CN103361348A - 与水稻叶片宽度调控相关microRNA及其编码核酸分子与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻叶片宽度调控相关microRNA及其编码基因与应用。本发明提供的提供的一种RNA，为如下1)-4)中任一一种：1)、由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的RNA；2)、由序列表中序列4所示的核苷酸序列组成的RNA；3)、由序列表中序列5所示的核苷酸序列组成的RNA；4)将1)或2)或3)所示的RNA序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与植物叶片宽度相关由1)或2)或3)衍生的RNA。本发明的实验证明，本发明发现了Osa-miR319及其编码基因，通过基因工程的方法能利用该基因有效地调节和控制水稻叶片的宽度，进而改变水稻的叶片形态。

Description

与水稻叶片宽度调控相关microRNA及其编码核酸分子与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与水稻叶片宽度调控相关microRNA及其编码核酸分子与应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是在真核生物及病毒中发现的一类内源性的、具有调控功能的非编码RNA，其大小为19-24个核苷酸(nucleotides，nt)。在植物中，miRNA多由独立的基因编码。在细胞核内，miRNA基因首先被RNA聚合酶II转录成较长的转录本，这个转录本被称为miRNA的初级转录物(primary miRNA，pri-miRNAs)。初级转录本的结构与一般的mRNA相似，大多也有5’-帽子和3’-poly(A)尾巴结构。初级转录本包含有不完全匹配的茎-环结构(stem-loop structure)。初级转录本可被RNaseIII家族的酶Dicer like1(DCL1)和其他一些相关的双链RNA结合蛋白加工成只含有茎-环结构的miRNA前体(pre-miRNAs)。随后，pre-miRNAs又被DCL1蛋白复合体进一步加工形成miRNA:miRNA*复合体，成熟的miRNA源于其中的一条链，另一条链(miRNA*)则被降解。miRNA被整合进RISC复合体(RNA-induced silencing complex)中，在RISC的介导下，与其靶基因的mRNA结合，导致靶基因mRNA的降解或者使其翻译受到抑制，从而实现转录后水平的基因表达调控。近年来，大量的研究表明：miRNA也是植物生命活动的重要调控分子，在植物的生长发育、新陈代谢、营养吸收、激素调控、对生物和非生物胁迫的应答反应以及对miRNA自身的调控等多个方面发挥着重要的作用。

虽然在理论研究上已经取得了很大的进展，miRNA也具备为植物遗传改良提供丰富基因资源的潜能，但目前对其在生产上应用的研究相对滞后。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，叶片形态的改良是水稻育种的重要目标之一。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种水稻叶片宽度调控相关microRNA及其编码核酸分子。

本发明提供的一种RNA，来自粳稻品种日本晴(Oryza sativa L.subsp.japonicacv.Nipponbare)，为如下1)-4)中任一一种：

1)、由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的RNA；

2)、由序列表中序列4所示的核苷酸序列组成的RNA；

3)、由序列表中序列5所示的核苷酸序列组成的RNA；

4)将1)或2)或3)所示的RNA序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与植物叶片宽度相关由1)或2)或3)衍生的RNA。

上述经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个碱基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述RNA的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子是如下(1)-(7)中任一所述的DNA分子：

(1)序列表中序列2所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2自5‘末端第252-594位核苷酸所示的DNA分子；

(3)序列表中序列3所示的DNA分子；

(4)序列表中序列3自5‘末端第1-1494位核苷酸所示的DNA分子

(5)序列表中序列3自5‘末端第1-674位核苷酸所示的DNA分子；

(6)在严格条件下与(1)-(5)中任一限定的DNA序列杂交且编码与植物叶片宽度相关RNA的DNA分子；

(7)与(1)-(5)中任一限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与植物叶片宽度相关RNA的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述核酸分子转录得到mRNA，再由mRNA翻译修饰得到上述2)或3)所示的RNA，再经过修饰最终得到1)所示RNA，因此上述2)或3)所示的RNA均为1)所示RNA的前体，上述核酸分子编码得到mRNA为1)所示RNA的前前体。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转核酸分子细胞系或重组菌也是本发明保护范围。

