수동 점적 또는 분무)은 유사한 결과를 제공하였다.
검정 7: 당해 검정은 글리포세이트 내성에 대해 선택된 F3 종자로부터 성장한 팔머 아마란쓰 묘목의 3개- 내지 4개-잎 단계를 사용하였으며 검정 1 내지 6에서 식물보다 글리포세이트에 대해 보다 더 내성이었다. 완충액은 2% 황산암모늄을 포함하였다. 처리당 18개의 식물을 다음과 같이 처리하였다. (1) 1% Silwet L-77의 분무; (2) 2 밀리리터의 dsRNA 용액의 분무; 및 (3) 글리포세이트의 분무.
Figure pct00007
실시예 18
본 실시예는 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝제의 사용을 포함하는 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 방법 및 국소 적용된 조성물을 설명한다.
이들 검정에서, dsRNA 용액은 0.2% 탈로우아민 표면활성제 및 2% 황산암모늄(도 22에서 "탈로우아민/AMS"로 확인됨), 또는 다음 형질감염 시약들 중의 하나를 함유하는 용액 속에서 "10X" 투여량(식물당 8 나노몰)에서 실시예 1에서 기술한 등량의 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자를 함유하였다: (a) 폴리아민(JetPRIMETM, 제조원: Polyplus-transfection SA, 프랑스 일키르크(Illkirch) 소재), (b) 자기 나노입자(SilenceMag, 제조원: OZ Biosciences, 프랑스 마르세일 소재), (c) 펩타이드(N-TERTM 나노입자, 제조원: Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재), (d) 지질(siPORTTM NeoFX TM, 제조원: Ambion, 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 또는 (e) 양이온성 지질/중합체(TransIT? 제조원: Mirus Bio, 위스콘신주 매디슨 소재). 식물을 다음과 같이 처리하였다: (1) dsRNA 용액의 수동 적용; (2) 1% Silwet L-77의 분무; 및 (3) 159리터/에이커의 비율로 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 840 g의 산 당량에서 적용된 글리포세이트를 사용한 분무. 탈로우아민 표면활성제/황산암모늄 용액 속에서 dsRNA와 함께 사용하는 경우 당해 프로토콜은 35개 카피의 EPSPS를 가진 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰를 사멸시켰다. 결과는 도 22에 묘사한다. 식물의 발육정지 또는 사멸은 폴리아민(JetPRIMETM), 펩타이드(N-TERTM 나노입자), 양이온성 지질/중합체(TransIT?, 또는 탈로우아민 표면활성제/황산암모늄을 함유하는 용액중 dsRNA로 처리한 식물의 경우 관찰되었다.
실시예 19
본 실시예는 식물에서 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 사용하는 방법을 설명한다. 보다 상세하게, 당해 실시예는 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 상이한 유형의 폴리뉴클레오타이드의 용도를 기술한다.
14 내지 38번 위치, 153 내지 177번 위치, 345 내지 369번 위치, 및 1105 내지 1129번 위치(도 1에서 밑줄친 뉴클레오타이드로 나타냄)에서 팔머 아마란쓰 EPSPS 유전자에 상응하는 센스 단일가닥 DNAs (ssDNA) 및 안티-센스 단일가닥 RNA (ssRNA)는 업자(Integrated DNA Technologies)에서 구입하였다. 센스 ssDNA 및 안티-센스 ssRNA는 등몰의 혼합된 ssDNA 및 ssRNA를 95℃에서 5분 동안 가열하여 어닐링시키고 1.5 내지 2시간에 걸쳐 실온으로 서서히 냉각시켜 DNA/RNA 하이브리드를 수득하였다.
16개-카피의 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물을 당해 과정을 사용한 검정에서 사용하였다:(1) 1% Silwet L-77의 분무; (2) 팔머 EPSPS dsRNA(실시예 1에서 기술된 바와 같음) 또는 팔머 EPSPS DNA/RNA 하이브리드의 총 0.8나노몰을 각각의 식물의 4개 성숙한 잎에 수동-적용; 및 (3) 159리터/에이커의 비율로 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 840 g의 산 당량에서 적용된 글리포세이트를 사용한 분무.
결과는 도 23에 묘사한다. 제초제 분무 후 7일째에, 6개의 dsRNA 처리된 식물 중 4개가 사멸하였고 나머지 2개는 죽어간 반면, DNA/RNA 하이브리드로 분무한 식물은 대조군과 비교하여 성장에 있어 발육정지(글리포세이트 손상)되었다.
실시예 20
본 실시예는 식물에서 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 사용하는 방법을 설명한다. 보다 상세하게, 당해 실시예는 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 상이한 유형의 폴리뉴클레오타이드의 용도를 기술한다.
16개 카피의 EPSPS를 가진 6개의 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물을 당해 검정에서 처리당 사용하였다. dsRNA의 식물 처리당 0.8 나모놀("1X"), 10배 더 큰 양(식물 처리당 8 나노몰, "10X")의 ssDNA 폴리뉴클레오타이드(실시예 19에서 기술됨) 및 대조군으로서 완충액 단독을 별도의 식물에 2% 황산암모늄을 함유하는 완충액 속에서 수동으로 적용시킨 후 48시간 후에 159리터/에이커의 비율로 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 840 g의 산 당량에서 적용된 글리포세이트를 분무함으로써 적용시켰다. 도 24는 결과를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드 처리 둘다는 완충액과 제초제만으로 처리한 식물과 비교하여 팔머 아마란쓰의 보다 우수한 방제를 제공하였다. 10X ssDNA 처리한 식물 중에서, 6개 중 2개는 사멸하였고, 나머지 4개는 30%까지 성장시 발육정지되었다. 1X dsRNA 처리한 식물 중에서, 6개 식물 모두가 WM 분무 또는 dsRNA 처리 후 10일째에 사멸하였다.
실시예 21
본 실시예는 식물에서 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 사용하는 방법을 설명한다. 보다 상세하게, 당해 실시예는 식물에서 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 폴리뉴클레오타이드 서열의 선택을 기술한다.
각각 약 250 bp이고 서열 번호: 41 내지 52(표 8)의 EPSPS 틸링(tiling)된 DNA 서열에 상응하는 dsRNA의 하나의 쇄를 갖는 12개의 dsRNA를 설계하여 도 25a에 묘사된 바와 같이, 팔머 아마란쓰 EPSPS 유전자의 5' 및 3' 해독되지 않은 영역의 일부 및 완전한 암호화 서열을 틸링 양식으로 포함시켰다.
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 1 및 도 1에 기술된 바와 같은 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자는 틸링 분절 2, 3, 4, 및 8에 각각 위치되어 있으며, 이들 분절내 담회색 바아로 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 EcoRI 및 BamHI 클로닝 부위에서 삽입된 EPSPS 폴리뉴클레오타이드를 지닌 pBR322 벡터를 사용하여 시험관내 전사로 합성하였으며; 플라스미드 DNA는 Qiagen Maxi prep 키트로 분리하고 EcoRI 및 BamHI 제한 효소로 분해하였다. 분해된 DNA 용액을 추가의 정제없이 식물의 처리시 사용하였다.
16개 카피의 EPSPS를 가진 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물을 다음과 같이 처리하였다: 1% Silwet L-77을 사용한 분무; (2) dsRNA 용액(12개의 틸링 분절 또는 실시예 1에 기술된 4개의 "짧은" dsRNA 분자로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드를 0.01 나노몰 DNA/식물의 비율로 함유) 또는 대조군으로서 완충액의 수동 적용; 및 (3) 48시간 후 159리터/에이커의 비율로 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 840 g의 산 당량에서 적용된 글리포세이트를 사용한 분무. 처리된 식물의 대지 위 높이를 제초제 처리 후 11일 째에 관찰하였으며; 사멸하거나 죽어가는 식물을 0의 높이로 지정하였다. 결과는 도 25b 및 25c에 묘사한다. 당해 검정에서 최대 효능을 나타내는 dsRNA 폴리뉴클레오타이드 조합은 실시예 1에 기술된 4개의 "짧은" dsRNA 분자, 틸링 분절 2, 5, 8, 및 11의 조합, 및 틸링 분절 7, 8, 및 9의 조합을 포함하였다.
실시예 22
본 실시예는 식물에서 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 사용하는 방법을 설명한다. 보다 상세하게, 당해 실시예는 폴리뉴클레오타이드의 국소 적용 후 제초제를 식물에 적용함을 기술한다.
하나의 검정에서, 16개 카피의 EPSPS를 갖는 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물을 159리터/에이커의 비율로 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 840 g의 산 당량에서 적용된 글리포세이트로 분무하였다. 제초제 적용 후 2 또는 24시간째에, 식물을 1% Silwet L-77로 분무하여 처리하였다. Silwet 처리 후 15 내지 20분 째에, 식물을 4개의 2% 황산암모늄을 함유하는 완충액 중 실시예 1에서 기술된 바와 같은 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자 또는 2% 황산암모늄을 함유하는 완충액의 식물당 0.8 나노몰("1X")을 수동 적용시켜 처리하였다. 당해 검정에서, 처리되지 않은("UT") 대조군 식물은 1% Silwet L-77 분무만으로 처리하였으나 제초제 또는 dsRNA로 처리하지 않았다. 결과는 도 26에 묘사한다. 당해 검정에서, 1% Silwet의 적용은 제초제 분무 후 2시간째에 적용된 경우 60%까지 및 제초제 분무 후 24시간째에 적용된 경우 20%까지 증진된 글리포세이트 활성을 생성하였다. 당해 검정에서 1% Silwet에 이은 EPSPS dsRNA의 적용은 제초제 분무 후 2시간째에 적용된 경우 적어도 80%까지 및 제초제 분무 후 24시간째에 적용된 경우 20%까지 증진된 글리포세이트 활성을 생성하였다.
다른 검정에서, 조지아주 마콘의 농장 지역으로부터의 토양속 종자로부터 성장된 팔머 아마란쓰 식물에 159리터/에이커의 비율로 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 840 g의 산 당량에서 적용된 글리포세이트를 분무하였다. 제초제 처리 후 3일 째에, 40개 식물 중 9개가 사멸하였고 3개는 심각하게 발육정지되었다. 생존하는 식물에 1% Silwet L-77에 이어, 식물당 8 나노몰("10X")의 실시예 1에 기술된 바와 같은 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자를 수동으로 국소 적용에 의해 분무하였다. 3일 후, dsRNA 처리된 그룹에서 3개 이상의 식물이 사멸하였고 완충액 처리된 그룹에서 2개 이상의 식물이 사멸하였다. 당해 시점(원래의 제초제 처리 후 6일 째 및 Silwet/dsRNA 또는 완충액 처리 후 3일째)에, 각각의 그룹에서 생존하는 식물의 1/2에 글리포세이트의 두번째 적용(첫번째 적용에서와 동일한 투여량으로 적용)으로 분무하였다. 당해 두번째 제초제 처리 후 2주째에, 나머지 dsRNA 처리된 식물은 80% 손상을 나타내었으며 나머지 완충액 처리된 식물은 40% 손상을 나타내었다.
실시예 23
본 실시예는 식물에서 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 사용하는 방법을 설명한다. 보다 상세하게, 당해 실시예는 제초제 내성 잡초를 방제하기 위한 폴리뉴클레오타이드, 표면활성제 및 제초제를 포함하는 단일 조성물의 일-단계 국소 적용을 기술한다.
당해 검정은 매우 높은 카피 수의 EPSPS를 가진 것으로 공지된 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물(당해 연구 지역으로부터의 식물은 문헌: Gaines et al . (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107:1029-1034에서 5 내지 160개 이상 카피의 EPSPS를 가진 것으로 보고되어 왔다)의 현지 집단에서 수행하였다. 당해 검정에서 사용된 폴리뉴클레오타이드는 실시예 1에 기술된 바와 같이 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은" EPSPS dsRNA 분자의 등몰 혼합물이었다.
1 피트×5 피트의 처리 지역에서 4 내지 6 인치 크기의 식물에 1% Silwet L-77 표면활성제, 2% 황산암모늄, 및 글리포세이트(159리터/에이커의 비율로 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제 1682 g의 산 당량으로 적용됨)를 또한 함유한 용액 중 264 마이크로그람("100X") 또는 52.8 마이크로그람("20X")의 EPSPS dsRNA로 단일 처리하여 분무하였다. 비교용으로, 1 피트×5 피트의 처리 지역내 다른 식물에 동일한 비율로 적용된 글리포세이트(1% Silwet L-77 표면활성제 및 2% 황산암모늄을 또한 함유하는 용액중)를 분무하였다.
결과는 도 27에 묘사한다. Silwet L-77 및 황산암모늄을 또한 함유한 용액 중 글리포세이트(159리터/에이커의 비율로 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 1682 g의 산 당량에서 적용됨) 만을 사용한 식물의 처리는 약 70% 대조군(식물의 사멸)을 생성하였다. 20X EPSPS dsRNA 폴리뉴클레오타이드, 표면활성제, 황산암모늄, 및 제초제를 함유하는 조성물을 사용한 일-단계 처리는 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰의 약 80 내지 85% 방제를 생성하였으며, 이는 159리터/에이커의 비율로 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 6720 g의 산 당량에서(즉, 159리터/에이커의 비율로 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 약 840 g의 산 당량의 표준 적용율의 8배에서) 적용된 글리포세이트를 사용한 분무에 의해 수득된 대략적인 방제율이다. 100X EPSPS dsRNA 폴리뉴클레오타이드, 표면활성제, 황산암모늄, 및 제초제를 함유하는 조성물을 사용한 일-단계 처리는 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰의 약 90 내지 95% 방제율을 생성하였으며, 이는 159리터/에이커의 비율에서(즉, 159리터/에이커의 비율로 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 약 840 g의 산 당량의 표준 적용율의 16배에서) 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 13440 g의 산 당량에서 적용된 글리포세이트를 사용한 분무에 의해 수득된 대략적인 방제율이다.
실시예 24
본 실시예는 표적 유전자로부터 전사된 RNA 또는 표적 유전자에서 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 본질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 지닌 분절을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 야채에 국소 적용 후 야채 식물에서 표적 유전자의 전신계적 조절을 유도하는 방법을 설명하며, 당해 방법에 의해 분자는 야채 식물의 내부에 침투하여 표적 유전자의 전신계적 조절을 유도한다. 당해 실시예에서, 성장하는 야채 식물을 (a) 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대한 식물의 컨디셔닝용 제제 및 (b) 안티-센스 또는 센스 배향으로 표적 유전자의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 야채 또는 과일 작물에서 표적 유전자의 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 국소 적용된 조성물을 사용하여 처리하였다. 보다 상세하게는, 당해 실시예는 야채 작물, 즉, 상추(락투카 사티바)에서 파이토엔 데사투라제 (PDS) 유전자의 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드의 용도를 입증한다.
상추 PDS는 하기 서열을 갖는다:
CAGAGTCAACTCACGAATACAAAAAATTGAGTTAAACAAAGACGGAACTGTCCGGAACTTTCTATTGAGTGATGGGAATGTTCTAGAAGCTGATGCTTATGTTTTCGCTACCCCTGTTGACATTCTCAAGCTTCTTTTACCCGAAGAATGGAAACCAATTCCATATTTCAAAAAATTAGAGAAGTTAGTCGGTGTTCCTGTTATAAACGTTCATATATGGTTTGACAGAAAGCTGAAAAACACATATGATCACTTACTTTTCAGTAGGTCACCTCTGCTGAGTGTGTATGCTGACATGTCAGTGACATGTAAGGAATATTATGATCCGAATAAGTCAATGTTGGAGTTGGTTCTTGCTCCAGCTGAGGAATGGATTTCAAGAAGTGACACTGATATTATTGATGCAACAATGAGTGAACTTTCAAGGCTTTTTCCTGATGAAATTGCAGCTGATCAAAGTAAAGCAAAAATCTTGAAATATAAAGTTGTTAAAACACCAAGGTCTGTTTATAAAACTGTTCCAGATTGTGAACCATGTCGACCCCTACAAAGATCTCCAATTCAAGGATTTTATTTATCTGGTGATTATACTAAACAAAAGTATTTGGCTTCAATGGGGGGTGCTGTTTTATCTGGAAAAATTTGTGCACAAGCTATTTTACAAGATTATGAGATGCTTGCTACA (서열 번호: 53). 다음 서열을 지닌 길이가 21 내지 45개 뉴클레오타이드인 폴리뉴클레오타이드 단일가닥 DNA를 합성하였다: taatacgactcactatagggtttggagcttacccaaATGtac("HL286", 센스 배향, 서열 번호: 54), taatacgactcactatagggaggccacgtcagcatttcattgttc("HL287", 안티-센스 배향, 서열 번호: 55), ccattcaATGgtgcaggtaaaac("HL288", 안티-센스 배향, 서열 번호: 56), catagaATGctccttccactg ("HL289", 안티-센스 배향, 서열 번호: 57), 및 caaataaattttgtacatttgggtaagctccaa("HL290", 안티-센스 배향, 서열 번호: 58). ssDNA 용액을 5 밀리몰의 인산나트륨 완충액, pH 6.8 중 0.01% Silwet L-77 중 모든 5개의 폴리뉴클레오타이드의 동등한 혼합물로 제조하였다.
상추 다양성 LS49 "그린 타워(Green Tower)"를 당해 검정에서 사용하였다. 각각의 식물의 2개의 완전히 확장된 잎을 이중-증류수 용액 속에 새로이 제조된 0.1% Silwet L-77내로 수초 동안 침지시켰다. 잎들이 15 내지 30분 동안 건조되도록 하였다. 이후에, 각각의 식물에 20 마이크로리터의 ssDNA 용액을 2개의 Silwet 처리된 잎에 적용시켜 처리하였다(식물당 총 40 마이크로리터). 표 9는 사용된 검정 조건 및 ssDNA 폴리뉴클레오타이드로 국소 처리한 식물의 관찰된 표백을 나열한다. 도 28은 처리후 37, 46 및 60일째에 식물당 1 나노몰의 ssDNA로 처리한(상부로부터 하부로) 상추 식물의 표백 및 사멸의 진행을 묘사한다.
Figure pct00010
검정을 식물당 적용된 2 또는 4 나노몰의 ssDNA를 사용하여 반복하였다. 도 29a는 폴리뉴클레오타이드로 국소 처리한 후 4 또는 12일째 관찰된 표백에 의해 입증된 전신계적 사이런싱을 묘사한다.
검정은 적용된 식물 당 8나노몰의 폴리뉴클레오타이드와 함께 각각의 개개 안티-센스 ssDNA("HL287", 서열 번호: 55; "HL288", 서열 번호: 56; "HL289", 서열 번호: 57; 및 "L290", 서열 번호: 58)를 사용하여 반복하였으며; 양성 대조군 식물은 각각 2 나노몰에서 4개의 개개의 안티-센스 ssDNA의 혼합물(식물당 적용된 총 8 나노몰의 폴리뉴클레오타이드)로 처리하였고 음성 대조군 식물은 완충액만으로 처리하였다. 도 29b는 안티-센스 ssDNA로 국소 처리한 후 4일째에 관찰된 표백에 의해 입증된 전신계적 사일런싱을 묘사한다.
