CN101802215A - 植物微rna及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新的微RNA和它们的前体，还公开了包含这些新的miRNA、miRNA前体、miRNA启动子和对应于miRNA的miRNA识别位点的重组DNA构建体。本发明包括表现出营养-应答表达的新的miRNA和miRNA前体。本发明也公开了miRNA诱骗序列。本发明还提供了在其基因组中含有本发明重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞、植物和种子，以及利用本发明重组DNA构建体来调控基因表达的方法。

Description

植物微RNA及其使用方法
相关申请的交叉引用和序列表的结合
本申请要求于2006年10月12日申请的美国临时专利申请60/851,187、2007年3月29日申请的美国临时专利申请60/908,826和2007年8月31日申请的美国临时专利申请60/969,195的优先权权益，所述专利申请通过引用全部结合到本文中。在2007年10月11日创建的文件名为“38-21_54769_D.txt”的文件中所含有的且为2209千字节(用操作系统MS-Windows统计)的序列表，在名称为“Copy 1”、“Copy 2”和“CRF”的3个光盘(CD-R)上以计算机可读形式提交，其在本文中提交并通过引用结合到本文中。下列文件名中含有的序列表通过引用全部结合到本文中：文件名“38-21(54769)A.txt”(用操作系统MS-Windows统计为734千字节，创建于2006年10月11日，在名称为“Copy 1”、“Copy 2”和CRF的3个光盘上以计算机可读形式与美国临时专利申请60/851,187一起于2006年10月12日提交)、文件名“38-21_54769_B.txt”(用操作系统MS-Windows统计为1517千字节，创建于2007年3月29日，并以电子文件形式与美国临时专利申请60/908,826一起于2007年3月29日提交)和文件名“38-21_54769_C.txt”(用操作系统MS-Windows统计为2369千字节，创建于2007年8月30日，并以电子文件形式与美国临时专利申请60/969,195一起于2007年8月31日提交)。
发明领域
本发明公开了新的微RNA(microRNA)和微RNA前体，还公开了包含这些新的miRNA、miRNA前体和对应于miRNA的miRNA识别位点的重组DNA构建体。本发明包括表现出非生物-胁迫-应答表达的新的miRNA和miRNA前体。本发明还提供miRNA诱骗序列(decoy sequence)，在其基因组中含有本发明重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞、植物和种子，以及利用本发明重组DNA构建体来调控基因表达的方法。
发明背景
已经描述了参与RNA介导的基因抑制的若干细胞途径，其各自在特征性途径和特异性组成上不同。有关综述参见例如Brodersen和Voinnet(2006)，Trends Genetics，22：268-280、以及Tomari和Zamore(2005)Genes & Dev.，19：517-529。siRNA途径包括将双链RNA(“RNA双链体”)非定相切割(non-phased cleavage)为小干扰RNA(siRNA)。微RNA途径包括微RNA(miRNA)，是通常介于约19至约25个核苷酸(在植物中通常为约20-24个核苷酸)的非蛋白质编码RNA，其指导靶转录物的反式切割，负调节参与各种调节和发育途径的基因表达。植物miRNA以一组特征来定义，包括由DCL1加工成约21个核苷酸的单个特异性miRNA的茎环前体，表达来自具有2个核苷酸的3’突出端(overhang)的RNA双链体的一对miRNA和miRNA*，并能反式沉默特定靶标。参见Bartel(2004)Cell，116：281-297；Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，6：376-385；Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.Plant Biol.，57：19-53；Ambros等(2003)RNA，9：277-279。在反式作用siRNA(ta-siRNA)途径中，miRNA的作用是在需要RNA依赖性RNA聚合酶来产生RNA双链体的过程中指导siRNA初级转录物的同步加工；反式作用siRNA定义为缺乏二级结构，缺乏启动双链RNA产生的miRNA靶位点，需要DCL4和RNA依赖性RNA聚合酶(RDR6)并产生多个完美定相的(perfectlyphased)～21个核苷酸小RNA(small RNA)，其具有含2个核苷酸的3’突出端的完美匹配的双链体(参见Allen等(2005)Cell，121：207-221)。
微RNA(miRNA)是非蛋白质编码RNA，通常介于约19至约25个核苷酸(在植物中通常为约20-24个核苷酸)，其指导靶转录物的反式切割，负调节参与各种调节和发育途径的基因表达(Bartel(2004)Cell，116：281-297)。在某些情况下，miRNA的作用是指导siRNA初级转录物的同步加工(参见Allen等(2005)Cell，121：207-221)。
已经鉴定出一些微RNA基因(MIR基因)并且在数据库中是公众可得的(“miRBase”，在microrna.sanger.ac.uk/sequences在线可得)。本申请人已在2005年12月15日申请的美国专利申请11/303,745中公开了新的MIR基因、成熟miRNA和miRNA识别位点，通过引用结合到本文中。其它MIR基因和成熟miRNA也描述于美国专利申请公布说明书2005/0120415和2005/144669A1，通过引用结合到本文中。已经报告MIR基因存在于基因间区域，在基因组中或单独或成簇存在，但也可完整或部分地位于其它基因(蛋白质编码基因或非蛋白质编码基因)的内含子中。有关miRNA生物起源的最新综述，可参见Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，6：376-385。至少在某些情况下，MIR基因转录可处于MIR基因自身启动子的启动控制之下。MIR基因转录可能通常由RNA聚合酶II介导(参见例如Aukerman和Sakai(2003)Plant Cell，15：2730-2741；Parizotto等(2004)GenesDev.，18：2237-2242)，因此可适合已用于其它聚合酶II转录基因的基因沉默方法。初级转录物(其可以是多顺反子)称为“pri-miRNA”，即miRNA前体分子，其可以相当大(数千碱基)并含有一个或多个局部双链或“发夹”区以及通常具有mRNA的5’“帽子”和聚腺苷酸化尾。参见例如Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，6：376-385中的图1。
在植物细胞中，认为微RNA前体分子在细胞核中大量加工。pri-miRNA加工为更短的miRNA前体分子，其也包含茎环或折回结构，称为“pre-miRNA”。在植物中，miRNA和siRNA由不同切酶(DICER)样(DCL)酶来形成，而在拟南芥属(Arabidopsis)中，认为核DCL酶(DCL1)是成熟miRNA形成所需的；参见例如Ambros等(2003)RNA，9：277-279，和Xie等(2004)PLoS Biol.，2：642-652。有关微RNA生物起源和功能的其它综述可参见例如Bartel(2004)Cell，116：281-297；Murchison和Hannon(2004)Curr.Opin.Cell Biol.，16：223-229；Dugas和Bartel(2004)Curr.Opin.Plant Biol.，7：512-520。因此，可根据RNA(例如成熟miRNA或miRNA前体RNA分子的RNA序列)，或者根据DNA(例如对应于成熟miRNA RNA序列的DNA序列或者编码MIR基因或MIR基因片段或miRNA前体的DNA序列)，对微RNA进行描述。
估计MIR基因家族在至少某些基因组中占1％并能影响或调节全部基因中大约三分之一的表达(参见例如Tomari等(2005)Curr.Biol.，15：R61-64；G.Tang(2005)Trends Biochem.Sci.，30：106-14；Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，6：376-385)。因为在包括动植物在内的真核生物中，miRNA是重要的调节元件，所以miRNA的转基因抑制可导致例如对重要生物学过程的了解或者允许操纵某些途径(例如调节细胞分化、增殖和细胞凋亡)，可用于例如生物技术应用。参见例如O′Donnell等(2005)Nature，435：839-843；Cai等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102：5570-5575；Morris和McManus(2005)Sci.STKE，pe41(stke.sciencemag.org/cgi/reprint/sigtrans；2005/297/pe41.pdf)。微RNA(MIR)基因具有许多标志性特征，包括在植物物种中的保守性、稳定的折回结构和由切酶(Dicer)样酶对特定miRNA/miRNA*双链体进行加工(Ambros等(2003)RNA，9：277-279)。这些特征已用于在植物中鉴定miRNA及其相应基因(Xie等(2005)Plant Physiol.，138：2145-2154；Jones-Rhoades和Bartel(2004)Mol.Cell，14：787-799；Reinhart等(2002)Genes Dev.，16：1616-1626；Sunkar和Zhu(2004)Plant Cell，16：2001-2019)。公众可得的微RNA基因的目录列在miRBase上(Griffiths-Jones等(2003)Nucleic Acids Res.，31：439-441)。
MiRNA在拟南芥的非常特殊的细胞类型中表达(参见例如Kidner和Martienssen(2004)Nature，428：81-84，Millar和Gubler(2005)Plant Cell，17：705-721)。抑制可限制在细胞类型的侧面、边缘或其它分界线，认为它是合适细胞类型图式形成和特化所必需的(参见例如Palatnik等(2003)Nature，425：257-263)。已经发现，含内源miR171识别位点的GFP报道基因的抑制限制转基因拟南芥特定细胞的表达(Parizotto等(2004)Genes Dev.，18：2237-2242)。已经证实miRNA的识别位点在mRNA的所有区域，包括5’非翻译区、编码区和3’非翻译区，表明miRNA靶位点相对于编码序列的位置可能并非一定会影响抑制(参见例如Jones-Rhoades和Bartel(2004)，Mol.Cell，14：787-799，Rhoades等(2002)Cell，110：513-520，Allen等(2004)Nat.Genet.，36：1282-1290，Sunkar和Zhu(2004)Plant Cell，16：2001-2019)。
本文所公开的成熟miRNA是从通常隶属于在远缘植物物种中保守的规范家族(canonical family)的MIR基因加工而来。这些MIR基因及其所编码的成熟miRNA也可用于例如改变发育途径，例如通过影响细胞分化或形态发生(参见例如Palatnik等(2003)Nature，425：257-263；Mallory等(2004)Curr.Biol.，14：1035-1046)，作为用于工程(非天然)miRNA的序列来源，这类工程miRNA经设计成为沉默序列而不是天然miRNA序列所靶向的转录物(参见例如Parizotto等(2004)Genes Dev.，18：2237-2242；另见美国专利申请公布说明书2004/3411A1和2005/0120415，通过引用结合到本文中)并能使dsRNA稳定化。MIR基因本身(或其天然5’非翻译区或3’非翻译区、或其天然启动子或参与其转录的其它元件)可作为靶基因用于基因抑制(例如通过本发明方法)，其中MIR基因所编码的miRNA的抑制是所需的。MIR基因的启动子可具有非常特殊的表达图式(expression pattern)(例如细胞特异性、组织特异性或时间特异性)，因此可用于重组构建体，来诱导与之操作性连接的DNA序列的这类特异性转录。
本发明提供从植物(包括作物，例如玉米、水稻和大豆)中鉴定出的新的微RNA和微RNA前体、以及重组DNA构建体，所述构建体包含这些新的miRNA、miRNA前体、miRNA识别位点、miRNA诱骗序列和对应于miRNA的miRNA启动子。也公开并要求保护在其基因组中含有本发明重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞、植物和种子。还提供了用本发明重组DNA构建体进行基因抑制的方法、以及提供具有所需表型的转基因植物、尤其是在干旱、营养缺乏、冷或热胁迫等非生物胁迫条件下具有高产量(相对于非转基因植物而言)的转基因植物的方法。
发明概述
一方面，本发明提供重组DNA构建体，其包含用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA元件选自：(a)可转录为具有选自以下植物miRNA前体序列折回结构的miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，其中miRNA前体包含玉米、水稻或大豆的miRNA前体序列的至少90％核苷酸的连续区段；(b)可转录为从选自以下植物miRNA前体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ IDNO.8816-8819，其中工程miRNA前体包含修饰的成熟miRNA；(c)位于转基因转录单元内或其附近并可转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点可被选自以下的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1-1035、SEQ ID NO.2730-3921、SEQ ID NO.5498-6683、SEQ ID NO.8409-8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812-8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或者可被从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819；和(d)用于抑制从选自以下植物miRNA前体序列获得的内源miRNA表达的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ IDNO.8816-8819。
本发明的另一方面提供包含任何本发明重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞。还提供含有本发明非天然转基因植物细胞的非天然转基因植物，包括任何发育时期的植物，并包括由本文所公开的非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物或再生植物的后代植物(其可以是近交或杂交后代植物)、或这类非天然转基因植物的种子。也提供并要求保护在其基因组中具有本发明所提供的任何重组DNA构建体的转基因种子。
再一方面，本发明提供影响基因抑制的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供非天然转基因植物，其包括由本发明的非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物或再生植物的后代植物；和(b)在非天然转基因植物中转录重组DNA构建体；其中转录产生的RNA能够在非天然转基因植物中抑制至少一个靶基因，因此相对于在没有所述重组DNA构建体转录时的表达而言，至少一个靶基因被抑制。
又一方面，本发明提供同时影响至少一个靶基因的基因抑制和至少一个目标基因的基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供非天然转基因植物，其包括由本发明非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物或再生植物的后代植物，其中重组DNA构建体还包含用于表达至少一个目标基因的基因表达元件；和(b)在非天然转基因植物中转录重组DNA构建体，其中，当重组DNA构建体在非天然转基因植物中转录时，产生能够抑制至少一个靶基因的转录RNA和编码至少一个目标基因的转录RNA，因此相对于在没有所述重组DNA构建体转录时的表达而言，至少一个靶基因被抑制，而且至少一个目标基因同时表达。
再一方面，本发明提供重组DNA构建体，其包含对给定成熟miRNA无应答的合成miRNA-无应答的转基因序列，其中合成miRNA-无应答的转基因序列是：(a)由天然miRNA-应答序列获得，即通过缺失或修饰天然miRNA-应答序列内被特定成熟miRNA识别的所有天然miRNA识别位点，和(b)不被给定成熟miRNA识别。
另一方面，本发明提供重组DNA构建体，其包含表现出对非生物胁迫应答的表达图式的miRNA启动子，例如，表现出特征为在营养胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA启动子，表现出特征为在水胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA启动子，或者表现出特征为在温度胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA启动子。
又一方面，本发明提供重组DNA构建体，其可转录为包含至少一个miRNA诱骗序列的RNA转录物，所述诱骗序列被内源成熟miRNA识别并结合，但不切割；包括在其基因组中具有该构建体的转基因植物细胞、植物和种子，以及使用该构建体的方法。本发明相关方面包括重组DNA构建体和用于抑制内源miRNA诱骗序列的方法。也公开了识别并结合其它小RNA(ta-siRNA、nat-siRNA和定相小RNA)但不被切割、因而降低小RNA活性的类似诱骗序列。
本发明的其它具体实施方案在以下发明详述中公开。
附图简述[0010]图1描绘了选自以下植物miRNA前体序列的折回结构的非限制性实例：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，更准确地讲，具有SEQ ID NO.1136的miRNA前体序列折回结构，其包含2个短茎环、1个环和2个凸起(bulge)。miRNA前体通过in planta方式加工为成熟miRNA(在该特定实例中，加工成具有SEQ ID NO.32的成熟miRNA)。[0011]图2和图3描绘了用于抑制靶基因(例如内源miRNA)表达的DNA元件的非限制性实例，如实施例3所述。[0012]图4描绘了从不同玉米组织分离的成熟miRNA的RNA印迹结果，如实施例4所述。[0013]图5描绘了探针组(probeset)序列的转录概况，包括具有对玉米雄性生殖组织(花粉)具有特异性的表达图式的miRNA前体序列，如实施例4所述。[0014]图6描绘了用于大豆植物干旱期的从1.0(无影响或对照)至4.0的相对评分系统，如实施例5所述。[0015]如实施例6所述，图7A描绘了玉米miRMON18前体(SEQ ID NO.3936)的折回结构，图7B描绘了水稻miRMON18前体(SEQ ID NO.1763)的折回结构，图7C描绘了拟南芥(Arabidopsisthaliana)miR827前体(SEQ ID NO.8743)的折回结构。图7D描绘了miR827(SEQ ID NO.8744)和miRMON18(SEQ ID NO.393、SEQ IDNO.3227或SEQ ID NO.8742)的比较，带编号的箭头标明成熟miRNA的位置1、10和21；位置10的核苷酸还具有下划线。[0016]图8描绘了通过成熟miRMON18 21聚体的RNA印迹测定的miRMON18的表达图式(图8A)和miRMON18前体的转录概况分析(transcription profiling)(图8B)，如实施例6所述。[0017]图9描绘了在来自缺水(干旱)(图9A)、低温(图9B)和缺氮条件(图9C)下生长的植物的玉米组织中玉米miRMON18前体(SEQID NO.3936)的表达分析，如实施例6所述。[0018]图10描绘了玉米(Zea mays var.LH244)小RNA的RNA印迹结果，表明miRMON18在玉米胚乳和籽粒中表达提高，在叶片中由缺氮诱导的强miRMON18抑制(图10A)，以及在磷充足条件下叶片组织中的强miRMON18表达和在缺磷条件下miRMON18抑制(图10B)，如实施例6所述。
图11描绘了含有玉米SPX结构域(如果存在的话，用下划线标明序列)和玉米MFS结构域(用粗体字标明序列)的新的玉米miRMON18靶基因的多序列比对，如实施例7所述。
图12描绘了构建用于已鉴定SPX基因的系统树，如实施例7所述；已经实验证实含有预测miRMON18识别位点(在来自并非拟南芥的物种的基因中)或预测miR827识别位点(在来自拟南芥的基因中)的基因用粗体字标明。
图13描绘了miRMON18基因组序列(SEQ ID NO.8800)，如实施例8所述。它显示了以大写字母表示的在核苷酸2173-2788的miRMON18转录物、以小写字母表示的在核苷酸211-2172的miRMON18启动子元件、以小写字母表示的在核苷酸2173-2308的前导元件、以下划线加上小写字母表示的在核苷酸2144-2147的规范TATA盒(末端是转录起始位点上游的25个核苷酸)、以下划线加上大写字母表示的在核苷酸2419-2439的成熟miRMON18和以下划线加上大写字母表示的在核苷酸2322-2341的miRMON18*。
图14描绘了水稻序列Os02g45520(SEQ ID NO.8784)和Os04g48390(SEQ ID NO.8786)以及玉米序列MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)的miRMON18的预测切割，如实施例9所述。
图15描绘了miRMON18前体(图15A)和miRMON18靶标(图15B)之间的负相关，如实施例9所述。图15B显示玉米序列MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)，表明在缺氮条件下比在氮充足条件下表达水平更高，即表达图式与miRMON18前体的表达图式相反，如图15A所示。
图16描绘了载体pMON107261，其包含驱动玉米miRMON18转录物(例如SEQ ID NO.8800核苷酸2173-2788)表达的CaMV 35S启动子，如实施例10所述。
图17A描绘了玉米miR399前体的折回结构；图17B描绘了转录概况分析实验结果，表明Zm-miR399pri-miRNA在缺氮条件(黑柱)下受抑制，而在氮充足条件(白柱)下表达，如实施例11所述。
图18描绘了miR399诱骗序列的玉米cDNA序列与共有序列SEQ ID NO.8834的比对，揭示出至少两组基因含有miR399诱骗序列，如实施例11所述。
图19描绘了比较玉米miR399诱骗序列和miR399前体表达的实验结果，如实施例11所述。图19A显示组1miR399诱骗基因MRT4577_47862C.7(SEQ ID NO.8827)的转录概况，图19B显示组2miR399诱骗基因MRT4577_36567C.8(SEQ ID NO.8829)的转录概况，表明这些miR399诱骗序列受到缺氮的下调。这些结果通过测定成熟miR399表达(图19C)和miR399诱骗序列MRT4577_47862C.7(SEQ ID NO.8827)表达(图19D)的RNA印迹得以证实。
图20描绘了比较不同温度条件下玉米内源miR399诱骗cDNA序列和相应玉米miR399前体的表达的转录概况分析实验，如实施例11所述。在氮充足条件期间，在玉米叶片中，尤其是在白天时，组2miR399诱骗基因MRT4577_36567C.8(SEQ ID NO.8829)表现出至少10倍以上的较高表达(图20A)。在根(图20B)和芽(图20C)中，在延长低温处理后，这同一基因表现出至少2倍下调。
图21描绘了在玉米和大豆的不同组织中内源miR399诱骗cDNA序列的表达，如实施例11所述。图21A描绘了以下序列的表达水平：组1玉米miR399诱骗序列SEQ ID NO.8827(MRT4577_47862C，代表为探针A1ZM005814_at和A1ZM005813_s_at)，和组2玉米miR399诱骗序列SEQ ID NO.8829(MRT4577_36567C，代表为探针A1ZM048024_at)、以及玉米pri-miR399序列SEQ ID NO.8818(MRT4577_22487C.6代表为探针A1ZM033468_at)。图21B描绘了以下序列的表达水平：大豆miR399诱骗序列SEQ ID NO.8842(MRT3847_217257C.2，代表为探针A1GM031412_at)、SEQ ID NO.8844(MRT3847_236871C.2，代表为探针A1GM053788_at)、SEQ ID NO.8836(MRT3847_238967C.1，代表为探针A1GM035741_at)和SEQ ID NO.8838(MRT3847_241832C.1，代表为探针A1GM069937_at)。
图22A描绘了大豆内源miR319诱骗SEQ ID NO.8847(MRT3847_41831C.6，代表为探针A1GM001017_at)在不同大豆组织中的转录概况分析数据；图22B描绘了玉米内源miR319诱骗SEQ IDNO.8849(MRT4577_577703C.1，代表为探针A1ZM012886_s_at)在不同玉米组织中的转录概况分析数据，如实施例11所述。
发明详述
除非另有说明，否则所用的所有科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员公知的含义。通常，所用的命名法和下述制造或实验室步骤都是本领域众所周知的和常用的。常规方法用于这些步骤，例如本领域和各种通用参考文献所提供的那些。除非另有说明，否则就本说明书而言的核酸序列是给定的，当从左到右阅读时，按5’→3’的方向。按照说明，核酸序列可以DNA或RNA形式提供；一个公开必定限定另一个，这是本领域普通技术人员已知的。当给出的术语为单数时，本发明人也以该术语的复数形式来考虑本发明所述方面。所用的命名法和下述实验室步骤是本领域众所周知的和常用的。当通过引用结合到本文中的参考文献中所用的术语和定义有出入时，本申请所用的术语应当具有所给出的定义。所用的其它技术术语具有所属领域公知的含义，如各种技术词典所示例。本发明人并不受限于作用机制或作用方式。其中所提供的参考文献仅用于说明性目的。重组DNA构建体
本发明提供重组DNA构建体，其包含用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA元件选自：(a)可转录为具有选自以下植物miRNA前体序列折回结构的miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ IDNO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，其中miRNA前体包含玉米、水稻或大豆的miRNA前体序列的至少90％核苷酸的连续区段；(b)可转录为从选自以下植物miRNA前体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，其中工程miRNA前体包含修饰的成熟miRNA；(c)位于转基因转录单元内或其附近并可转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点可被选自以下的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1-1035、SEQ ID NO.2730-3921、SEQ ID NO.5498-6683、SEQ ID NO.8409-8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812-8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或者可被从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819；和(d)用于抑制从选自以下植物miRNA前体序列获得的内源miRNA表达的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ IDNO.8816-8819。在标题“靶基因”下描述了其表达可使用本发明重组DNA构建体来调节的靶基因。至少一个可转录DNA元件的实施方案和用途描述如下。(A)天然miRNA在非天然条件下的表达。
在重组DNA构建体的一个实施方案中，用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件包含可转录为具有选自以下植物miRNA前体序列折回结构的miRNA前体的DNA元件：SEQID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，其中miRNA前体包含玉米、水稻或大豆的miRNA前体序列的至少90％核苷酸的连续区段。在优选的实施方案中，至少一个靶基因是植物内源基因，重组DNA构建体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。至于“miRNA前体”是指比自miRNA前体加工而来的成熟miRNA大的转录RNA，其通常预测可形成含有非完美互补双链RNA区的折回结构。参见Bartel(2004)Cell，116：281-297；Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，6：376-385；Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.Plant Biol.，57：19-53；Ambros等(2003)RNA，9：277-279。微RNA前体的实例包括但不限于初级miRNA转录物(pri-miRNA)以及天然来自pri-miRNA的pre-miRNA；miRNA前体也包含非天然RNA序列，预测其可形成含有非完美互补双链RNA区的折回结构并一般通过一个或多个切割步骤在体内加工为成熟miRNA。至于“miRNA前体序列”是指这样的RNA序列：其至少包含miRNA前体核苷酸，但也可包含额外核苷酸(致使miRNA前体包含玉米、水稻或大豆的miRNA前体序列至少90％核苷酸的连续区段)。各miRNA前体自身形成折回结构，其与由至少部分相应miRNA前体序列所形成的折回结构相同或几乎相同。
在这些实施方案中，miRNA前体不必包含选自以下植物miRNA前体序列中所含有的所有核苷酸：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，但优选包含选自以下植物miRNA前体序列的至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％、或至少99％核苷酸的连续区段：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819。
在优选的实施方案中，至少一个靶基因是植物内源基因，因此重组DNA构建体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。重组DNA构建体在转基因植物细胞中的转录可调节含有与miRNA前体所编码的成熟miRNA基本互补并被其识别的序列(“miRNA识别位点”)的任何基因(内源基因或转基因)的表达。通常，重组DNA构建体的转录导致对含有被miRNA前体所编码的成熟miRNA识别的miRNA识别位点的内源基因的抑制。在优选的实施方案中，重组DNA构建体还包含并非miRNA序列天然启动子的启动子。这允许成熟miRNA在并不能天然表达的空间或时间或诱导条件下得以表达。例如，可将重组DNA构建体设计成包含组成型启动子，因而能组成型地表达仅在黑暗条件下才能天然表达的成熟miRNA(即当以处于天然启动子控制之下的内源miRNA前体的形式表达时)。在标题“启动子”下描述了可与该重组DNA构建体一起使用的启动子。
在一个非限制性实例中，重组DNA构建体包含用于调节至少一个靶基因表达的可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA元件包含可转录为miRNA前体的DNA元件，所述miRNA前体是由具有SEQ ID NO.1136的玉米miRNA前体序列的约90％核苷酸组成的连续区段，并且预测其具有的折回结构与具有SEQ ID NO.1136的miRNA前体序列的折回结构基本相同(即在相同或大致相同的位置上具有双链RNA茎和单链环或凸起的区域)。具有SEQ ID NO.1136的miRNA前体序列的折回结构包含约118个核苷酸，其在折回结构的闭合端的环上伸出两个短茎环，并在折回结构的主要双链“茎”内具有两个小凸起(图1)。通过in planta方式自miRNA前体(其是包含具有SEQ ID NO.1136的玉米miRNA前体序列的约90％核苷酸的连续区段)加工而来的成熟miRNA，优选与由具有SEQ ID NO.1136的miRNA前体序列的折回结构(即具有SEQ ID NO.32的成熟miRNA)所编码的相同。该重组DNA构建体的转录优选导致对含有被具有SEQ ID NO.32的成熟miRNA识别的miRNA识别位点的至少一个内源基因的抑制。尽管具有SEQ ID NO.1136的玉米miRNA前体序列在玉米籽粒组织、而不是在叶片中天然表达(参见表2)，但是重组DNA构建体还可包含并非具有SEQ ID NO.1136的miRNA前体序列的天然启动子的启动子，例如组成型启动子，以允许具有SEQ ID NO.32的成熟miRNA能在除籽粒组织之外的组织中转录。(B)成熟的工程miRNA的表达。