上述重组载体为如下1)或2)：

1)为将上述RNA的编码核酸分子插入pCABIA1300A载体的Xba I和Sal I酶切位点间，得到表达上述RNA的重组载体；

2)为将上述RNA的编码核酸分子插入pTCK303载体的Bam H I和Kpn I酶切位点间，得到表达上述RNA的重组载体。

上述RNA、上述核酸分子或上述重组载体、表达盒、转核酸分子细胞系或重组菌在调节植物表型中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述表型具体体现在增加叶片宽度和/或增加叶脉数。

本发明的另一个目的是提供一种培育转核酸分子植物的方法。

本发明提供的方法，为将上述RNA的编码核酸分子导入目的植物，得到转核酸分子植物，

所述转核酸分子植物具有如下至少一种特征：

1)所述转核酸分子植物的叶片宽度大于所述目的植物；

2)所述转核酸分子植物的叶脉数大于所述目的植物。

上述方法中，上述RNA的编码核酸分子通过上述的重组载体导入目的植物。

上述方法中，上述叶片为旗叶、倒二叶或倒三叶。

上述方法中，所述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物，所述单子叶植物尤其具体为水稻。

可用现有的植物表达载体构建含有所述核酸分子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用所述核酸分子构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的核酸分子构建植物表达载体时，还可使用转录增强子。为了便于对转核酸分子植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的核酸分子、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记核酸分子等。也可不加任何选择性标记核酸分子，直接根据表型筛选目的植物。

扩增所述核酸分子的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

携带有所述核酸分子的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、核酸分子枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻，如籼稻品种Kasalath。

本发明的实验证明，本发明发现了osa-miR319及其编码核酸分子，通过核酸分子工程的方法能利用该核酸分子有效地调节和控制水稻叶片的宽度，进而改变水稻的叶片形态，对培育叶片宽度增加、形状改变的植物新品种及对植物株型改良具有重要意义。

附图说明

图1为水稻osa-miR319a和osa-miR319b的序列比对

图2为Osa-MIR319a和Osa-MIR319b基因的基因组信息和结构示意图

图3为pre-miRNA319a和pre-miRNA319b的二级结构示意图

图4为定量RT-PCR分析Osa-MIR319a和Osa-MIR319b基因的表达模式(Actin1基因为内参基因)

图5为过量表达重组载体结构示意图(图示为重组的双元载体的T-DNA插入位点右边界和左边界部分)

图6为4个过量表达载体转基因植株及野生型对照的叶片宽度比较

图7为过量表达载体转基因植株及野生型对照的的叶片小脉数比较

图8为过量表达Osa-MIR319aFL转基因水稻与野生型旗叶、倒二叶和倒三叶的叶片宽度比较

图9为野生型和转基因植株叶片最宽处横切面的比较

图10为定量RT-PCR分析Osa-MIR319a基因在野生型和转基因水稻中的表达情况

图11为小RNA Northern杂交分析osa-miR319在野生型和转基因水稻中的表达情况

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

粳稻品种日本晴(Nipponbare)：记载于International Rice Genome SequencingProject(2005).The map-based sequence of the rice genome.Nature 436，793-800，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

籼稻品种Kasalath：记载于Nishimura，A.，Ashikari，M.，Lin，S.，Takashi，T.，Angeles，E.R.，Yamamoto，T.，and Matsuoka，M.(2005).Isolation of a riceregeneration quantitative trait loci gene and its application totransformation systems.Proc Natl Acad Sci U S A 102，11940-11944，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以下简称野生型水稻。

载体pTCK303：记载于Wang et al.，2004，Plant Mol Biol Reporter 22：409-417，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

实施例1、水稻叶片宽度调控相关的miRNA及其编码基因的发现与表达分析

一、水稻叶片宽度调控相关的miRNA及其编码基因的发现

对多个从粳稻品种日本晴(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Nipponbare)预筛选得到的水稻miRNA基因进行反向遗传学研究，主要研究策略是对目标基因进行过量表达分析。在对转基因水稻群体进行表型分析时发现并鉴定了一个水稻叶片宽度调控相关的miRNA及其编码基因。