실시예 25
본 실시예는 본 발명의 양태를 설명한다. 당해 실시예에서, 성장하는 식물을 (a) 폴리뉴클레오타이드에 의한 침투에 대해 식물의 컨디셔닝용 제제 및 (b) 표적 유전자의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 안티-센스 또는 센스 배향으로 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물에서 표적 유전자의 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 국소 적용된 조성물로 처리하였다. 보다 상세하게는, 당해 실시예는 야채 작물, 즉, 토마토(솔라눔 라이코페르시쿰)에서 파이토엔 데사투라제 (PDS) 유전자의 전신계적 사일런싱을 유도하기 위한 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드의 용도를 입증한다.
토마토 PDS는 하기 서열을 갖는다:
GGAAGCAAGCGTAGTTTAGCTTTGTGGTTATTATTTAGCTTCTGTACACTAAATTTATGATGCAAGAAGCGTTGTACACAACATATAGAAGAAGAGTGCGAGGTGAAGCAAGTAGGAGAAATGTTAGGAAAGCTCCTATACAAAAGGATGGCATGTTGAAGATTAGCATCTTTTTAATCCCAAGTTTAAATATAAAGCATATTTTATGTACCACTTTCTTTATCTGGGGTTTGTAATCCCTTTATATCTTTATGCAATCTTTACGTTAGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCGA (서열 번호: 59).
토마토 PDS 유전자 서열(서열 번호: 59)로부터 전사된 mRNA의 1724 내지 1923번 위치에서의 뉴클레오타이드에 상응하는 서열 tcgcagcgactcagaaattattgATGcaacgATGaaggaactagcaacgctttttcctgATGaaatttcagcagatcaaagcaaagcaaaaatattgaagtaccATGttgtcaaaactccgaggtctgtttataaaactgtgccaggttgtgaaccctgtcggcctttacaaagatccccaatagaggggttttatttag(서열 번호: 60)에 의해 암호화된 RNA에 하이브리드화할 수 있는 안티-센스 쇄를 지닌 201개 뉴클레오타이드 dsRNA 폴리뉴크렐오타이드를 RT PCR에 의해 서열 taatacgactcactatagggtcgcagcgactcagaaattattg (서열 번호: 61, 센스 프라이머) 및 taatacgactcactataggggtaaaggccgacagggttcacaacc (서열 번호: 62, 안티-센스 프라이머)를 지닌 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 합성하였다. 2.5 마이크로몰 dsRNA 용액을 5 밀리몰 인산나트륨 완충액, pH 6.8 속에서 0.01% Silwet L-77 중 201개 뉴클레오타이드 dsRNA 폴리뉴클레오타이드 (서열 번호: 60)로 제조하였다.
3주 된 토마토 묘목을 다음과 같이 처리하였다. 2개의 완전히 확장된 잎을이중-증류수 중 새로이 제조된 0.1% Silwet L-77 용액 내로 수초 동안 침지시켰다. 잎이 30분 내지 1시간 동안 건조되도록 하였다. 이후에 각각의 식물을 20 마이크로리터의 dsRNA 용액을 2개의 Silwet 처리된 잎(식물당 총 40 마이크로리터)의 상부 표면에 적용시켜 처리하였다. 대조군 식물을 완충액으로 처리하였다. 식물을 관찰용 성장 체임버 속에 유지시켰다. 도 30은 국소 처리 후 30일째에 dsRNA 처리된 식물의 표백에 의해 입증되는 것으로서 표적 유전자 PDS의 전신계적 사일런싱을 묘사한다. dsRNA 처리된 식물은 대조군 식물과 비교하여 심하게 발육정지되었다.
실시예 26
본 실시예는 성장하는 식물의 외부 표면에 국소 피복시키기 위해 조정된 제초제 조성물에 대한 증진을 설명하며, 여기서 식물 치사제는 식물 유전자로부터 전사된 DNA의 서열 또는 하나 이상의 식물 유전자의 서열과 본질적으로 동일하거나 상보성인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 국소 적용을 제공받은 것들 외의 식물 기관 또는 조직에서 식물 유전자의 전신계적 억제를 수행한다. 보다 구체적으로, 당해 실시예는 표면활성제, 및 팔머 아마란쓰에서 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPS) 유전자, 전사 개시 인자(TIF), 및 DNA-의존성 ATPase(ddATPase)를 표적화하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 적어도 하나의 치사제를 포함하는, 성장하는 식물의 외부 표면 위에 국소 피복하도록 조정된 제초제 조성물을 설명한다.
제초제 조성물은 다음의 21개-염기쌍 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 포함한다:
(1) nDsRNA1: 센스 쇄 CUACCAUCAACAAUGGUGUCC (서열 번호: 63) 및 안티-센스 쇄 GGACACCAUUGUUGAUGGUAG (서열 번호: 64)
(2) nDsRNA3: 센스 쇄 GUCGACAACUUGCUGUAUAGU (서열 번호: 65) 및 안티-센스 쇄 ACUAUACAGCAAGUUGUCGAC (서열 번호: 66)
(3) nDsRNA4: 센스 쇄 GGUCACCUGGACAGAGAAUAG (서열 번호: 67) 및 안티-센스 쇄 CUAUUCUCUGUCCAGGUGACC (서열 번호: 68)
(4) nDsNA5: 센스 쇄 AAUGCCAGAUGUUGCUAUGAC (서열 번호: 69) 및 안티-센스 쇄 GUCAUAGCAACAUCUGGCAUU (서열 번호: 70)
다수의 폴리뉴클레오타이드의 혼합물은 처리된 식물에서 내성의 선택을 방지하는데 유리하다. 하나의 구현예에서, 제초제 조성물은 서열 번호: 63 내지 70을 갖는 상기 dsRNA 폴리뉴클레오타이드의 4개 모두의 혼합물을 포함한다. 다른 양태에서, 제초제 조성물은 dsRNA 서열 서열 번호: 63 내지 70 중 하나 이상에 상응하는 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 지닌 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 양태에서, 제초제 조성물은 dsRNA 서열 서열 번호: 63 내지 70 중 하나 이상에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 RNA/DNA 하이브리드를 포함한다. 다른 양태에서, 제초제 조성물은, 2' 하이드록실이 안전성을 위해 메틸화된 dsRNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
제초제 조성물은 Silwet L-77과 같은 표면활성제(또는 실시예 36에서 제공된 것들과 같은 다른 효과적인 표면활성제)를 포함한다. 임의로, 제초제 조성물은 염, 킬레이트제, 또는 습윤제(실시예 35에서 제공된 것들과 같음)와 같은 하나 이상의 첨가제를 포함함으로써, 예를 들면, 식물의 내부내로 폴리뉴클레오타이드의 전달을 향상시키거나, 폴리뉴클레오타이드의 효능을 향상시키거나, 비-폴리뉴클레오타이드 제초제의 제초 활성을 강화시킴으로써 제초 수행능을 증신시킴을 포함할 수 있다.
임의로, 제초제 조성물은 식물에서 다수 유전자를 조절하도록 설계된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 제초제 조성물은 제2 유전자의 서열 또는 제2 유전자로부터 전사된 RNA의 서열에 대해 본질적으로 동일하거나 상보성인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 제2 유전자의 조절은 조성물의 제초 활성의 상승적 향상을 제공한다.
하나의 구현예에서, 제초제 조성물은 내인성 팔머 아마란쓰 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 유전자 또는 내인성 EPSPS 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 상보성인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 및 또한 내인성 팔머 해독 개시 인자(TIF) 유전자의 서열 또는 내인성 TIF 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 상보성인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 전사 개시 인자(TIF)는 단백질 합성을 개시하는데 필수적이고 식물을 통해 발현되는 핵-암호화된 엽록체 단백질이다. 아라비도프시스 탈리아나는 AT1G17220.1(공공 이용가능한 데이타베이스 The Arabidopsis Information Resource found online at www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=locus&name=AT1G17220에 기술되어 있음)로 명명되고 GenBank 수탁번호 GI:186478573로 지정되어 있는 오르톨로그(orthologue)를 가지며, 이는 세균 해독 개시 인자 2에 대해 유사성을 가진 엽록체 국재화된 단백질로 확인되었으며; 또한 당해 유전자의 설명에 대해서는 문헌 'Miura et al . (2007) Plant Cell , 19:1313-1328'을 참조한다. TIF 서열은 팔머 아마란쓰(아마란쓰 팔머리)로부터 확인되었으며; 하나의 TIF 유전자는 서열 번호: 71의 서열을 갖는 것으로 확인되었다. 아마란투스 팔머리에서 당해 TIF 유전자의 억제를 위한 폴리뉴클레오타이드의 예는 표 10에 나열한다.
Figure pct00011
Figure pct00012
하나의 구현예에서, 제초제 조성물은 서열 번호: 63 내지 70을 갖는 상기 EPSPS dsRNA 폴리뉴클레오타이드 및 또한 내인성 팔머 해독 개시 인자(TIF) 유전자의 서열 또는 표 10에서 제공된 바와 같이, 내인성 TIF 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 상보성인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 2개의 혼합물을 포함한다. 구체적인 양태에서, 제초제 조성물은 서열 번호: 63 내지 70을 갖는 4개의 EPSPS dsRNA 폴리뉴클레오타이드 및 UUCGAGUAAUGGGAAAUUGGAUAAUGUAGAGGAGAGGAAGAAGGUUAUUGAUUCAUUGGAUGAGGUAUUAGAAAAGGCCGAGAGAUUAGAAACGGCGAACUUACAAGCAGAUAAUAGAAAGGAUAGCACAAAUGUAAAUAAACCGUCUCCGAGUGUAAGU (서열 번호: 73)의 센스 서열 및 ACUUACACUCGGAGACGGUUUAUUUACAUUUGUGCUAUCCUUUCUAUUAUCUGCUUGUAAGUUCGCCGUUUCUAAUCUCUCGGCCUUUUCUAAUACCUCAUCCAAUGAAUCAAUAACCUUCUUCCUCUCCUCUACAUUAUCCAAUUUCCCAUUACUCGAA (서열 번호: 74)의 안티-센스 서열을 갖는 160개 염기쌍 TIF 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 혼합물을 포함한다.
일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 다수의 표적 유전자를 조절하도록 설계되어, 제초 활성에 있어서 상승 효과를 생성한다. 예를 들면, 제초 활성에 대한 상승 효과는 해독 개시 인자(TIF) 및 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPS)를 억제하도록 설계된 폴리뉴클레오타이드로 식물을 처리한 후 비-폴리뉴클레오타이드 제초 글리포세이트로 처리함으로써 수득되었다.
표 11에 나열된 폴리뉴클레오타이드는 합성 또는 시험관내 전사에 의해 생산되었다.
Figure pct00013
Figure pct00014
폴리뉴클레오타이드의 용액을 제조하여 표 12에 기술된 프로토콜을 사용하여 팔머 아마란쓰의 잎에 적용하였다.
Figure pct00015
폴리뉴클레오타이드의 조합물을 표 13에 나타낸 바와 같이 시험하였다.
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
*1개 이상의 카피 수가 나열되어 있으며, 처리된 식물은 카피 수들의 혼합물이었다.
**DAT = 처리 후 일수; "0% 대조군"은 처리된 식물과 대조군 식물 사이의 차이가 관찰되지 않았음을 의미한다; 발육정지 %는 [100 - (시험 식물의 평균 높이/대조군 식물의 평균 높이)*100]으로 계산한다.
아마란쓰 팔머리에서 TIF 유전자의 억제를 위한 이중가닥 25-머 RNA 폴리뉴클레오타이드 서열을 표 14에 나열된 바와 같이 설계하였다.
Figure pct00020
TIF 25-머 dsRNA 폴리뉴클레오타이드를 고 (112) 카피 및 저 (16) 카피 EPSPS 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰에서 시험하였다.
고-카피 식물을 11.5 그람/에이커에서 4개의 짧은 EPSPS dsRNA(실시예 1에 기술된 바와 같은, 짧은 dsRNA-1, 짧은 dsRNA-3, 짧은 dsRNA-4, 및 IDT [5](표 11에 기술된 것으로서 서열 번호: 91 내지 92)) 및 5.8 그람/에이커에서 하나의 개개의 TIF dsRNA의 혼합물, 또는 5.8 그람/에이커에서 각각 개개의 TIF 25-머 dsRNA로 처리하고; 폴리뉴클레오타이드 용액을 2% 황산암모늄 및 1% Silwet L-77을 함유하는 10 밀리몰 인산나트륨 완충액 (pH 6.8) 속에서 제형화하였다. 폴리뉴클레오타이드 처리 후 30분 째에, 식물에 글리포세이트(헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 1682 g의 산 당량)를 분무하거나 분무하지 않았다.
저-카피 식물을 0.23 그람/에이커에서 4개의 짧은 EPSPS dsRNA(실시예 1에 기술된 바와 같은, 짧은 dsRNA-1, 짧은 dsRNA-3, 짧은 dsRNA-4, 및 IDT[5](표 11에 기술된 바와 같은 서열 번호: 91 내지 92))의 혼합물 및 5.8 그람/에이커에서 하나의 개개의 TIF dsRNA, 또는 5.8 그람/에이커에서 각각 개개의 TIF 25-머 dsRNA로 처리하고; 폴리뉴클레오타이드 용액을 2% 황산암모늄 및 1% Silwet L-77을 함유하는 10 밀리몰 인산나트륨 완충액 (pH 6.8) 속에 제형화하였다. 폴리뉴클레오타이드 처리 후 30분 째에, 식물에 글리포세이트(헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 1682 g의 산 당량)를 분무하거나 또는 분무하지 않았다.
결과를 도 31 및 32에 묘사하며, TIF 폴리뉴클레오타이드가 EPSPS 폴리뉴클레오타이드의 활성을 향상시키며 TIF 폴리뉴클레오타이드가 이들 자체의 제초 활성을 가짐을 나타낸다.
실시예 27
본 발명의 양태는 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 식물에서 비-폴리뉴클레오타이드 제초제의 활성을 강화시키기 위한 사용 방법을 포함한다. 예를 들면, 제초제 표적 유전자, 또는 제초제 불활성화 유전자, 또는 스트레스 반응 유전자, 또는 이러한 표적 유전자의 조합을 조절하도록 설계된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 잡초 또는 자생 식물에 적용하고, 동시에 또는 이어서 또는 연속하여 비-폴리뉴클레오타이드 제초제(전형적으로 통상의 화학적 제초제)를 적용하여, 비-폴리뉴클레오타이드 제초제의 활성을 강화시킨다. 폴리뉴클레오타이드 조성물과 비-폴리뉴클레오타이드 제초제(예를 들면, 통상의 화학적 제초제)의 조합물은 상승 효과를 제공하는데, 즉, 이러한 조합의 제초 활성은 폴리뉴클레오타이드 조성물의 제초 효과와 비-폴리뉴클레오타이드 제초제의 제초 효과의 합보다 크다.
통상의 화학적 제초제 및 이들의 상응하는 제초제 표적 유전자의 예는 표 15에 제공된다.
Figure pct00021
통상의 화학적 제초제 및 이들의 상응하는 제초제 불활성화 유전자의 예는 표 16에서 제공된다.
Figure pct00022
실시예 28
본 실시예는 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 또는 표적 내인성 유전자내 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열에 대해 본질적으로 동일하거나 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 성장하는 식물 폴리뉴클레오타이드의 잎 위에 국소 적용시킴을 포함하는 성장하는 식물에서 표적 내인성 유전자의 전신계적 조절을 유도하는 방법을 설명하며, 당해 방법에 의해 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 침투하여 표적 내인성 유전자의 전신계적 조절을 유도한다.
이중가닥 RNA 또는 안티-센스 ssDNA 폴리뉴클레오타이드를 유전자 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS), 파이토엔 데사투라제 (PDS), 프로토포르피린 IX 옥시게나제 (PPO), 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL), 하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD), 아세틸-보조효소 A 카복실라제 (ACCase), 아세토락테이트 신타제 (ALS), 및 글루타민 신타제 (GS)를 표적화한 제초제에 대해 설계하였다. 각각의 제초제 표적화된 유전자의 경우, 2% 황산암모늄 중 8개의 안티-센스 ssDNA 폴리뉴클레오타이드의 혼합물을 10 밀리몰 인산나트륨 완충액, pH 6.8 속에 함유하는 용액을 2.32 g/에이커의 비율로 적용한 후 0.5% Silwet L-77 분무(10 갈론/에이커)를 적용하였다. 시험한 폴리뉴클레오타이드 및 수득되는 표현형 관찰은 표 17에 나열한다.
Figure pct00023
Figure pct00024
팔머 아마란쓰에서 효소 4-하이드록시페닐피루베이트 (HPPD) 및 프로토포르피리노겐 옥시다제 (PPO)를 표적화하는 ssDNA 폴리뉴클레오타이드, 및 전사 개시 인자(TIF)의 제초 활성, 및 제초제 메소트리온, 포메사펜, 및 아트라진과 함께 사용되는 경우 제초 활성에 있어서 이들의 효과를 시험하였다. 당해 실험에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 8개의 HPPD 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호: 141 내지 148), 8개의 PPO 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호: 125 내지 132), 및 8개의 TIF 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호: 75 내지 82, 참조: 실시예 26)이었다.
글리포세이트 민감성 팔머 아마란쓰 (아마란투스 팔머리) 식물을 온실 속의 3.5kg/입방미터 Osmocote? 14-14-14 비료를 함유하는 Sun Gro? Redi-Earth 묘목이 심어져 있는 4-인티 사각 포트에 온실내에서 14시간의 광기간 및 30℃의 낮 온도 및 20℃의 밤 온도에서 성장시켰다. 식물을 필요에 따라 소-관개(sub-irrigating)하였다.
