CN102822350A - 用于植物基因调控的多核苷酸分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于调控植物基因的多核苷酸分子和方法，例如通过提供用于对基因进行系统性调控的RNA。本发明的各个方面提供用于调控植物细胞中的内源性基因和转基因的多核苷酸分子和方法，以及多核苷酸分子。

Description

用于植物基因调控的多核苷酸分子
相关申请的交叉引用和序列表的并入
本申请要求2010年3月8日提交的美国临时专利申请61/311,762、2010年5月28日提交的美国临时专利申请61/349,807和2010年9月10日提交的美国临时专利申请61/381,556的优先权权益，这些临时专利申请以引用的方式整体并入本文。序列表含于2011年3月7日创建的133KB(在操作系统MS-Windows中测量)的名称为“38-21_56855_D.txt”的文件中，与本文一同提交并且以引用的方式并入本文。
发明领域
本文公开了用于调控植物基因的多核苷酸分子以及制造和使用所述分子的方法。
背景
除草剂无法控制抗性杂草是一个问题，尤其当这些杂草是在除草剂抗性可能低于所述杂草的除草剂抗性作物的田间生长时。除草剂抗性杂草可用多种作用模式来鉴定。藜中通过针对多个拷贝的产生除草剂靶向蛋白的基因进行选择而引起的抗性由Gaines等(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，107(3)：1029-1034报道。牛筋草、多刺莴苣和黑麦草中由产生除草剂靶向蛋白的基因突变而引起的抗性由Baerson等(2002)Plant Physiol.，129(3)：1265-1275；Preston等(2006)Pesticide Biochem.Physiol.，84(3)：227-235；和Wakelin等(2006)Weed Res.(Oxford)，46(5)：432-440报道。草甘膦的液泡隔离是在草甘膦抗性加拿大飞篷中观察到的一种机制；参看Ge等(2010)Pest Management Sci.，66：576-576。毛马唐中通过表达使除草剂代谢为无活性化学形式的酶而引起的抗性由Hidayat等(1997)PesticideBiochem.Physiol.，57(2)：137-146报道。Reddy等(2008)J.Agric.Food Chem.，56(6)：2125-2130报道了用草甘膦处理的植物物种中氨甲基膦酸的累积。
发明概述
本发明提供用于调控植物基因的多核苷酸分子和方法，例如通过提供用于对基因进行系统性调控的RNA。本发明的各个方面提供用于调控植物细胞中的内源性基因和转基因的多核苷酸分子和方法，以及多核苷酸分子。本文公开的多核苷酸、组合物和方法可用于调控植物害虫或病原体的内源性基因。在本发明的一方面，多核苷酸分子是以组合物形式提供，所述组合物可渗透到或吸收至活植物组织中，以起始内源性基因或转基因或其转录的RNA的系统性基因沉默。在本发明的一些方面，多核苷酸分子最终向植物提供或允许于植物细胞中产生能够在植物细胞中的生理条件下与从植物细胞中的靶标内源性基因或靶标转基因转录的RNA杂交的RNA，由此实现对靶标基因的调控，例如靶标基因的沉默或抑制。在本发明的其它方面，本文公开的多核苷酸分子也可用于最终向植物提供或允许于植物细胞中产生能够在生理条件下与从无脊椎害虫的细胞中或植物的病毒性病原体的靶标基因转录的RNA杂交的RNA，由此实现对靶标基因的调控，例如靶标基因的沉默或抑制。在一些方面，靶标基因的沉默或抑制导致本身受靶标基因的表达影响或调控的另一基因上调。
相信本发明的组合物和方法通过RNA介导的基因抑制中涉及的若干天然细胞路径中的一个或多个起作用，如由Brodersen和Voinnet(2006)，TrendsGenetics，22：268-280；Tomari和Zamore(2005)Genes&Dev.，19：517-529；Vaucheret(2006)Genes Dev.，20：759-771；Meins等(2005)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，21：297-318；和Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.Plant Biol.，57：19-53以综述形式所概述。RNA介导的基因抑制一般涉及分子内在单个RNA分子内或分子间在两个RNA分子之间形成的双链RNA(dsRNA)中间体。这种较长的dsRNA中间体由RNase III家族的核糖核酸酶(Dicer或Dicer样核糖核酸酶)加工成一个或多个较短的双链RNA，其中一条链并入RNA诱导的沉默复合体(“RISC”)中。举例来说，siRNA路径涉及使较长的双链RNA中间体裂解成小干扰RNA(“siRNA”)。siRNA的尺寸认为在约19个碱基对到约25个碱基对的范围内，但植物中最常见的siRNA种类包括含有21个碱基对或24个碱基对的siRNA。参看Hamilton等(2002)EMBO J.，21：4671-4679。本文所用的“寡核苷酸”意指长度为18-25个核苷酸的多核苷酸分子，类似于以基因沉默机制加工的小RNA分子的尺寸。本发明的各个实施方案包括包含寡核苷酸或多核苷酸或两者的混合物的组合物。
本发明的各方面包括用于以下的组合物和方法：提供植物细胞中用于对基因进行系统性调控的单链RNA分子；用包括表面活性剂和植物致死剂的组合物进行除草剂处理，所述植物致死剂提供用于抑制植物细胞中的内源性基因的单链RNA；局部涂布于植物表面上，包括表面活性剂(例如有机硅酮表面活性剂)和用于抑制植物细胞中的内源性基因的寡核苷酸或多核苷酸分子；用于诱导植物中靶标基因的系统性沉默的局部施加的组合物，包括(a)用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂，和(b)多核苷酸分子；以及用组合物进行除草剂处理，所述组合物包括(a)用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂，(b)多核苷酸分子。任选地，这些组合物可包括非核苷酸除草剂。
在其它方面，本发明提供用于以下的方法：控制除草剂抗性自生植物；通过在生长中的植物的组织上施加用于在植物细胞中提供用于对基因进行系统性调控的单链RNA分子的组合物来调节植物中的内源性基因，借此研究反向遗传学；诱导靶标基因的系统性沉默，包括向植物局部施加多核苷酸；通过(a)调节植物的多核苷酸渗透和(b)向植物局部施加多核苷酸，来诱导植物中靶标基因的系统性沉默；通过在活植物上局部施加局部施加的组合物来调节植物中的内源性基因，借此研究反向遗传学，所述组合物包括多核苷酸分子和用于调节植物的所述多核苷酸分子渗透的试剂。
在其它方面，本发明提供具有用于抑制内源性基因的外源DNA或RNA的植物，其中所述外源DNA未整合到植物染色体中，所述外源RNA并非从整合到植物染色体中的DNA转录，并且所述内源性基因是通过向植物局部施加多核苷酸受到抑制。本发明的这些和其它方面在以下章节中更详细地描述。
附图简述
图1呈现SEQ ID NO：1，其为编码长芒苋(Palmer amaranth)EPSPS的核苷酸序列。
图2呈现SEQ ID NO：3，其为合成的Pol III基因的核苷酸序列。
图3图解说明用dsRNA处理的长芒苋植物的发病率。图3A描绘草甘膦处理后7天的植物。图3B描绘表面活性剂处理的植物，它们用长dsRNA溶液处理，接着72小时后用草甘膦处理。图3C描绘表面活性剂处理的植物，它们用短dsRNA溶液处理，接着72小时后用草甘膦处理。
图4图解说明用dsRNA组合物处理的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)植物的漂白情况。
图5呈现SEQ ID NO：2，其为本氏烟草八氢番茄红素去饱和酶的核苷酸序列。
图6图解说明如实施例9中所述渗透草甘膦抗性长芒苋叶子的5’-AlexaFluor 488标记的反义ssDNA寡核苷酸(SEQ ID NO：15)。
图7描绘如实施例9中所述在用针对EPSPS的反义ssDNA寡核苷酸处理的草甘膦抗性长芒苋叶子中测量的EPSPS mRNA结果。竖条表示针对各处理#1-#4(由圆圈中圈起的数字指示并且参考表2)和针对对照(渗透有针对大麦种子蛋白的反义ssDNA寡核苷酸SEQ ID NO：14的叶子，用或未用草甘膦处理)的重复实验。
图8描绘如实施例9中所述在用针对EPSPS的反义ssDNA寡核苷酸局部处理的草甘膦抗性长芒苋叶子中测量的EPSPS蛋白结果；各处理由圆圈中圈起的数字指示并且参考表2。
图9描绘如实施例9中所述在两个实验中在用针对EPSPS的反义ssDNA寡核苷酸处理的草甘膦抗性长芒苋叶子中测量的莽草酸累积结果；各处理由圆圈中圈起的数字指示并且参考表2。
图10描绘本氏烟草八氢番茄红素去饱和酶的核苷酸序列(SEQ IDNO：2)。
图11示意性描绘测定的寡核苷酸和多核苷酸的序列(参看表3)相对于八氢番茄红素合酶序列(SEQ ID NO：16)的位置，如实施例10中所述。
图12A图解说明用缓冲液(“对照”)、具有对应于由SEQ ID NO：2的核苷酸914-1113组成的区段的RNA序列的200聚体dsRNA多核苷酸(“200ntdsRNA”)以及单链DNA寡核苷酸与多核苷酸的组合(SEQ ID NO：16、17、20、21、24、25和26)(“ssDNA寡聚物”)局部处理的本氏烟草植物中的顶叶漂白情况，如实施例10中所述。图12B图解说明从用缓冲液(对照)、200聚体dsRNA多核苷酸和ssDNA寡核苷酸处理的本氏烟草植物分离的RNA的RNA印迹分析(northern blot analysis)结果。还显示从已通过在4℃下和暗处保持过夜，接着用200聚体dsRNA多核苷酸处理而受到胁迫的植物分离的RNA。
图13图解说明用多核苷酸或寡核苷酸的各种组合双重复局部处理的本氏烟草植物的顶叶漂白情况(数字是指表4中所列的处理)，如实施例10中所述。对照(表4中的处理13)植物未图示。
图14图解说明用表5中所列的多核苷酸局部处理的本氏烟草植物的顶叶漂白情况，如实施例10中所述。
图15图解说明用PDS 21聚体反义ssDNA(SEQ ID NO：34，“21nt PDS反义”)或用先前测定的无T7启动子的PDS反义22聚体寡核苷酸(SEQ IDNO：22和23)(“PDS反义”)局部处理后在本氏烟草植物中观察到的顶叶漂白情况。在仅用缓冲液局部处理后或在用PDS 21聚体有义ssDNA(SEQ IDNO：36，“21nt PDS有义”)局部处理后观察到几乎不可见的顶叶漂白，如实施例10中所述。
图16图解说明长芒苋和本氏烟草PDS DNA序列的比对，显示约71％同一性(1252/1762)，如实施例11中所述。
图17图解说明在用678bp或198bp长芒苋PDS dsRNA局部处理的长芒苋植物中而未在用玉米根虫基因的260碱基对dsRNA局部处理的长芒苋植物中观察到的顶叶漂白情况，如实施例11中所述。
图18A图解说明首先用表面活性剂溶液且接着用ssDNA PDS寡核苷酸局部处理以诱导八氢番茄红素去饱和酶的系统性沉默的本氏烟草植物的顶叶、茎和花的漂白情况，如实施例12中所述。图18B图解说明在用或未用表面活性剂溶液调节的情况下用ssDNA PDS寡核苷酸局部处理以诱导八氢番茄红素去饱和酶的系统性沉默的本氏烟草植物的顶叶、茎和花的漂白情况，如实施例12中所述。
图19图解说明用表6中所列的条件处理的不同草甘膦抗性长芒苋植株(每次重复3株植物)的测定结果，如实施例13中所述。照片是在草甘膦处理后7天(实验1-6)或在草甘膦处理后9天(实验7-9)拍摄的。
图20图解说明被鉴定为在EPSPS dsRNA处理的长芒苋植物中丰富的两个小RNA的位置，并且其在全长EPSPS(SEQ ID NO：40)的位置564-588和743-767处显示为斜体并加下划线的核苷酸，如实施例14中所述。所述EPSPS序列还显示四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子(加下划线，非斜体字)和三种“长”双链RNA多核苷酸(粗体字的位置，如实施例1中所述。
图21A图解说明相继用表面活性剂、dsRNA(三种施加量中的一种)、除草剂处理长芒苋植物的结果，如实施例17中所述。图21B图解说明对从田间采集的种子生长而成的草甘膦抗性长芒苋进行的测定1的结果，如实施例17中所述；显示用除草剂处理后8天和30天时的植物。
图22图解说明用牛脂胺表面活性剂和硫酸铵或用转染试剂处理长芒苋后获得的结果，如实施例18中所述。
图23图解说明用EPSPS dsRNA或EPSPS DNA/RNA杂交体处理草甘膦抗性长芒苋植物的结果，如实施例19中所述。
图24图解说明用EPSPS dsRNA或EPSPS ssDNA多核苷酸处理草甘膦抗性长芒苋植物的结果，如实施例20中所述。上方照片是在除草剂喷洒后8天拍摄的，并且下方(条形)图形呈现在除草剂喷洒后8天评分获得的草甘膦伤害(GI)结果。
图25A图解说明对应于约250bp的DNA区段的12种dsRNA多核苷酸，各自以分块方式涵盖长芒苋EPSPS基因的完整编码序列以及5’和3’非翻译区的一部分，如实施例21中所述；如实施例1和图1中所述的四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子分别位于分块区段2、3、4和8中，并且显示为这些区段内的浅灰色竖条。图25B和图25C图解说明用从这些分块区段或四个“短”dsRNA分子设计的dsRNA或缓冲液处理草甘膦抗性长芒苋植物的结果。
图26图解说明用草甘膦处理草甘膦抗性长芒苋植物，接着喷洒1％SilwetL-77，随后施加含2％硫酸铵的缓冲液中的EPSPS dsRNA的结果，如实施例22中所述。未处理(“UT”)对照植物仅用1％Silwet L-77喷雾剂而不用除草剂或dsRNA处理。植物在处理后16天拍照并且评级。
图27图解说明用含有20X或100X的量的EPSPS dsRNA多核苷酸、表面活性剂、硫酸铵和除草剂的组合物或用含有表面活性剂、硫酸铵和除草剂的组合物处理高拷贝数草甘膦抗性长芒苋的田间种群的结果，如实施例23中所述。对于每一次处理，处理两个重复1英尺×5英尺田块。
图28描绘用1纳摩尔ssDNA处理的莴苣植物的每株植物在处理后(自上而下)37、46和60天时的漂白和死亡进展，如实施例24中所述。
图29A图解说明用多核苷酸局部处理后4天或12天观察到的漂白情况所显现的莴苣植物中的系统性沉默，如实施例24中所述。图29B描绘用四个个别反义ssDNA(“HL287”，SEQ ID NO：43；“HL288”，SEQ ID NO：44；“HL289”，SEQ ID NO：45；和“HL290”，SEQ ID NO：46)或所有四者的混合物局部处理后4观察到的漂白情况所显现的系统性沉默。
图30图解说明用番茄八氢番茄红素去饱和酶多核苷酸处理的番茄植物的叶子(右上图)和花(右中图)的漂白情况，如实施例25中所述。图30还图解说明了用PDS多核苷酸处理的番茄植物的矮化情况(下图)。
图31图解说明TIF多核苷酸使EPSPS多核苷酸的低拷贝数长芒苋中的草甘膦除草剂活性增强并且所述TIF多核苷酸单独具有除草剂活性，如实施例26中所述。EPSPS多核苷酸“1、3、4”是指具有能够与分别从长芒苋EPSPS基因(SEQ ID NO：1)的位置14-38(短dsRNA-1)、345-369(短dsRNA-3)和1105-1129(短dsRNA-4)转录的mRNA杂交的反义链的“短”dsRNA，如图1中加下划线的核苷酸所指示(参看实施例1)。EPSPS“5”是指IDT[5](如表11中所述的SEQ ID NO：91-92)。
图32图解说明TIF多核苷酸使EPSPS多核苷酸的高拷贝数长芒苋中的草甘膦除草剂活性增强并且所述TIF多核苷酸单独具有除草剂活性，如实施例26中所述。EPSPS多核苷酸“1、3、4”是指具有能够与分别从长芒苋EPSPS基因(SEQ ID NO：1)的位置14-38(短dsRNA-1)、345-369(短dsRNA-3)和1105-1129(短dsRNA-4)转录的mRNA杂交的反义链的“短”dsRNA，如图1中加下划线的核苷酸所指示(参看实施例1)。EPSPS“5”是指IDT[5](如表11中所述的SEQ ID NO：91-92)。
图33图解说明用非多核苷酸除草剂和多核苷酸的指定组合处理后对长芒苋的除草剂作用，如实施例28中所述。
图34图解说明本氏烟草PDS基因座1启动子(SEQ ID NO：319)与PDS基因座2启动子(SEQ ID NO：320)的比对，如实施例30中所述。
图35示意性图解说明本氏烟草PDS基因座1和基因座2启动子以及由多核苷酸的混合物靶向的区域，如实施例30中所述。
图36图解说明对用PDS反义多核苷酸(图36A)、EPSPS反义多核苷酸(图36B)或RuBisCO反义多核苷酸(图36C)处理的本氏烟草植物的植物高度的影响，如实施例33中所述。
图37图解说明通过用靶向内源性EPSPS基因的dsRNA多核苷酸(“EPSPS DNA寡聚物”)或用作为对照的单独缓冲液局部处理对玉米(Zeamays)(Gaspe)单子叶植物的影响，如实施例34中所述。
图38图解说明改变草甘膦反离子对草甘膦抗性长芒苋植物上的除草剂活性的影响，如实施例35中所述。
图39图解说明多胺精胺(“SPM”)和亚精胺(“SPMD”)或硫酸铵(“AMS”)对含有33、36或57个拷贝的EPSPS的草甘膦抗性长芒苋的影响，如实施例35中所述。“fb 4X WM”意指“随后用草甘膦(Roundup
Figure BPA00001609644700091
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700092
牌除草剂的每公顷3360g酸等效物)处理”。
发明详述
除非另外规定，否则本说明书文本中的核酸序列当从左向右阅读时是以5’至3’方向给出。核酸序列可如所指定提供为DNA或RNA；一者的公开必定定义另一者，如本领域的普通技术人员所已知。如果术语是以单数形式提供，那么本发明者也预期由所述术语的复数形式描述的本发明的方面。“不可转录”多核苷酸意指所述多核苷酸不包含完整聚合酶II转录单元。如本文所用的“溶液”是指均质混合物和非均质混合物，诸如悬浮液、胶体、胶束和乳液。
多核苷酸
如本文所用的“多核苷酸”是指含有多个核苷酸的核酸分子并且一般是指“寡核苷酸”(长度为18-25个核苷酸的多核苷酸分子)和具有26个或更多个核苷酸的多核苷酸。本发明的各实施方案包括的组合物包括长度为18-25个核苷酸的寡核苷酸(例如18聚体、19聚体、20聚体、21聚体、22聚体、23聚体、24聚体或25聚体)，或长度为26个或更多个核苷酸的中等长度的多核苷酸(例如具有26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290或约300个核苷酸的多核苷酸)，或长度大于约300个核苷酸的长多核苷酸(例如多核苷酸的长度在约300至约400个核苷酸之间、约400至约500个核苷酸之间、约500至约600个核苷酸之间、约600至约700个核苷酸之间、约700至约800个核苷酸之间、约800至约900个核苷酸之间、约900至约1000个核苷酸之间、约300至约500个核苷酸之间、约300至约600个核苷酸之间、约300至约700个核苷酸之间、约300至约800个核苷酸之间、约300至约900个核苷酸之间或为约1000个核苷酸，或甚至长度大于约1000个核苷酸，例如多达靶标基因中包括靶标基因的编码或非编码部分或编码与非编码两部分的整个长度)。如果多核苷酸是双链的，那么其长度可类似地以碱基对方式进行描述。
本发明的各个实施方案中所用的多核苷酸组合物包括以下组合物，其包括寡核苷酸或多核苷酸或两者的混合物，包括RNA或DNA或RNA/DNA杂交体或经过化学修饰的寡核苷酸或多核苷酸或其混合物。在一些实施方案中，多核苷酸可为核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合，例如主要由核糖核苷酸组成但具有一个或多个末端脱氧核糖核苷酸的合成多核苷酸，或主要由脱氧核糖核苷酸组成但具有一个或多个末端双脱氧核糖核苷酸的合成多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包括非典型核苷酸，诸如肌苷、硫代尿苷或假尿苷。在一些实施方案中，多核苷酸包括经过化学修饰的核苷酸。经过化学修饰的寡核苷酸或多核苷酸的实例在本领域中是众所周知的；参看例如Verma和Eckstein(1998)Annu.Rev.Biochem.，67：99-134。举例来说，寡核苷酸或多核苷酸的天然存在的磷酸二酯骨架可部分或完全地被硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯修饰，或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰、经过修饰的核苷碱基或经过修饰的糖可用于寡核苷酸或多核苷酸合成中，并且寡核苷酸或多核苷酸可用荧光部分(例如荧光素或罗丹明)或其它标记(例如生物素)标记。
多核苷酸可为单链或双链RNA或单链或双链DNA或双链DNA/RNA杂交体或其经过修饰的类似物，并且可具有寡核苷酸长度或较长。在本发明的更特定实施方案中，提供植物细胞中的单链RNA的多核苷酸是选自由以下组成的组：(a)单链RNA分子，(b)自身杂交形成双链RNA分子的单链RNA分子，(c)双链RNA分子，(d)单链DNA分子，(e)自身杂交形成双链DNA分子的单链DNA分子，和(f)转录成RNA分子的包括经过修饰的Pol III基因在内的单链DNA分子，(g)双链DNA分子，(h)转录成RNA分子的包括经过修饰的Pol III基因在内的双链DNA分子，(i)双链杂交RNA/DNA分子，或其组合。在一些实施方案中，这些多核苷酸包括经过化学修饰的核苷酸或非典型核苷酸。在所述方法的各实施方案中，多核苷酸包括通过分子内杂交形成的双链DNA、通过分子间杂交形成的双链DNA、通过分子内杂交形成的双链RNA或通过分子间杂交形成的双链RNA。在一个实施方案中，多核苷酸包括自身杂交形成发夹结构的单链DNA或单链RNA，所述发夹结构具有至少部分双链结构，该双链结构包括至少一个将在细胞中的生理条件下与从抑制作用所靶向的基因转录的RNA杂交的区段。不欲受任何机制束缚，相信所述多核苷酸是或将产生至少一个区段将在细胞中的生理条件下与从抑制作用所靶向的基因转录的RNA杂交的单链RNA。在某些其它实施方案中，多核苷酸更包括启动子，一般是在植物中具有功能的启动子，例如pol II启动子、polIII启动子、pol IV启动子或pol V启动子。
在一些实施方案中，多核苷酸组合物是用已知与核酸分子缔合的反离子或其它分子，例如四烷基铵离子、三烷基铵离子、锍离子、锂离子和多胺(诸如精胺、亚精胺或腐胺)来配制。在一些实施方案中，多核苷酸组合物是用非多核苷酸除草剂(例如本文中在标题为“除草剂耐受性蛋白”的章节中公开的化学除草剂)或用转移剂或渗透性增强剂(参看标题为“渗透性增强剂和处理”的章节)来配制。
多核苷酸被设计成诱导植物中内源性基因的系统性调控或抑制并且设计成具有与植物内源性基因的序列(其可为编码序列或非编码序列)或从植物内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或基本上互补的序列。“基本上相同”或“基本上互补”意指多核苷酸(或双链多核苷酸的至少一条链)被设计成在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交，从而实现对内源性基因的调控或抑制。
本发明中的功能性单链多核苷酸的各实施方案具有的序列互补性无需为100％，而是至少足以允许与从靶标基因转录的RNA杂交，从而在植物细胞中的生理条件下形成双链体，以允许通过基因沉默机理发生裂解。因此，在各实施方案中，区段被设计成与靶标基因或从靶标基因转录的信使RNA中的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补。“基本上相同”意指当与靶标基因或从靶标基因转录的RNA中的18个或更多个相邻核苷酸的序列相比较时，具有100％序列同一性或至少约83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列同一性；“基本上互补”意指当与靶标基因或从靶标基因转录的RNA中的18个或更多个相邻核苷酸的序列相比较时，具有100％序列互补性或至少约83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列互补性。在本发明的一些实施方案中，多核苷酸分子被设计成与指定靶标基因(例如除草剂耐受性蛋白、除草剂去活蛋白的基因、胁迫反应基因或必需基因的编码或非编码序列)的一个等位基因具有100％序列同一性或互补性；在其它实施方案中，多核苷酸分子被设计成与指定靶标基因的多个等位基因具有100％序列同一性或互补性。
在本发明的一个方面，多核苷酸是经过修饰的RNA聚合酶III基因，例如转录7SL信号识别粒子RNA或U6拼接体RNA的基因(Pol III基因)或含有功能性Pol III启动子序列的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸是经过修饰的Pol III基因，其含有对应于针对调控作用所鉴定的靶标基因的RNA的有义和反义DNA来代替最初由Pol III基因转录的DNA序列。
可用于本发明的多核苷酸通常在处理过的植物的生命期间在至少1周或更长的一段时间内并且通常以系统性方式实现对基因表达的调控或调节(例如抑制)。举例来说，在用本发明的多核苷酸组合物处理植物叶子的数天内，可在处理过的叶子的侧向和上方的其它叶子中以及在顶端组织中检测到初级和转移性siRNA。
制备多核苷酸的方法在本领域中是众所周知的。寡核苷酸的商业制备通常在有义链的3’末端上提供2个脱氧核糖核苷酸。长多核苷酸分子可由可购得的试剂盒合成，例如来自Ambion的试剂盒具有连接于5’末端的编码细菌T7聚合酶启动子的DNA，所述启动子制备可组装到dsRNA中的RNA链。或者，dsRNA分子可由已受到调控或缺乏RNase III酶活性的细菌细胞中的表达盒产生。长多核苷酸分子也可由多个RNA或DNA片段组装。在一些实施方案中，诸如Reynolds评分和Tuschl规则等设计参数也是本领域中已知的并且用于选择在基因沉默方面有效的多核苷酸序列。在一些实施方案中，在基因沉默方面有效的多核苷酸序列的选择中使用多核苷酸序列的随机设计或经验选择。在一些实施方案中，针对预定植物的基因组DNA筛选多核苷酸序列以使其它基因的无意沉默减到最少。
本发明的多核苷酸组合物可用于组合物，诸如单独或与在同一溶液中或在单独施加的溶液中的其它组分(例如表面活性剂、盐和非多核苷酸除草剂)组合的低浓度的多核苷酸分子的溶液中。虽然可用于本发明方法中的多核苷酸分子的浓度和剂量无上限，但一般将针对有效性搜寻较低有效浓度和剂量。浓度可考虑施加到植物叶子上的喷雾剂的体积进行调整。在一个实施方案中，使用25聚体寡核苷酸分子对草本植物进行的适用处理是每株植物约1纳摩尔寡核苷酸分子，例如每株植物约0.05至1纳摩尔。针对草本植物的其它实施方案包括每株植物约0.05纳摩尔至约100纳摩尔、或约0.1纳摩尔至约20纳摩尔、或约1纳摩尔至约10纳摩尔多核苷酸的适用范围。非常大的植物、树或藤可能需要相应较大量的多核苷酸。当使用可加工成多个寡核苷酸的长dsRNA分子时，可使用较低浓度。在以下说明本发明实施方案的实施例中，应用于寡核苷酸分子时的因数1X是专门用于表示每株植物0.8纳摩尔多核苷酸分子的处理；10X，每株植物8纳摩尔多核苷酸分子；和100X，每株植物80纳摩尔多核苷酸分子，举例来说，在实施例23中，植物用包含每株植物100X EPSPS dsRNA(264微克或80纳摩尔)处理的水溶液处理。
单链RNA分子
本发明提供用于提供用于对植物细胞中基因进行系统性调控的单链RNA的多核苷酸分子。更具体来说，本发明还提供用于通过向植物局部施加多核苷酸分子来诱导对植物中靶标基因的系统性调控(例如系统性抑制或沉默)的组合物和方法，所述多核苷酸分子具有核苷酸序列与靶标基因或从靶标基因转录的RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的区段，由此所述组合物渗透植物内部并且通过与转录的RNA(例如信使RNA)杂交的单链RNA的作用来诱导靶标基因的系统性调控。多核苷酸分子可以是一个或多个具有单个所述区段、多个所述区段、多个不同的所述区段或其组合的多核苷酸分子。
转移剂、渗透性增强剂和处理
本发明的组合物和方法可包含转移剂或渗透性增强剂和处理，以调节植物组织(例如叶子、茎、根、花或果实)的表面，从而使多核苷酸分子渗透到植物细胞中。可通过预先或同时将多核苷酸转移剂施加到植物组织来促进多核苷酸转移到植物细胞中。在一些实施方案中，转移剂是在施加多核苷酸组合物后施加的。多核苷酸转移剂能够提供多核苷酸通过角质层蜡质屏障、气孔和/或细胞壁或膜屏障并且进入植物细胞中的路径。适合促进组合物转移到植物细胞中的试剂包括增加植物外部的渗透性或增加植物细胞对寡核苷酸或多核苷酸的渗透性的试剂。所述促进组合物转移到植物细胞中的试剂包括化学试剂或物理试剂或其组合。用于调节的化学试剂包括(a)表面活性剂，(b)有机溶剂或有机溶剂的水溶液或水性混合物，(c)氧化剂，(e)酸，(f)碱，(g)油，(h)酶或其组合。所述方法的实施方案可任选地包括孵育步骤、中和步骤(例如以中和酸、碱或氧化剂或使酶失活)、冲洗步骤或其组合。用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂或处理的实施方案包括乳液、反相乳液、脂质体和其它胶束样组合物。用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂或处理的实施方案包括反离子或已知与核酸分子缔合的其它分子，例如无机铵离子、烷基铵离子、锂离子、多胺(诸如精胺、亚精胺或腐胺)和其它阳离子。可用于调节植物的多核苷酸渗透的有机溶剂包括DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷酰胺、乙腈、二噁烷、聚丙二醇、可与水混溶或将磷酸核苷酸溶解于非水性系统中的其它溶剂(诸如合成反应中所使用)。可使用天然来源或合成的具有或不具有表面活性剂或乳化剂的油，例如可使用植物来源的油、作物油(诸如第9版的Compendium of Herbicide Adjuvants中所列的油，在www.herbicide.adjuvants.com上可在线公开获得)，例如石蜡油、多元醇脂肪酸酯、或具有经过酰胺或多胺(诸如聚乙烯亚胺或N-吡咯烷)改性的短链分子的油。
所述用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂是通过任何便利方法，例如喷洒或涂布粉末、乳液、悬浮液或溶液来施加；类似地，多核苷酸分子是通过任何便利方法，例如喷洒或擦拭溶液、乳液或悬浮液来施加。
适用表面活性剂的实例包括脂肪酸(诸如牛脂或牛脂胺或磷脂)的钠盐或锂盐和有机硅酮表面活性剂。其它适用表面活性剂包括有机硅酮表面活性剂，包括非离子性有机硅酮表面活性剂，例如三硅氧烷乙氧基化物表面活性剂或硅酮聚醚共聚物，诸如经过聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷与烯丙氧基聚丙二醇甲醚的共聚物(可作为Silwet
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L-77表面活性剂购得，具有CAS编号27306-78-1和EPA编号：CAL.REG.NO.5905-50073-AA，目前可获自Momentive Performance Materials，Albany，New York)。当使用Silwet L-77表面活性剂作为植物叶子或其它表面的预喷洒处理时，在约0.015重量％(wt％)至约2wt％(例如约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)范围内的浓度在制备叶子或其它植物表面以用于通过局部施加于表面上使多核苷酸分子转移到植物细胞中方面是有效的。
适用物理试剂可包括(a)研磨剂，诸如金刚砂、刚玉、砂、方解石、浮石、石榴石等；(b)纳米粒子，诸如碳纳米管；或(c)物理力。碳纳米管由Kam等(2004)J.Am.Chem.Soc.，126(22)：6850-6851，Liu等(2009)Nano Lett.，9(3)：1007-1010，和Khodakovskaya等(2009)ACS Nano，3(10)：3221-3227公开。物理力试剂可包括加热、冷却、施加正压、或超声处理。所述方法的实施方案可任选地包括孵育步骤、中和步骤(例如以中和酸、碱或氧化剂或使酶失活)、冲洗步骤或其组合。本发明方法可更包括施加其它将因使某些基因沉默而具有增强的作用的试剂。举例来说，当多核苷酸被设计成调控提供除草剂抗性的基因时，随后施加除草剂可对除草剂效力具有显著影响。
用于实验室调节植物的多核苷酸渗透的试剂包括例如施加化学试剂、酶处理、加热或冷却、用正压或负压处理、或超声处理。用于田间调节植物的试剂包括化学试剂，诸如表面活性剂和盐。
靶标基因和必需基因
本发明的组合物和方法可用于调节植物细胞中内源性或转基因靶标基因的表达。在各个实施方案中，靶标基因包括编码(蛋白质编码或可翻译)序列、非编码(非可翻译)序列、或编码和非编码序列两者。本发明组合物可包括设计成靶向多个基因、或一个或多个基因的多个区段的多核苷酸和寡核苷酸。靶标基因可包括靶标基因的多个连续区段、靶标基因的多个非连续区段、靶标基因的多个等位基因、或来自一个或多个物种的多个靶标基因。靶标基因的实例包括在植物细胞中表达的内源性植物基因和转基因。靶标基因的其它实例包括植物病毒性病原体的内源性基因或无脊椎植物害虫的内源性基因。
靶标基因可包括编码除草剂耐受性蛋白的基因、包括调控RNA在内的非编码序列、和必需基因，所述必需基因是维持细胞生命或支持生物体繁殖所必需的基因。必需基因的实施方案包括DNA或RNA复制、基因转录、RNA介导的基因调控、蛋白质合成、能量产生和细胞分裂中涉及的基因。必需基因的概述的一个实例描述于Zhang等(2004)Nucleic Acids Res.，32：D271-D272中，并且可在tubic.tju.edu.cn/deg/上获得；DEG 5.4版列出拟南芥(Arabidopsis thaliana)的777种必需基因。必需基因的实例包括翻译起始因子(TIF)和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶(RuBisCO)。靶标基因可包括编码转录因子的基因和编码植物分子的生物合成或分解代谢中所涉及的酶的基因，所述分子诸如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖和其它碳水化合物、生物聚合物、和包括生物碱、萜类化合物、聚酮化合物、非核糖体肽在内的次级代谢产物、和混合生物合成起源的次级代谢产物。