在重组DNA构建体的另一个实施方案中，用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件包含可转录为从选自以下植物miRNA前体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，其中工程miRNA前体包含修饰的成熟miRNA。在优选的实施方案中，至少一个靶基因是植物内源基因或者所述植物的有害动物或病原体的内源基因，重组DNA构建体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。至于“工程”是指例如选自以下植物miRNA前体序列的天然miRNA前体序列中的核苷酸被改变(替换、缺失或添加)：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ IDNO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，因而产生具有与天然miRNA前体序列折回结构基本相同的折回结构的工程miRNA前体，但其中由工程miRNA前体加工而来的成熟miRNA具有修饰序列(即不同于天然成熟miRNA的序列)，所述修饰序列经设计用于抑制靶基因，该靶基因不同于被天然miRNA前体序列天然抑制的靶基因。
用于测定天然miRNA前体序列中核苷酸改变以产生工程miRNA前体、用于制备本发明重组DNA构建体的一个通用的非限制性方法包括下列步骤：(a)选择对靶基因具有特异性的至少18个核苷酸的例如玉米cDNA数据库和基因组DNA数据库的独特靶序列，例如通过使用序列比对工具例如BLAST(参见例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.，215：403-410；Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.，25：3389-3402)，以鉴定靶转录直向同源物和对无关基因的任何潜在匹配，因而避免非靶序列的无意沉默。(b)分析靶基因中不需要的序列(例如与来自非目标物种(尤其是动物)的序列匹配)，并评价每个潜在19聚体区段的GC含量、Reynolds评分(参见Reynolds等(2004)Nature Biotechnol.，22：326-330)和特征是自由能为负差异(“ΔΔG”)的功能不对称(参见Khvorova等(2003)Cell，115：209-216)。优选选择具有以下所有或大部分特征的19聚体：(1)Reynolds评分＞4，(2)GC含量介于约40％至约60％，(3)负ΔΔG，(4)末端腺苷，(5)缺乏连续4轮以上的同一核苷酸；(6)位置靠近靶基因的3’端；(7)与miRNA前体转录物的差异最小。优选选择多个(3个或更多)19聚体用于试验。(c)测定所选19聚体的反向互补，用于制备修饰的成熟miRNA；优选位置20的额外核苷酸与所选靶序列匹配，优选选择位置21的核苷酸不配对，以防靶转录物上扩散沉默。(d)测定工程miRNA前体，例如，在土壤杆菌(Agrobacterium)介导的瞬时烟草(Nicotiana benthamiana)测定，用于修饰的成熟miRNA表达和靶抑制。和(e)将最有效的工程miRNA前体克隆到构建体中，用于玉米的稳定转化(参见标题“制备和使用重组DNA构建体”和“制备和使用非天然转基因植物细胞和非天然转基因植物”下的部分)。(C)转基因的表达与miRNA识别位点
在重组DNA构建体的另一个实施方案中，重组DNA构建体还包含转基因转录单元，其中用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件包含位于转基因转录单元内或其附近并可转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点可被从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，并且至少一个靶基因包含转基因转录单元所编码的转基因，而且其中重组DNA构建体在植物中的表达导致转基因在成熟miRNA并不能天然表达的植物细胞中得以表达。miRNA识别位点的优选实施方案是预测可被选自以下成熟miRNA中的至少一个成熟miRNA识别的那些：SEQ ID NO.1-1035、SEQ IDNO.2730-3921、SEQ ID NO.5498-6683、SEQ ID NO.8409-8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812-8815、SEQID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或者被从选自以下植物miRNA前体序列获得的至少一个成熟miRNA识别的那些：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819。使用以下文献所述的序列互补法则等本领域已知方法，可完成对识别位点的预测：Zhang(2005)Nucleic Acids Res.，33：W701-704和Rhoades等(2002)Cell，110：513-520。
对miRNA识别位点的预测允许鉴定和证实受到来自天然表达miRNA前体的miRNA调节的内源基因；这可用于例如消除或修饰内源基因内的miRNA识别位点，以便使该基因的表达从由天然调节基因表达的内源miRNA的调节中解脱出来。例如，可以增加涉及位置2至13的碱基(在具有连续21个核苷酸的miRNA识别位点中)的错配数，以防被miRNA识别并切割。
这些重组DNA构建体尤其可用于转基因在特定的空间、时间或诱导模式下的in planta表达，而无需具有该特定表达图式的启动子。这些重组DNA构建体允许例如由组成型启动子或表达超出所需细胞或组织类型的启动子转录的基因的限制性表达。限制性表达可以是在空间或时间上受限制，例如局限在特定组织或细胞类型或形式，或局限在特定发育期、生殖期、生长期或季节期。当在特定条件下(例如在拥挤、异株克生作用(allelopathic interaction)或有害动物或病原体侵染等生物胁迫下，或者在冷或热胁迫、干旱胁迫、营养胁迫、重金属或盐胁迫等非生物胁迫下)表达miRNA时，相应miRNA识别位点可用于条件特异性抑制，即在特定条件下抑制转基因。在一个非限制性实例中，本发明重组DNA构建体可用于在非水胁迫条件下在植物中表达转基因，其中本发明重组DNA构建体编码：(a)转基因，其处于组成型启动子控制之下，和(b)miRNA识别位点，其由仅在水胁迫条件下才特异性表达的成熟miRNA识别。在另一个非限制性实例中，本发明重组DNA构建体可用于在植物受到有害动物伤害的条件下在植物根部限制性表达杀虫蛋白，其中本发明重组DNA构建体编码：(a)表达杀虫蛋白的转基因，其处于由创伤特异性诱导的启动子的控制之下，和(b)miRNA识别位点，其被在非根组织中表达的成熟miRNA识别。
转基因转录单元包含至少一个转基因和任选额外序列，例如但不限于启动子、启动子增强子、终止子、信使RNA稳定或去稳定序列(参见例如Newman等(1993)Plant Cell，5：701-714；Green(1993)Plant Physiol.，102：1065-1070；和Ohme-Takagi等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：11811-11815)、用于将转基因转录物定位或转运至特定场所(例如线粒体、质体、核仁、过氧化物酶体、内质网等)的序列、或转基因所需加工相关的其它序列。转基因转录单元所编码的转基因可包含任何一个或多个目标基因，包括编码序列、非编码序列或这两者。目标基因可包含“靶基因”下所列出的任何基因，其优选的实例包括转录因子编码基因和酶编码基因的可翻译(编码)序列，所述酶参与目标分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖类和其它碳水化合物、生物聚合物和次级代谢物(包括生物碱类、萜类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物))的生物合成或分解代谢。(D)对内源或天然miRNA的抑制。
在重组DNA构建体的又一个实施方案中，用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件包含用于对从选自以下植物miRNA前体序列获得的内源miRNA表达进行抑制的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819。在优选的实施方案中，至少一个靶基因是植物内源基因，而且该内源基因的表达在发生内源miRNA天然表达的植物细胞中被抑制，因此重组DNA构建体在细胞中的表达导致内源基因在细胞中的表达。
用于抑制表达的DNA元件包含以下至少一个：(a)包含至少一个反义DNA区段的DNA，该反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的；(b)包含多拷贝的至少一个反义DNA区段的DNA，该反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的；(c)包含至少一个有义DNA区段的DNA，该有义DNA区段是靶基因的至少一个区段；(d)包含多拷贝的至少一个有义DNA区段的DNA，该有义DNA区段是靶基因的至少一个区段；(e)可转录为RNA并通过形成双链RNA而抑制靶基因的DNA，并且该DNA包含至少一个反义DNA区段和至少一个有义DNA区段，该反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的，而该有义DNA区段是靶基因的至少一个区段；(f)可转录为RNA并通过形成一个双链RNA而抑制靶基因的DNA，并且该DNA包含多个连续反义DNA区段和多个连续有义DNA区段，这些反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的，而这些有义DNA区段是靶基因的至少一个区段；(g)可转录为RNA并通过形成多个双链RNA而抑制靶基因的DNA，并且该DNA包含多个反义DNA区段和多个有义DNA区段，这些反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的，而这些有义DNA区段是靶基因的至少一个区段，并且其中多个反义DNA区段和多个有义DNA区段以一系列反向重复序列方式排列；(h)包含从植物miRNA获得的核苷酸的DNA；(i)包含siRNA的核苷酸的DNA；(j)可转录为能结合配体的RNA适配子(aptamer)的DNA；和(k)可转录为能结合配体的RNA适配子的DNA，和可转录为能调节靶基因表达的调节RNA的DNA，其中调节依赖于调节RNA的构象，而调节RNA的构象受到RNA适配子结合状态的变构影响。
用于抑制表达的DNA元件在实施例3中进一步描述并如图2和图3所示。
在某些实施方案中，重组DNA构建体包含这样的DNA：其设计成可转录为单链RNA或至少部分双链RNA(例如以“相吻茎环(kissing stem-loop)”排列)、或可转录为假定二级结构或三维构型(例如靶基因或适配子的反义序列的大环)的RNA，该RNA赋予转录物额外的所需特性，例如稳定性提高、体内半衰期延长或者细胞特异性或组织特异性提高。在一个实例中，间隔区可转录为能连接连续RNA区段第一系列和第二系列的稳定环(参见例如Di Giusto和King(2004)J.Biol.Chem.，279：46483-46489)。在另一个实例中，重组DNA构建体包含可转录为包含RNA适配子(例如可结合细胞特异性配体的适配子)在内的RNA的DNA，允许针对重组RNA双链体的细胞特异性或组织特异性寻靶(targetting)。
通过常用技术制备重组DNA构建体，例如在标题“制备和使用重组DNA构建体”下描述的那些并示例于工作实施例。重组DNA构建体尤其可用于制备非天然转基因植物细胞、非天然转基因植物和转基因种子，如以下“转基因植物细胞和转基因植物”中所讨论。
通过以下“微RNA诱骗序列”中详述的替代方法可控制miRNA对其靶基因的作用。靶基因
本发明的重组DNA构建体可设计为抑制任何靶基因。靶基因可以是可翻译(编码)序列，或者可以是非编码序列(例如非编码的调节序列)或者这两者，并且可包含至少一个选自以下的基因：真核靶基因、非真核靶基因、微RNA前体DNA序列和微RNA启动子。靶基因对于其中重组DNA构建体可转录的细胞(例如植物细胞或动物细胞)而言可以是天然(内源)的，或者对于其中重组DNA构建体可转录的动植物的有害动物或病原体而言可以是天然的。靶基因可以是外源基因，例如植物中的转基因。靶基因可以是抑制所靶向的天然基因，有或没有同时表达外源转基因，例如通过在重组DNA构建体或在分离的重组DNA构建体中包含基因表达元件。例如，最好用外源转基因同源物取代天然基因。
靶基因可包含单个基因或单个基因的一部分(其可靶向抑制)、或者可包含例如靶基因的多个连续区段、靶基因的多个非连续区段、靶基因的多个等位基因或者来自一种或多种物种的多个靶基因。靶基因可包含来自任何物种(包括但不限于细菌和病毒等非真核生物；真菌；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如作物、观赏植物和非驯化植物即野生植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；和脊椎动物，例如两栖类、鱼类、鸟类、驯化或野生哺乳动物，甚至人)的任何序列。
在一个实施方案中，靶基因对于其中重组DNA构建体可转录的植物而言是外源的，但对于植物的有害动物或病原体(例如病毒、细菌、真菌、卵菌和无脊椎动物，其中无脊椎动物例如昆虫、线虫和软体动物)而言是内源的。靶基因可包含多个靶基因、或者一个或多个基因的多个区段。在一个优选的实施方案中，靶基因是植物的无脊椎动物害虫或病原体基因。这些实施方案尤其可用于提供对一种或多种植物有害动物或病原体具有抗性的非天然转基因植物，例如，对线虫(例如大豆胞囊线虫或根结线虫)的抗性或对害虫的抗性。
靶基因可以是可翻译(编码)序列，或者可以是非编码序列(例如非编码的调节序列)或者这两种。靶基因的非限制性实例包括非翻译(非编码)序列，例如但不限于5’非翻译区、启动子、增强子、或其它非编码转录区、3’非翻译区、终止子和内含子。靶基因包括编码以下RNA的基因：微RNA、小干扰RNA、核糖体或核酶的RNA成分、核仁小RNA和其它非编码RNA(参见例如在rfam.wustl.edu上为公众提供的非编码RNA序列；Erdmann等(2001)Nucleic Acids Res.，29：189-193；Gottesman(2005)Trends Genet.，21：399-404；Griffiths-Jones等(2005)Nucleic Acids Res.，33：121-124)。靶基因的一个具体实例包含微RNA识别位点(也就是说，在RNA链上的位点，该位点可结合成熟miRNA并诱导切割)。靶基因的另一个具体实例包含对非天然转基因植物的有害动物或病原体而言是天然的微RNA前体序列，也就是说，编码微RNA的初级转录物、或由该初级转录物加工而来的RNA中间产物(例如核局限的pri-miRNA或pre-miRNA，其可从核输出至细胞质)。参见例如Lee等(2002)EMBO Journal，21：4663-4670；Reinhart等(2002)Genes & Dev.，16：161611626；Lund等(2004)Science，303：95-98；和Millar和Waterhouse(2005)Funct.Integr.Genomics，5：129-135。靶基因也可包含转录因子编码基因和酶编码基因的可翻译(编码)序列，所述酶参与目标分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖类和其它碳水化合物、生物聚合物和次级代谢物(包括生物碱类、萜类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物)的生物合成或分解代谢。
在多个优选的实施方案中，靶基因是植物有害动物或病原体的必需基因。必需基因包括有害动物或病原体发育为能育的生殖成体所需要的基因。必需基因包含当沉默或受到抑制时能导致生物体(作为成体或处于任何发育期，包括配子)死亡或者导致生物体无法成功繁殖(例如雄性或雌性亲本不育或者合子、胚胎或幼虫致死)的基因。有关线虫必需基因的描述可参见例如Kemphues，K.“Essential Genes(必需基因)”(2005年12月24日)，WormBook主编，The C.elegansResearch Community，WormBook，doi/10.1895/wormbook.1.57.1，可得自以下网址：www.wormbook.org。线虫必需基因的非限制性实例包括精子主要蛋白、RNA聚合酶II和几丁质合酶(参见例如美国专利申请公布说明书US20040098761 A1)；额外的大豆胞囊线虫必需基因在以下文献中提供：美国专利申请11/360,355(2006年2月23日申请)，通过引用结合到本文中。有关昆虫基因的描述公众可从以下数据库中得到：果蝇基因组数据库(Drosophila genome database，可得自以下网址：flybase.bio.indiana.edu/)。已经通过基于细胞培养的RNA干扰筛选，分析了大部分预测果蝇基因的功能，结果鉴定出438个必需基因；参见Boutros等(2004)Science，303：832-835，支持性材料可得自以下网址：www.sciencemag.org/cgi/content/full/303/5659/832/DC1。有关细菌和真菌必需基因的描述可得自必需基因数据库(Database of EssentialGenes，简称“DEG”，可得自以下网址：tubic.tju.edu.cn/deg/)；参见Zhang等(2004)Nucleic Acids Res.，32：D271-D272。
植物有害无脊椎动物包括但不限于有害线虫、有害软体动物(鼻涕虫和蜗牛)。目标植物病原体包括真菌、卵菌、细菌(例如引起叶斑病、枯萎病、冠瘿病和细菌性萎蔫病的细菌)、柔膜细菌和病毒(例如引起花叶病、脉结病、斑驳(flecking)、斑点(spotting)或异常生长的病毒)。另见G.N.Agrios，“Plant Pathology”(第4版)，Academic Press，San Diego，1997，第635页，对真菌、细菌、柔膜细菌(包括支原体和螺原体)、病毒、线虫、寄生性高等植物和有鞭毛的原生动物的有关描述，所有这些都是目标植物有害动物或病原体。另见由美国植物病理学会植物病害通用名称标准化委员会(Committee on Standardization ofCommon Names for Plant Diseases of The American PhytopathologicalSociety)编写的以下文献中不断更新的植物害虫和病原体和病害名录：American Phytopathological Society“Common Names of PlantDiseases”，Committee on Standardization of Common Names for PlantDiseases of The American Phytopathological Society编，1978-2005，可得自以下网址：www.apsnet.org/online/common/top.asp。
特别有兴趣的真菌性植物病原体的非限制性实例包括例如引起以下病害的真菌：白粉病、锈病、叶斑病和叶枯病、猝倒病、根腐病、颈腐病、棉铃腐病、茎溃疡病、树枝溃疡病(twig canker)、维管萎蔫病(Vascular wilt)、黑穗病或霉病，包括但不限于镰孢(Fusariumspp.)、层锈菌(Phakospora spp.)、丝核菌(Rhizoctonia spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)、赤霉(Gibberella spp.)、梨孢(Pyricularia spp.)和链格孢(Alternaria spp.)。真菌性植物病原体的具体实例包括豆薯层锈菌(Phakospora pachirhizi)(亚洲大豆锈病)、高粱柄锈菌(Puccinia sorghi)(玉米普通锈病)、多堆柄锈菌(Puccinia polysora)(玉米南方锈病)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)和其它镰孢(Fusarium spp.)、链格孢(Alternaria spp.)、青霉(Penicillium spp.)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、大斑病突脐蠕孢菌(Exserohilum turcicum)(玉米大斑病)、玉蜀黍双极蠕孢(Bipolaris maydis(玉米小斑病)、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)(玉米黑粉病)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)(玉米赤霉(Gibberella zeae))、轮状镰孢(Fusarium verticilliodes)(串珠状赤霉(Gibberella moniliformis))、增生镰孢(F.proliferatum)(藤仓赤霉中间变种(G.fujikuroi var.intermedia))、半粘镰孢(F.subglutinans)(半粘赤霉(G.subglutinans))、玉米色二孢(Diplodia maydis)、丝轴团散黑粉菌(Sporisorium holci-sorghi)、禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)、大斑病毛球腔菌(Setosphaeria turcica)、玉蜀黍出芽短梗霉(Aureobasidium zeae)、油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)以及美国专利6,194,636的表4和表5中提供的各种真菌种类，所述文献通过引用全部结合到本文中。植物病原体的非限制性实例包括起先归类为真菌、但最近归类为卵菌的病原体。特别有兴趣的卵菌性植物病原体的具体实例包括腐霉属(Pythium)(例如瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum))和疫霉属(Phytophthora)(例如致病疫霉(Phytophthora infestans)、大豆疫霉(Phytophthora sojae))的成员和引起霜霉病的生物体(例如粉霜霉(Peronospora farinosa))。
细菌性病原体的非限制性实例包括引起黄化病的支原体和螺原体(例如引起玉米矮缩病的孔氏螺原体(Spiroplasma kunkelii))、真细菌例如燕麦假单胞菌(Pseudomonas avenae)、须芒草假单胞菌(Pseudomonas andropogonis)、斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)以及美国专利6,194,636的表3中所列举的各种细菌种类，所述专利文献通过引用全部结合到本文中。
特别有兴趣的病毒性植物病原体的非限制性实例包括玉米矮缩花叶病毒(MDMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV，以前称为MDMV B株)、小麦条纹花叶病毒(WSMV)、玉米褪绿矮缩病毒(MCDV)、大麦黄矮病毒(BYDV)、香蕉簇顶病毒(BBTV)以及美国专利6,194,636的表2中所列举的各种病毒，所述专利文献通过引用全部结合到本文中。
无脊椎动物害虫的非限制性实例包括胞囊线虫(Heterodera spp.)尤其是大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、根结线虫(Meloidogyne spp.)、纽带线虫(Hoplolaimus spp.)、矮化线虫(Tylenchorhynchus spp.)、螺旋线虫(Helicotylenchus spp.)、根腐线虫(短体线虫(Pratylenchus spp.))、环线虫(Criconema spp.)、真滑刃线虫(Aphelenchus spp.)或滑刃线虫(Aphelenchoides spp.)、玉米根虫、盲蝽(Lygus spp.)、蚜虫和类似吸食树汁的昆虫例如根瘤蚜(葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae))、玉米螟、切根虫、粘虫、叶蝉、日本金龟子、草蜢(蝗虫)和其它有害鞘翅目、双翅目和鳞翅目。无脊椎动物害虫的具体实例包括能够侵染作物根系的害虫，例如北方玉米根虫(Diabrotica barberi)、南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata)、西方玉米根虫(Diabrotica virgifera)、玉米根蚜(Anuraphis maidiradicis)、黑色切根虫(球菜夜蛾(Agrotis ipsilon))、透翅缓夜蛾(Crymodesdevastator)、暗黑切根虫(Fsltia ducens)、泥背切根虫(Agrotis gladiaria)、金针虫(Melanotus spp.，Aeolus mellillus)、小麦金针虫(Aeolus mancus)、砂地金针虫(Horistonotus uhlerii)、玉米象甲(Sphenophorus maidis)、梯牧草象甲(Sphenophorus zeae)、早熟禾象甲(Sphenophorus parvulus)、南方玉米象甲(Sphenophorus callosus)、蛴螬(金龟子(Phyllophagaspp.))、玉米种蝇(灰地种蝇(Delia platura))、葡萄肖叶甲(Colaspisbrunnea)、玉米籽步甲(Stenolophus lecontei)和玉米籽细步甲(Cliviniaimpressifrons)，以及美国专利6,194,636的表6中所列举的寄生性线虫，所述专利文献通过引用全部结合到本文中。
特别有兴趣的无脊椎动物害虫，尤其是但不限于南半球地区(包括美洲中南部地区)包括蚜虫、玉米根虫、贪夜蛾、夜蛾(noctuideae)、马铃薯瓢虫、草盲蝽(Lygus spp.)、任何半翅目、同翅目或异翅目、任何鳞翅目、任何鞘翅目、线虫、切根虫、谷实夜蛾(earworms)、粘虫、螟虫、卷叶螟等。本发明具体涵盖的节肢动物害虫包括各种切根虫，包括切根虫(Agrotis repleta)、黑色切根虫(球菜夜蛾(Agrotis ipsilon))、切根虫(Anicla ignicans)、粒化切根虫(Feltiasubterranea)、“gusano áspero”(Agrotis malefida)；地中海粉螟(Anagasta kuehniella)、方颈扁甲(Cathartus quadricollis)、跳甲(Chaetocnema spp)、米蛾(Corcyra cephalonica)、玉米根虫或“vaquita deSan Antonio”(Diabotica speciosa)、甘蔗螟(Diatraea saccharalis)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)、褐臭蝽(Euschistus spp.)、谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、扁平谷盗(Laemophloeus minutus)、稻毛胫夜蛾(Mocis latipes)、锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)、紫斑谷螟(Pyralisfarinalis)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、玉米叶蚜(Rhopalosiphummaidis)、福土蝽(brown burrowing bug)或“chinche subterránea”(Scaptocoris castanea)、麦二岔蚜(Schizaphis graminum)、米象(Sitophiluszeamais)、麦蛾(Sitotroga cerealella)、草地粘虫(Spodoptera frugiperda)、大谷盗(Tenebroides mauritanicus)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)、赤拟谷盗(Triboleum castaneum)、棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea)、棉铃象甲(Anthonomus grandis)、棉蚜(Aphis gossypii)甘薯粉虱(Bemisiatabaci)、各种蓟马(Frankliniella spp.)、棉铃虫(谷实夜蛾(Helicoverpazea))、“oruga bolillera”(例如Helicoverpa geletopoeon)、烟夜蛾(Heliothis virescens)、稻绿蝽Nezara viridula)、棉红铃虫(Pectinophoragossypiella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、叶螨(Tetranychus spp.)、葱蓟马(Thrips tabaci)、温室白粉虱(Trialeurodes vaporarium)、大豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、斑点玉米叶甲(spotted maize beetle)或“astilomoteado”(Astylus atromaculatus)、“oruga de la alfalfa”(Colias lesbia)、“chinche marrón”或“chinche de los cuernos”(Dichelops furcatus)、“alquiche chico”(Edessa miditabunda)、blister beetles(Epicauta spp.)、“barrenador del brote”(Epinotia aporema)、“oruga verde del yuyocolorado”(Loxostege bifidalis)、根结线虫、“oruga cuarteadora”(Mocisrepanda)、南方绿盲蝽(Nezara viridula)、“chinche de la alfalfa”(Piezodorus guildinii)、苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)、大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)、尺夜蛾“isoca medidora del girasol”(Rachiplusia nu)、黄毛灯蛾(Spilosoma virginica)、黄条粘虫(Spodopteraornithogalli)、各种象虫(象虫科(Curculionidae))、各种金针虫(叩甲科(Elateridae))和各种蛴螬(金龟子科(Scarabaeidae))。本发明所具体包括的有害线虫包括以下植物的有害线虫：玉米(针刺线虫(Belonolaimusspp.)、毛刺线虫(Trichodorus spp.)、长针线虫(Longidorus spp.)、锥线虫(Dolichodorus spp.)、鳗线虫(Anguina spp.)、短体线虫、根结线虫、胞囊线虫)、大豆(大豆胞囊线虫、根结线虫、针刺线虫)、香蕉(相似穿孔线虫(Radopholus similis)、根结线虫、螺旋线虫)、甘蔗(甘蔗胞囊线虫(Heterodera sacchari)、短体线虫、根结线虫)、橙子(半穿刺线虫(Tylenchulus spp.)、穿孔线虫(Radopholus spp.)、针刺线虫、短体线虫、剑线虫(Xiphinema spp.))、咖啡(根结线虫、短体线虫)、椰子(伞滑刃线虫(Bursaphelenchus spp.))、番茄(根结线虫、针刺线虫、根瘤线虫(Nacobbus spp.)、葡萄(根结线虫、剑线虫、半穿刺线虫、小环线虫(Criconemella spp.)、柠檬和酸橙(半穿刺线虫、穿孔线虫、针刺线虫、短体线虫、剑线虫、可可(根结线虫、肾形小盘旋线虫(Rotylenchulusreniformis)、菠萝(根结线虫、短体线虫、肾形小盘旋线虫、木瓜(根结线虫、肾形小盘旋线虫)、葡萄柚(半穿刺线虫、穿孔线虫、针刺线虫、短体线虫、剑线虫)和蚕豆(根结线虫)。