20 내지 15 cm 높이의 식물에 40 마이크로리터(4개의 완전히 확장된 성숙한 잎을 각각의 식물에서 잎당 10 밀리리터의 용액으로 처리하였다)의 완충액-표면활성제 용액(대조군으로서, 0.5% Silwet L-77 및 2% 황산암모늄), 또는 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 표적화 HPPD, PPO, 또는 TIF의 완충액-표면활성제-ssDNA 폴리뉴클레오타이드 혼합물로 처리하였다. 일부 식물을 처리하지 않은채로 두어 대조군으로 사용하였다. 24시간 후, 처리되지 않은 식물, 완충액-표면활성제 처리된 식물, 및 완충액-표면활성제-ssDNA 처리된 식물을 표 18에 나타낸 바와 같이 9501E 노즐이 장착되고 HPPD 억제제, 메소트리온(4 파운드 활성 성분/갈론), 또는 PPO 억제제, 포메사펜(2 파운드 활성 성분/갈론), 또는 광시스템 Ⅱ 억제제, 아트라진(90% 활성 성분)이 들어있는, 헥타르당 93 리터의 용액을 전달하도록 계산된 트랙-분무기를 사용하여 처리하였다. 1%에서의 작물 오일 농축물(COC)을 모든 제초제 처리에 가하였다. 낮은 비율의 각각의 제초제(메소트리온: 13 g/에이커, 1/8X의 추천된 현지 비율과 동일; 포메사펜: 16 g/에이커, 1/22X의 추천된 현지 비율과 동일; 및 아트라진: 170 g/에이커, 1/8X의 추천된 현지 비율과 동일)를 사용하여 올리고뉴클레오타이드 혼합물에 의한 제초제 활성의 어떠한 증진도 검출할 수 있었다.
Figure pct00025
식물 높이를 제초제 처리 후 4일 째에 측정하였다.. 데이타를 처리당 4회 반복하는 1개 실험으로부터 수집하였다. 결과(완충액-표면활성제 용액, ssDNA, 및 제초제 처리 조합에 의해 영향받은 팔머 아마란쓰 식물 높이로 나타냄)는 표 19 및 도 33에 나타낸다. HPPD 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드, PPO 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드, 및 TIF 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드로 처리한 식물은 성장 발육정지를 나타내었으며, 각각 125, 153, 및 115 mm로 측정된 반면, 완충액-표면활성제(대조군)로 처리한 식물은 185 mm로 측정되었다(도 33). HPPD 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드, PPO 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드, 및 TIF 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드 각각으로 처리하면 완충액-표면활성제 대조군과 비교하여 32%, 18%, 및 38% 성장 감소를 유발하였다.
식물 높이에 있어서 주요 차이는 완충액-표면활성제에 이어 제초제로 처리한 식물과, 제초제 만을 처리한 식물 사이에서 관찰되지 않았다. HPPD 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드에 이어서 메소트리온으로 처리한 식물은 완충액-표면활성제 처리한 식물과 비교하여 100 mm, 46% 감소로 측정되는, 식물 성장에 있어 최대 감소를 나타내었다. PPO 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드에 이어서 포메사펜으로 처리한 식물은 126 mm로 측정되었으며, 완충액-표면활성제 처리된 식물과 비교하여 32% 감소되었다. TIF 안티-센스 ssDNA 올리고뉴클레오타이드에 이어 아트라진으로 처리한 식물은 121 mm로 측정되었으며, 완충액-표면활성제 처리된 식물과 비교하여 34% 감소되었다.
Figure pct00026
실시예 29
본 실시예는 관측가능한 표현형에 있어서 시험한 서열의 효과를 확인하기 위하여 상이한 필수 유전자에 대해 설계된 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 시험한 서열을 설명한다. 각각의 필수 유전자의 경우, 10 밀리몰 인산나트륨 완충액, pH 6.8 속에서 2% 황산암모늄 중 dsRNA 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 용액을 팔머 아마란쓰에 240 피모콜/식물의 비율로 적용한 후 0.5% Silwet L-77 분무(10 갈론/에이커)를 적용하였다. 시험한 폴리뉴클레오타이드 및 수득되는 표현형 관찰은 표 20에 나타낸다.
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
실시예 30
본 실시예는 특수한 저 서열 상동성 영역을 표적화하도록 설계되고, 예를 들면, 특수 종의 유전자 또는 표적 유전자의 특이적인 대립형질을 선택하는데 유용한 폴리뉴클레오타이드를 설명한다. 비-암호화 서열을 표적화하도록 설계된 폴리뉴클레오타이드는 유전자 조절에 관여된 비-암호화 RNA를 조절하는데, 예를 들면, RNAi-조절된 경로로 siRNA에 프로세싱되는 비-암호화 RNA를 조절하는데 유용한 비-암호화 서열을 표적화하도록 설계된다. 도 34는 니코티아나 벤타미아나 PDS 유전자위치 1 프로모터(서열 번호: 319) 및 PDS 유전자위치 2 프로모터 (서열 번호: 320)를 묘사하며; 다중 전사 출발 부위를 함유하는 유전자위치 1의 경우, 당해 정렬에 사용된 프로모터 서열은 5' 전사 개시 부위를 지닌 것이다. 니코티아나 벤타미아나 PDS1 및 PDS2 유전자는 프로모터 영역내 저 서열 상동성을 가지지만 암호화 영역내 고 서열 상동성을 가진 것으로 밝혀졌다.
PDS1 및 PDS2 프로모터의 상이한 부위를 표적화하도록 설계된 폴리뉴클레오타이드는 표 21에 나열한다.
Figure pct00030
Figure pct00031
표 21에 나열되고 도 35에 설명된 것으로서 폴리뉴클레오타이드(1 나노몰/각각 적용된 폴리뉴클레오타이드의 식물)의 6개의 상이한 조합을 실시예 12에 기술된 것과 유사한 과정을 사용하여 4주된 니코티아나 벤타미아나 식물에서 시험하였다. 폴리뉴클레오타이드 용액을 0.01% (v/v) Silwet L-77 및 5 밀리몰 인산나트륨, pH 6.8 중 2% (w/v) 황산암모늄 속에서 제조하였다. 식물당 2개의 완전히 확장된 잎을 ddH2O로 새로이 제조한 0.1% Silwet L-77 용액 내로 수초 동안 침지시키고 건조되도록 하였다. 약 30분 후, 20 마이크로리터의 폴리뉴클레오타이드 용액을 2개의 예비 처리된 잎 각각에 적용시켰다. 양성 대조군 식물을 PDS1 및 PDS2의 암호화 영역의 보존된 분절을 표적화하는 DNA 올리고뉴클레오타이드로 유사하게 처리하고; 음성 대조군 식물을 녹색 형광성 단백질(GFP)을 사일런싱하도록 설계된 DNA 올리고뉴클레오타이드로 유사하게 처리하였다. PDS1 또는 PDS2 프로모터 영역을 표적화하도록 설계된 폴리뉴클레오타이드의 모든 6개 조합물은 표백에 의해 입증되는 바와 같이 처리된 식물에서 전신계적 사일런싱을 유도하였다. 대략 200bp의 dsRNA 또는 dsDNA 폴리뉴클레오타이드를 사용한 처리 및 PDS1 또는 PDS2 프로모터 영역의 표적화는 또한 표백에 의해 입증되는 바와 같이 처리된 식물에서 전신계적 사일런싱을 유도하였다.
표 22에 나열된 다음의 추가의 게놈 서열(프로모터 및 전사된 인트론 및 엑손 서열 포함)을 국소 적용을 위한 폴리뉴클레오타이드를 설계하는데 사용하기 위한 아마란투스 팔머리 유전자에 대해 확인하였다.
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
실시예 31
본 실시예는 하나 이상의 식물 종에서 유전자 발현을 조절하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 설명한다. 상이한 잡초 종으로부터 EPSPS 서열내 2개의 고도로 보존된 영역을 확인하고 표 23에 "영역 1" 및 "영역 2"로 나타낸다.
Figure pct00038
표 24는 영역 2, TNGANGTcAAcATGAAcAAaATGCCaGATGTNGCNATGACNcTtGCNGTNGTTGC (서열 번호: 263)에 대한 EPSPS 컨센수스 서열을 기초하여 설계된 21-, 22-, 24-, 35-, 45-, 및 55-머 dsRNA 폴리뉴클레오타이드 서열을 나열한다.
Figure pct00039
EPSPS 컨센수스 dsRNA 폴리뉴클레오타이드를 시험관내 전사로 합성하여 조 RNA 제제로서 국소 적용하였다. 글리포세이트 내성 잡초(16개-카피 팔머 아마란쓰 및 쥐꼬리망초(horseweed))를 6개의 개개의(21-, 22-, 24-, 35-, 45-, 55-머) 컨센수스 dsRNA; 비-글리포세이트 내성 잡초(워터헴프, 시클포드(sicklepod), 바랭이, 나팔꽃, 명아주, 등대풀속)를 3개의 개개의 짧은(21-, 22-, 24-머) 컨센수스 dsRNA로 처리하였다. 폴리뉴클레오타이드 처리 후 글리포세이트 내성 식물을 글리포세이트(헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 1682 g의 산 당량) 및 비-글리포세이트 내성 식물을 글리포세이트(헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 105 g의 산 당량)로 처리하였다. 처리 후 7일째에, 모든 6개의 EPSPS 영역 2 컨센수스 dsRNA 폴리뉴클레오타이드는 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰의 100% 방제(식물을 사멸시킴)를 제공하는 것으로 밝혀졌으며; 글리포세이트 만으로 처리한 대조군 팔머 아마란쓰 식물은 사멸하지 않았다. 처리 후 7일 째에, 개개 시험한 3개의 보다 짭은(21-, 22-, 24-머) EPSPS 영역 2 컨센수스 dsRNA 폴리뉴클레오타이드는 워터헴프의 각각 95%, 80% 및 65% 방제율(사멸된 식물과 손상된 식물을 조합함)을 제공하는 것으로 밝혀졌으며; 글리포세이트 만으로 처리한 워터헴프 식물은 약 40% 방제율(사멸된 식물과 손상된 식물을 조합함)을 제공하였고; 모든 3개의 보다 짧은(21-, 22-, 24-머) 컨센수스 dsRNA 폴리뉴클레오타이드의 혼합물은 글리포세이트 단독과 대략 동일한 방제율을 제공하였다. EPSPS 영역 2 컨센수스 dsRNA 폴리뉴클레오타이드는 시험한 다른 잡초(쥐꼬리망초, 시클포드, 바랭이, 나팔꽃, 명아주, 등대풀속)에서 관찰가능한 효과를 유발하지 않았다.
실시예 32
본 실시예는 식물에서 유전자를 일시적으로 사일런싱시켜 목적하는 표현형을 수행하는 국소 폴리뉴클레오타이드 처리의 용도를 설명한다. 식물 조직에서 폴리페놀 옥시다제의 사일런싱은, 갈변(browning)에 대한 내성이 바람직한 특징인 과일 및 야채에 대한 가치있는 특징인, 절단되거나 손상된 식물 조직의 갈변을 억제한다.
표 25에 나타낸 서열을 갖는 안티-센스 DNA 올리고뉴클레오타이드를 설계하여 상추로부터 3개의 폴리페놀 옥시다제 유전자(PPO1, PPO2, 및 PPO3)를 표적화하였으며; 밑줄친 내용은 안티-센스 폴리뉴클레오타이드에 포함된 T7 서열을 나타낸다.
Figure pct00040
3주된 상추 식물(변종 SVR3603 L4)을 다음과 같이 처리하였다. 각각의 식물에서 2개의 공급 잎(보다 늙거나 이들의 성숙한 크기의 ~60%인 잎)을 0.1% (v/v) Silwet-L-77로 예비 처리하고 건조되도록 하였다(~15분), 각각의 잎에 0.01% (v/v) Silwet L-77 중 폴리페놀 옥시다제 안티-센스 폴리뉴클레오타이드의 20 마이크로리터의 혼합물 및 5 밀리몰 인산나트륨, pH 6.8 중 2% (w/v) 황산암모늄의 혼합물을 소적으로 적용시키고; 각각의 식물을 6.7나노몰의 각각의 3개의 폴리뉴클레오타이드 HH07, HH09, 및 HH11(식물당 총 20 나노몰에 대해)로 처리하였다. 대조군 식물을 관련되지 않는 폴리뉴클레오타이드 HH02-05(파이토엔 데사투라제에 대한 안티-센스) 또는 완충액(5 밀리몰 인산나트륨, pH 6.8 중 0.01% (v/v) Silwet L-77 및 2% (w/v) 황산암모늄) 단독으로 처리하였다.
폴리뉴클레오타이드 국소 처리 후 약 3주째에, "처리되지 않은" 상추 잎(즉, 국소 폴리뉴클레오타이드로 처리된 것들 제외)를 상추 머리로부터 물속에서 절단하고 컵 속에서 5% 에탄올 중 1.33 밀리몰 메틸 자스모네이트와 함께 항온처리하였다. 잎을 중심 추(central rib) 갈변에 대해 검사하고 매 24시간마다 사진을 찍었다. 시료를 나머지 식물로부터 취하여 작은 RNA 및 mRNA 분석을 위해 동결하였다.
폴리페놀 옥시다제 안티-센스 폴리뉴클레오타이드 HH07, HH09, 및 HH11로 처리한 식물은 메틸 자스모네이트로 처리한 후 중심 추 갈변에 있어 유의적인 감소를 나타내었다. 대조군으로서 HH02-05 (파이토엔 데사투라제에 대한 안티-센스)로 처리한 식물은 완충액 처리한 대조군과 비교하여 중심 추 갈변에 있어 작은 감소를 나타내었다.
실시예 33
본 실시예는 표면활성제 및 적어도 하나의 식물 치사제를 포함하는 성장하는 식물의 외부 표면에 국소 피복하기 위해 조정된 제초제 조성물을 설명하며, 당해 조성물은, 식물 치사제가 식물 유전자 또는 식물 유전자의 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 상보성인 서열을 갖고 식물 유전자의 전신계적 억제를 수행하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 개선점으로 한다. 보다 상세하게는, 당해 실시예는 표면활성제 및 적어도 하나의 식물 치사제를 포함하는 성장하는 식물의 외부 표면에 국소 피복하기 위해 조정된 제초제 조성물을 설명하며, 당해 조성물은, 식물 치사제가 니코티아나 벤타미아나로부터의 내인성 파이토엔 데사투라제(PDS), 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPS), 또는 리불로즈-1,5-비스포스페이트 카복실라제 옥시게나제(RuBisCO) 유전자의 억제를 수행하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 개선점으로 한다. 당해 실시예는 또한 식물에서 매우 고도로 발현된 유전자(리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제 옥시게나제)를 억제하는 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드의 용도를 설명한다.