组合物和方法
本发明的单链RNA分子可以RNA形式直接提供至植物细胞，或间接提供，例如在处理组合物中的多核苷酸分子在植物细胞中引起能够与靶标基因的转录物杂交的单链RNA产生的情况下。在多个实施方案中，多核苷酸分子的组合物更包括一种或多种渗透性增强剂以促进多核苷酸分子转移到植物细胞中，诸如用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂。在本发明的各方面，方法包括一次或多次施加多核苷酸组合物和一次或多次施加用于调节植物的多核苷酸渗透的渗透性增强剂。当用于调节渗透的试剂是有机硅酮表面活性剂时，多核苷酸分子的实施方案是双链RNA寡核苷酸、单链RNA寡核苷酸、双链RNA多核苷酸、单链RNA多核苷酸、双链DNA寡核苷酸、单链DNA寡核苷酸、双链DNA多核苷酸、单链DNA多核苷酸、经过化学修饰的RNA或DNA寡核苷酸或多核苷酸或其混合物。
本发明的一方面提供一种用于诱导植物中靶标基因的系统性沉默的方法，其包括(a)调节植物的多核苷酸渗透，和(b)向植物局部施加多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括以反义或有义方向从靶标基因克隆或以其它方式从靶标基因鉴定的18个或更多个相邻核苷酸的至少一个区段，由此所述多核苷酸分子渗透植物内部并且诱导靶标基因的系统性沉默。调节和多核苷酸施加可单独地或在单个步骤中进行。当调节和多核苷酸施加是在单独的步骤中进行时，调节可在多核苷酸施加前或可在多核苷酸施加后的数分钟、数小时或数天以内。在一些实施方案中，可对同一株植物进行超过一个调节步骤或超过一次多核苷酸分子施加。在所述方法的实施方案中，区段可从靶标基因的(a)编码(即蛋白质编码)、(b)非编码、或(c)编码和非编码部分克隆或鉴定。非编码部分包括编码RNA调控序列(例如启动子、内含子、5’或3’非翻译区和微小RNA、反式作用siRNA、天然反义siRNA、和具有调控功能的其它小RNA)或编码具有结构或酶功能的RNA(例如核酶、核糖体RNA、t-RNA、适体和核糖开关)的DNA(或由所述DNA编码的RNA)。
在用于诱导植物中靶标基因的系统性沉默的方法的各个实施方案中，靶标基因是(a)植物的内源性基因，(b)植物病毒性病原体的内源性基因，(c)植物无脊椎害虫的内源性基因，(d)植物无脊椎害虫的共生体的内源性基因，或(e)插入转基因植物中的人造基因。在靶标基因是植物内源性基因的实施方案中，靶标基因(a)是维持植物生长或生命必不可少的植物内源性基因，(b)编码向植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(c)转录成RNA调控分子。在用于诱导植物中靶标基因的系统性沉默的方法的实施方案中，调节包括施加化学试剂、磨蚀、伤害、酶处理、加热或冷却、用正压或负压处理、超声处理或其组合。在一些实施方案中，调节包括施加表面活性剂，诸如有机硅酮表面活性剂，例如硅酮聚醚共聚物，诸如经过聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷与烯丙氧基聚丙二醇甲醚的共聚物(可作为Silwet
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L-77表面活性剂购得)。在所述方法的实施方案中，调节包括施加(a)表面活性剂，(b)有机溶剂或有机溶剂的水溶液或水性混合物，(c)聚丙二醇或聚丙二醇的水溶液或水性混合物，(d)纳米粒子，(e)氧化剂，(f)酸或碱，或(g)油，或其组合。所述方法的实施方案可任选地包括孵育步骤、中和步骤(例如以中和酸、碱或氧化剂或使酶失活)、冲洗步骤或其组合。
本发明提供用于诱导植物中靶标基因的系统性沉默的局部组合物，其包括(a)用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂，和(b)具有18个或更多个相邻核苷酸的至少一个区段的多核苷酸分子，所述区段与靶标基因在反义或有义方向上的核苷酸序列基本上相同或互补。所述组合物可用于本文公开的各种方法，包括通过调节植物中的内源性基因来研究反向遗传学的方法，并且可用作用于杂草控制和自生植物控制的公开方法的除草剂组合物。本发明的另一方面提供包括用于抑制内源性基因的外源DNA或RNA的植物，其中外源DNA未整合到植物染色体中并且外源RNA并非从整合到植物染色体中的DNA转录，并且其中内源性基因是通过向植物局部施加多核苷酸受到抑制。或者，外源DNA或RNA可设计用于抑制对害虫或病原体作出反应时所涉及的内源性植物基因，以提供对植物害虫或疾病的控制。所述植物可从种子生长，或通过插枝、克隆或嫁接方法产生(即植物并非从种子生长)。所述植物是中耕作物、果实、蔬菜、树木或观赏植物。举例来说，在本文公开发明的实施方案中，植物是中耕作物(例如玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜、苜蓿、甘蔗、水稻和小麦)，或者是蔬菜(例如番茄、甜椒、辣椒、甜瓜、西瓜、黄瓜、茄子、花椰菜、青花菜、莴苣、菠菜、洋葱、豌豆、胡萝卜、甜玉米、大白菜、韭菜、茴香、南瓜(pumpkin)、南瓜(squash)或葫芦、小萝卜、球芽甘蓝、粘果酸浆、青刀豆、干豆角或黄秋葵)，或者是烹调植物(例如罗勒、欧芹、咖啡或茶)，或者是果实(例如苹果、梨、樱桃、桃子、李子、杏、香蕉、车前草、鲜食葡萄、酿酒葡萄、柑橘、鳄梨、芒果或浆果)，或者是针对观赏或商业用途生长的树木(例如果树或坚果树，或者是观赏植物(例如观赏开花植物、或灌木、或草坪草)。通过插枝、克隆或嫁接方法产生的植物(即植物并非从种子生长)的实施方案包括果树和果类植物，包括柑橘、苹果、鳄梨、番茄、茄子、黄瓜、甜瓜、西瓜和葡萄，以及各种观赏植物。
用于研究反向遗传学的方法
在另一方面，本发明提供一种通过调控或调节植物中的内源性靶标基因来研究反向遗传学的方法；所述方法包括向生长中的植物的组织施加用于提供(直接或间接)本发明的单链RNA以便对植物细胞中的基因进行系统性调控的组合物。在所述方法的实施方案中，编码蛋白质或调控RNA基因的信使RNA由本发明的多核苷酸靶向，从而在植物生命期间至少1周的时间内实现基因调节，例如以鉴定可通过局部施加多核苷酸赋予的性状。所述方法可更包括附加步骤，例如使植物暴露于一系列化合物以鉴定除草剂相互作用，或使植物暴露于非生物胁迫(例如缺水胁迫、养分缺乏胁迫、热胁迫、冷胁迫、盐度胁迫)或生物处理(例如用昆虫或线虫害虫或用病毒性、真菌或细菌病原体激发，或暴露于化合物或生物处理)以鉴定植物对胁迫或处理的反应。在本发明的另一方面，针对化合物文库(例如除草剂、植物激素、内源性或外源性防御刺激剂(诸如水杨酸或肝素)、提供诸如氮、磷、钾、硫、钙、镁、铁和锌等植物养分的分子缺乏)对具有多种短暂沉默的基因的植物的文库进行筛选以鉴定与所述化合物的相互作用。可用于所述筛选的植物的实例包括长芒苋(Amaranthus palmeri)和本氏烟草。
用于转基因沉默的方法
在本发明的又一方面，这种方法可用于使植物中正在表达的转基因沉默，由此提供阴性对照，所述阴性对照是与事件无关的对转基因对于植物性能的贡献或对性状的影响的衡量。赋予阴性对照作用可能需要在植物的生命周期期间用本发明的多核苷酸分子进行多个连续处理。
特定施加
在一相关方面，本发明的组合物和方法也可用于使生长中的植物细胞或完整植物中的一个或多个基因短暂沉默，以回应于培养条件、环境或非生物或生物胁迫、或生长期期间的市场需求或收获后环境的改变实现所需表型。举例来说，本发明的组合物和方法可用于短暂抑制生物合成或分解代谢基因以便产生具有所需表型的植物或植物产品，诸如作物产品的所需营养组成，例如抑制FAD2基因以实现大豆或油菜或其它含油种子中的所需脂肪酸概况或抑制木质素生物合成基因(诸如COMT和CCOMT)以提供更容易消化的饲料植物。类似地，本发明的组合物和方法可用于短暂抑制诸如微小RNA(miRNA)等RNA调控分子，或内源性miRNA诱饵，诸如内源性miRNA、miRNA前体或如美国专利申请公布2009/0070898(其以引用的方式并入本文)所公开的miRNA诱饵。本发明的实施方案可用于抑制对害虫或病原体作出反应时所涉及的内源性植物基因，由此提供对植物害虫或疾病的控制。本文公开的多核苷酸、组合物和递送方法另外可用于抑制植物无脊椎害虫(例如可摄取植物RNA的鳞翅目或鞘翅目害虫)的内源性靶标基因，由此提供对植物害虫或害虫诱导的疾病的控制，例如通过使用针对作物、蔬菜或果树的具有靶向无脊椎动物必需基因或无脊椎害虫的共生体的基因的DNA或RNA分子的局部喷雾剂。本文公开的多核苷酸、组合物和递送方法另外可用于提供对病毒性病原体的控制，例如通过使用针对作物、蔬菜或果树的具有靶向病毒基因的DNA或RNA分子的局部抗病毒喷雾剂。
除草剂组合物和方法
本发明的一方面提供一种包含多核苷酸分子作为植物致死剂的液体除草剂组合物，所述多核苷酸分子提供至少一种可在植物细胞中的生理条件下与从植物细胞中的内源性基因转录的RNA杂交的单链RNA。在一些实施方案中，靶标基因编码提供除草剂耐受性的蛋白质或编码维持植物生长或生命必不可少的基因。液体除草剂组合物可更包括渗透性增强剂、非核苷酸除草剂或其组合，并且可用于使用单独施加的非核苷酸除草剂和/或渗透性增强剂的多步骤处理中。液体除草剂组合物的一实施方案是一种包括有机硅酮表面活性剂作为渗透性增强剂和寡核苷酸或多核苷酸作为植物致死剂的液体，所述寡核苷酸或多核苷酸向植物细胞提供能够在植物细胞中的生理条件下与从植物细胞中的靶标基因转录的RNA杂交的单链RNA，以实现靶标基因的沉默。在一个实施方案中，有效针对草甘膦抗性植物的液体除草剂组合物包括有机硅酮表面活性剂(诸如Silwet
Figure BPA00001609644700211
L-77表面活性剂)和多核苷酸分子，所述多核苷酸分子用于提供能够在植物细胞中的生理条件下与编码提供草甘膦耐受性的EPSPS蛋白的内源性或转基因EPSPS基因的RNA转录物杂交的单链RNA。当多核苷酸分子被设计成在植物细胞中的生理条件下与编码维持植物生长或生命必不可少的内源性蛋白质或非蛋白质编码RNA的mRNA杂交并且实现基因沉默和必需蛋白质的减少时，所述多核苷酸分子可充当植物致死剂，即核苷酸除草剂。这些包括多核苷酸分子的除草剂组合物可适于局部涂布到生长中的植物的叶子上，或适于施加到水培或盆栽植物的例如根或切枝上。
本发明的一方面提供一种适于局部涂布于活植物的叶子或其它表面上的组合物，所述组合物包括渗透性增强剂(例如表面活性剂，诸如有机硅酮表面活性剂)，和提供(直接或间接)可在植物细胞中的生理条件下与从细胞中的内源性植物基因转录的RNA杂交的单链RNA的寡核苷酸或多核苷酸。在一个实施方案中，内源性植物基因是编码提供针对诸如草甘膦、麦草畏(dicamba)或磺酰脲等除草剂的除草剂耐受性的蛋白质的内源性植物基因。所述提供除草剂耐受性的蛋白质的实例公开于下文中的章节“除草剂耐受性蛋白”中。
本发明的另一方面提供一种用于控制在除草剂抗性作物的田间生长的除草剂抗性自生植物的方法，其包括在自生植物的叶子或其它表面上施加一种组合物，所述组合物向自生植物的细胞提供或允许在自生植物的细胞中产生能够在自生植物的细胞中的生理条件下与从细胞中的内源性基因转录的RNA杂交的单链RNA分子，其中所述内源性基因(i)是用于维持自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码向自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂(例如启动子以及miRNA前体、miRNA、反式作用siRNA，和其它具有调控功能的非编码RNA，诸如适体和核糖开关)。所述向自生植物的细胞提供或允许在自生植物的细胞中产生能够在自生植物的细胞中的生理条件下与从细胞中的内源性基因转录的RNA杂交的单链RNA分子的组合物包括至少一种选自由以下组成的组的多核苷酸分子：(a)单链RNA分子，(b)自身杂交形成双链RNA分子的单链RNA分子，(c)双链RNA分子，(d)单链DNA分子，(e)自身杂交形成双链DNA分子的单链DNA分子，和(f)转录成RNA分子的包括经过修饰的Pol III基因在内的单链DNA分子，(g)双链DNA分子，(h)转录成RNA分子的包括经过修饰的Pol III基因在内的双链DNA分子，和(i)双链杂交RNA/DNA分子；在关于沉默或抑制自生植物中编码向自生植物提供除草剂抗性的蛋白质的内源性基因的实施方案中，所述方法可包括向自生植物施加一定量的被所述蛋白质抵抗的除草剂。本发明的组合物和方法可用于控制可生长在作物田间的除草剂耐受性(抗性)杂草或自生除草剂耐受性(抗性)转基因植物，所述作物田间为例如除草剂抗性作物(诸如玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜、苜蓿、甘蔗、水稻、小麦以及果实和蔬菜作物)的田间。在一些所述实施方案中，所述杂草或自生植物是藜(例如长芒苋)和其它苋属物种、飞篷(加拿大飞篷)、水麻(waterhemp)、三裂叶豚草(giant ragweed)、美洲豚草(common ragweed)、约翰逊草(johnsongrass)、牛筋草、黑麦草、毛马唐、多刺莴苣、绒毛叶(velvetleaf)、苜蓿、玉米、大豆、油菜、棉花、甜菜、甘蔗、水稻或小麦。在一些所述实施方案中，所述内源性基因编码提供除草剂耐受性的蛋白质；所述蛋白质的实例公开于本文中的章节“除草剂耐受性蛋白”中。在其它所述实施方案中，单链RNA选择性抑制特定植物物种而非其它植物物种中的基因，以允许选择性控制这一植物物种。在其它所述实施方案中，非选择性单链RNA分子抑制多个植物物种中的共同基因，从而允许更广泛地控制一组或一个分类群的植物。在更特定的实施方案中，所述方法更包括向杂草或自生植物施加一定量的被RNA分子所靶向的蛋白质抵抗的非核苷酸除草剂(例如草甘膦、麦草畏、草铵膦(glufosinate)或磺酰脲)，从而通过所述RNA分子的作用减少靶标蛋白质的产生并且抑制通过所述非核苷酸除草剂的作用产生的蛋白质的功能来允许双重作用模式；所述除草剂可在与核苷酸组合物分开(较早或稍后)的步骤中或与核苷酸组合物一起施加。在一些情况下，与施加常规非核苷酸除草剂同时施加多核苷酸组合物或在施加多核苷酸组合物后施加常规非核苷酸除草剂会以协同作用控制杂草或自生植物(即其中组合作用大于单独进行的处理的作用的总和)。
除草剂耐受性蛋白
展现除草剂耐受性(抗性)的天然(非转基因)和转基因植物通常具有编码负责除草剂耐受性的蛋白质的基因，例如提供耐受性的转基因、提供耐受性的突变型内源性基因或多个拷贝的通常由除草剂靶向的内源性基因。用于控制所述植物的策略是施加抑制编码赋予除草剂耐受性的蛋白质的基因或至少减少所述基因的表达的试剂。提供除草剂耐受性的蛋白质的实例包括例如5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草甘膦氧化还原酶(GOX)、草甘膦脱羧酶、草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)、麦草畏单加氧酶、草胺膦乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase)、2，2-二氯丙酸脱卤素酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、卤芳基腈水解酶、乙酰辅酶A羧化酶、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶、原卟啉IX加氧酶、羟基苯丙酮酸双加氧酶、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶、纤维素合酶、β-微管蛋白和丝氨酸羟甲基转移酶。
编码赋予除草剂耐受性的蛋白质的核酸的实例包括5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS；参看例如美国专利号5,627,061、5,633,435RE39247、6,040,497和5,094,945，以及PCT国际申请公布WO04074443和WO04009761)、草甘膦氧化还原酶(GOX；美国专利号5,463,175)、草甘膦脱羧酶(PCT国际申请公布WO05003362、美国专利号7,405,347和美国专利申请公布2004/0177399)、赋予草甘膦耐受性的草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT；美国专利号7,714,188)；麦草畏单加氧酶，赋予对诸如麦草畏等生长素样除草剂的耐受性(美国专利号7,105,724)；草胺膦乙酰转移酶(pat或bar)，赋予草胺膦或草铵膦耐受性(美国专利号5,646,024)；2，2-二氯丙酸脱卤素酶，赋予2，2-二氯丙酸(Dalapon)耐受性(PCT国际申请公布WO9927116)；乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶，赋予对诸如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基氧基苯甲酸和苯酞等乙酰乳酸合酶抑制剂的耐受性(美国专利号6,225,105)；卤芳基腈水解酶(Bxn)，赋予溴苯腈(bromoxynil)耐受性(美国专利号4,810,648)；经过修饰的乙酰辅酶A羧化酶，赋予对环己二酮(稀禾定(sethoxydim))和芳氧基苯氧基丙酸(吡氟氯禾灵(haloxyfop))的耐受性(美国专利号6,414,222)；二氢蝶酸合酶(sul I)，赋予对磺酰胺除草剂的耐受性(美国专利号5,719,046)；32kDa光合系统II多肽(psbA)，赋予对三嗪除草剂的耐受性(Hirschberg等，1983，Science，222：1346-1349)；邻氨基苯甲酸合酶，赋予对5-甲基色氨酸的耐受性(美国专利号4,581,847)；二氢吡啶二羧酸合酶(dap A)，赋予对氨乙基半胱氨酸的耐受性(PCT国际申请公布WO8911789)；八氢番茄红素去饱和酶(crtI)，赋予对诸如达草灭(norflurazon)等哒嗪酮除草剂的耐受性(日本专利JP06343473)；羟基苯丙酮酸双加氧酶、4-羟基苯基乙酸氧化酶和4-羟基苯基乙酸1-水解酶(美国专利7,304,209)，赋予对诸如异噁唑草酮(isoxaflutole)等环丙基异噁唑除草剂的耐受性(美国专利号6,268,549)；经过修饰的原卟啉原氧化酶I(protox)，赋予对原卟啉原氧化酶抑制剂的耐受性(美国专利号5939602)；芳氧基链烷酸双加氧酶(AAD-1)，赋予对含有芳氧基链烷酸部分的除草剂的耐受性(WO05107437)；丝氨酸羟甲基转移酶(美国专利申请公布2008/0155716)、草铵膦耐受性谷氨酰胺合酶(美国专利申请公布2009/0018016)。所述除草剂的实例包括含苯氧基的生长素(诸如2，4-D和滴丙酸(dichlorprop))、含吡啶基氧基的生长素(诸如氟草烟(fluroxypyr)和绿草定(triclopyr))、芳氧基苯氧基丙酸(AOPP)乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂(诸如吡氟氯禾灵、喹禾灵(quizalofop)和二氯苯氧基苯氧基丙酸(diclofop))，和5位经过取代的苯氧基乙酸原卟啉原氧化酶IX抑制剂(诸如吡草醚(pyraflufen)和氟烯草酸(flumiclorac))。编码除草剂耐受性蛋白的核酸的核苷酸序列和除草剂耐受性蛋白的序列(如这一段中所引用的美国专利和专利申请公布所公开)以引用的方式并入本文。
本发明的各方面提供直接或间接向植物细胞提供植物致死量或至少降低除草剂耐受性的量的与编码所述除草剂耐受性蛋白的RNA杂交的RNA的多核苷酸和方法。由于编码除草剂耐受性蛋白的DNA的序列简并性，有可能设计用于本发明中对特定植物特别有效的多核苷酸。由于多种植物中DNA结构域的保守性，有可能设计用于本发明中对多种植物有效的多核苷酸。
在一实施方案中，所述多核苷酸与相应的除草剂混合以通过提供提高的除草剂活性来增强所述除草剂的活性。在一实施方案中，所述多核苷酸与所述除草剂分开使用，但与作为预处理或后处理施加的除草剂组合使用。在各实施方案中，当组合物以连续性方式施加时，有机硅酮表面活性剂宜与除草剂和多核苷酸组合，或与一者或另一者组合。温室配置中的植物可使用履带式喷洒器或具有11001XR喷雾喷嘴的实验室喷洒器在0.25MPa压力下以确定的速率(例如140L/ha)递送样品溶液进行处理。在田间，处理溶液可用CO2加压背负式喷洒器施加，所述喷洒器经过校准以在0.25MPa的喷洒压力下用具有定制单喷嘴组合件(以使浪费减到最少)的11015扇形雾锥喷嘴以适当速率递送组合物；单喷嘴喷洒器提供3至12英寸高的生长中的植物的冠层上方60cm的有效喷幅。
以上描述和本公开中呈现的实施例描述了本发明的主题，本发明的主题包括但不限于这些罗马数字编号的分句中所述的各方面和实施方案：(I)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达。(II)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控除局部涂布处以外的植物细胞中所述靶标内源性基因的表达。(III)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸系统地调控至少一种植物器官中靶标内源性基因的表达。(IV)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述多核苷酸组合物诱导对所述靶标内源性基因的抑制。(V)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述多核苷酸组合物在生长中的植物或植物器官中实现所需表型。(VI)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述多核苷酸组合物抑制生长中的植物或植物器官中酶、结构蛋白质或植物调控蛋白质的表达。(VII)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述多核苷酸组合物是一种植物致死剂。(VIII)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述靶标内源性基因编码与除草剂相互作用的蛋白质。(IX)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述靶标内源性基因是选自由以下组成的组：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶(GS)、草铵膦耐受性谷氨酰胺合酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DOXP)合酶、二氢蝶酸(DHP)合酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光合系统II的D1蛋白、单加氧酶、细胞色素P450、纤维素合酶、β-微管蛋白和丝氨酸羟甲基转移酶。(X)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述靶标内源性基因编码维持生长中的植物的生长必不可少的蛋白质。(XI)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述靶标内源性基因是选自由以下组成的组：RuBisCO、翻译起始因子和八氢番茄红素去饱和酶。(XII)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述靶标内源性基因编码提供除草剂耐受性的蛋白质。(XIII)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述靶标内源性基因编码赋予磺酰脲和咪唑啉酮除草剂抗性的突变型乙酰乳酸合酶或赋予芳氧基苯氧基丙酸除草剂抗性的突变型ACCase。(XIV)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述多核苷酸组合物更包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸具有与第二靶标内源性基因或从所述第二靶标内源性基因转录的信使RNA的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列。(XV)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述多核苷酸组合物更包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸具有与第二靶标内源性基因或从所述第二靶标内源性基因转录的信使RNA的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列，其中所述至少一种多核苷酸与生长中的植物或植物器官中内源性EPSPS基因的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补，并且所述第二多核苷酸与生长中的植物或植物器官中内源性翻译起始因子基因的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补。(XVI)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述靶标内源性基因是非编码序列、编码序列或非编码序列与编码序列的组合。(XVII)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述多核苷酸组合物是涂布到生长中的植物的器官上。(XVIII)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述多核苷酸组合物是涂布到生长中的植物的叶子、茎、种子、果实或花上。(XIX)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述多核苷酸组合物更包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA的不同于所述至少一种多核苷酸的区段的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列。(XX)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述生长中的植物是在旷野中或在温室中。(XXI)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述多核苷酸未整合到所述生长中的植物的染色体中。(XXII)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和盐。(XXIII)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：有机硅酮表面活性剂和盐。(XXIV)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和盐。(XXV)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和盐，其中所述硅酮聚醚共聚物是经过聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷与烯丙氧基聚丙二醇甲醚的共聚物。(XXVI)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和盐，其中所述盐是有机盐或无机盐。(XXVII)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂、有机铵盐和无机铵盐。(XXVIII)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和硫酸铵。(XXIX)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和盐，并且更包括保湿剂或螯合剂。(XXX)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述多核苷酸组合物是通过喷洒装置涂布到生长中的植物或植物器官上。(XXXI)一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包含至少一种具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，和有效量的转移剂，以允许所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达，其中所述多核苷酸是选自由以下组成的组：ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA和RNA/DNA杂交体。(XXXII)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性。(XXXIII)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述内源性基因表达的蛋白质是除草剂靶标基因或除草剂去活基因。(XXXIV)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述内源性基因表达的蛋白质是选自由以下组成的组的除草剂靶标基因或除草剂去活基因：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶(GS)、草铵膦耐受性谷氨酰胺合酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DOXP)合酶、二氢蝶酸(DHP)合酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光合系统II的D1蛋白、单加氧酶、细胞色素P450、纤维素合酶、β-微管蛋白和丝氨酸羟甲基转移酶。(XXXV)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述多核苷酸组合物和所述除草剂是分开或在同一溶液中施加。(XXXVI)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述多核苷酸是选自由以下组成的组：ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA和RNA/DNA杂交体。(XXXVII)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述多核苷酸组合物更包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA的不同于所述至少一种多核苷酸的区段的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列。(XXXVIII)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述多核苷酸组合物更包括多个多核苷酸，所述多个多核苷酸各自具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA的不同于所述至少一种多核苷酸的区段的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列。(XXXIX)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和盐。(XL)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：有机硅酮表面活性剂和盐。(XLI)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和盐。(XLII)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和盐，其中所述硅酮聚醚共聚物是经过聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷与烯丙氧基聚丙二醇甲醚的共聚物。(XLIII)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和盐，其中所述盐是有机盐或无机盐。(XLIV)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂、有机铵盐和无机铵盐。(XLV)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和硫酸铵。(XLVI)一种用于增强生长中的植物中除草剂的活性的方法，其包括(a)在生长中的植物的表面上局部涂布多核苷酸组合物，所述组合物包括至少一种具有与植物内源性基因中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上互补的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，和有效量的转移剂，以允许所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部，和(b)向所述生长中的植物施加所述除草剂；由此所述至少一种多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对内源性基因的抑制，由此增强生长中的植物中所述除草剂的活性，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和盐，其中所述转移剂更包括保湿剂或螯合剂。(XLVII)在一种包括表面活性剂和至少一种植物致死剂的适于局部涂布到生长中的植物的外部表面上的液体除草剂组合物中，改进之处在于其中所述植物致死剂包括具有与植物基因的序列或植物基因的转录RNA的序列基本上相同或互补的序列的多核苷酸，所述多核苷酸实现与针对植物基因的探针杂交的小RNA的系统性产生。(XLVIII)在一种包括非多核苷酸除草剂的液体除草剂组合物中，改进之处在于其中所述组合物更包括具有与植物基因的序列或植物基因的转录RNA的序列基本上相同或互补的序列的多核苷酸。(XLIX)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进双链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂。(L)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进双链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和盐。(LI)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进双链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：有机硅酮表面活性剂和无机盐。(LII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进双链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和无机盐。(LIII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进双链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和无机盐，其中所述硅酮聚醚共聚物是经过聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷与烯丙氧基聚丙二醇甲醚的共聚物(可作为Silwet