来自有害动物的靶基因可包括精子主要蛋白、α微管蛋白、β微管蛋白、液泡ATP酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、RNA聚合酶II、几丁质合酶、细胞色素、miRNA、miRNA前体分子、miRNA启动子等物质的无脊椎动物基因，以及其它基因例如以下文献中公开的那些：美国专利申请公布说明书2006/0021087 A1、PCT专利申请PCT/US05/11816和美国专利申请公布说明书2004/0098761 A1中的表II，所述文献通过引用结合到本文中。来自病原体的靶基因可包括病毒翻译起始因子、病毒复制酶、miRNA、miRNA前体分子、真菌微管蛋白、真菌液泡ATP酶、真菌几丁质合酶、真菌MAP激酶、真菌Pac1 Tyr/Thr磷酸酶、参与营养运输的酶(例如氨基酸转运蛋白或糖转运蛋白)、参与真菌细胞壁生物合成的酶、角质酶、黑素生物合成酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶酶、果胶裂合酶、纤维素酶、蛋白酶等物质的基因，与植物无毒性基因相互作用的基因，以及其它参与病原体在受感染植物中的侵袭和复制的基因。因此，靶基因对于其中重组DNA构建体可转录的植物而言不一定是内源的。本发明的重组DNA构建体可在植物中转录并用于抑制可侵染植物的病原体或有害动物的基因。
合适靶基因的具体的非限制性实例也包括氨基酸分解代谢基因(例如但不限于编码赖氨酸-酮戊二酸还原酶(LKR)和酵母氨酸脱氢酶(SDH)的玉米LKR/SDH基因、及其同源物)、玉米醇溶蛋白基因、参与脂肪酸合成(例如植物微粒体脂肪酸去饱和酶和植物酰基-ACP硫酯酶，例如但不限于美国专利号6,426,448、6,372,965和6,872,872公开的那些)的基因、参与多步生物合成途径的基因，其中可能有兴趣调节一种或多种中间产物的水平，例如编码聚羟基链烷酸酯生物合成酶的基因(参见例如美国专利号5,750,848)；和编码细胞周期控制蛋白的基因，例如编码具有细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂样活性的蛋白质的基因(参见例如在国际专利申请公布号WO05007829A2中公开的基因)。靶基因可包括编码不想要的蛋白质(例如变应原或毒素)的基因，或编码不想要的化合物(例如不想要的味道或气味成分)生物合成酶的基因。因此，本发明的一个实施方案是非天然转基因植物或该植物的组织，该植物通过抑制变应原性蛋白或毒素而得以改良，例如变应原性降低的花生、大豆或小麦籽粒。靶基因可包括参与水果成熟的基因，例如多聚半乳糖醛酸酶的基因。靶基因可包括这样的基因：其表达优选局限于特定细胞或组织或发育期，或者其表达优选是瞬时的，也就是说，其中组成型或一般性抑制、或遍及许多组织的抑制，并非是想要的。因此，合适靶基因的其它实例包括蛋白质编码基因，当其在转基因植物中表达时，使得转基因植物对有害动物或病原体具有抗性(参见例如美国专利号5,763,245中公开的胆固醇氧化酶基因)；其表达受到有害动物或病原体诱导的基因；和可诱导或恢复能育性的基因(参见例如美国专利号6,759,575所述的芽孢杆菌RNA酶抑制剂/芽孢杆菌RNA酶(barstar/barnase)基因)；本段落所引用的所有专利都通过引用全部结合到本文中。
重组DNA构建体可设计成对靶基因的抑制更具特异性，例如通过将重组DNA构建体设计成编码成熟miRNA，使其包含与非靶基因序列基本不相同(或不互补)的区域。非靶基因可包含不会沉默或抑制的任何基因，无论是在含有重组DNA构建体的植物中还是在可能接触到重组DNA构建体的生物体中。非靶基因序列可包含来自任何物种(包括但不限于细菌和病毒等非真核生物；真菌；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如作物、观赏植物和非驯化植物即野生植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；和脊椎动物，例如两栖类、鱼类、鸟类、驯化或野生哺乳动物，甚至人)的任何序列。
在一个实施方案中，靶基因对于给定物种而言是内源基因，这些给定物种例如给定植物(例如但不限于农业或商业上重要的植物，包括单子叶植物和双子叶植物)，而非靶基因可以是例如非靶物种(例如另一种植物)的基因，或是病毒、真菌、细菌、无脊椎动物或脊椎动物、甚至人的基因。一个非限制性实例是这样的：其中重组DNA构建体设计为抑制靶基因而不抑制非靶基因，该靶基因对一种物种(例如西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera LeConte))而言是内源基因，而该非靶基因是例如来自相关、甚至密切相关物种(例如北方玉米根虫(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)或南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata))的基因。
在其它实施方案(例如其中最好能抑制跨越多个物种的靶基因)中，最好能设计重组DNA构建体，使其抑制这多个物种(在其中靶基因是沉默的)共同的靶基因序列。因此，可选择对一个分类单元具有特异性(例如对一个属、一个科或者甚至更大的分类单元(例如一个门，例如节肢动物门)具有特异性)、但对其它分类单元(例如植物或脊椎动物或哺乳动物)不具特异性的RNA双链体。在该实施方案的一个非限制性实例中，可选择用于基因沉默的重组DNA构建体，从而靶向致病真菌(例如镰孢菌)，而不靶向来自有益真菌的任何基因序列。
在该实施方案的另一个非限制性实例中，可选择在玉米根虫中用于基因沉默的重组DNA构建体对叶甲属(Diabrotica)所有成员具有特异性。在该实施方案的又一个实例中，可选择这类靶向叶甲属的重组DNA构建体，使其不靶向来自有益鞘翅目(例如捕食性瓢虫(coccinellid beetle)，通常称为瓢虫)或其它有益昆虫种类的任何基因序列。
用于沉默靶基因的本发明重组DNA构建体的所需特异性程度取决于各种因素。这些因素可包括重组DNA构建体所编码的成熟微RNA的大小和核酸序列、以及降低这种成熟miRNA对非靶基因的抑制潜力的相对重要性。在一个非限制性实例中，当预期这种成熟miRNA大小为21个碱基对时，一个特别优选的实施方案包括编码成熟miRNA并用于沉默靶基因的DNA，其中成熟miRNA包含与非靶基因序列基本不相同的序列，例如与非靶基因序列的21个连续核苷酸只有少于18、或少于17、或少于16、或少于15的匹配。
在某些实施方案中，最好设计用于沉默靶基因的重组DNA构建体，使其包含预测不会产生不想要的多肽的区域，例如通过筛选重组DNA构建体中的可编码不想要多肽的序列或其密切同源物。不想要的多肽包括但不限于与已知变应原性多肽同源的多肽和与已知多肽毒素同源的多肽。编码这些不想要的潜在变应原性肽的公众可得的序列可得自例如食物变应原研究和来源项目(Food AllergyResearch and Resource Program，FARRP)的变应原数据库(可得自allergenonline.com)或食品安全数据库生物技术信息(BiotechnologyInformation for Food Safety Databases)(可得自www.iit.edu/～sgendel/fa.htm)(另外参见例如Gendel(1998)Adv.FoodNutr.Res.，42：63-92)。不想要的序列也可包括例如注释为已知毒素或潜在或已知变应原并在例如以下公众可得的数据库中具有的多肽序列：GenBank，EMBL，SwissProt等等，其可通过Entrez系统(www.ncbi.nih.gov/Entrez)来搜索。不想要的潜在变应原性肽序列的非限制性实例包括大豆的大豆球蛋白，花生的油质蛋白和凝集素，小麦的麦谷蛋白，牛乳的酪蛋白，乳清蛋白和乳球蛋白，以及各种贝类的原肌球蛋白(allergenonline.com)。不想要的潜在毒性肽的非限制性实例包括破伤风梭菌(Clostridium tetani)的破伤风毒素tetA、金黄色葡萄球菌的腹泻毒素、以及毒物(例如来自芋螺(Conus spp.)的芋螺毒素和来自节肢动物和爬行动物的神经毒素(www.ncbi.nih.gov/Entrez)。
在一个非限制性实例中，可筛选重组DNA构建体，以消除编码以下多肽的可转录序列，所述多肽与已知变应原或毒素具有超过8个连续氨基酸的完美同源性，或者与超过至少80个氨基酸具有至少35％同一性；这样的筛选可以在任何和所有可能读框上以两个方向进行，在以AUG(在相应DNA中为ATG)开头的潜在可读框上，或在所有可能读框上，无论它们是否以AUG(或ATG)开头。当有“命中”或匹配时，也就是说，当鉴别出编码与已知变应原或毒素具有超过8个连续氨基酸的完美同源性(或与超过至少80个氨基酸具有至少35％同一性)的潜在多肽的序列时，可避免、消除或修饰对应于该命中的核酸序列，当选择序列用于RNA进行沉默靶基因时。在一个实施方案中，这样设计重组DNA构建体，使其不含以AUG(在相应DNA中为ATG)开头的潜在可读框。
可通过本领域技术人员已知的任何方法，来达到避免、消除或修饰不想要的序列。在某些情况下，结果可以是据信在自然界不存在的新的序列，例如，可通过将“干净”序列一起连接成待用于RHA双链体的新的嵌合序列，从而避免某些序列。
申请人知道，在某些微RNA介导的基因沉默中，不完美匹配的miRNA序列在基因沉默中可能是有效的。例如，已经知道在邻近miRNA互补位点中心的错配，比起更远位置的错配而言，对miRNA的基因沉默的影响更强一些。参见例如Mallory等(2004)EMBOJ.，23：3356-3364中的图4。在另一个实例中，已经报道，错配碱基对的位置和形成错配的核苷酸特征，这两者都影响给定siRNA沉默靶基因的能力，而且腺嘌呤-胞嘧啶错配，除了G:U摆动碱基对之外，具有良好耐受性(参见Du等(2005)Nucleic Acids Res.，33：1671-1677)。因此，给定链的重组DNA构建体不必与规定靶基因总是具有100％序列同一性，但一般会优选与规定靶基因具有基本的序列同一性，例如与规定靶基因具有约95％、约90％、约85％或约80％序列同一性。对于互补性的描述，重组DNA构建体的一条链优选设计成与规定目标(例如目标信使RNA或目标非编码RNA)具有基本互补性，例如与规定目标具有约95％、约90％、约85％或约80％互补性。在一个非限制性实例中，在编码21个核苷酸的成熟miRNA的重组DNA构建体的情况下，所编码的成熟miRNA可设计为与靶RNA的21个连续核苷酸基本、但并非完美互补；优选位置21的核苷酸与靶RNA中的相应位置不配对，以避免传递性。
本领域技术人员将能判断，相对于其它标准的重要性而言，筛选预测对靶基因具有更高特异性或预测不产生不想要的多肽的区域的重要性，所述其它标准例如但不限于与规定靶基因具有的％序列同一性或预测给定序列的基因沉默效率。例如，编码成熟miRNA的本发明重组DNA构建体可设计为在若干物种中都具有活性，因此本领域技术人员可确定，在重组DNA构建体中包含编码对若干目标物种具有特异性的成熟miRNA的DNA更为重要，而筛选预测具有更高基因沉默效率的区域或筛选预测能产生不想要的多肽的区域则没那么重要。启动子
通常，本发明的重组DNA构建体包含在植物细胞起作用、并与可转录DNA元件操作性连接的启动子。在不同实施方案中，启动子选自组成型启动子、空间特异性启动子、时间特异性启动子、发育特异性启动子和诱导型启动子。
适用于本发明重组DNA构建体的非组成型启动子包括空间特异性启动子、时间特异性启动子和诱导型启动子。空间特异性启动子可包括细胞器特异性启动子、细胞特异性启动子、组织特异性启动子或器官特异性启动子(例如质体特异性启动子、根特异性启动子、花粉特异性启动子或种子特异性启动子，用于分别抑制第一靶RNA在质体、根部、花粉或种子中的表达)。在许多情况下，种子特异性启动子、胚特异性启动子、糊粉特异性启动子或胚乳特异性启动子尤为有用。时间特异性启动子可包括在植物生长周期的某些发育阶段期间、或在不同昼夜时间中、或在一年的不同季节中能启动表达的启动子。诱导型启动子包括由例如但不限于以下生物胁迫或非生物胁迫的化学物或环境条件诱导的启动子：例如缺水即干旱、热、冷、高或低营养或盐水平、高或低光照水平、或者有害动物或病原体侵染。表达特异性动子也可包括通常为组成型表达、但以不同程度或“强度”表达的启动子，包括通常认为是“强启动子”或“弱启动子”的启动子。
特别有兴趣的启动子包括以下非限制性实例：从土壤杆菌(Agrobacterium)T-DNA分离的章鱼碱(opaline)合酶启动子；花椰菜花叶病毒35S启动子；增强型启动子元件或嵌合启动子元件，例如连接增强子元件(来自玉米热激蛋白70的内含子)的增强型花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子；根特异性启动子，例如美国专利5,837,848；6,437,217和6,426,446中公开的那些；美国专利6,433,252中公开的玉米L3油质蛋白启动子；美国专利申请公布说明书2004/0216189中公开的用于编码质体局限性醛缩酶的植物核基因的启动子；美国专利6,084,089中公开的低温诱导型启动子；美国专利号6,140,078中公开的盐诱导型启动子；美国专利6,294,714中公开的光诱导型启动子；美国专利6,252,138中公开的病原体诱导型启动子；和美国专利申请公布说明书2004/0123347A1中公开的缺水诱导型启动子，所有上述专利和专利公布说明书公开的启动子及其应用，尤其是在植物中的重组DNA构建体功能，所述文献都通过引用结合到本文中。
启动子元件可包括并非天然启动子或启动子元件或其同源物、但可调节基因表达的核酸序列。这类“基因独立性”调节序列的实例包括天然存在的RNA序列或人工设计的RNA序列，其可包含配体结合区或适配子和调节区(其可以是顺式作用的)。参见例如Isaacs等(2004)Nat.Biotechnol.，22：841-847；Bayer和Smolke(2005)NatureBiotechnol.，23：337-343；Mandal和Breaker(2004)Nature Rev.Mol.CellBiol.，5：451-463；Davidson和Ellington(2005)Trends Biotechnol.，23：109-112；Winkler等(2002)Nature，419：952-956；Sudarsan等(2003)RNA，9：644-647；和Mandal和Breaker(2004)Nature Struct.Mol.Biol.，11：29-35。可选择或设计这些“核糖核酸调节物(riboregulator)”具体的空间或时间特异性，例如仅在给定浓度的合适配体存在(或不存在)时才调节外源基因的翻译。制备和使用重组DNA构建体
可通过适合预定用途的任何方法来制备本发明重组DNA构建体，考虑到例如所需表达类型和在构建体用来转录的植物中使用的方便性。制备和使用DNA构建体和载体的通用方法是本领域众所周知的，详述于例如包括以下在内的手册和实验室指南：Sambrook和Russell，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，2001。构建DNA构建体和载体并用于转化的有用技术的实例公开于美国专利申请公布说明书2004/0115642A1，通过引用结合到本文中。也可使用GATEWAYTM克隆技术(可得自Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)来构建DNA构建体，该技术使用来自噬菌体λ载体构建的整合酶(Integrase)/att系统的位点特异性重组酶LR克隆反应，代替限制性核酸内切酶和连接酶。LR克隆反应公开于美国专利5,888,732和6,277,608和美国专利申请公布说明书2001/283529、2001/282319和2002/0007051，所有这些文献都通过引用结合到本文中。GATEWAYTM克隆技术指导手册(也由Invitrogen提供)提供了将任何所需DNA常规克隆到含有可操作植物表达元件的载体中的简明指导。另一种载体构建的替代方法使用不依赖连接的克隆，如以下文献所公开：Aslandis等(1990)NucleicAcids Res.，18：6069-6074和Rashtchian等(1992)Biochem.，206：91-97，其中将具有单链5’端和3’端的DNA片段连接到所需载体中，然后可以在体内扩增。
在某些实施方案中，重组DNA构建体的DNA序列包含对于植物已经经过密码子优化的序列，其中重组DNA构建体在所述植物中表达。例如，可通过本领域已知方法，使在植物中表达的重组DNA构建体具有经密码子优化的所有或部分序列(例如第一基因抑制元件或基因表达元件)，用于在植物中表达。参见例如美国专利5,500,365中有关植物密码子优化的描述，通过引用结合到本文中；另见De Amicis和Marchetti(2000)Nucleic Acids Res.，28：3339-3346。转基因植物细胞和植物
本发明另一方面提供非天然转基因植物细胞，其包含本发明的任何重组DNA构建体，如以上标题“重组DNA构建体”下所述。还提供含有本发明非天然转基因植物细胞的非天然转基因植物。本发明的非天然转基因植物包括任何发育期的植物，并包括由本文所公开的转基因植物细胞制备而来的再生植物或再生植物的后代植物(其可以是近交或杂交后代植物)、或这类转基因植物的种子。也提供并要求保护在其基因组中具有本发明所提供的重组DNA构建体的转基因种子。可通过本领域众所周知的方法制备本发明的非天然转基因植物细胞、非天然转基因植物和转基因种子，如以下标题“制备和使用非天然转基因植物细胞和非天然转基因植物”下所述。
非天然转基因植物细胞可包括分离的植物细胞(例如单独的植物细胞或在人工培养基中或人工培养基上生长的细胞)，或可包括未分化组织(例如愈伤组织或任何聚集的植物细胞)中的植物细胞。非天然转基因植物细胞可包括至少一种分化组织中的植物细胞，所述分化组织选自叶(例如叶柄和叶片)、根、茎(例如块茎、根状茎、匍匐茎、鳞茎和球茎)、茎秆(例如木质部、韧皮部)、木材、种子、果实(例如坚果、谷物、肉质果)和花(例如雄蕊、花丝、花药、花粉、心皮、雌蕊、子房、胚珠)。
本发明的非天然转基因植物细胞或非天然转基因植物可以是任何合适的目标植物细胞或植物。瞬时转化和稳定转化的植物细胞都包含在本发明之内。特别优选稳定转化的转基因植物。在多个优选的实施方案中，非天然转基因植物是可收获种子的能育的转基因植物，而且本发明还要求保护这些转基因植物的转基因种子，其中种子优选也含有本发明的重组构建体。制备和使用非天然转基因植物细胞和非天然转基因植物
尽管本发明的重组DNA构建体用于产生本发明的非天然转基因植物细胞、非天然转基因植物或转基因种子，但转化可包括任何众所周知的并已证明的方法和组成。用于植物转化的合适方法其实包括将DNA导入细胞的任何方法，例如通过直接递送DNA(例如通过PEG介导的原生质体转化、通过电穿孔、通过用碳化硅纤维搅拌、以及通过DNA包被颗粒加速(acceleration of DNA coated particles))、通过土壤杆菌介导的转化、通过病毒或其它载体等。一种植物转化的优选方法是微弹轰击，例如以下文献所述：美国专利5,015,580(大豆)、5,550,318(玉米)、5,538,880(玉米)、6,153,812(小麦)、6,160,208(玉米)、6,288,312(水稻)和6,399,861(玉米)和6,403,865(玉米)，所有这些文献都通过引用结合到本文中。
植物转化的另一种优选方法是土壤杆菌介导的转化。在一个优选的实施方案中，可通过含二元Ti质粒系统的土壤杆菌转化的方法，得到本发明的非天然转基因植物细胞，其中土壤杆菌携带第一Ti质粒和含有野生型Ti质粒的至少一个T-DNA边界的第二嵌合质粒、在转化植物细胞中具有功能并与本发明基因抑制构建体操作性连接的启动子。参见例如美国专利5,159,135所述的二元系统，通过引用结合到本文中。另见De Framond(1983)Biotechnology，1：262-269；和Hoekema等，(1983)Nature，303：179。在这样的二元系统中，可在合适的替代宿主(例如大肠杆菌)中方便地构建含有T-DNA边界的较小质粒，并转移至土壤杆菌中。
用于土壤杆菌介导的植物(尤其是作物)转化的具体方法包括例如以下文献中公开的方法：美国专利5,004,863、5,159,135和5,518,908(棉花)；5,416,011、5,569,834、5,824,877和6,384,301(大豆)；5,591,616和5,981,840(玉米)；5,463,174(芸薹属)和美国专利申请公布说明书2004/0244075(玉米)，所有这些文献都通过引用结合到本文中。对于以下双子叶植物和单子叶植物等许多植物而言都报道了类似方法：花生(Cheng等(1996)Plant Cell Rep.，15：653)；芦笋(Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：5345)；大麦(Wan和Lemaux(1994)Plant Physiol.，104：37)；水稻(Toriyama等(1988)Bio/Technology，6：10；Zhang等(1988)Plant Cell Rep.，7：379；小麦(Vasil等(1992)Bio/Technology，10：667；Becker等(1994)Plant J.，5：299)，苜蓿(Masoud等(1996)Transgen.Res.，5：313)；和番茄(Sun等(2006)Plant CellPhysiol.，47：426-431)。另见美国专利申请公布说明书2003/0167537A1中有关转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物的载体、转化方法和生产的描述，其中转录因子由CaMV35S启动子组成型表达，该文献通过引用结合到本文中。也可通过用其它载体的转化而得到转基因植物细胞和转基因植物，所述其它载体例如但不限于病毒载体(例如烟草蚀纹病毒(tobacco etch potyvirus，TEV)、大麦条状花叶病毒(BSMV)、以及Edwardson和Christie(″The Potyvirus Group：MonographNo.16，1991，Agric.Exp.Station，Univ.of Florida)中所述的有关病毒、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)或任何其它合适的克隆载体，当用于例如以下合适转化方案时：细菌感染(例如用如上所述的土壤杆菌)、二元细菌人工染色体构建体、DNA的直接递送(例如通过PEG介导的转化、脱水/抑制介导的DNA摄取、电穿孔、用碳化硅纤维搅拌和微弹轰击)。本领域普通技术人员显而易见的是，各种转化方法都可用于或经修改用于自许多目标植物物种产生稳定的转基因植物。
优选在组织培养基和受控环境中实施能提供含稳定整合的重组DNA的转基因植物细胞和转基因植物的转化方法。“培养基”是指用于在体外(即在完整的活生物体之外)培养细胞的多种营养混合物。受体细胞靶标包括但不限于分生组织细胞、愈伤组织、未成熟胚或部分胚、以及配子细胞例如小孢子、花粉、精子和卵细胞。可再生为能育植物的任何细胞都可作为有用的受体细胞，用于本发明的实践。愈伤组织可来自各种组织来源，包括但不限于未成熟胚或部分胚、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够增殖为愈伤组织的这些细胞可作为受体细胞，用于遗传转化。用于制备本发明非天然转基因植物的实用的转化方法和材料(例如各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化、以及其后的能育转基因植物的再生)都公开于例如美国专利6,194,636和6,232,526和美国专利申请公布说明书2004/0216189，通过引用结合到本文中。转基因植物包括转基因植物组织或部分，例如转基因砧木或转基因嫁接或接穗材料，其可与非转基因植物组织或部分组合使用。
在通常的转化实践中，在任何一个转化实验中，DNA仅能导入到少量靶细胞中。标记基因通常用于提供鉴定稳定转化的细胞的有效系统，这样的细胞是通过接受转基因DNA构建体并将它整合到其基因组中而得到的。优选的标记基因提供赋予选择剂(例如抗生素或除草剂)抗性的选择标记。植物细胞对其具有抗性的任何抗生素或除草剂都可以是有用的选择剂。使潜在的转化细胞接触选择剂。在存活细胞群体中的细胞就是赋予抗性的基因整合并以允许细胞存活的足够量表达的细胞。还可进一步测定细胞，以证实重组DNA的稳定整合。常用的选择标记基因包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因，这些抗生素例如卡那霉素或巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)和庆大霉素(aac3和aacC4)，这些除草剂例如草铵膦(bar或pat)和草甘膦(EPSPS)。有用的选择标记基因和选择剂的实例可参见美国专利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047，所有这些文献都通过引用结合到本文中。也可使用筛选标记或报道基因，例如提供可目测鉴定转化子的能力的标记。有用的筛选标记的非限制性实例包括例如表达这样的蛋白质的基因：该蛋白质通过作用于发色底物(例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(uidA)或萤光素酶(luc))而产生可检测颜色，或者它自身是可检测的，例如绿色荧光蛋白(GFP)(gfp)或免疫原性分子。本领域技术人员将会知道，许多其它有用标记或报道基因都可使用。
重组构建体在本发明非天然转基因植物中转录而表达靶基因(或同时表达目标基因)，可通过蛋白质检测方法(例如蛋白质印迹、ELISA和其它免疫化学方法)、酶活性测定或核酸检测方法(例如DNA印迹、RNA印迹、PCR、RT-PCR、荧光原位杂交)等任何合适的方法，来检测或测定所述靶基因表达上的变化。根据大量可用的手册，这些方法是本领域普通技术人员众所周知的；参见例如JosephSambrook和David W.Russell，“Molecular Cloning：A LaboratoryManual”(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，2001；Frederick M.Ausubel等(编著)“Short Protocols in Molecular Biology”(第5版)，John Wiley和Sons，2002；John M.Walker(编著)“ProteinProtocols Handbook”(第2版)，Humana Press，2002；和Leandro
Figure G2007800457886D00411
(编著)“Transgenic Plants：Methods and Protocols”，Humana Press，2004。
重组DNA在本发明非天然转基因植物中转录而表达靶基因(或同时表达目标基因)，还可通过其它合适的方法来检测或测定所述靶基因表达上的变化，包括测定能直接或间接指示靶基因在重组DNA可转录的转基因植物(相对于不转录重组DNA的转基因植物)中的表达(或目标基因的同时表达)的任何其它性状，例如总体或显微形态学性状、生长率、产量、生殖或补充(recruitment)率、对有害动物或病原体的抗性、或对生物或非生物胁迫(例如缺水胁迫、盐胁迫、营养胁迫、热或冷胁迫)的耐性。这些方法可用于直接测定表型性状或间接测定(例如在植物中，这些测定包括植物部分测定例如叶或根的测定，以测定非生物胁迫耐性)。
通过例如表达或抑制其它基因，可将本发明的重组DNA构建体与赋予额外性状(例如就转化植物而言，包括除草剂抗性、抗虫性、低温发芽耐性、缺水耐性等性状)的其它重组DNA叠加在一起(stack)。用于调节基因表达增减的构建体公开于美国专利申请公布说明书2004/0126845 A1，通过引用结合到本文中。
可收获能育转基因植物的种子并用于培育后代，包括在其基因组中包含重组DNA构建体的本发明非天然转基因植物的杂交后代。因此，除了用重组DNA构建体直接转化植物之外，可通过将具有重组DNA的第一植物与缺乏构建体的第二植物杂交，制备本发明的非天然转基因植物。例如，可将重组DNA导入适于转化的植物系中以产生非天然转基因植物，其可与第二植物系杂交，将重组DNA渐渗入所得后代中。可将携带一个重组DNA(导致靶基因表达变化)的本发明非天然转基因植物与具有赋予一种或多种额外性状(例如但不限于除草剂抗性、抗虫性或抗病性、环境胁迫抗性、营养含量改变和产量提高)的其它重组DNA的植物系杂交，产生具有同时赋予所需靶序列表达行为和额外性状的重组DNA的后代植物。
通常，在合并性状的育种中，提供额外性状的转基因植物是雄性品系，而携带基础性状的转基因植物是雌性品系。这种杂交后代发生分离，使得某些植物携带同时具有双亲性状的DNA，而某些只携带一方亲本性状的DNA；可通过与亲本重组DNA缔合的标记来鉴定这类植物。可将携带同时具有双亲性状的DNA的后代植物与雌性亲本系多次回交，例如通常6-8代，产生具有与一个原始转基因亲本系基本相同的基因型的后代植物，如果没有其它转基因亲本系的重组DNA的话。
本发明的再一方面是自本发明转基因种子培育而来的非天然转基因植物。本发明涵盖自含有重组DNA的转基因种子直接培育而来的非天然转基因植物以及植物后代，包括近交或杂交植物系，其通过将自转基因种子直接培育而来的转基因植物与并非由同一转基因种子培育而来的第二植物杂交而制备。
杂交可包括例如以下步骤：(a)按照本发明，种植第一亲本植物(例如非转基因或转基因)和转基因的第二亲本植物的种子；(b)将第一和第二亲本植物的种子培育为长花的植物；(c)用第二亲本的花粉给第一亲本的花授粉；和(d)在携带能育花的亲本植物上收获长出的种子。
最好是将重组DNA渐渗入原种中，例如通过回交，将一个来源的特定所需性状转移到缺乏该性状的近交或其它植物中。这可通过例如以下步骤来完成：将优良近交系(“A”)(回归亲本)与携带具有目标性状的合适基因(例如按照本发明制备的构建体)的供体近交系(“B”)(非回归亲本)第一次杂交。在第一次杂交的所得后代中选出具有从非回归亲本“B”转移的所需性状的后代，所选后代再与优良回归亲本“A”回交。经过选择所需性状的5代以上回交后，后代在控制所转移性状的基因座上是半合子，但在大多数或几乎所有其它基因上都类似于优良亲本。回交的的最后一代自己生长出的后代，对所转移(即一次或多次转化事件)的基因而言是纯系。
经过一序列育种操纵，所选DNA构建体可从一个品系移至完全不同的另一品系，而无需进一步重组操纵。因此可产生近交植物，其可真实育种用于一个或多个DNA构建体。通过将不同近交植物杂交，可得到具有不同DNA构建体组合的大量不同杂种。按照这种方式，可产生具有通常与杂交有关的所需农艺学特性(“杂交优势”)以及由一种或多种DNA构建体赋予的所需特性的植物。
遗传标记可用于帮助将本发明的一个或多个DNA构建体从一个遗传背景渐渗到另一个。相对于常规育种而言，有助于选择的标记具有优势，因为它可用于避免因表型变异而引起的错误。此外，遗传标记可提供数据，无论原种种质(elite germplasm)在具体杂交的单个后代中的相对程度如何。例如，当具有所需性状并具有非农艺学所需遗传背景的植物与原种亲本杂交时，遗传标记可用于选择不仅具有目标性状、而且具有相当大比例的所需种质的后代。这样，将一种或多种性状的基因渐渗到特定遗传背景所需的传代次数最小。采用标记有助于在本发明非天然转基因植物的育种中进行选择，有用的分子标记的种类例如但不限于SSR和SNP，可参见PCT申请公布说明书WO02/062129和美国专利申请公布号2002/0133852、2003/0049612和2003/0005491，各自通过引用全部结合到本文中。
在某些本发明的非天然转基因植物细胞和非天然转基因植物中，最好同时表达(或抑制)目标基因，同时也调节靶基因的表达。因此，在某些实施方案中，非天然转基因植物含有重组DNA，所述重组DNA还包含基因表达(或抑制)元件，用于表达至少一个目标基因，而靶基因表达的调节优选受到至少一个目标基因在转基因植物中同时表达(或抑制)的影响。
因此，如本文所述，通过采用本领域已知的或本文所公开的任何合适的瞬时或稳定、整合或非整合的转化方法，可得到本发明的非天然转基因植物细胞或非天然转基因植物。重组DNA构建体可在任何植物细胞或组织中或者在完整植物的任何发育期转录。转基因植物可来自任何单子叶植物或双子叶植物，例如但不限于具有商业或农业价值的植物，例如作物(尤其是作为人类食物或动物饲料的作物)、生产木材或纸浆的树木、蔬菜植物、水果植物和观赏植物。目标植物的非限制性实例包括谷类作物(例如小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、小黑麦、水稻、稷、高粱、奎藜籽(quinoa)、苋菜和荞麦)；饲料作物(例如饲用禾草和饲用双子叶植物，包括苜蓿、野豌豆、三叶草等)；油料作物(例如棉花、红花、向日葵、大豆、甘兰型油菜(亦称双低油菜，canola)、白菜型油菜(rapeseed)、亚麻、花生和油棕)；树坚果(例如核桃、腰果、榛子、山核桃、杏仁等)；甘蔗、椰子、枣椰、橄榄、甜菜、茶和咖啡；木材用树或纸浆用树；蔬菜作物例如豆类(例如菜豆、豌豆、兵豆、苜蓿、花生)、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、芹菜、胡萝卜、萝卜、芸薹类(例如甘蓝、羽衣甘蓝、芥菜和其它叶用芸薹类、椰菜、花椰菜、孢子甘蓝、芜菁、球茎甘蓝)、食用葫芦科类(例如黄瓜、甜瓜、夏西葫芦、冬西葫芦)、食用葱属(例如洋葱、大蒜、韭菜、火葱、细香葱)、茄科(Solanaceae)的食用成员(例如番茄、茄子、马铃薯、辣椒、灯笼果(groundcherry))、和藜科(Chenopodiaceae)的食用成员(例如甜菜、牛皮菜、菠菜、奎藜籽、苋菜)；水果作物例如苹果、梨、柑橘类水果(例如橙子、酸橙、柠檬、葡萄柚等)、核果类(例如杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠萝、葡萄、猕猴桃、木瓜、鳄梨和浆果类；和观赏植物，包括观赏用花卉植物、观赏用乔木和灌木、观赏用地被植物和观赏草。优选的双子叶植物包括但不限于甘兰型油菜、椰菜、甘蓝、胡萝卜、花椰菜、白菜、黄瓜、干豆类、茄子、茴香、四季豆、葫芦、莴苣、甜瓜、秋葵、豌豆、辣椒、西葫芦(pumpkin)、萝卜、菠菜、南瓜(squash)、西瓜、棉花、马铃薯、奎藜籽、苋菜、荞麦、红花、大豆、甜菜和向日葵。优选的单子叶植物包括但不限于小麦、燕麦、大麦、玉米(包括甜玉米和其它品种)、黑麦、小黑麦、水稻、观赏用禾草和饲用禾草、高粱、稷、洋葱、韭菜和甘蔗，更优选玉米、小麦和水稻。