서열 CATCTCCTTTAATTGTACTGC (서열 번호: 34)를 지닌 안티-센스 폴리뉴클레오타이드를 내인성 니코티아나 벤타미아나 파이토엔 데사투라제 (PDS) 유전자에 대해 설계하였으며, 이는 하기 cDNA 서열 단편을 갖는다:
CAGACTAAACTCACGAATAAAAAAGATCGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAATGTTTTATACTGAATAATGGCAGTACAATTAAAGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCACTCCAGTGGATATCTTGAAGCTTCTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATCCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGCTAGTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCCATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAGAACACATCTGATAATCTGCTCTTCAGCAGAAGCCCGTTGCTCAGTGTGTACGCTGACATGTCTGTTACATGTAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTATTTGCACCCGCAGAAGAGTGGATAAATCGTAGTGACTCAGAAATTATTGATGCTACAATGAAGGAACTAGCGAAGCTTTTCCCTGATGAAATTTCGGCAGATCAGAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTATCATGTTGTCAAAACCCCAAGGTCTGTTTATAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCCTTGCAAAGATCCCCTATAGAGGGTTTTTATTTAGCTGGTGACTACACGAAACAGAAGTACTTGGCTTCAATGGAAGGTGCTGTCTTATCAGGAAAGCTTTGTGCACAAGCTATTGTACAGGATTACGAGTTACTTCTTGGCCGGAGCCAGAAGATGTTGGCAGAAGCAAGCGTAGTTAGCATAGTGAACTAA (서열 번호: 38). 서열 CTGTGATCATCATATGTATCA (서열 번호: 279), CCTTAACTCTCCAGCTAGCAA (서열 번호: 280), CAGCCCGCAAATGTTTCATTC (서열 번호: 281), GCCGTCAATGGCCGCATTGCT (서열 번호: 282), TCCTTCCCTCAGAAAGGGCAG (서열 번호: 283), 및 TTGCCTCATGCTGCTAATCTG (서열 번호: 284)를 갖는 안티-센스 폴리뉴클레오타이드를, 니코티아나 벤타미아나 EPSPS cDNA 서열
CTTATATGTGCTTAAGCCTAACGTGCACCCGGCCCCTTAACCCCAGCAGTTTTCAATCTACCTACCGTCTCTACCATTTTCTTCTAGTTGGTGAAAATTTCTAACTTTGAGAAAACAAGCCAAAGTTTTTGTTTCTAAGAACGCAAAATGAGTGAAATTTTTTGCAGCAATGGCACAGATTAGCAGCATGAGGCAAGGGATACAGACCCCTAATCTTAATTCCTATTTTCCTAAAACCCAAAAGGTTCCTCTTTTTTCGCATTCTATCTTCTTTGGATCAAAGAAAATAACCCAAAATTCAGCAAAATCTTTGTGGGTGTGTAAGAAAGATTCAGTTTTGAGGGTGGCAAAGTCACCTTTTAGGATTTGTGCATCAGTGGCCACTGCACAGAAGCCCAACGAGATTGTGCTGCAACCCATCAAAGATATATCAGGCACTGTTAAATTGCCTGGTTCTAAATCCCTTTCCAACCGTATTCTCCTTCTTGCTGCCCTTTCTGAGGGAAGGACTGTTGTTGACAATTTACTGAGTAGTGATGACATTCATTACATGCTTGGTGCGTTGAAAACACTTGGACTTCATGTAGAAGATGACAATGAAAACCAACGAGCAATTGTGGAAGGTTGTGGTGGGCAGTTTCCTGTCGGCGAGAAGTCTGAGGAAGAAATCCAACTATTCCTTGGAAATGCAGGAACAGCAATGCGGCCATTGACGGCAGCAGTTACTGTAGCTGGAGGACATTCAAGATATGTACTTGATGGAGTTCCTAGGATGAGAGAGAGACCGAT (서열 번호: 285),
CACTGACGTTGGATTAGAGGTAGGCTCCTTATATGTGCTTAAGCCTAACGTGCAGCCGGCCCCCAACCCCAGCAGTTTTCAATCTACCTACCGTCTCTACCATTTTCTTATAGTAGTTGAAAATTTCTAACTTTGAGAAAACAAGCCAAAGTTTTGTTTCTAAGAACACAAAGGGAGTGAAATTTTTTGCAGCAATGGCACAGATTAGCAGCATGAGGCAAGGGATACAGACCCCTAATCTTAATTCCTATTTTCCTAAAACCCAAAAGGTTCCTCTTTTTTCGCATTCTATCTTCATTGGATCAAAGAAAATAACCCAAAATTCAGCAAAATCTTTGTGGGTGTGTAAGAAAGATTCAGTTTTGAGGGTGGCAAAGTCACCTTTTAGGATTTGTGCATCAGTGGCCACTGCACAGAAGCCTAACGAGATTGTGCTGCAACCTATCAAAGATATATCAGGCACTGTTAAATTACCTGGTTCTAAATCCCTTTCCAATCGTATTCTCCTTCTTGCTGCCCTTTCTGAGGGAAGGACTGTTGTTGACAATTTACTGAGTAGTGATGACATTCATTACATGCTTGGTGCATTGAAAACACTTGGACTTCATGTAGAAGATGACAATGAAAACCAACGAGCAATCGTAGAAGGTTGTGGTGGGCAGTTTCCTGTCGGCAAGAAGTCTGAGGAAGAAATCCAACTATTCCTTGGAAATGCAGGAACAGCAATGCGGCCATTGACGGCAGCAGTTACTGTAGCTGGTGGACATTCTAGATATGTACTTGATGGAGTTCCTAGGAT (서열 번호: 286), 및
AAATTCTTGGTTCGAGGAGGTCAGAAGTACAAGTCTCCTGGAAAAGCATATGTTGAAGGAGATGCCTCAAGTGCTAGCTACTTTTTGGCGGGTGCAGCTGTCACAGGTGGAACTGTCACTGTTGAAGGTTGTGGAACAAGCAGTTTACAGGGGGATGTTAAGTTTGCTGAGGTCCTCGAAAAGATGGGGGCAGAAGTTACATGGACAGAGAACAGTGTCACGGTTAAAGGACCTCCAAGGAACTCTTCTGGAATGAAACATTTGCGGGCTGTTGACGTTAACATGAACAAAATGCCAGATGTTGCCATGACTCTTGCTGTAGTTGCACTTTTTGCTGATAGTCCTACTGCCATAAGAGATGTTGCTAGCTGGAGAGTTAAGGAAACTGAGCGGATGATTGCCATATGCACAGAACTTAGGAAGTTGGGTGCAACAGTTGTAGAAGGGCCAGACTACTGCATAATCACTCCACCTGAAAAGTTAAAAGTAGCGGAAATTGATACATATGATGATCACAGAATGGCCATGGCTTTCTCTCTTGCGGCTTGTGCTGATGTTCCAGTCACCATTAAGGACCCCGGTTGTACTCGCAAAACCTTCCCCAACTACTTTGACGTTCTCCAGCAGTATTCCAAGCATTAAACCACTTTCCATTAAGAATTTTGAAAAAGAGAGACTTTGACAACAATGGTGTCATACCGGAAGAGAAAAGCTTTGATCCAAGCTTTCAACTCCTTTTCATTTGTCATGTGATGATCATTGTATTTGTTGAAGTTGAGCTGCTTTTCTTTTGTCCAGAAGACATGTATGGATACTATTACTATATAGTTAAGGTGAACTCAGCA (서열 번호: 287)를 기초로 하는, 내인성 니코티아나 벤타미아나 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 유전자에 대해 설계하였다. 하기 서열:
CCACATGGTCCAGTATCTGCC (AK195, RBCS_1-2-3-4, 서열 번호: 288), CAAGCAAGGAACCCATCCATT (AK196, RBCS_1-2-3-4, 서열 번호: 289), GGCCACACCTGCATGCATTGC (AK197, RBCS_1-2-3-4, 서열 번호: 290), GTGTTCACGGTAGACAAATCC (AK198, RBCS_1-2, 서열 번호: 291), TGCACTGCACTTGACGCACGT (AK199, RBCS_1-2, 서열 번호: 292), AACTGATGCATTGCACTTGAC (AK200, RBCS_3-4, 서열 번호: 293), CAAATCAGGAAGGTATGAGAG (AK201, RBCS_3-4, 서열 번호: 294), 및 TGTCAAGGTTTTGTTTCCTGG (AK202, RBCS_3-4, 서열 번호: 295)를 갖는 안티-센스 폴리뉴클레오타이드를, 니코티아나 벤타미아나 클로로플라스틱 RuBisCO 작은 쇄 2A cDNA 서열 단편:
GCAATGGCTTCCTCAGTTCTTTCCTCAGCAGCAGTTGCCACCCGCAGCAATGTTGCTCAAGCTAACATGGTTGCACCTTTCACAGGTCTTAAGTCTGCTGCCTCATTCCCTGTTTCAAGAAAGCAAAACCTTGACATCACTTCCATTGCCAGCAACGGCGGAAGAGTGCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAACATGAAGAAGTATGAGACTCTCTCATACCTTCCCGATTTGAGCCAGGAGCAATTGCTCTCCGAAATTGAGTACCTTTTGAAGAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGAAAGGATTTGTCTACCGTGAACACCACAAGTCACCAGGATACTATGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGCTACCTATGTTCGGATGCACTGATGCCACCCAAGTGTTGGCTGAGGTGGGAGAGGCGAAGAAGGAATACCCACAGGCCTGGGTCCGTATCATTGGATTTGACAACGTGCGTCAAGTGCAGTGCATCAGTTTCATTGCCTCCAAGCCTGACGGCTAC (서열 번호: 296),
ACAATGGCTTCCTCAGTTCTTTCCTCAGCAGCAGTTGCCACCCGCAGCAATGTTGCTCAAGCTAACATGGTTGCACCTTTCACTGGTCTTAAGTCAGCTGCCTTTTTCCCTGTTTCAAGGAAGCAAAACCTTGACATCACTTCCATTGCCAGCAACGGCGGAAGAGTGCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAACAAGAAGAAGTACGAGACTCTCTCATACCTTCCTGATCTGAGCGTGGAGCAATTGCTTAGCGAAATTGAGTACCTCTTGAAAAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGCGCGGATTTGTCTACCGTGAACACCACAAGTCACCGGGATACTATGACGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGTTGCCTATGTTCGGATGCACTGATGCCACCCAAGTGTTGGCCGAGGTGGAAGAGGCGAAGAAGGCATACCCACAGGCCTGGATCCGTATTATTGGATTCGACAACGTGCGTCAAGTGCAGTGCATCAGTTTCATTGCCTACAAGCCAGAAGGCTAC (서열 번호: 297),
CAAGCCAACATGGTTGCACCCTTCACTGGCCTCAAGTCCGCCTCCTCCTTCCCTGTTACCAGGAAACAAAACCTTGACATTACCTCCATTGCTAGCAATGGTGGAAGAGTTCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAACATGAAGAAGTACGAGACACTCTCATACCTTCCTGATTTGAGCCAGGAGCAATTGCTTAGTGAAGTTGAGTACCTTTTGAAAAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGCGTGGATTCGTCTACCGTGAACACCACAACTCACCAGGATACTACGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGTTGCCCATGTTCGGGTGCACTGATGCCACTCAGGTGTTGGCTGAGGTCGAGGAGGCAAAGAAGGCTTACCCACAAGCCTGGGTTAGAATCATTGGATTCGACAACGTCCGTCAAGTGCAATGCATCAGTTTTATCGCCTCCAAGCCAGAAGGCTAC (서열 번호: 298), 및
GGCTCAGTTATGTCCTCAGCTGCCGCTGTTTCCACCGGCGCCAATGCTGTTCAAGCCAGCATGGTCGCACCCTTCACTGGCCTCAAGGCCGCCTCCTCCTTCCCGGTTTCCAGGAAACAAAACCTTGACATTACTTCCATTGCTAGAAATGGTGGAAGAGTCCAATGCATGCAGGTGTGGCCGCCAATTAACAAGAAGAAGTACGAGACACTCTCATACCTTCCTGATTTGAGCGTGGAGCAATTGCTTAGCGAAATTGAGTACCTTTTGAAAAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGCATGGATTCGTCTACCGTGAACACCACCACTCACCAGGATACTACGATGGCAGATACTGGACGATGTGGAAGTTGCCCATGTTCGGGTGCACCGATGCCACTCAGGTCTTGGCTGAGGTAGAGGAGGCCAAGAAGGCTTACCCACAAGCCTGGGTCAGAATCATTGGATTCGACAACGTCCGTCAAGTGCAATGCATCAGTTTCATCGCCTACAAGCCCGAAGGCTAT (서열 번호: 299)를 기초로 하는, 내인성 니코티아나 벤타미아나 리불로즈-1,5-비스포스페이트 카복실라제 옥시게나제 (RuBisCO) 유전자에 대해 설계하였다.
니코티아나 벤타미아나 식물을 실시예 12에 기술된 것과 유사한 과정을 사용하여 처리하였다. 폴리뉴클레오타이드 용액(또는 EPSPS 및 RuBisCO의 경우에 혼합된 폴리뉴클레오타이드)를 5 밀리몰 인산나트륨, pH 6.8 중 0.01% (v/v) Silwet L-77 및 2% (w/v) 황산암모늄 속에서 제조하였다. 식물당 2개의 완전히 확장된 잎들을 ddH2O를 사용하여 새로이 제조한 0.1% Silwet L-77 용액 내로 수초 동안 침지시키고, 건조되도록 하였다. 약 30분 후에, 20 마이크로리터의 폴리뉴클레오타이드 용액을 각각의 2개의 예비 처리된 잎에 적용하였다. PDS의 경우, 각각의 5개 식물에 25나노몰의 PDS 안티-센스 폴리뉴클레오타이드(서열 번호: 34)를 제공하고; EPSPS의 경우, 각각의 5개 식물에 50나노몰의 각각의 EPSPS 안티-센스 폴리뉴클레오타이드 (서열 번호: 279-284)를 제공하며; RuBisCO의 경우, 각각의 5개의 식물에 50 나노몰의 각각의 RuBisCO 안티-센스 폴리뉴클레오타이드 (서열 번호: 288-295)를 제공하였다. 쌍을 이룬 대조군 식물을 완충액(5 밀리몰의 인산나트륨, pH 6.8 중 0.01% (v/v) Silwet L-77 및 2% (w/v) 황산암모늄)으로 처리하였다. 처리 후 12일째(PDS 및 EPSPS) 또는 10일째(RuBisCO)에 식물 높이로 측정한 결과를 도 36a 내지 36b에 나타낸다. PDS 안티-센스 폴리뉴클레오타이드로 처리한 식물은 심각한 발육정지(도 36a) 및 표백을 나타내었다. EPSPS 안티-센스 폴리뉴클레오타이드로 처리한 식물은 분열조직 및 줄기 조직에서 심각한 발육정지(도 36b) 및 심각한 손상을 나타내었다. RuBisCO 안티-센스 폴리뉴클레오타이드로 처리한 식물은 심각한 발육정지(도 36c) 및 기형의 정단 조직을 나타내었다.
제2 세트의 실험을 설계하여 식물에서 내인성 RNAi 사일런싱 경로의 성분을 사일런싱하는 효과를 조사하였다. 아르고나우트(AGO) 단백질은 RNAi 사일런싱 공정에서 작은 RNA에 결합하는 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RISC)의 성분이다. 아르고나우트의 억제는 RNAi 사일런신 공정에 의해 유발된 관찰된 표현형 효과를 감소시키는 것으로 예상될 수 있다. 서열 ggaggcaaaatacgagcctca (HL510, 서열 번호: 300), cactaatcttaataccaaact (HL511, 서열 번호: 301), tATGggtcattagcataggcattAT (HL512, 서열 번호: 302), tctcaagaatatcacgctccc (HL513, 서열 번호: 303), cccttggggacgctggcaggtcac (HL514, 서열 번호: 304), taatacgactcactatagggggagagagctagatcttttg (HL515, 서열 번호: 305), taatacgactcactataggcacagtatttcttcctccaacc (HL516, 서열 번호: 306), TTGCTCATCTTAAATACATGT (HL517, 서열 번호: 307), TCATCTTAAATACATGTTTTGTCA (HL518, 서열 번호: 308), ttatcttcagggatacattagc (HL519, 서열 번호: 309), aatactgcttgctcatcttaaata (HL520, 서열 번호: 310), gacaattccaagttcagtttc (HL521, 서열 번호: 311), ccgttttagatcaccataaagaga (HL522, 서열 번호: 312), ttgtctggtaatatcacaatc (HL523, 서열 번호: 313)를 갖는 AGO1 안티-센스 폴리뉴클레오타이드를, 2개의 니코티아나 벤타미아나 AGO1-2 부분 cDNA 서열,
TTTTTGGTGCAGATGTCACCCACCCTCACCCTGGGGAGGACTCTAGCCCATCCATTGCCGCGGTGGTTGCTTCTCAAGATTGGCCTGAGATTACAAAGTATGCTGGTCTAGTTTCTGCTCAAGCCCATAGGCAAGAGCTTATTCAGGATCTGTACACGACTAGGCAAGATCCTGTTAAGGGGACAGTTGCTGGTGGAATGATTAAGGACTTACTTATATCCTTCCGAAGAGCTACTGGACAAAAGCCCCAGAGAATAATTTTCTATAGGGATGGTGTTAGTGAAGGACAATTTTATCAAGTGCTTCTGTTCGAACTTGATGCGATCCGCAAAGCATGTGCGTCTTTGGAGCCAAATTATCAGCCCCCAGTCACATTTGTTGTGGTTCAGAAACGACATCACACAAGGCTTTTTGCCAATAACCACCGTGACAGAAATGCAGTTGACAGGAGCGGGAACATTATACCTGGTACTGTTGTAGATTCAAAGATATGCCACCCGACAGAGTTTGATTTCTATCTTTGTAGCCATGCCGGCATACAGGGTACGAGCCGTCCAGCTCACTACCATGTTCTATGGGACGAGAACAAATTCACAGCCGATGCGCTGCAGTCTTTGACCAACAACCTCTGCTATACATATGCAAGGTGCACGCGTTCCGTCTCCATCGTTCCCCCTGCATATTATGCACATTTGGCAGCTTTCCGTGCTCGATTTTATATGGAGCCGGAGACATCTGACGGTGGTTCAGTAACAAGTGGGGCTGCTGGTGGCAGAGGGGGTGGTGCAGGAGCTGCTGGAAGGAACACCCGAGCCCCAAGTGCTGGTGCTGCTGTTAGACCTCTTCCTGCGCTCAAGGATAATGTGAAGAGGGTTATGTTCTACTGC (서열 번호: 314) 및
TGCACATTTGGCAGCTTTCCGTGCTCGGTTTTACATGGAGCCAGAGACATCTGATAATGGATCAGTCACAAGCGCAGCTGCTTCAAACAGAGGAGGTTTAGGAGCTATGGGAAGGAGCACGCGAGCACCAGGTGCTGGTGCTGCTGTAAGGCCCCTTCCTGCTCTCAAGGAGAATGTTAAGAGGGTTATGTTTTATTGT (서열 번호: 315)을 기초로 하는, 내인성 니코티아나 벤타미아나 아르고나우트-1 (AGO1) 유전자에 대해 설계하였다.
니코티아나 벤타미아나 식물을 실시예 12에 기술된 것과 유사한 과정을 사용하여 처리하였다. 폴리뉴클레오타이드 용액(또는 AGO1의 경우에 혼합된 폴리뉴클레오타이드)을 5 밀리리터의 인산나트륨, pH 6.8 중 0.01% (v/v) Silwet L-77 및 2% (w/v) 황산암모늄 속에서 제조하였다. 식물당 2개의 완전히 확장된 잎을 ddH2O를 사용하여 새로이 제조한 0.1% Silwet L-77 용액 내로 수초 동안 침지시키고 건조되도록 하였다. 약 30분 후, 20 마이크로리터의 폴리뉴클레오타이드 용액을 각각의 2개의 예비 처리된 잎에 적용하였다. PDS의 경우, 각각의 5개 식물에게 25나노몰의 PDS 안티-센스 폴리뉴클레오타이드 (서열 번호: 34)를 제공하였으며; AGO1의 경우, 각각의 5개 식물에 50나노몰의 각각의 14 AGO1 안티-센스 폴리뉴클레오타이드 (서열 번호: 300-313)을 제공하였고; PDS 및 AGO 조합된 처리의 경우, 각각의 5개 식물에게 25나노몰의 PDS 안티-센스 폴리뉴클레오타이드 (서열 번호: 34) 및 50나노몰의 각각의 14개의 AGO1 안티-센스 폴리뉴클레오타이드(서열 번호: 300-313)를 별도의 잎에 적용하였다. 쌍을 이룬 대조군 식물을 완충액(5 밀리몰 인산나트륨, pH 6.8 중 0.01% (v/v) Silwet L-77 및 2% (w/v) 황산암모늄)으로 처리하였다. AGO1 안티-센스 폴리뉴클레오타이드로 처리된 식물과 완충액 만으로 처리된 식물 사이에 차이는 관찰되지 않았다. PDS 안티-센스 폴리뉴클레오타이드 및 별도로 적용된 AGO1 안티-센스 폴리뉴클레오타이드 둘다로 처리한 식물은 전신계적 표백을 나타내지 않았으며, 이는, AGO1의 억제가 사일런싱 시그날의 전신계적 확산을 차단하였음을 나타낸다.
실시예 34
본 실시예는 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 또는 표적 내인성 유전자내 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열에 대해 본질적으로 동일하거나 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 성장하는 식물 폴리뉴클레오타이드의 잎 위에 국소 적용시킴을 포함하는 성장하는 식물에서 표적 내인성 유전자의 전신계적 조절을 유도하는 방법을 설명하며, 당해 방법에 의해 폴리뉴클레오타이드는 성장하는 식물의 내부에 침투하여 표적 내인성 유전자의 전신계적 조절을 유도한다. 보다 구체적으로, 당해 실시예는 내인성 제아 마이스(Zea mays) 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 유전자의 전신계적 조절을 적어도 일시적으로 유도하기 위한 표면활성제 및 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의 용도를 설명한다.
