ES2633352T3 - microARN de plantas y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para disminuir la actividad del miARN en una célula vegetal que comprende expresar en una célula vegetal una construcción de ADN recombinante que comprende un promotor heterólogo unido operativamente a un ADN que codifica al menos una secuencia señuelo de un miARN sintético que consiste en 19 a 36 nucleótidos de ARN contiguos, en el que la secuencia señuelo de dicho miARN sintético se reconoce y une, pero no se escinde, por un miARN expresado en dicha célula vegetal, dando como resultado un emparejamiento de bases entre dicha secuencia señuelo de miARN sintético y dicho miARN maduro, formando por tanto un duplete de ARN resistente a la escisión que comprende al menos un emparejamiento incorrecto entre dicha secuencia señuelo de miARN sintético y dicho miARN maduro en las posiciones 9, 10, u 11 de dicho miARN vegetal maduro, o al menos una inserción en una posición de dicha secuencia señuelo de miARN sintético correspondiente a las posiciones 10-11 de dicho miARN maduro, por lo cual disminuye la actividad de dicho miARN maduro en la mencionada célula vegetal, con respecto a aquella en la que dicha construcción de ADN recombinante no se expresa en dicha célula vegetal.

Description

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microARN de plantas y procedimientos de uso de los mismos

Campo de la invención

La presente invención desvela un procedimiento de disminuir la actividad de microARN en una en una célula vegetal

5 mediante la expresión en la célula vegetal, una construcción de ADN recombinante que comprende al menos una secuencia señuelo de miARN, reconocida y encontrada, pero no escindida, por un miARN expresado en dicha célula vegetal, células vegetales transgénicas no naturales, plantas, y semillas que contienen en su genoma dicha construcción de ADN recombinante.

Antecedentes de la invención

10 Se han descrito varias rutas celulares implicadas en la supresión génica mediada por ARN, cada una distinguida por una ruta característica y componentes específicos. Véanse, por ejemplo, las revisiones de Brodersen y Voinnet (2006), Trends Genetics, 22:268-280, y Tomari y Zamore (2005) Genes & Dev., 19:517-529. La ruta del ARNip implica la escisión fuera de fase de un ARN bicatenario ("ARN duplete") en ARN interferentes pequeños ("ARNip"). La ruta del microARN implica microARN (miARN), ARN que no codifican proteínas de entre aproximadamente 19 a

15 aproximadamente 25 nucleótidos (comúnmente, aproximadamente 20 -24 nucleótidos en plantas) que orientan la escisión en trans de transcritos diana, regulando de manera negativa la expresión de genes implicados en varias rutas de regulación y desarrollo. Los miARN de plantas se han definido mediante un conjunto de características que incluyen un precursor de tallo-bucle que se procesa mediante DCL1 en un único miARN específico de ~21nucleótidos, la expresión de una única pareja de especies de miARN y miARN* procedentes del duplete de ARN con

20 salientes de dos nucleótidos en 3', y silenciamiento de dianas específicas en trans. Véase Bartel (2004) Cell, 116:281-297; Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6:376-385; Jones-Rhoades y col. (2006) Annu. Rev. Plant Biol., 57:19-53; Ambros y col. (2003) RNA, 9:277-279. En la ruta del ARNip que actúa en trans ("ARNip-ta"), los miARN sirven para orientar el procesamiento en fase de transcritos primarios de ARNip en un proceso que requiere de una ARN polimerasa dependiente de ARN para la producción de un precursor de un duplete de ARN; los ARNip que

25 actúan en trans se definen por la ausencia de estructura secundaria, un sitio diana de miARN que inicia la producción de ARN bicatenario, necesidad de DCL4 y una ARN polimerasa dependiente de ARN (RDR6), y la producción de múltiples ARN pequeños de ~21 nucleótidos perfectamente en fase con dupletes perfectamente emparejados con salientes de 2 nucleótidos en 3' (véase Allen y col. (2005) Cell, 121:207-221).