植物转化的最终目标是得到对人类有用的植物。就此而言，本发明的非天然转基因植物可用于对生产者或消费者视为有价值的任何实际目的。例如，人们可以希望收获转基因植物本身，或收获转基因植物的转基因种子(用于种植)，或者可以用转基因植物或其种子来生产各种产品，例如油、淀粉、乙醇或其它发酵产品、动物饲料或人类食物、医药和各种工业产品。例如，玉米可广泛用于食品及饲料业、以及工业应用。有关玉米用途的进一步讨论可参见例如美国专利号6,194,636、6,207,879、6,232,526、6,426,446、6,429,357、6,433,252、6,437,217和6,583,338，通过引用结合到本文中，以及PCT公布说明书WO 95/06128和WO 02/057471。因此，本发明也提供由本发明的转基因植物细胞、植物或种子制备而来的商品，包括但不限于收获的叶、根、苗、块茎、茎、果实、种子或其它植物部分、食物、油类、提取物、发酵或消化产物、碾碎或完整的谷物或植物种子、或任何食品或非食品(包含由本发明转基因植物细胞、植物或种子制备而来的商品)。本文所涵盖的对一种或多种商品中本发明重组DNA构建体的一个或多个核酸序列的检测，是该商品含有或源自本发明转基因植物细胞、植物或种子的实际证据。
在优选的实施方案中，相对于缺乏重组DNA构建体的植物而言，由本发明非天然转基因植物细胞制备而来的非天然转基因植物(即在其基因组中含有本发明重组DNA构建体的转基因植物)具有至少一个额外改变的性状，其选自以下性状：(a)提高非生物胁迫耐性；(b)提高生物胁迫耐性；(c)改变初级代谢产物组成；(d)改变次级代谢产物组成；(e)改变微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；(f)提高产量；(g)提高氮或其它营养物的利用能力；(h)改变农艺学特性；(i)改变生长或生殖特性；和(j)提高收获、贮存或加工品质。
在特别优选的实施方案中，非天然转基因植物的特性是提高对非生物胁迫的耐性(例如对缺水或干旱、热、冷、非优化营养或盐水平、非优化光照水平的耐性)或者对生物胁迫(例如拥挤、异株克生作用或受伤)的耐性；改变初级代谢产物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成；改变次级代谢产物(例如生物碱类、萜类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物)组成；改变微量元素(例如铁、锌)、类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、玉米黄质或其它类胡萝卜素和叶黄素)或维生素(例如生育酚)组成；提高产量(例如在非胁迫条件下产量提高或在生物或非生物胁迫下产量提高)；提高氮或其它营养物的利用能力；改变农艺学特性(例如延迟成熟；延迟衰老；更早熟或更晚熟；改善耐荫性；提高根茎倒伏的抗性；提高对茎的“green snap”的抗性；光周期反应的改变)；改变生长或生殖特性(例如有意矮化；有意雄性不育，用于例如例如改进杂交步骤；营养体生长率提高；提高发芽率；提高雄性或雌性生育力)；提高收获、贮存或加工品质(例如提高贮存期间对有害动物的抗性，提高对破损的抗性、提高对消费者的吸引)；或这些性状的任何组合。
在一个优选的实施方案中，转基因种子或由非天然转基因植物产生的种子具有改变的初级代谢产物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成，改变的次级代谢产物(例如生物碱类、萜类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物)组成，改变的微量元素(例如铁、锌)、类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、玉米黄质或其它类胡萝卜素和叶黄素)或维生素(例如生育酚)组成，提高的收获、贮存或加工品质，或这些状性的组合。例如，最好改变作物(例如甘兰型油菜、棉花、红花、大豆、甜菜、向日葵、小麦、玉米或水稻)种子的氨基酸(例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或总蛋白)、油(例如脂肪酸组成或总油)、碳水化合物(例如单糖或淀粉)、微量元素、类胡萝卜素或维生素含量，优选还包括提高种子收获、贮存或加工品质，并因此提供改良的种子，用于动物饲料或人类食物。在另一个实例中，最好改变转基因植物或转基因植物种子的天然成分的含量，例如以降低具有低水平赖氨酸、甲硫氨酸或色氨酸的蛋白质含量，或提高所需氨基酸或脂肪酸的含量，或降低变应原性蛋白或糖蛋白(例如花生变应原，包括ara h 1；小麦变应原，包括醇溶蛋白和麦谷蛋白；大豆变应原，包括P34变应原、球蛋白、大豆球蛋白和伴大豆球蛋白(conglycinins)或有毒代谢产物(例如木薯中产生氰基的糖苷，茄科成员中的龙葵(solanum)生物碱)的含量。基因抑制的方法
本发明再一方面提供影响基因抑制的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供非天然转基因植物，其包括由本发明非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物、或再生植物的后代植物(如以上标题“转基因植物细胞和植物”下所述)；和(b)在非天然转基因植物中转录重组DNA构建体；其中转录产生在非天然转基因植物中能够抑制至少一个靶基因的RNA，因此相对于在没有转录重组DNA构建体时的表达而言，至少一个靶基因被抑制。
至少一个靶基因是至少一个选自以下的基因：对转基因植物而言是天然的基因，转基因植物中的转基因，以及对转基因植物的病毒、细菌、真菌或无脊椎动物害虫或病原体而言是天然的基因。合适的靶基因如以上标题“靶基因”下所述。在某些实施方案中，至少一个靶基因是单个靶基因。在其它实施方案中，至少一个靶基因是多个靶基因。靶基因抑制包括非特异性抑制，例如组成型表达抑制，以及特异性表达抑制，例如空间特异性基因抑制、时间特异性基因抑制、发育特异性基因抑制或诱导型基因抑制。通过本领域技术人员已知技术，可达到对至少一个靶基因抑制的特异性，例如通过选择具有所需特异性表达图式的启动子，或者通过选择具有所需特异性表达图式的成熟miRNA识别的微RNA识别位点。
通过本领域已知方法进行重组DNA构建体的转录。在某些实施方案中，转录是组成型的即是非特异性的，例如在组成型启动子控制之下。在其它实施方案中，转录在特定空间、时间或诱导条件下发生。例如，重组DNA构建体可包含空间特异性启动子、时间特异性启动子或诱导特异性启动子。在另一个实例中，重组DNA构建体可包含核糖体开关(riboswitch)(可转录为能结合配体的RNA适配子的DNA，和可转录为能调节靶基因表达的调节RNA的DNA，其中调节依赖于调节RNA的构象，而调节RNA的构象受到RNA适配子结合状态的变构影响)，因此允许重组DNA构建体的转录受到RNA适配子结合状态和配体存在(或不存在)的控制。
本发明还提供同时影响至少一个靶基因的基因抑制和至少一个目标基因的基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供非天然转基因植物，其包括由本发明非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物或再生植物的后代植物(如以上标题“转基因植物细胞和植物”下所述)，其中重组DNA构建体还包含用于表达至少一个目标基因的基因表达元件；和(b)在非天然转基因植物中转录重组DNA构建体，其中当重组DNA构建体在非天然转基因植物中转录时，产生能够抑制至少一个靶基因的转录RNA和编码至少一个目标基因的转录RNA，其中相对于在没有所述重组DNA构建体转录时的表达而言，至少一个靶基因被抑制，而且至少一个目标基因同时表达。
目标基因可包含来自任何物种(包括但不限于细菌和病毒等非真核生物；真菌；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如作物、观赏植物和非驯化植物即野生植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；和脊椎动物，例如两栖类、鱼类、鸟类和哺乳动物)的任何编码或非编码序列。由基因表达元件所表达的非编码序列的非限制性实例包括但不限于5’非翻译区、启动子、增强子或其它非编码转录区、3’非翻译区、终止子、内含子、微RNA、微RNA前体DNA序列、小干扰RNA、核糖体或核酶的RNA成分、核仁小RNA、能结合配体的RNA适配子、和其它非编码RNA。目标基因的非限制性实例还包括但不限于可翻译(编码)序列，例如编码转录因子的基因和编码参与目标分子(例如氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖和其它碳水化合物、生物聚合物和次级代谢产物，包括生物碱类、萜类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物)的生物合成或分解代谢的酶的基因。目标基因对于其中本发明重组DNA构建体可转录的细胞(例如植物细胞)而言可以是天然的基因，或者可以是非天然的基因。目标基因可以是标记基因，例如，编码抗生素抗性、抗真菌剂抗性或除草剂抗性的选择标记基因，或编码易于检测的性状(例如在植物细胞中，八氢番茄红素合酶或赋予植物特定色素的其它基因)的标记基因，或编码可检测分子的基因，所述可检测分子例如荧光蛋白、萤光素酶或可分别通过蛋白质或核酸检测方法而检测的独特多肽或核酸“标签”)。选择标记是特别用于鉴定本发明构建体的成功加工中的目标基因。目标基因包括在以上标题“靶基因”下描述为靶基因的那些基因。
由基因表达元件表达的目标基因可包含至少一个选自以下的基因：真核靶基因、非真核靶基因和微RNA前体DNA序列。目标基因可包含单个基因或多个基因(例如多拷贝的单基因、单基因的多个等位基因、或包含来自多个物种的基因的多个基因)。在一个实施方案中，基因表达元件可包含自我水解的肽序列，例如位于编码一种或多种多肽的多个序列之间(参见例如来自病毒、锥虫和细菌等不同物种的2A和“2A样”自我切割序列，公开于Donnelly等(2001)，J.Gen.Virol.，82：1027-1041)。在另一个实施方案中，基因表达元件可包含核糖体“skip”序列，例如位于编码一种或多种多肽的多个序列之间(参见例如口蹄疫病毒(FMDV)2A核糖体“skip”序列，公开于Donnelly等(2001)，J.Gen.Virol.，82：1013-1025)。非生物-胁迫-应答MIRNA
本发明另一方面涉及表现出对非生物胁迫应答的表达图式的miRNA，例如表现出特征为被营养胁迫而调节miRNA的表达图式的miRNA，表现出特征为被水胁迫而调节miRNA的表达图式的miRNA，或表现出特征为被温度胁迫而调节miRNA的表达图式的miRNA。
实施例6-11描述了在作物中鉴定的新的miRNA，其俗名为miRMON18，其表现出特征为在营养胁迫(即缺氮、缺磷或氮磷同时缺乏)下抑制miRNA的表达图式。成熟miRMON18是序列为UUAGAUGACCAUCAGCAAACA的21个核苷酸的miRNA，是从水稻(SEQ ID NO.393)、玉米(SEQ ID NO.3227)和大豆(SEQ ID NO.8742)的小RNA文库中克隆而来的。在水稻(SEQ ID NO.1763)和玉米(SEQ ID NO.3936)中鉴定出前体序列。
本发明的重组DNA构建体在以上标题“重组DNA构建体”下有详细描述，可用于本文所公开的任何miRNA，例如选自以下的成熟miRNA：SEQ ID NO.1-1035、SEQ ID NO.2730-3921、SEQ ID NO.5498-6683、SEQ ID NO.8409-8560、SEQ ID NO8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812-8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819。本发明重组DNA构建体的描述也可一般性用于本发明的实施方案，其可更具体地涉及具有特定表达图式的miRNA，例如本节所描述的营养-胁迫-应答的植物miRNA(例如miRMON18和实施例所述的其它miRNA)。以下描述涉及miRMON18，但也可用于被非生物胁迫调节的其它miRNA，尤其是表现出特征为在营养胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA，表现出特征为在水胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA，或表现出特征为在温度胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA；被非生物胁迫调节的miRNA的非限制性实例包括miR399和miR319。
因此，本发明提供重组DNA构建体，其包含用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA元件选自：(a)可转录为具有选自SEQ ID NO.1763和SEQID NO.3936的miRMON18前体序列折回结构的miRNA前体并加工为具有序列UUAGAUGACCAUCAGCAAACA(SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742)的成熟miRMON18miRNA的DNA元件；(b)可转录为从选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件，其中工程miRNA前体包含修饰的成熟miRMON18miRNA；(c)位于转基因转录单元内或其附近并可转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点可被从选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列获得的成熟miRNA识别；和(d)用于抑制从选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列获得的内源miRNA表达的DNA元件。这些涉及miRMON18的实施方案详述如下。(A)天然miRMON18在非天然条件下的表达。
本发明提供重组DNA构建体，其包含用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA元件包含可转录为具有选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列折回结构的miRNA前体并加工为具有SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742序列的成熟miRMON18miRNA的DNA元件，并且至少一个靶基因是植物内源基因，并且其中重组DNA构建体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。在一个优选的实施方案中，miRNA前体包含miRMON18前体序列的至少90％核苷酸的连续区段。这些构建体尤其可用于以并非天然miRMON18表达图式的表达图式来表达miRMON18(例如在不同组织、在不同时间或以不同表达水平)。
miRMON18前体不必包含选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列中所含有的所有核苷酸，但优选包含选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列的至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％、或至少99％核苷酸的连续区段。在一个优选的实施方案中，miRNA前体包含选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列的至少90％核苷酸的连续区段。无论所使用的具体核苷酸序列如何，miRMON18前体构成与由选自SEQ IDNO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列构成的折回结构相同或近似相同的折回结构并经过一个或多个步骤在体内加工为具有SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742序列的成熟miRMON18miRNA。
在优选的实施方案中，至少一个靶基因是包含至少一个miRMON18识别位点(靶位点)的植物内源基因，而且重组DNA构建体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。在优选的实施方案中，至少一个靶基因是植物内源基因，因此重组DNA构建体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。在优选的实施方案中，重组DNA构建体还包含并非天然miRMON18启动子的启动子。这允许在不能天然表达的空间或时间或诱导条件下表达成熟miRMON18miRNA。例如，重组DNA构建体可设计为包含组成型启动子，因而可组成型表达成熟miRMON18，其表达图式的特征为在营养胁迫(即缺氮、缺磷或氮磷同时缺乏)下抑制miRNA；这将会导致miRMON18靶基因的组成型抑制。在另一个实例中，重组DNA构建体可设计为包含诱导型根特异性启动子，因此当诱导时在根中表达成熟miRMON18；这将会导致在诱导时在根组织对miRMON18靶基因的抑制。可用于该重组DNA构建体的启动子在标题“启动子”下有描述。(B)来自miRMON18的成熟的工程miRNA的表达。
在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件包含可转录为从选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件，其中工程miRNA前体包含修饰的成熟miRMON18miRNA，其中至少一个靶基因是植物内源基因或者所述植物的有害动物或病原体的内源基因，而且其中重组DNA构建体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。
在优选的实施方案中，至少一个靶基因是植物内源基因或者所述植物的有害动物或病原体的内源基因，而且重组DNA构建体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制。合适的靶基因描述于以上标题“靶基因”下。至于“工程”是指选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的天然miRMON18前体序列中的核苷酸被改变(替换、缺失或添加)，因而产生具有与天然miRMON18前体序列折回结构基本相同的折回结构的工程miRNA前体，但其中由工程miRMON18前体加工而来的成熟miRNA具有修饰序列(即不同于天然成熟miRMON18的序列)，所述修饰序列可设计为抑制靶基因，该靶基因不同于被天然miRMON18前体序列天然抑制的靶基因。用于测定天然miRMON18前体序列中核苷酸改变以产生工程miRNA前体的一个通用的非限制性方法描述于以上标题“成熟的工程miRNA的表达”下。(C)转基因的表达和miRMON18识别位点。
在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，并且还包含转基因转录单元，其中用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件包含位于转基因转录单元内或其附近并可转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点可被具有SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742序列的成熟miRMON18miRNA识别，或者被从选自SEQ ID NO.1763和SEQID NO.3936的miRMON18前体序列获得的成熟miRMON18miRNA识别，并且至少一个靶基因包含转基因转录单元所编码的转基因，而且其中重组DNA构建体在植物中的表达导致转基因在成熟miRMON18miRNA并不能天然表达的植物细胞中得以表达。使用以下文献所述的序列互补法则等本领域已知方法，可完成对miRMON18识别位点的预测：Zhang(2005)Nucleic Acids Res.，33：W701-704和Rhoades等(2002)Cell，110：513-520；以下工作实施例中提供了miRMON18识别位点的非限制性实例。
对miRMON18识别位点的预测允许鉴定和证实受到来自天然表达miRMON18前体的成熟miRMON18调节的内源基因；这可用于例如消除或修饰内源基因内的miRMON18识别位点，以便将该基因的表达从由天然调节基因表达的内源miRMON18的调节中解脱出来。在一个实施方案中，可增加miRMON18识别位点与成熟miRMON18之间的错配数(尤其是对应于成熟miRMON18的位置2至13的错配)，以防被内源miRMON18识别并切割。
这些重组DNA构建体尤其可用于根据miRMON18的内源表达而限制的转基因的in planta表达，也就是说，当例如在营养胁迫(即缺氮、缺磷或氮磷同时缺乏)下miRMON18被抑制时，表达转基因。转基因的表达还可通过使用合适启动子来控制。在一个非限制性实例中，本发明的重组DNA构建体可用于在缺氮(或缺磷)条件下在植物根部表达转基因，其中本发明的重组DNA构建体编码：(a)转基因，其处于根特异性启动子控制之下，和(b)miRNA识别位点，其由仅在缺氮(或磷)条件下才被特异性抑制的成熟miRMON18识别。
转基因转录单元包含至少一个转基因和任选额外序列，例如但不限于启动子、启动子增强子、终止子、信使RNA稳定或去稳定序列(参见例如Newman等(1993)Plant Cell，5：701-714；Green(1993)Plant Physiol.，102：1065-1070；和Ohme-Takagi等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：11811-11815)、用于将转基因转录物定位或转运至特定场所(例如线粒体、质体、核仁、过氧化物酶体、内质网等)的序列、或转基因所需加工相关的其它序列。转基因转录单元所编码的转基因可包含任何一个或多个目标基因，包括编码序列、非编码序列或这两者。目标基因可包含“靶基因”下所列出的任何基因，其优选的实例包括转录因子编码基因和酶编码基因的可翻译(编码)序列，所述酶参与目标分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖类和其它碳水化合物、生物聚合物和次级代谢物(包括生物碱类、萜类、聚酮类、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物))的生物合成或分解代谢。(D)对内源或天然miRMON18的抑制。
在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA元件包含用于对从选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列获得的内源成熟miRMON18miRNA表达进行抑制的DNA元件，其中至少一个靶基因是植物内源基因，而且其中该内源基因的表达在发生内源成熟miRMON18miRNA天然表达的植物细胞中被抑制，而且其中重组DNA构建体在细胞中的表达导致内源基因在细胞中的表达。这些构建体尤其可用于抑制天然或内源miRMON18，因此允许具有一个或多个miRMON18识别位点的基因表达。在优选的实施方案中，至少一个靶基因是植物内源基因并包含一个或多个miRMON18识别位点，而且内源基因的表达在发生成熟miRMON18的天然表达的植物细胞中被抑制，因此重组DNA构建体在细胞中的表达导致内源靶基因在细胞中的表达。
用于抑制表达的DNA元件包含以下至少一个：(a)包含至少一个反义DNA区段的DNA，该反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的；(b)包含多拷贝的至少一个反义DNA区段的DNA，该反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的；(c)包含至少一个有义DNA区段的DNA，该有义DNA区段是靶基因的至少一个区段；(d)包含多拷贝的至少一个有义DNA区段的DNA，该有义DNA区段是靶基因的至少一个区段；(e)可转录为RNA并通过形成双链RNA而抑制靶基因的DNA，并且该DNA包含至少一个反义DNA区段和至少一个有义DNA区段，该反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的，而该有义DNA区段是靶基因的至少一个区段；(f)可转录为RNA并通过形成一个双链RNA而抑制靶基因的DNA，并且该DNA包含多个连续反义DNA区段和多个连续有义DNA区段，这些反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的，而这些有义DNA区段是靶基因的至少一个区段；(g)可转录为RNA并通过形成多个双链RNA而抑制靶基因的DNA，并且该DNA包含多个反义DNA区段和多个有义DNA区段，这些反义DNA区段对靶基因的至少一个区段而言是反义的，而这些有义DNA区段是靶基因的至少一个区段，并且其中多个反义DNA区段和多个有义DNA区段以一系列反向重复序列方式排列；(h)包含从植物miRNA获得的核苷酸的DNA；(i)包含siRNA的核苷酸的DNA；(j)可转录为能结合配体的RNA适配子的DNA；和(k)可转录为能结合配体的RNA适配子的DNA，和可转录为能调节靶基因表达的调节RNA的DNA，其中调节依赖于调节RNA的构象，而调节RNA的构象受到RNA适配子结合状态的变构影响。
用于抑制表达的DNA元件在实施例3中进一步描述并如图2和图3所示。通过以下“微RNA诱骗序列”中详述的替代方法可控制miRNA对其靶基因的作用。
在某些实施方案中，重组DNA构建体包含这样的DNA：其设计成可转录为单链RNA或至少部分双链RNA(例如以“相吻茎环”排列)、或可转录为假定二级结构或三维构型(例如靶基因或适配子的反义序列的大环)的RNA，该RNA赋予转录物额外的所需特性，例如稳定性提高、体内半衰期延长或者细胞特异性或组织特异性提高。在一个实例中，间隔区可转录为能连接连续RNA区段第一系列和第二系列的稳定环(参见例如Di Giusto和King(2004)J.Biol.Chem.，279：46483-46489)。在另一个实例中，重组DNA构建体包含可转录为包含RNA适配子(例如可结合细胞特异性配体的适配子)在内的RNA的DNA，允许针对重组RNA双链体的细胞特异性或组织特异性寻靶。(E)miRNA-无应答的转基因，包括miRMON18-无应答的转基因。
也公开并要求保护重组DNA构建体，其包含对给定成熟miRNA无应答的合成miRNA-无应答的转基因序列，其中合成miRNA-无应答的转基因序列是：(a)由天然miRNA-应答序列获得，即通过缺失或修饰天然miRNA-应答序列内被给定成熟miRNA识别的所有天然miRNA识别位点，和(b)不被给定成熟miRNA识别。非限制性实施方案包括重组DNA构建体，其包含对选自以下的成熟miRNA无应答的合成miRNA-无应答的转基因序列：SEQ ID NO.1-1035、SEQ ID NO.2730-3921、SEQ ID NO.5498-6683、SEQ ID NO.8409-8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812-8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或者对从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA无应答：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，其中合成miRNA-无应答的转基因序列是：(a)由天然miRNA-应答序列获得，即通过缺失或修饰天然miRNA-应答序列内被给定成熟miRNA识别的所有天然miRNA识别位点，和(b)不被给定成熟miRNA识别。使用以下文献所述的序列互补法则等本领域已知方法，可完成对识别位点的预测：Zhang(2005)Nucleic Acids Res.，33：W701-704和Rhoades等(2002)Cell，110：513-520。
一个非限制性优选实施方案是重组DNA构建体，其包含合成miRMON18-无应答的转基因序列，其中合成miRMON18-无应答的转基因序列是：(a)由天然miRMON18-应答序列获得，即通过缺失或修饰天然miRMON18-应答序列内的所有天然miRMON18miRNA识别位点(也就是说，缺失或修饰被具有SEQ ID NO.393、SEQID NO.3227或SEQ ID NO.8742序列的成熟miRMON18miRNA识别或者被从选自SEQ ID NO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列获得的成熟miRMON18miRNA识别的任何识别位点)，和(b)不被成熟miRMON18miRNA识别。(F)非生物-胁迫-应答的miRNA启动子，包括miRMON18启动子。
也公开并要求保护重组DNA构建体，其包含表现出特征为被非生物胁迫而调节的表达图式的miRNA启动子，例如，表现出特征为被营养胁迫而调节miRNA的表达图式的miRNA启动子，表现出特征为被水胁迫而调节miRNA的表达图式的miRNA启动子，或表现出特征为被温度胁迫而调节miRNA的表达图式的miRNA启动子。优选的实施方案包括重组DNA构建体，其包含表现出特征为被营养胁迫而调节miRNA的表达图式的miRNA启动子，其中营养胁迫包括选自缺氮和缺磷的至少一种营养缺乏。在一个实施方案中，启动子是被缺氮抑制的miRNA启动子。在另一个实施方案中，启动子是被缺无机磷抑制的miRNA启动子。在又一个实施方案中，启动子是被同时缺氮和缺磷抑制的miRNA启动子。在再一个实施方案中，启动子是被缺氮或缺磷上调的miRNA启动子。
特别优选的实施方案包括重组DNA构建体，其包含表现出特征为在营养胁迫下抑制miRNA的表达图式的miRNA启动子，其中营养胁迫包括选自缺氮和缺磷的至少一种营养缺乏，并且其中启动子包含以下至少一个：(a)在叶组织中表现出在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制的玉米miRNA启动子；(b)在叶组织中表现出在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制的玉米miRNA启动子；(c)具有SEQ ID NO.8804序列的miRMON18启动子；(d)与SEQID NO.8804区段具有至少85％同一性的至少约50个连续核苷酸的片段。也优选这样的实施方案：其中启动子与以下至少一个操作性连接：(a)基因抑制元件，和(b)基因表达元件；优选这些实施方案可用于在植物中表达重组DNA构建体。
非限制性实例包括具有SEQ ID NO.8800的核苷酸211-2172序列的启动子；与SEQ ID NO.8800的核苷酸211-2172具有至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％同一性的至少约50、至少约100、至少约150、至少约200、至少约300、至少约400、或至少500个连续核苷酸的片段，其中所述片段在至少一种植物组织中具有启动子活性，其特征为在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在磷充足条件条件下强表达、而在缺磷条件下抑制；而且至少约50、至少约100、至少约150、至少约200、至少约300、至少约400、或至少500个连续核苷酸的片段与SEQ ID NO.8804具有至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％同一性，其中所述片段在至少一种植物组织中具有启动子活性，其特征为在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在磷充足条件条件下强表达、而在缺磷条件下抑制。(G)非生物-胁迫-应答的转基因植物细胞和植物。