내인성 제아 마이스 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 유전자의 게놈 서열은, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 306번에 위치한 5' 해독되지 않은 영역 및 뉴클레오타이드 위치 3490 내지 3907번에 위치한 3' 해독되지 않은 영역을 갖는,
TAAAAACTATTGGCTCGTTGGCAGTGGCTTCCTGGAGAGTAAAGGAGACCGAGAGGATGGTTGCGATCCGGACGGAGCTAACCAAGGTAAGGCTACATACTTCACATGTCTCACGTCGTCTTTCCATAGCTCGCTGCCTCTTAGCGGCTTGCCTGCGGTCGCTCCATCCTCGGTTGCTGTCTGTGTTTTCCACAGCTGGGAGCATCTGTTGAGGAAGGGCCGGACTACTGCATCATCACGCCGCCGGAGAAGCTGAACGTGACGGCGATCGACACGTACGACGACCACAGGATGGCCATGGCCTTCTCCCTTGCCGCCTGTGCCGAGGTCCCCGTGACCATCCGGGACCCTGGGTGCACCCGGAAGACCTTCCCCGACTACTTCGATGTGCTGAGCACTTTCGTCAAGAATTAATAAAGCGTGCGATACTACCACGCAGCTTGATTGAAGTGATAGGCTTGTGCTGAGGAAATACATTTCTTTTGTTCTGTTTTTTCTCTTTCACGGGATTAAGTTTTGAGTCTGTAACGTTAGTTGTTTGTAGCAAGTTTCTATTTCGGATCTTAAGTTTGTGCACTGTAAGCCAAATTTCATTTCAAGAGTGGTTCGTTGGAATAATAAGAATAATAAATTACGTTTCAGTGGCTGTCAAGCCTGCTGCTACGTTTTAGGAGATGGCATTAGACATTCATCATCAACAACAATAAAACCTTTTAGCCTCAAACAATAATAGTGAAGTTATTTTTTAGTCCTAAACAAGTTGCATTAGGATATAGTTAAAACACAAAAGAAGCTAAAGTTAGGGTTTAGACATGTGGATATTGTTTTCCAT (서열 번호: 316)로 확인되었다. EPSPS cDNA 서열은,
TGAAGTTATTTTTTAGTCCTAAACAAGTTGCATTAGGATATAGTTAAAACACAAAAGAAGCTAAAGTTAGGGTTTAGACATGTGGATATTGTTTTCCAT (서열 번호: 317)로 확인되었다. 240개 염기쌍 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드를 EPSPS cDNA 서열의 937 내지 1176번 뉴클레오타이드 위치에 위치한 240개 뉴클레오타이드 분절에 상응하는 DNA 서열:
TACTTGAGTGCCTTGCTGATGGCTGCTCCTTTGGCTCTTGGGGATGTGGAGATTGAAATCATTGATAAATTAATCTCCATTCCGTACGTCGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGTGAAAGCAGAGCATTCTGATAGCTGGGACAGATTCTACATTAAGGGAGGTCAAAAATACAAGTCCCCTAAAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGCAAGCTATTTCTTG (서열 번호: 318)에 상응하는 단일가닥를 사용하여 설계하였다.
제아 마이스[가스페(Gaspe)] 종자를 발아지 위에서 발아시켰다. 묘목을 4인티 화분으로 이전시키고 식물을 성장 체임버 속에서 성장시켰다. 3개의 17일된 식물에 폴리뉴클레오타이드를 국소 처리하고 3개 식물을 대조군으로 사용하였다. 각각의 식물의 2개의 보다 작은 잎을 표지한 후 0.1% Silwet L-77의 용액 속에 침지시켜 예비 처리하였다. 표면활성제 예비 처리 후 약 30분 째에, 20 마이크로리터의 처리 용액을 2개의 예비 처리된 잎 각각의 상부 측면에 적용하였다. 처리 용액은 100 마이크로리터의 2X 완충액 용액, 90 마이크로리터의 물, 10 마이크로리터의 EPSPS dsRNA(서열 번호: 318에 상응하는 단일가닥 지님)의 4.6 마이크로그램/마이크로리터 용액의 혼합물로 이루어지며; 2X 완충액 용액은 200 마이크로리터의 0.1% Silwet L-77, 200 마이크로리터 50 밀리몰 인산나트륨, 146 마이크로리터 34% 인산암모늄, 및 454 마이크로리터 물의 혼합물이었다. 처리 후 8일째에, 3개의 폴리뉴클레오타이드 처리된 식물 중 2개는 손상되거나 사멸한 정단 잎(유사한 EPSPS 폴리뉴클레오타이드 처리된 니코티아나 벤타미아나 식물에서 관찰된 표현형과 유사함)을 지니면서 발육을 방해받은 반면, 3개의 대조군 식물 모두는 정상적인 성장 및 형태학을 가졌다(도 37).
실시예 35
폴리뉴클레오타이드 전달제로서 또는 공지된 폴리뉴클레오타이드 전달제의 향상제로서 상이한 물질(염, 킬레이트제, 습윤제 및 폴리아민 포함)의 효능을 조사하였다. 황산암모늄은 폴리뉴클레오타이드에 대한 식물의 침투능을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(참조: 예를 들면, 실시예 13). 표 26은 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물에서 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드(RNA)의 1% Silwet L-77 분무 용액에 대한 첨가제로서 황산암모늄 및 EDTA의 제초 활성(잡초 방제/사멸 퍼센트로서, 및 식물 높이로서 나타냄)에 있어서의 효과를 나열한다. 당해 특수 실험에서, 0.004%에서 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 분무 용액 속에서 2% 황산암모늄과 유사하게 작용하며, 폴리뉴클레오타이드의 효능을 향상시키고 글리포세이트의 제초 활성을 강화시키는 것으로 밝혀졌다.
Figure pct00041
표 27은 글리포세티트 내성 팔머 아마란쓰 식물에서 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드(RAN)의 1% Silwet L-77 분무 용액에 대한 첨가제로서 무기 염(염화나트륨, 황산나트륨, 황산암모늄, 염화암모늄) 및 유기 염(테트라메틸암모늄 클로라이드, 테트라에틸암모늄 클로라이드, 테트라프로필암모늄 브로마이드 및 테트라부틸포스포늄 브로마이드)을 포함하는 각종 염의 제초 활성(잡초 방제/사멸의 퍼센트로서, 및 식물 높이로서 나타냄)에 있어서의 효과를 나열한다. 당해 특수 실험에서, 염화암모늄 및 테트라부틸포스포늄 브로마이드는 분무 용액 속에서 황산암모늄과 유사하게 작용하여, 폴리뉴클레오타이드의 효능을 향상시키고 글리포세이트의 제초 활성을 강화시키는 것으로 밝혀졌다.
Figure pct00042
표 28은 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물에서 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드 (RNA)의 제초 활성(잡초 방제/사멸의 퍼센트로서, 및 식물 높이로서 나타냄)에 있어서 습윤제 글리세린의 효과를 나열한다. 글리세린은 폴리뉴클레오타이드의 효능을 향상시키고, 글리포세이트의 제초 활성을 강화시키는 것으로 밝혀졌다.
Figure pct00043
도 38은 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물에 있어서 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드 (RNA)의 제초 활성(잡초 방제/사멸의 퍼센트로서, 및 식물 높이로서 나타냄)에 대한 다양한 글리포세이트 역이온의 효과를 묘사한다. 0.5% Silwet L-77 중 EPSPS 폴리뉴클레오타이드 (IDT [1] (서열 번호: 83-84), IDT [2] (서열 번호: 85-86), IDT [3] (서열 번호: 87-88), 및 IDT [4] (서열 번호: 89-90)), 10 밀리몰 인산나트륨 완충액, pH 6.8 중 2% 황산암모늄과, 0.2% Roundup? WeatherMAX? 담체(탈로우아민 (16-18C) 및 코코아민(12-14C)의 55:45 비의 MON56151 탈로우아민 표면활성제 배합물) 및 헥타르당 글리포세이트 염들 중 하나의 1682 g 산 당량의 혼합물; 16개 카피의 EPSPS를 함유하는 4 내지 6 인티의 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰의 3개 복제물 상에서 밀리 분무(Milli spray)에 의한 215 리터/에이커에서 K+ 글리포세이트, 이소프로필암모늄 + 글리포세이트 또는 모노에탄올암모늄 + 글리포세이트. 식물 높이는 글리포세이트 처리 후 21일째에 기록하였다. 결과(잡초 방제/사멸의 퍼센트로서, 및 식물 높이로서 나타냄)는 표 29에 제공된다. 글리포세이트의 이소프로필암모늄 및 모노에탄올암모늄 염을 칼륨 염과 비교하여 보다 우수한 제초 활성을 제공하였다.
Figure pct00044
글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물에서 국소 적용된 폴리뉴클레오타이드(RNA)의 제초 활성에 대한 폴리아민 양이온 스페르민 (N,N'-비 스(3-아미노프로필)부탄-1,4-디아민) 및 스페르민 (N-(3-아미노프로필)부탄-1,4-디아민)의 효능을 조사하였다. 폴리뉴클레오타이드 용액을 실시예 1에서 기술한 등량의 4개의 올리고뉴클레오타이드-크기의 "짧은"dsRNA 분자의 혼합물을 사용하여 제조하였으며, 당해 분자는 도 1에서 밑줄친 뉴클레오타이드에 의해 나타낸 바와 같이, 14 내지 38번 위치(짧은 dsRNA-1), 153 내지 177번 위치(짧은 dsRNA-2), 345 내지 369번 위치(짧은 dsRNA-3), 및 1105 내지 1129번 위치(짧은 dsRNA-4)에서 팔머 아마란쓰 EPSPS 유전자(서열 번호: 1)로부터 전사된 mRNA에 대해 하이브리드화하도록 설계된 안티-센스 쇄를 가지며; dsRNA는 안티-센스 쇄의 3' 말단에서 2개의 뉴클레오타이드 오우버행을 가졌고, 센스 쇄의 3' 말단에서 말단 뉴클레오타이드로서 2개의 데옥시뉴클레오타이드를 가졌다. dsRNA 폴리뉴클레오타이드 용액은 10 밀리몰 인산나트륨(pH 6.8) 완충액 중의 1 또는 10 밀리몰 스페르민 또는 스페르미딘 또는 2% 황산암모늄을 사용하여 제조하였다. 대조군 용액(폴리뉴클레오타이드를 함유하지 않음)은 10 밀리몰 인산나트륨(pH 6.8) 완충액 중의, 1 또는 10 밀리몰 스페르민 또는 스페르미딘 또는 2% 황산암모늄을 사용하여 제조하였다. 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰 식물 (33, 36, 또는 57개 카피 EPSPS를 1% Silwet L-77을 사용하여 예비-분무하였다. dsRNA 폴리뉴클레오타이드 용액(11.6 그람/에이커) 또는 완충액 용액을 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰의 4개의 보다 작은 완전히 확장된 잎 위에 소적으로서 피펫팅하여 적용하였다. 폴리뉴클레오타이드 처리 후 2일 째에 식물을 글리포세이트(헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 3360 g의 산 당량)로 분무하였다. 식물을 글리포세이트 처리 후 14일 째에 사진을 찍고; 결과를 도 39에 나타낸다. dsRNA 및 10 밀리몰 스페르민을 사용한 처리에 이어서 글리포세이트 처리로 33개-카피의 EPSPS를 가진 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰가 사멸하였고 36개-카피의 EPSPS를 가진 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰가 심각하게 손상되었고 발육정지되었다. 10 mM 스페르미딘 만을 사용한 처리는 33개-카피의 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰를 발육정지시켰다. 당해 특수 실험에서, 1 또는 10 밀리몰에서 스페르민 또는 또한 스페르미딘 및 2% 황산암모늄은 수행하지 않았다.
실시예 36
폴리뉴클레오타이드 전달제로서 상이한 표면활성제의 효능을 글리포세이트 내성 팔머 아마란쓰에 적용된 폴리뉴클레오타이드 분무 용액 속에서 시험하였다. 브레이크-트루(Break-Thru) 표면활성제를 업자(Evonik Industries)로부터 입수하고; Silwet 표면활성제는 업자(Momentive)로부터 입수하였다. 분무 용액을 분무하는 날에 제조하였다. EPSPS 폴리뉴클레오타이드 (IDT [1] (서열 번호: 83 내지 84), IDT [3] (서열 번호: 87 내지 88), 및 IDT [4] (서열 번호: 89 내지 90))의 혼합물을 분무 용액에 분무하기 15 내지 50분 전에 가하고 1- 내지 2-밀리리터를 통상의 저-사멸-용적("밀리") 분무기를 사용하여 절단물로부터 성장시킨 1/4인치의 글리포세이트 내성 (R-22) 팔머 아마란쓰 식물에 적용하였다. 10 내지 225 마이크로그람의 총 폴리뉴클레오타이드를 각각의 식물에 적용하였으며, 실험에 따라; 통상적으로 23 마이크로그람의 총 폴리뉴클레오타이드를 식물당 적용하였다. 처리된 식물을 26.7/21.1 ℃ 또는 29.4/21.1℃ 14/10 시간 온도 및 보충적인 광 스케쥴로 설정된 온실 속에 위치시켰다. 2 내지 3일 후, 식물에 글리포세이트("2X Wmax" 또는 헥타르당 Roundup? WeatherMAX? 상표명 제초제의 1682 g의 산 당량)를 정규의 분무기(10 갈론/에이커)로 분무하고 온실로 돌려보냈다. 분무되지 않은 처리에 대한 방제량(가지적인 손상), 식물 높이 및 팔머 아마란쓰의 사진을 글리포세이트 처리 후 21일까지 상이한 시간 간격에서 수집하였다. 새로운 중량의 상기-토양 식물 물질을 마지막 싯점에 수집하였다. 0 내지 3의 전체 식물 손상 점수를 방제, 높이, 새로운 중량 및 가시적인 식물 사진의 조합된 분석을 기초로 하여 각각의 처리에 제공하였으며, 여기서 "3"은 강력한 제초 활성이며, "2"는 중간 활성이고, "1"은 약한 활성이며 "0"은 글리포세이트 만을 사용한 처리에 의해 유발된 어떠한 관찰된 손상에 대한 교정 후 관찰된 활성이 없다는 것이며; 결과는 표 30에 나타낸다.
상이한 표면활성제의 물리적 특성을 또한 조사하여 표 30에 나열한다. 첨가된 70 밀리리터의 표면활성제 용액(EPSPS 폴리뉴클레오타이드 (IDT [2] (서열 번호: 85-86), 0.09 밀리그람/밀리리터)의 존재 또는 부재하에, 2% 황산암모늄, 완충액 (20 밀리몰 인산칼륨, pH 6.8)을 함유하는 수용액 중 0.5% 표면활성제)을 측정과 동일한 날에 제조하였다. 역학적 표면 장력을 주위 실온(22 내지 23℃)에서 Kruss BP100 장력계 위에서 표면 장력 대 표면 노화를 플롯팅하는 최대 버블압 방법((maximum bubble pressure method)을 사용하여 측정하였다. 장치는 표면을 자동적으로 검출하고 10mm의 깊이로 모세관을 침지시키도록 설정하였다. 3개의 표면 노화에 대한 표면 장력 측정(약 20, 500 및 1250 ms)을 기록하였다. 표면 장력(dyne/cm)은 정적 표면 장력의 근사치로서 1250ms 간격에서 기록하고 20 내지 500 ms 사이의 변화는 역학적 표면 장력의 추정치로 보고하였다. 표면활성제에 대한 친수성-친지성 균형(HLP) 값은 표면활성제 참조물 및 생성물 정보로부터 입수하였다.