该miRNA的核苷酸序列为序列表的序列1，属于一个在植物中保守的miRNA家族——miRNA319家族。在水稻中miR319家族有两个成员，分别为osa-miR319a和osa-miR319b。成熟的osa-miR319b和osa-miR319a的序列完全相同，都由20个核苷酸组成(序列表的序列1；图1)，osa-miR319a前体和osa-miR319b前体的核苷酸序列为序列表中的序列4和序列5。

osa-miR319a的编码基因为Osa-MIR319a，该基因的核苷酸序列为序列表中的序列2(可以人工合成)；

osa-miR319b的编码基因为Osa-MIR319b，该基因的核苷酸序列为序列表中的序列3(可以人工合成)；

Osa-MIR319a(序列2)和Osa-MIR319b(序列3)这两个基因都位于水稻的第1号染色体(图2)，直接编码osa-miR319a和osa-miR319b初级转录物(即：pri-miRNA319a和pri-miRNA319b)，然后被OsDCL1等加工成含有茎-环(stem-loop)结构的miRNA前体pre-osa-miR319a(序列4)或pre-osa-miR319b(序列5)(它们的茎-环结构如图3所示)；再经过进一步加工最终均得到成熟的miR319a和miR319b(图1，核苷酸序列均为序列1)。分别过量表达Osa-MIR319a和Osa-MIR319b全长基因或基因片段获得的转基因水稻叶片的宽度明显增加，并且该表型能稳定遗传。

二、Osa-MIR319a和Osa-MIR319b基因的表达分析

为了研究Osa-MIR319a和Osa-MIR319b基因的表达模式，首先通过定量RT-PCR分析它在籼稻品种Kasalath(Oryza sativa L.subsp.indica cv.Kasalath)的根、茎、叶片、幼穗和成熟的穗等组织中的表达。

Osa-MIR319a基因的扩增引物为：

F1：5’-TCAGTCCACTCTCAGATGGCTG-3’；

R1：5’-CACCCTTCAGTCCAACCACAA-3’。

Osa-MIR319b基因的扩增引物为：

F2：5’-TGCTGCCGTTTTTCATGTTG-3’；

R2：5’-GCGTTTCTTGCTTGGCATGT-3’。

内参基因Actin1的扩增引物为：

F3：5’-AGCAACTGGGATGATATGGA-3’；

R3：5’-CAGGGCGATGTAGGAAAGC-3’。

将Osa-MIR319a和Osa-MIR319b基因的荧光信号(以Ct值表示)分别与Actin1基因(内参基因)的荧光信号(以Ct值表示)根据公式(相对表达量＝2^-ΔCt，其中ΔCt＝Ct_{目的 基因}-Ct_内参基因)计算出的值作为Osa-MIR319a和Osa-MIR319b基因的相对表达量。

结果见图4，表明Osa-MIR319b基因的表达量在整体上要高于Osa-MIR319a。Osa-MIR319a在幼穗中表达相对较高，在根、叶和成熟穗中有微弱表达；Osa-MIR319b在茎和幼穗的表达量明显高于其他组织。

实施例2、过表达Osa-MIR319a和Osa-MIR319b基因及基因片段的转基因水稻的获得和表型分析

理论上，过表达miRNA基因及含完整的茎-环结构的基因片段所产生的生物学效应大致相同。为了研究水稻MIR319基因的生物学功能，将Osa-MIR319aFL(指Osa-MIR319a的全长cDNA)、Osa-MIR319aST(指包含Osa-MIR319a的茎-环结构的基因片段)、Osa-MIR319bFL(指Osa-MIR319b的全长cDNA)和Osa-MIR319bST(指包含Osa-MIR319b的茎环结构的基因片段)分别置于水稻的Actin或玉米的Ubi启动子控制之下，构建双元载体(图5)，并转化至水稻籼稻品种Kasalath(Oryza sativa L.subsp.indicacv.Kasalath)中。

一、重组质粒的制备

1、Osa-MIR319aFL过表达载体(319aFL-OX)的制备

提取粳稻品种日本晴的幼苗(种子萌发后4周左右的幼苗)的总RNA，并反转录得到cDNA作为模板，用F4和R4组成的引物对进行PCR扩增，得到1540bpPCR扩增产物。

F4：5’-TCTAGAAGAGCCATGGCATTGCT-3’；

R4：5’-GTCGACGCAAAAGAAAAATACTACATGATTG-3’。

用限制性内切酶Xba I和Sal I双酶切上述PCR扩增产物，回收酶切产物，与经过同样酶切的载体pCAMBIA1300A骨架(记载于Jin et al.，2011，DevelopmentalBiology 359：277-288，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中序列2正向插入pCABIA1300A的Xba I和Sal I酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为319aFL-OX，MIR319a基因由水稻ACTIN启动子启动表达。