还公开和要求保护非天然转基因植物细胞，其包含该标题(“非生物-胁迫-应答的miRNA”)下所公开的任何重组DNA构建体。一个优选的实施方案包括由包含重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来的非天然转基因植物，该重组DNA构建体包含用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA元件包含可转录为具有选自SEQ ID NO.1763、SEQID NO.3936和SEQ ID NO.8800的miRMON18前体序列折回结构的miRNA前体的DNA元件，其中miRNA前体包含miRMON18前体序列的至少90％核苷酸的连续区段并加工为具有序列UUAGAUGACCAUCAGCAAACA(SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742)的成熟miRMON18miRNA，而且至少一个靶基因是植物内源基因并包含SPX结构域，而且其中重组DNA构建体在植物中的表达导致对至少一个靶基因的抑制；通常重组DNA构建体还包含并非天然miRMON18启动子的启动子，以驱动成熟miRMON18的表达。
另一个优选的实施方案包括由包含重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来的非天然转基因植物，该重组DNA构建体包含用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中至少一个可转录DNA元件包含用于对从选自SEQ ID NO.1763、SEQ ID NO.3936和SEQ ID NO.8800的miRMON18前体序列获得的内源成熟miRMON18miRNA表达进行抑制的DNA元件，其中至少一个靶基因是植物内源基因并包含SPX结构域，而且内源基因的表达在发生内源成熟miRMON18miRNA天然表达的植物细胞中被抑制，而且其中重组DNA构建体在细胞中的表达导致内源基因在细胞中的表达。用于抑制内源成熟miRMON18miRNA表达的合适DNA元件描述于以上标题“对内源或天然miRMON18的抑制”下。微RNA诱骗序列
植物微RNA通过以下方式调节其靶基因：识别并结合靶转录物中几乎完美互补的序列(miRNA识别位点)，再通过RNA酶III酶(例如Agol)切割转录物。在植物中，给定miRNA识别位点与相应成熟miRNA之间的某些错配是不能忍受的，尤其是成熟miRNA位置10和11的错配核苷酸。以5’至3’方向给出成熟miRNA内的位置；为了清楚起见，图7D描绘了miRNA、miR827(SEQ ID NO.8744)和miRMON18(SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742)的实例，带编号的箭头标明成熟miRNA的位置1、10和21；位置10的核苷酸还具有下划线。在成熟miRNA的位置10和11上通常需要给定miRNA识别位点与相应成熟miRNA之间的完美互补。参见例如Franco-Zorrilla等(2007)Nature Genetics，39：1033-1037；和Axtell等(2006)Cell，127：565-577。
植物miRNA的这一特征可用于达到预测“微RNA诱骗序列”的法则，也就是说，该序列可被内源成熟miRNA识别并结合而导致miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间的碱基配对，因而形成因miRNA诱骗序列与成熟miRNA间存在错配而不被切割的抗切割RNA双链体。错配包括规范错配(例如G-A、C-U、C-A)以及G::U摆动配对和得失位(indels)(核苷酸插入或缺失)。一般而言，这些法则定义(1)所需错配，和(2)允许但并非必需的错配。
所需错配包括：(a)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间在内源成熟miRNA位置9、10或11上的至少1个错配，或者，(b)在对应于内源成熟miRNA的位置9、10或11的miRNA诱骗序列的位置上的1、2、3、4或5个插入(即额外核苷酸)。在优选的实施方案中，存在(a)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间在内源成熟miRNA的位置10和/或11上的至少1个错配，或(b)在对应于内源成熟miRNA的位置10和/或11的miRNA诱骗序列的位置上的至少1个插入。
允许但并非必需的错配包括：(a)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间在内源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2个错配，和(b)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间在内源成熟miRNA位置12至最后一位(即21个核苷酸的成熟miRNA的位置21)上的0、1、2或3个错配，其中在内源成熟miRNA位置12至最后一位上的每个错配都邻近至少一个互补碱基对(即使得在内源成熟miRNA位置12至最后一位上有不超过2个连续错配)。在优选的实施方案中，在内源成熟miRNA的位置1、2、3、4、5、6、7和8上不存在错配(即所有都是互补碱基对)。
miRNA诱骗序列可以是任何长度，只要能被内源成熟miRNA识别并结合，形成抗切割的RNA双链体。在优选的实施方案中，miRNA诱骗序列包含约18至约36个核苷酸。特别要求保护的实施方案包括18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30和31个核苷酸的miRNA诱骗序列。在非限制性实例中，具有在成熟miRNA位置10上的4个核苷酸插入的所需错配和在成熟miRNA位置20上的1个核苷酸插入的允许错配的miRNA诱骗序列(对于21个核苷酸的成熟miRNA)总共具有26个核苷酸；具有在成熟miRNA位置11上的5个核苷酸插入的所需错配以及在成熟miRNA位置20上的1个规范错配和在成熟miRNA位置23上的1个核苷酸插入的允许错配的miRNA诱骗序列(对于25个核苷酸的成熟miRNA)总共具有31个核苷酸。
因此，本发明的一个实施方案包括重组DNA构建体，其可转录为包含至少一个miRNA诱骗序列的RNA转录物，该miRNA诱骗序列可被内源成熟miRNA识别并结合、但不切割(例如不被淘金者蛋白(Argonaute)或AGO样蛋白切割)，其中内源miRNA是选自以下的至少一种miRNA：(a)选自以下成熟miRNA的成熟miRNA：SEQID NO.1-1035、SEQ ID NO.2730-3921、SEQ ID NO.5498-6683、SEQ ID NO.8409-8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQID NO.8812-8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或(b)从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ IDNO.8816-8819；而且miRNA诱骗序列包含约19个至约36个连续RNA核苷酸的RNA序列，其中miRNA诱骗序列被内源成熟miRNA识别并结合，导致miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间的碱基配对，因而形成包含以下的抗切割RNA双链体：(a)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一个错配，或在所述miRNA诱骗序列对应于所述内源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一个插入，(b)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2个错配，和(c)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3个错配，其中在所述内源成熟miRNA位置12至最后一位上的每个所述错配都邻近至少一个互补碱基对。
本发明的重组DNA构建体包含至少一个miRNA诱骗序列，并且包含多个miRNA诱骗序列(可以是单miRNA诱骗序列的多拷贝，或不同miRNA诱骗序列的拷贝，或这两者的组合)。在一个实例中，多拷贝的miRNA诱骗序列在重组DNA构建体中串联排列，该设计用于降低相应成熟miRNA的活性。在另一个实例中，通过表达可转录为多个不同miRNA诱骗序列的单个嵌合重组DNA构建体，来降低不同的成熟miRNA的活性。miRNA诱骗序列的表达可被不同启动子驱动，这些启动子包括但不限于组织特异性启动子、细胞特异性启动子、时间特异性启动子、诱导型启动子或组成型启动子，例如在标题“启动子”下描述的任何启动子。miRNA诱骗序列可位于转录物的不同位置。在也可转录为编码序列、非编码序列(例如miRNA)或这两者的重组DNA构建体中，miRNA诱骗序列优选位于内含子内或聚腺苷酸化信号之后，以允许编码序列、非编码序列或这两者的正常转录。
在本发明的另一些实施方案中，类似诱骗序列可用于调节参与双链RNA介导的基因抑制的其它小RNA的活性，包括反式作用小干扰RNA(ta-siRNA)、天然反义转录siRNA(nat-siRNA)和定相小RNA(可参见以下文献：美国专利申请11/897,611，2007年8月31日申请，其通过引用结合到本文中)。基本上采用与预测miRNA诱骗序列相同的法则，来预测这些类似ta-siRNA诱骗序列、nat-siRNA诱骗序列和定相小RNA诱骗序列，并且具有与miRNA诱骗序列类似的用途。
miRNA诱骗序列可以是天然存在的序列或人工序列。在一个实施方案中，至少一个miRNA诱骗序列包含天然存在的miRNA诱骗序列，例如，通过生物信息学而鉴定的内源miRNA诱骗序列。在另一个实施方案中，至少一个miRNA诱骗序列包含合成miRNA诱骗序列，例如，经从头开始设计为结合给定成熟miRNA并形成抗切割RNA双链体的序列。
因此，本发明的一个实施方案是重组DNA构建体，其可转录为包含至少一个miRMON18诱骗序列的RNA转录物，该miRMON18诱骗序列可被内源成熟miRMON18识别并结合、但不切割(例如不被淘金者蛋白(Argonaute)或AGO样蛋白切割)，其中内源miRMON18是选自以下的至少一个：(a)成熟miRMON18，或(b)从植物miRMON18前体序列获得的成熟miRNA；和包含约19个至约36个连续RNA核苷酸的RNA序列的miRMON18诱骗序列，其中miRMON18诱骗序列可被内源成熟miRMON18识别并结合，导致miRMON18诱骗序列与内源成熟miRMON18之间的碱基配对，因而形成包含以下的抗切割RNA双链体：(a)miRNA诱骗序列与内源成熟miRMON18之间在内源成熟miRMON18位置9、10或11上的至少一个错配，或在miRMON18诱骗序列对应于内源成熟miRMON18位置10-11的位置上的至少一个插入，(b)miRMON18诱骗序列与内源成熟miRMON18在内源成熟miRMON18位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2个错配，和(c)miRMON18诱骗序列与内源成熟miRMON18之间在内源成熟miRMON18位置12至最后一位上的0、1、2或3个错配，其中在内源成熟miRMON18位置12至最后一位上的每个错配都邻近至少一个互补碱基对；而且其中至少一个miRMON18诱骗序列被成熟miRMON18miRNA识别并结合、但不切割。在优选的实施方案中，成熟miRMON18具有SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.874的序列，或者是从选自SEQ IDNO.1763和SEQ ID NO.3936的miRMON18前体序列获得的成熟miRNA。本发明还提供在选自缺氮和缺磷的至少一种营养缺乏下提供产量提高的非天然转基因作物的方法，该方法包括在非天然转基因作物中表达可转录为包含至少一个miRMON18诱骗序列的RNA转录物的重组DNA构建体。
本发明的另一个实施方案是重组DNA构建体，其可转录为包含至少一个miRMON18诱骗序列的RNA转录物，该miRMON18诱骗序列可被内源成熟miR399识别并结合、但不切割(例如不被淘金者蛋白或AGO样蛋白切割)，其中内源miR399是选自以下的至少一个：(a)成熟miR399，或(b)从选自SEQ ID NO.8816-8819的miR399前体序列获得的成熟miRNA；而且miR399诱骗序列包含约19个至约36个连续RNA核苷酸的RNA序列，其中miR399诱骗序列被内源成熟miR399识别并结合，导致miR399诱骗序列与内源成熟miR399之间的碱基配对，因而形成包含以下的抗切割RNA双链体：(a)miR399诱骗序列与内源成熟miR399之间在所述内源成熟miR399位置9、10或11上的至少一个错配，或在miR399诱骗序列对应于内源成熟miR399位置10-11的位置上的至少一个插入，(b)miR399诱骗序列与内源成熟miR399之间在内源成熟miR399位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2个错配，和(c)miR399诱骗序列与内源成熟miR399之间在内源成熟miR399位置12至最后一位上的0、1、2或3个错配，其中在内源成熟miR399位置12至最后一位上的每个错配都邻近至少一个互补碱基对；而且其中至少一个miR399诱骗序列被成熟miR399识别并结合、但不切割。在优选的实施方案中，成熟miR399具有SEQ ID NO.8812-8815的序列，或者是从选自SEQ IDNO.8816-8819的miR399前体序列获得的成熟miRNA。本发明还提供在选自缺氮和缺磷的至少一种营养缺乏下提供产量提高的非天然转基因作物的方法，该方法包括在非天然转基因作物中表达可转录为包含至少一个miR399诱骗序列的RNA转录物的重组DNA构建体。
本发明的再一个实施方案是对内源miRNA诱骗序列的抑制，例如通过基因抑制元件(例如在标题“用于抑制表达的DNA元件”下所述)，尤其是被细胞特异性启动子或组织特异性启动子或诱导型启动子驱动。
本文所述的任何这些重组DNA构建体都可通过常用技术来制备，例如在标题“制备和使用重组DNA构建体”下所述并参见工作实施例。重组DNA构建体尤其可用于制备非天然转基因植物细胞、非天然转基因植物和转基因种子，如以下“转基因植物细胞和转基因植物”所述。
包含miRNA诱骗序列的重组DNA构建体可用于提供经工程改造以抑制内源基因的合成miRNA的独特表达图式；这尤其可用于防止由合成miRNA在某些组织中的不想要的表达而引起的不利表型。例如，合成miRNA可用于仅在植物的特定组织中才抑制内源基因，例如通过重组DNA构建体在植物中的表达，该重组DNA构建体包含：(a)驱动合成miRNA表达的组成型启动子，和(b)驱动miRNA诱骗序列表达的组织特异性启动子，该miRNA诱骗序列经设计用于隐蔽合成miRNA。
本发明还提供用于提供改良的作物的方法。本发明一方面包括提供具有至少一个改变的性状的非天然转基因作物的方法，该方法包括在非天然转基因作物中表达可转录为包含至少一个miRNA诱骗序列的RNA转录物的重组DNA构建体，该miRNA诱骗序列被内源成熟miRNA识别并结合、但不切割(例如不被淘金者蛋白或AGO样蛋白切割)，其中内源miRNA是选自以下的至少一种miRNA：(a)选自以下成熟miRNA的成熟miRNA：SEQ ID NO.1-1035、SEQ IDNO.2730-3921、SEQ ID NO.5498-6683、SEQ ID NO.8409-8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812-8815、SEQID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或(b)从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ IDNO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819；而且miRNA诱骗序列包含约19个至约36个连续RNA核苷酸的RNA序列，其中miRNA诱骗序列被内源成熟miRNA识别并结合，导致miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间的碱基配对，因而形成包含以下的抗切割RNA双链体：(a)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一个错配，或在所述miRNA诱骗序列对应于所述内源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一个插入，(b)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2个错配，和(c)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3个错配，其中在所述内源成熟miRNA位置12至最后一位上的每个所述错配都邻近至少一个互补碱基对，因而相对于不表达重组DNA构建体的作物而言，导致非天然转基因作物表现出选自以下的至少一个改变的性状：(i)提高非生物胁迫耐性；(ii)提高生物胁迫耐性；(iii)提高针对植物的有害动物或病原体的抗性；(iv)改变初级代谢产物组成；(v)改变次级代谢产物组成；(vi)改变微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；(vii)提高产量；(viii)提高氮或其它营养物的利用能力；(ix)改变农艺学特性；(x)改变生长或生殖特性；和(xi)提高收获、贮存或加工品质。
另一方面，本发明提供具有至少一个改变的性状的非天然转基因作物的方法，该方法包括在非天然转基因作物中抑制至少一个内源miRNA诱骗序列，该内源miRNA诱骗序列被内源成熟miRNA识别并结合、但不切割(例如不被淘金者蛋白或AGO样蛋白切割)，其中内源miRNA是选自以下的至少一种miRNA：(a)选自以下成熟miRNA的成熟miRNA：SEQ ID NO.1-1035、SEQ ID NO.2730-3921、SEQ ID NO.5498-6683、SEQ ID NO.8409-8560、SEQ ID NO8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812-8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或(b)从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819；而且miRNA诱骗序列包含约19个至约36个连续RNA核苷酸的RNA序列，其中miRNA诱骗序列被内源成熟miRNA识别并结合，导致miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间的碱基配对，因而形成包含以下的抗切割RNA双链体：(a)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一个错配，或在所述miRNA诱骗序列对应于所述内源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一个插入，(b)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2个错配，和(c)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3个错配，其中在所述内源成熟miRNA位置12至最后一位上的每个所述错配都邻近至少一个互补碱基对；因而相对于不表达重组DNA构建体的作物而言，导致非天然转基因作物表现出选自以下的至少一个改变的性状：(i)提高非生物胁迫耐性；(ii)提高生物胁迫耐性；(iii)提高针对植物的有害动物或病原体的抗性；(iv)改变初级代谢产物组成；(v)改变次级代谢产物组成；(vi)改变微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；(vii)提高产量；(viii)提高氮或其它营养物的利用能力；(ix)改变农艺学特性；(x)改变生长或生殖特性；和(xi)提高收获、贮存或加工品质。
可通过包括在非天然转基因作物中表达基因抑制元件(例如在标题“对内源或天然miRNA的抑制”下所述的用于抑制表达的DNA元件)的任何方法或通过任何其它的基因抑制方法，来达到对至少一个内源miRNA诱骗序列的抑制。
在一个非限制性实例中，转基因植物在营养充足条件下过量表达针对miRNA(其在营养充足条件下高水平天然表达而在营养缺乏条件下低水平天然表达)的至少一个miRNA诱骗序列，因而导致植物在营养缺乏下的性能或产量提高，对营养的利用力提高。例如，miRMON18和miR399在缺氮或缺磷条件下低水平表达，而在氮磷充足的条件下高水平表达，因而它们的天然靶基因在缺氮或缺磷条件下被抑制，而在氮磷充足条件下以相对高的水平表达；这导致转基因植物对氮和/或磷的利用力提高。因此，相对于不表达重组DNA构建体的植物而言，过量表达包含至少一个miRMON18诱骗序列(或至少一个miR399诱骗序列)的重组DNA构建体的转基因植物，导致在氮磷充足条件下以较高水平表达miRMON18天然靶基因(或miR399天然靶基因)。在一个非限制性实例中，预期过量表达包含至少一个miRMON18诱骗序列的重组DNA构建体的转基因植物能积累相对高水平的天然miRMON18靶标(例如含有SPX结构域的基因，例如图12所示的基因，如实施例7、9和10所述)。
实施例实施例1
本实施例描述鉴定作物(水稻和玉米)微RNA和它们的前体(折回)结构的方法的非限制性实施方案，用于制备本发明的重组DNA构建体。通过高通量测序(Margulies等(2005)Nature，437：376-380)，从成熟水稻(Oryza sativa cv.Nipponbare)成熟谷粒(一式三份)和秧苗以及从玉米(Zea mays)叶和玉米籽粒(授粉后39天)中克隆若干小(19-25个核苷酸)RNA文库。由此得到的序列用于分别在水稻基因组序列和玉米基因组序列中进行miRNA预测，使用来自先前已表征的miRNA的一组法则，再按照手册指南来消除不良预测的折回结构。与注释tRNA、rRNA、转座子/反转录转座子和其它已知重复序列、以及叶绿体基因组或线粒体基因组完美匹配的小RNA排除在分析之外。
基因组研究学会(Institute for Genome Research)的水稻基因组注释4.0版(公众可得自www.tigr.org)用于预测～310个核苷酸的两个侧翼基因组区段，其中给定的小RNA位于所述区段左端或右端附近，因而得到由280个核苷酸+小RNA+10个核苷酸组成的序列，或由10个核苷酸+小RNA+280个核苷酸组成的序列。按照以下文献所述，用Vienna软件包中的RNAfold程序，预测由此得到的各区段的折回结构：Hofacker等(1994)Monatsh.f.Chemie，125：167-188。为了便于结构预测，各小RNA的假丰度(pseudo-abundance)定为2。
根据从以下文献所述修饰而来的已证实的miRNA前体的特性，来过滤结构：Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.Plant.Biol.，57：19-53。对于水稻miRNA，过滤要求包括：(1)小RNA必须全部位于预测折回(茎环)结构的一个臂内；(2)小RNA与其相反臂中的对应物区段的核苷酸序列必须彼此具有至少75％互补性；和(3)小RNA及其对应物，当形成不完美双链体时，必须不含多于3个核苷酸的对称凸起(bulge)或多于2个核苷酸的不对称凸起。满足以上标准的预测结构还可进一步过滤，即通过选择(1)仅长度为20或21个核苷酸并且5’端碱基为尿嘧啶的小RNA；或(2)测序至少10次的小RNA。最终过滤步骤包括：(1)选择与基因组具有少于23个完美匹配的小RNA，以除去重复元件，和(2)用于预测的区段不含来自负链的小RNA。在当鉴定出多个重叠小RNA的情况下，选择其中最丰富的成员作为代表性的序列。
就玉米miRNA预测而言，预测/过滤步骤是从用于水稻miRNA的步骤修改而来，因为尚不可使用完整玉米基因组。独立分析来自玉米叶和玉米籽粒文库的小RNA，以便使用小RNA丰度来进行miRNA预测。将小RNA作图到Maize Assembled Gene Islands(MAGI第4版)，这是公众可得的装配玉米基因组序列数据库，描述于Fu等(2005)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102：12282-12287。具有来自正负链的小RNA的序列排除在外。采用与水稻所用的相同需要，预测和过滤微RNA折回结构，并且进一步手工检查，以消除具有大(＞100个核苷酸)或高不配对环区的结构。通过过滤而排除的先前表征的miRNA用于表明假阴性。
分析来自水稻的大小范围在19-25个核苷酸的总共260676个独特小RNA中推定的新miRNA。过滤并手工检查后，对应于1072基因座的840个小RNA被鉴定为新的水稻miRNA。过滤后，捕获了miRNA数据库“miRBase”(可得自microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中存在的27个已知miRNA家族和原始独特序列组22个家族。根据已表征miRNA(miRBase)估计的18.5％的假阴性率表明，通过该方法捕获大部分miRNA。从来自玉米籽粒的总共126691个小RNA中，鉴定出对应于MAGI第4.0版玉米基因组序列中的281基因座的116个新的玉米miRNA；同样，从来自玉米叶的总共53103个小RNA中，鉴定出对应于302基因座的79个新的玉米miRNA。水稻miRNA和玉米miRNA以及它们相应的miRNA前体序列、以及各miRNA前体序列中成熟miRNA的核苷酸位置，可按其各自的序列标识号归于下表1：玉米籽粒miRNA(SEQ ID NO.1-116)、玉米叶miRNA(SEQ ID NO.117-195)、水稻miRNA(SEQ IDNO.196-1035)、玉米籽粒miRNA前体序列(SEQ ID NO.1036-1316)、玉米叶miRNA前体序列(SEQ ID NO.1317-1618)和水稻miRNA前体序列(SEQ ID NO.1619-2690)。总共174个预测的新的玉米miRNA(代表528基因组座位)包括与先前在并非玉米的物种中鉴定的已知miRNA相同的9个miRNA直向同源物；这些都列于下表2。表1：玉米和水稻miRNA和miRNA前体
Figure G2007800457886D00741
表1(续)
Figure G2007800457886D00751
表1(续)表1(续)
Figure G2007800457886D00771
表1(续)
Figure G2007800457886D00781
表1(续)
Figure G2007800457886D00791
表1(续)
Figure G2007800457886D00801
表1(续)
Figure G2007800457886D00811
表1(续)
Figure G2007800457886D00821
表1(续)
Figure G2007800457886D00831
表1(续)
Figure G2007800457886D00841
表1(续)
Figure G2007800457886D00851
表1(续)
Figure G2007800457886D00861
表1(续)
Figure G2007800457886D00871
表1(续)表1(续)
Figure G2007800457886D00891
表1(续)
Figure G2007800457886D00901
表2：玉米miRNA
  sRNA ID   SEQ ID NO.   同源物＊   预测在玉米籽粒中   预测在玉米叶中
  159961964425372359793611656811592504320061392730   3479101331613832   ptc-miR390cosa-miR396eptc-miR172fath-miR167dosa-miR528ptc-miR396eptc-miR398csbi-miR164cath-miR171a   yyyyynyyy   yyyyyyyyn
*“ptc”，毛果杨(Populus trichocarpa)；“osa”，水稻(Oryza sativa)；“ath”，拟南芥(Arabidopsis thaliana)；“sbi”，高粱(Sorghum bicolor)实施例2
根据以下文献所述的序列互补法则，使用基因组研究学会(Institute for Genome Research)的水稻基因组注释第4.0版(公众可得自www.tigr.org)，对预测是新的水稻miRNA的靶标的水稻基因进行了预测：Zhang(2005)Nucleic Acids Res.，33：W701-704和Rhoades等(2002)Cell，110：513-520。这些预测靶标是包含至少一个miRNA识别位点的序列，该识别位点被选自以下的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1-1035、SEQ ID NO.2730-3921、SEQ ID NO.5498-6683、SEQ IDNO.8409-8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812-8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或被从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819。表3列出被水稻成熟miRNA(SEQ ID NO.197)识别的miRNA识别位点(SEQ ID NO.2691-2729)的非限制性实例。表3
Figure G2007800457886D00921
表3(续)
Figure G2007800457886D00931
表3(续)3(续)
Figure G2007800457886D00951
实施例3
本实施例描述重组DNA构建体的非限制性实施方案，其中用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件包含用于抑制从选自以下植物miRNA前体序列获得的内源miRNA的表达的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819。更具体地讲，本实施例说明用于抑制靶基因(例如内源miRNA或内源miRNA诱骗序列)表达的DNA元件的非限制性实例。
图2A示意性描绘了用于抑制靶基因(例如内源miRNA)表达的DNA元件的非限制性实例。这些DNA元件包含用于抑制至少一个第一靶基因的至少一个第一基因抑制元件(“GSE”或“GSE1”)，其中第一基因抑制元件嵌入内含子中，其一侧或两侧邻接非蛋白质编码DNA。这些DNA元件利用内含子(在许多实施方案中，优选得自5’非翻译区的内含子或表达增强内含子)来递送基因抑制元件，而无需任何蛋白质编码外显子(编码序列)的存在。DNA元件可任选包含用于抑制至少一个第二靶基因的至少一个第二基因抑制元件(“GSE2”)，用于表达至少一个目标基因(其可以是编码序列或非编码序列或这两者)的至少一个基因表达元件(“GEE”)或这两者。在含有任选基因表达元件的实施方案中，基因表达元件可位于内含子之外(例如与内含子相邻)。在某些实施方案中，含有第一基因抑制元件的内含子是终止子的3’。
为了根据现有技术而更明确地区分本发明的DNA元件(含有至少一个基因抑制元件，其嵌入在一侧或两侧侧接非蛋白质编码DNA的一个内含子中)，图2B示意性描绘了重组DNA构建体的现有技术的实例。这些构建体可含有位于邻近侧接蛋白质编码序列的内含子、或在两个不连续的内含子之间的基因抑制元件(其中基因抑制元件并不包含在这两个不连续内含子的任一个之内)，或可包含含有嵌入在内含子中的基因抑制元件的基因表达元件，该内含子侧接多个外显子(例如包含蛋白质编码序列的外显子)。
图3描绘了用于抑制靶基因(例如内源miRNA)表达的DNA元件的各种非限制性实例，其可用于本发明的重组DNA构建体。当划出一条单链时(图3A至图3E)，这些都按常规以5’至3’(左到右)转录方向来描绘；箭头表明反义序列(箭头指向左)、或有义序列(箭头指向右)。这些DNA元件可包含：包含至少一个反义DNA区段的DNA，该反义DNA区段对至少一个第一靶基因的至少一个区段而言是反义的，或包含多拷贝的至少一个反义DNA区段的DNA，该反义DNA区段对至少一个第一靶基因的至少一个区段而言是反义的(图3A)；包含至少一个有义DNA区段的DNA，该区段是至少一个第一靶基因的至少一个区段，或包含多拷贝的至少一个有义DNA区段的DNA，该有义DNA区段是至少一个第一靶基因的至少一个区段(图3B)；可转录为RNA并通过形成双链RNA而抑制至少一个第一靶基因的DNA，并且该DNA包含至少一个反义DNA区段和至少一个有义DNA区段，该反义DNA区段对至少一个靶基因的至少一个区段而言是反义的，而该有义DNA区段是至少一个第一靶基因的至少一个区段(图3C)；可转录为RNA并通过形成一个双链RNA而抑制至少一个第一靶基因的DNA，并且该DNA包含多个连续反义DNA区段和多个连续有义DNA区段，这些反义DNA区段对至少一个第一靶基因的至少一个区段而言是反义的，而这些有义DNA区段是至少一个第一靶基因的至少一个区段(图3D)；可转录为RNA并通过形成多个双链RNA而抑制至少一个第一靶基因的DNA，并且该DNA包含多个反义DNA区段和多个有义DNA区段，这些反义DNA区段对至少一个第一靶基因的至少一个区段而言是反义的，而这些有义DNA区段是至少一个第一靶基因的至少一个区段，并且其中所述多个反义DNA区段和多个有义DNA区段以一系列反向重复序列方式排列(图3E)；和包含从miRNA获得的核苷酸的DNA、或包含siRNA的核苷酸的DNA(图3F)。