Figure pct00045
SEQUENCE LISTING <110> Sammons, Robert D. Ivashuta, Sergey I. Liu, Hong Wang, Dafu Feng, Paul C.C. Kouranov, Andrei Y. Andersen, Scott E. <120> POLYNUCLEOTIDE MOLECULES FOR GENE REGULATION IN PLANTS <130> 38-21(56855)0000/PCT <140> null <141> 2011-03-08 <150> 61/311,762 <151> 2010-03-08 <150> 61/349,807 <151> 2010-05-28 <150> 61/381,556 <151> 2010-09-10 <160> 320 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1557 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 1 atggctcaag ctactaccat caacaatggt gtccatactg gtcaattgca ccatacttta 60 cccaaaaccc agttacccaa atcttcaaaa actcttaatt ttggatcaaa cttgagaatt 120 tctccaaagt tcatgtcttt aaccaataaa agagttggtg ggcaatcatc aattgttccc 180 aagattcaag cttctgttgc tgctgcagct gagaaacctt catctgtccc agaaattgtg 240 ttacaaccca tcaaagagat ctctggtact gttcaattgc ctgggtcaaa gtctttatcc 300 aatcgaatcc ttcttttagc tgctttgtct gagggcacaa cagtggtcga caacttgctg 360 tatagtgatg atattcttta tatgttggac gctctcagaa ctcttggttt aaaagtggag 420 gatgatagta cagccaaaag ggcagtcgta gagggttgtg gtggtctgtt tcctgttggt 480 aaagatggaa aggaagagat tcaacttttc cttggtaatg caggaacagc gatgcgccca 540 ttgacagctg cggttgccgt tgctggagga aattcaagtt atgtgcttga tggagtacca 600 agaatgaggg agcgccccat tggggatctg gtagcaggtc taaagcaact tggttcagat 660 gtagattgtt ttcttggcac aaattgccct cctgttcggg tcaatgctaa aggaggcctt 720 ccagggggca aggtcaagct ctctggatcg gttagtagcc aatatttaac tgcacttctc 780 atggctactc ctttgggtct tggagacgtg gagattgaga tagttgataa attgatttct 840 gtaccgtatg ttgaaatgac aataaagttg atggaacgct ttggagtatc cgtagaacat 900 agtgatagtt gggacaggtt ctacattcga ggtggtcaga aatacaaatc tcctggaaag 960 gcatatgttg agggtgatgc ttcaagtgct agctacttcc tagccggagc cgccgtcact 1020 ggtgggactg tcactgtcaa gggttgtgga acaagcagtt tacagggtga tgtaaaattt 1080 gccgaagttc ttgagaagat gggttgcaag gtcacctgga cagagaatag tgtaactgtt 1140 actggaccac ccagggattc atctggaaag aaacatctgc gtgctatcga cgtcaacatg 1200 aacaaaatgc cagatgttgc tatgactctt gcagttgttg ccttgtatgc agatgggccc 1260 accgccatca gagatgtggc tagctggaga gtgaaggaaa ccgaacggat gattgccatt 1320 tgcacagaac tgagaaagct tggggcaaca gttgaggaag gatctgatta ctgtgtgatc 1380 actccgcctg aaaagctaaa ccccaccgcc attgaaactt atgacgatca ccgaatggcc 1440 atggcattct ctcttgctgc ctgtgcagat gttcccgtca ctatccttga tccgggatgc 1500 acccgtaaaa ccttcccgga ctactttgat gttttagaaa agttcgccaa gcattga 1557 <210> 2 <211> 1761 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 2 atgccccaaa tcggacttgt atctgctgtt aatttgagag tccaaggtaa ttcagcttat 60 ctttggagct cgaggtcttc gttgggaact gaaagtcaag atgtttgctt gcaaaggaat 120 ttgttatgtt ttggtagtag cgactccatg gggcataagt taaggattcg tactccaagt 180 gccacgaccc gaagattgac aaaggacttt aatcctttaa aggtagtctg cattgattat 240 ccaagaccag agctagacaa tacagttaac tatttggagg cggcgttatt atcatcatcg 300 tttcgtactt cctcacgccc aactaaacca ttggagattg ttattgctgg tgcaggtttg 360 ggtggtttgt ctacagcaaa atatctggca gatgctggtc acaaaccgat attgctggag 420 gcaagagatg tcctaggtgg gaaggtagct gcatggaaag atgatgatgg agattggtac 480 gagactgggt tgcacatatt ctttggggct tacccaaata tgcagaacct gtttggagaa 540 ctagggattg atgatcggtt gcagtggaag gaacattcaa tgatatttgc gatgcctaac 600 aagccagggg agttcagccg ctttgatttt cctgaagctc ttcctgcgcc attaaatgga 660 attttggcca tactaaagaa caacgaaatg cttacgtggc ccgagaaagt caaatttgct 720 attggactct tgccagcaat gcttggaggg caatcttatg ttgaagctca agacggttta 780 agtgttaagg actggatgag aaagcaaggt gtgcctgata gggtgacaga tgaggtgttc 840 attgccatgt caaaggcact taacttcata aaccctgacg agctttcgat gcagtgcatt 900 ttgattgctt tgaacagatt tcttcaggag aaacatggtt caaaaatggc ctttttagat 960 ggtaaccctc ctgagagact ttgcatgccg attgtggaac atattgagtc aaaaggtggc 1020 caagtcagac taaactcacg aataaaaaag atcgagctga atgaggatgg aagtgtcaaa 1080 tgttttatac tgaataatgg cagtacaatt aaaggagatg cttttgtgtt tgccactcca 1140 gtggatatct tgaagcttct tttgcctgaa gactggaaag agatcccata tttccaaaag 1200 ttggagaagc tagtgggagt tcctgtgata aatgtccata tatggtttga cagaaaactg 1260 aagaacacat ctgataatct gctcttcagc agaagcccgt tgctcagtgt gtacgctgac 1320 atgtctgtta catgtaagga atattacaac cccaatcagt ctatgttgga attggtattt 1380 gcacccgcag aagagtggat aaatcgtagt gactcagaaa ttattgatgc tacaatgaag 1440 gaactagcga agcttttccc tgatgaaatt tcggcagatc agagcaaagc aaaaatattg 1500 aagtatcatg 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agatgggccc accgccatca gagatgtggc tagctggaga gtgaaggaaa ccgaacggat 60 gattgccatt tgcacagaac tgagaaagct tggggcaaca gttgaggaag gatctgatta 120 ctgtgtgatc actccgcctg aaaagctaaa ccccaccgcc attgaaactt atgacgatca 180 ccgaatggcc atggcattct ctcttgctgc ctgtgcagat gttcccgtca ctatccttga 240 tccgggatgc 250 <210> 50 <211> 257 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 50 ctcttgctgc ctgtgcagat gttcccgtca ctatccttga tccgggatgc acccgtaaaa 60 ccttcccgga ctactttgat gttttagaaa agttcgccaa gcattgatga gtagctatat 120 acgagatcct taaattgtac gccgaaggtt ttgatttgag tctaatagta gataaaaggc 180 tataaataaa ctggctttct gcttgagtaa ttatgaaatt ctttgtatta tgtttgtgag 240 atttgaagta gcttata 257 <210> 51 <211> 273 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 51 taattatgaa attctttgta ttatgtttgt gagatttgaa gtagcttata aattacaatg 60 tactaaagtc tagaaataag ttatgtatct tttaaatcaa tgagaaatgc atacttgaaa 120 ggcttgacct tgtatttgtg acctaaagag tactaacttt ggagtttcca actcatttgt 180 ttatctcatt tttttttaat ttttgattta aattgtttat ttttatgagt aatcatgtat 240 ctttcttatt ctaaccaaat gtaatactcc ttc 273 <210> 52 <211> 301 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 52 tatgagtaat catgtatctt tcttattcta accaaatgta atactccttc caactctctt 60 taaacgtcca cactctgggc acagagtgta atagtgtggt ggttggagtc ttttaagtga 120 ttataataat tgtaaatgtg gtagttagaa tattttaagt aatgtaggtg gggtattatg 180 gtcttgttga acataggata tttaggtaaa aaatctatgc aaaaaaagga aagtaagcaa 240 ataaagcgaa ttgacctgaa aagaaaagtg gacatgtata gtgagttgga ggaagtattt 300 t 301 <210> 53 <211> 1710 <212> DNA <213> Lactuca sativa <400> 53 atgtctctgt ttggaaatgt ttctgccatt aactcaagtg gaaagtgtat agtaatgaat 60 ctttcaagca cacaaatcac ttcaagagat tgtttcaaga ttacctcagg gcaaaaagat 120 gttttgtcat ttggatgctg tgatgctatg ggtaacagat tgcaattccc aagtgctcgt 180 tcttttacac caagatcaaa gaagaatgtc tcccctctaa aggtagtttg tgttgattat 240 ccaagaccag atcttgataa cacatctaat ttcttggaag ctgctcactt gtcttcaacc 300 ttcagaactt ccccacgccc atctaagcca ttgaagattg taattgctgg tgcaggttta 360 gctggtttat caactgctaa gtatttagct gatgcaggtc acaagccaat tttactagaa 420 gcaagagatg ttcttggtgg aaaggtggca gcttggaaag atgatgatgg agattggtat 480 gagacaggtt tacacatatt ctttggagct tacccaaatg tacaaaattt atttggagag 540 ctaggaatta atgatagatt acagtggaag gagcattcta tgatatttgc aatgccaaat 600 aagcctggag aatttagtag gtttgacttc ccagatgttt tacctgcacc attgaatgga 660 atttttgcta tattgaggaa caatgaaatg ctgacgtggc ctgagaaagt gaagtttgca 720 attgggctgt tgcctgcaat gttaggtgga caggcttatg ttgaggccca agatgggctt 780 agtgttcagg actggatgag aaagcaaggt atacctgatc gagttactac tgaagtgttt 840 attgcaatgt caaaagcatt aaactttata aatccagatg aactttcaat gcaatgtatt 900 ctcattgctc taaaccgttt tcttcaggaa aagcatggtt ccaagatggc atttttagat 960 gggagcccac cagaaagact ttgcaagcca attgttgacc acatcgagtc actcggtggc 1020 caagtcagag tcaactcacg aatacaaaaa attgagttaa acaaagacgg aactgtccgg 1080 aactttctat tgagtgatgg gaatgttcta gaagctgatg cttatgtttt cgctacccct 1140 gttgacattc tcaagcttct tttacccgaa gaatggaaac caattccata tttcaaaaaa 1200 ttagagaagt tagtcggtgt tcctgttata aacgttcata tatggtttga cagaaagctg 1260 aaaaacacat atgatcactt acttttcagt aggtcacctc tgctgagtgt gtatgctgac 1320 atgtcagtga catgtaagga atattatgat ccgaataagt caatgttgga gttggttctt 1380 gctccagctg aggaatggat ttcaagaagt gacactgata ttattgatgc aacaatgagt 1440 gaactttcaa ggctttttcc tgatgaaatt gcagctgatc aaagtaaagc aaaaatcttg 1500 aaatataaag ttgttaaaac accaaggtct gtttataaaa ctgttccaga ttgtgaacca 1560 tgtcgacccc tacaaagatc tccaattcaa ggattttatt tatctggtga ttatactaaa 1620 caaaagtatt tggcttcaat ggggggtgct gttttatctg gaaaaatttg tgcacaagct 1680 attttacaag attatgagat gcttgctaca 1710 <210> 54 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 54 taatacgact cactataggg tttggagctt acccaaatgt ac 42 <210> 55 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 taatacgact cactataggg aggccacgtc agcatttcat tgttc 45 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 56 ccattcaatg gtgcaggtaa aac 23 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 57 catagaatgc tccttccact g 21 <210> 58 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 caaataaatt ttgtacattt gggtaagctc caa 33 <210> 59 <211> 2349 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 59 gggtttatct cgcaagtgtg gctatggtgg gacgtgtcaa attttggatt gtagccaaac 60 atgagatttg atttaaaggg aattggccaa atcaccgaaa gcaggcatct tcatcataaa 120 ttagtttgtt tatttataca gaattatacg cttttactag ttatagcatt cggtatcttt 180 ttctgggtaa ctgccaaacc accacaaatt tcaagtttcc atttaactct tcaacttcaa 240 cccaaccaaa tttatttgct taattgtgca gaaccactcc ctatatcttc taggtgcttt 300 cattcgttcc gagtaaaatg cctcaaattg gacttgtttc tgctgttaac ttgagagtcc 360 aaggtagttc agcttatctt tggagctcga ggtcgtcttc tttgggaact gaaagtcgag 420 atggttgctt gcaaaggaat tcgttatgtt ttgctggtag cgaatcaatg ggtcataagt 480 taaagattcg tactccccat gccacgacca gaagattggt taaggacttg gggcctttaa 540 aggtcgtatg cattgattat ccaagaccag agctggacaa tacagttaac tatttggagg 600 ctgcattttt atcatcaacg ttccgtgctt ctccgcgccc aactaaacca ttggagattg 660 ttattgctgg tgcaggtttg ggtggtttgt ctacagcaaa atatttggca gatgctggtc 720 acaaaccgat actgctggag gcaagggatg ttctaggtgg aaaggtagct gcatggaaag 780 atgatgatgg agattggtac gagactggtt tgcatatatt ctttggggct tacccaaata 840 ttcagaacct gtttggagaa ttagggatta acgatcgatt gcaatggaag gaacattcaa 900 tgatatttgc aatgccaagc aagccaggag aattcagccg ctttgatttc tccgaagctt 960 tacccgctcc tttaaatgga attttagcca tcttaaagaa taacgaaatg cttacatggc 1020 cagagaaagt caaatttgca attggactct tgccagcaat gcttggaggg caatcttatg 1080 ttgaagctca agatgggata agtgttaagg actggatgag aaagcaaggt gtgccggaca 1140 gggtgacaga tgaggtgttc attgctatgt caaaggcact caactttata aaccctgacg 1200 aactttcaat gcagtgcatt ttgatcgcat tgaacaggtt tcttcaggag aaacatggtt 1260 caaaaatggc ctttttagat ggtaatcctc ctgagagact ttgcatgccg attgttgaac 1320 acattgagtc aaaaggtggc caagtcagac tgaactcacg aataaaaaag attgagctga 1380 atgaggatgg aagtgtcaag agttttatac tgagtgacgg tagtgcaatc gagggagatg 1440 cttttgtgtt tgccgctcca gtggatattt tcaagcttct attgcctgaa gactggaaag 1500 agattccata tttccaaaag ttggagaagt tagtcggagt acctgtgata aatgtacata 1560 tatggtttga cagaaaactg aagaacacat atgatcattt gctcttcagc agaagctcac 1620 tgctcagtgt gtatgctgac atgtctgtta catgtaagga atattacaac cccaatcagt 1680 ctatgttgga attggttttt gcacctgcag aagagtggat atctcgcagc gactcagaaa 1740 ttattgatgc aacgatgaag gaactagcaa cgctttttcc tgatgaaatt tcagcagatc 1800 aaagcaaagc aaaaatattg aagtaccatg ttgtcaaaac tccgaggtct gtttataaaa 1860 ctgtgccagg ttgtgaaccc tgtcggcctt tacaaagatc cccaatagag gggttttatt 1920 tagccggtga ctacacgaaa cagaaatact tggcttcaat ggaaggcgct gtcttatcag 1980 gaaagctttg tgctcaagct attgtacagg attatgagtt acttgttgga cgtagccaaa 2040 agaagttgtc ggaagcaagc gtagtttagc tttgtggtta ttatttagct tctgtacact 2100 aaatttatga tgcaagaagc gttgtacaca acatatagaa gaagagtgcg aggtgaagca 2160 agtaggagaa atgttaggaa agctcctata caaaaggatg gcatgttgaa gattagcatc 2220 tttttaatcc caagtttaaa tataaagcat attttatgta ccactttctt tatctggggt 2280 ttgtaatccc tttatatctt tatgcaatct ttacgttagt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaactcga 2349 <210> 60 <211> 200 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 60 tcgcagcgac tcagaaatta ttgatgcaac gatgaaggaa ctagcaacgc tttttcctga 60 tgaaatttca gcagatcaaa gcaaagcaaa aatattgaag taccatgttg tcaaaactcc 120 gaggtctgtt tataaaactg tgccaggttg tgaaccctgt cggcctttac aaagatcccc 180 aatagagggg ttttatttag 200 <210> 61 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 61 taatacgact cactataggg tcgcagcgac tcagaaatta ttg 43 <210> 62 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 taatacgact cactataggg gtaaaggccg acagggttca caacc 45 <210> 63 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 63 cuaccaucaa caaugguguc c 21 <210> 64 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 64 ggacaccauu guugauggua g 21 <210> 65 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 65 gucgacaacu ugcuguauag u 21 <210> 66 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 66 acuauacagc aaguugucga c 21 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 67 ggucaccugg acagagaaua g 21 <210> 68 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 68 cuauucucug uccaggugac c 21 <210> 69 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 69 aaugccagau guugcuauga c 21 <210> 70 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 70 gucauagcaa caucuggcau u 21 <210> 71 <211> 2827 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 71 atggcaacaa tggcttccct agtgagtttg ggaagctctg gagcaacttg ctcagggcaa 60 ttggaggttt ccttttcatt ggttaagaaa attacattgc ctagaagaaa ttgtagttgc 120 aattttaggc aattaggagg ggggaggaga tggcgttacg tttcggtgtg tagactttct 180 gtcactactg attatgtttc tgagcaagga aatgctgttt ctcttgaaaa tgcatatagt 240 gagagtaaag aagagggtct catcttgaag ccttctccta agccggtttt gaaatccggg 300 tctgatggaa atcggaaatt tggggagagt tcggtggcgt tttcgagtaa tgggaaattg 360 gataatgtag aggagaggaa gaaggttatt gattcattgg atgaggtatt agaaaaggcc 420 gagagattag aaacggcgaa cttacaagca gataatagaa aggatagcac aaatgtaaat 480 aaaccgtctc cgagtgtaag tagttcaacc aatggtaaac ctgtaaataa tttgaacaaa 540 gggaagccta aagctgcgaa gagcgtttgg agaaagggaa atccagtttc tactgtgcaa 600 aaagtagtgc aagaatctcc gaagattgaa aaggttgaga gagtggaagc tcgaacgacc 660 agccaatcgt ctgaaacgat aagaccccca gtgccactac agaggcctga gattaagttg 720 caggcaaagc cttctactgc tcctccaccc atgcctaaga agccggtttt gaaggatgtg 780 gggatgtcct ccagagctga tgggaaggac cagtctgtga aatctaaaga gaggaagcct 840 attctagtgg acaaatttgc caccaagaag gcatcagttg atccgtcgat tgctcaagca 900 gtaattgccc caccaaaacc tgctaaattt ccttctggaa agtttaaaga tgattatcgg 960 aagaagggtc ttgcagctgg tgggccgaag aggcgtatgg tcaatgatga tgatattgaa 1020 atgcatgaag acacttcaga gctcggtctt tctattcctg gtgctgctac ggctcggaaa 1080 ggcaggaaat ggagtaaggc aagtcgcaag gctgccagac gccaagcagc tagagatgcc 1140 gctcctgtta aagtggaaat cttagaggtt gaagaaaagg gcatgtcgac cgaagaatta 1200 gcatacaact tggctattag cgaaggtgaa attcttgggt acctgtattc taaggggata 1260 aaaccagatg gtgtgcaaac tcttgacaag gcaatggtaa agatgatatg tgaaagatat 1320 gacgtggagg ttttggacgc actttctgaa caaatggaag aaatggctcg aaagaaggaa 1380 attttcgacg aagatgacct tgacaagctt gaagataggc ctcctgtgct tactataatg 1440 ggtcatgtag atcatggcaa gacgaccctt ctggattata tacggaagag caaggttgct 1500 gcttctgaag ctggtgggat tacacaaggt attggtgctt ataaagtgga agtaccggtt 1560 gatggcaagt tgctgccttg tgtctttctt gacactcccg gacacgaggc gttcggggca 1620 atgagggctc gtggagcaag agtgacagat attgctatta tagttgtagc tgctgacgat 1680 gggatccgtc ctcaaacaaa tgaagccata gcacatgcaa aagcagctgg tgtacctatt 1740 gtggttgcaa ttaataagat tgacaaggat ggggctaatc cggaccgtgt gatgcaagag 1800 ctttcatcaa ttggtctaat gccagaggat tggggtggtg ataccccaat ggtcaagata 1860 agtgctctaa aaggtgaaaa tgtggacgag ttactcgaga cagccatgct tgtcgccgag 1920 ttgcaagagt taaaggctaa tcctcagagg aacgctaagg gcactgtaat tgaggctggt 1980 cttcataaat caaaaggacc cattgccact tttattgtgc agaatggtac cctcaaacaa 2040 ggggatactg tagtttgtgg ggaagcattt gggaaggttc gtgccctatt tgatcacgga 2100 gggaatcgcg ttgatgaagc tggtccatct attcccgtgc aggttattgg attgaataat 2160 gttccttttg ccggtgatga gttcgaggta gtgagttccc ttgatatagc tcgtgaaaag 2220 gcagaggtcc gtgcagagtc tttacgaaat gagcgtatag ctgctaaggc cggagacgga 2280 aaggttacgc tgtcatcctt ggcatcggct gtttcttcag ggaagatggc tggtttggat 2340 ttgcaccagt taaatatcat tttgaaggtt gatgttcagg gatcaatcga ggcattgagg 2400 caagctctag aagttcttcc tcaagataac gtcactttga agtttctctt acaagcgacc 2460 ggagatgtta ctacaagtga tgttgatctt gcagttgcta gtaaagctat tatcttgggg 2520 ttcaatgtga aggcaccagg ttctgtcgaa aaattagcag ataacaaagg tgttgaaatt 2580 cggctttata aagtcattta tgatctaatt gacgacatgc ggagtgcaat ggaaggaatg 2640 ctagatcccg ttgaggaaca agttgcaatt ggttcagccg aagtgcgggc tacattcagt 2700 agtggtagtg gccgtgtcgc tggatgcatg gtgaccgagg gaaagattac caaaggctgt 2760 gggattcgag