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L-77表面活性剂获得)。(LIV)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进双链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，更包括非多核苷酸除草剂分子。(LV)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进双链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述植物基因编码提供除草剂耐受性的蛋白质并且是5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶(GS)、草铵膦耐受性谷氨酰胺合酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DOXP)合酶、二氢蝶酸(DHP)合酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光合系统II的D1蛋白、单加氧酶、细胞色素P450、纤维素合酶、β-微管蛋白或丝氨酸羟甲基转移酶。(LVI)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂。(LVII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和盐。(LVIII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：有机硅酮表面活性剂和无机盐。(LIX)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和无机盐。(LX)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和无机盐，其中所述硅酮聚醚共聚物是经过聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷与烯丙氧基聚丙二醇甲醚的共聚物(可作为Silwet
Figure BPA00001609644700401
L-77表面活性剂获得)。(LXI)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，更包括非多核苷酸除草剂分子。(LXII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述植物基因编码提供除草剂耐受性的蛋白质并且是5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶(GS)、草铵膦耐受性谷氨酰胺合酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DOXP)合酶、二氢蝶酸(DHP)合酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光合系统II的D1蛋白、单加氧酶、细胞色素P450、纤维素合酶、β-微管蛋白或丝氨酸羟甲基转移酶。(LXIII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂。(LXIV)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和盐。(LXV)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：有机硅酮表面活性剂和无机盐。(LXVI)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和无机盐。(LXVII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和无机盐，其中所述硅酮聚醚共聚物是经过聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷与烯丙氧基聚丙二醇甲醚的共聚物(可作为Silwet
Figure BPA00001609644700421
L-77表面活性剂获得)。(LXVIII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，更包括非多核苷酸除草剂分子。(LXIX)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述植物基因编码提供除草剂耐受性的蛋白质并且是5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶(GS)、草铵膦耐受性谷氨酰胺合酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DOXP)合酶、二氢蝶酸(DHP)合酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光合系统II的D1蛋白、单加氧酶、细胞色素P450、纤维素合酶、β-微管蛋白或丝氨酸羟甲基转移酶。(LXX)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂。(LXXI)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和盐。(LXXII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：有机硅酮表面活性剂和无机盐。(LXXIII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和无机盐。(LXXIV)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和无机盐，其中所述硅酮聚醚共聚物是经过聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷与烯丙氧基聚丙二醇甲醚的共聚物(可作为Silwet
Figure BPA00001609644700441
L-77表面活性剂获得)。(LXXV)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，更包括非多核苷酸除草剂分子。(LXXVI)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述植物基因编码提供除草剂耐受性的蛋白质并且是5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶(GS)、草铵膦耐受性谷氨酰胺合酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DOXP)合酶、二氢蝶酸(DHP)合酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光合系统II的D1蛋白、单加氧酶、细胞色素P450、纤维素合酶、β-微管蛋白或丝氨酸羟甲基转移酶。(LXXVII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA/RNA杂交体多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂。(LXXVIII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA/RNA杂交体多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：表面活性剂和盐。(LXXIX)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA/RNA杂交体多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：有机硅酮表面活性剂和无机盐。(LXXX)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA/RNA杂交体多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和无机盐。(LXXXI)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA/RNA杂交体多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述转移剂是选自由以下组成的组：硅酮聚醚共聚物有机硅酮表面活性剂和无机盐，其中所述硅酮聚醚共聚物是经过聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷与烯丙氧基聚丙二醇甲醚的共聚物(可作为Silwet
Figure BPA00001609644700461
L-77表面活性剂获得)。(LXXXII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA/RNA杂交体多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，更包括非多核苷酸除草剂分子。(LXXXIII)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA/RNA杂交体多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂，其中所述植物基因编码提供除草剂耐受性的蛋白质并且是5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶(GS)、草铵膦耐受性谷氨酰胺合酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DOXP)合酶、二氢蝶酸(DHP)合酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光合系统II的D1蛋白、单加氧酶、细胞色素P450、纤维素合酶、β-微管蛋白或丝氨酸羟甲基转移酶。(LXXXIV)一种用于选择性控制在除草剂抗性作物的田间生长的靶标除草剂抗性自生植物的方法，其包括在自生植物的叶子上施加一种包括多核苷酸寡聚物的组合物，所述多核苷酸寡聚物在自生植物的细胞中提供能够在自生植物的细胞中的生理条件下与从内源基因内源性基因转录的信使RNA杂交的系统性单链RNA，所述内源性基因(i)是用于维持自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂。(LXXXV)一种用于选择性控制在除草剂抗性作物的田间生长的靶标除草剂抗性自生植物的方法，其包括在自生植物的叶子上施加一种包括多核苷酸寡聚物的组合物，所述多核苷酸寡聚物在自生植物的细胞中提供能够在自生植物的细胞中的生理条件下与从内源基因内源性基因转录的信使RNA杂交的系统性单链RNA，所述内源性基因(i)是用于维持自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂，其中所述组合物包括表面活性剂和选自由单链RNA、双链RNA、单链DNA、双链DNA和双链杂交RNA/DNA组成的组的寡聚物，其中所述寡聚物具有与内源性基因的信使RNA基本上相同或互补的序列；并且其中所述内源性基因是天然基因或重组转基因。(LXXXVI)一种用于选择性控制在除草剂抗性作物的田间生长的靶标除草剂抗性自生植物的方法，其包括在自生植物的叶子上施加一种包括多核苷酸寡聚物的组合物，所述多核苷酸寡聚物在自生植物的细胞中提供能够在自生植物的细胞中的生理条件下与从内源基因内源性基因转录的信使RNA杂交的系统性单链RNA，所述内源性基因(i)是用于维持自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂，其中所述自生植物是藜、绒毛叶、水麻、多刺莴苣、蒲公英、苜蓿、玉米、大豆、油菜、棉花、甜菜、甘蔗、小麦、水稻或蔬菜。(LXXXVII)一种用于选择性控制在除草剂抗性作物的田间生长的靶标除草剂抗性自生植物的方法，其包括在自生植物的叶子上施加一种包括多核苷酸寡聚物的组合物，所述多核苷酸寡聚物在自生植物的细胞中提供能够在自生植物的细胞中的生理条件下与从内源基因内源性基因转录的信使RNA杂交的系统性单链RNA，所述内源性基因(i)是用于维持自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂，其中作物是玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜、苜蓿、甘蔗、水稻、小麦或果实或蔬菜作物。(LXXXVIII)一种用于选择性控制在除草剂抗性作物的田间生长的靶标除草剂抗性自生植物的方法，其包括在自生植物的叶子上施加一种包括多核苷酸寡聚物的组合物，所述多核苷酸寡聚物在自生植物的细胞中提供能够在自生植物的细胞中的生理条件下与从内源基因内源性基因转录的信使RNA杂交的系统性单链RNA，所述内源性基因(i)是用于维持自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂，其中所述内源性基因编码对自生植物提供除草剂抗性的蛋白质并且所述蛋白质是5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶(GS)、草铵膦耐受性谷氨酰胺合酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DOXP)合酶、二氢蝶酸(DHP)合酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光合系统II的D1蛋白、单加氧酶、细胞色素P450、纤维素合酶、β-微管蛋白或丝氨酸羟甲基转移酶。(LXXXIX)一种用于选择性控制在除草剂抗性作物的田间生长的靶标除草剂抗性自生植物的方法，其包括在自生植物的叶子上施加一种包括多核苷酸寡聚物的组合物，所述多核苷酸寡聚物在自生植物的细胞中提供能够在自生植物的细胞中的生理条件下与从内源基因内源性基因转录的信使RNA杂交的系统性单链RNA，所述内源性基因(i)是用于维持自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂，其中所述内源性基因编码对自生植物提供除草剂抗性的蛋白质并且所述蛋白质是5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶(GS)、草铵膦耐受性谷氨酰胺合酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DOXP)合酶、二氢蝶酸(DHP)合酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光合系统II的D1蛋白、单加氧酶、细胞色素P450、纤维素合酶、β-微管蛋白或丝氨酸羟甲基转移酶，所述方法更包括在自生植物上施加一定量的被蛋白质抵抗的除草剂。(XC)一种通过调节植物中的内源性靶标基因来研究反向遗传学的方法，所述方法包括在生长中的植物的组织上施加：(1)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进双链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(2)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(3)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(4)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(5)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA/RNA杂交体多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂。(XCI)一种通过调节植物中的内源性靶标基因来研究反向遗传学的方法，所述方法包括在生长中的植物的组织上施加：(1)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进双链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(2)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(3)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(4)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(5)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA/RNA杂交体多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；其中所述组合物在植物生命期间至少1周的时间内实现对靶标基因的调节。(XCII)一种通过调节植物中的内源性靶标基因来研究反向遗传学的方法，所述方法包括在生长中的植物的组织上施加：(1)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进双链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(2)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(3)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(4)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(5)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA/RNA杂交体多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；其中细胞中转录的RNA是编码蛋白质或调控RNA的信使RNA。(XCIII)一种通过调节植物中的内源性靶标基因来研究反向遗传学的方法，所述方法包括在生长中的植物的组织上施加：(1)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进双链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(2)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(3)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(4)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(5)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA/RNA杂交体多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；所述方法更包括使植物暴露于一系列化合物以鉴定除草剂相互作用。(XCIV)一种通过调节植物内源性基因来研究反向遗传学的方法，所述方法包括在活植物的组织上局部施加：(1)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进双链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(2)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(3)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(4)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂；或(5)一种主要由以下组成的组合物：(a)不可转录双链DNA/RNA杂交体多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物内源性基因的序列或从内源性基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸能够在植物细胞中的生理条件下与内源性基因或从内源性基因转录的RNA杂交以实现内源性基因的沉默；和(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交体多核苷酸从植物表面转移到植物细胞中的转移剂。(XCV)一种除草剂组合物，其包括以下各物的水溶液：(a)用于调节植物的多核苷酸寡聚物渗透的试剂，和(b)包括至少一条多核苷酸链的多核苷酸寡聚物，所述多核苷酸链包括植物内源性基因在反义或有义方向上的18个或更多个相邻核苷酸的至少一个区段，其中所述内源性基因编码对化学除草剂提供植物抗性的蛋白质或者是必需基因。(XCVI)一种除草剂组合物，其包括以下各物的水溶液：(a)用于调节植物的多核苷酸寡聚物渗透的试剂，和(b)包括至少一条多核苷酸链的多核苷酸寡聚物，所述多核苷酸链包括植物内源性基因在反义或有义方向上的18个或更多个相邻核苷酸的至少一个区段，其中所述内源性基因编码对化学除草剂提供植物抗性的蛋白质或者是必需基因，所述组合物更包括化学除草剂。(XCVII)一种除草剂组合物，其包括以下各物的水溶液：(a)用于调节植物的多核苷酸寡聚物渗透的试剂，和(b)包括至少一条多核苷酸链的多核苷酸寡聚物，所述多核苷酸链包括植物内源性基因在反义或有义方向上的18个或更多个相邻核苷酸的至少一个区段，其中所述内源性基因编码对化学除草剂提供植物抗性的蛋白质或者是必需基因，所述组合物更包括化学除草剂，所述化学除草剂包括草甘膦、麦草畏、草胺膦、溴苯腈、碘苯腈或绿磺隆(chlorsulfuron)除草剂化合物。(XCVIII)一种除草剂组合物，其包括以下各物的水溶液：(a)用于调节植物的多核苷酸寡聚物渗透的试剂，和(b)包括至少一条多核苷酸链的多核苷酸寡聚物，所述多核苷酸链包括植物内源性基因在反义或有义方向上的18个或更多个相邻核苷酸的至少一个区段，其中所述内源性基因编码对化学除草剂提供植物抗性的蛋白质或者是必需基因，所述组合物更包括化学除草剂，所述化学除草剂包括草甘膦化合物、硅酮聚醚共聚物表面活性剂和多核苷酸寡聚物。(XCIX)一种包括用于抑制内源性基因的外源DNA或RNA的植物，其中所述外源DNA未整合到植物染色体中并且所述外源RNA并非从整合到植物染色体中的DNA转录，并且其中所述内源性基因在植物从种子出苗后通过向植物局部施加多核苷酸而受到抑制。(C)一种通过向植物细胞的外部局部施加多核苷酸而向植物细胞的内部递送多核苷酸的方法，所述方法包括组合所述多核苷酸与有机硅酮表面活性剂。(CI)一种通过向植物细胞的外部局部施加多核苷酸而向植物细胞的内部递送多核苷酸的方法，所述方法包括组合所述多核苷酸与有机硅酮表面活性剂，其中所述有机硅酮表面活性剂是硅酮聚醚共聚物。(CII)一种通过向植物细胞的外部局部施加多核苷酸而向植物细胞的内部递送多核苷酸的方法，所述方法包括组合所述多核苷酸与有机硅酮表面活性剂，其中所述有机硅酮表面活性剂是硅酮聚醚共聚物，其中所述硅酮聚醚共聚物是经过聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷与烯丙氧基聚丙二醇甲醚的共聚物。(CIII)一种通过向植物细胞的外部局部施加多核苷酸而向植物细胞的内部递送多核苷酸的方法，所述方法包括组合所述多核苷酸与有机硅酮表面活性剂和有机盐或无机盐。(CIV)一种通过向植物细胞的外部局部施加多核苷酸而向植物细胞的内部递送多核苷酸的方法，所述方法包括组合所述多核苷酸与有机硅酮表面活性剂和有机盐或无机盐，其中所述盐是铵盐。(CV)一种通过向植物细胞的外部局部施加多核苷酸而向植物细胞的内部递送多核苷酸的方法，所述方法包括组合所述多核苷酸与有机硅酮表面活性剂和有机盐或无机盐，其中所述盐是铵盐，其中所述铵盐是硫酸铵。(CVI)一种通过向植物细胞的外部局部施加多核苷酸而向植物细胞的内部递送多核苷酸的方法，所述方法包括组合所述多核苷酸与有机硅酮表面活性剂，其中所述多核苷酸组合物是通过喷洒装置涂布到生长中的植物或植物器官上。
实施例1
本实施例说明本发明的多核苷酸分子控制除草剂抗性杂草的效用。草甘膦抗性长芒苋的基因型鉴定为具有多个拷贝，例如4至超过100个拷贝的编码由除草剂处理中的草甘膦化合物所靶向的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因。
关于图1中所示的SEQ ID NO：1，如图1中加下划线的核苷酸所指示，设计具有能够与从长芒苋EPSPS基因的位置14-38(短dsRNA-1)、位置153-177(短dsRNA-2)、345-369(短dsRNA-3)和1105-1129(短dsRNA-4)上转录的mRNA杂交的反义链的四种寡核苷酸尺寸的“短”dsRNA分子。四种所设计的短dsRNA从Integrated DNA Technologies(IDT)购得；所述dsRNA在反义链的3’末端具有两个核苷酸的悬垂物并且在有义链的3’末端具有两个脱氧核苷酸作为末端核苷酸。
关于SEQ ID NO：1和图1，如图1中的粗体核苷酸所指示，设计具有能够与从长芒苋EPSPS基因的位置16-170(长dsRNA-1)、451-722(长dsRNA-2)和1109-1328(长dsRNA-3)上转录的mRNA杂交的一条链的三种“长”双链RNA多核苷酸。三种所设计的长dsRNA是使用Ambion MEGAscript
Figure BPA00001609644700551
RNAi试剂盒(目录号1626)制得。
使具有16个拷贝的编码EPSPS的内源性基因的草甘膦抗性长芒苋营养克隆(Gaines等(2010)Proceedings of the National Academy of Sciences 107(3)：1029-1034)在3.5英寸方形罐中含有3.5kg/m3Osmocote
Figure BPA00001609644700552
14-14-14肥料的SunGro
Figure BPA00001609644700553
Redi-earth幼苗混合物中在具有14小时光周期以及30℃日间温度和20℃夜间温度的温室中生长；必要时，植物用去离子水浇水。
通过用蒸馏水稀释Silwet L-77牌有机硅酮表面活性剂至0.1％(v/v)来制备用于叶子浸渍的预处理表面活性剂溶液。通过在40ml蒸馏水中混合2g金刚砂(400颗粒度)来制备预处理5％(w/v)金刚砂溶液。用含10mM磷酸钠和0.01％(v/v)Silwet L-77有机硅酮表面活性剂的DEPC水(OmegaBio-Tek)制备处理缓冲溶液并且调整至pH 6.8。用处理缓冲溶液中等摩尔量的四种短dsRNA中的每一者(上文鉴定)制备浓度为每微升0.005纳摩尔每种短dsRNA的短dsRNA溶液。用处理缓冲液中等摩尔量的三种长dsRNA中的每一者制备浓度为每微升0.0006纳摩尔每种长dsRNA的长dsRNA溶液。用每微升0.005纳摩尔四种短dsRNA中的每一者和0.0006纳摩尔三种长dsRNA中的每一者制备混合(短/长)dsRNA溶液。
将具有16个拷贝的编码EPSPS的内源性基因的草甘膦抗性长芒苋的营养克隆用金刚砂溶液或表面活性剂溶液预处理以调节叶子使其转移或渗透dsRNA。对于金刚砂溶液预处理，通过在叶子的上表面上轻轻地擦上0.5ml金刚砂溶液，用水冲洗并且吸干来实现叶子磨蚀。对于表面活性剂溶液预处理，将四片完全展开的成熟来源叶子浸渍于表面活性剂溶液中且使其干燥。用金刚砂溶液或表面活性剂溶液预处理叶子后，用缓冲溶液(作为对照)或40微升dsRNA溶液(在每株植物4片叶子中的每一者上施加10微升dsRNA溶液)处理经过调节的叶子。用短dsRNA溶液处理时，向每株处理过的植物施加约0.8纳摩尔短dsRNA分子(0.2纳摩尔每种短dsRNA)。用长dsRNA溶液处理时，向每株处理过的植物施加约0.072纳摩尔长dsRNA分子(0.024纳摩尔每种长dsRNA)。用混合(短/长)dsRNA溶液处理时，向每株处理过的植物施加约0.8纳摩尔短dsRNA分子和约0.072纳摩尔长dsRNA分子。除对照以外，所有植物均在dsRNA处理后即刻、48或72小时喷洒草甘膦除草剂溶液(每公顷1682g酸当量的RoundupWeatherMAX
Figure BPA00001609644700562
牌除草剂)并且在草甘膦后处理至少7天后进行评价。
结果：
六株用表面活性剂处理过的对照植物(无dsRNA分子处理)在草甘膦处理后存活。参看图3A中草甘膦处理后7天植物的图像。
四株用金刚砂研磨剂处理过的对照植物(无dsRNA分子处理)中的两株由于草甘膦处理而被杀死。
六株用表面活性剂处理过的植物在施加混合(短/长)dsRNA溶液后即刻用草甘膦处理的情况下存活，但矮化。
六株用表面活性剂处理过的植物在仅用混合(短/长)dsRNA溶液处理而无草甘膦的情况下存活。六株用表面活性剂处理过的植物中的五株在用混合(短/长)dsRNA溶液处理，随后用草甘膦处理的情况下被杀死。
六株用表面活性剂处理过的植物中的五株在施加混合(短/长)dsRNA溶液后48小时用草甘膦处理的情况下被杀死。
四株用金刚砂处理过的植物中的三株在施加混合(短/长)dsRNA溶液后48小时用草甘膦处理的情况下被杀死。
六株用表面活性剂处理过的植物中的五株在用长dsRNA溶液处理，随后72小时后用草甘膦处理的情况下被杀死；参看图3B。六株用表面活性剂处理过的植物中的六株在用短dsRNA溶液处理，随后72小时后用草甘膦处理的情况下均被杀死；参看图3C。
实施例2
本实施例说明本发明的多核苷酸分子用于改进对草甘膦除草剂敏感性杂草的控制的效用。将实施例1中制备的混合(短/长)dsRNA溶液施加到已用实施例1中所用的表面活性剂溶液预处理过的草甘膦敏感性绒毛叶植物上(总共40微升施加到两片叶子上)。对照植物在用表面活性剂溶液预处理后仅用缓冲液处理。dsRNA处理后48小时，植物用草甘膦除草剂溶液处理(每公顷53g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700571
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700572
牌草甘膦除草剂)。与用缓冲液和除草剂处理的对照植物相比，在用多核苷酸组合物和除草剂处理的植物中观察到草甘膦活性的两倍增加，如通过观察植物生长(测量为植物高度)所估计。用多核苷酸组合物和除草剂处理的植物存活，但严重矮化；用缓冲液和除草剂处理的对照植物存活，并且完全恢复。使用其它草甘膦除草剂敏感性杂草(即草甘膦除草剂敏感性水麻、红根藜、三裂叶豚草、多刺莴苣、烟草和蒲公英)，获得类似结果。
实施例3
本实施例说明本发明的多核苷酸分子用于控制转基因草甘膦抗性作物中的杂草的效用。具有用于表达细菌EPSPS的重组DNA的转基因苜蓿、油菜、玉米、棉花、水稻、大豆、甘蔗、甜菜和小麦植物(参看美国专利RE39,247中关于草甘膦抗性“II类”EPSPS基因的描述)在dsRNA处理后48小时用(a)实施例1中所用的表面活性剂溶液，(b)实施例1中制备的混合(短/长)dsRNA溶液，和(c)草甘膦除草剂溶液(每公顷1682g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700581
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700582
)处理。30天后，所有转基因草甘膦抗性作物均存活且不显示矮化。
实施例4
本实施例说明本发明的多核苷酸分子作为除草剂的效用。两种dsRNA多核苷酸分子被设计成靶向编码烟草(本氏烟草)中的八氢番茄红素去饱和酶的mRNA的重叠区段。关于SEQ ID NO：2和图5，使用Ambion