Los microARN (miARN) son ARN que no codifican proteínas, generalmente de entre aproximadamente 19 a

30 aproximadamente 25 nucleótidos (comúnmente aproximadamente 20 -24 nucleótidos en plantas), que orientan la escisión en trans de transcritos diana, regulando de manera negativa la expresión de genes implicados en varias rutas de regulación y desarrollo (Bartel (2004) Cell, 116:281-297). En algunos casos, los miARN sirven para orientar el procesamiento en fase de transcritos primarios de ARNip (véase Allen y col. (2005) Cell, 121:207-221).

Se han identificado algunos genes del microARN (genes MIR) y están públicamente disponibles en una base de

35 datos (’miRBase", disponible en línea en microrna.sanger.ac.uk/sequences). Los solicitantes han desvelado novedosos genes MIR, miARN maduros, y sitios de reconocimiento del miARN en la publicación de patente de Estados Unidos 2006/0200878. Se describen también genes MIR adicionales y miARN maduros en las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos 2005/0120415 y 2005/144669. Se ha notificado que se producen genes MIR en regiones intergénicas, aislados y en clústeres en el genoma, pero también se pueden localizar

40 completa o parcialmente en intrones de otros genes (que codifican proteínas y que no codifican proteínas). Para una revisión reciente de la biogénesis del miARN, véase Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6:376-385. La transcripción de genes MIR puede realizarse, al menos en algunos casos, bajo el control promocional del propio promotor de un gen MIR. La transcripción del gen MIR está mediada generalmente de forma probable por la ARN polimerasa II (véase, por ejemplo, Aukerman. y Sakai (2003) Plant Cell, 15:2730-2741; Parizotto y col. (2004) Genes

45 Dev.,18:2237-2242), y, por tanto, podría ser susceptible a soluciones de silenciamiento génico que se han utilizado en otros genes transcritos por la polimerasa II. El transcrito primario (que puede ser policistrónico) se denomina un "pri-miARN", una molécula precursora de miARN que puede ser muy grande (algunas kilobases) y contiene una o más regiones locales bicatenarias o "en horquilla" así como la "protección" usual en 5' y la cola poliadenilada de un ARNm. Véanse, por ejemplo, la Figura 1 de Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6:376-385.

50 En células vegetales, se cree que las moléculas precursoras de microARN se procesan ampliamente en el núcleo. El pri-miARN se procesa para dar una molécula precursora de miARN más corta que incluye también una estructura de tallo-bucle o replegado y se denomina el "pre-miARN". En plantas, los miARN y los ARNip se forman mediante distintas enzimas análogas a DICER (DCL), y en Arabidopsis, se cree que se requiere una enzima DCL nuclear (DCL1) para la formación de miARN maduro; véanse, por ejemplo, Ambros y col. (2003) RNA, 9:277-279, y Xie y col.

55 (2004) PLoS Biol., 2:642-652. Se encuentran revisiones adicionales sobre la biogénesis y la función del microARN, por ejemplo, en Bartel (2004) Cell, 116:281-297; Murchison y Hannon (2004) Curr. Opin. Cell Biol., 16:223-229; y Dugas y Bartel (2004) Curr. Opin. Plant Biol., 7:512-520. Los micro ARN pueden de esta manera describirse en términos de ARN (por ejemplo, secuencia de ARN de un miARN maduro o una molécula de miARN precursora de ARN), o en términos de ADN (por ejemplo, una secuencia de ADN que corresponde a una secuencia de ARN de un

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Se estima que las familias del gen MIR representan aproximadamente el 1% de al menos algunos genomas y son capaces de alterar o regular la expresión de aproximadamente un tercio de todos los genes (véase, por ejemplo, 5 Tomari y col. (2005) Curr. Biol., 15:R61-64; G. Tang (2005) Trends Biochem. Sci., 30:106-14; Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6:376-385). Como los miARN son importantes elementos reguladores en eucariotas, incluyendo animales y plantas, la supresión transgénica de los miARN conduciría, por ejemplo, a la comprensión de importantes procesos biológicos o a permitir la manipulación de determinadas rutas (por ejemplo, la regulación de la diferenciación celular, proliferación, y apoptosis) útiles, por ejemplo, en aplicaciones biotecnológicas. Véanse, por 10 ejemplo, O’Donnell y col. (2005) Nature, 435:839-843; Cai y col. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:5570-5575; Morris y McManus (2005) Sci. STKE, pe41 (stke.sciencemag.org/cgi/reprint/sigtrans;2005/297/pe41.pdf). Los genes microARN (MIR) tienen características de identificación, incluyendo la conservación entre especies vegetales, una estructura replegada estable, y el procesamiento de un duplete de miARN/miARN* específico mediante las enzimas de tipo Dicer (Ambros y col. (2003) RNA, 9:277-279). Se han utilizado estas características para identificar los