tgatacggaa gggaaaaact gtccacgttg gagttcttga ttcgttgcgt 2820 cgagtaa 2827 <210> 72 <211> 200 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 72 tttcgagtaa tgggaaattg gataatgtag aggagaggaa gaaggttatt gattcattgg 60 atgaggtatt agaaaaggcc gagagattag aaacggcgaa cttacaagca gataatagaa 120 aggatagcac aaatgtaaat aaaccgtctc cgagtgtaag tagttcaacc aatggtaaac 180 ctgtaaataa tttgaacaaa 200 <210> 73 <211> 160 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 73 uucgaguaau gggaaauugg auaauguaga ggagaggaag aagguuauug auucauugga 60 ugagguauua gaaaaggccg agagauuaga aacggcgaac uuacaagcag auaauagaaa 120 ggauagcaca aauguaaaua aaccgucucc gaguguaagu 160 <210> 74 <211> 160 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 74 acuuacacuc ggagacgguu uauuuacauu ugugcuaucc uuucuauuau cugcuuguaa 60 guucgccguu ucuaaucucu cggccuuuuc uaauaccuca uccaaugaau caauaaccuu 120 cuuccucucc ucuacauuau ccaauuuccc auuacucgaa 160 <210> 75 <211> 22 <212> DNA 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<212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 99 uauucucugu ccaggugacc uugcaac 27 <210> 100 <211> 27 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 100 guugcaaggu caccuggaca gagaaua 27 <210> 101 <211> 29 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 101 gguauggaca ccauuguuga ugguaguac 29 <210> 102 <211> 29 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 102 gcuaccauca acaauggugu ccauaccac 29 <210> 103 <211> 29 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 103 gaagaauuga ugauugccca ccaacucac 29 <210> 104 <211> 29 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 104 gaguuggugg gcaaucauca auuauucac 29 <210> 105 <211> 27 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 105 gaucacuaua cagcaaguug ucgacac 27 <210> 106 <211> 27 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 106 gucgacaacu ugcuguauag ugaucac 27 <210> 107 <211> 29 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 107 guauucucug uccaggugac cuugcacac 29 <210> 108 <211> 29 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 108 gugcaagguc accuggacag agaauacac 29 <210> 109 <211> 58 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 109 guauggacac cauuguugau gguaguagaa auacuaccau caacaauggu guccauac 58 <210> 110 <211> 58 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 110 aauaauugau gauugcccac caacucugaa aagaguuggu gggcaaucau caauuauu 58 <210> 111 <211> 58 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 111 aucacuauac agcaaguugu cgaccacgaa aguggucgac aacuugcugu auagugau 58 <210> 112 <211> 58 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 112 uauucucugu ccaggugacc uugcaacgaa aguugcaagg ucaccuggac agagaaua 58 <210> 113 <211> 168 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 113 gaucacaaau uugccgguuu augaucaaau acggaacaua agacagauac acuugaacac 60 caugauucgc auugggggug ugguuacucg ucguucugga guauucccuc aguugaugca 120 ggugaaguau gacugcaaua aauguggggc uauccugggu cccuuuuu 168 <210> 114 <211> 168 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 114 aaaaagggac ccaggauagc cccacauuua uugcagucau acuucaccug caucaacuga 60 gggaauacuc cagaacgacg aguaaccaca cccccaaugc gaaucauggu guucaagugu 120 aucugucuua uguuccguau uugaucauaa accggcaaau uugugauc 168 <210> 115 <211> 25 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 115 uuuucuaaua ccucauccaa ugaau 25 <210> 116 <211> 25 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 116 auucauugga ugagguauua gaaaa 25 <210> 117 <211> 25 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 117 uaucugcuug uaaguucgcc guuuc 25 <210> 118 <211> 25 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 118 gaaacggcga acuuacaagc agaua 25 <210> 119 <211> 25 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 119 ggagacgguu uauuuacauu ugugc 25 <210> 120 <211> 25 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 120 gcacaaaugu aaauaaaccg ucucc 25 <210> 121 <211> 25 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 121 uauuuacagg uuuaccauug guuga 25 <210> 122 <211> 25 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 122 ucaaccaaug guaaaccugu aaaua 25 <210> 123 <211> 185 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 123 gacggaaacc cuccagagag gcugugcaug ccuauuguua aacacaucga gucacuaggu 60 ggugaaguua aacuuaacuc ucguauacaa aagauucagu uggaccagag uggaagcgug 120 aagaguuuuu ugcuaaauaa cgggagggaa auacgaggag augccuaugu uuuugccacc 180 ccagu 185 <210> 124 <211> 185 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 124 acuggggugg 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sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 131 tagctcaata tcaaggtcct a 21 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 132 tcataagcac cctctataca c 21 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 133 ttcttaacct cgtcgagatg 20 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 134 atacccgagt atccttgcaa a 21 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 135 tagggcccac ggccttggag t 21 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 136 agcggatata acctcagcta g 21 <210> 137 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 137 cttcgtggcc caacgaatga c 21 <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 138 caagctcggg tccctgcttg c 21 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence 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Synthetic Construct <400> 155 ccacccgaga aacctctcca a 21 <210> 156 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 156 cagtcttgac gagtgattcc t 21 <210> 157 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 157 gttcttcagg gctaaatcgg ga 22 <210> 158 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 158 gttcaagagc ttcaacgaga ac 22 <210> 159 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 159 atacaaactc caacgcgtcc ag 22 <210> 160 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 160 ctcttggaaa gcatcagtac ca 22 <210> 161 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 161 ctagaaagat acccacccaa tt 22 <210> 162 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 162 actagaattc aaacacccac cc 22 <210> 163 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 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<210> 179 <211> 159 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 179 cgcugcaguu ggugaaguag aucccggcaa ggggauuuca cuccgguuuc cacgucuggu 60 ucguauccga gaggauaaau cuccagagga cgccacauca ucugagcagg uggcggauau 120 guacagaucu caagcaaaca auccacaccg caaaaagag 159 <210> 180 <211> 159 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 180 cucuuuuugc gguguggauu guuugcuuga gaucuguaca uauccgccac cugcucagau 60 gauguggcgu ccucuggaga uuuauccucu cggauacgaa ccagacgugg aaaccggagu 120 gaaauccccu ugccgggauc uacuucacca acugcagcg 159 <210> 181 <211> 159 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 181 uaaagauggc ggaaaaaucg acuaugauaa auugauugac aaauucggcu gucagcgacu 60 ugauuuaucg cucauucaga gaauugagcg caucacugcu cguccugcuc auguauuucu 120 ucgccgcaac guuuucuucg cucaccguga uuugaauga 159 <210> 182 <211> 159 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 182 ucauucaaau cacggugagc gaagaaaacg uugcggcgaa gaaauacaug agcaggacga 60 gcagugaugc gcucaauucu cugaaugagc gauaaaucaa gucgcugaca gccgaauuug 120 ucaaucaauu uaucauaguc gauuuuuccg ccaucuuua 159 <210> 183 <211> 150 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 183 ugaagcugau gcugaaggaa aggauauuga ugcuagugaa guaguucgcc caagggugcc 60 auuagaagcu ugccuagcua gcuacucagc uccggaggag gugauggacu ucuacagcac 120 ugcauugaag gcaaaggcaa cugcuacaaa 150 <210> 184 <211> 150 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 184 uuuguagcag uugccuuugc cuucaaugca gugcuguaga aguccaucac cuccuccgga 60 gcugaguagc uagcuaggca agcuucuaau ggcacccuug ggcgaacuac uucacuagca 120 ucaauauccu uuccuucagc aucagcuuca 150 <210> 185 <211> 155 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 185 acaccugccc uaacaucucg ggguuuucuc gaagaagauu uuguuaaagu ggccgaguau 60 uuugaugcug cuguuaagcu ggcucuaaaa aucaaggcug acacaaaagg aacaaaguug 120 aaggacuucg uugccaccuu gcagucuggu guuuu 155 <210> 186 <211> 155 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 186 aaaacaccag acugcaaggu ggcaacgaag uccuucaacu uuguuccuuu ugugucagcc 60 uugauuuuua gagccagcuu aacagcagca ucaaaauacu cggccacuuu aacaaaaucu 120 ucuucgagaa aaccccgaga uguuagggca ggugu 155 <210> 187 <211> 159 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 187 ugaacuacga agcaggcaaa uucuccaaaa guaaaggcau uggaguuuuu gggaaugacg 60 ccaagaauuc uaauauaccu guagaagugu ggagauacua ucugcuaaca aacaggccug 120 agguaucaga cacauuguuc acuugggcgg aucuucaag 159 <210> 188 <211> 159 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 188 cuugaagauc cgcccaagug aacaaugugu cugauaccuc aggccuguuu guuagcagau 60 aguaucucca cacuucuaca gguauauuag aauucuuggc gucauuccca aaaacuccaa 120 ugccuuuacu uuuggagaau uugccugcuu cguaguuca 159 <210> 189 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 189 tcccatctcc cacatgggtt actg 24 <210> 190 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 190 cagtaaccca tgtgggagat ggga 24 <210> 191 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 191 ggctgatgaa attcaagtgc ta 22 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 192 aaactgagct tggaaataat c 21 <210> 193 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 193 gaacccaaaa ttgtcacttt tt 22 <210> 194 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 194 atgcacttgt ttatactctt gtca 24 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 195 atttattagt gttctaaaga a 21 <210> 196 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 196 tgtagtagct tataagatta gctt 24 <210> 197 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 197 gttgtccctt ttatgggtct tt 22 <210> 198 <211> 21 <212> DNA <213> artificial 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tgattagttg 420 catcatacag agagatgaag ggcgaactcc gatgaggcat tcattctatt ggtcagcaga 480 aaaacaatat tatagtgagg agcctttact acgtcatttg gaaccccctc tatctatgta 540 tctcgagctg gtactagtct ctgaaccgat tgcctttctt ctgctttgtt attttgtgtg 600 atatttcgac ttaagtctaa tttacatcgt tttgtacatt tgttatc 647 <210> 226 <211> 738 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 226 ttttgctttt ttactattat ttccttcttt tcaaggattt gagttgttta ttgctgactg 60 cttcctatgt attacccata tgtctctgta taggcattac gggagctgta cctacatcta 120 actcctatac aacgtgtgaa tattgcccgg catcctaatc gccccacttt tcttgaccac 180 gtattcagca tcacagaaaa ggtttctgat ttattataat ttttgtcatt tgtattcact 240 cttcaataaa gtacatccat tatcaatctt tacggaggtt gttcacacaa cttcttgttt 300 cattttgcat aattagtttg tggaactaca tggagatcgt gctggttatg atgaccctgc 360 tatagttact ggccttggta cgatagatgg taggcgttat atgttcattg gtcatcaaaa 420 gggaagaaat acgaaggaaa atattgcacg gaatttcggg atgcctactc ctcatgggta 480 aatgctttac tataatgttt tactttaatt taattaccta tgttatttag gatgaaaatg 540 aatacttttc ttattactat tacttaggtt cctaatgcac aaaaaccgta attattaatg 600 taccctaatg gaattaacac atggtaatta agctctccgc tttgtgtaat taatccaatt 660 ttttagagag tcaaatagtt caggttaaac tagagctttt catacccaaa taataaaacc 720 aagggtaaat ttccaaaa 738 <210> 227 <211> 880 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 227 atgtgatcaa ttaaagaaaa agtctaatta tatgagcccg tctcacagtg acggagctat 60 catagagccc atggggtcac gtgcccttcg gggtttttag aaaaaattca aagtatactt 120 ttctattaat aagagtaaaa atgtaaaatt aatattaaac tcttttgata ataaatactc 180 tctcacttta gtaattttgt cttatttatt tattttatct catgtgttta ataaggtcag 240 ttgacttatt ttgttccatt ttcttttatg gtatgccgta tttaaaattt tagcaagtaa 300 agataaaata gttgttaatc ttacaaataa aactctatcg aaatttcatc cattagttaa 360 tgtccccaaa aagtccgaac tacaaatcga ccactgtcat cacatggtga gatagtctca 420 tataaaacga gttcagttat taaaggaaaa taggaaacac gaaacagtta atttaggcgg 480 ggcctatgta ttatccaaat gtgatactcc agtccacatt actcagtcct tccaattgaa 540 cagttggctt aatctaccaa gcgcgtggcc ataaatgcct ctaacacttt tcaatctctc 600 agataactct cacaccactt atcatcacaa ttcacaatta ctctaattct ttttattcct 660 ttccatgtcg ctaattttct actgattcag gttttattct cagcttttat caattttatt 720 tcatgctttt tatgtcaatt tcttgtttcg cattttgtct tccacttgct gtctgtttta 780 ttaatcaatt ttgtatgatt gttggaataa ttgtatgtat ttttcatgat tttcctctta 840 tggaggttca taatgtattg ctagatttgt ttactttcac 880 <210> 228 <211> 453 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 228 aatttgagcg ggaaaatttt aatatcatta aatagtcttt gctttagtat atagaatagt 60 taaaattaat agtcaaactt attgtaatag catgcactaa tctataataa tcttatcctg 120 aaagctataa taaaattata aaaaaatata tgtgaaaaac taatttgagc gggaaaattt 180 taaccaaggg ctaacacgta tcattaaata gtctttactt tagtatatag aatgataatt 240 aacgatcata aaacaaaatt gtcactttca gtagcaaact tacaaaatga gcagagtacc 300 tcatatcata aaattgcttc tttctcattt gttgtgttgc tctcatttta ggagttcatc 360 gtttatatcg tcgtcttacc actcaatcac ttttagattt attagtagca cttcctcaat 420 ctacagcagc aatttctaca gttcaacaac ctc 453 <210> 229 <211> 3953 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 229 ggaaaattta cctagaataa tccaatttat tcgtgatttt tctacaaatt ccaacttcaa 60 ggggtatttg cctaaagtaa ttaaacttgg ataccccgat gacctgctat agtagataat 120 ttaccagaaa attaaaaatg aaaattaatt taaaattaga gaaaaatttt gaaatttcat 180 ataaaaaatt ttaaataata aaaaaaatat aaattttttt gaacatttta ttttaatcta 240 tcttttttga aaaaataaaa cttagttata gcaagtgatc tggtcaccgg gtttactcta 300 ggaaaatatc cctcaaagtt gagattattc atggttaata aataggtgag attattatag 360 aaaaattacg aataaattgg attattgttg gtaatttttt tttcaaaact atccctagga 420 aggaccttat tagtgattct ccctctactt tggaggagta tattgtggac ttcccatctt 480 ccttaattgt attgtaactt ttaactattg attctttaaa aaaaagaact tataaaattg 540 tagggttaat aaaatctaag attttatcta atttcacttt gattattccg attttgtatt 600 cacattattt taaatgacat tcgtcaaata aaaaaaaata gtttcattgc attccaattt 660 tgttgactag ggggattaaa gaaagaatag tatcaataat cgtaatgtag caagtagtac 720 aaaagaagta tatttcaata tgtcaaactt tgatctcgtt gtaacttgta atttgtacga 780 tgcggtgtga atgacatact tcaccttttt cattatttta tactggtagt gacatgggat 840 tattattgcg atatttgcag taatgaaaat ttttttggtt gttgctttta 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agtttacagg gagatgtaaa gtt 23 <210> 240 <211> 23 <212> DNA <213> Euphorbia heterophylla <400> 240 agtttgcagg gagatgtgaa att 23 <210> 241 <211> 23 <212> DNA <213> Ambrosia trifida <400> 241 agtttacagg gggatgtaaa gtt 23 <210> 242 <211> 23 <212> DNA <213> Abutilon theophrasti <400> 242 agtttgcagg gtgatgtaaa att 23 <210> 243 <211> 23 <212> DNA <213> Xanthium strumarium <400> 243 agtttgcagg gtgatgtgaa att 23 <210> 244 <211> 23 <212> DNA <213> Ipomoea hederacea <400> 244 agtttacagg gggatgttaa gtt 23 <210> 245 <211> 23 <212> DNA <213> Chenopodium album <400> 245 agtttacagg gtgatgtaaa att 23 <210> 246 <211> 23 <212> DNA <213> Digitaria sanguinalis <400> 246 agtttgcagg gtgatgtgaa att 23 <210> 247 <211> 23 <212> DNA <213> Senna obtusifolia <400> 247 agtttacagg gagatgtaaa att 23 <210> 248 <211> 23 <212> DNA <213> Amaranthus rudis/tuberculatus <400> 248 agtttacagg gtgatgtaaa att 23 <210> 249 <211> 23 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 249 agtttacagg gtgatgtaaa att 23 <210> 250 <211> 23 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 250 agtttacagg gtgatgtaaa att 23 <210> 251 <211> 54 <212> DNA <213> Euphorbia heterophylla <400> 251 tcgatgtgaa catgaacaaa atgccagatg tcgctatgac attggctgtg gttg 54 <210> 252 <211> 55 <212> DNA <213> Euphorbia heterophylla <400> 252 tcgatgtgaa tatgaacaaa atgccagatg ttgctatgac attagctgtg gttgc 55 <210> 253 <211> 55 <212> DNA <213> Ambrosia trifida <400> 253 tcgatgttaa catgaacaaa atgccagatg ttgccatgac gcttgcagtc gttgc 55 <210> 254 <211> 55 <212> DNA <213> Abutilon theophrasti <400> 254 ttgatgtcaa catgaacaaa atgccagatg ttgccatgac tctcgctgtt gttgc 55 <210> 255 <211> 55 <212> DNA <213> Xanthium strumarium <400> 255 ttgatgtcaa catgaacaaa atgcctgatg tcgcaatgac tcttgctgtg gttgc 55 <210> 256 <211> 55 <212> DNA <213> Ipomoea hederacea <400> 256 ttgatgtcaa catgaacaaa atgccagatg ttgccatgac tcttgctgta gttgc 55 <210> 257 <211> 55 <212> DNA <213> Chenopodium album <400> 257 ttgatgtcaa catgaacaaa atgccagatg tcgcaatgac tcttgctgtt gttgc 55 <210> 258 <211> 55 <212> DNA <213> Digitaria sanguinalis <400> 258 ttgacgtcaa catgaacaaa atgcctgatg tcgcaatgac tcttgctgtg gttgc 55 <210> 259 <211> 55 <212> DNA <213> Senna obtusifolia <400> 259 ttgatgtcaa catgaacaag atgccagatg ttgccatgac gcttgctgta gttgc 55 <210> 260 <211> 55 <212> DNA <213> Amaranthus rudis/tuberculatus <400> 260 tcgacgtcaa catgaataaa atgccagatg ttgctatgac tcttgcagtt gttgc 55 <210> 261 <211> 55 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 261 tcgacgtcaa catgaacaaa atgccagatg ttgctatgac tcttgcagtt gttgc 55 <210> 262 <211> 55 <212> DNA <213> Amaranthus palmeri <400> 262 tcgacgtcaa catgaacaaa atgccagatg ttgctatgac tcttgcagtt gttgc 55 <210> 263 <211> 55 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (47)..