Figure BPA00001609644700583
MEGAscript
Figure BPA00001609644700584
试剂盒制备靶向mRNA的192nt长度(图5中以粗体显示)和685nt长度(图5中以下划线显示)的dsRNA。制备单独的dsRNA溶液。烟草植物叶子用实施例1中制备的表面活性剂溶液预处理，接着用所述dsRNA溶液中的任一者处理，每株植物施加约0.6微摩尔dsRNA。dsRNA处理后第9天，从顶叶上漂白的可见叶子明显可见八氢番茄红素去饱和酶沉默；参看图4。dsRNA处理后15天，有一半处理过的植物看起来死亡并且另一半植物的大部分地上组织被漂白。RNA印迹分析指示存在对应于处理中所用dsRNA的siRNA。
实施例5
本实施例进一步说明本发明的多核苷酸分子作为除草剂的效用。dsRNA寡核苷酸分子被设计成靶向编码以下植物中每一者的EPSPS的RNA：豚草(豚草(Ambrosia artemisiifolia))、三裂叶豚草(三裂叶豚草(Ambrosiatrifida))、约翰逊草(假高粱(Sorghum halepense))、野塘蒿(hairy fleabane)(美洲假蓬(Conzya bonariensis))、两耳草(sourgrass)(马唐属草(Digitariainsularis))、黍尾稃草(liverseedgrass)(类黍尾稃草(Urochloa panicoides))、大戟属(euphorbia)(白苞猩猩草(Euphorbia heterophylla))、芒稷(junglerice)(芒稷(Echinochloa colona))、藜(lambsquarters)(藜草(Chenopodiumalbum))、狗尾草(green foxtail)(狗尾草(Setaria viridis))、谷子(foxtail millet)(粟(Setaria italic))、稗(barnyard grass)(稗草(Echinochloa crus-galli))、马唐(crabgrass)(马唐草(Digitaria sanguinalis))、苍耳(cocklebur)(苍耳(Xanthium strumarium))、大穗看麦娘(blackgrass)(大穗看麦娘(Alopecurusmyosuroides))、野燕麦(wild oat)(野燕麦(Avena fatua))、决明(sicklepod)(决明(Senna obtusifolia))、牵牛花(morning glories)(番薯属(Ipomoea sp.))、田旋花(field bindweed)(田旋花(Convolvulus arvensis))、野生甘蔗(shattercane)(高粱(Sorghum bicolor))、鸭跖草(dayflower)(鸭跖草(Commelina))、紫鸭拓草(Spiderwort)(紫露草属(Tradescantia sp.))、黑麦草(黑麦草属(Lolium sp.))、牛筋草(蟋蟀草(Eleusine indica))、加拿大飞篷(加拿大飞篷(Conzya canadensis))、长叶车前(buckhom plantain)(车前草(Plantago lanceolata))、藜(长芒苋)、糙果苋属(糙果苋(Amaranthustuberculatus))、白苋(tumble pigweed)(白苋(Amaranthus albus))、绿穗苋(smooth pigweed)(绿穗苋(Amaranthus hybridus))、红根藜(反枝苋(Amaranthus retroflexus))、水麻(野苋(Amaranthus rudis)/小瘤龙脑香(tuberculatus))、皱果苋(slender amaranth)(皱果苋(Amaranthus viridis))、Thunberg′s amaranth(Amaranthus thumbergii)、刺苋(spiny amaranth)(刺苋(Amaranthus spinosis))、(Amaranthus rubra)、(凹头苋(Amaranthus lividus))、匍匐苋(Mediterranean amaranth)(匍匐苋(Amaranthus graecizans))、roughamaranth(Amaranthus chlorostachys)、鲍威尔苋(Powell amaranth)(鲍威尔苋(Amaranthus powellii))、北美苋(Mat amaranth)(北美苋(Amaranthusblitoides))、地肤(Kochia)(地肤(Kochia scoparia))、黄矢车菊(Yellowstarthistle)(黄矢车菊(Centaurea solstitialis))和绒毛叶(苘麻(Abutilontheophrasti))。植物叶子用实施例1中制备的表面活性剂溶液预处理并且以每株植物约1纳摩尔的处理用dsRNA溶液处理。15天后，经过处理的植物死亡、濒临死亡或矮化。
实施例6
本实施例进一步说明本发明的多核苷酸分子作为除草剂的效用。dsRNA寡核苷酸分子被设计成靶向编码实施例5中所列的每一种植物的乙酰乳酸合酶和八氢番茄红素去饱和酶的RNA。植物叶子用实施例1中制备的表面活性剂溶液预处理并且以每株植物约1纳摩尔的处理用dsRNA溶液处理。15天后，经过处理的植物死亡、濒临死亡或矮化。
实施例7
本实施例进一步说明本发明的多核苷酸分子作为除草剂的效用。重复实施例4的方法以提供短dsRNA寡核苷酸，所述寡核苷酸被设计成靶向编码长芒苋中以下各蛋白质的RNA：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、乙酰辅酶A羧化酶、二氢蝶酸合酶、原卟啉IX加氧酶、羟基苯丙酮酸双加氧酶、谷氨酰胺合酶、D1蛋白、翻译起始因子(TIF)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶(RuBisCO)和DNA依赖性ATPase(ddATPase)。各别草甘膦抗性长芒苋植物的叶子用实施例1中制备的表面活性剂溶液处理并且分别以每株植物1纳摩尔dsRNA的处理用各dsRNA寡核苷酸分子按照实施例1的方式处理。30天后，经过处理的植物死亡、濒临死亡或矮化。
实施例8
本实施例说明在本发明的组合物和方法中使用合成Pol III基因的效用。关于SEQ ID NO：3和图2，使用来自拟南芥U6snRNA基因的元件制备合成Pol III基因以提供具有两个拷贝的RGCCCR元件(粗体并且加下划线)、具有序列“TCCCACATCG”的上游序列元件(USE)(SEQ ID NO：4，粗体并且加下划线)、TATA盒(粗体并且加下划线)、“G”核苷酸(粗体并且加下划线)、对应于编码EPSPS蛋白的细菌DNA(参看美国专利RE39,247)的反义DNA(斜体)(当在转基因玉米植物中表达时，其赋予草甘膦除草剂抗性)、嵌入所述反义DNA中的“AAGATTAGCACGG”元件(SEQ ID NO：5，粗体并且加下划线)、“ACGCATAAAAT”元件(SEQ ID NO：6，粗体并且加下划线)、随后为有义DNA(小写字体)和“TTTTTT”终止子元件(SEQ ID NO：7，粗体并且加下划线)的dsDNA分子。将0.1wt％Silwet L-77牌有机硅酮表面活性剂溶液和多个拷贝dsDNA分子的溶液喷洒到在草甘膦抗性大豆植物的田间生长的自生草甘膦抗性玉米植物的叶子上，7天后用Roundup WeatherMAX
Figure BPA00001609644700611
牌草甘膦除草剂处理。15天后，玉米植物死亡并且大豆植物生长茂盛；仅用表面活性剂和草甘膦除草剂处理的对照草甘膦抗性玉米植物生长茂盛。
实施例9
本实施例说明本发明的一方面。在这一实施例中，将多核苷酸分子施加到植物组织上并且渗透到植物组织中，从而诱导对靶标基因(内源性EPSPS)的系统性调控，即沉默。更具体说来，包括单链DNA(ssDNA)寡核苷酸的组合物抑制草甘膦耐受性长芒苋(长芒苋)中内源性EPSPS的表达。
使用IDT SciTools软件(在idtdna.com/Scitools/Applications/Anti-sense/Anti-sense.aspx上获得)设计反义ssDNA寡核苷酸。所述寡核苷酸包括长芒苋EPSPS的四种反义ssDNA寡核苷酸(SEQ ID NO：8、9、10和11)、长芒苋EPSPS的两种经过化学修饰的(经过硫代磷酸酯修饰的)反义ssDNA寡核苷酸(SEQ ID NO：12和13)、对照基因大麦(大麦芽(Hordeum vulgare))种子蛋白(GenBank ID X97636)的对照反义ssDNA寡核苷酸(SEQ ID NO：14)、和长芒苋EPSPS的经过化学修饰的(5’处经过来自Invitrogen的Alexa Fluor 488标记的)反义ssDNA寡核苷酸(SEQ ID NO：15)，如表1中所指示。
表1：反义ssDNA寡核苷酸
Figure BPA00001609644700612
Figure BPA00001609644700621
用荧光标记的ssDNA寡核苷酸(SEQ ID NO：15)证实寡核苷酸的吸收，从而确认ssDNA寡核苷酸渗透叶子组织。将草甘膦抗性长芒苋的离体叶子的叶柄放入含荧光标记的ssDNA寡核苷酸(SEQ ID NO：15)的200mM蔗糖溶液中。在通过叶柄吸收后4小时至48小时，利用配备有488nm激光的Bio-Rad PharosFX成像器拍摄叶子图像。用单独200mM蔗糖孵育的叶子用作对照。观察到荧光标记的ssDNA寡核苷酸的略具时间依赖性的维管吸收(参看图6)。荧光标记的ssDNA寡核苷酸早在处理后8小时就从维管组织释放到细胞中，并且在24小时和48小时时观察到这些寡核苷酸在叶子边缘处累积，表明蒸腾作用。
使用叶柄吸收技术用草甘膦抗性长芒苋的离体叶子证实EPSPS抑制作用。根据表2中所列的处理，将草甘膦抗性长芒苋的离体叶子的叶柄放入含寡核苷酸的200mM蔗糖溶液中。对照叶子用反义对照(SEQ ID NO：14)渗透并且另外用或不用50μg/mL草甘膦处理。48小时孵育后测量EPSPSmRNA、EPSPS蛋白和莽草酸含量。为了评估反义ssDNA寡核苷酸对EPSPSmRNA的影响，分离总叶子RNA并且进行定量实时RT-PCR以比较EPSPSmRNA含量。为了评估反义ssDNA寡核苷酸对EPSPS蛋白的影响，分离总叶子可溶性蛋白质，通过SDS-PAGE分离，并且通过蛋白质印迹使用针对玉米EPSPS TIPA的抗体测量EPSPS蛋白质含量。两个实验中评估反义ssDNA寡核苷酸对作为EPSPS抑制作用的指示的莽草酸累积的影响：在实验1中，用寡核苷酸处理过的叶子再通过叶柄吸收用50μg/mL草甘膦孵育48小时(对照叶子用反义对照(SEQ ID NO：14)渗透，并且另外用或不用50μg/mL草甘膦处理)；在实验2中，对用寡核苷酸处理过的叶子进行叶圆片测定，并且利用HPLC测量莽草酸含量(在这种情况下，对照是未用寡核苷酸处理但用50μg/mL草甘膦孵育的叶子)。
表2：使用反义ssDNA寡核苷酸的处理的列表
Figure BPA00001609644700631
EPSPS mRNA表达、EPSPS蛋白含量和莽草酸含量的结果分别展示于图7、8和9中。这些结果证实，使用反义ssDNA寡核苷酸的处理通过降低植物组织中靶标基因转录物(EPSPS mRNA)的含量或由靶标基因编码的蛋白质(EPSPS)的含量系统性地调控或抑制靶标基因。在这一特定实验中，处理#1和#6看起来更有效地抑制EPSPS mRNA和蛋白质的含量并且增加草甘膦效力，如由莽草酸累积的增加所证明。这些结果还表明，草甘膦效力通过抑制草甘膦抗性长芒苋中的EPSPS mRNA和蛋白质得到提高。
实施例10
本实施例说明本发明的一方面。在这一实施例中，生长中的植物用局部施加的用于诱导植物中靶标基因的系统性沉默的组合物处理，所述组合物包括(a)用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂，和(b)包括至少一条多核苷酸链的多核苷酸，所述多核苷酸链包括靶标基因在反义或有义方向上的18个或更多个相邻核苷酸的至少一个区段。更具体说来，烟草(本氏烟草)植物用以下各物处理：(a)局部施加的用于调节植物的多核苷酸渗透的表面活性剂溶液，和(b)包括局部施加的DNA寡核苷酸或多核苷酸的组合物，所述DNA寡核苷酸或多核苷酸的至少一条链包括靶标基因在反义或有义方向上的18个或更多个相邻核苷酸的至少一个区段，由此达成对靶标基因(八氢番茄红素去饱和酶，“PDS”)的系统性调控或抑制。
所用靶标基因是本氏烟草八氢番茄红素去饱和酶(SEQ ID NO：2)，显示于图10中；使用由SEQ ID NO：2的核苷酸421-1120组成的区段(图10中加下划线的文字)来设计700聚体dsRNA多核苷酸(“PDS 700聚体”)，并且使用由SEQ ID NO：2的核苷酸914-1113组成的区段(图10中粗体、加下划线的文字)来设计200聚体dsRNA多核苷酸(“PDS 200聚体”)。处理中所用的其它多核苷酸或寡核苷酸的序列列于表3中。图11示意性描绘这些寡核苷酸和多核苷酸的序列相对于八氢番茄红素合酶(SEQ ID NO：2)序列的位置。从玉米食根虫(“CRW”)获得的非植物序列SEQ ID NO：27、28、29和30用作非同源对照。一些多核苷酸包括T7启动子序列(在表3中由小写字体文字指示)，其为由噬菌体T7 RNA聚合酶识别的启动子。
表3
Figure BPA00001609644700641
Figure BPA00001609644700651
以下程序用于这一实施例中所述的所有测定。在所有测定中均使用4周龄本氏烟草植物。植物用由ddH2O新近制备的0.1％Silwet L-77溶液处理。将每株植物的两片完全展开的叶子(一片子叶，一片真叶)浸渍于Silwet L-77溶液中数秒，并且干燥15-30分钟，随后施加多核苷酸组合物。除非另外规定，否则各寡核苷酸或多核苷酸的最终浓度为25μM(在0.01％Silwet L-77、5mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中)。将20微升溶液施加到两片经过预处理的叶子中每一者的顶面上以对每株植物提供总共40微升(1nmol寡核苷酸或多核苷酸)。处理后3天观察叶子漂白情况。
图12A图解说明测定的结果，其中具有对应于“PDS 200聚体”区段的RNA序列的200聚体dsRNA多核苷酸(SEQ ID NO：2的核苷酸914-1113)以及单链DNA寡核苷酸与多核苷酸的组合(SEQ ID NO：16、17、20、21、24、25和26)分别施加到烟草植物上。200聚体dsRNA多核苷酸以0.6μM的浓度施加。用多核苷酸和寡核苷酸局部处理后观察到顶叶漂白，指示对靶标八氢番茄红素去饱和酶基因的系统性调控或抑制。
图12B图解说明从用缓冲液(对照)、200聚体dsRNA多核苷酸和ssDNA寡核苷酸处理的本氏烟草植物分离的RNA的RNA印迹分析结果。还显示从已通过在4℃下和暗处保持过夜，接着用200聚体dsRNA多核苷酸处理而受到胁迫的植物分离的RNA。
图13图解说明在处理后第12天在多核苷酸或寡核苷酸的十二种组合的作用的另一测定中观察到的表型(参看表4)。表4还列出处理后第5天观察到的植物的可见漂白情况，以及处理后第7天和第12天获得的叶绿素测量的结果。叶绿素测量结果是对靶标基因八氢番茄红素去饱和酶的抑制作用的指示，并且测量结果是在顶区上的6个点获取，集中在可见漂白的叶子上或(在无可见漂白的植物中)植物相同位置上的叶子上：较低叶绿素测量值指示八氢番茄红素去饱和酶受到抑制。这些结果显示，处理2、3、4、8和11中寡核苷酸和多核苷酸的组合有效地系统性调控(抑制)经过处理的植物中的靶标基因；处理1也实现较小程度的对靶标基因的系统性调控(抑制)。200聚体dsRNA多核苷酸也有效地系统性调控(抑制)经过处理的植物中的靶标基因。来自非同源(玉米食根虫)基因的寡核苷酸(处理5和6)不抑制靶标八氢番茄红素去饱和酶基因。这些结果证实，有义和反义单链DNA寡核苷酸和多核苷酸均有效地系统性调控(抑制)经过处理的植物中的靶标基因。在这一特定实施例中，具有T7启动子的有义寡核苷酸(处理1)实现对八氢番茄红素去饱和酶基因的弱系统性抑制，而无T7启动子的有义寡核苷酸(处理7)不抑制八氢番茄红素去饱和酶基因。在这一特定实施例中，具有T7启动子的反义寡核苷酸(处理2)以及无T7启动子的反义寡核苷酸(处理8)均提供强漂白，指示对靶标八氢番茄红素去饱和酶基因的强系统性调控。
表4
Figure BPA00001609644700681
表5显示六种多核苷酸：一种由“PDS 700聚体”的5’最远端40个核苷酸(SEQ ID NO：2的核苷酸1081-1120)组成的40聚体区段(“PDS 40聚体有义ssDNA”，SEQ ID NO：31)，和四种反义单链DNA多核苷酸，和一种基于“PDS 40聚体有义ssDNA”序列(SEQ ID NO：31)合成的有义单链DNA多核苷酸。图14图解说明用多核苷酸和寡核苷酸局部处理烟草植物的结果。在用PDS 21聚体反义ssDNA和PDS 33聚体反义ssDNA局部处理后，以及在用经过PCR扩增和管柱纯化的700聚体dsRNA多核苷酸(“PDS 700聚体dsRNA”)、先前测定的具有T7启动子的PDS反义22聚体寡核苷酸(SEQ IDNO：20和21)(“PDS T7反义”)或先前测定的无T7启动子的PDS反义22聚体寡核苷酸(SEQ ID NO：22和23)(“PDS反义”)局部处理后，观察到顶叶的强漂白，指示靶标基因八氢番茄红素去饱和酶受到系统性调控或抑制。在仅用缓冲液(“缓冲液”)局部处理后，或在用热变性的(95℃下5分钟，接着在冰上储存)700聚体dsRNA多核苷酸(“经过加热的PDS 700聚体dsRNA”)、PDS 15聚体反义ssDNA或PDS 18聚体反义ssDNA局部处理后，几乎未观察到顶叶的可见漂白。
表5
Figure BPA00001609644700691
另一测定的结果显示于图15中，在用PDS 21聚体反义ssDNA(SEQ IDNO：34，“21nt PDS反义”)或用先前测定的无T7启动子的PDS反义22聚体寡核苷酸(SEQ ID NO：22和23)(“PDS反义”)局部处理后，观察到顶叶的强漂白，指示靶标基因八氢番茄红素去饱和酶受到系统性调控或抑制。在仅用缓冲液局部处理后(“对照：缓冲液”)，或在用PDS 21聚体有义ssDNA(SEQID NO：36，“21nt PDS有义”)局部处理后，几乎未观察到顶叶的可见漂白。
实施例11
本实施例说明用局部施加的用于诱导植物中靶标基因的系统性沉默的组合物处理生长中的植物，所述组合物包括(a)用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂，和(b)包括至少一条多核苷酸链的多核苷酸，所述多核苷酸链包括靶标基因在反义或有义方向上的18个或更多个相邻核苷酸的至少一个区段。更具体说来，本实施例证实多核苷酸的靶标特异性(序列特异性)。
长芒苋八氢番茄红素去饱和酶(PDS)具有序列TCAATTTCATCTATTGGAAGTGATTTTTTGGGTCATTCTGTGAGAAATTTCAGTGTTAGTAAAGTTTATGGAGCAAAGCAAAGAAATGGGCACTGCCCTTTAAAGGTTGTTTGTATAGATTATCCTAGGCCAGAGCTTGAAAGTACATCCAATTTCTTGGAAGCCGCCTACTTATCTTCTACTTTTCGGAATTCGCCTCGTCCTCAGAAGCCATTAGAAGTTGTAATTGCTGGAGCAGGTTTGGCTGGTCTATCCACGGCAAAGTATTTAGCTGATGCAGGTCACAAACCCATATTGTTGGAAGCACGAGATGTTTTAGGAGGAAAGGTTGCAGCGTGGAAGGATGA GGATGGTGACTGGTATGAGACTGGGCTACATATATTCTTTGGGGCATATC CAAATGTCCAAAATCTATTTGGAGAACTTGGTATAAATGACCGACTGCA ATGGAAGGAGCACTCTATGATTTTTGCAATGCCCAGCAAGCCCGGTGAA TTCAGTCGCTTTGATTTTCCCGAAATCCTGCCTGCACCATTAAATGGCAT ATGGGCAATCCTAAGAAATAATGAAATGCTAACCTGGCCAGAAAAAATC AAGTTTGCCATTGGCTTGTTGCCTGCTATGGCAGGCGGACAGTCATATGT TGAAGCACAAGATGGTTTGAGTGTCCAAGAGTGGATGAGAAAACAAGG AGTACCCGATCGTGTAACTGATGATGTGTTTATTGCCATGTCAAAGGCAC TGAACTTCATAAATCCCGATGAACTTTCAATGCAGTGCATCTTGATTGCT
Figure BPA00001609644700702
GAGGAGATGCCTATGTTTTTGCCACCCCAGTTGACATCTTGAAGCTGTTACTACCTGATACTTGGAAGGAAATCTCATACTTCAAAAAACTTGAGAAATTAGTGGGCGTTCCTGTGATTAATGTTCACATATGGTTTGACAGAAAATTAAAGAATACATATGACCATCTACTCTTCAGCAGGAGTCCTCTTTTGAGTGTCTATGCTGATATGTCGGAGACATGCAAGGAATATAAGGATCCAAATAGATCCATGCTGGAATTGGTTTTTGCACCCGCGGAGGAATGGATTTCACGAAGCGACACTGATATTATAGAGGCAACAATGAAAGAGCTTGCCAAGCTTTTCCCGGATGAAATCGCTGCCGATGGAAGCAAGGCCAAGATCCTCAAATATCATGTCGTCAAAACTCCAAGGTCGGTTTATAAGACTGTACCGGATTGTGAACCTTGTCGGCCGCTGCAAAGATCACCAATAGAGGGTTTCTATTTAGCTGGTGATTACACAAAACAAAAATATTTGGCTTCTATGGAAGGTGCTGTCTTATCTGGGAAGCTTTGTGCACAGGCTATCGTACAGGATTATGATCTGCTGAGTTCTCGAGCACAAAGAGAATTGGCG(SEQ ID NO：37)。合成678bp dsRNA多核苷酸和198bp dsRNA多核苷酸，所述678bp dsRNA多核苷酸具有能够与由SEQ ID NO：37中位置317-994上的核苷酸(以加下划线的文字显示)编码的RNA杂交的反义链，所述198bp dsRNA多核苷酸具有能够与由SEQ IDNO：37中位置797-994上的核苷酸(以斜体并且加下划线的文字显示)编码的RNA杂交的反义链。
本氏烟草八氢番茄红素去饱和酶具有序列ATGCCCCAAATCGGACTTGTATCTGCTGTTAATTTGAGAGTCCAAGGTAATTCAGCTTATCTTTGGAGCTCGAGGTCTTCGTTGGGAACTGAAAGTCAAGATGTTTGCTTGCAAAGGAATTTGTTATGTTTTGGTAGTAGCGACTCCATGGGGCATAAGTTAAGGATTCGTACTCCAAGTGCCACGACCCGAAGATTGACAAAGGACTTTAATCCTTTAAAGGTAGTCTGCATTGATTATCCAAGACCAGAGCTAGACAATACAGTTAACTATTTGGAGGCGGCGTTATTATCATCATCGTTTCGTACTTCCTCACGCCCAACTAAACCATTGGAGATTGTTATTGCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCTACAGCAAAATATCTGGCAGATGCTGGTCACAAACCGATATTGCTGGAGGCAAGAGATGTCCTAGGTGGGAAGG TAGCTGCATGGAAAGATGATGATGGAGATTGGTACGAGACTGGGTTGCA CATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATGCAGAACCTGTTTGGAGAACTAG GGATTGATGATCGGTTGCAGTGGAAGGAACATTCAATGATATTTGCGATG CCTAACAAGCCAGGGGAGTTCAGCCGCTTTGATTTTCCTGAAGCTCTTC CTGCGCCATTAAATGGAATTTTGGCCATACTAAAGAACAACGAAATGCT TACGTGGCCCGAGAAAGTCAAATTTGCTATTGGACTCTTGCCAGCAATG CTTGGAGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGACGGTTTAAGTGTTAAGG ACTGGATGAGAAAGCAAGGTGTGCCTGATAGGGTGACAGATGAGGTGT TCATTGCCATGTCAAAGGCACTTAACTTCATAAACCCTGACGAGCTTTC
Figure BPA00001609644700721
Figure BPA00001609644700722
CAATTAAAGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCACTCCAGTGGATATCTTGAAGCTTCTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATCCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGCTAGTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCCATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAGAACACATCTGATAATCTGCTCTTCAGCAGAAGCCCGTTGCTCAGTGTGTACGCTGACATGTCTGTTACATGTAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTATTTGCACCCGCAGAAGAGTGGATAAATCGTAGTGACTCAGAAATTATTGATGCTACAATGAAGGAACTAGCGAAGCTTTTCCCTGATGAAATTTCGGCAGATCAGAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTATCATGTTGTCAAAACCCCAAGGTCTGTTTATAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCCTTGCAAAGATCCCCTATAGAGGGTTTTTATTTAGCTGGTGACTACACGAAACAGAAGTACTTGGCTTCAATGGAAGGTGCTGTCTTATCAGGAAAGCTTTGTGCACAAGCTATTGTACAGGATTACGAGTTACTTCTTGGCCGGAGCCAGAAGATGTTGGCAGAAGCAAGCGTAGTTAGCATAGTGAACTAA(SEQ ID NO：38)。合成685bp dsRNA多核苷酸和192bp dsRNA多核苷酸，所述685bp dsRNA多核苷酸具有能够与由SEQ ID NO：38中位置421-1105上的核苷酸(以加下划线的文字显示)编码的RNA杂交的反义链，所述192bp dsRNA多核苷酸具有能够与由SEQID NO：38中位置914-1105上的核苷酸(以斜体并且加下划线的文字显示)编码的RNA杂交的反义链。
使用全局双序列比对(伸展器)进行长芒苋和本氏烟草PDS DNA序列的比对，并且在图16中图解说明；使用这种方法，两个序列显示约71％同一性(1252/1762)。
具有16个拷贝的EPSPS并且高5-8英寸的长芒苋植物用由ddH2O新近制备的0.1％Silwet L-77溶液处理。将每株植物的四片完全展开的叶子浸渍于Silwet L-77溶液中数秒，并且干燥30分钟至1小时，随后施加多核苷酸组合物。针对678bp长芒苋PDS dsRNA、198bp长芒苋PDS dsRNA、685bp本氏烟草PDS dsRNA和192bp本氏烟草PDS dsRNA中的每一者制备个别多核苷酸溶液(0.6μM多核苷酸于0.01％Silwet L-77、5mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中)。将10微升多核苷酸溶液(或作为对照的缓冲液)施加到每株植物的四片经过预处理的叶子中每一者的顶面上以对每株植物提供总共40微升。植物保持在生长室中，并且处理后3天观察叶子漂白情况。用678bp长芒苋PDSdsRNA或198bp长芒苋PDS dsRNA局部处理的植物显示叶子漂白(指示内源性八氢番茄红素去饱和酶沉默)，但用685bp本氏烟草PDS dsRNA或192bp本氏烟草PDS dsRNA局部处理的长芒苋植物不显示叶子漂白。这种序列特异性证实，本发明的多核苷酸组合物和方法可用于选择性控制具有特定靶标基因序列的指定物种或分类群，例如可用于控制在除草剂抗性作物的田间生长的对相同除草剂具有抗性的自生植物。
在另一测定中，用678bp长芒苋PDS dsRNA(经过标记的“700nt dsRNAPDS”)或198bp长芒苋PDS dsRNA(经过标记的“200nt dsRNA PDS”)局部处理的长芒苋植物显示叶子漂白(指示内源性八氢番茄红素去饱和酶沉默)，但用无脊椎动物基因的260bp dsRNA(经过标记的“260nt dsRNA DV49”，来自玉米根虫玉米根叶甲(Diabrotica virgifera))局部处理的长芒苋植物不产生漂白表型，指示无内源性八氢番茄红素去饱和酶沉默(图17)。这种序列特异性证实，本发明的多核苷酸组合物和方法可用于选择性控制指定物种或分类群。
实施例12
本实施例描述使用局部施加的包括至少一条包括靶标基因在反义或有义方向上的18个或更多个相邻核苷酸的至少一个区段的多核苷酸链的组合物来诱导植物中靶标基因的系统性沉默。更具体说来，本实施例证实使用利用八氢番茄红素去饱和酶(PDS)寡核苷酸的单个处理来诱导不同植物器官(包括叶子、茎和花)中的系统性沉默。
在所有处理中均使用4周龄烟草(本氏烟草)植物。通过将两片完全展开的叶子(一片子叶，一片真叶)浸渍于新近制备的表面活性剂溶液(含0.1％Silwet L-77的双蒸水)中数秒来进行调节且干燥15-30分钟。向每片经过调节的叶子的顶面施加20微升具有对应于本氏烟草八氢番茄红素去饱和酶(SEQ ID NO：2)的位置1099-1120上的核苷酸的序列GGCAGTACAATTAAAGGAGATG(SEQ ID NO：39)的单链DNA(ssDNA)22聚体寡核苷酸于含0.01％Silwet L-77的5mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中的25μM溶液，每株植物总共40微升(1纳摩尔寡核苷酸)。对照植物用不含DNA寡核苷酸的Silwet溶液处理。处理后3天观察植物的漂白情况。用ssDNA寡核苷酸处理的植物的顶叶、茎和花均展示漂白，指示PDS系统性沉默(图18A)。
使对照植物和经过ssDNA处理的植物的花结出种子。从成熟果实采集种子，称重并且使其发芽。种子重量为相同的(每100个种子约11mg)，并且种子形态看起来在经过ssDNA处理的植物和对照植物之间为类似的。与来自对照植物的种子的每个果实的种子量和发芽率(100个种子中有95个发芽)相比，在来自经过ssDNA处理的植物的种子中观察到每个果实产生的种子量降低并且发芽率降低(100个种子中有4个发芽)。
在另一种使用类似程序的测定中，通过将烟草植物浸渍于含0.1％SilwetL-77的双蒸水中来进行调节，干燥15-30分钟并且用PDS ssDNA 22聚体(SEQID NO：39)处理，所述PDS ssDNA 22聚体作为含0.01％Silwet L-77的5mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中的25μM溶液施加到每片经过调节的叶子的顶面上，每株植物总共40微升(1纳摩尔寡核苷酸)。其它植物未用表面活性剂处理进行调节，而是仅用1纳摩尔PDS ssDNA 22聚体(SEQ ID NO：39)处理，所述PDS ssDNA 22聚体是通过用无针注射器渗入(显示于图18B中)或通过向叶子表面手动施加数滴(未显示于图18B中)来施加，并且呈含0.01％Silwet L-77的5mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中的25μM溶液形式或呈5mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中的25μM溶液形式(无表面活性剂)。阴性对照植物用不含DNA寡核苷酸的Silwet缓冲溶液处理。结果描绘于图18B中。所有仅通过直接施加PDS ssDNA进行处理的植物(未通过Silwet L-77表面活性剂处理进行调节)，无论是通过渗入或通过手动施加数滴来施加，均展示顶叶、茎和花的漂白，指示PDS系统性沉默。
实施例13
本实施例说明用于诱导系统性沉默的方法和局部施加的组合物，包括使用用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂。更具体说来，本实施例描述使用本发明的多核苷酸来控制除草剂抗性长芒苋。
具有较低(低于30)拷贝数的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的长芒苋植物对用设计用于使EPSPS沉默的dsRNA处理并随后用草甘膦处理敏感(参看实施例1中的细节)。然而，具有高拷贝数的EPSPS(即30个或更多个拷贝的EPSPS)的长芒苋植物对草甘膦处理具有抗性并且是杂草抗性管理的一个挑战。举例来说，在一个使用类似于实施例1中所述的处理但dsRNA的任一剂量均增加至10倍(即每株植物8纳摩尔实施例1中所述的短dsRNA)或使用专有草甘膦制剂(“Roundup
Figure BPA00001609644700751
WeatherMAX牌除草剂”)与牛脂胺表面活性剂的组合的对草甘膦抗性高拷贝长芒苋进行的测定(结果未显示)中，草甘膦活性得到提高(通过观察测量为植物高度的植物生长来估计)，但抗性植物未被杀死。