图3F描绘了可由DNA元件的实施方案转录而来的、用于抑制靶基因表达(例如内源miRNA)的双链RNA的各种非限制性排列，用于本发明的重组DNA构建体。当形成这样的双链RNA时，它可抑制一个或多个靶基因，并且可形成一个双链RNA或多个双链RNA、或一个双链RNA“茎”或多个“茎”。当形成多个双链RNA“茎”时，它们可以“锤头”或“三叶草”形式排列。在某些实施方案中，双链茎可形成“假结(pseudoknot)”排列(例如当一个双链茎的间隔区或环RNA形成第二双链茎部分时)；参见例如以下文献中对假结构造的描述：Staple和Butcher(2005)PLoS Biol.，3(6)：e213。间隔DNA(位于dsRNA区之间或邻近dsRNA区)是任选的，但通常包含和一般包含不符合靶基因的DNA(尽管在某些实施方案中可包含靶基因的有义或反义DNA)。间隔DNA可包含以下序列：其可转录为单链RNA或至少部分双链RNA(例如以“相吻茎环”排列)、或可转录为假定二级结构或三维构型(例如靶基因或适配子的反义序列的大环)的RNA，该RNA赋予转录物额外的所需特性，例如稳定性提高、体内半衰期延长或者细胞特异性或组织特异性提高。
用于抑制靶基因表达的DNA元件和方法的其它描述可参见例如美国专利申请公布说明书2006/0200878，其通过引用结合到本文中。实施例4
本实施例描述使用微RNA、微RNA前体、微RNA识别位点和微RNA启动子来调节至少一个靶基因表达的方法的非限制性实施方案。
miRNA或其识别位点的不同潜在用途由miRNA的表达图式来表示。有关给定成熟miRNA的表达的空间或时间分布或诱导性的知识可用于例如设计以空间或时间或诱导型特异性方式来表达的重组构建体。确定成熟miRNA的表达图式的一个非限制性方法是通过分离成熟miRNA(或其前体)并通过用合适探针(即对成熟miRNA或miRNA前体具有特异性的探针)的RNA印迹来分析表达图式。
图4描绘了从不同玉米组织中分离的成熟miRNA的RNA印迹结果的非限制性实施例。将一个探针与来自两个家族(miR156和miR157)的成熟miRNA杂交。各个成熟miRNA在特定细胞或组织中以不同水平表达，例如Zm-miR390在根和成长叶中不表达或仅以低水平表达，而miR156在根、叶和雄花穗(tassel)中表达。因此，例如，包含由组成型启动子驱动的转基因转录单元和被玉米miR390成熟miRNA识别的miRNA识别位点的本发明重组DNA构建体可用于转基因在根和成长叶组织中表达，但不在高水平表达成熟miR390的组织中表达。为了进一步说明本发明的构建体和方法在调控转基因表达中的用途，用报道基因作为转基因本身，或者作为转基因的替代物。例如，当需要报道基因(例如绿色荧光蛋白，GFP)在玉米秆和未成熟穗组织中表达时，将miR156靶位点包含在GFP表达盒中并在稳定的转基因玉米植物中、在CaMV 35S启动子控制之下表达。在强表达miR156的组织(例如根、叶和雄花穗)中，GFP表达被抑制。抑制表型可局限于受抑制组织内非常特殊的细胞类型，而邻近细胞表现出在邻近表达成熟miR156的细胞的GFP的表达或表达梯度。
确定成熟miRNA的表达图式的另一个非限制性方法是通过分析包含成熟miRNA序列的核酸序列的转录概况，例如通过包括以下步骤的通用方法：(a)提供包含茎环区的起始miR序列，例如来自“miRBase”数据库(可得自microrna.sanger.ac.uk/sequences)中的公众可得的miR序列；(b)使用序列分析算法，例如本领域众所周知的BLAST(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.，215：403-410)，鉴定同源或相同序列(例如根据用玉米全基因组DNA制备的微阵列探针组上的专有序列)；和(c)分析步骤(b)中鉴定的同源探针组序列的转录概况并鉴定在所需组织(即雄性或雌性生殖组织)中具有表达图式的miRNA。
优选加上第4步：(d)对于发现具有所需转录概况的同源探针组序列来说，证实对miRNA基因的鉴定，即通过将起始miR序列的茎环序列与探针组序列进行比对，或者对于潜在新的miRNA，确定序列预测能折叠成miRNA的茎环结构特征。还优选使用任选步骤，其中包括针对额外序列数据组(dataset)(而不是探针组序列数据组)的一个或多个BLAST比较(在以上步骤(b)之前)，允许对落入miR基因预测折回区之外的探针进行进一步鉴定；假阳性(例如因为在包含不正确剪接片段重叠群(contigs)的额外序列数据组的匹配所致的假阳)，因其缺乏miRNA特征(例如合适折回结构)而得以鉴定并除去。
图5描绘了探针组序列的转录概况，这些序列用前述段落所述方法鉴定为包含对玉米雄性生殖组织(花粉)具有特异性的表达图式的miRNA前体序列。这些miRNA前体适用于本发明重组DNA构建体，其设计用于在非天然条件下(例如在对miRNA前体而言并非天然启动子的启动子的控制之下)表达天然miRNA(在该实施例中，为花粉特异性miRNA)。这些miRNA前体也可用于提供可经修饰或工程改造以抑制并非天然或内源靶基因的靶基因的“支架(scaffold)”序列。本发明的重组DNA构建体的一个非限制性实例包含用于驱动编码苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫蛋白或蛋白片段(“Bt”)的转基因转录单元表达的强组成型启动子和花粉特异性miRNA的识别位点，导致Bt在除花粉之外的植物组织中强表达。另外，这些miRNA前体的天然启动子可用于任何目标基因的花粉特异性表达。
在一个替代方法中，使用例如以下文献所述的序列互补法则，可鉴定现有(天然或内源)miRNA识别位点：Zhang(2005)Nucleic Acids Res.，33：W701-704和Rhoades  等(2002)Cell，110：513-520。使天然miRNA识别位点充分突变(例如通过化学诱变)，以减少或防止切割(参见Mallory等(2004)Curr.Biol.，14：1035-1046)。因此，可使含有天然miRNA识别位点并具有所需效应(例如叶片或种子大小增加)的基因发生突变，因而其表达水平比当存在未突变天然或内源miRNA识别位点时更高。一个实施方案是用工程同源物替代天然基因，其中天然miRNA已发生突变或者甚至缺失，这样对给定miRNA切割的敏感性更低。
该方法的另一具体实例是在玉米根中基本不表达、但在大多数其它组织表达的成熟miRNA(例如但不限于miRNA162、miRNA164或miRNA390，如图4所示)的一个或多个识别位点包含在重组DNA构建体中，用于以转基因的形式表达苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白或蛋白片段(“Bt”，参见例如以下文献中公开的苏云金芽孢杆菌杀虫序列和方法及其应用：美国专利号6,953,835和美国临时专利申请号60/713,111，2005年8月31日申请，通过引用结合到本文中)，例如在包含表达盒e35S/Bt/hsp17的构建体中。表达盒中包含这些识别位点中的一个或多个，能降低转录物在并非根的大多数组织中的表达，但在根中维持高水平的Bt靶RNA表达，例如最好用于害虫例如玉米根虫的防治。在类似实施方案中，构建体中包含不同miRNA识别位点的组合，以便在一种或多种特定组织中得到所需表达图式。实施例5
本实施例描述作物微RNA及其前体(折回)结构的额外非限制性实施方案，用于制备本发明的重组DNA构建体。通过30个玉米文库的高通量测序(Margulies等(2005)Nature，437：376-380)，总共得到1327933个独特小RNA(长度为20-24个核苷酸)。所得序列用于根据玉米基因组序列来预测玉米微RNA及其前体结构，使用以上实施例1所述的方法。在1576个专有玉米基因组序列中预测共有1192小RNA是新miRNA。玉米miRNA及其相应的miRNA前体、以及各miRNA前体序列中成熟miRNA的核苷酸位置，可按其各自的序列标识号归于下表4：玉米miRNA(SEQ ID NO.2730-3921)和玉米miRNA前体序列(SEQ ID NO.3922-5497)。表4：玉米和水稻miRNA和miRNA前体
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表4(续)
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表4(续)表4(续)
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表4(续)
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表4(续)
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表4(续)
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表4(续)
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表4(续)表4(续)
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表4(续)
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表4(续)
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表4(续)
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表4(续)
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表4(续)
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表4(续)
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实施例5
本实施例描述作物微RNA及其前体(折回)结构的额外非限制性实施方案，用于制备本发明的重组DNA构建体。
自在水胁迫和对照条件下生长的玉米(Zea mays)或大豆(Glycine max)制备小RNA文库(表5)。用从1.0(无影响或对照)至4.0的相对评分系统评价干旱期的大豆；大豆植物各期的实例见图6。由此得到的小RNA序列用于分别根据玉米或大豆基因组序列预测额外的新的微RNA及其前体(折回)结构，使用以上实施例1所述的方法。从玉米中，在1725个玉米基因组序列中预测1186个玉米miRNA，而从大豆中，在181个大豆基因组序列中预测134个大豆miRNA(表6)。这些miRNA及其相应的miRNA前体序列、以及各miRNA前体序列中成熟miRNA的核苷酸位置，可按其各自的序列标识号归于下表6：玉米miRNA(SEQ ID NO.5498-6683)、玉米miRNA前体序列(SEQID NO.6684-8408)、大豆miRNA(SEQ ID NO.8409-8560)和大豆miRNA前体序列(SEQ ID NO.8561-8417)。表5
  文库号   作物   组织   发育期   处理
  42   玉米(Zea mays)   嫩库叶(youngsink leaf)   V8   对照
  43   玉米(Zea mays)   嫩库叶   V8   轻微干旱
  44   玉米(Zea mays)   嫩库叶   V8   对照
  45   玉米(Zea mays)   嫩库叶   V8   严重干旱
  46   玉米(Zea mays)   根   V8   对照
  47   玉米(Zea mays)   根   V8   轻微干旱
  48   玉米(Zea mays)   根   V8   对照
  38   大豆(Glycine max)   幼苗叶   幼苗   对照
39 大豆(Glycine max) 合并幼苗叶 幼苗   干旱，3.0和3.5期合并*
  40   大豆(Glycine max)   根   成熟   对照
41 大豆(Glycine max)   合并根成熟 成熟   干旱，所有1.5至3.5期合并*
*对于自大豆制备的文库39和41，将所示各期的样品合并在一起；大豆干旱期用以下相对评分系统进行评价：1.0＝无影响1.5＝分生组织或1片三小叶枯萎2.0＝2片三小叶枯萎2.5＝所有三小叶都枯萎3.0＝底部三小叶完全干枯易碎3.5＝除顶部一片之外，所有三小叶都完全干枯易碎，顶部三小叶仍然柔软4.0＝所有都完全干枯易碎表6：玉米和大豆miRNA和miRNA前体表6(续)表6(续)
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表6(续)
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表6(续)
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表6(续)
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表6(续)
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表6(续)
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表6(续)
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表6(续)表6(续)
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表6(续)
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表6(续)表6(续)
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表6(续)
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表6(续)
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表6(续)
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表6(续)
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表6(续)
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表6(续)
微RNA及其前体和启动子，尤其是在水充足和水不足(干旱或水胁迫)条件下具有差异表达图式的那些，可用于在经历水胁迫的作物中工程改造所需性状(例如提高产量、提高发芽率)。在对其它非生物或生物胁迫条件具有特异性的表达图式的其它miRNA中也发现类似用途，这类miRNA例如在营养充足和营养不足条件、或者在热胁迫和热非胁迫条件下具有差异表达图式的miRNA。合适方法包括将外源miRNA识别位点引入序列，缺失或修饰序列中的内源miRNA识别位点，工程改造天然miRNA或miRNA前体序列，以便识别并非内源靶序列的序列，以及利用miRNA启动子来提供特定表达图式。实施例6
本实施例描述具有特定表达图式的作物miRNA(miRMON18)的鉴定，所述表达图式的特征为在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制。
按照实施例1和实施例5所述技术，从水稻(Oryza sativacv.Nipponbare)、玉米(Zea mays var.LH244)和大豆(Glycine max var.A3525)的不同组织和发育期克隆小RNA并鉴定推定的miRNA。将各文库的小RNA丰度标准化，并按照转录物/四分之一百万序列(transcripts per quarter million sequence，tpq)来计算。在水稻(SEQ IDNO.393)、玉米(SEQ ID NO.3227)和大豆(SEQ ID NO.8742)小RNA文库中鉴定出具有序列UUAGAUGACCAUCAGCAAACA的推定的成熟miRNA(小RNA编号为370903，已确定俗名为“miRMON18”)。该序列与miRBase中的已知miRNA不匹配。
从水稻基因组中鉴定出miRMON18前体序列为CCAUGAACCUGUUUUGUUGCUGGUCAUCUAGCUACCCGUGCAUGCCUGGAGAUUGGAGAAUAAUUGACGAUGCAGCAGUCGGCUUAUUGGCUCUUGGGCACGCGUGGUUAGAUGACCAUCAGCAAA CAAGUUCGUGAG，(SEQ ID NO.1763，图7B)。从可用的玉米基因组数据中鉴定出另一推定的miRMON18前体序列为CUCCGAACCUGUUUUGUUGGUGGUCAUUUAACCAUGCAUGCUUCGAUCGAUGGAUUGGUGCAUGCAUGGAUUAUUGCAUAGUGUGAUGCAUGUGGCGCAUCAGUGCAUGGUUAGAUGACCAUCAG CAAACAUGUUCUUGAG(SEQ ID NO.3936，图7A)。成熟miRMON18的位置在以上这些前体序列(SEQ ID NO.1763和SEQ IDNO.3936)中用下划线标明。各miRMON18前体预测能形成折回结构(图7A和7B)，成熟miRNA(miRMON18)位于折回结构3’臂内，而预测miRNA*(“miRMON18*”)位于5’臂；这与相对于在单个玉米基因座MRT4577_378723C.3中观察到的miRMON18*而言、丰富得多的成熟miRMON18是一致的。在拟南芥中鉴定出具有序列UGCAACCCUUGAAUGUGUUUGUUGAUUGAUAUCUACACAUGUUGAUCAUCCUUGUGUUGAUCGAUUGGUUUAGAUGACCAUCAA CAAACUCUUUCGUGGUUUUGCA(SEQ ID NO.8743，图7C)的折回结构为序列UUAGAUGACCAUCAACAAACU(miR827，SEQ IDNO.8744)的相对成熟miRNA的前体。在拟南芥中仅观察到低丰度的成熟miR827。这两种成熟miRNA的比对表明，miR827与miRMON18有2个核苷酸的差异(图7D)。miRMON18与miR827间的这2个核苷酸差异看来是在单子叶植物和双子叶植物中是保守的，其中在玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)和甘蔗(Saccharum officinarum，数据未显示)中鉴定出miRMON18，而在双子叶植物(拟南芥)中鉴定出miR827。
RNA印迹证实miRMON18 21聚体在采自正常(非胁迫)条件下生长的植物的至少水稻(谷粒和秧苗)和玉米(籽粒、叶和根)组织样品中表达，见图8A。微RNA前体起源自由RNA聚合酶II产生的聚腺苷酸化转录物，玉米miRMON18前体(SEQ ID NO.3936，对应于探针组A1ZM068928_at)的标准转录概况分析进一步证实在玉米胚乳、愈伤组织和幼苗中表达提高(图8B)，而在该样品其它组织中的表达落入500单位的检测截止阈值以下。
对玉米miRMON18前体(SEQ ID NO.3936)在缺水(干旱)(图9A)、低温(图9B)和缺氮条件下(图9C)生长的植物的玉米组织中的表达进行了分析。miRMON18前体的表达在根、芽、穗、籽粒和雄花穗中相对不受水条件的影响，而相对于水充足条件而言，在缺水条件下在叶和穗丝(silk)中的表达增加(图9A)；表达也相对不受温度的影响(图9B)。然而，miRMON18表达对氮条件高度应答，其中相对于在充足氮(20毫摩尔(mM)硝酸铵)时观察到的表达而言，在氮限制(2毫摩尔(mM)硝酸铵)时观察到约2倍抑制(图9C)。通过对小RNA样品的RNA印迹的磷光体成像定量测定(phosphor image quantification)，证实了这种氮-应答表达图式，在3个时间点显示出对成熟miRMON18 21聚体的平均9.6倍的抑制(图10A)。因此，miRMON18在玉米胚乳和玉米籽粒中显示出总表达增加，而在缺氧诱导的叶中强抑制。
在另一实验中，在水培系统中在充足磷下培养玉米，直到V3期，然后剥夺磷多达3天。在磷剥夺开始后的第1天和第3天采集叶组织样品。在第3天，让植物恢复到磷充足条件，恢复后30分钟和6小时采样。在各时间点从在磷充足条件下持续培养的植物中采集对照样品。图10B描绘了用miRMON18探针分析的RNA印迹结果，证明在该实验中，在叶组织中，玉米miRMON18成熟miRNA在磷充足条件下表现出强表达，而在缺磷条件下表现出抑制。实施例7
本实施例描述具有被作物miRNA(miRMON18)天然调节的miRNA识别位点(miRMON18识别位点)的基因的鉴定，其中表达图式的特征为在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制。
鉴定出成熟miRMON18(UUAGAUGACCAUCAGCAAACA，SEQ ID NO.393，SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742)的推定靶标，其包含SPX(“SYG1/Pho81/XPR1”)结构域家族中的基因进化枝。SPX结构域属于名称为Pfam PF03105的蛋白质家族/结构域，并且发现它是若干蛋白质的N-端的疏水结构域，通常包含约180个残基的一段，其具有35-47个氨基酸的3个较小亚结构域；参见例如Janelia Farms ResearchCampus of the Howard Hughes Medical Institute的Pfam数据库的SPX词条，公众可得自pfam.janelia.org/family？acc＝PF03105。
SPX结构域家族中的大多数蛋白质在其C-端都包含其它保守结构域。例如，SPX结构域家族中的若干蛋白质在其C-端也包含EXS(“ERD1、XPR1和SYG1”)结构域，Pfam PF03124，其可参与蛋白质分选；参见例如pfam.janelia.org/family？acc＝PF03124。其它SPX蛋白包括保守VTC(液泡转运蛋白(vacuolar transporter)陪伴分子2)结构域，Pfam PF09359；参见例如pfam.janelia.org/family？acc＝PF09359。若干SPX蛋白包含保守MFS_1或MFS(“major facilitator superfamily”)结构域，Pfam PF07690，其可参与小的糖和无机盐等小溶质的转运，以应答化学渗透离子梯度；参见pfam.janelia.org/family？acc＝PF07690。SPX结构域可能是转录因子，并且可作为二聚化结构域。
SPX蛋白包含PHO基因所编码的那些，其可参与将无机磷加载到根的木质部；参见例如Wang等(2004)Plant Physiol.，135：400-411，该作者描述了对若干PHO1同源物的鉴定、在这些蛋白质内SPX结构域的保守性、以及PHO1启动子在根、叶、茎或花等维管组织和某些非维管组织中的优势表达。SPX结构域家族中的蛋白质可能参与G-蛋白缔合的信号转导(因此可能是无机磷的感受器)；参见Ticconi和Abel(2004)Trends Plant Sci.，9：548-555。PHO1基因同时包含SPX结构域和EXS结构域。PHO进化枝成员也包含RING结构域(At1g02860和At2g38920)或MFS结构域(At4g22990、At4g11810和At1g63010)；参见Wang等(2004)Plant Physiol.，135：400-411，尤其是图3和图6d。
目前，已报道名称为NLA的基因是在拟南芥中低氮利用率的适应性所需的；参见Peng等(2007)Plant Cell，50：320-337。NLA(“AtNLA”，locus At1g02860)，称为UniProtKB/Swiss-Prot检索号Q2V4F9，具有序列MRT3702_101115C，SEQ ID NO.8745；有关NLA蛋白的注释公众可自beta.uniprot.org/uniprot/Q2V4F9和pfam.janelia.org/protein？id＝Q94C80_ARATH。具有序列SEQ ID NO.8745的拟南芥NLA基因含有SPX结构域、MFS_1结构域和RING结构域，并包含位于核苷酸位置135至155的miR827识别位点(靶)序列TGTTTGTTGATGGTCATCTAA(SEQ ID NO.8746)，其已证实为拟南芥miR827的靶标。NLA编码C3HC4-型环指(RING-finger)泛蛋白连接酶(AT1G02860.1，SEQ ID NO.8747)；该基因若发生突变就会破坏拟南芥对氮限制的适应性。
对AtNLA基因的10个额外克隆进行了测序。克隆1、4和5含有部分AtNLA序列(SEQ ID NO.8748)。克隆2含有缺乏SPX结构域的AtNLA序列(SEQ ID NO.8749)。克隆3含有缺乏RING结构域的AtNLA序列(SEQ ID NO.8750)。克隆6含有具有位于核苷酸位置2142-2162的破坏的miR827识别位点(靶序列)的基因组AtNLA片段(SEQ ID NO.8751)。克隆7含有另一AtNLA序列(At1g63010，SEQ ID NO.8752)。克隆8含有具有位于核苷酸位置2142-2162的破坏的miR827识别位点(靶序列)的另一基因组AtNLA片段(At1g63010，SEQ ID NO.8753)。克隆9含有缺乏SPX结构域的另一AtNLA序列(At1g63010，SEQ ID NO.8754)。克隆10含有缺乏MFS结构域的AtNLA序列(At1g63010，SEQ ID NO.8755)。
大量“实际”cDNA自玉米基因组和cDNA序列装配，描述了miRMON18所靶向的独立基因。这些新的miRMON18靶标(“SPX_MFS_117961287”，来自BAC的GI：117961287)中的第一个具有序列SEQ ID NO.8756并包含核苷酸位置326-328的ATG起始密码子和核苷酸位置2414-2416的TGA终止密码子；由SEQ ID NO.8756编码的最长可读框(翻译框＝2)具有氨基酸序列SEQ ID NO.8757。这第一个新的miRMON18靶基因的一个替代剪接形式是SEQ ID NO.8758(“SPX_MFS_117961287_2”)，其包含核苷酸位置87-89的ATG起始密码子和核苷酸位置1137-1139的TGA终止密码子；由SEQ IDNO.8758编码的最长可读框(翻译框＝3)具有氨基酸序列SEQ ID NO.8759。
这些新的miRMON18靶标中的第二个具有序列SEQID NO.8760(“SPX_MFS2”，来自BAC的GI：118200525)并包含核苷酸位置201-203的ATG起始密码子和核苷酸位置2295-2297的TGA终止密码子；由SEQ ID NO.8760编码的最长可读框(翻译框＝3)具有氨基酸序列SEQ ID NO.8761。这个第二新的miRMON18靶基因的一个替代剪接形式是SEQ ID NO.8762(“SPX_MFS_117961287_2”)，其包含核苷酸位置145-147的ATG起始密码子和核苷酸位置1189-1191的TGA终止密码子；由SEQ IDNO.8762编码的最长可读框(翻译框＝1)具有氨基酸序列SEQ ID NO.8763。
第三个新的miRMON18靶标包含来自EST数据的凹凸(stitched)cDNA序列并具有序列SEQ ID NO.8764(来自BAC的GI：126116193)并在核苷酸位置217-219和1034-1036包含2个可能的ATG起始密码子以及在核苷酸位置2093-2095包含TGA终止密码子。通过同源性从两个可能可读框预测2种蛋白质；第一种蛋白(预测移码为1)含有625个氨基酸并具有序列SEQ ID NO.8765，而第二种蛋白含有353个氨基酸并具有序列SEQ ID NO.8766。
用ClustalW(1.82版)对这些新的玉米miRMON18靶基因所编码的肽进行比对；所得多序列比对见图11，显示出玉米SPX结构域(用下划线序列表示，如果有的话)和玉米MFS结构域(用黑体序列表示)。
自BAC115312385的额外克隆工作证实第一miRMON18靶的序列(“SPX_MFS_117961287”，SEQ ID NO.8756)并产生基因组SPX_MFS2序列SEQ ID NO.8767，其中进一步鉴定出前导序列(用斜体表示)、5’内含子(用下划线表示)、外显子(用大写字母表示)和miRMON18识别位点(位于SEQ ID NO.8767核苷酸2628-2648并用黑体表示)：导序列(用斜体表示)、5’内含子(用下划线表示)、外显子(用大写字母表示)和miRMON18识别位点(位于SEQ ID NO.8767核苷酸2628-2648并用黑体表示)：gttacaaggcaatatttttgtagaataaaatcttaaaggaaactcaactccacgaattggtcacttgcattaaatcatattgtgggtctcttttagttgcatcttaagatggcggcaacaagatttcaagcactttttatctagtgaccgcaatgcactggagataaataagaatccaaatattatttttgataaccttgacactatttaaatcttcttataagtgacgaagtagtttgatcaacaataaaaacgtatagatttcaacattttttgcgattgtaggatatatgttagcaaatattttaagcaaaataatatttttatctataatctctatatggattattctagattttggggaccctatataaaattagctatgagtattaacacttgataatcttgcctagaatgtcttcgatttctgggtctaccactacacctaactgagtttaaccctgcaataaataattaatctcgtgaaatcatttggagattttgactcaatttaaataggtagctactgtgtagttaggttgaaccaggacaccaggtgtaacacgagtcacatatgcatgcatgtgtattgactcaatcggccggcgcacgctatgatggtgctagaaaatgttttatacggctgtgaaaggtgtaacctgtgctgtgtcgcaaacaatatattgtttaactttgtttggccttgaactcctgggggcaaacataagatataaaagatcgatatgcctttcatgattccgtcataatctcgaccgtaattaaggcccgctctatataaacctttaaagcaaattgttagtcatataataatttattagttggattgatgcaacaaataacaactatttatttaagattaactaacttctcagttaaatttagtcactaactattagttttagaggtttggaacatgttataagaacctaaccggtctctcaacgttacaaaagctatcatatttgaacccccgtcatcggagcgcacacgttttattttgttctgttcatgtctatgctgagatactaaaattttgtgcacaagactacaaggacgagagcacctaatgaggtattaatcggttattcaaattccgtaagagttgggggtattggaagagattattagaatttttgacctgttaagatttaaacccacttaatttcttgcaacacatactgcaggtcctcagatagcgaggcgcagtcgcgcagaccgcagagcgccgaatcgtgagaaggatcagaagtgcttgttacttccgtacgggttagagcatctccaacaacgtgacctataaaaatgccctataatttgaaaatgagtatattttatagaatttagggcaccaacaaaacaccccgctccaacagtaaagccccaaatctagattatagggcagcccactacggtgtagtatatttgagtcacttgagagggtgccctatagttttttgacaaaattttatgaaatggagcactgttggagtagtttttcctgtgtagagccctatatttcaatttgaggcactagtttgaggcattgttggagatgctcttacaaatacacggaacatatttgggttcagcaacagggacggacggacggcgcgccgtgttctacagacttgccgtcgctgcttctgcatctgttcgaaaaccgtaacccccgtgcaccgctggtcagtagtcgtcgtttcgtttcgtttcgtttcgtcgcggcgatcttcgaaccgatgaagcgtggcacttggctggttggtggtggtacgccgggccagaaggtgacctgcctcgatccgaataccatgcatcgatctgtgcacgtgcctgttctcttcctactccgattaccgatagtccgggccgggaaaaagagcgcgaagccagatctgaccactaggggtctgtttggttggtttctctcgccaacctggctgtgtgagccaggatcactggagcctggctctgaagatacgaccaatctgctcgtatctggtgagcctggcccaaggtgctttaaggatcgtgcgagtctggattcaaatctacatgcagacaaccaaacacagagctcgcacgcgcatagcttggctcatagcaaccaaacagcagctacccgcatcccgcgacgcaagcacgcgcagatgcaggcaaccaaacagaccccaggtgatccaggtcgtcgaatgttccacgcgaaccgcagccgcgagtgccgtctccggctccgccacaggtagagctcagagcagaaaatgctccagccacctgtctctcttcttcctccttcctgccctgcacgcggctataagtacccaccgccatctcactttgcccagcagcacggcagtagctgcgccattgcacgcctccggccggcggctgcttgtcttgctgcttctgccgcacatccgtgatccgtacgtcgtcacctcaccactcacgcacaagcacaaagagcgttaatttcttgctggagattctattctatttctatggcgtgtccctgatcgaatcctaaatcctaaacctctgtggtgcactgcagggcagaaggtgcttcgttcgttgcaggcctggcgccacgccgtaccgtgcaagcg