2、Osa-MIR319aST过表达载体(319aST-OX)的制备

提取粳稻品种日本晴种子萌发后4周左右的幼苗的总RNA，并反转录得到cDNA作为模板，用F5和R5组成的引物对进行PCR扩增，得到343bpPCR扩增产物。

F5：5’-TCTAGAAAGATTGTGGCTTTGACTACA-3’；

R5：5’-GTCGACAGATTTCCCAGGTCATTGA-3’。

上述PCR扩增产物，回收酶切产物，与经过同样酶切的载体pCAMBIA1300A骨架(约10595bp)连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中序列2自5’末端第252-594位核苷酸正向插入pCABIA1300A的Xba I和Sal I酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为319aST-OX，MR319a基因片段由水稻ACTIN启动子启动表达。

3、Osa-MIR319bFL过表达载体(319bFL-OX)的制备

提取粳稻品种日本晴种子萌发后4周左右的幼苗的总RNA，并反转录得到cDNA作为模板，用F6和R6组成的引物对进行PCR扩增，得到1494bpPCR扩增产物。

F6：5’-GGATCCGATGATGTCTTCTCTTCTCT-3’；

R6：5’-GGTACCGTGAGTTGTAGACAAATATAG-3’。

用限制性内切酶Bam H I和Kpn I双酶切上述PCR扩增产物，回收酶切产物，与经过同样酶切的载体pTCK303骨架(约14100bp)连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中序列3自5’末端第1-1494位核苷酸正向插入pTCK303的BamH I和Kpn I酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为319bFL-OX，MIR319b基因由玉米Ubi启动子启动表达。

4、Osa-MIR319bST过表达载体(319bST-OX)的制备

提取粳稻品种日本晴种子萌发后4周左右的幼苗的总RNA，并反转录得到cDNA作为模板，用F7和R7组成的引物对进行PCR扩增，得到674bpPCR扩增产物。

F7：5’-TCTAGAGATGATGTCTTCTCTTCTCTATCC-3’；

R7：5’-GTCGACGAGAAACAGTAATCACACCAGTG-3’。

用限制性内切酶Xba I和Sal I双酶切上述PCR扩增产物，回收酶切产物，与经过同样酶切的载体pCAMBIA1300A骨架(约10595bp)连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中序列3自5’末端第1-674位核苷酸正向插入pCAMBIA1300A的Xba I和Sal I酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为319bST-OX，MIR319b基因片段由水稻ACTIN启动子启动表达。

二、转基因水稻的获得

1、将步骤一构建的4个重组质粒319aFL-OX、319aST-OX、319bFL-OX和319bST-OX分别转化农杆菌(Agrobactericum tumefaciens)菌株LBA4404(Cat.No.18313-015，Invitrogen公司)得到重组农杆菌1、2、3、4。

分别提取重组农杆菌1、2、3、4的质粒送去测序，重组农杆菌1的质粒为319aFL-OX，将该菌命名为LBA4404/319aFL-OX，重组农杆菌2的质粒为319aST-OX，将该菌命名为LBA4404/319aST-OX，重组农杆菌3的质粒为319bFL-OX，将该菌命名为LBA4404/319bFL-OX，重组农杆菌4的质粒为319bST-OX，将该菌命名为LBA4404/319bST-OX。

2、将步骤1得到的重组农杆菌LBA4404/319aFL-OX、LBA4404/319aST-OX、LBA4404/319bFL-OX和LBA4404/319bST-OX分别转化野生型水稻(WT)的成熟胚愈伤组织中，经潮霉素筛选培养后分别得到18株T0代转319aFL-OX水稻、10株T0代转319aST-OX水稻、21株T0代转319bFL-OX水稻和12株T0代转319bST-OX水稻。

农杆菌介导的水稻转化方法参见文献：Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.PlantJournal 6：271-282.