将三个不同的草甘膦抗性高拷贝长芒苋植株(每个重复3株植物)使用表6中所列的处理条件用dsRNA处理，其中dsRNA递送媒剂、渗透或调节剂，并且步骤顺序有所改变。结果描绘于图19中。仅用“4X”草甘膦处理(即用每公顷3360g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700753
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700754
牌除草剂处理，这是每公顷施加840g酸当量的标准比率的4倍)未杀死35个拷贝(实验3)或57个拷贝(实验6)的长芒苋。
在一组实验(1-3，表6)中，在包含0.1％牛脂胺表面活性剂和10％甘油的dsRNA递送媒剂水溶液中包括2％硫酸铵(实验2)会提高10倍剂量的dsRNA、随后4X草甘膦施加的效力。当硫酸铵包括于不含牛脂胺表面活性剂的dsRNA递送媒剂中时(实验8)，也观察到10倍剂量的dsRNA、随后草甘膦施加的效力提高。
在另一组实验(4-6，表6)中，先施加Silwet L-77表面活性剂，随后施加含有硫酸铵的递送媒剂中的dsRNA是有效的，而将Silwet L-77表面活性剂与dsRNA组合于含有硫酸铵的dsRNA递送媒剂中无效。用dsRNA处理后，在72小时时施加草甘膦(“RoundupWeatherMAX
Figure BPA00001609644700756
牌除草剂”)(实验7)的有效性低于在48小时时施加草甘膦(实验2)。
表6
Figure BPA00001609644700761
Figure BPA00001609644700771
*草甘膦(呈商业制剂“Roundup
Figure BPA00001609644700772
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700773
牌除草剂”形式，其含有660g/L草甘膦K+盐于包括牛脂胺(16-18C)和椰油胺(12-14C)的55∶45比率的MON56151牛脂胺表面活性剂掺合物的载剂中)以所用的量(其中1X＝每公顷840g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700774
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700775
牌除草剂，4X＝每公顷3360g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700776
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700777
牌除草剂)和dsRNA施加后的小时数列出。
实施例14
本实施例说明用于诱导系统性沉默的方法和局部施加的组合物，包括使用用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂。
发现两种通过小RNA测序所鉴定的小RNA富含于已用如实施例1中所述的四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子处理的长芒苋植物中并且是所述植物所特有的。这两种小RNA分别定位于具有图20中所示序列(SEQID NO：40)的全长EPSPS的核苷酸位置743-764和566-585。设计具有反义链对两种25个核苷酸长的寡核苷酸尺寸的“短”dsRNA分子，所述反义链能够与从长芒苋EPSPS基因的核苷酸位置743-767(“短dsRNA-5”)和564-588(“短dsRNA-6”)上转录的mRNA杂交，这些位置如图20中所示的SEQ IDNO：40中斜体、加下划线的核苷酸所指示，图20还显示四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子(加下划线的非斜体文字)和三种“长”双链RNA多核苷酸(粗体文字)，如实施例1中所述。
施加这四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子(实施例1中所述)的混合物，随后施加草甘膦，重复实施例1中所述的处理程序，导致4株具有16个拷贝的EPSPS的长芒苋植物中的4株均被杀死。使用相同处理程序但共同施加短dsRNA-5和短dsRNA-6导致4株长芒苋植物均未被杀死。向这四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子(实施例1中所述)的混合物中添加短dsRNA-5和短dsRNA-6中的任一者或两者导致4株长芒苋植物中的4株均被杀死，即未观察到短dsRNA-5和短dsRNA-6的拮抗作用。
实施例15
本实施例说明用于诱导系统性沉默的方法和局部施加的组合物，包括使用用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂。更具体说来，本实施例描述使用水杨酸和多核苷酸。
水杨酸(SA)诱导烟草中的病毒抗性；参看例如Chivasa等(1997)PlantCell，19：547-557。具有49或63个拷贝的EPSPS的草甘膦抗性长芒苋植物用15mM SA预处理。用SA处理后1、5或24小时，手动施加四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子(实施例1中所述)的溶液，72小时后喷洒草甘膦(每公顷1682g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700781
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700782
牌除草剂)。草甘膦处理后7天，未观察到dsRNA和草甘膦活性的作用的提高(通过观察测量为植物高度的植物生长来估计)。
实施例16
本实施例说明用于诱导系统性沉默的方法和局部施加的组合物，包括使用用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂。更具体说来，本实施例描述施加多核苷酸和表面活性剂溶液的顺序和时机的变化。
使用包括以下步骤的方案，对具有高拷贝数(56、63或100个拷贝)的EPSPS的长芒苋植物进行这些测定：(1)于含有牛脂胺表面活性剂和甘油的溶液中施加dsRNA(实施例1中所述的四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子的溶液)；(2)施加1％Silwet L-77硅酮表面活性剂；和(3)施加草甘膦(每公顷1682g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700783
WeatherMAX牌除草剂)。评估多核苷酸施加和Silwet施加的时间间隔，其中Silwet喷雾剂是在施加dsRNA溶液后30分钟、1小时或2小时施加。在这一组测定中，Silwet溶液施加的三个不同时间均产生类似结果，即，如与用仅含有牛脂胺表面活性剂和甘油的对照溶液处理的对照高拷贝植物相比，大部分用dsRNA溶液处理的高拷贝植物的生长矮化。
实施例17
本实施例说明用于诱导系统性沉默的方法和局部施加的组合物，包括使用用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂。更具体说来，本实施例描述通过低容量喷洒以及使用硅酮表面活性剂和硫酸铵来施加本发明的多核苷酸。
通过低容量喷洒将dsRNA(实施例1中所述的四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子的溶液)于含有2％硫酸铵的溶液中的溶液施加到具有16个拷贝的EPSPS的长芒苋上，随后喷洒草甘膦(每公顷1682g酸当量的RoundupWeatherMAX
Figure BPA00001609644700792
牌除草剂)，导致长芒苋植物被杀死。
每种处理六株长芒苋植物用三步骤程序使用低容量喷洒进行处理：(1)喷洒1％Silwet L-77；(2)喷洒2毫升含有等量的实施例1中所述的四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子的dsRNA溶液，剂量为3种剂量中的一种(每株植物1X或0.8纳摩尔、每株植物2X或1.6纳摩尔、或每株植物4X或3.2纳摩尔)；和(3)以159升/英亩的比率喷洒草甘膦(每公顷1682g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700793
WeatherMAX牌除草剂)。草甘膦喷洒后9天，喷洒4X(每株植物3.2纳摩尔)dsRNA的所有六株植物均被杀死，而喷洒2X(每株植物1.6纳摩尔)dsRNA或1X(每株植物0.8纳摩尔)dsRNA的植物矮化(图21A)。
对从田间采集的种子生长的草甘膦抗性长芒苋进行若干测定。植物用下文所述的各种方案处理，其中一些植物用dsRNA溶液局部处理并且对照植物用缓冲液(dsRNA媒剂)处理；施加是通过低容量喷洒来进行。除非另外说明，否则dsRNA溶液含有等量的实施例1中所述的四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子于缓冲液中，剂量为“4X”(每株植物3.2纳摩尔)；缓冲液由焦碳酸二乙酯(DEPC)水(Omega Bio-Tek)中的10mM磷酸钠和0.01％(v/v)Silwet L-77有机硅酮表面活性剂组成并调整至pH 6.8；并且除草剂是以159升/英亩的比率以每公顷840g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700795
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700796
牌除草剂施加的草甘膦除草剂。结果提供于表7中。
测定1和2：对从具有已知的草甘膦抗性长芒苋生长植物的农场位置处的土壤样品获得的种子生长的草甘膦抗性长芒苋进行这些测定。对于测定1，每种处理10株植物如下进行处理：(1)喷洒1％Silwet L-77；(2)喷洒2毫升dsRNA溶液；和(3)喷洒草甘膦。对于测定2，每种处理18株植物使用与测定1中相同的程序进行处理。
测定3：这一测定比较了在不同发育阶段施加的处理，并且使用从来自Macon County的GA场所的长芒苋种子生长并且选用于草甘膦抗性的幼苗。缓冲液包括2％硫酸铵。每种处理12株小(3叶阶段)或12株大(5叶阶段)幼苗如下进行处理：(1)喷洒1％Silwet L-77；(2)喷洒2毫升dsRNA溶液；和(3)喷洒草甘膦。与较大幼苗相比，这一处理对小幼苗提供较好的控制(杀死更多植物)。dsRNA处理所杀死或矮化的草甘膦抗性植物多于用缓冲液和除草剂处理所达成的情况，但处理后16天时，并非所有经过dsRNA处理的植物均被杀死。
测定4和5：这些测定使用从来自Pemiscot的MO农场的土壤中的种子生长的长芒苋植物。缓冲液包括2％硫酸铵。每种处理11株小(3叶阶段)幼苗如下进行处理：(1)喷洒1％Silwet L-77；(2)喷洒2毫升dsRNA溶液；和(3)喷洒草甘膦。对于测定5，每种处理12株植物使用与测定4中相同的程序进行处理。
测定6：这一测定使用从来自“Ivy2”农场的土壤中的种子生长的长芒苋植物。缓冲液包括2％硫酸铵。每种处理18株小(3叶阶段)幼苗如下进行处理：(1)喷洒1％Silwet L-77；(2)手动或通过喷洒施加2毫升dsRNA溶液；和(3)喷洒草甘膦。在这一测定中，施加方法(手动滴落或喷洒)提供类似结果。
测定7：这一测定使用从F3种子生长的3叶阶段至4叶阶段长芒苋幼苗，这些幼苗是选用于草甘膦抗性并且草甘膦抗性强于测定1-6中的植物。缓冲液包括2％硫酸铵。每种处理18株植物如下进行处理：(1)喷洒1％Silwet L-77；(2)喷洒2毫升dsRNA溶液；和(3)喷洒草甘膦。
表7
Figure BPA00001609644700801
Figure BPA00001609644700811
实施例18
本实施例说明用于诱导系统性沉默的方法和局部施加的组合物，包括使用用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂。
在这些测定中，dsRNA溶液含有等量的实施例1中所述的四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子，于含有0.2％牛脂胺表面活性剂和2％硫酸铵(在图22中鉴定为“牛脂胺/AMS”)或一种以下转染试剂的溶液中剂量为“10X”(每株植物8纳摩尔)：(a)多胺(JetPRIMETM，Polyplus-transfection SA，Illkirch，France)，(b)磁性纳米粒子(SilenceMag，OZ Biosciences，Marseille，France)，(c)肽(N-TERTM纳米粒子，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，(d)脂质(siPORTTM NeoFXTM，Ambion，Foster City，CA)，或(e)阳离子性脂质/聚合物(TransIT
Figure BPA00001609644700812
Mirus Bio，Madison，WI)。植物如下进行处理：(1)手动施加dsRNA溶液；(2)喷洒1％Silwet L-77；和(3)喷洒以159升/英亩的比率以每公顷840g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700813
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700814
牌除草剂施加的草甘膦。这一方案当与牛脂胺表面活性剂/硫酸铵溶液中的dsRNA一起使用时，杀死具有35个拷贝的EPSPS的草甘膦抗性长芒苋。结果描绘于图22中。对于用于含有多胺(JetPRIMETM)、肽(N-TERTM纳米粒子)、阳离子性脂质/聚合物(TransIT
Figure BPA00001609644700815
)或牛脂胺表面活性剂/硫酸铵的溶液中的dsRNA处理的植物，观察到植物矮化或死亡。
实施例19
本实施例说明使用包括局部施加的用于在植物中诱导系统性沉默的多核苷酸的组合物的方法。更具体说来，本实施例描述使用不同类型的多核苷酸用于诱导系统性沉默。
对应于长芒苋EPSPS基因的位置14-38、位置153-177、345-369和1105-1129(由图1中加下划线的核苷酸指示)的有义单链DNA(ssDNA)和反义单链RNA(ssRNA)是从Integrated DNA Technologies购得。有义ssDNA和反义ssRNA通过在95℃下将等摩尔的混合的ssDNA和ssRNA加热5分钟来退火，并且经1.5-2小时缓慢冷却至室温以产生DNA/RNA杂交体。
测定中使用16个拷贝的草甘膦抗性长芒苋植物，这些测定使用这一程序：(1)喷洒1％Silwet L-77；(2)在每株植物的四片成熟叶子上手动施加总共0.8纳摩尔的长芒苋EPSPS dsRNA(如实施例1中所述)或长芒苋EPSPSDNA/RNA杂交体；和(3)喷洒以159升/英亩的比率以每公顷840g酸当量的RoundupWeatherMAX
Figure BPA00001609644700822
牌除草剂施加的草甘膦。
结果描绘于图23中。除草剂喷洒后7天，6株经过dsRNA处理的植物中的4株死亡并且剩余2株濒临死亡，而喷洒DNA/RNA杂交体的植物与对照相比生长矮化(草甘膦伤害)。
实施例20
本实施例说明使用包括局部施加的用于在植物中诱导系统性沉默的多核苷酸的组合物的方法。更具体说来，本实施例描述使用不同类型的多核苷酸用于诱导系统性沉默。
在这一测定中，每个处理使用六株具有16个拷贝的EPSPS的草甘膦抗性长芒苋植物。于含有2％硫酸铵的缓冲液中将每个植物处理0.8纳摩尔(“1X”)dsRNA、10倍增大量(每个植物处理8纳摩尔，“10X”)的ssDNA多核苷酸(描述于实施例19中)和作为对照的单独缓冲液手动施加到各别植物上，48小时后喷洒以159升/英亩的比率以每公顷840g酸当量的RoundupWeatherMAX牌除草剂施加的草甘膦。图24描绘结果。与仅用缓冲液和除草剂处理的植物相比，两种多核苷酸处理均得到长芒苋的较好控制。在用10XssDNA处理进行处理的植物中，六株植物中的两株被杀死，并且剩余四株的生长矮化30％。在用1X dsRNA处理进行处理的植物中，在WM喷洒后8天或dsRNA处理后第10天，所有六株植物均被杀死。
实施例21
本实施例说明使用包括局部施加的用于在植物中诱导系统性沉默的多核苷酸的组合物的方法。更具体说来，本实施例描述选择多核苷酸序列用于在植物中诱导系统性沉默。
12种各为约250bp且具有一条对应于SEQ ID NO：41-52(表8)的EPSPS分块DNA序列的dsRNA链的dsRNA设计成以分块方式涵盖如图25A中所描绘的长芒苋EPSPS基因的完全编码序列以及5’和3’非翻译区的一部分。
表8
Figure BPA00001609644700833
Figure BPA00001609644700851
Figure BPA00001609644700861
如实施例1和图1中所述的四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子分别位于分块区段2、3、4和8中，并且显示为这些区段内的浅灰色竖条。多核苷酸是通过使用pBR322载体用插入EcoRI和BamHI克隆位点的EPSPS多核苷酸进行体外转录来合成；质体DNA用Qiagen Maxi prep试剂盒分离并且用EcoRI和BamHI限制酶消化。经过消化的DNA溶液不经进一步纯化就用于植物处理中。
具有16个拷贝的EPSPS的草甘膦抗性长芒苋植物如下进行处理：喷洒1％Silwet L-77；(2)手动施加dsRNA溶液(含有选自12个分块区段的多核苷酸或实施例1中所述的四种“短”dsRNA分子，以0.01纳摩尔DNA/植物的比率)或作为对照的缓冲液；和(3)48小时后喷洒以159升/英亩的比率以每公顷840g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700871
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700872
牌除草剂施加的草甘膦。在除草剂处理后11天，观察经过处理的植物的地上高度；将死亡或濒临死亡的植物指定为零高度。结果描绘于图25B和25C中。在这一测定中显示最大效力的dsRNA多核苷酸组合包括实施例1中所述的四种“短”dsRNA分子、分块区段2、5、8和11的组合以及分块区段7、8和9的组合。
实施例22
本实施例说明使用包括局部施加的用于在植物中诱导系统性沉默的多核苷酸的组合物的方法。更具体说来，本实施例描述向植物施加除草剂后局部施加多核苷酸。
在一个测定中，向具有16个拷贝的EPSPS的草甘膦抗性长芒苋植物喷洒以159升/英亩的比率以每公顷840g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700873
WeatherMAX牌除草剂施加的草甘膦。在除草剂施加后2小时或24小时，通过喷洒1％SilwetL-77来处理植物。在Silwet处理后15至20分钟，通过手动施加于含有2％硫酸铵的缓冲液中的每株植物0.8纳摩尔(“1X”)如实施例1中所述的四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子或含有2％硫酸铵的缓冲液来处理植物。在这一测定中，未处理(“UT”)对照植物仅用1％Silwet L-77喷雾剂而不用除草剂或dsRNA处理。结果描绘于图26中。在这一测定中，当在除草剂喷洒后2小时施加时，施加1％Silwet使得草甘膦活性提高60％，并且当在除草剂喷洒后24小时施加时，使得草甘膦活性提高20％。在这一测定中，当在除草剂喷洒后2小时施加时，相继施加1％Silwet和EPSPS dsRNA使得草甘膦活性提高至少80％，并且当在除草剂喷洒后24小时施加时，使得草甘膦活性提高20％。
在另一测定中，向从来自Macon，GA的农场场所的土壤中的种子生长的长芒苋植物喷洒以159升/英亩的比率以每公顷840g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700875
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700876
牌除草剂施加的草甘膦。在除草剂处理后3天，40株植物中的9株被杀死并且3株严重矮化。向存活的植物喷洒1％Silwet L-77，随后手动局部施加每株植物8纳摩尔(“10X”)如实施例1中所述的四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPS dsRNA分子或作为对照的缓冲液。3天后，经过dsRNA处理的组中另有3株植物死亡并且经过缓冲液处理的组中另有2株植物死亡。此时(最初除草剂处理后6天和Silwet/dsRNA或缓冲液处理后3天)，向各组中一半的存活植物喷洒第二次施加的草甘膦(以与第一次施加相同的剂量施加)。在这一第二次除草剂处理后2周，剩余的经过dsRNA处理的植物显示80％伤害，并且剩余的经过缓冲液处理的植物显示40％伤害。
实施例23
本实施例说明使用包括局部施加的用于在植物中诱导系统性沉默的多核苷酸的组合物的方法。更具体说来，本实施例描述以单个步骤局部施加单一组合物，所述组合物包括多核苷酸、表面活性剂和用于控制除草剂抗性杂草的除草剂。
对已知具有极高拷贝数的EPSPS的草甘膦抗性长芒苋植物的田间种群进行这一测定(据Gaines等(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，107：1029-1034报道，来自这一研究场所的植物具有5至超过160个拷贝的EPSPS)。在这一测定中所用的多核苷酸是如实施例1中所述的四种寡核苷酸尺寸的“短”EPSPSdsRNA分子的等摩尔浓度混合物。
在单一处理中用还含有1％Silwet L-77表面活性剂、2％硫酸铵和草甘膦(以159升/英亩的比率以每公顷1682g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700881
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700882
牌除草剂施加)的溶液中的264微克(“100X”)或52.8微克(“20X”)EPSPSdsRNA喷洒1英尺×5英尺处理区域中的4至6英寸高植物。为进行比较，向1英尺×5英尺处理区域中的其它植物喷洒以相同比率施加的草甘膦(在还含有1％Silwet L-77表面活性剂和2％硫酸铵的溶液中)。
结果描绘于图27中。仅用还含有Silwet L-77和硫酸铵的溶液中的草甘膦(以159升/英亩的比率以每公顷1682g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700883
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700884
牌除草剂施加)处理植物产生约70％控制(植物死亡)。使用含有20X EPSPSdsRNA多核苷酸、表面活性剂、硫酸铵和除草剂的组合物的一步骤处理产生草甘膦抗性长芒苋的约80-85％控制，这是通过喷洒以159升/英亩的比率以每公顷6720g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700885
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700886
牌除草剂施加的草甘膦(即，在159升/英亩的比率下每公顷约840g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700891
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700892
牌除草剂的标准施加比率的8倍)所获得的近似控制比率。使用含有100X EPSPSdsRNA多核苷酸、表面活性剂、硫酸铵和除草剂的组合物的一步骤处理产生草甘膦抗性长芒苋的约90-95％控制，这是通过喷洒以159升/英亩的比率以每公顷13440g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700893
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700894
牌除草剂施加的草甘膦(即，在159升/英亩的比率下每公顷约840g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644700895
WeatherMAX
Figure BPA00001609644700896
牌除草剂的标准施加比率的16倍)所获得的近似控制比率。
实施例24
本实施例说明通过向蔬菜局部施加多核苷酸分子来诱导蔬菜植物中对靶标基因的系统性调控的方法，所述多核苷酸分子包括具有与靶标基因或从靶标基因转录的RNA中的18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的核苷酸序列的区段，由此所述分子渗透蔬菜植物的内部并且诱导靶标基因的系统调控。在这一实施例中，生长中的蔬菜植物用局部施加的用于诱导蔬菜或果实作物中靶标基因的系统性沉默的组合物处理，所述组合物包括(a)用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂，和(b)包括至少一条包括靶标基因在反义或有义方向上的18个或更多个相邻核苷酸的至少一个区段的多核苷酸链的多核苷酸。更具体说来，本实施例证实使用局部施加的多核苷酸来诱导蔬菜作物(即莴苣(莴苣(Lactuca sativa)))中八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因的系统性沉默。
莴苣PDS具有序列ATGTCTCTGTTTGGAAATGTTTCTGCCATTAACTCAAGTGGAAAGTGTATAGTAATGAATCTTTCAAGCACACAAATCACTTCAAGAGATTGTTTCAAGATTACCTCAGGGCAAAAAGATGTTTTGTCATTTGGATGCTGTGATGCTATGGGTAACAGATTGCAATTCCCAAGTGCTCGTTCTTTTACACCAAGATCAAAGAAGAATGTCTCCCCTCTAAAGGTAGTTTGTGTTGATTATCCAAGACCAGATCTTGATAACACATCTAATTTCTTGGAAGCTGCTCACTTGTCTTCAACCTTCAGAACTTCCCCACGCCCATCTAAGCCATTGAAGATTGTAATTGCTGGTGCAGGTTTAGCTGGTTTATCAACTGCTAAGTATTTAGCTGATGCAGGTCACAAGCCAATTTTACTAGAAGCAAGAGATGTTCTTGGTGGAAAGGTGGCAGCTTGGAAAGATGATGATGGAGATTGGTATGAGACAGGTTTACACATATTCTTTGGAGCTTACCCAAATGTACAAAATTTATTTGGAGAGCTAGGAATTAATGATAGATTACAGTGGAAGGAGCATTCTATGATATTTGCAATGCCAAATAAGCCTGGAGAATTTAGTAGGTTTGACTTCCCAGATGTTTTACCTGCACCATTGAATGGAATTTTTGCTATATTGAGGAACAATGAAATGCTGACGTGGCCTGAGAAAGTGAAGTTTGCAATTGGGCTGTTGCCTGCAATGTTAGGTGGACAGGCTTATGTTGAGGCCCAAGATGGGCTTAGTGTTCAGGACTGGATGAGAAAGCAAGGTATACCTGATCGAGTTACTACTGAAGTGTTTATTGCAATGTCAAAAGCATTAAACTTTATAAATCCAGATGAACTTTCAATGCAATGTATTCTCATTGCTCTAAACCGTTTTCTTCAGGAAAAGCATGGTTCCAAGATGGCATTTTTAGATGGGAGCCCACCAGAAAGACTTTGCAAGCCAATTGTTGACCACATCGAGTCACTCGGTGGCCAAGTCAGAGTCAACTCACGAATACAAAAAATTGAGTTAAACAAAGACGGAACTGTCCGGAACTTTCTATTGAGTGATGGGAATGTTCTAGAAGCTGATGCTTATGTTTTCGCTACCCCTGTTGACATTCTCAAGCTTCTTTTACCCGAAGAATGGAAACCAATTCCATATTTCAAAAAATTAGAGAAGTTAGTCGGTGTTCCTGTTATAAACGTTCATATATGGTTTGACAGAAAGCTGAAAAACACATATGATCACTTACTTTTCAGTAGGTCACCTCTGCTGAGTGTGTATGCTGACATGTCAGTGACATGTAAGGAATATTATGATCCGAATAAGTCAATGTTGGAGTTGGTTCTTGCTCCAGCTGAGGAATGGATTTCAAGAAGTGACACTGATATTATTGATGCAACAATGAGTGAACTTTCAAGGCTTTTTCCTGATGAAATTGCAGCTGATCAAAGTAAAGCAAAAATCTTGAAATATAAAGTTGTTAAAACACCAAGGTCTGTTTATAAAACTGTTCCAGATTGTGAACCATGTCGACCCCTACAAAGATCTCCAATTCAAGGATTTTATTTATCTGGTGATTATACTAAACAAAAGTATTTGGCTTCAATGGGGGGTGCTGTTTTATCTGGAAAAATTTGTGCACAAGCTATTTTACAAGATTATGAGATGCTTGCTACA(SEQ ID NO：53)。合成具有以下序列的长21-45个核苷酸的多核苷酸单链DNA：taatacgactcactatagggtttggagcttacccaaATGtac(“HL286”，有义方向，SEQ IDNO：54)、taatacgactcactatagggaggccacgtcagcatttcattgttc(“HL287”，反义方向，SEQ ID NO：55)、ccattcaATGgtgcaggtaaaac(“HL288”，反义方向，SEQ IDNO：56)、catagaATGctccttccactg(“HL289”，反义方向，SEQ ID NO：57)和caaataaattttgtacatttgggtaagctccaa(“HL290”，反义方向，SEQ ID NO：58)。用所有五种多核苷酸于含0.01％Silwet L-77的5mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中的相等混合物制备ssDNA溶液。
测定中使用莴苣品种LS49“Green Tower”。将每株植物两片完全展开的叶子浸渍于新近制备的含0.1％Silwet L-77的双蒸水溶液中数秒。使叶子干燥15-30分钟。每株植物接着通过向两片经过Silwet处理的叶子的顶面施加20微升ssDNA溶液(每株植物总共40微升)来进行处理。表9列出所用的测定条件和所观察到的用ssDNA多核苷酸局部处理的植物的漂白情况。图28描绘用每株植物1纳摩尔ssDNA处理的莴苣植物在处理后(自上而下)37、46和60天时漂白和死亡的进展。
表9
Figure BPA00001609644700911
用每株植物施加2或4纳摩尔ssDNA重复测定。图29A描绘由用多核苷酸局部处理后4天或12天观察到的漂白情况所显现的系统性沉默。
使用各个别反义ssDNA(“HL287”，SEQ ID NO：55；“HL288”，SEQ IDNO：56；“HL289”，SEQ ID NO：57；和“HL290”，SEQ ID NO：58)用每株植物施加8纳摩尔多核苷酸重复测定；阳性对照植物用各2纳摩尔的4种个别反义ssDNA的混合物处理(总共每株植物施加8纳摩尔多核苷酸)，并且阴性对照植物仅用缓冲液处理。图29B描绘由用反义ssDNA局部处理后4时观察到的漂白情况所显现的系统性沉默。
实施例25
本实施例说明本发明的一方面。在这一实施例中，生长中的植物用局部施加的用于诱导植物中靶标基因的系统性沉默的组合物处理，所述组合物包括(a)用于调节植物的多核苷酸渗透的试剂，和(b)包括至少一条包括靶标基因在反义或有义方向上的18个或更多个相邻核苷酸的至少一个区段的多核苷酸链的多核苷酸。更具体说来，本实施例证实使用局部施加的多核苷酸来诱导蔬菜作物(即番茄(番茄(Solanum lycopersicum)))中八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因的系统性沉默。