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对于SPX基因，搜索TIGR转录物数据库中的SPX:MFS结构域编码序列。这些基因的鉴定可支持高等植物中存在保守调节途径。通过搜索起始密码子上游5’非翻译区中与miRMON18互补的保守序列，发现推定的miRMON18靶位点。在葡萄(Vitis vinifera)中鉴定出推定的mirMON18靶(TA40434_29760)，其序列为SEQ ID NO.8768，其中miRMON18识别位点位于SEQ ID NO.8768的核苷酸323-343。同样，在莴苣(Lactuca sativa)中鉴定出miRMON18靶标(TA5852_4236)，其序列为SEQ ID NO.8769，其中miRMON18识别位点位于SEQ ID NO.8769的核苷酸64-84。
在玉米、水稻和大豆等各种不同物种中鉴定出含有直向SPX-结构域的基因，包括NLA样基因。当序列可用时，在5’UTR中鉴定出推定的miRMON18或miR827靶序列(识别位点)。图12描绘了为已鉴定SPX基因而构建的系统树，通过ClustalW比对氨基酸序列，用10000次迭代测定自引(bootstrap)值；通过实验证实的含有预测miRMON18识别位点(在来自并非拟南芥的物种的基因中)或预测miR827识别位点(在来自拟南芥的基因中)的基因用黑体表示。除了含有SPX结构域和RING结构域的拟南芥NLA基因AtNLA(MRT3702_101115C，At1g02860，SEQ ID NO.8770，其包含在核苷酸135-155的miR827识别位点并编码序列为SEQ ID NO.8771的蛋白质)之外，系统树中的基因还有玉米NLA样基因ZmNLA(SEQ ID NO.8772，编码序列为SEQ ID NO.8773的蛋白质)、大豆NLA样基因GmNLA(SEQ ID NO.8774，编码序列为SEQ ID NO.8775的蛋白质)、水稻NLA样基因OsNLA(SEQ ID NO.8776，编码序列为SEQ ID NO.8777的蛋白质)；拟南芥序列At1g63010(SEQ ID NO.8778，其包含核苷酸153-173的miR827识别位点并编码序列为SEQ ID NO.8779的蛋白质)、AT2g26660(SEQ ID NO.8780，编码序列为SEQ ID NO.8781的蛋白质)和AT5g20150(SEQ ID NO.8782，编码序列为SEQ IDNO.8783的蛋白质)；水稻序列Os02g45520(SEQ ID NO.8784，其包含核苷酸395-415的miRMON18识别位点，并编码序列为SEQ IDNO.8785的蛋白质)和Os04g48390(SEQ ID NO.8786，其包含核苷酸334-354的miRMON18识别位点，并编码序列为SEQ ID NO.8787的蛋白质)；和玉米序列MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788，其包含核苷酸1660-1680的miRMON18识别位点，并编码序列为SEQ IDNO.8789的蛋白质)、MRT4577_51705C(SEQ ID NO.8790，编码序列为SEQ ID NO.8791的蛋白质)、MRT4577_375264C(SEQ ID NO.8792，编码序列为SEQ ID NO.8793的蛋白质)、MRT4577_46983C(SEQ ID NO.8794，编码序列为SEQ ID NO.8795的蛋白质)、MRT4577_340665C(SEQ ID NO.8796，编码序列为SEQ ID NO.8797的蛋白质)和MRT4577_319995C(SEQ ID NO.8798，编码序列为SEQID NO.8799的蛋白质)。
几千碱基对的序列是玉米和水稻NLA样编码序列的可用上游，其中从初步测序工作中未鉴定出miRMON18靶位点。根据表达概况分析数据，看来ZmNLA(SEQ ID NO.8772)RNA水平对氮利用率不应答。相比之下，图12所示的SPX-MFS结构域进化枝(SEQID NO.8788、SEQ ID NO.8786、SEQ ID NO.8784和SEQ ID NO.8778)在充足氮条件下、在玉米和拟南芥中受到抑制，并且预测会受到miRMON18的调节；该进化枝中的序列含有经实验证实的miRMON18(或miR827)识别位点。树的顶端所显示的SPX进化枝(SEQ ID NO.8798、SEQ ID NO.8796、SEQ ID NO.8794、SEQ ID NO.8782、SEQID NO.8780、SEQ ID NO.8792和SEQ ID NO.8790)(图12)仅含有可识别的SPX结构域，被有限氮抑制，并且也可预测会受到miRMON18的调节。在玉米中，对应于进化枝1的基因(SEQ ID NO.8798、SEQ ID NO.8796、SEQ ID NO.8794、SEQ ID NO.8792和SEQID NO.8780)的TxP数据与miRMON18前体表达相关；miRMON18前体的表达和进化枝1基因的表达都在氮充足条件下被上调。SPX-MFS进化枝2中的基因(SEQ ID NO.8788、SEQ ID NO.8786、SEQ ID NO.8784和SEQ ID NO.8778)受到miRMON18的直接抑制，而进化枝1基因缺乏直接靶标，表明miRMON18可通过抑制进化枝2基因而间接调节进化枝1基因表达。实施例8
本实施例描述具有特定表达图式的作物miRNA(miRMON18)启动子的鉴定，所述表达图式的特征为在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制。
玉米miRMON18基因的进一步表征涉及miRMON18前体(SEQ ID NO.3936)与cDNA文库和微阵列元件的BLAST匹配，和来自玉米(Zea mays var.LH244)的miRMON18基因组序列(SEQ IDNO.8800)的反向PCR  克隆，使用基于来自克隆LIB5025-018-A1-XP1-B6的cDNA序列(SEQ ID NO.8801)的反向PCR引物。该miRMON18基因组序列(SEQ ID NO.8800)具有图13所示的注释序列，其中以大写字母给出SEQ ID NO.8800的核苷酸2173-2788的miRMON18转录物。该基因组序列也包含以小写字母表示的SEQ ID NO.8800的核苷酸211-2172的miRMON18启动子元件、以小写字母表示的SEQ ID NO.8800的核苷酸2173-2308的前导元件、以下划线加上小写字母表示的SEQ ID NO.8800的核苷酸2144-2147的规范TATA盒(末端是转录起始位点上游的25个核苷酸)、以下划线加上大写字母表示的SEQ ID NO.8800的核苷酸2419-2439的成熟miRMON18、以及以下划线加上大写字母表示的SEQ ID NO.8800的核苷酸2322-2341的miRMON18*。
为了证实miRMON18启动子的表达图式，在二元载体中构建了2个重组DNA构建体(SEQ ID NO.8802和SEQ ID NO.8803)，其包含驱动新霉素磷酸转移酶II(nptII)作为选择标记的水稻肌动蛋白1启动子。质粒pMON111971中的构建体(SEQ ID NO.8802)依次包含miRMON18启动子(SEQ ID NO.8804)和驱动GUS基因(SEQ ID NO.8806)表达的miRMON18前导序列(SEQ ID NO.8805)、和NOS终止序列(SEQ ID NO.8807)。质粒pMON111967中的构建体(SEQ ID NO.8803)含有DnaK内含子(SEQ ID NO.8808)并且还依次包含miRMON18启动子(SEQ ID NO.8804)、miRMON18前导序列(SEQ ID NO.8805)、GUS基因(SEQ ID NO.8806)和NOS终止序列(SEQ ID NO.8807)。用标题“制备和使用非天然转基因植物细胞和非天然转基因植物”下所述的标准技术，用土壤杆菌介导的转化和抗生素选择，将载体转化到玉米中。在氮充足和磷充足条件下，在转化玉米叶中观察到强miRMON18-启动子驱动的GUS的表达。在缺氮或缺磷条件下在转化玉米叶中GUS表达被抑制。
用于驱动转基因以天然miRMON18基因的表达图式而表达的(即在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制)替代miRMON18启动子序列包含具有SEQ ID NO.8800的核苷酸211-2172的序列的启动子；与SEQ ID NO.8800的核苷酸211-2172具有至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％同一性的至少约50、至少约100、至少约150、至少约200、至少约300、至少约400、或至少500个连续核苷酸的片段，其中所述片段在至少一种植物组织中具有启动子活性，其特征是在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制；和与SEQ ID NO.8804具有至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％同一性的至少约50、至少约100、至少约150、至少约200、至少约300、至少约400、或至少500个连续核苷酸的片段，其中所述片段在至少一种植物组织中具有启动子活性，其特征是在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制。通过常规技术证实对替代启动子序列的鉴定，例如证实TATA盒在启动子序列内和证实在至少一种植物组织中的启动子活性(例如通过测定重组DNA构建体包含启动子驱动的报道基因(例如GUS或萤光素酶)在瞬时表达实验或在稳定转化的植物中的表达)。实施例9
本实施例描述作物miRNA(miRMON18)识别位点的鉴定，其中表达图式的特征为在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制，或者在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制。也公开了miRNA、miRNA启动子和miRNA识别位点的使用方法。非限制性实例包括在缺氮或缺磷条件下提供产量提高的非天然转基因作物的方法，即通过在转基因作物中表达包含miRMON18-无应答的转基因的重组DNA构建体，以及在缺氮或缺磷条件下提供产量提高的非天然转基因作物的方法，即通过在转基因作物中表达包含miRMON18识别位点的重组DNA构建体包含miRMON18识别位点，所述位点已经添加到正常miRMON18-无应答的基因的序列中。
使用以下文献所述的序列互补法则等本领域已知方法，可完成对识别位点的预测：Zhang(2005)Nucleic Acids Res.，33：W701-704和Rhoades等(2002)Cell，110：513-520。经实验证实预测miRNA识别位点的一个非限制性方法是称为RNA连接酶介导的cDNA 5’端快速扩增(“5’RLM-RACE”)的技术，其鉴定miRNA切割模式；参见例如Kasschau等(2003)Dev.Cell，4：205-217和Llave等(2002)Science，297：2053-2056。该方法依赖于RNA衔接分子与切割位点5’端的连接并且依赖于RNA酶III酶(包括Agol)留下的5’磷酸。对所得PCR产物进行了测序，与预测miRNA在相对于miRNA 5’端而言的核苷酸10和11之间的切割位点比对的克隆的相对数量提供对miRNA活性的估计值。图14描绘了对水稻序列Os02g45520(SEQ ID NO.8784)和Os04g48390(SEQ ID NO.8786)和玉米序列MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)的miRMON18的预测切割。5’RLM-RACE测定的结果用于证实在水稻序列Os02g45520(SEQ IDNO.8784)和Os04g48390(SEQ ID NO.8786)中的预测miRMON18识别位点(靶位点)切割，其中对24个克隆中的3个和16个克隆中的13个分别测序，发现具有预测切割模式(在相对于miRMON18 5’端而言的核苷酸10和11)。5’-RACE实验也部分证实了玉米SPX_MFS2序列SEQ ID NO.8767中的miRMON18识别位点(数据未显示)。
实验证实了预测miRNA识别位点的另一非限制性方法是检查推定靶标的表达水平，例如通过转录概况分析实验。可以预测，当不表达miRNA时，真正的miRNA靶标的表达水平是高的，而当表达miRNA时，miRNA靶标的表达水平则是低的。因此，当不表达miRMON18时(即在缺氮或缺磷条件下)，miRMON18靶标预测具有较高表达，而当表达miRMON18时(即在氮磷充足条件下)，miRMON18靶标预测表达则较低。图15B描绘了含有预测miRMON18识别位点的玉米序列MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)的表达概况。MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)不受水利用率或温度的影响(在水充足或干旱条件下、或者在低温或常温下，观察到转录物水平没有大的差异；数据未显示)，但在缺氮条件下比在氮充足条件下表现出更高的表达水平，即表达图式与miRMON18的相反，如图15A所示(另见图9和图10)，表明MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)的确受到miRMON18的调节。
这些数据证实，miRMON18调节含有保守SPX结构域的基因。miRMON18的表达在缺氮或缺磷时被抑制，允许在这样的条件下表达内源miRMON18-调节的基因。对成熟miRMON18miRNA或miRMON18靶标(至少在miRMON18识别位点包含的基因)表达的操作可用于改变植物对缺氮或缺磷的应答。
本发明一方面包括在缺氮或缺磷条件下提供产量提高的非天然转基因作物的方法，即通过在转基因作物中表达miRMON18-无应答的转基因。一个实施方案是在非天然转基因作物中表达包含合成miRMON18-无应答的转基因序列的重组DNA构建体，其中合成miRMON18-无应答的转基因序列是：(a)由天然miRMON18-应答序列获得，即通过缺失或修饰天然miRMON18-应答序列内的所有天然miRMON18miRNA识别位点(也就是说，消除或改变天然miRMON18-应答序列的核苷酸)，所述识别位点被具有SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742序列的成熟miRMON18miRNA识别，或被从选自SEQ ID NO.1763、SEQ ID NO.3936和SEQID NO.8800的miRMON18前体序列获得的成熟miRMON18miRNA识别，和(b)不被成熟miRMON18miRNA识别。在一个非限制性实例中，在图12所示的任何含保守SPX-结构域的基因中的miRMON18识别位点都缺失或修饰，使得修饰SPX基因不被内源成熟miRMON18(SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742)识别和结合，而且因此从miRMON18的调节中解脱出来并因此也从缺氮或缺磷的影响中解脱出来。在一个非限制性具体实例中，玉米基因MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)可从miRMON18调节中解脱出来并因此通过表达修饰MRT4577_36529C基因而从缺氮或缺磷的影响中解脱出来，其中miRMON18识别位点在其5’非翻译区(SEQ IDNO.8788的核苷酸1660-1680)已经缺失或修饰，使得修饰MRT4577_36529C基因不被成熟miRMON18(SEQ ID NO.393、SEQID NO.3227或SEQ ID NO.8742)识别和结合。修饰miRMON18-无应答的MRT4577_36529C用组成型启动子或组织特异性启动子在玉米中表达，在氮充足和磷充足条件下提高营养摄取和利用并导致在正常条件下、优选在缺氮或缺磷条件下使产量提高。
或者，miRMON18识别位点经工程改造成为正常miRMON18-无应答-基因，其在氮充足条件下被抑制，而在缺氮条件时表达；这是一个有用的方法，例如用氮转运基因，其在氮或磷限制条件下具有增加的表现或产量，而在非限制条件下表达时则没有益处。实施例10
可用于根据对miRMON18或SPX基因表达的操作而提高氮或磷利用的方法和重组DNA构建体的额外非限制性实例如下所述。
(A)在限制条件下调节SPX基因表达以提高氮利用。在该实施方案中，经工程改造而在5’UTR缺乏miRMON18识别位点(或在拟南芥中为miR827识别位点)的含有SPX-结构域的基因在植物中表达。将SPX基因从内源miRMON18(或在拟南芥中为miR827)调节中解脱出来，提供在氮或磷充足条件下对营养利用率的适应性，并导致产量提高。SPX-MFS进化枝(SEQ ID NO.8788、SEQ ID NO.8786、SEQ ID NO.8784和SEQ ID NO.8778)(图12)表达提高的一个想要的结果就是，在氮或磷充足条件期间，通过在库(sink)组织中增加营养利用率，在至少一种植物组织(例如叶、茎秆、根或种子)中提高蛋白质含量。在拟南芥中评价了几种载体(参见表7)，以模拟SPX基因的功能。
在植物中上调AtNLA(At1g02860，其含有SPX-RING结构域，SEQ ID NO.8745)的预测表型对低氮或低磷条件而言是组成型适应性的并提高植物对营养的总体运输和利用；在SPX-RING进化枝(SEQ ID NO.8772、SEQ ID NO.8770、SEQ ID NO.8774和SEQ IDNO.8776)中有关基因的上调预测也具有类似表型(图12)。载体编号1至5是嵌合转录物，其包含非靶向5’非翻译区和3’非翻译区和AtNLA编码区(SEQ ID NO.8745)；载体编号6包含基因组AtNLA(SEQ IDNO.8745)片段，其包含自内源AtNLA启动子至终止序列的序列(以防止异位表达)，但其中天然miR827识别位点已缺失或修饰，以防止被成熟miR827识别。
上调SPX-MFS进化枝基因(SEQ ID NO.8788、SEQ IDNO.8786、SEQ ID NO.8784和SEQ ID NO.8778)(图12)的预测表型是增加营养(尤其是氮和/或磷)运输，尤其是从来源到库(sink)组织，导致产量增加。载体编号7、9和10是嵌合转录物，其包含非靶向5’非翻译区和3’非翻译区和At1g63010编码区(SEQ ID NO.8778)；载体编号8包含基因组At1g63010(SEQ ID NO.8778)片段，其包含自内源At1g63010启动子至终止序列的序列(以防止异位表达)，但其中天然miR827识别位点已缺失或修饰，以防止被成熟miR827识别；载体编号11是嵌合转录物，其包含非靶向5’非翻译区和3’非翻译区和Os04g48390编码区(SEQ ID NO.8786)；载体编号12包含基因组Os04g48390(SEQ ID NO.8786)片段，其包含自内源Os04g48390启动子至终止序列的序列(以防止异位表达)，但其中天然miRMON18识别位点已缺失或修饰，以防止被成熟miRMON18(或在拟南芥中为成熟miR827)识别。
通过MRT4577_319995C(SEQ ID NO.8798)的表达，用载体13-15(表7)，评价了未分类功能、但预测被低氮利用率阻遏的SPX进化枝基因的上调效应。
类似表达实验在玉米中进行。构建包含具有保守SPX结构域的基因(参见图12)的载体(表7)并转化玉米。载体变异体包括含SPX基因的基因组序列的载体和含SPX基因克隆的、受天然启动子驱动的cDNA的载体。在非限制性实例中，载体16-18使用来自MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)的编码序列，并具有破坏的miRMON18识别位点，允许在仅可表达天然启动子的充足氮条件下表达转基因。也会制备仅表达来自MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)的MFS结构域的第三构建体(其代表缺乏SPX的天然替代剪接同种型)并在玉米中测试氮的同化。表7
  载体编号   构建体＊   预测表达图式
  1   35S：AtNLA   组成型
  2   缺乏SPX结构域的35S：AtNLA   组成型
  3   缺乏RING结构域的35S：AtNLA   组成型
  4   FDA/PPDK：AtNLA   叶特异性
  5   RCc3：AtNLA   根特异性
  6   AtNLA启动子：AtNLA，具有破坏的miR827识别位点   天然AtNLA表达
  7   35S：At1g63010   组成型
  8   At1g63010启动子：At1g63010，具有破坏的miR827识别位点   天然At1g63010表达
  9   缺乏SPX结构域的35S：At1g63010   组成型
  10   缺乏MFS结构域的35S：At1g63010   组成型
  载体编号   构建体＊   预测表达图式
  11   35S：Os04g48390   组成型
  12   Os04g48390启动子：Os04g48390，具有破坏的miRMON18识别位点
  13   35S：MRT4577_319995C   组成型
  14   FDA/PPDK：MRT4577_319995C   叶特异性
  15   RCc3：MRT4577_319995C   根特异性
  16   启动子ZmSPXMFS：ZmSPXMFScDNA：终止子ZmSPXMFS
  17   启动子ZmSPXMFS：ZmSPXMFSgDNA：终止子ZmSPXMFS
  18   启动子ZmSPXMFS：ZmMFS cDNA：终止子ZmSPXMFS
*35S，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子；FDA，果糖二磷酸醛缩酶启动子(维管束鞘(bundle sheath)启动子)；PPDK，丙酮酸正磷酸二激酶启动子(叶肉细胞启动子)；RCc3，水稻RCc3基因启动子(根特异性启动子)
(B)在充足氮条件下使用MIRMON18启动子的基因表 达。在该实施方案中，miRMON18启动子用于消除在限制氮条件下表达转基因所得到的不想要的表型(非正常型(off-types))。例如，当氮不限制时，天冬酰胺合成酶的表达产生想要的高蛋白表型。在限制氮条件下，过量表达天冬酰胺合成酶引起产量减少。由MIRMON18启动子驱动的天冬酰胺合成酶的表达在充足氮利用率下得到高蛋白表型，但在限制氮条件下，转基因被关掉以防止产量惩罚(penalty)。构建含以下部分的载体：玉米miRMON18启动子(SEQ ID NO.8804)、玉米miRMON18前导序列(SEQ ID NO.8805)和与天冬酰胺合成酶基因融合的miRMON18折回结构。天冬酰胺合成酶基因的非限制性实例包括大豆(Glycine max)天冬酰胺合成酶(SEQ ID NO.8809)、Galdieriasulphuraria天冬酰胺合成酶(SEQ ID NO.8810)和玉米(Zea mays)天冬酰胺合成酶(SEQ ID NO.8811)。用这些载体转化玉米，然后在限制氮和充足氮条件下，在所得转基因玉米植物中评价产量和蛋白质品质。
(C)在限制氮条件下使用miRMON18识别位点序列的 基因抑制。该实施方案的非限制性实例是包含转基因转录单元和外源miRMON18识别位点的重组DNA构建体，其中重组DNA构建体在植物中表达，导致转基因的表达，当不表达成熟miRMON18miRNA时。高等植物中含有SPX-结构域的基因的5’UTR赋予在充足氮条件下通过内源成熟miRMON18或miR827的调节而抑制mRNA。在本发明的一个非限制性实施方案中，由miRMON18或miR827调节SPX基因的5’UTR，例如但不限于AtNLA(SEQ ID NO.8770)、At1g63010(SEQ ID NO.8778)、Os02g45520(SEQ ID NO.8784)、Os04g48390(SEQ ID NO.8786)和MRT4577_36529C(SEQ ID NO.8788)，都掺入到转基因表达盒的前导序列中。这导致在充足氮条件下对转基因的抑制，无论所用的启动子序列如何，以消除与未调节的转基因表达相关的非正常型(off-types)。在一个优选的实施方案中，将miRMON18或miR827识别位点的切割位点上存在的保守4个核苷酸的序列AUG(G/U)变为GUGG，以防止不想要的起始，同时保留对成熟miRNA的碱基配对。或者，将合成miRMON18或miR827识别位点掺入到非翻译区中或编码区内，而不改变蛋白质功能，从而在充足氮条件下赋予抑制。
在另一实例中，将Os04g48390(SEQ ID NO.8786)的5’UTR与由组成型启动子驱动的GUS融合；构建含有内源水稻序列的一种形式(其中存在于miRMON18切割位点上的AUG已修饰为GUG)和另一形式(其中在miRMON18切割位点上的AUG已修饰为GUG)。也评价了将串联(2个或更多)合成miRMON18识别位点引入到3’UTR的第三构建体。在不同营养(氮或磷)条件下生长的转化玉米植物和不同组织中评价这些载体的GUS表达。
(D)MIRMON18异位表达限制SPX基因表达。在该实施方案中，miRMON18(或在拟南芥中为miR827)表达是由组成型启动子或组织特异性启动子驱动的，导致对所有miRMON18-调节的(或miR827调节的)基因(例如保守SPX基因)的抑制。一个非限制性实例包含载体pMON107261(图16)，其包含CaMV 35S启动子，驱动玉米miRMON18转录物(例如SEQ ID NO.8800的核苷酸2173-2788)的表达。评价用该载体转化的转基因玉米和拟南芥植物的表型，并选择在氮或磷限制条件下表现出改良性状(例如产量增加)的植物。实施例11
本实施例描述重组DNA构建体，其可转录为包含至少一个miRNA诱骗序列的RNA转录物，所述miRNA诱骗序列被内源成熟miRNA识别并结合，但不切割。在本发明的一个优选的实施方案中，内源成熟miRNA是对营养胁迫应答的miRNA-例如成熟miRNA，其表达可受到营养缺乏条件的上调或下调，相对于营养充足条件下的表达而言。更具体地讲，本实施例描述对营养胁迫应答的成熟miRNA(miR827、miRMON18和miR399)的miRNA诱骗序列。
实施例6-10描述表现出以下表达图式的2种miRNA即miR827(SEQ ID NO.8744)和miRMON18(SEQ ID NO.393、SEQID NO.3227或SEQ ID NO.8742)，其表达图式的特征为营养胁迫对miRNA的调节(例如在缺氮、缺磷或氮磷同时缺乏条件下抑制miRNA)。另一miRNA即在拟南芥中鉴定的miR399具有序列UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUG(SEQ ID NO.8812)；通过小RNA测序，在玉米(SEQ ID NO.8813)水稻(SEQ ID NO.8814)和大豆(SEQID NO.8815)中鉴定出相同miRNA。发现玉米miR399基因可应答氮利用率。从专有cDNA数据组中鉴定出玉米miR399前体，其包含具有序列SEQ ID NO.8816的Zm-miR399cDNA序列(MRT4577_22484C.8)，其在SEQ ID NO.8816的核苷酸71-175含有Zm-miR399前体(SEQ ID NO.8817)；并包含具有序列SEQ ID NO.8818的另一Zm-miR399cDNA序列(MRT4577_22487C.6)，其在SEQ ID NO.8818的核苷酸136-330含有Zm-miR399前体(SEQ ID NO.8819)。玉米miR399前体的折回结构见图17A；图17B描绘了用对应于MRT4577_22487C.6(SEQ ID NO.8818)的探针A1ZM033468_at的转录概况分析实验结果，这些结果表明Zm-miR399pri-miRNA(SEQ ID NO.8817)在缺氮条件下被抑制(黑色条柱)，而在氮充足条件下表达(白色条柱)。
在拟南芥中，已经报道miR399能应答无机磷利用率并抑制基因进化枝，这些基因包含拟南芥PHO2基因(At2g33770，编码E2结合酶(conjugase))和来自各种植物的推定PHO2直向同源物。无机磷剥夺可诱导miR399的表达；miR399在磷充分供应条件下过量表达可阻遏PHO2的表达并导致叶中的高磷浓度。参见Fujii等(2005)Curr.Biol.，15：2038-2043；Chiou等(2006)Plant Cell，18：412-421；Aung等(2006)Plant Physiol..141：1000-1011；和Bari等(2006)Plant Physiol.，141：988-999。
在拟南芥IPS1转录物和基因的Mt4-TPSI家族的其它成员中发现的一个保守的23个核苷酸的基序据报道对miR399具有序列互补性，除了对应于成熟miR399的位置10和11的错配环之外，这可阻止miR399：IPS1双链体的切割；参见Franco-Zorrilla等(2007)Nature Genetics，39：1033-1037。也含有对应于成熟miRNA位置10和11的错配的一个类似的非切割序列据报道用于miR390；参见Axtell等(2006)Cell，127：565-577。
开发了用于预测内源“微RNA诱骗序列”的法则，该序列可被内源成熟miRNA识别并结合，导致miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间的碱基配对，因而形成因miRNA诱骗序列与成熟miRNA间存在错配而不被切割的抗切割RNA双链体。一般而言，这些法则定义(1)所需错配，和(2)允许但并非必需的错配。错配包括规范错配(例如G-A、C-U、C-A)以及G::U摆动配对和得失位(indels)(核苷酸插入或缺失)。
所需错配包括：(a)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间在内源成熟miRNA位置9、10或11上的至少1个错配，或者，(b)在对应于内源成熟miRNA的位置9、10或11的miRNA诱骗序列的位置上的1、2、3、4或5个插入(即额外核苷酸)。在优选的实施方案中，存在(a)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间在内源成熟miRNA的位置10和/或11上的至少1个错配，或(b)在对应于内源成熟miRNA的位置10和/或11的miRNA诱骗序列的位置上的至少1个插入。
允许但并非必需的错配包括：(a)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间在内源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2个错配，和(b)miRNA诱骗序列与内源成熟miRNA之间在内源成熟miRNA位置12至最后一位(即21个核苷酸的成熟miRNA的位置21)上的0、1、2或3个错配，其中在内源成熟miRNA位置12至最后一位上的每个错配都邻近至少一个互补碱基对(即使得在内源成熟miRNA位置12至最后一位上有不超过2个连续错配)。在优选的实施方案中，在内源成熟miRNA的位置1、2、3、4、5、6、7和8上不存在错配(即所有都是互补碱基对)。
这些法则可用于从专有cDNA数据组中鉴定出大量含有内源miRNA诱骗序列的玉米序列或大豆序列。表8提供针对miRMON18(SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742)的玉米(Zea mays)内源miRNA诱骗序列；miRNA诱骗序列中的错配在miRNA与miRNA诱骗序列之间的比对中用下划线表示。表8
  SEQIDNO. miRMON18诱骗序列   玉米cDNA名称和SEQ ID NO.(编码miRNA诱骗序列在cDNA中的核苷酸位置)   以3’至5’方向(上方)表示的miRMON18与以5’至3’方向(下方)表示的miRNA诱骗序列之间的比对
  8820   AGGUUGCUGAUGAAGUCAUCUAA   MRT4577_321885C.1(SEQ ID NO.8821)(182-204)   ACAAACGACUAC--CAGUAGAUUAGGUUGCUGAUGAAGUCAUCUAA