3、鉴定阳性转基因水稻

分别提取上述转基因水稻叶片总DNA，通过PCR检测转基因水稻植株中的潮霉素基因(pCABIA1300A和pTCK303载体上均有)初步确定是否是阳性植株。所用引物为F8(5’-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’)和R8(5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’)。所有转基因植株均能扩增出预期长度为845bp的潮霉素抗性基因片段，而野生型植株(阴性对照)未扩增出相应的条带。PCR分析结果表明共得到18株阳性T0代转319aFL-OX水稻、10株阳性T0代转319aST-OX水稻、21株阳性T0代转319bFL-OX水稻和12株阳性T0代转319bST-OX水稻。

采用同样的方法将空载体pCABIA1300A和空载体pTCK303分别转入野生型水稻，经PCR鉴定得到10株阳性T0代转pCABIA1300A水稻和8株阳性T0代转pTCK303水稻。

三、转基因水稻表型的研究

将阳性T0代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)、阳性T0代转319aST-OX水稻(319aST-OX)、阳性T0代转319bFL-OX水稻(319aST-OX)、阳性T0代转319bST-OX水稻(319aST-OX)、T0转pCABIA1300A水稻和T0转pTCK303水稻的种子播种，水稻种植在中国科学院遗传与发育生物学研究所北京基地(北京市昌平区)水田，为常规管理，种植时间为5月至11月。以野生型水稻(WT)为对照。

在水稻抽穗后观察各株系的旗叶的宽度，结果如图6所示，

野生型水稻、阳性T0代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)、阳性T0代转319aST-OX水稻(319aST-OX)、阳性T0代转319bFL-OX水稻(319aST-OX)和阳性T0代转319bST-OX水稻(319aST-OX)的旗叶的宽度分别为1.52cm、1.97cm、1.93cm、1.98cm和1.96cm；说明上述转基因植物的叶片的宽度相对于野生型的均发生叶片明显的增加。统计旗叶宽度，结果如图6所示，可以看出，上述转基因植物的叶片的宽度相对于野生型的均发生叶片明显的增加。

统计上述转基因植物的旗叶叶片最宽处横切面的叶脉数(小脉数)，结果如图7所示，野生型水稻、阳性T0代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)、阳性T0代转319aST-OX水稻(319aST-OX)、阳性T0代转319bFL-OX水稻(319aST-OX)和阳性T0代转319bST-OX水稻(319aST-OX)的平均叶脉数分别为47.9、62.8、61.9、64.6和63.2个；上述转基因植物的叶片的叶脉数相对于野生型的均发生叶片明显的增加。

T0代转pCABIA1300A水稻和T0代转pTCK303水稻与野生型水稻的表型无显著差异。

由于上述4种转基因水稻表现出了相似的表型，因此选取过量表达Osa-MIR319aFL的阳性T0代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)株系进行进一步的具体分析：

将上述阳性T0代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)自交6代，得到T6代转319aFL-OX水稻。

将编号为1的T6代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)和野生型水稻的种子播种，水稻种植在中国科学院遗传与发育生物学研究所北京基地(北京市昌平区)水田，为常规管理，种植时间为5月至11月。在水稻抽穗后使用LI-3000A便携式叶面积仪(美国LI-COR公司)对上述各株系的植株进行叶片宽度测量。每个株系30株，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图8所示，OX-1、OX-2、OX-3分别指编号为1的T6代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)的旗叶、倒二叶和倒三叶，编号为WT-1、WT-2、WT-3分别指野生型水稻的旗叶、倒二叶和倒三叶；

T6代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)的旗叶、倒二叶和倒三叶的叶宽的平均值分别1.96厘米、1.84厘米、1.72厘米；野生型水稻的旗叶、倒二叶和倒三叶的叶宽平均值分别1.51厘米、1.35厘米和1.22厘米；可以看出，转基因植株较野生型叶片宽度都增加了30％左右。

再将编号为1的T6代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)和野生型水稻的旗叶叶片最宽处横切面的进行解剖学比较叶脉数，结果如图9所示，编号为1的T6代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)和野生型水稻的平均叶脉数分别为62.5个和48.6个。

四、过量表达Osa-MIR319aFL转基因水稻的分子鉴定及表型分析

1、定量RT-PCR鉴定

分别提取编号为1、2、3的T6代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)和野生型水稻(WT)的总RNA，进行定量RT-PCR鉴定，所用引物具体如下：