番茄PDS具有序列GGGTTTATCTCGCAAGTGTGGCTATGGTGGGACGTGTCAAATTTTGGATTGTAGCCAAACATGAGATTTGATTTAAAGGGAATTGGCCAAATCACCGAAAGCAGGCATCTTCATCATAAATTAGTTTGTTTATTTATACAGAATTATACGCTTTTACTAGTTATAGCATTCGGTATCTTTTTCTGGGTAACTGCCAAACCACCACAAATTTCAAGTTTCCATTTAACTCTTCAACTTCAACCCAACCAAATTTATTTGCTTAATTGTGCAGAACCACTCCCTATATCTTCTAGGTGCTTTCATTCGTTCCGAGTAAAATGCCTCAAATTGGACTTGTTTCTGCTGTTAACTTGAGAGTCCAAGGTAGTTCAGCTTATCTTTGGAGCTCGAGGTCGTCTTCTTTGGGAACTGAAAGTCGAGATGGTTGCTTGCAAAGGAATTCGTTATGTTTTGCTGGTAGCGAATCAATGGGTCATAAGTTAAAGATTCGTACTCCCCATGCCACGACCAGAAGATTGGTTAAGGACTTGGGGCCTTTAAAGGTCGTATGCATTGATTATCCAAGACCAGAGCTGGACAATACAGTTAACTATTTGGAGGCTGCATTTTTATCATCAACGTTCCGTGCTTCTCCGCGCCCAACTAAACCATTGGAGATTGTTATTGCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCTACAGCAAAATATTTGGCAGATGCTGGTCACAAACCGATACTGCTGGAGGCAAGGGATGTTCTAGGTGGAAAGGTAGCTGCATGGAAAGATGATGATGGAGATTGGTACGAGACTGGTTTGCATATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATTCAGAACCTGTTTGGAGAATTAGGGATTAACGATCGATTGCAATGGAAGGAACATTCAATGATATTTGCAATGCCAAGCAAGCCAGGAGAATTCAGCCGCTTTGATTTCTCCGAAGCTTTACCCGCTCCTTTAAATGGAATTTTAGCCATCTTAAAGAATAACGAAATGCTTACATGGCCAGAGAAAGTCAAATTTGCAATTGGACTCTTGCCAGCAATGCTTGGAGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGATGGGATAAGTGTTAAGGACTGGATGAGAAAGCAAGGTGTGCCGGACAGGGTGACAGATGAGGTGTTCATTGCTATGTCAAAGGCACTCAACTTTATAAACCCTGACGAACTTTCAATGCAGTGCATTTTGATCGCATTGAACAGGTTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAATCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCGATTGTTGAACACATTGAGTCAAAAGGTGGCCAAGTCAGACTGAACTCACGAATAAAAAAGATTGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAGAGTTTTATACTGAGTGACGGTAGTGCAATCGAGGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCGCTCCAGTGGATATTTTCAAGCTTCTATTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATTCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGTTAGTCGGAGTACCTGTGATAAATGTACATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAGAACACATATGATCATTTGCTCTTCAGCAGAAGCTCACTGCTCAGTGTGTATGCTGACATGTCTGTTACATGTAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTTTTTGCACCTGCAGAAGAGTGGATATCTCGCAGCGACTCAGAAATTATTGATGCAACGATGAAGGAACTAGCAACGCTTTTTCCTGATGAAATTTCAGCAGATCAAAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTACCATGTTGTCAAAACTCCGAGGTCTGTTTATAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCTTTACAAAGATCCCCAATAGAGGGGTTTTATTTAGCCGGTGACTACACGAAACAGAAATACTTGGCTTCAATGGAAGGCGCTGTCTTATCAGGAAAGCTTTGTGCTCAAGCTATTGTACAGGATTATGAGTTACTTGTTGGACGTAGCCAAAAGAAGTTGTCGGAAGCAAGCGTAGTTTAGCTTTGTGGTTATTATTTAGCTTCTGTACACTAAATTTATGATGCAAGAAGCGTTGTACACAACATATAGAAGAAGAGTGCGAGGTGAAGCAAGTAGGAGAAATGTTAGGAAAGCTCCTATACAAAAGGATGGCATGTTGAAGATTAGCATCTTTTTAATCCCAAGTTTAAATATAAAGCATATTTTATGTACCACTTTCTTTATCTGGGGTTTGTAATCCCTTTATATCTTTATGCAATCTTTACGTTAGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCGA(SEQ ID NO：59)。
通过RT PCR使用具有序列TAATACGACTCACTATAGGGTCGCAGCGACTCAGAAATTATTG(SEQ IDNO：61，有义引物)和TAATACGACTCACTATAGGGGTAAAGGCCGACAGGGTTCACAACC(SEQID NO：62，反义引物)的寡核苷酸引物合成201个核苷酸的dsRNA多核苷酸，所述多核苷酸具有能够与由以下序列编码的RNA杂交的反义链：TCGCAGCGACTCAGAAATTATTGATGCAACGATGAAGGAACTAGCAACGCTTTTTCCTGATGAAATTTCAGCAGATCAAAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTACCATGTTGTCAAAACTCCGAGGTCTGTTTATAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCTTTACAAAGATCCCCAATAGAGGGGTTTTATTTAG(SEQ ID NO：60)，所述序列对应于从番茄PDS基因序列(SEQ IDNO：59)转录的mRNA的位置1724-1923上的核苷酸。用含0.01％Silwet L-77的5mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中的201个核苷酸的dsRNA多核苷酸(SEQID NO：60)制备2.5μM dsRNA溶液。
3周龄番茄幼苗如下进行处理。将两片完全展开的叶子浸渍于新近制备的双蒸水中的0.1％Silwet L-77溶液中数秒。使叶子干燥30分钟至1小时。每株植物接着通过向两片经过Silwet处理的叶子的顶面施加20微升dsRNA溶液(每株植物总共40微升)来进行处理。对照植物用缓冲液处理。植物保持在生长室中以供观察。图30描绘如由经过dsRNA处理的植物在局部处理后30天的漂白情况所显现的靶标基因PDS的系统性沉默。与对照植物相比，经过dsRNA处理的植物严重矮化。
实施例26
本实施例说明适于局部涂布于生长中的植物的外部表面上的除草剂组合物的改进，其中植物致死剂包括具有与一个或多个植物基因的序列或从所述植物基因转录的DNA的序列基本上相同或互补的序列的多核苷酸。所述多核苷酸实现对接受局部多核苷酸施加的那些植物器官或组织以外的植物器官或组织中植物基因的系统性抑制。更具体说来，本实施例说明一种适于局部涂布于生长中的植物的外部表面上的除草剂组合物，其包含表面活性剂和至少一种植物致死剂，所述植物致死剂包括具有靶向长芒苋中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因、转录起始因子(TIF)和DNA依赖性ATPase(ddATPase)的序列的多核苷酸的组合。
除草剂组合物包括至少一种以下21bp双链RNA多核苷酸：
(1)nDsRNA1：有义链CUACCAUCAACAAUGGUGUCC(SEQ ID NO：63)和反义链GGACACCAUUGUUGAUGGUAG(SEQ ID NO：64)
(2)nDsRNA3：有义链GUCGACAACUUGCUGUAUAGU(SEQ ID NO：65)和反义链ACUAUACAGCAAGUUGUCGAC(SEQ ID NO：66)
(3)nDsRNA4：有义链GGUCACCUGGACAGAGAAUAG(SEQ ID NO：67)和反义链CUAUUCUCUGUCCAGGUGACC(SEQ ID NO：68)
(4)nDsNA5：有义链AAUGCCAGAUGUUGCUAUGAC(SEQ ID NO：69)和反义链GUCAUAGCAACAUCUGGCAUU(SEQ ID NO：70)
多种多核苷酸的混合物宜用于防止经过处理的植物中抗性的选择。在一实施方案中，除草剂组合物包括以上所有四种具有SEQ ID NO：63-70的dsRNA多核苷酸的混合物。在另一实施方案中，除草剂组合物包括具有对应于dsRNA序列SEQ ID NO：63-70中一个或多个的脱氧核糖核苷酸序列的单链DNA多核苷酸。在另一实施方案中，除草剂组合物包括具有对应于dsRNA序列SEQ ID NO：63-70中一个或多个的核苷酸序列的RNA/DNA杂交体。在另一实施方案中，除草剂组合物包括dsRNA多核苷酸，其中2’羟基经过甲基化以达成稳定性。
除草剂组合物包括表面活性剂，诸如Silwet L-77(或其它有效表面活性剂，诸如实施例36中所提供者)。任选地，除草剂组合物可包括一种或多种添加剂，诸如盐、螯合剂或保湿剂(诸如实施例35中所提供者)，以例如通过增强多核苷酸向植物内部的转移、增强多核苷酸的效力或强化非多核苷酸除草剂的除草剂活性来改进除草剂性能。
任选地，除草剂组合物包括设计成调控植物中的多种基因的多核苷酸。在一实施方案中，除草剂组合物包括具有与第二基因的序列或从所述第二基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列的多核苷酸，其中对所述第二基因的调控可协同增强组合物的除草剂活性。
在一实施方案中，除草剂组合物包括具有与内源性长芒苋5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的序列或从所述内源性EPSPS基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列的多核苷酸，以及具有与内源性长芒苋翻译起始因子(TIF)基因的序列或从所述内源性TIF基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列的多核苷酸。翻译起始因子(TIF)是细胞核编码的叶绿体蛋白质，它对于起始蛋白质合成必不可少并且在整个植物中表达。拟南芥具有命名为AT1G17220.1(描述于在线可见于www.arabidopsis.org/servlets/TairObject？type＝locus&name＝AT1G17220的公众可用数据库The Arabidopsis Information Resource中)并且指定GenBank保藏编号GI：186478573的直系同源物，它已被鉴定为与细菌翻译起始因子2具有相似性的叶绿体定位蛋白质；关于这种基因的描述，还请参看Miura等(2007)Plant Cell，19：1313-1328。从长芒苋(长芒苋(Amaranthus palmeri))鉴定出TIF序列；一种TIF基因鉴定为具有序列SEQ ID NO：71。用于抑制长芒苋中的这种TIF基因的多核苷酸的实例列于表10中。
表10
Figure BPA00001609644700971
Figure BPA00001609644700991
Figure BPA00001609644701001
在一实施方案中，除草剂组合物包括以上具有SEQ ID NOS：63-70的EPSPS dsRNA多核苷酸中至少两者以及至少一种具有与内源性长芒苋翻译起始因子(TIF)基因的序列或从所述内源性TIF基因转录的RNA的序列基本上相同或互补的序列的多核苷酸(诸如表10中所提供者)的混合物。在一特定实施方案中，除草剂组合物包括具有SEQ ID NO：63-70的四种EPSPSdsRNA多核苷酸和160bp TIF双链RNA多核苷酸的混合物，所述160bpTIF双链RNA多核苷酸具有有义序列UUCGAGUAAUGGGAAAUUGGAUAAUGUAGAGGAGAGGAAGAAGGUUAUUGAUUCAUUGGAUGAGGUAUUAGAAAAGGCCGAGAGAUUAGAAACGGCGAACUUACAAGCAGAUAAUAGAAAGGAUAGCACAAAUGUAAAUAAACCGUCUCCGAGUGUAAGU(SEQ ID NO.73)和反义序列ACUUACACUCGGAGACGGUUUAUUUACAUUUGUGCUAUCCUUUCUAUUAUCUGCUUGUAAGUUCGCCGUUUCUAAUCUCUCGGCCUUUUCUAAUACCUCAUCCAAUGAAUCAAUAACCUUCUUCCUCUCCUCUACAUUAUCCAAUUUCCCAUUACUCGAA(SEQ ID NO.74)。
在一些实施方案中，多核苷酸被设计成调控多种靶标基因，从而对除草剂活性产生协同作用。举例来说，对除草剂活性的协同作用是通过用设计成抑制翻译起始因子(TIF)和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核苷酸处理植物，随后用非多核苷酸除草剂草甘膦处理来获得。
通过合成或通过体外转录产生表11中所列的多核苷酸。
表11
Figure BPA00001609644701021
Figure BPA00001609644701031
Figure BPA00001609644701041
Figure BPA00001609644701051
使用表12中所述的方案，制备多核苷酸的溶液并且施加到长芒苋叶子上。
表12
Figure BPA00001609644701061
如表13中所指示来测试多核苷酸的组合。
表13
Figure BPA00001609644701062
Figure BPA00001609644701081
Figure BPA00001609644701091
Figure BPA00001609644701101
Figure BPA00001609644701111
*其中列出大于1的拷贝数，经过处理的植物是拷贝数的混合物
**DAT＝处理后的天数；“0％对照”意指经过处理的植物与对照植物之间未观察到差异；矮化％是计算为[100-(测试植物的平均高度/对照植物的平均高度)*100]
如表14中所列设计用于抑制长芒苋中的TIF基因的双链25聚体RNA多核苷酸序列。
表14
Figure BPA00001609644701121
对高(112)拷贝和低(16)拷贝EPSPS草甘膦抗性长芒苋测试TIF 25聚体dsRNA多核苷酸。
高拷贝植物用11.5克/英亩的4种短EPSPS dsRNA的混合物(如实施例1中所述的短dsRNA-1、短dsRNA-3、短dsRNA-4，以及IDT[5](如表11中所述的SEQ ID NO：91-92))以及5.8克/英亩的一种个别TIF dsRNA或用5.8克/英亩的各个别TIF 25聚体dsRNA处理；多核苷酸溶液在含有2％硫酸铵和1％Silwet L-77的10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中配制。多核苷酸处理后30分钟，对植物喷洒草甘膦(每公顷1682g酸当量的RoundupWeatherMAX
Figure BPA00001609644701132
牌除草剂)或不喷洒草甘膦。
低拷贝植物用0.23克/英亩的4种短EPSPS dsRNA的混合物(如实施例1中所述的短dsRNA-1、短dsRNA-3、短dsRNA-4，以及IDT[5](如表11中所述的SEQ ID NO：91-92))以及5.8克/英亩的一种个别TIF dsRNA或用5.8克/英亩的各个别TIF 25聚体dsRNA处理；多核苷酸溶液在含有2％硫酸铵和1％Silwet L-77的10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中配制。多核苷酸处理后30分钟，对植物喷洒草甘膦(每公顷1682g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644701133
WeatherMAX
Figure BPA00001609644701134
牌除草剂)或不喷洒草甘膦。
结果描绘于图31和32中并且显示，TIF多核苷酸增强EPSPS多核苷酸的活性并且TIF多核苷酸单独具有除草剂活性。
实施例27
本发明的各方面包括用于增强植物中非多核苷酸除草剂的活性的多核苷酸组合物和使用方法。举例来说，将设计成调控除草剂靶标基因或除草剂去活基因或胁迫反应基因或所述靶标基因的组合的多核苷酸组合物施加到杂草或自生植物上，同时或随后或预先施加非多核苷酸除草剂(通常为常规化学除草剂)，使得非多核苷酸除草剂的活性增强。多核苷酸组合物与非多核苷酸除草剂(例如常规化学除草剂)的组合提供协同作用，即所述组合的除草剂作用大于多核苷酸组合物的除草剂作用与非多核苷酸除草剂的除草剂作用的总和。
常规化学除草剂和其对应除草剂靶标基因的实例提供于表15中。
表15
Figure BPA00001609644701141
常规化学除草剂和其对应除草剂去活基因的实例提供于表16中。
表16
Figure BPA00001609644701142
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实施例28
本实施例说明用于诱导生长中的植物中靶标内源性基因的系统性调控的方法，其包括在生长中的植物的叶子上局部涂布具有与靶标内源性基因或从靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，由此所述多核苷酸渗透生长中的植物的内部并且诱导对靶标内源性基因的系统性调控。
设计针对以下除草剂靶向的基因的双链RNA或反义ssDNA多核苷酸：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、乙酰乳酸合酶(ALS)和谷氨酰胺合酶(GS)。对于各除草剂靶向的基因，在施加0.5％Silwet L-77喷雾剂(10加仑/英亩)后以2.32克/英亩的比率施加含有8种反义ssDNA多核苷酸的混合物于含2％硫酸铵的10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中的溶液。所测试的多核苷酸和所得表型观察结果列于表17中。
表17
Figure BPA00001609644701152
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研究靶向酶4-羟基苯丙酮酸(HPPD)和原卟啉原氧化酶(PPO)以及转录起始因子(TIF)的ssDNA多核苷酸的除草剂活性，以及其与除草剂甲基磺草酮、氟磺胺草醚(fomesafen)和莠去津组合用于长芒苋中时对除草剂活性的影响。这一实验中所用的多核苷酸是8种HPPD反义ssDNA寡核苷酸(SEQ ID NO：141-148)、8种PPO反义寡核苷酸(SEQ ID NO：125-132)和8种TIF反义ssDNA寡核苷酸(SEQ ID NO：75-82，参看实施例26)。
草甘膦敏感性长芒苋(长芒苋)植物在4英寸方形罐中含有3.5kg/m3Osmocote
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14-14-14肥料的Sun Gro
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Redi-Earth幼苗混合物中在具有14小时光周期以及30℃日间温度和20℃夜间温度的温室中生长。必要时，对植物进行地下灌溉。
对10至15cm高的植物用40微升(4片完全展开的成熟叶子用每株植物上每片叶子10微升溶液处理)缓冲液-表面活性剂溶液(作为对照；0.5％Silwet L-77和2％硫酸铵)或缓冲液-表面活性剂-靶向HPPD、PPO或TIF的反义寡核苷酸的ssDNA多核苷酸混合物进行人工预处理。一些植物保持未处理并且用作对照。24小时后，使用配备有9501E喷嘴并且经过校准以递送每公顷93升溶液的履带式喷洒器对未处理的植物、用缓冲液-表面活性剂处理过的植物和用缓冲液-表面活性剂-ssDNA处理过的植物进行处理，所述溶液具有HPPD抑制剂、甲基磺草酮(每加仑4磅活性成分)，或具有PPO抑制剂、氟磺胺草醚(每加仑2磅活性成分)，或具有光合系统II抑制剂、莠去津(90％活性成分)，如表18中所指示。将1％的作物油浓缩物(COC)添加至所有除草剂处理中。使用低比率的各除草剂(甲基磺草酮：每英亩13g，等于推荐田间比率的1/8X；氟磺胺草醚：每英亩16g，等于推荐田间比率的1/22X；和莠去津：每英亩170g，等于推荐田间比率的1/8X)以便能够检测寡核苷酸混合物对除草剂活性的任何提高。
表18
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在除草剂处理后4天测定植物高度。从一个使用每个处理4个重复的实验采集数据。结果(表示为受缓冲液-表面活性剂溶液、ssDNA和除草剂处理组合影响时的长芒苋植物高度)呈现于表19和图33中。用HPPD反义ssDNA寡核苷酸、PPO反义ssDNA寡核苷酸和TIF反义ssDNA寡核苷酸处理的植物显示生长矮化，分别测量为125、153和115mm，而用缓冲液-表面活性剂(对照)处理的植物测量为185mm(图33)。相对于缓冲液-表面活性剂对照，用HPPD反义ssDNA寡核苷酸、PPO反义ssDNA寡核苷酸和TIF反义ssDNA寡核苷酸处理分别引起32％、18％和38％生长减少。
在相继用缓冲液-表面活性剂和除草剂处理的植物和仅用除草剂处理的植物之间未观察到植物高度的较大差异。与用缓冲液-表面活性剂处理的植物相比，相继用HPPD反义ssDNA寡核苷酸和甲基磺草酮处理的植物显示植物生长的最大减少，测量为100mm，即减少46％。与用缓冲液-表面活性剂处理的植物相比，相继用PPO反义ssDNA寡核苷酸和氟磺胺草醚处理的植物测量为126mm，即减少32％。与用缓冲液-表面活性剂处理的植物相比，相继用TIF反义ssDNA寡核苷酸和莠去津处理的植物测量为121mm，即减少34％。
表19
Figure BPA00001609644701221
实施例29
本实施例说明设计用于不同的必需基因的双链RNA多核苷酸的测试序列以确定测试序列对可观察到的表型的影响。对于各必需基因，在施加0.5％Silwet L-77喷雾剂(10加仑/英亩)后以每株植物240皮摩尔的比率将含有dsRNA多核苷酸于含2％硫酸铵的10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中的溶液施加到长芒苋上。所测试的多核苷酸和所得表型观察结果列于表20中。
表20
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实施例30
本实施例说明被设计成靶向特定低序列同源区并且可用于例如选择特定物种的靶标基因或基因的特定等位基因的多核苷酸。设计成靶向非编码序列的多核苷酸可用于调控在基因调控中所涉及的非编码RNA，例如调控被加工成RNAi调控路径中的siRNA的非编码RNA。图34描绘本氏烟草PDS基因座1启动子(SEQ ID NO：319)与PDS基因座2启动子(SEQ ID NO：320)的比对；在含有多个转录开始位点的基因座1的情况下，这一比对中所用的启动子序列是具有5’最远端转录开始位点的启动子序列。发现本氏烟草PDS1和PDS2基因在启动子区域中具有低序列同源性，但在编码区中具有高序列同源性。
设计成靶向PDS1和PDS2启动子的不同部分的多核苷酸列于表21中。
表21
Figure BPA00001609644701292
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使用类似于实施例12中所述的程序，对4周龄本氏烟草植物测试如列于表21中并且图解说明于图35中的多核苷酸的六种不同组合(每株植物1纳摩尔每种施加的多核苷酸)。多核苷酸溶液是在含0.01％(v/v)Silwet L-77和2％(w/v)硫酸铵的5mM磷酸钠(pH 6.8)中制备。将每株植物的两片完全展开的叶子浸渍于用ddH2O新近制备的0.1％Silwet L-77溶液中数秒，并且使其干燥。约30分钟后，将20微升多核苷酸溶液施加到两片经过预处理的叶子中的每一片上。阳性对照植物类似地用靶向PDS1和PDS2的编码区的保守区段的DNA寡核苷酸处理；阴性对照植物类似地用设计成使绿色荧光蛋白(GFP)沉默的DNA寡核苷酸处理。所有设计成靶向PDS1或PDS2启动子区域的多核苷酸的6种组合均在经过处理的植物中诱导系统性沉默，如漂白情况所显现。用约为200bp并且靶向PDS1或PDS2启动子区域的dsRNA或dsDNA多核苷酸处理也在经过处理的植物中诱导系统性沉默，如漂白情况所显现。
列于表22中的以下额外基因组序列(包括启动子以及转录的内含子和外显子序列)是针对长芒苋基因鉴定出，以供用于设计供局部施加的多核苷酸：
表22
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实施例31
本实施例说明一种调控超过一种植物物种中的基因表达的多核苷酸序列。鉴别来自不同的杂草物种的EPSPS序列中的两个高度保守的区域并且显示为表23中的“区域1”和“区域2”序列。
表23
Figure BPA00001609644701521
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表24列出基于针对区域2的EPSPS共有序列TNGANGTcAAcATGAAcAAaATGCCaGATGTNGCNATGACNcTtGCNGTNGTTGC(SEQ ID NO：263)所设计的21聚体、22聚体、24聚体、35聚体、45聚体和55聚体dsRNA多核苷酸序列。
表24
Figure BPA00001609644701541
EPSPS共有dsRNA多核苷酸是通过体外转录而合成，并且以粗RNA制剂形式局部施加。草甘膦抗性杂草(16个拷贝的长芒苋和加拿大飞篷)用6种个别(21聚体、22聚体、24聚体、35聚体、45聚体、55聚体)共有dsRNA处理；非草甘膦抗性杂草(水麻、决明、马唐、牵牛花、藜、大戟属)用三种个别较短(21聚体、22聚体、24聚体)共有dsRNA处理。在多核苷酸处理后，将草甘膦抗性植物用草甘膦(每公顷1682g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644701542
WeatherMAX
Figure BPA00001609644701543
牌除草剂)处理并且非草甘膦抗性植物用草甘膦(每公顷105g酸当量的Roundup
Figure BPA00001609644701544
WeatherMAX
Figure BPA00001609644701545
牌除草剂)处理。处理后7天，发现所有6种EPSPS区域2共有dsRNA多核苷酸均得到草甘膦抗性长芒苋的100％控制(被杀死的植物)；仅用草甘膦处理的对照长芒苋植物未被杀死。处理后7天，发现个别测试的三种较短(21聚体、22聚体、24聚体)EPSPS区域2共有dsRNA多核苷酸分别得到水麻的95％、80％和65％控制(合并被杀死和被伤害的植物)；仅用草甘膦处理的水麻植物得到约40％控制(合并被杀死和被伤害的植物)；并且所有三种较短(21聚体、22聚体、24聚体)共有dsRNA多核苷酸的混合物得到与单独草甘膦大致相同的控制。EPSPS区域2共有dsRNA多核苷酸未对所测试的其它杂草物种(加拿大飞篷、决明、马唐、牵牛花、藜、大戟属)造成可观察到的影响。
实施例32
本实施例说明使用局部多核苷酸处理来使植物基因短暂沉默以实现所需表型。使植物组织中的多酚氧化酶沉默可抑制切割或受损的植物组织的褐化，这对于褐化抗性是所需要的性状的果实和蔬菜来说是一种有价值的性状。
设计具有表25中所示的序列的反义DNA寡核苷酸以靶向来自莴苣的三种多酚氧化酶基因(PPO1、PPO2和PPO3)；加下划线的文字指示反义多核苷酸中所包括的T7序列。
表25
Figure BPA00001609644701551
3周龄莴苣植物(品种SVR3603L4)如下进行处理。用0.1％(v/v)Silwet-L-77预处理每株植物上的两片源叶子(较老且约为成熟尺寸的60％的叶子)且使其干燥(约15分钟)。以小液滴形式向每片叶子施加20微升的多酚氧化酶反义多核苷酸在含0.01％(v/v)Silwet L-77和2％(w/v)硫酸铵的5mM磷酸钠(pH 6.8)溶液中的混合物；每株植物用6.7纳摩尔的三种多核苷酸HH07、HH09和HH11中的每一者处理(每株植物总共20纳摩尔)。对照植物仅用无关的多核苷酸HH02-05(八氢番茄红素去饱和酶的反义分子)或用缓冲液(含0.01％(v/v)Silwet L-77和2％(w/v)硫酸铵的5mM磷酸钠，pH 6.8)处理。
局部多核苷酸处理后约3周，在水下从莴苣头切下“未处理的”莴苣叶子(即，不是用局部多核苷酸处理的叶子)且在具有含1.33mM甲基茉莉酮酸酯的5％乙醇的杯子中孵育。检查叶子的中央主脉褐化并且每24小时拍摄照片。从剩余的植物取样并且冷冻以用于小RNA和mRNA分析。
用多酚氧化酶反义多核苷酸HH07、HH09和HH11处理的植物显示用甲基茉莉酮酸酯处理后中央主脉褐化明显减少。作为对照用HH02-05(八氢番茄红素去饱和酶的反义分子)处理的植物显示与经过缓冲液处理的对照相比，中央主脉褐化的减少较小。
实施例33
本实施例说明一种适于局部涂布于生长中的植物的外部表面上的除草剂组合物，其包含表面活性剂和至少一种植物致死剂，改进之处在于其中植物致死剂包括具有与植物基因的序列或植物基因的转录RNA的序列基本上相同或互补的序列的多核苷酸，所述多核苷酸实现对植物基因的系统性抑制。更具体说来，本实施例说明一种适于局部涂布于生长中的植物的外部表面上的除草剂组合物，其包含表面活性剂和至少一种植物致死剂，改进之处在于其中植物致死剂包括多核苷酸，所述多核苷酸实现对来自本氏烟草的内源性八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)或核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶(RuBisCO)基因的抑制。本实施例还说明使用局部施加的多核苷酸来抑制植物中以极高程度表达的基因(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶)。