15 miARN y sus correspondientes genes en plantas (Xie y col. (2005) Plant Physiol., 138:2145-2154; Jones-Rhoades y Bartel (2004) Mol. Cell, 14:787-799; Reinhart y col. (2002) Genes Dev., 16:1616-1626; Sunkar y Zhu (2004) Plant Cell, 16:2001-2019). Los genes de microARN públicamente disponibles están catalogados en la miRBase (Griffiths-Jones y col. (2003) Nucleic Acids Res., 31:439-441).

Los miARN se expresan en tipos celulares muy específicos de Arabidopsis (véase, por ejemplo, Kidner y

20 Martienssen (2004) Nature, 428:81-84, Millar y Gubler (2005) Plant Cell, 17:705-721). La supresión puede estar limitada a un lado, borde, u otra división entre tipos de células, y se cree que se requerirá para la modelación y especificación del tipo de célula adecuado (véase, por ejemplo, Palatnik y col. (2003) Nature, 425:257-263). Se ha descubierto que la supresión de un gen indicador GFP que contiene un sitio de reconocimiento de miR171 endógeno limita la expresión a células específicas en Arabidopsis transgénico (Parizotto y col. (2004) Genes Dev., 18:2237

25 2242). Se han validado los sitios de reconocimiento de los miARN en todas las regiones de un ARNm, incluyendo la región 5' no traducida, la región de codificación, y la región 3' no traducida, indicando que la posición del sitio diana de miARN con respecto a la secuencia de codificación puede no necesariamente afectar a la supresión (véase, por ejemplo, Jones-Rhoades y Bartel (2004). Mol. Cell, 14:787-799, Rhoades y col. (2002) Cell, 110:513-520, Allen y col. (2004) Nat. Genet., 36:1282-1290, Sunkar y Zhu (2004) Plant Cell, 16:2001-2019).

30 Los miARN maduros desvelados en el presente documento se procesan a partir de genes MIR que generalmente pertenecen a las familias convencionales conservadas a través de especies de plantas relacionadas de forma distante. Estos genes MIR y sus miARN maduros codificados son también útiles, por ejemplo, para modificar las rutas de desarrollo, por ejemplo, alterando la diferenciación celular o a la morfogénesis (véase, por ejemplo, Palatnik y col. (2003) Nature, 425:257-263; Mallory y col. (2004) Curr. Biol., 14:1035-1046), para servir como fuentes de

35 secuencias para los miARN genomanipulados (que no son de origen natural) que se diseñan para silenciar secuencias diferentes de las de los transcritos diana por la secuencia de miARN de origen natural (véase, por ejemplo, Parizotto y col. (2004) Genes Dev., 18:2237-2242; véanse también las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos 2004/3411A1 y 2005/0120415, y para estabilizar el ARNds. Un mismo gen MIR (o sus regiones 5' o 3' no traducidas naturales), o su prom natural u otros elementos implicados en su transcripción) es útil

40 como gen diana para la supresión del gen (por ejemplo, mediante los procedimientos de la presente invención), cuando se desea la supresión del miARN codificado por el gen MIR. Los promotores de los genes MIR pueden tener patrones de expresión muy específicos (por ejemplo, específicos de células, específicos de tejidos, o temporalmente específicos), y de esta manera son útiles en las construcciones recombinantes para inducir dicha transcripción específica de una secuencia de ADN a la cual se unen de manera operativa.