(47) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 263 tngangtcaa catgaacaaa atgccagatg tngcnatgac ncttgcngtn gttgc 55 <210> 264 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 264 aacaugaaca aaaugccaga u 21 <210> 265 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 265 aucuggcauu uuguucaugu u 21 <210> 266 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 266 aacaugaaca aaaugccaga ug 22 <210> 267 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 267 caucuggcau uuuguucaug uu 22 <210> 268 <211> 24 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 268 caacaugaac aaaaugccag augu 24 <210> 269 <211> 24 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 269 acaucuggca uuuuguucau guug 24 <210> 270 <211> 35 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 270 ucgacgucaa caugaacaaa augccagaug uugcu 35 <210> 271 <211> 35 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 271 agcaacaucu ggcauuuugu ucauguugac gucga 35 <210> 272 <211> 45 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 272 ucgacgucaa caugaacaaa augccagaug uugcuaugac ucuug 45 <210> 273 <211> 45 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 273 caagagucau agcaacaucu ggcauuuugu ucauguugac gucga 45 <210> 274 <211> 55 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 274 ucgacgucaa caugaacaaa augccagaug uugcuaugac ucuugcaguu guugc 55 <210> 275 <211> 55 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 275 gcaacaacug caagagucau agcaacaucu ggcauuuugu ucauguugac gucga 55 <210> 276 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 276 taatacgact cactataggg ctttattgaa tttagctatg taatc 45 <210> 277 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 277 taatacgact cactataggg tttatcaacc aaatgtgcag c 41 <210> 278 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 278 taatacgact cactataggg ttgtctgtac ataattgtga gatttgtgg 49 <210> 279 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 279 ctgtgatcat catatgtatc a 21 <210> 280 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 280 ccttaactct ccagctagca a 21 <210> 281 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 281 cagcccgcaa atgtttcatt c 21 <210> 282 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 282 gccgtcaatg gccgcattgc t 21 <210> 283 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 283 tccttccctc agaaagggca g 21 <210> 284 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 284 ttgcctcatg ctgctaatct g 21 <210> 285 <211> 789 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 285 cttatatgtg cttaagccta acgtgcaccc ggccccttaa ccccagcagt tttcaatcta 60 cctaccgtct ctaccatttt cttctagttg gtgaaaattt ctaactttga gaaaacaagc 120 caaagttttt gtttctaaga acgcaaaatg agtgaaattt tttgcagcaa tggcacagat 180 tagcagcatg aggcaaggga tacagacccc taatcttaat tcctattttc ctaaaaccca 240 aaaggttcct cttttttcgc attctatctt ctttggatca aagaaaataa cccaaaattc 300 agcaaaatct ttgtgggtgt gtaagaaaga ttcagttttg agggtggcaa agtcaccttt 360 taggatttgt gcatcagtgg ccactgcaca gaagcccaac gagattgtgc tgcaacccat 420 caaagatata tcaggcactg ttaaattgcc tggttctaaa tccctttcca accgtattct 480 ccttcttgct gccctttctg agggaaggac tgttgttgac aatttactga gtagtgatga 540 cattcattac atgcttggtg cgttgaaaac acttggactt catgtagaag atgacaatga 600 aaaccaacga gcaattgtgg aaggttgtgg tgggcagttt cctgtcggcg agaagtctga 660 ggaagaaatc caactattcc ttggaaatgc aggaacagca atgcggccat tgacggcagc 720 agttactgta gctggaggac attcaagata tgtacttgat ggagttccta ggatgagaga 780 gagaccgat 789 <210> 286 <211> 799 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 286 cactgacgtt ggattagagg taggctcctt atatgtgctt aagcctaacg tgcagccggc 60 ccccaacccc agcagttttc aatctaccta ccgtctctac cattttctta tagtagttga 120 aaatttctaa ctttgagaaa acaagccaaa gttttgtttc taagaacaca aagggagtga 180 aattttttgc agcaatggca cagattagca gcatgaggca agggatacag acccctaatc 240 ttaattccta ttttcctaaa acccaaaagg ttcctctttt ttcgcattct atcttcattg 300 gatcaaagaa aataacccaa aattcagcaa aatctttgtg ggtgtgtaag aaagattcag 360 ttttgagggt ggcaaagtca ccttttagga tttgtgcatc agtggccact gcacagaagc 420 ctaacgagat tgtgctgcaa cctatcaaag atatatcagg cactgttaaa ttacctggtt 480 ctaaatccct ttccaatcgt attctccttc ttgctgccct ttctgaggga aggactgttg 540 ttgacaattt actgagtagt gatgacattc attacatgct tggtgcattg aaaacacttg 600 gacttcatgt agaagatgac aatgaaaacc aacgagcaat cgtagaaggt tgtggtgggc 660 agtttcctgt cggcaagaag tctgaggaag aaatccaact attccttgga aatgcaggaa 720 cagcaatgcg gccattgacg gcagcagtta ctgtagctgg tggacattct agatatgtac 780 ttgatggagt tcctaggat 799 <210> 287 <211> 845 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 287 aaattcttgg ttcgaggagg tcagaagtac aagtctcctg gaaaagcata tgttgaagga 60 gatgcctcaa gtgctagcta ctttttggcg ggtgcagctg tcacaggtgg aactgtcact 120 gttgaaggtt gtggaacaag cagtttacag ggggatgtta agtttgctga ggtcctcgaa 180 aagatggggg cagaagttac atggacagag aacagtgtca cggttaaagg acctccaagg 240 aactcttctg gaatgaaaca tttgcgggct gttgacgtta acatgaacaa aatgccagat 300 gttgccatga ctcttgctgt agttgcactt tttgctgata gtcctactgc cataagagat 360 gttgctagct ggagagttaa ggaaactgag cggatgattg ccatatgcac agaacttagg 420 aagttgggtg caacagttgt agaagggcca gactactgca taatcactcc acctgaaaag 480 ttaaaagtag cggaaattga tacatatgat gatcacagaa tggccatggc tttctctctt 540 gcggcttgtg ctgatgttcc agtcaccatt aaggaccccg gttgtactcg caaaaccttc 600 cccaactact ttgacgttct ccagcagtat tccaagcatt aaaccacttt ccattaagaa 660 ttttgaaaaa gagagacttt gacaacaatg gtgtcatacc ggaagagaaa agctttgatc 720 caagctttca actccttttc atttgtcatg tgatgatcat tgtatttgtt gaagttgagc 780 tgcttttctt ttgtccagaa gacatgtatg gatactatta ctatatagtt aaggtgaact 840 cagca 845 <210> 288 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 288 ccacatggtc cagtatctgc c 21 <210> 289 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 289 caagcaagga acccatccat t 21 <210> 290 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 290 ggccacacct gcatgcattg c 21 <210> 291 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 291 gtgttcacgg tagacaaatc c 21 <210> 292 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 292 tgcactgcac ttgacgcacg t 21 <210> 293 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 293 aactgatgca ttgcacttga c 21 <210> 294 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic 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tgttgctcaa 60 gctaacatgg ttgcaccttt cactggtctt aagtcagctg cctttttccc tgtttcaagg 120 aagcaaaacc ttgacatcac ttccattgcc agcaacggcg gaagagtgca atgcatgcag 180 gtgtggccac caattaacaa gaagaagtac gagactctct cataccttcc tgatctgagc 240 gtggagcaat tgcttagcga aattgagtac ctcttgaaaa atggatgggt tccttgcttg 300 gaattcgaga ctgagcgcgg atttgtctac cgtgaacacc acaagtcacc gggatactat 360 gacggcagat actggaccat gtggaagttg cctatgttcg gatgcactga tgccacccaa 420 gtgttggccg aggtggaaga ggcgaagaag gcatacccac aggcctggat ccgtattatt 480 ggattcgaca acgtgcgtca agtgcagtgc atcagtttca ttgcctacaa gccagaaggc 540 tac 543 <210> 298 <211> 486 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 298 caagccaaca tggttgcacc cttcactggc ctcaagtccg cctcctcctt ccctgttacc 60 aggaaacaaa accttgacat tacctccatt gctagcaatg gtggaagagt tcaatgcatg 120 caggtgtggc caccaattaa catgaagaag tacgagacac tctcatacct tcctgatttg 180 agccaggagc aattgcttag tgaagttgag taccttttga aaaatggatg ggttccttgc 240 ttggaattcg agactgagcg tggattcgtc taccgtgaac accacaactc accaggatac 300 tacgatggca gatactggac catgtggaag ttgcccatgt tcgggtgcac tgatgccact 360 caggtgttgg ctgaggtcga ggaggcaaag aaggcttacc cacaagcctg ggttagaatc 420 attggattcg acaacgtccg tcaagtgcaa tgcatcagtt ttatcgcctc caagccagaa 480 ggctac 486 <210> 299 <211> 537 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 299 ggctcagtta tgtcctcagc tgccgctgtt tccaccggcg ccaatgctgt tcaagccagc 60 atggtcgcac ccttcactgg cctcaaggcc gcctcctcct tcccggtttc caggaaacaa 120 aaccttgaca ttacttccat tgctagaaat ggtggaagag tccaatgcat gcaggtgtgg 180 ccgccaatta acaagaagaa gtacgagaca ctctcatacc ttcctgattt gagcgtggag 240 caattgctta gcgaaattga gtaccttttg aaaaatggat gggttccttg cttggaattc 300 gagactgagc atggattcgt ctaccgtgaa caccaccact caccaggata ctacgatggc 360 agatactgga cgatgtggaa gttgcccatg ttcgggtgca ccgatgccac tcaggtcttg 420 gctgaggtag aggaggccaa gaaggcttac ccacaagcct gggtcagaat cattggattc 480 gacaacgtcc gtcaagtgca atgcatcagt ttcatcgcct acaagcccga aggctat 537 <210> 300 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic 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ctctgagagg tgtgaaggtg gaggttactc atcgtggaaa tatgcggagg 1080 aagtaccgca tttcgggttt aacatctcaa gcaacaagag agttgacctt ccctgttgat 1140 gaaaatggta cagtgaaatc tgtaattgag tattttcgag aaacatatgg gtttgtaatt 1200 cagcatactc agtggccttg tctacaagtt ggaaatcagc agagacctaa ttacttgcca 1260 atggaagtct gcaagattgt ggagggacaa aggtactcaa agcgcttgaa tgagagacag 1320 attactgcac ttctgaaagt gacctgccag cgtccccaag ggagggagcg tgatattctt 1380 gagaccgtac atcataatgc ctatgctaat gacccatatg ccaaggagtt tggtattaag 1440 attagtgaca agttggcaca agttgaggct cgtattttgc ctccacctcg gcttaaatat 1500 catgataacg gtcgagaaaa ggactgcctg ccacaagttg gccaatggaa tatgatgaat 1560 aagaaaatgg taaatggagg gacggtgaac aattggatct gcataaactt ctctcgcaat 1620 gtgcaagata gtgttgctca tgggttttgc tctgagcttg cacaaatgtg ccagatatct 1680 ggcatgaatt tcaatccaaa tcctgttctg ccaccttcga gtgcacgccc tgatcaggtc 1740 gaaagagtat tgaaaactcg atttcatgat gctatgacta agttgcagct gcatgggaga 1800 gagcttgatt tgctagttgt catcttgcca gacaataatg gatctcttta tggtgatctg 1860 aagcgcattt 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Claims (16)

  1. 성장하는 식물 또는 식물 기관에서 표적 내인성 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서,
    표적 내인성 유전자 또는 당해 표적 내인성 유전자로부터 전사된 전령 RNA 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 그 서열에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 성장하는 식물 또는 식물 기관의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 성장하는 식물 또는 식물 기관 위에 국소 피복함으로써 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 표적 내인성 유전자의 발현을 조절함을 포함하는 방법.
  2. 성장하는 식물에서 제초제의 활성을 강화시키는 방법으로서,
    (a) (i) 제초제와 상호작용하는 단백질을 발현하는, 성장하는 식물의 내인성 유전자 내의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및
    (ⅱ) 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부에 침투하도록 하는 유효량의 전달제로 구성된 폴리뉴클레오타이드 조성물을 상기 성장하는 식물의 표면에 국소 피복시키는 단계; 및
    (b) 상기 제초제를 상기 성장하는 식물에 적용시키는 단계를 포함함으로써, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 상기 성장하는 식물의 내부로 침투하여 상기 내인성 유전자의 억제를 유도함으로써 상기 성장하는 식물에서 상기 제초제의 활성을 강화시키는 방법.
  3. 표면활성제 및 적어도 하나의 식물 치사제를 포함하는, 성장하는 식물의 외부 표면 위에 국소 피복하도록 조정된 액상의 제초제 조성물로서, 당해 식물 치사제가, 식물 유전자의 서열 또는 식물 유전자의 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 식물 유전자에 대한 프로브(probe)에 하이브리드화하는 작은 RNA의 전신계적 생산을 수행하는 것을 개선점으로 하는 액상의 제초제 조성물.
  4. 비-뉴클레오타이드 제초제를 포함하는 액상의 제초제 조성물로서, 당해 조성물이, 식물 유전자의 서열 또는 식물 유전자의 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 것을 개선점으로 하는 액상의 제초제 조성물.
  5. (a) 식물의 내인성 유전자 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 여기서 상기 이중 가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드는 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행하기 위하여 상기 식물의 세포 내 생리학적 조건하에서 상기 내인성 유전자 또는 상기 내인성 유전자로부터 전사된 상기 RNA로 하이브리드화 할 수 있다; 및
    (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물.
  6. (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및
    (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물.
  7. (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및
    (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물.
  8. (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및
    (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 단일가닥 RNA 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물.
  9. (a) 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 내인성 유전자 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA에 하이브리드화하여 상기 내인성 유전자의 사일런싱을 수행할 수 있는, 식물의 내인성 유전자의 서열 또는 당해 내인성 유전자로부터 전사된 RNA의 서열과 본질적으로 동일하거나 또는 이에 대해 본질적으로 상보적인 서열을 갖는 전사가능하지 않은 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 용액; 및
    (b) 상기 식물의 표면으로부터 상기 식물의 세포내로 상기 이중가닥 DNA/RNA 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 전달을 촉진하는데 효과적인 전달제로 본질적으로 이루어진 조성물.
  10. 자생 식물의 세포내에서 생리학적 조건하에 (i) 당해 자생 식물의 성장 또는 생애를 유지시키기 위한 필수 유전자이거나, (ⅱ) 상기 자생 식물에 대해 내성인 제초제를 제공하는 단백질을 암호화하거나, (ⅲ) RNA 조절제로 전사하는 내인성 유전자로부터 전사되는 전령 RNA에 하이브리드화할 수 있는 전신계적인 단일가닥 RNA를 상기 자생 식물의 세포내에 제공하는 폴리뉴클레오타이드 올리고머를 포함하는 조성물을 상기 자생 식물의 잎 위에 적용함을 포함하여, 제초제 내성 작물의 현지(field)에서 성장하는 표적화된 제초제 내성 자생 식물을 선택적으로 방제하기 위한 방법.
  11. 청구항 1에 따르는 조성물을 살아있는 식물의 조직 위에 국소 적용시킴을 포함하여, 식물내의 내인성 유전자를 조절함으로써 역유전학(reverse genetics)을 조사하는 방법.
  12. (a) 폴리뉴클레오타이드 올리고머에 의한 침투에 대해 식물을 컨디셔닝하기 위한 제제, 및 (b) 상기 식물에 화학적 제초제에 내한 내성을 제공하는 단백질을 암호화하거나 필수 유전자인, 안티-센스 또는 센스 배향의 상기 식물의 내인성 유전자의 18개 이상의 인접 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 분절을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 올리고머의 수용액을 포함하는 제초제 조성물.
  13. 내인성 유전자를 억제하기 위한 외인성 DNA 또는 RNA를 포함하는 식물로서,
    상기 외인성 DNA는 상기 식물의 염색체 내로 통합되지 않고 외인성 RNA는 상기 식물의 염색체로 통합된 DNA로부터 전사되지 않으며, 상기 내인성 유전자는 식물이 종자로부터 생긴 후 당해 식물에 대한 폴리뉴클레오타이드의 국소 적용에 의해 억제되는 식물.
  14. 식물 세포의 외부에 상기 폴리뉴클레오타이드를 국소 적용함으로써 식물 세포의 내부로 폴리뉴클레오타이드를 전달하기 위한 방법으로서, 폴리뉴클레오타이드를 오가노실리콘 표면활성제와 조합함을 포함하는 방법.
  15. 청구항 1, 2, 10, 11 및 14 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 내인성 유전자의 발현이 국소 피복된 것 이외의 식물 세포내에서 조절되고,
    상기 표적 내인성 유전자가 적어도 하나의 식물 기관 내에서 전신계적으로 조절되거나;
    상기 내인성 표적 유전자가 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS), 아세토하이드록시산 신타제 또는 아세토락테이트 신타제(ALS), 아세틸-보조효소 A 카복실라제(ACCase), 디하이드로프테로에이트 신타제, 파이토엔 데사투라제(PDS), 프로토포르피린 IX 옥시게나제(PPO), 하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제(HPPD), 파라-아미노벤조에이트 신타제, 글루타민 신타제(GS), 1-데옥시-D-크실룰로즈 5-포스페이트(DOXP) 신타제, 디하이드로프테로에이트(DHP) 신타제, 페닐알라닌 암노니아 리아제(PAL), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 광시스템 Ⅱ의 D1 단백질, 모노-옥시게나제, 시토크롬 P450, 셀룰로즈 신타제, 베타-투불린, RUBISCO, 해독 개시 인자, 파이토엔 데사투라제 및 이중가닥 DNA 아데노신 트리폴리포스파타제(ddATP)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단백질을 암호화하거나;
    폴리뉴클레오타이드가 내인성 유전자 또는 상이한 내인성 유전자의 상이한 분절을 표적화하거나;
    식물의 표면으로부터 세포내로의 상기 폴리뉴클레오타이드의 침투가 오가노실리콘을 포함하는 전달제를 사용하거나;
    식물의 표면으로부터 세포내로 상기 폴리뉴클레오타이드의 침투가 암모늄 염을 포함하는 전달제를 사용하거나;
    상기 식물이 개방된 현지에서 성장하거나;
    상기 식물이 온실에서 성장하거나;
    상기 식물이 또한 비-폴리뉴클레오타이드 제조제로 분무되거나;
    상기한 것들 중의 하나 이상의 조합인 방법.
  16. 청구항 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 12 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 전달제가 표면활성제 및 염으로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나;
    상기 표면활성제가 오가노실리콘 표면활성제이거나;
    상기 오가노실리콘 표면활성제가 실리콘 폴리에테르 공중합체이거나;
    상기 실리콘 폴리에테르 공중합체가 폴리알킬렌 옥사이드 변형된 헵타메틸 트리실록산 및 알릴옥시폴리프로필렌 글리콜 메틸에테르(Silwet? L-77 표면활성제로서 구입가능함)의 공중합체이거나;
    비-폴리뉴클레오타이드 제초제 분자를 추가로 포함하거나;
    상기 식물 유전자가 제초제 내성을 제공하고 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS), 아세토하이드록시산 신타제 또는 아세토락테이트 신타제(ALS), 아세틸-보조효소 A 카복실라제(ACCase), 디하이드로프테로에이트 신타제, 파이토엔 데사투라제(PDS), 프로토포르피린 IX 옥시게나제(PPO), 하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제(HPPD), 파라-아미노벤조에이트 신타제, 글루타민 신타제(GS), 1-데옥시-D-크실룰로즈 5-포스페이트(DOXP) 신타제, 디하이드로프테로에이트(DHP) 신타제, 페닐알라닌 암노니아 리아제(PAL), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 광시스템 Ⅱ의 D1 단백질, 모노-옥시게나제, 시토크롬 P450, 셀룰로즈 신타제, 베타-투불린, RUBISCO, 해독 개시 인자, 파이토엔 데사투라제 및 이중가닥 DNA 아데노신 트리폴리포스파타제(ddATP)인 단백질을 암호화하거나; 또는 상기한 것들의 조합인 조성물.
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