设计具有序列CATCTCCTTTAATTGTACTGC(SEQ ID NO：34)的反义多核苷酸用于内源性本氏烟草八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因，所述基因具有cDNA序列片段ATGCCCCAAATCGGACTTGTATCTGCTGTTAATTTGAGAGTCCAAGGTAATTCAGCTTATCTTTGGAGCTCGAGGTCTTCGTTGGGAACTGAAAGTCAAGATGTTTGCTTGCAAAGGAATTTGTTATGTTTTGGTAGTAGCGACTCCATGGGGCATAAGTTAAGGATTCGTACTCCAAGTGCCACGACCCGAAGATTGACAAAGGACTTTAATCCTTTAAAGGTAGTCTGCATTGATTATCCAAGACCAGAGCTAGACAATACAGTTAACTATTTGGAGGCGGCGTTATTATCATCATCGTTTCGTACTTCCTCACGCCCAACTAAACCATTGGAGATTGTTATTGCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCTACAGCAAAATATCTGGCAGATGCTGGTCACAAACCGATATTGCTGGAGGCAAGAGATGTCCTAGGTGGGAAGGTAGCTGCATGGAAAGATGATGATGGAGATTGGTACGAGACTGGGTTGCACATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATGCAGAACCTGTTTGGAGAACTAGGGATTGATGATCGGTTGCAGTGGAAGGAACATTCAATGATATTTGCGATGCCTAACAAGCCAGGGGAGTTCAGCCGCTTTGATTTTCCTGAAGCTCTTCCTGCGCCATTAAATGGAATTTTGGCCATACTAAAGAACAACGAAATGCTTACGTGGCCCGAGAAAGTCAAATTTGCTATTGGACTCTTGCCAGCAATGCTTGGAGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGACGGTTTAAGTGTTAAGGACTGGATGAGAAAGCAAGGTGTGCCTGATAGGGTGACAGATGAGGTGTTCATTGCCATGTCAAAGGCACTTAACTTCATAAACCCTGACGAGCTTTCGATGCAGTGCATTTTGATTGCTTTGAACAGATTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAACCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCGATTGTGGAACATATTGAGTCAAAAGGTGGCCAAGTCAGACTAAACTCACGAATAAAAAAGATCGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAATGTTTTATACTGAATAATGGCAGTACAATTAAAGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCACTCCAGTGGATATCTTGAAGCTTCTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATCCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGCTAGTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCCATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAGAACACATCTGATAATCTGCTCTTCAGCAGAAGCCCGTTGCTCAGTGTGTACGCTGACATGTCTGTTACATGTAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTATTTGCACCCGCAGAAGAGTGGATAAATCGTAGTGACTCAGAAATTATTGATGCTACAATGAAGGAACTAGCGAAGCTTTTCCCTGATGAAATTTCGGCAGATCAGAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTATCATGTTGTCAAAACCCCAAGGTCTGTTTATAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCCTTGCAAAGATCCCCTATAGAGGGTTTTTATTTAGCTGGTGACTACACGAAACAGAAGTACTTGGCTTCAATGGAAGGTGCTGTCTTATCAGGAAAGCTTTGTGCACAAGCTATTGTACAGGATTACGAGTTACTTCTTGGCCGGAGCCAGAAGATGTTGGCAGAAGCAAGCGTAGTTAGCATAGTGAACTAA(SEQ IDNO：38)。基于以下本氏烟草EPSPS cDNA序列设计具有序列CTGTGATCATCATATGTATCA(SEQ ID NO：279)、CCTTAACTCTCCAGCTAGCAA(SEQ ID NO：280)、CAGCCCGCAAATGTTTCATTC(SEQ ID NO：281)、GCCGTCAATGGCCGCATTGCT(SEQ ID NO：282)、TCCTTCCCTCAGAAAGGGCAG(SEQ ID NO：283)和TTGCCTCATGCTGCTAATCTG(SEQ ID NO：284)的反义多核苷酸用于内源性本氏烟草5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因：CTTATATGTGCTTAAGCCTAACGTGCACCCGGCCCCTTAACCCCAGCAGTTTTCAATCTACCTACCGTCTCTACCATTTTCTTCTAGTTGGTGAAAATTTCTAACTTTGAGAAAACAAGCCAAAGTTTTTGTTTCTAAGAACGCAAAATGAGTGAAATTTTTTGCAGCAATGGCACAGATTAGCAGCATGAGGCAAGGGATACAGACCCCTAATCTTAATTCCTATTTTCCTAAAACCCAAAAGGTTCCTCTTTTTTCGCATTCTATCTTCTTTGGATCAAAGAAAATAACCCAAAATTCAGCAAAATCTTTGTGGGTGTGTAAGAAAGATTCAGTTTTGAGGGTGGCAAAGTCACCTTTTAGGATTTGTGCATCAGTGGCCACTGCACAGAAGCCCAACGAGATTGTGCTGCAACCCATCAAAGATATATCAGGCACTGTTAAATTGCCTGGTTCTAAATCCCTTTCCAACCGTATTCTCCTTCTTGCTGCCCTTTCTGAGGGAAGGACTGTTGTTGACAATTTACTGAGTAGTGATGACATTCATTACATGCTTGGTGCGTTGAAAACACTTGGACTTCATGTAGAAGATGACAATGAAAACCAACGAGCAATTGTGGAAGGTTGTGGTGGGCAGTTTCCTGTCGGCGAGAAGTCTGAGGAAGAAATCCAACTATTCCTTGGAAATGCAGGAACAGCAATGCGGCCATTGACGGCAGCAGTTACTGTAGCTGGAGGACATTCAAGATATGTACTTGATGGAGTTCCTAGGATGAGAGAGAGACCGAT(SEQ ID NO：285)、CACTGACGTTGGATTAGAGGTAGGCTCCTTATATGTGCTTAAGCCTAACGTGCAGCCGGCCCCCAACCCCAGCAGTTTTCAATCTACCTACCGTCTCTACCATTTTCTTATAGTAGTTGAAAATTTCTAACTTTGAGAAAACAAGCCAAAGTTTTGTTTCTAAGAACACAAAGGGAGTGAAATTTTTTGCAGCAATGGCACAGATTAGCAGCATGAGGCAAGGGATACAGACCCCTAATCTTAATTCCTATTTTCCTAAAACCCAAAAGGTTCCTCTTTTTTCGCATTCTATCTTCATTGGATCAAAGAAAATAACCCAAAATTCAGCAAAATCTTTGTGGGTGTGTAAGAAAGATTCAGTTTTGAGGGTGGCAAAGTCACCTTTTAGGATTTGTGCATCAGTGGCCACTGCACAGAAGCCTAACGAGATTGTGCTGCAACCTATCAAAGATATATCAGGCACTGTTAAATTACCTGGTTCTAAATCCCTTTCCAATCGTATTCTCCTTCTTGCTGCCCTTTCTGAGGGAAGGACTGTTGTTGACAATTTACTGAGTAGTGATGACATTCATTACATGCTTGGTGCATTGAAAACACTTGGACTTCATGTAGAAGATGACAATGAAAACCAACGAGCAATCGTAGAAGGTTGTGGTGGGCAGTTTCCTGTCGGCAAGAAGTCTGAGGAAGAAATCCAACTATTCCTTGGAAATGCAGGAACAGCAATGCGGCCATTGACGGCAGCAGTTACTGTAGCTGGTGGACATTCTAGATATGTACTTGATGGAGTTCCTAGGAT(SEQ ID NO：286)和AAATTCTTGGTTCGAGGAGGTCAGAAGTACAAGTCTCCTGGAAAAGCATATGTTGAAGGAGATGCCTCAAGTGCTAGCTACTTTTTGGCGGGTGCAGCTGTCACAGGTGGAACTGTCACTGTTGAAGGTTGTGGAACAAGCAGTTTACAGGGGGATGTTAAGTTTGCTGAGGTCCTCGAAAAGATGGGGGCAGAAGTTACATGGACAGAGAACAGTGTCACGGTTAAAGGACCTCCAAGGAACTCTTCTGGAATGAAACATTTGCGGGCTGTTGACGTTAACATGAACAAAATGCCAGATGTTGCCATGACTCTTGCTGTAGTTGCACTTTTTGCTGATAGTCCTACTGCCATAAGAGATGTTGCTAGCTGGAGAGTTAAGGAAACTGAGCGGATGATTGCCATATGCACAGAACTTAGGAAGTTGGGTGCAACAGTTGTAGAAGGGCCAGACTACTGCATAATCACTCCACCTGAAAAGTTAAAAGTAGCGGAAATTGATACATATGATGATCACAGAATGGCCATGGCTTTCTCTCTTGCGGCTTGTGCTGATGTTCCAGTCACCATTAAGGACCCCGGTTGTACTCGCAAAACCTTCCCCAACTACTTTGACGTTCTCCAGCAGTATTCCAAGCATTAAACCACTTTCCATTAAGAATTTTGAAAAAGAGAGACTTTGACAACAATGGTGTCATACCGGAAGAGAAAAGCTTTGATCCAAGCTTTCAACTCCTTTTCATTTGTCATGTGATGATCATTGTATTTGTTGAAGTTGAGCTGCTTTTCTTTTGTCCAGAAGACATGTATGGATACTATTACTATATAGTTAAGGTGAACTCAGCA(SEQ ID NO：287)。基于以下本氏烟草叶绿体RuBisCO小链2A cDNA序列片段设计具有序列CCACATGGTCCAGTATCTGCC(AK195、RBCS_1-2-3-4、SEQ ID NO：288)、CAAGCAAGGAACCCATCCATT(AK196、RBCS_1-2-3-4、SEQ ID NO：289)、GGCCACACCTGCATGCATTGC(AK197、RBCS_1-2-3-4、SEQ ID NO：290)、GTGTTCACGGTAGACAAATCC(AK198、RBCS_1-2、SEQ ID NO：291)、TGCACTGCACTTGACGCACGT(AK199、RBCS_1-2、SEQ ID NO：292)、ACTGATGCATTGCACTTGAC(AK200、RBCS_3-4、SEQ ID NO：293)、CAAATCAGGAAGGTATGAGAG(AK201、RBCS_3-4、SEQ ID NO：294)和TGTCAAGGTTTTGTTTCCTGG(AK202、RBCS_3-4、SEQ ID NO：295)的反义多核苷酸用于内源性本氏烟草核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶(RuBisCO)基因：GCAATGGCTTCCTCAGTTCTTTCCTCAGCAGCAGTTGCCACCCGCAGCAATGTTGCTCAAGCTAACATGGTTGCACCTTTCACAGGTCTTAAGTCTGCTGCCTCATTCCCTGTTTCAAGAAAGCAAAACCTTGACATCACTTCCATTGCCAGCAACGGCGGAAGAGTGCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAACATGAAGAAGTATGAGACTCTCTCATACCTTCCCGATTTGAGCCAGGAGCAATTGCTCTCCGAAATTGAGTACCTTTTGAAGAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGAAAGGATTTGTCTACCGTGAACACCACAAGTCACCAGGATACTATGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGCTACCTATGTTCGGATGCACTGATGCCACCCAAGTGTTGGCTGAGGTGGGAGAGGCGAAGAAGGAATACCCACAGGCCTGGGTCCGTATCATTGGATTTGACAACGTGCGTCAAGTGCAGTGCATCAGTTTCATTGCCTCCAAGCCTGACGGCTAC(SEQ ID NO：296)、CAATGGCTTCCTCAGTTCTTTCCTCAGCAGCAGTTGCCACCCGCAGCAATGTTGCTCAAGCTAACATGGTTGCACCTTTCACTGGTCTTAAGTCAGCTGCCTTTTTCCCTGTTTCAAGGAAGCAAAACCTTGACATCACTTCCATTGCCAGCAACGGCGGAAGAGTGCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAACAAGAAGAAGTACGAGACTCTCTCATACCTTCCTGATCTGAGCGTGGAGCAATTGCTTAGCGAAATTGAGTACCTCTTGAAAAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGCGCGGATTTGTCTACCGTGAACACCACAAGTCACCGGGATACTATGACGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGTTGCCTATGTTCGGATGCACTGATGCCACCCAAGTGTTGGCCGAGGTGGAAGAGGCGAAGAAGGCATACCCACAGGCCTGGATCCGTATTATTGGATTCGACAACGTGCGTCAAGTGCAGTGCATCAGTTTCATTGCCTACAAGCCAGAAGGCTAC(SEQ ID NO：297)、CAAGCCAACATGGTTGCACCCTTCACTGGCCTCAAGTCCGCCTCCTCCTTCCCTGTTACCAGGAAACAAAACCTTGACATTACCTCCATTGCTAGCAATGGTGGAAGAGTTCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAACATGAAGAAGTACGAGACACTCTCATACCTTCCTGATTTGAGCCAGGAGCAATTGCTTAGTGAAGTTGAGTACCTTTTGAAAAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGCGTGGATTCGTCTACCGTGAACACCACAACTCACCAGGATACTACGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGTTGCCCATGTTCGGGTGCACTGATGCCACTCAGGTGTTGGCTGAGGTCGAGGAGGCAAAGAAGGCTTACCCACAAGCCTGGGTTAGAATCATTGGATTCGACAACGTCCGTCAAGTGCAATGCATCAGTTTTATCGCCTCCAAGCCAGAAGGCTAC(SEQ ID NO：298)和GGCTCAGTTATGTCCTCAGCTGCCGCTGTTTCCACCGGCGCCAATGCTGTTCAAGCCAGCATGGTCGCACCCTTCACTGGCCTCAAGGCCGCCTCCTCCTTCCCGGTTTCCAGGAAACAAAACCTTGACATTACTTCCATTGCTAGAAATGGTGGAAGAGTCCAATGCATGCAGGTGTGGCCGCCAATTAACAAGAAGAAGTACGAGACACTCTCATACCTTCCTGATTTGAGCGTGGAGCAATTGCTTAGCGAAATTGAGTACCTTTTGAAAAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGCATGGATTCGTCTACCGTGAACACCACCACTCACCAGGATACTACGATGGCAGATACTGGACGATGTGGAAGTTGCCCATGTTCGGGTGCACCGATGCCACTCAGGTCTTGGCTGAGGTAGAGGAGGCCAAGAAGGCTTACCCACAAGCCTGGGTCAGAATCATTGGATTCGACAACGTCCGTCAAGTGCAATGCATCAGTTTCATCGCCTACAAGCCCGAAGGCTAT(SEQ ID NO：299)。
使用类似于实施例12中所述的程序处理本氏烟草植物。多核苷酸溶液(或在EPSPS和RuBisCO的情况下是混合的多核苷酸)是在含0.01％(v/v)Silwet L-77和2％(w/v)硫酸铵的5mM磷酸钠(pH 6.8)中制备。将每株植物的两片完全展开的叶子浸渍于用ddH2O新近制备的0.1％Silwet L-77溶液中数秒，并且使其干燥。约30分钟后，将20微升多核苷酸溶液施加到两片经过预处理的叶子中的每一片上。对于PDS，5株植物中的每一者均接受25纳摩尔PDS反义多核苷酸(SEQ ID NO：34)；对于EPSPS，5株植物中的每一者均接受50纳摩尔的各EPSPS反义多核苷酸(SEQ ID NO：279-284)；并且对于RuBisCO，5株植物中的每一者均接受50纳摩尔的各RuBisCO反义多核苷酸(SEQ ID NO：288-295)。成对的对照植物用缓冲液(含0.01％(v/v)Silwet L-77和2％(w/v)硫酸铵的5mM磷酸钠，pH 6.8)处理。测量为处理后12天(PDS和EPSPS)或10天(RuBisCO)的植物高度的结果显示于图36A-36B中。用PDS反义多核苷酸处理的植物展示严重矮化(图36A)和漂白。用EPSPS反义多核苷酸处理的植物展示严重矮化(图36B)并且分生组织和茎组织严重受损。用RuBisCO反义多核苷酸处理的植物展示严重矮化(图36C)和顶端组织畸形。
设计第二组实验以研究使植物中的内源性RNAi沉默路径的组分沉默的作用。Argonaute(AGO)蛋白是RNA诱导的沉默复合体(RISC)的组分，所述复合体结合RNAi沉默过程中的小RNA。预期抑制Argonaute将减少由RNAi沉默过程引起的所观察到的表型作用。基于以下两个本氏烟草AGO1-2部分cDNA序列设计具有序列GGAGGCAAAATACGAGCCTCA(HL510，SEQ ID NO：300)、CACTAATCTTAATACCAAACT(HL511，SEQ IDNO：301)、TATGGGTCATTAGCATAGGCATTAT(HL512，SEQ ID NO：302)、TCTCAAGAATATCACGCTCCC(HL513，SEQ ID NO：303)、CCCTTGGGGACGCTGGCAGGTCAC(HL514，SEQ ID NO：304)、TAATACGACTCACTATAGGGGGAGAGAGCTAGATCTTTTG(HL515，SEQID NO：305)、TAATACGACTCACTATAGGCACAGTATTTCTTCCTCCAACC(HL516，SEQ ID NO：306)、TTGCTCATCTTAAATACATGT(HL517，SEQID NO：307)、TCATCTTAAATACATGTTTTGTCA(HL518，SEQ ID NO：308)、TTATCTTCAGGGATACATTAGC(HL519，SEQ ID NO：309)、ATACTGCTTGCTCATCTTAAATA(HL520，SEQ ID NO：310)、GACAATTCCAAGTTCAGTTTC(HL521，SEQ ID NO：311)、CCGTTTTAGATCACCATAAAGAGA(HL522，SEQ ID NO：312)、TTGTCTGGTAATATCACAATC(HL523，SEQ ID NO：313)的AGO1反义多核苷酸用于内源性本氏烟草Argonaute-1(AGO1)基因：TGGTGAGGAAGAGGAGAACTGAGTTACCTGGTTCTGGTGAGAGCTCTGGGTCTCAAGAAACTGGCGGACAGGGTCGTGGCCAGCATCCACAGCAGCTGCACCAAGCTACCTCCCAGACTCCATATCAAACTGCAATGACTACTCAGCCAATACCTTATGCAAGACCAACTGAAACATCCTCCGAAGCTGGTTCCTCATCTCAGCCACCTGAGCAGGCAGCTCTACAAGTGACACAACAGTTCCAGCAACTTGCTTTGCAACAAGAAGCGGCTACAACGCAAGCAGTTCCACCTGCATCAAGCAAATTACTAAGGTTTCCCCTGCGTCCAGGGAAGGGGAGCAATGGTATGAGATGCATAGTCAAAGCCAATCACTTCTTCGCAGAGCTGCCTGACAAAGACTTGCACCAGTATGATGTCACAATTTCTCCAGAGGTGTCATCACGTGGCGTCAACCGTGCTGTCATGGCGCAACTGGTGAAGCTGTACCAAGAATCTCATCTTGGGAAGAGACTTCCAGCATATGATGGAAGGAAAAGTCTATACACTGCAGGGCCCCTTCCATTTGTTCAAAAAGACTTCAAAATAACTCTTATTGATGATGAGGATGGGCCTGGTGGTGCTAGAAGGGAAAGGGAATTTAAAGTTGTGATCAAATTGGCTGCCCGTGCTGATCTTCATCACTTGGGAATGTTTTTAGAAGGGAAACAGGCTGATGCACCTCAAGAGGCGCTTCAAGTTCTGGATATTGTTCTGCGTGAGTTGCCAACATCTAGGTTTTGTCCTGTGGGTCGTTCTTTCTATTCCCGTGATTTAGGGCGAAAGCAACCATTGGGTGAAGGTTTAGAAAGTTGGCGTGGGTTCTATCAAAGCATTCGCCCCACACAAATGGGCTTATCACTGAACATCGATATGTCTTCCACTGCATTCATTGAGCCACTGCCAGTCATTGATTTTGTGACACAGCTTCTGAACCGAGATGTGCCATCTAGACCACTGTCTGATGCTGGCCGTGTAAAGATAAAAAAAGCTCTGAGAGGTGTGAAGGTGGAGGTTACTCATCGTGGAAATATGCGGAGGAAGTACCGCATTTCGGGTTTAACATCTCAAGCAACAAGAGAGTTGACCTTCCCTGTTGATGAAAATGGTACAGTGAAATCTGTAATTGAGTATTTTCGAGAAACATATGGGTTTGTAATTCAGCATACTCAGTGGCCTTGTCTACAAGTTGGAAATCAGCAGAGACCTAATTACTTGCCAATGGAAGTCTGCAAGATTGTGGAGGGACAAAGGTACTCAAAGCGCTTGAATGAGAGACAGATTACTGCACTTCTGAAAGTGACCTGCCAGCGTCCCCAAGGGAGGGAGCGTGATATTCTTGAGACCGTACATCATAATGCCTATGCTAATGACCCATATGCCAAGGAGTTTGGTATTAAGATTAGTGACAAGTTGGCACAAGTTGAGGCTCGTATTTTGCCTCCACCTCGGCTTAAATATCATGATAACGGTCGAGAAAAGGACTGCCTGCCACAAGTTGGCCAATGGAATATGATGAATAAGAAAATGGTAAATGGAGGGACGGTGAACAATTGGATCTGCATAAACTTCTCTCGCAATGTGCAAGATAGTGTTGCTCATGGGTTTTGCTCTGAGCTTGCACAAATGTGCCAGATATCTGGCATGAATTTCAATCCAAATCCTGTTCTGCCACCTTCGAGTGCACGCCCTGATCAGGTCGAAAGAGTATTGAAAACTCGATTTCATGATGCTATGACTAAGTTGCAGCTGCATGGGAGAGAGCTTGATTTGCTAGTTGTCATCTTGCCAGACAATAATGGATCTCTTTATGGTGATCTGAAGCGCATTTGTGAGACTGAACTAGGAGTCGTCTCACAGTGCTGTTTGACAAAACATGTATTTAAGATGAGCAAACAGTATCTAGCCAATGTAGCGCTGAAAATCAATGTGAAGGTGGGAGGGAGAAACACTGTGCTTGTTGATGCAATATCGAGGCGAATTCCTCTTGTCAGCGACCGGCCTACCATCATTTTTGGTGCAGATGTCACCCACCCTCACCCTGGGGAGGACTCTAGCCCATCCATTGCCGCGGTGGTTGCTTCTCAAGATTGGCCTGAGATTACAAAGTATGCTGGTCTAGTTTCTGCTCAAGCCCATAGGCAAGAGCTTATTCAGGATCTGTACACGACTAGGCAAGATCCTGTTAAGGGGACAGTTGCTGGTGGAATGATTAAGGACTTACTTATATCCTTCCGAAGAGCTACTGGACAAAAGCCCCAGAGAATAATTTTCTATAGGGATGGTGTTAGTGAAGGACAATTTTATCAAGTGCTTCTGTTCGAACTTGATGCGATCCGCAAAGCATGTGCGTCTTTGGAGCCAAATTATCAGCCCCCAGTCACATTTGTTGTGGTTCAGAAACGACATCACACAAGGCTTTTTGCCAATAACCACCGTGACAGAAATGCAGTTGACAGGAGCGGGAACATTATACCTGGTACTGTTGTAGATTCAAAGATATGCCACCCGACAGAGTTTGATTTCTATCTTTGTAGCCATGCCGGCATACAGGGTACGAGCCGTCCAGCTCACTACCATGTTCTATGGGACGAGAACAAATTCACAGCCGATGCGCTGCAGTCTTTGACCAACAACCTCTGCTATACATATGCAAGGTGCACGCGTTCCGTCTCCATCGTTCCCCCTGCATATTATGCACATTTGGCAGCTTTCCGTGCTCGATTTTATATGGAGCCGGAGACATCTGACGGTGGTTCAGTAACAAGTGGGGCTGCTGGTGGCAGAGGGGGTGGTGCAGGAGCTGCTGGAAGGAACACCCGAGCCCCAAGTGCTGGTGCTGCTGTTAGACCTCTTCCTGCGCTCAAGGATAATGTGAAGAGGGTTATGTTCTACTGC(SEQ IDNO：314)和CACCTATCACTCTCTTTCTCTCTCTACAAACATATCGTGCCGTTTCTCTCTCGGCCTCTCTTCGTGTTTTAGGGCACCGTGGTGGTTGGTATCCAGGCGGCGGTTTTGAGTTATTACCATGGTGCGGAAGAAGAGGACTGATGTTCCTGGTGGTGCTGAGAGTTTTGAGTCCCATGAAACTGGAGGGGCACGAGGTGGTGCCCAACGCCCATCACAGCAGCAGCAACATCAGCATCAGCAAGGCGGAGGAAGAGGCTGGGCACCTCAGCATGGAGGACATGGTGGCCGTGGTGGTGGGGGAGCTCCACGTGGTGGAATGGCCCCTCAACAATCCTATGGTGGACCTCCTGAATACTACCAACAGGGCAGGGGAACTCAACAGTATCAACGAGGTGGAGGACAACCCCAGCGCCGTGGTGGCATGGGGGGCCGTGGGGCACGGCCACCAGTACCCGAGCTGCACCAAGCAACCCAGACTCCACATCAGCCTGTACCATATGGAAGACCATCAGAAACATACTCAGAGGCTGGTTCCTCGTCTCAGCCACCTGAACCAACGACACAGCAAGTGACTCAGCAATTCCAGCAACTTGTTGTGCAGCCAGAAGCAGCTGCAACCCAAGCAATACAACCAGCATCGAGCAAGTCGATGAGGTTTCCACTCCGGCCAGGAAAGGGTAGTACTGGTATTAGATGCATAGTTAAGGCCAATCACTTCTTTGCCGAGTTACCTGACAAAGATCTGCACCAGTATGATGTTTCAATTACTCCTGAGGTCGCCTCTCGGGGTGTCAACCGGGCCGTCATGGAGCAGCTGGTGAAGCTTTATAGAGAATCCCATCTTGGGAAGAGGCTTCCAGCCTATGACGGAAGAAAAAGTCTATACACAGCAGGGCCCCTCCCTTTTGTTCAAAAGGATTTTAAAATCACTCTAATTGATGATGATGATGGACCTGGTGGTGCTAGGAGGGAAAGAGAGTTTAAAGTTGTGATCAAGCTGGCGGCTCGTGCTGATCTTCATCACTTGGGGATGTTCTTACAAGGGAGACAGGCTGATGCACCGCAAGAAGCACTTCAGGTGCTGGATATTGTGCTACGTGAGTTGCCAACATCTAGGTATTGTCCTGTGGGCCGCTCTTTCTATTCCCCTCATTTAGGACGAAGACAACCACTGGGTGAAGGTTTAGAGAGCTGGCGTGGCTTCTATCAAAGTATTCGTCCTACACAGATGGGATTATCCCTGAATATTGATATGTCTTCCACGGCTTTCATTGAGCCACTGCCGATTATTGACTTCGTGAGCCAGCTTCTGAATCGGGATATCTCTTCTAGACCACTGTCTGATGCTGACCGCGTTAAGATAAAGAAGGCACTGAGAGGTGTAAAGGTGGGGGTCACTCATCGTGGAAATATGCGGAGGAAGTATCGCATTTCTGGCTTGACGTCTCAAGCAACAAGAGAGTTGACTTTTCCTGTCGATGAAAGGGGTACGATGAAAGCTGTTGTGGAATATTTTCGGGAAACCTATGGTTTTGTCATTCGGCATACCCAGTGGCCTTGTCTTCAAGTTGGAAATACGCAGAGGCCAAATTACTTGCCAATGGAAGTATGTAAGATTGTAGAGGGACAGAGATACTCAAAGCGCTTGAATGAGAGGCAGATAACAGCACTTCTAAAAGTGACCTGCCAACGTCCTCAAGAGAGAGAACGTGATATTCTTCAGACTGTTCATCACAATGCTTATGCTGATGACCCATATGCGAAGGAGTTTGGTATTAAGATCAGTGAGGAGCTTGCTCAAGTTGAGGCTCGCGTTTTGCCTGCACCTTGGCTTAAATACCATGATACAGGTCGAGAGAAAGACTGTCTGCCACAAGTGGGCCAGTGGAATATGATGAATAAGAAAATGGTTAATGGAGGAACAGTGAACAACTGGATCTGTGTAAACTTTTCTCGCAATGTGCAAGACACAGTTGCACGTGGATTTTGTTCCGAGCTTGCACAAATGTGCATGATATCCGGAATGAACTTCAATCCCAATCCTGTTCTACCACCAGTGAGTGCTCGCCCTGATCAAGTTGAGAGAGTCTTGAAAACTCGATTTCACGATGCTATGACAAAGTTGCAGCCAAATGGGAGAGAGCTAGATCTTTTGATTGTGATATTACCAGACAATAACGGCTCTCTTTATGGTGATCTAAAACGGATTTGTGAAACTGAACTTGGAATTGTCTCACAATGCTGCTTGACAAAACATGTATTTAAGATGAGCAAGCAGTATTTAGCTAATGTATCCCTGAAGATAAATGTGAAGGTTGGAGGAAGAAATACTGTGCTGGTTGATGCGCTCTCTAGACGAATTCCCCTTGTCAGCGACCGCCCAACTATCATTTTTGGTGCAGATGTCACCCATCCCCACCCTGGGGAGGATTCTAGCCCGTCAATTGCTGCGGTGGTTGCTTCTCAAGATTGGCCTGAAATTACAAAGTATGCTGGTTTGGTTTCTGCTCAAGCGCATAGGCAAGAGCTTATACAAGATCTGTACAAGACTTGGCAAGATCCAGTTAGAGGACCTGTGACTGGTGGCATGATAAAGGAATTACTTATTTCCTTCCGTCGAGCAACTGGACAGAAGCCGCAGAGAATTATATTCTACAGAGATGGTGTTAGTGAAGGACAATTTTACCAAGTTCTTCTTTTTGAACTTGATGCAATCCGCAAGGCATGTGCATCTTTAGAACCCAACTATCAGCCCCCGGTTACGTTTGTTGTGGTCCAGAAACGGCATCATACTAGGTTGTTTGCCAATAACCACCACGACAGAAATGCAGTTGATCGGAGTGGGAACATTTTGCCTGGTACCGTTGTAGATTCAAAGATATGCCACCCTACTGAATTTGATTTCTATCTCTGTAGCCATGCCGGCATACAGGGTACTAGCCGCCCAGCTCATTATCATGTTCTGTGGGATGAGAACAATTTTACTGCTGACGCCCTGCAGTCTTTGACTAACAATCTTTGCTATACATATGCTAGGTGTACTCGTTCTGTCTCCATTGTTCCACCAGCATATTATGCACATTTGGCAGCTTTCCGTGCTCGGTTTTACATGGAGCCAGAGACATCTGATAATGGATCAGTCACAAGCGCAGCTGCTTCAAACAGAGGAGGTTTAGGAGCTATGGGAAGGAGCACGCGAGCACCAGGTGCTGGTGCTGCTGTAAGGCCCCTTCCTGCTCTCAAGGAGAATGTTAAGAGGGTTATGTTTTATTGT(SEQ ID NO：315)。
使用类似于实施例12中所述的程序处理本氏烟草植物。多核苷酸溶液(或在AGO1的情况下是混合的多核苷酸)是在含0.01％(v/v)Silwet L-77和2％(w/v)硫酸铵的5mM磷酸钠(pH 6.8)中制备。将每株植物的两片完全展开的叶子浸渍于用ddH2O新近制备的0.1％Silwet L-77溶液中数秒，并且使其干燥。约30分钟后，将20微升多核苷酸溶液施加到两片经过预处理的叶子中的每一片上。对于PDS，5株植物中的每一者均接受25纳摩尔PDS反义多核苷酸(SEQ ID NO：34)；对于AGO1，5株植物中的每一者均接受50纳摩尔的14种AGO1反义多核苷酸中的每一者(SEQ ID NO：300-313)；对于PDS与AGO组合处理，5株植物中的每一者均接受25纳摩尔PDS反义多核苷酸(SEQ ID NO：34)和50纳摩尔的14种AGO1反义多核苷酸中的每一者(SEQ ID NO：300-313)施加到各别叶子上。成对的对照植物用缓冲液(含0.01％(v/v)Silwet L-77和2％(w/v)硫酸铵的5mM磷酸钠，pH 6.8)处理。在用AGO1反义多核苷酸处理的植物与仅用缓冲液处理的植物之间未观察到差异。用PDS反义多核苷酸处理的植物展示系统性漂白。用PDS反义多核苷酸和分别施加的AGO1反义多核苷酸处理的植物未展示系统性漂白，指示抑制AGO1可阻断沉默信号的系统性扩展。
实施例34
本实施例说明一种用于诱导生长中的植物中靶标内源性基因的系统性调控的方法，其包括在所述生长中的植物的叶子上局部涂布具有与所述靶标内源性基因或从所述靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个相邻核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，由此所述多核苷酸渗透所述生长中的植物的内部并且诱导对所述靶标内源性基因的系统性调控。更具体说来，本实施例说明使用一种包含表面活性剂和多核苷酸的组合物来至少短暂地诱导对内源性玉米5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的系统性调控。