  8822   UCUUUGCAGAGUGUCAUCUAA   MRT4577_531852C.2(SEQ ID NO.8823)(198-218)   ACAAACGACUACCAGUAGAUUUCUUUGCAGAGUGUCAUCUAA
  8824   UGUUUGAUAGAGAUCAUCUAA   MRT4577_606578C.1(SEQ ID NO.8825)(65-85)   ACAAACGACUACCAGUAGAUUUGUUUGAUAGAGAUCAUCUAA
表9提供针对miR399(SEQ ID NO.8812、SEQ ID NO.8813、SEQ ID NO.8814或SEQ ID NO.8815)的玉米(Zea mays)内源miRNA诱骗序列；miRNA诱骗序列中的错配在miRNA与miRNA诱骗序列之间的比对中用下划线表示。表9
  SEQIDNO. miR399诱骗序列   玉米cDNA名称和SEQ ID NO.(编码miRNA诱骗序列在cDNA中的核苷酸位置)   以3’至5’方向(上方)表示的miR399与以5’至3’方向(下方)表示的miRNA诱骗序列之间的比对
  8826   UAGGGCAACUUGUAUCCUUUGGCA   MRT4577_47862C.7(SEQ ID NO.8827)(699-722)   GUCCCGUUGAG---AGGAAACCGUUAGGGCAACUUGUAUCCUUUGGCA
  8828   CAGGGCAAGUUGAAUCCUUUGGCA   MRT4577_36567C.8(SEQ ID NO.8829)(746-769)   GUCCCGUUGAG---AGGAAACCGUCAGGGCAAGUUGAAUCCUUUGGCA
  8830   UAGGGCAACUUGUAUCCUUUGGCA   MRT4577_521786C.1(SEQ IDNO.8831)(156-179)   GUCCCGUUGAG---AGGAAACCGUUAGGGCAACUUGUAUCCUUUGGCA
  8832   UAGGGCACCUUGUCUCCUUUGGCA   MRT4577_135578C.1(SEQ ID NO.8833)(185-208)   GUCCCGUUGU---GAGGAAACCGUUAGGGCACCUUGUCUCCUUUGGCA
在2个cDNA序列(SEQ ID NO.8831和SEQ ID NO.8833)的负链中鉴定出微RNA miR399诱骗序列。表9提供的cDNA序列的6框翻译分析没有显示任何长可读框，对这些相同序列进行BLAST搜索，在公共数据库中也没有鉴定出任何蛋白质，表明这些基因可能是非编码序列。miR399诱骗序列的玉米cDNA序列的比对见图18，其中共有序列为SEQ ID NO.8834，并且显示出至少两组基因含有miR399诱骗序列：第一组含有密切相关基因MRT4577_47862C.7(SEQ ID NO.8827)、MRT4577_521786C.1(SEQ ID NO.8831)和MRT4577_135578C.1(SEQ ID NO.8833)，而第二组含有MRT4577_36567C.8(SEQ ID NO.8829)。在含有miR399诱骗序列(SEQ ID NO.8827、SEQ ID NO.8831和SEQ ID NO.8833)的第一组玉米基因的miRNA诱骗序列与拟南芥IPS1(AT3G09922.1)miR399“模拟”位点(由Franco-Zorrilla等报道，Franco-Zorrilla等(2007)NatureGenetics，39：1033-1037)之间仅有1个核苷酸差异；SEQ ID NO.8826、SEQ ID NO.8830和SEQ ID NO.8832的位置12上的保守G在拟南芥miR399“模拟”位点中被C取代。然而，玉米基因(SEQ ID NO.8827、SEQ ID NO.8831和SEQ ID NO.8833)与拟南芥IPS1(AT3G09922.1)基因之间的同源性局限于miRNA诱骗序列位点。
表10提供针对miR399(SEQ ID NO.8812、SEQ ID NO.8813、SEQ ID NO.8814或SEQ ID NO.8815)的大豆(Glycine max)内源miRNA诱骗序列；miRNA诱骗序列中的错配在miRNA与miRNA诱骗序列之间的比对中用下划线表示。转录概况分析数据用于比较内源miRNA诱骗cDNA序列和相应miRNA前体的表达；探针组包括A1GM035741_at(对应于SEQ ID NO.8836)、A1GM069937_at(对应于SEQ ID NO.8838)、A1GM074873_at(对应于SEQ ID NO.8840)、A1GM031412_at(对应于SEQ ID NO.8842)和A1GM053788_at(对应于SEQ ID NO.8844)。表10
  SEQIDNO. miR399诱骗序列   玉米cDNA名称和SEQIDNO.(编码miRNA诱骗序列在cDNA中的核苷酸位置)   以3’至5’方向(上方)表示的miR399与以5’至3’方向(下方)表示的miRNA诱骗序列之间的比对
  8835   UAGGGCAACUUCGAUCCUUUGGCA   MRT3847_238967C.1(SEQIDN0.8836)(390-413)   GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUuagggcaacuucgauccuuuggca
  8837   UAGGGCAACUUCUAUCCUUUGGCA   MRT3847_241832C.1(SEQ ID NO.8838)(393-416)   GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUuagggcaacuucuaucCuuuggca
  8839   AAGGGCAACUUCAAUCCUUUGGCA   MRT3847_336885C.1(SEQ ID NO.8840)(96-119)   GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUaagggcaacuucaauccuuuggca
  8841   AAGGGCAACUUCCAUCCUUUGGCA   MRT3847_217257C.2(SEQ ID NO.8842)(179-202)   GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUaagggcaacuuccauccuuuggca
  8843   AAGGGCAACUUCCAUCCUUUGGCA   MRT3847_236871C.3(SEQ ID NO.8844)(238-261)   GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUaagggcaacuuccauccuuuggca
转录概况分析实验用于比较玉米内源miR399诱骗cDNA序列和相应的玉米miR399前体在不同氮条件下的表达。组1miR399诱骗基因MRT4577_47862C.7(SEQ ID NO.8827)在缺氮条件下在玉米叶中表现出约2倍下调(图19A)；组2miR399诱骗基因MRT4577_36567C.8(SEQ ID NO.8829)在缺氮条件下在玉米叶中表现出至少10倍以上的更明显下调(图19B)。通过RNA印迹对成熟miR399(图19C)和miR399诱骗序列MRT4577_47862C.7(SEQ ID NO.8827)(图19D)的表达测定，证实这些结果。用来自低氮(2毫摩尔)或高氮(20毫摩尔)下生长的玉米V6叶的5微克总RNA/泳道，进行RNA印迹，同样检测成熟21个核苷酸的miR399(图19C)和miR399诱骗序列MRT4577_47862C.7(SEQ ID NO.8827)(图19D，主要条带在约600bp)的印迹。玉米miR399诱骗序列在氮充足条件下更高表达水平反映出玉米miR399前体在氮充足条件下更高表达水平(图17B)。
类似转录概况分析实验用于比较玉米内源miR399诱骗cDNA序列和相应的玉米miR399前体在不同温度条件下的表达。组2miR399诱骗基因MRT4577_36567C.8(SEQ ID NO.8829)在氮充足条件下在玉米叶中表现出至少10倍以上的高表达，尤其是在白天时间里(图20A)。这同样的基因当长期低温后在根(图20B)和芽(图20C)中表现出至少2倍的下调。
也将内源miR399诱骗cDNA序列在玉米和大豆的不同组织中的表达进行比较。图21A描绘了以下序列的表达水平：组1玉米miR399诱骗序列SEQ ID NO.8827(MRT4577_47862C，代表为探针A1ZM005814_at和A1ZM005813_s_at)和组2玉米miR399诱骗序列SEQ ID NO.8829(MRT4577_36567C，代表为探针A1ZM048024_at)、以及玉米pri-miR399序列SEQ ID NO.8818(MRT4577_22487C.6，代表为探针A1ZM033468_at)。图21B描绘了以下序列的表达水平：大豆miR399诱骗序列SEQ ID NO.8842(MRT3847_217257C.2，代表为探针A1GM031412_at)、SEQ ID NO.8844(MRT3847_236871C.2，代表为探针A1GM053788_at)、SEQ IDNO.8836(MRT3847_238967C.1，代表为探针A1GM035741_at)和SEQ ID NO.8838(MRT3847_241832C.1，代表为探针A1GM069937_at)。
这些数据证实在包括玉米和大豆在内的作物中的新的氮-应答表达图式，用于成熟miR399(和miR399前体)以及内源miR399诱骗序列。miR399的各种用途包括过量表达成熟miR399(例如通过过量表达pri-miR399序列)，表达设计用于抑制并非天然成熟miR399所天然靶向基因的基因的工程miR399，表达处于miR399启动子控制之下的转基因(编码序列或非编码序列或这两者)，表达添加或除去miR399识别位点的转基因，过量表达miR399诱骗序列，以及抑制内源miR399诱骗序列。
表11提供针对miR319，UUGGACUGAAAGGAGCUCCU(SEQ ID NO.8845)的大豆(Glycinemax)和玉米(Zea mays)内源miRNA诱骗序列，所述miR319已在大量植物物种(包括拟南芥、水稻、玉米和大豆)中鉴定出来(参见公众可得的miRBase中的实例，microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences/query.pl？terms＝miR319)；miRNA诱骗序列中的错配在miRNA与miRNA诱骗序列的比对中用下划线表示。图22A描述了在不同大豆组织中大豆内源miR319诱骗SEQ ID NO.8847(MRT3847_41831C.6，代表为探针A1GM001017_at)的转录概况分析数据；图22B描述了不同玉米组织中玉米内源miR319诱骗SEQ ID NO.8849(MRT4577_577703C.1，代表为探针A1ZM012886_s_at)的转录概况分析数据。表11
  SEQIDNO. miR319诱骗序列   cDNA名称和SEQ IDNO.(编码miRNA诱骗序列在cDNA中的核苷酸位置)   以3’至5’方向(上方)表示的miR319与以5’至3’方向(下方)表示的miRNA诱骗序列之间的比对
  8846   GGGAGUUUCUACCUCCAGUCCAA   MRT3847_41831C.6(SEQ ID NO.8847)(545-567)   UCCUCGAGGA---AAGUCAGGUUgggaguuucuaccuccaguccaa
  8848   GGGAGCGCCAAUCAGUCCAA   MRT4577_577703C.1(SEQ ID NO.8849)(751-770)   UCCUCGAGGAAAGUCAGGUUgggagcgccaaaucaguccaa
由miR319调节的靶基因是参与叶发育的TCP基因和参与花发育的MYB基因。本发明的一个实施方案是通过抑制内源成熟miR319在转基因植物中的转录来改变植物的叶或花结构或发育模式，或通过miR319诱骗序列在转基因植物中的过量表达而改变内源miR319活性。
在再一个实施例中，miR398b(SEQ ID NO.8850)已经显示出调节CSD1和CSD2(铜/锌过氧化物歧化酶)的表达；参见Sunkar等(2006)Plant Cell，18：2051-2065。过氧化物歧化酶有助于通过将O2转化为H2O2而净化活性氧中间体(ROS)并能减少由过氧化物或过氧化物来源的ROS引起的潜在损伤。miR398被氧化胁迫轻微下调并被Cu利用率强下调；参见Yamasaki等(2007)J.Biol.Chem.，282：16369-16378。本发明的一个实施方案包括在氧化胁迫-诱导型启动子的控制下表达包含miR398b诱骗序列(例如SEQ ID NO.8851-8852)的嵌合转录物，导致在胁迫条件下对miR398b活性的进一步抑制并提高CSD1和CSD2的蓄积和胁迫保护作用。
按照以上所公开的内容所述，可制备和使用本文所公开和要求保护的所有材料与方法，而无需过多的实验。尽管根据优选的实施方案和说明性的实施例已经描述了本发明的材料与方法，但对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的构思、精神和范围的条件下，可以对本文所述的材料与方法进行修改。本领域技术人员显而易见的所有这些类似替换和修改都视为落入所附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和构思之内。

Claims (18)

1.一种重组DNA构建体，所述构建体包含：
(a)合成miRMON18-无应答的转基因序列，其中所述合成miRMON18-无应答的转基因序列是：
(i)由天然miRMON18-应答序列获得，即通过缺失或修饰所述天然miRMON18-应答序列内的所有天然miRMON18 miRNA识别位点，和
(ii)不被具有序列SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ IDNO.8742的成熟miRMON18 miRNA识别；或
(b)合成miRNA-无应答的转基因序列，其中所述合成miRNA-无应答的转基因序列是：
(i)由天然miRNA-应答序列获得，即通过缺失或修饰所述天然miRNA-应答序列内被至少一个选自以下的特定成熟miRNA识别的所有天然miRNA识别位点：SEQ ID NO.1-1035、SEQ ID NO.2730-3921、SEQ ID NO.5498-6683、SEQ ID NO.8409-8560、SEQ ID NO8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812-8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，和
(ii)不被所述至少一个特定成熟miRNA识别；或
(c)合成miR399-无应答的转基因序列，其中所述合成miR399-无应答的转基因序列是：
(i)由天然miR399-应答序列获得，即通过缺失或修饰所述天然miR399-应答序列内的所有天然miR399识别位点，和
(ii)不被成熟miR399 miRNA识别；或
(d)合成miR319-无应答的转基因序列，其中所述合成miR399-无应答的转基因序列是：
(i)由天然miR319-应答序列获得，即通过缺失或修饰所述天然miR319-应答序列内的所有天然miR319 miRNA识别位点，和
(ii)不被成熟miR319 miRNA识别。
2.一种重组DNA构建体，所述构建体包含用于调节至少一个靶基因表达的至少一个可转录DNA元件，其中所述至少一个可转录DNA元件选自：
(a)(i)转录为具有选自以下植物miRNA前体序列折回结构的miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ IDNO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，其中所述miRNA前体包含所述植物miRNA前体序列的至少90％核苷酸的连续区段，而且所述重组DNA构建体任选还包含并非所述miRNA前体序列天然启动子的启动子；或(ii)转录为具有选自以下植物miRNA前体序列折回结构的miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，其中所述miRNA前体包含所述植物前体miRNA序列的至少90％核苷酸的连续区段，而且所述至少一个靶基因是植物内源基因，而且所述重组DNA构建体任选还包含并非所述miRNA前体序列天然启动子的启动子，而且其中所述重组DNA构建体在所述植物中的表达导致对所述至少一个靶基因的抑制；
(b)(i)转录为具有miRMON18前体序列折回结构的miRNA前体并加工为成熟miRMON18 miRNA的DNA元件，而且所述重组DNA构建体任选还包含并非所述miRMON18前体序列天然启动子的启动子；或(ii)转录为具有miRMON18前体序列折回结构的miRNA前体并加工为成熟miRMON18 miRNA的DNA元件，而且所述至少一个靶基因是植物内源基因，而且所述重组DNA构建体任选还包含并非所述miRMON18前体序列天然启动子的启动子，而且其中所述重组DNA构建体在所述植物中的表达导致对所述至少一个靶基因的抑制；
(c)(i)转录为从选自以下植物miRNA前体序列的植物miRNA前体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ IDNO.8816-8819，其中所述工程miRNA前体包含修饰的成熟miRNA；或(ii)转录为从选自以下植物miRNA前体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ IDNO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，其中所述工程miRNA前体包含修饰的成熟miRNA，其中所述至少一个靶基因是植物内源基因或者所述植物的有害动物或病原体的内源基因，而且其中所述重组DNA构建体在所述植物中的表达导致对所述至少一个靶基因的抑制；
(d)(i)转录为从miRMON18前体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件，其中所述工程miRNA前体包含修饰的成熟miRMON18 miRNA；或(ii)转录为从miRMON18前体序列折回结构获得的工程miRNA前体的DNA元件，其中所述工程miRNA前体包含修饰的成熟miRMON18 miRNA，其中所述至少一个靶基因是植物内源基因或者所述植物的有害动物或病原体的内源基因，而且其中所述重组DNA构建体在所述植物中的表达导致对所述至少一个靶基因的抑制；
(e)(i)位于转基因转录单元内或其附近并转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点被选自以下的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1-1035、SEQ ID NO.2730-3921、SEQID NO.5498-6683、SEQ ID NO.8409-8560、SEQ ID NO 8742、SEQID NO.8744、SEQ ID NO.8812-8815、SEQ ID NO.8845和SEQ IDNO.8850，或者被从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819；或(ii)位于转基因转录单元内或其附近并转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点被选自以下的成熟miRNA识别：SEQ ID NO.1-1035、SEQ ID NO.2730-3921、SEQ ID NO.5498-6683、SEQ ID NO.8409-8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812-8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850，或者被从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA识别：SEQID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，并且所述至少一个靶基因包含由所述转基因转录单元编码的转基因，而且其中所述重组DNA构建体在植物中的表达导致所述转基因在并非天然表达所述成熟miRNA的所述植物的细胞中表达；
(f)(i)位于转基因转录单元内或其附近并转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点被成熟miRMON18miRNA或从miRMON18前体序列获得的成熟miRNA识别；或(ii)位于转基因转录单元内或其附近并转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点被成熟miRMON18 miRNA或从miRMON18前体序列获得的成熟miRNA识别，并且所述至少一个靶基因包含由所述转基因转录单元编码的转基因，而且其中所述重组DNA构建体在植物中的表达导致所述转基因在并非天然表达所述成熟miRMON18 miRNA的所述植物的细胞中表达；
(g)(i)用于抑制从选自以下植物miRNA前体序列获得的内源miRNA表达的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ IDNO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819；或(ii)用于抑制从选自以下植物miRNA前体序列获得的内源miRNA表达的DNA元件：SEQ ID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819，其中所述至少一个靶基因是植物内源基因，而且所述内源基因的表达在发生所述内源miRNA天然表达的所述植物细胞中受到抑制，而且其中所述重组DNA构建体在所述细胞中的表达导致所述内源基因在所述细胞中表达；和
(h)(i)用于抑制从miRMON18前体序列获得的内源成熟miRMON18 miRNA表达的DNA元件，所述至少一个靶基因是植物内源基因，而且所述内源基因的表达在发生所述内源成熟miRMON18miRNA天然表达的所述植物细胞中受到抑制，而且其中所述重组DNA构建体在所述细胞中的表达导致所述内源基因在所述细胞中表达；或(ii)用于抑制从miRMON18前体序列获得的内源成熟miRMON18 miRNA表达的DNA元件，其中所述至少一个靶基因是植物内源基因，而且所述内源基因的表达在发生所述内源成熟miRMON18 miRNA天然表达的所述植物细胞中受到抑制，而且其中所述重组DNA构建体在所述细胞中的表达导致所述内源基因在所述细胞中表达。
3.一种包含启动子的重组DNA构建体，所述启动子选自：
(a)表现出特征为受到非生物胁迫调节的表达图式的miRNA启动子；
(b)表现出特征为受到营养胁迫调节的表达图式的miRNA启动子，其中所述营养胁迫包括选自缺氮和缺磷的至少一种营养缺乏；
(c)在叶组织中表现出在氮充足条件下强表达、而在缺氮条件下抑制的玉米miRNA启动子；
(d)在叶组织中表现出在磷充足条件下强表达、而在缺磷条件下抑制的玉米miRNA启动子；
(e)具有序列SEQ ID NO.8804的miRMON18启动子；和
(f)与SEQ ID NO.8804区段具有至少85％同一性的至少约50个连续核苷酸的片段；
其中所述启动子与基因抑制元件和基因表达元件中的至少一个操作性连接。
4.权利要求4的重组DNA构建体，其中所述启动子至少与天冬酰胺合成酶基因的编码区操作性连接。
5.一种重组DNA构建体，所述构建体转录为包含至少一个miRNA诱骗序列的RNA转录物，所述诱骗序列被内源成熟miRNA识别并结合、但不切割，其中
所述内源miRNA是选自以下的至少一种miRNA：
(a)选自以下成熟miRNA的成熟miRNA：SEQ ID NO.1-1035、SEQ ID NO.2730-3921、SEQ ID NO.5498-6683、SEQ ID NO.8409-8560、SEQ ID NO 8742、SEQ ID NO.8744、SEQ ID NO.8812-8815、SEQ ID NO.8845和SEQ ID NO.8850；或
(b)从选自以下植物miRNA前体序列获得的成熟miRNA：SEQID NO.1036-2690、SEQ ID NO.3922-5497、SEQ ID NO.6684-8408、SEQ ID NO.8561-8417、SEQ ID NO.8743、SEQ ID NO.8800和SEQ ID NO.8816-8819；和
所述miRNA诱骗序列包含约19个至约36个连续RNA核苷酸的RNA序列，其中
所述miRNA诱骗序列被所述内源成熟miRNA识别并结合，导致所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间的碱基配对，因而形成包含以下的抗切割RNA双链体：
(a)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一个错配，或在所述miRNA诱骗序列对应于所述内源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一个插入，
(b)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2个错配，和
(c)所述miRNA诱骗序列与所述内源成熟miRNA之间在所述内源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3个错配，其中在所述内源成熟miRNA位置12至最后一位上的每个所述错配都邻近至少一个互补碱基对。
6.权利要求5的重组DNA构建体，其中所述至少一个miRNA诱骗序列包含：(a)天然存在的miRNA诱骗序列，或(b)合成miRNA诱骗序列，或(c)天然存在的miRNA诱骗序列和合成miRNA诱骗序列两者。
7.权利要求5的重组DNA构建体，其中所述至少一个miRNA诱骗序列被选自以下的至少一种miRNA识别并结合、但不切割：
(a)具有序列SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ ID NO.8742的成熟miRMON18 miRNA或者从选自SEQ ID NO.1763、SEQID NO.3936和SEQ ID NO.8800的miRMON18前体序列获得的成熟miRNA；
(b)具有序列SEQ ID NO.8815、SEQ ID NO.8816、SEQ ID NO.8817或SEQ ID NO.8818的成熟miR399或者从选自SEQ ID NO.8819、SEQ ID NO.8820、SEQ ID NO.8821和SEQ ID NO.8822的miR399前体序列获得的成熟miRNA；和
(c)具有序列SEQ ID NO.8845的成熟miR319。
8.一种非天然转基因植物细胞，所述细胞包含权利要求1-7中任一项的重组DNA构建体。
9.一种非天然转基因植物，所述植物包括由权利要求8的非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物，或由权利要求8的非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物的后代植物，其中相对于缺乏所述重组DNA构建体的植物而言，所述非天然转基因植物具有选自以下性状的至少一个改变的性状：
(b)提高非生物胁迫耐性；
(c)提高生物胁迫耐性；
(d)提高针对所述植物的有害动物或病原体的抗性；
(e)改变初级代谢产物组成；
(f)改变次级代谢产物组成；
(g)改变微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；
(h)提高产量；
(i)提高氮或其它营养物的利用能力；
(j)改变农艺学特性；
(k)改变生长或生殖特性；和
(l)提高收获、贮存或加工品质。
10.一种影响基因抑制的方法，所述方法包括：
(a)提供非天然转基因植物，所述植物包括由包含权利要求2的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物，或者由包含权利要求2的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物的后代植物；和
(b)在所述非天然转基因植物中转录所述重组DNA构建体；
其中所述转录产生能够在所述非天然转基因植物中抑制所述至少一个靶基因的RNA，
因此相对于在没有所述重组DNA构建体转录时的表达而言，至少一个靶基因被抑制。
11.权利要求10的方法，其中所述至少一个靶基因是选自以下的至少一个基因：对所述非天然转基因植物而言是天然的基因，所述非天然转基因植物中的转基因，以及对所述非天然转基因植物的病毒、细菌、真菌或无脊椎动物害虫或病原体而言是天然的基因。
12.权利要求10的方法，其中所述至少一个靶基因是多个靶基因。
13.权利要求10的方法，其中所述基因抑制包括空间特异性基因抑制、时间特异性基因抑制、发育特异性基因抑制或诱导型基因抑制。
14.一种同时影响至少一个靶基因的基因抑制和至少一个目标基因的基因表达的方法，所述方法包括：
(a)提供非天然转基因植物，所述植物包括由包含权利要求2的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物，或者由包含权利要求2的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来的再生植物的后代植物，其中所述重组DNA构建体还包含用于表达所述至少一个目标基因的基因表达元件；和
(b)在所述非天然转基因植物中转录所述重组DNA构建体，其中，当所述重组DNA构建体在所述非天然转基因植物中转录时，产生能够抑制所述至少一个靶基因的转录RNA和编码所述至少一个目标基因的转录RNA，
因此相对于在没有所述重组DNA构建体转录时的表达而言，所述至少一个靶基因被抑制，而且所述至少一个目标基因同时表达。
15.一种非天然转基因植物，所述植物由包含权利要求2的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来，其中用于调节至少一个靶基因表达的所述至少一个可转录DNA元件包含转录为具有选自以下miRMON18前体序列折回结构的miRNA前体的DNA元件：SEQID NO.1763、SEQ ID NO.3936和SEQ ID NO.8800，其中所述miRNA前体包含所述miRMON18前体序列的至少90％核苷酸的连续区段并加工为具有序列SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ IDNO.8742的成熟miRMON18 miRNA，而且所述至少一个靶基因是植物内源基因，而且其中所述重组DNA构建体在所述植物中的表达导致所述至少一个靶基因被抑制，其中所述至少一个靶基因包含SPX结构域。
16.一种非天然转基因植物，所述植物由包含权利要求2的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞制备而来，所述重组DNA构建体还包含转基因转录单元，其中用于调节至少一个靶基因表达的所述至少一个可转录DNA元件包含位于所述转基因转录单元内或其附近并转录为包含miRNA识别位点的RNA的DNA元件，所述miRNA识别位点被具有序列SEQ ID NO.393、SEQ ID NO.3227或SEQ IDNO.8742的成熟miRMON18 miRNA识别或者被从选自SEQ ID NO.1763、SEQ ID NO.3936和SEQ ID NO.8800的miRMON18前体序列获得的成熟miRMON18 miRNA识别，而且所述至少一个靶基因包含由所述转基因转录单元编码的所述转基因，而且其中所述重组DNA构建体在植物中的表达导致所述转基因在并非天然表达所述成熟miRMON18 miRNA的所述植物的细胞中表达，其中所述至少一个靶基因包含SPX结构域。
17.一种提供具有至少一个改变的性状的非天然转基因作物的方法，所述方法包括在所述非天然转基因作物中抑制至少一个内源miRNA诱骗序列，因而相对于不表达所述重组DNA构建体的作物而言，导致所述非天然转基因作物表现出选自以下性状的至少一个改变的性状：
(i)提高非生物胁迫耐性；
(ii)提高生物胁迫耐性；
(iii)提高针对所述植物的有害动物或病原体的抗性；
(iv)改变初级代谢产物组成；
(v)改变次级代谢产物组成；
(vi)改变微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；
(vii)提高产量；
(viii)提高氮或其它营养物的利用能力；
(ix)改变农艺学特性；
(x)改变生长或生殖特性；和
(xi)提高收获、贮存或加工品质。
18.一种在缺氮或缺磷条件下提供产量提高的非天然转基因作物的方法，所述方法包括在所述非天然转基因作物中表达权利要求7的重组DNA构建体。
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