45 La presente invención proporciona un procedimiento para disminuir la actividad del miARN en una célula vegetal (incluyendo plantas de cultivo tales como maíz, arroz, y soja), mediante la expresión en la célula vegetal, una construcción de ADN recombinante que incluye al menos una secuencia señuelo del miARN reconocida y unida, pero no escindida por la expresión de un miARN maduro de dicha célula vegetal. Se desvelan y reivindican células vegetales transgénicas no naturales. plantas, y semillas que contienen en su genoma dicha construcción de ADN

50 recombinante.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de disminuir la actividad del miARN en una célula vegetal que comprende expresar en una célula vegetal una construcción de ADN recombinante que comprende un promotor heterólogo unido operativamente a un ADN que codifica al menos una secuencia señuelo 55 de un miARN sintético que consiste en 19 a 36 nucleótidos de ARN contiguos, en el que la secuencia señuelo de dicho miARN sintético se reconoce y une, pero no se escinde, por un miARN expresado en dicha célula vegetal, dando como resultado un emparejamiento de bases entre dicha secuencia señuelo de miARN sintético y dicho miARN maduro, formando por tanto un duplete de ARN resistente a la escisión que comprende al menos un emparejamiento incorrecto entre dicha secuencia señuelo de miARN sintético y dicho miARN maduro en las 60 posiciones 9, 10, u 11 de dicho miARN vegetal maduro, o al menos una inserción en una posición de dicha secuencia señuelo de miARN sintético correspondiente a las posiciones 10-11 de dicho miARN maduro, por lo cual Otro aspecto de la presente invención proporciona una célula de planta transgénica no natural en la que la actividad de dicho miARN maduro se ha disminuido mediante el procedimiento que se muestra anteriormente en el presente 5 documento, es decir, la mencionada célula vegetal que incluye cualquiera de las construcciones de ADN recombinante anteriormente mencionado. Se proporciona además una planta transgénica no natural que contiene la célula de planta transgénica no natural que se muestra anteriormente en el presente documento, incluyendo plantas en cualesquiera etapas de desarrollo, e incluye una planta regenerada preparada a partir de las células de plantas transgénicas no naturales desveladas en el presente documento, o una progenie de plantas (que pueden ser plantas 10 endogámicas o híbridas) de la planta regenerada, o semillas de dicha planta transgénica no natural, dicha planta transgénicas tiene en su genoma y expresión cualquiera de las construcciones de ADN recombinante anteriormente mencionadas, en el que dicha planta transgénica no natural tiene al menos un rasgo alterado, con respecto a una planta que carece de dicha construcción de ADN recombinante, en relación a una planta que carece de la construcción de ADN recombinante, seleccionada entre los rasgos; tolerancia al estrés abiótico mejorada; tolerancia

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15 al estrés biótico mejorada; resistencia mejorada a una plaga o un patógeno de dicha planta; composición de metabolitos primarios modificada; composición de metabolitos secundarios modificada; elemento traza modificado, carotenoides, o composición de vitaminas; rendimiento mejorado; capacidad mejorada de usar nitrógeno u otros nutrientes; características agronómicas modificadas; características de crecimiento o reproductivas modificadas; y una cosecha, almacenamiento, o calidad del procesamiento mejorados.

20 En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una planta de cultivo transgénico no natural que tiene al menos un rasgo alterado, en el que dicha planta de cultivo transgénico no natural comprende y expresa una construcción de ADN recombinante como se muestra anteriormente en el presente documento, dando como resultado por tanto la mencionada planta de cultivo transgénico no natural que presenta al menos un rasgo alterado, con respecto a una planta de cultivo que no expresa dicha construcción de ADN recombinante, seleccionada entre

25 los rasgos; tolerancia al estrés abiótico mejorada; tolerancia al estrés biótico mejorada; resistencia mejorada a una plaga o un patógeno de dicha planta; composición de metabolitos primarios modificada; composición de metabolitos secundarios modificada; elemento traza modificado, carotenoides, o composición de vitaminas; rendimiento mejorado; capacidad mejorada de usar nitrógeno u otros nutrientes; características agronómicas modificadas; características de crecimiento o reproductivas modificadas; y una cosecha, almacenamiento, o calidad del

30 procesamiento mejorados.