内源性玉米5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的基因组序列鉴定为ACCTACTTCCCCCTCGCCCCTCTCATGGTCTCTCTCGCGCCCAGATCTGCTACTAGACGGCACCGCTGCAGCGCGTCGTGTCGCGGGGGTTGGTGGCAGGCAGCGAGAGCTTGCCGTTCCTCTCTCTCAGTTGTCAGGTCCTAGGCTCACCTCACCGGCTCCCAGCCCGCTTCTATTTCTTCCTCCCCGACCCCGTGCAGGTGGCAGTCCAGTCCACGCCACCAACCGCGAGGCGAACCAAACCAACCCACTCTCCCCAACCCCGCGCGCCCAGGCCGCCCGCCCTACCAACCATCGGCGTCGGCAATGGCGGCCATGGCGACCAAGGCCGCCGCGGGCACCGTGTCGCTGGACCTCGCCGCGCCGCCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGTGCAGGCGGGTGCCGAGGAGATCGTGCTGCAGCCCATCAAGGAGATCTCCGGCACCGTCAAGCTGCCGGGGTCCAAGTCGCTTTCCAACCGGATCCTCCTGCTCGCCGCCCTGTCCGAGGTGAGCGATTTTGGTGCTTGCTGCGCTGCCCTGTCTCACTGCTACCTAAATGTTTTGCCTGTCGAATACCATGGATTCTCGGTGTAATCCATCTCACGATCAGATGCACCGCATGTCGCATGCCTAGCTCTCTCTAATTTGTCTAGTAGTTTGTATACGGATTAATATTGATAAATCGGTACCGCAAAAGCTAGGTGTAAATAAACACTAGAAAATTGGATGTTCCCCTATCGGCCTGTACTCGGCTACTCGTTCTTGTGATGGCATGCTGTCTCTTCTTGGTGTTTGGTGAACAACCTTATGAAATTTGGGCGCAAAGAACTCGCCCTCAAGGGTTGATCTTATGCCATCGTCATGATAAACAGTGGAGCACGGACGATCCTTTACGTTGTTTTTAACAAACTTTGTCAGAAAACTAGCATCATTAACTTCTTAATGACGATTTCACAACAAAAAAAGGTAACCTCGCTACTAACATAACAAAATACTTGTTGCTTATTAATTATATGTTTTTTAATCTTTGATCAGGGGACAACAGTGGTTGATAACCTGTTGAACAGTGAGGATGTCCACTACATGCTCGGGGCCTTGAGGACTCTTGGTCTCTCTGTCGAAGCGGACAAAGCTGCCAAAAGAGCTGTAGTTGTTGGCTGTGGTGGAAAGTTCCCAGTTGAGGATTCTAAAGAGGAAGTGCAGCTCTTCTTGGGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTGACAGCAGCTGTTACTGCTGCTGGTGGAAATGCAACGTATGTTTCCTCTCTTTCTCTCTACAATACTTGCTGGAGTTAGTATGAAACCCATGGGTATGTCTAGTGGCTTATGGTGTATTGGTTTTTGAACTTCAGTTACGTGCTTGATGGAGTACCAAGAATGAGGGAGAGACCCATTGGCGACTTGGTTGTCGGATTGAAGCAGCTTGGTGCAGATGTTGATTGTTTCCTTGGCACTGACTGCCCACCTGTTCGTGTCAATGGAATCGGAGGGCTACCTGGTGGCAAGGTTAGCTACTAAGGGCCACATGTTACATTCTTCTGTAAATGGTACAACTATTGTCGAGCTTTTGCATTTGTAAGGAAAGCATTGATTGATCTGAATTTGATGCTACACCACAAAATATCCTACAAATGGTCATCCCTAACTAGCAAACAATGAAGTAATACTTGGCATGTGTTTATCAAATTAATTTCCATCTTCTGGGGCATTGCCTGTTTTCTAGTCTAATAGCATTTGTTTTTAGCATTAATTAGCTCTTACAATTGTTATGTTCTACAGGTCAAGCTGTCTGGCTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCTGATGGCTGCTCCTTTGGCTCTTGGGGATGTGGAGATTGAAATCATTGATAAATTAATCTCCATTCCCTACGTCGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGTGAAAGCAGAGCATTCTGATAGCTGGGACAGATTCTACATTAAGGGAGGTCAAAAATACAAGTAAGCTCTGTAATGTATTTCACTACTTTGATGCCAATGTTTCAGTTTTCAGTTTTCCAAACAGTCGCATCAATATTTGAATAGATGCACTGTAGAAAAAAAATCATTGCAGGGAAAAACTAGTACTGAGTATTTTGACTGTAAATTATTTTACCAGTCGGAATATAGTCAGTCTATTGGAGTCAAGAGCGTGAACCGAAATAGCCAGTTAATTATCCCATTATACAGAGGACAACCATGTATACTATTGAAACTTGGTTTATAAGAGAATCTAGGTAGCTGGACTCGTAGCTGCTTGGCATGGATACCTTCTTATCTTTAGGAAAAGACACTTGATTTTTTTTTTCTGTGGCCCTCTATGATGTGTGAACCTGCTTCTCTATTGCTTTAGAAGGATATATCTATGTCGTTATGCAACATGCTTCCCTTAGCCATTTGTACTGAAATCAGTTTCATAAGTTCGTTAGTGGTTCCCTAAACGAAACCTTGTTTTTCTTTGCAATCAACAGGTCCCCTAAAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGCAAGCTATTTCTTGGCTGGTGCTGCAATTACTGGAGGGACTGTGACTGTGGAAGGTTGTGGCACCACCAGTTTGCAGGTAAAGATTTCTTGGCTGGTGCTACAATAACTGCTTTTGTCTTTTTGGTTTCAGCATTGTTCTCAGAGTCACTAAATAACATTATCATCTGCAAATGTCAAATAGACATACTTAGGTGAATTCATGTAACCGTTTCCTTACAAATTTGCTGAAACCTCAGGGTGATGTGAAGTTTGCTGAGGTACTGGAGATGATGGGAGCGAAGGTTACATGGACCGAGACTAGCGTAACTGTTACTGGCCCACCGCGGGAGCCATTTGGGAGGAAACACCTCAAGGCGATTGATGTCAACATGAACAAGATGCCTGATGTCGCCATGACTCTTGCTGTGGTTGCCCTCTTTGCCGATGGCCCGACAGCCATCAGAGACGGTAAAACATTCTCAGCCCTACAACCATGCCTCTTCTACATCACTACTTGACAAGACTAAAAACTATTGGCTCGTTGGCAGTGGCTTCCTGGAGAGTAAAGGAGACCGAGAGGATGGTTGCGATCCGGACGGAGCTAACCAAGGTAAGGCTACATACTTCACATGTCTCACGTCGTCTTTCCATAGCTCGCTGCCTCTTAGCGGCTTGCCTGCGGTCGCTCCATCCTCGGTTGCTGTCTGTGTTTTCCACAGCTGGGAGCATCTGTTGAGGAAGGGCCGGACTACTGCATCATCACGCCGCCGGAGAAGCTGAACGTGACGGCGATCGACACGTACGACGACCACAGGATGGCCATGGCCTTCTCCCTTGCCGCCTGTGCCGAGGTCCCCGTGACCATCCGGGACCCTGGGTGCACCCGGAAGACCTTCCCCGACTACTTCGATGTGCTGAGCACTTTCGTCAAGAATTAATAAAGCGTGCGATACTACCACGCAGCTTGATTGAAGTGATAGGCTTGTGCTGAGGAAATACATTTCTTTTGTTCTGTTTTTTCTCTTTCACGGGATTAAGTTTTGAGTCTGTAACGTTAGTTGTTTGTAGCAAGTTTCTATTTCGGATCTTAAGTTTGTGCACTGTAAGCCAAATTTCATTTCAAGAGTGGTTCGTTGGAATAATAAGAATAATAAATTACGTTTCAGTGGCTGTCAAGCCTGCTGCTACGTTTTAGGAGATGGCATTAGACATTCATCATCAACAACAATAAAACCTTTTAGCCTCAAACAATAATAGTGAAGTTATTTTTTAGTCCTAAACAAGTTGCATTAGGATATAGTTAAAACACAAAAGAAGCTAAAGTTAGGGTTTAGACATGTGGATATTGTTTTCCAT(SEQ ID NO：316)，其具有位于核苷酸位置1-306的5’非翻译区和位于核苷酸位置3490-3907的3’非翻译区。EPSPS cDNA序列鉴定为ACCTACTTCCCCCTCGCCCCTCTCATGGTCTCTCTCGCGCCCAGATCTGCTACTAGACGGCACCGCTGCAGCGCGTCGTGTCGCGGGGGTTGGTGGCAGGCAGCGAGAGCTTGCCGTTCCTCTCTCTCAGTTGTCAGGTCCTAGGCTCACCTCACCGGCTCCCAGCCCGCTTCTATTTCTTCCTCCCCGACCCCGTGCAGGTGGCAGTCCAGTCCACGCCACCAACCGCGAGGCGAACCAAACCAACCCACTCTCCCCAACCCCGCGCGCCCAGGCCGCCCGCCCTACCAACCATCGGCGTCGGCAATGGCGGCCATGGCGACCAAGGCCGCCGCGGGCACCGTGTCGCTGGACCTCGCCGCGCCGCCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGTGCAGGCGGGTGCCGAGGAGATCGTGCTGCAGCCCATCAAGGAGATCTCCGGCACCGTCAAGCTGCCGGGGTCCAAGTCGCTTTCCAACCGGATCCTCCTGCTCGCCGCCCTGTCCGAGGGGACAACAGTGGTTGATAACCTGTTGAACAGTGAGGATGTCCACTACATGCTCGGGGCCTTGAGGACTCTTGGTCTCTCTGTCGAAGCGGACAAAGCTGCCAAAAGAGCTGTAGTTGTTGGCTGTGGTGGAAAGTTCCCAGTTGAGGATTCTAAAGAGGAAGTGCAGCTCTTCTTGGGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTGACAGCAGCTGTTACTGCTGCTGGTGGAAATGCAACTTACGTGCTTGATGGAGTACCAAGAATGAGGGAGAGACCCATTGGCGACTTGGTTGTCGGATTGAAGCAGCTTGGTGCAGATGTTGATTGTTTCCTTGGCACTGACTGCCCACCTGTTCGTGTCAATGGAATCGGAGGGCTACCTGGTGGCAAGGTCAAGCTGTCTGGCTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCTGATGGCTGCTCCTTTGGCTCTTGGGGATGTGGAGATTGAAATCATTGATAAATTAATCTCCATTCCCTACGTCGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGTGAAAGCAGAGCATTCTGATAGCTGGGACAGATTCTACATTAAGGGAGGTCAAAAATACAAGTCCCCTAAAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGCAAGCTATTTCTTGGCTGGTGCTGCAATTACTGGAGGGACTGTGACTGTGGAAGGTTGTGGCACCACCAGTTTGCAGGGTGATGTGAAGTTTGCTGAGGTACTGGAGATGATGGGAGCGAAGGTTACATGGACCGAGACTAGCGTAACTGTTACTGGCCCACCGCGGGAGCCATTTGGGAGGAAACACCTCAAGGCGATTGATGTCAACATGAACAAGATGCCTGATGTCGCCATGACTCTTGCTGTGGTTGCCCTCTTTGCCGATGGCCCGACAGCCATCAGAGACGTGGCTTCCTGGAGAGTAAAGGAGACCGAGAGGATGGTTGCGATCCGGACGGAGCTAACCAAGCTGGGAGCATCTGTTGAGGAAGGGCCGGACTACTGCATCATCACGCCGCCGGAGAAGCTGAACGTGACGGCGATCGACACGTACGACGACCACAGGATGGCCATGGCCTTCTCCCTTGCCGCCTGTGCCGAGGTCCCCGTGACCATCCGGGACCCTGGGTGCACCCGGAAGACCTTCCCCGACTACTTCGATGTGCTGAGCACTTTCGTCAAGAATTAATAAAGCGTGCGATACTACCACGCAGCTTGATTGAAGTGATAGGCTTGTGCTGAGGAAATACATTTCTTTTGTTCTGTTTTTTCTCTTTCACGGGATTAAGTTTTGAGTCTGTAACGTTAGTTGTTTGTAGCAAGTTTCTATTTCGGATCTTAAGTTTGTGCACTGTAAGCCAAATTTCATTTCAAGAGTGGTTCGTTGGAATAATAAGAATAATAAATTACGTTTCAGTGGCTGTCAAGCCTGCTGCTACGTTTTAGGAGATGGCATTAGACATTCATCATCAACAACAATAAAACCTTTTAGCCTCAAACAATAATAGTGAAGTTATTTTTTAGTCCTAAACAAGTTGCATTAGGATATAGTTAAAACACAAAAGAAGCTAAAGTTAGGGTTTAGACATGTGGATATTGTTTTCCAT(SEQ ID NO：317)。设计具有一条对应于以下DNA序列的链的240bp双链RNA多核苷酸：TACTTGAGTGCCTTGCTGATGGCTGCTCCTTTGGCTCTTGGGGATGTGGAGATTGAAATCATTGATAAATTAATCTCCATTCCGTACGTCGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGTGAAAGCAGAGCATTCTGATAGCTGGGACAGATTCTACATTAAGGGAGGTCAAAAATACAAGTCCCCTAAAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGCAAGCTATTTCTTG(SEQ IDNO：318)，其对应于位于EPSPS cDNA序列的核苷酸位置937-1176的240个核苷酸的区段。
使玉米(Gaspe)种子在发芽纸上发芽。幼苗转移至4英寸罐中并且植物在生长室中生长。三株17日龄植物用多核苷酸局部处理并且三株植物用作对照。对每株植物的两片较低的叶子做标记，接着通过浸渍于0.1％Silwet L-77溶液中进行预处理。表面活性剂预处理后约30分钟，将20微升处理溶液施加到两片经过预处理的叶子中的每一片的上部。处理溶液由100微升2X缓冲溶液、90微升水、10微升的4.6微克/微升的EPSPS dsRNA(一条链对应于SEQ ID NO：318)溶液的混合物组成；2X缓冲溶液是200微升的0.1％SilwetL-77、200微升50mM磷酸钠、146微升的34％磷酸铵和454微升水的混合物。在处理后8天，三株经过多核苷酸处理的植物中的两株矮化，其中顶叶受损或死亡(类似于在类似地用EPSPS多核苷酸处理的本氏烟草植物中观察到的表型)，而所有三株对照植物均具有正常生长和形态(图37)。
实施例35
研究不同物质(包括盐、螯合剂、保湿剂和多胺)作为多核苷酸转移剂或作为已知多核苷酸转移剂的增强剂的效力。先前已显示硫酸铵增强植物对多核苷酸的渗透性(参看例如实施例13)。表26列出硫酸铵和EDTA作为1％Silwet L-77喷洒溶液中的添加剂对局部施加到草甘膦抗性长芒苋植物上的多核苷酸(RNA)的除草剂活性(呈现为杂草控制/杀死的百分率和植物高度)的影响。在这一特定实验中，发现0.004％的乙二胺四乙酸(EDTA)类似地作用于含2％硫酸铵的喷洒溶液，从而增强多核苷酸的效力并且强化草甘膦的除草剂活性。
表26
  处理   长芒苋控制(％)   长芒苋高度(cm)
  无添加   0   7.5
  +2％硫酸铵   43   1.8
  +0.004％EDTA   45   1.0
表27列出包括无机盐(氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化铵)和有机盐(四甲基氯化铵、四乙基氯化铵、四丙基溴化铵和四丁基溴化鏻)在内的各种盐作为1％Silwet L-77喷洒溶液中的添加剂对局部施加到草甘膦抗性长芒苋植物上的多核苷酸(RNA)的除草剂活性(呈现为杂草控制/杀死的百分率和植物高度)的影响。在这一特定实验中，发现氯化铵和四丁基溴化鏻类似地作用于含硫酸铵的喷洒溶液，从而增强多核苷酸的效力并且强化草甘膦的除草剂活性。
表27
  处理   长芒苋控制(％)   长芒苋高度(cm)
  无添加   0   16.0
  +2％氯化钠   15   15.0
  +2％硫酸钠   7   17.0
  +2％硫酸铵   54   9.3
  +2％氯化铵   52   10.3
  +2％四甲基氯化铵   19   15.0
  +2％四乙基氯化铵   27   12.0
  +2％四丙基溴化铵   34   11.0
  +2％四丁基溴化鏻   19   13.3
  +2％四丁基溴化鏻   5555   55.3
表28列出保湿剂甘油对局部施加到草甘膦抗性长芒苋植物上的多核苷酸(RRNNA)的除草剂活性(呈现为杂草控制/杀死的百分率和植物高度)的影响。发现甘油增强多核苷酸的效力，从而强化草甘膦的除草剂活性。
表28
  处理   长芒苋控制(％)   长芒苋高度(cm)
  无添加   0   16.0
  Silwet L-77/AMS(无甘油)   54   9.3
  Silwet L-77/AMS+0.5％甘油   57   6.3
图38描绘不同草甘膦反离子对局部施加到草甘膦抗性长芒苋植物上的多核苷酸(RNA)的除草剂活性(呈现为杂草控制/杀死的百分率和植物高度)的影响。通过Milli喷洒，以215升/英亩对含有16个拷贝的EPSPS的4-6英寸草甘膦抗性长芒苋的3个重复喷洒于含0.5％Silwet L-77、2％硫酸铵的10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中的EPSPS多核苷酸混合物(IDT[1](SEQ IDNO：83-84)、IDT[2](SEQ ID NO：85-86)、IDT[3](SEQ ID NO：87-88)和IDT[4](SEQ ID NO：89-90))与0.2％Roundup
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载剂(牛脂胺(16-18C)和椰油胺(12-14C)的比率为55∶45的MON56151牛脂胺表面活性剂掺合物)和每公顷1682g酸当量的一种以下草甘膦盐；K+草甘膦，异丙铵+草甘膦，或单乙醇铵+草甘膦。在草甘膦处理后21天，对植物高度评分。结果(呈现为杂草控制/杀死的百分率和植物高度)提供于表29中。草甘膦的异丙铵和单乙醇铵盐与钾盐相比提供较好的除草剂活性。
表29
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研究多胺阳离子精胺(N，N’-双(3-氨基丙基)丁烷-1，4-二胺)和亚精胺(N-(3-氨基丙基)丁烷-1，4-二胺)对局部施加到草甘膦抗性长芒苋植物上的多核苷酸(RNA)的除草剂活性的影响。多核苷酸溶液是使用等量的在实施例1中所述的四种寡核苷酸尺寸的“短”dsRNA分子的混合物来制备，所述四种分子具有设计成与从长芒苋EPSPS基因(SEQ ID NO：1)的位置14-38(短dsRNA-1)、位置153-177(短dsRNA-2)、345-369(短dsRNA-3)和1105-1129(短dsRNA-4)转录的mRNA杂交的反义链，如图1中加下划线的核苷酸所指示；dsRNA在反义链的3’末端具有两个核苷酸的悬垂物，并且在有义链的3’末端具有两个脱氧核苷酸作为末端核苷酸。dsRNA多核苷酸溶液是用含1或10mM精胺或亚精胺或2％硫酸铵的10mM磷酸钠(pH 6.8)缓冲液制备。对照溶液(无多核苷酸)是用含1或10mM精胺或亚精胺或2％硫酸铵的10mM磷酸钠(pH 6.8)缓冲液制备。草甘膦抗性长芒苋植物(33、36或57个拷贝EPSPS)预喷洒1％Silwet L-77。通过移液将dsRNA多核苷酸溶液(11.6克/英亩)或缓冲溶液以液滴形式施加到草甘膦抗性长芒苋的4片较低的完全展开的叶子上。多核苷酸处理后2天，对植物喷洒草甘膦(每公顷3360g酸当量的Roundup
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牌除草剂)。在草甘膦处理后14天，对植物拍摄照片；结果显示于图39中。用dsRNA和10mM精胺处理，随后用草甘膦处理，可杀死具有33个拷贝的EPSPS的草甘膦抗性长芒苋，并且严重伤害且矮化具有36个拷贝的EPSPS的草甘膦抗性长芒苋。单独用10mM亚精胺处理可矮化33个拷贝的草甘膦抗性长芒苋。在这一特定实验中，1或10mM的精胺或亚精胺所其的作用均不能与2％硫酸铵媲美。
实施例36
在施加到草甘膦抗性长芒苋上的多核苷酸喷洒溶液中测试不同表面活性剂作为多核苷酸转移剂的效力。Break-Thru表面活性剂是从Evonik Industries获得；Silwet表面活性剂是从Momentive获得。喷洒溶液是在喷洒当天制备。在喷洒之前15至50分钟将EPSPS多核苷酸混合物(IDT[1](SEQ IDNO：83-84)、IDT[3](SEQ ID NO：87-88)和IDT[4](SEQ ID NO：89-90))添加到喷洒溶液中，并且使用定制的低死容量(“milli”)喷洒器将1至2毫升施加到从插枝物生长的四分之一英寸草甘膦抗性(R-22)长芒苋植物上。视实验而定，将介于10微克与225微克之间的总多核苷酸施加到每株植物上；通常每株植物施加23微克的总多核苷酸。将经过处理的植物放入设定为26.7/21.1℃或29.4/21.1℃、14/10小时温度及补充光照时程的温室中。2至3天后，利用常规喷洒器(10加仑/英亩)向植物喷洒草甘膦(“2X Wmax”或每公顷1682g酸当量的Roundup
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牌除草剂)并且使其返回温室。在草甘膦处理后直至21天，以不同时间间隔采集相对于无喷洒处理的控制量(可见伤害)、植物高度以及长芒苋图像。在最后时间点采集地上植物材料的最新高度。基于控制、高度、最新重量和可见植物表型的组合分析，对每种处理给出介于0与3之间的总植物伤害评分，其中“3“是强除草剂活性，“2”是中等活性，“1”是轻微活性且“0”是无活性，这些活性是在针对单独使用草甘膦的处理所引起的任何观察到的伤害进行校正后观察到的；结果显示于表30中。
还研究不同表面活性剂的物理特性并且列于表30中。在测量当天制备70毫升的表面活性剂溶液(含0.5％表面活性剂的水溶液，含有2％硫酸铵、缓冲液(20mM磷酸钾，pH 6.8)，添加或不添加EPSPS多核苷酸(IDT[2](SEQ ID NO：85-86)，0.09毫克/毫升)。在周围室温(22至23℃)下，在Kruss BP100张力计上，使用最大气泡压力方法测量动态表面张力，从而绘制表面张力对表面年龄的曲线。将仪器设定为自动检测表面并且将毛细管浸入10mm的深度。记录针对三种表面年龄(约20、500和1250ms)的表面张力测量值。以1250ms时间间隔记录表面张力(以达因/厘米为单位)作为静表面张力的近似值，并且将介于20ms与500ms之间的变化报告为动态表面张力的估计值。从表面活性剂参考文献和产品信息获得表面活性剂的亲水-亲油平衡(HLP)值。
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Claims (16)

1.一种用于调控生长中的植物或植物器官中靶标内源性基因的表达的方法，其包括在所述生长中的植物或植物器官上局部涂布多核苷酸组合物，所述多核苷酸组合物包含至少一种多核苷酸和有效量的转移剂，所述多核苷酸具有与所述靶标内源性基因中或从所述靶标内源性基因转录的信使RNA中18个或更多个连续核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列；所述有效量的转移剂允许所述至少一种多核苷酸渗透所述生长中的植物或植物器官的内部，由此所述至少一种多核苷酸调控所述靶标内源性基因的表达。
2.一种用于强化除草剂在生长中的植物中的活性的方法，其包括：
(a)在所述生长中的植物的表面局部涂布多核苷酸组合物，所述多核苷酸组合物包含：
(i)至少一种多核苷酸，所述多核苷酸具有与所述生长中的植物的内源性基因中18个或更多个连续核苷酸的序列基本上相同或基本上互补的序列，其中所述内源性基因表达与除草剂相互作用的蛋白质，以及
(ii)有效量的转移剂，其允许所述多核苷酸渗透所述生长中的植物的内部，以及
(b)在所述生长中的植物上施加所述除草剂；
通过所述至少一种多核苷酸渗透所述生长中的植物的内部并且诱导对所述内源性基因的抑制，从而强化所述除草剂在所述生长中的植物中的活性。
3.一种适于局部涂布于生长中的植物的外部表面上的液体除草剂组合物，其包含表面活性剂和至少一种植物致死剂，改进之处在于其中所述植物致死剂包含具有与植物基因序列或所述植物基因的转录RNA的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸，所述多核苷酸实现与针对所述植物基因的探针杂交的小RNA的系统性产生。
4.一种液体除草剂组合物，其包含非多核苷酸除草剂，改进之处在于其中所述组合物更包含具有与植物基因序列或所述植物基因的转录RNA的序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸。
5.一种组合物，其主要由以下组成：
(a)不可转录双链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物的内源性基因序列或由所述内源性基因转录的RNA序列基本上相同或基本上互补的序列；其中所述双链DNA多核苷酸能够在所述植物的细胞中的生理条件下与所述内源性基因或由所述内源性基因转录的所述RNA杂交，以实现所述内源性基因的沉默；以及
(b)有效促进所述双链DNA多核苷酸从所述植物的表面转移至所述植物的细胞中的转移剂。
6.一种组合物，其主要由以下组成：
(a)不可转录单链DNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物的内源性基因序列或由所述内源性基因转录的RNA序列基本上相同或基本上互补的序列；其中所述单链DNA多核苷酸能够在所述植物的细胞中的生理条件下与所述内源性基因或由所述内源性基因转录的所述RNA杂交，以实现所述内源性基因的沉默；以及
(b)有效促进所述单链DNA多核苷酸从所述植物的表面转移至所述植物的细胞中的转移剂。
7.一种组合物，其主要由以下组成：
(a)不可转录双链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物的内源性基因序列或从所述内源性基因转录的RNA序列基本上相同或基本上互补的序列；其中所述双链RNA多核苷酸能够在所述植物的细胞中的生理条件下与所述内源性基因或由所述内源性基因转录的所述RNA杂交，以实现所述内源性基因的沉默；以及
(b)有效促进所述双链RNA多核苷酸从所述植物的表面转移至所述植物的细胞中的转移剂。
8.一种组合物，其主要由以下组成：
(a)不可转录单链RNA多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物的内源性基因序列或由所述内源性基因转录的RNA序列基本上相同或基本上互补的序列；其中所述单链RNA多核苷酸能够在所述植物的细胞中的生理条件下与所述内源性基因或由所述内源性基因转录的所述RNA杂交，以实现所述内源性基因的沉默；以及
(b)有效促进所述单链RNA多核苷酸从所述植物的表面转移至所述植物的细胞中的转移剂。
9.一种组合物，其主要由以下组成：
(a)不可转录双链DNA/RNA杂交多核苷酸的溶液，所述多核苷酸具有与植物的内源性基因序列或从所述内源性基因转录的RNA序列基本上相同或基本上互补的序列；其中所述双链DNA/RNA杂交多核苷酸能够在所述植物的细胞中的生理条件下与所述内源性基因或由所述内源性基因转录的所述RNA杂交，以实现所述内源性基因的沉默；以及
(b)有效促进所述双链DNA/RNA杂交多核苷酸从所述植物的表面转移至所述植物的细胞中的转移剂。
10.一种用于选择性控制在除草剂抗性作物的田间生长的靶标除草剂抗性自生植物的方法，其包括在所述自生植物的叶子上施加组合物，所述组合物包含多核苷酸寡聚物，所述多核苷酸寡聚物在所述自生植物的细胞中提供能够在所述自生植物的细胞中的生理条件下与由内源性基因转录的信使RNA杂交的系统性单链RNA，所述内源性基因(i)是用于维持所述自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码为所述自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂。
11.一种用于在植物中通过调节内源性基因来研究反向遗传学的方法，所述方法包括在活植物的组织上局部施加根据权利要求1所述的组合物。
12.一种除草剂组合物，其包含(a)用于调节植物的多核苷酸寡聚物渗透的药剂和(b)多核苷酸寡聚物的水溶液，所述多核苷酸寡聚物包含至少一条多核苷酸链，所述多核苷酸链包含所述植物的内源性基因在反义或有义方向上的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，其中所述内源性基因编码向所述植物提供针对化学除草剂的抗性的蛋白质或者是必需基因。
13.一种植物，其包含用于抑制内源性基因的外源DNA或RNA，其中所述外源DNA未整合到所述植物的染色体中并且所述外源RNA不是由整合到所述植物的染色体中的DNA转录的，并且其中通过在所述植物从种子长出后在所述植物上局部施加多核苷酸来抑制所述外源基因。
14.一种通过向植物细胞的外部局部施加多核苷酸来将所述多核苷酸递送至所述植物细胞的内部的方法，所述方法包括将所述多核苷酸与有机硅酮表面活性剂组合。
15.如权利要求1、2、10、11或14中任一项所述的方法，
其中所述靶标内源性基因的所述表达在除局部涂布的那些植物细胞以外的植物细胞中受到调控；
其中所述靶标内源性基因在至少一个植物器官中受到系统性调控；
其中所述内源性基因编码选自由以下组成的组的蛋白质：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶(GS)、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DOXP)合酶、二氢蝶酸(DHP)合酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光合系统II的D1蛋白、单加氧酶、细胞色素P450、纤维素合酶、β-微管蛋白、RUBISCO、翻译起始因子、八氢番茄红素去饱和酶和双链DNA腺苷三聚磷酸酶(ddATP)；
其中多核苷酸靶向内源性基因的不同区段或不同内源性基因；
其中所述多核苷酸从植物表面向细胞中的渗透使用包含有机硅酮的转移剂；
其中所述多核苷酸从植物表面向细胞中的渗透使用包含铵盐的转移剂；
其中所述植物在旷野中生长；
其中所述植物在温室中生长；
其中所述植物也用非多核苷酸除草剂喷洒；
或其中一种或多种的组合。
16.如权利要求3、4、5、6、7、8、9或12中任一项所述的组合物，
其中所述转移剂选自由表面活性剂和盐组成的组；
其中所述表面活性剂是有机硅酮表面活性剂；
其中所述有机硅酮表面活性剂是硅酮聚醚共聚物；
其中所述硅酮聚醚共聚物是聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷与烯丙氧基聚丙二醇甲醚(可作为Silwet
Figure FPA00001609644600051
L-77表面活性剂获得)的共聚物；
更包含非多核苷酸除草剂分子；
其中所述植物基因编码提供除草剂耐受性的蛋白质，并且是5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶(GS)、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DOXP)合酶、二氢蝶酸(DHP)合酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光合系统II的D1蛋白、单加氧酶、细胞色素P450、纤维素合酶、β-微管蛋白、RUBISCO、翻译起始因子、八氢番茄红素去饱和酶和双链DNA腺苷三聚磷酸酶(ddATP)；
或其组合。
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