用于鉴定Osa-MIR319a基因的引物对为F3和R3组成的引物对，靶序列约154bp。

F5：5’-TCAGTCCACTCTCAGATGGCTG-3’；

R5：5’-CACCCTTCAGTCCAACCACAA-3’。

用于鉴定Actin1基因的引物对为F6和R6组成的引物对，靶序列约435bp。

F4：5’-AGCAACTGGGATGATATGGA-3’；

R4：5’-CAGGGCGATGTAGGAAAGC-3’。

将Osa-MIR319a基因的荧光信号(以Ct值表示)与Actin1基因(内参基因)的荧光信号(以Ct值表示)根据公式(相对表达量＝2^-ΔCt，其中ΔCt＝Ct_目的基因-Ct_内参基因)计算出的值作为Osa-MIR319a基因的相对表达量。

结果如图10所示，编号为1、2、3的T6代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)和野生型水稻(WT)的Osa-MIR319a基因的相对表达量分别为5.25、2.82、2.42、8*10^-6，结果表明，编号为1、2、3的T6代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)中Osa-MIR319a基因的表达量明显增强，认为转基因水稻叶片宽度增加表型是由强启动子驱动下Osa-MIR319a的过量表达造成的。

2、小分子RNA Northern杂交分析

将编号为1的T6代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)和野生型水稻(WT)进行小分子RNA Northern杂交分析，检测osa-miR319所用的探针序列为：

5’-GGGAGCACCCTTCAGTCCAA-3’。(方法见文献，Guo，H.S.，Xie，Q.，Fei，J.F.，andChua，N.H.(2005).MicroRNA directs mRNA cleavage of the transcription factorNAC1 to downregulate auxin signals for Arabidopsis lateral root development.Plant Cell 17：1376-1386.)。

结果如图11所示，可以看出，编号为1的T6代转319aFL-OX水稻(319aFL-OX)成熟的osa-miR319的表达量也明显高于对照的野生型植株。

上述分子生物学检测说明了过量表达植株中Osa-MIR319a基因初始转录本和成熟的小分子RNA的表达量都得到了明显的提高，也说明了转基因植株中Osa-MIR319a基因被成功地加工为成熟的小分子miRNA。转基因水稻叶片变宽的表型是由强启动子(水稻ACTIN启动子)驱动下Osa-MIR319a基因的过量表达引起osa-miR319的表达量提高造成的。

Claims (10)

1.一种RNA，为如下1)-4)中任一一种：

1)、由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的RNA；

2)、由序列表中序列4所示的核苷酸序列组成的RNA；

3)、由序列表中序列5所示的核苷酸序列组成的RNA；

4)将1)或2)或3)所示的RNA序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且与植物叶片宽度相关由1)或2)或3)衍生的RNA。

2.编码权利要求1所述RNA的核酸分子。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是如下(1)-(7)中任一所述的DNA分子：

(1)序列表中序列2所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2自5‘末端第252-594位核苷酸所示的DNA分子；

(3)序列表中序列3所示的DNA分子；

(4)序列表中序列3自5‘末端第1-1494位核苷酸所示的DNA分子

(5)序列表中序列3自5‘末端第1-674位核苷酸所示的DNA分子；

(6)在严格条件下与(1)-(5)中任一限定的DNA序列杂交且编码与植物叶片宽度相关RNA的DNA分子；

(7)与(1)-(5)中任一限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与植物叶片宽度相关RNA的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转核酸分子细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述重组载体，其特征在于：所述重组载体为如下1)或2)：

1)为将权利要求1所述RNA的编码核酸分子插入pCABIA1300A载体中，得到表达权利要求1所述RNA的重组载体；

2)为将权利要求1所述RNA的编码核酸分子插入pTCK303载体中，得到表达权利要求1所述RNA的重组载体。

6.权利要求1所述RNA、权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转核酸分子细胞系或重组菌在调节植物表型中的应用；所述表型具体体现在增加叶片宽度和/或增加叶脉数。

7.一种培育转核酸分子植物的方法，为将权利要求1所述RNA的编码核酸分子导入目的植物，得到转核酸分子植物，

所述转核酸分子植物具有如下至少一种特征：

1)所述转核酸分子植物的叶片宽度大于所述目的植物；

2)所述转核酸分子植物的叶脉数大于所述目的植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求1所述RNA的编码核酸分子通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述叶片为旗叶、倒二叶或倒三叶。

10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：所述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物，所述单子叶植物尤其具体为水稻。

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