Otras realizaciones específicas de la invención se desvelan en la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa gráficamente un ejemplo no limitante de una estructura replegada de una secuencia de miARN precursor de una planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ

35 ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 8819, más específicamente, la estructura replegada de la secuencia del miARN precursor que tiene la SEQ ID NO. 1136, que incluye dos tallos-bucles cortos, un bucle, y dos protuberancias. El precursor de miARN se procesa in planta para dar un miARN maduro (en este ejemplo concreto, el miARN maduro que tiene la SEQ ID NO. 32). Las Figuras 2 y 3 representan gráficamente ejemplos no limitantes de elementos del ADN para suprimir la

40 expresión de un gen diana, por ejemplo, un miARN endógeno, como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 4 representa gráficamente los resultados del análisis de transferencia Northern para los miARN maduros de diferentes tejidos de maíz, como se describe en el Ejemplo 4. La Figura 5 representa gráficamente los perfiles de transcripción de secuencias probeset que incluyen las secuencias precursoras del miARN que tienen patrones de expresión específicos para el tejido reproductor

45 masculino de maíz (polen), como se describe en el Ejemplo 4. La Figura 6 representa gráficamente las etapas de sequía para plantas de soja con un sistema de puntuación de 1,0 (sin efecto o sin control) a 4,0, como se describe en el Ejemplo 5. Como se describe en el Ejemplo 6, la Figura 7A representa gráficamente la estructura replegada de un precursor miRMON18 de maíz (SEQ ID NO. 3936), la Figura 7B representa gráficamente la estructura replegada de un

50 precursor miRMON 18 de ratones (SEQ ID NO. 1763), y la Figura 7C representa gráficamente la estructura replegada de un precursor miR827 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO. 8743). La Figura 7D representa gráficamente una comparación de miR827 (SEQ ID NO. 8744) y miRMON18 (SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227,

o la SEQ ID NO. 8742), con flechas numeradas que indican las posiciones 1, 10, y 21 del miARN maduro; el nucleótido en la posición 10 está también subrayado.

55 La Figura 8 representa gráficamente los patrones de expresión de miRMON18 como se determina según las transferencias Northern de miRMON18 maduro de 21-mer (Figura 8A) y el perfil de transcripción del precursor miRMON (Figura 8B), como se describe en el Ejemplo 6. La Figura 9 representa gráficamente el análisis de expresión del precursor miRMON18 del maíz (SEQ ID NO. 3936) en tejidos de maíz de plantas que crecen en condiciones deficientes en agua (sequía) (Figura 9A), condiciones frías (Figura 9B), y condiciones deficientes en

60 nitrógeno (Figura 9C), como se describe en el Ejemplo 6. La Figura 10 representa gráficamente los resultados de los análisis de transferencias Northern de ARN pequeños en maíz (Zea mays var. LH244), que muestran una expresión de miRMON18 potenciada en endospermo y semilla de maíz, y una fuerte supresión de miRMON18 en hojas inducida por deficiencia de nitrógeno (Figura 10A), y una fuerte expresión de miRMON18 en tejido de hojas en condiciones suficientes de fosfato y una supresión de miRMON18 en condiciones deficientes de fosfato (Figura 10B), como se describe en el Ejemplo 6. La Figura 11 representa gráficamente una alineación de secuencias múltiples de novedosos genes diana de

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5 miRMON18 de maíz que contienen el dominio SPX de maíz (indicado por una secuencia subrayada, cuando está presente) y el dominio MFS de maíz (indicado por una secuencia en texto en negrita), como se describe en el

Ejemplo 7. La Figura 12 representa gráficamente un árbol filogenético construido para los genes SPX identificados, tal como se describe en el Ejemplo 7; los genes que contienen un sitio de reconocimiento de miRMON18 previsto (en genes de especies diferentes de Arabidopsis thaliana) o un sitio de reconocimiento de miR827 previsto (en genes de Arabidopsis thaliana) que se ha validado experimentalmente se indican en texto en negrita. La Figura 13 representa gráficamente una secuencia genómica de miRMON18 (SEQ ID NO. 8800), como se describe en el Ejemplo 8. Este muestra el transcrito miRMON18 en texto en mayúscula en los nucleótidos 2173 2788, un elemento promotor de miRMON18 en texto en minúscula en los nucleótidos 211 -2172, un elemento líder

15 en texto en minúscula en los nucleótidos 2173 -2308, una secuencia TATA convencional (que termina 25 nucleótidos en la dirección 5') del sitio de inicio de la transcripción en el texto en negrita subrayado en los nucleótidos 2144 -2147, el miRMON18 maduro como texto en mayúscula subrayado en los nucleótidos 2419 2439, y el miRMON18* como texto en mayúscula subrayado en los nucleótidos 2322 -2341. La Figura 14 representa gráficamente la escisión prevista por miRMON18 de las secuencias del arroz Os02g45520 (SEQ ID NO. 8784) y Os04g48390 (SEQ ID NO. 8786) y la secuencia del maíz MRT4577_36529C (SEQ ID NO. 8788), como se describe en el Ejemplo 9. La Figura 15 representa gráficamente la correlación inversa entre el precursor miRMON18 (Figure 15A) y un miRMON18 diana (Figura 15B), como se describe en el Ejemplo 9. La Figura 15B muestra que la secuencia del maíz MRT4577_36529C (SEQ ID NO. 8788), presentó mayores niveles de expresión en condiciones deficientes de

25 nitrógeno que en condiciones suficientes de nitrógeno, es decir, un patrón de expresión opuesto al del precursor miRMON18 que se muestra en la Figura 15A. La Figura 16 representa gráficamente el vector pMON107261, que incluye un promotor CaMV 35S que impulsa la expresión del transcrito miRMON18 de maíz (por ejemplo, los nucleótidos 2173 -2788 de la SEQ ID NO. 8800), como se describe en el Ejemplo 10. La Figura 17A representa gráficamente las estructuras replegadas de los precursores miR399 de maíz; La Figura17B representa gráficamente los resultados de los experimentos de perfil de la transcripción, que demuestran que el Zm-miR399 pri-miARN está suprimido en condiciones deficientes de nitrógeno (barras negras) y se expresa en condiciones suficientes de nitrógeno (barras blancas), como se describe en el Ejemplo 11. La Figura 18 representa gráficamente las secuencias de ADNc del maíz de las secuencias señuelo de miR399, con la secuencia consenso dada como la SEQ ID NO. 8834, y desvela al menos dos grupos de genes que

35 contienen las secuencias señuelo de miR399, como se describe en el Ejemplo 11. La Figura 19 representa gráficamente los experimentos que comparan la expresión de las secuencias señuelo miR399 de maíz y los precursores miR399 como se describe en el Ejemplo 11. La Figura 19A muestra un perfil de transcripción del gen señuelo de miR399 del grupo 1 MRT4577_47862C.7 (SEQ ID NO. 8827) y la Figura 19B muestra un perfil de transcripción del gen señuelo de miR399 del grupo 2 MRT4577_36567C.8 (SEQ ID NO. 8829), indicando que estas secuencias señuelo de miR399 están infrarreguladas por la deficiencia de nitrógeno. Estos resultados se verificaron mediante transferencias Northern que medían la expresión de miR399 maduro (Figura 19C) y de la secuencia señuelo de miR399 MRT4577_47862C.7 (SEQ ID NO. 8827) (Figura 19D). La Figura 20 representa gráficamente los experimentos del perfil de transcripción que comparan la expresión de las secuencias de ADNc señuelo del miR399 endógeno de maíz y los correspondientes precursores miR399 de

45 maíz en condiciones de temperatura diferentes, como se describe en el Ejemplo 11. El gen señuelo de miR399 del grupo 2 MRT4577_36567C.8 (SEQ ID NO. 8829) presentó al menos una expresión de diez veces o más mayor en condiciones de nitrógeno suficiente en hoja de maíz, especialmente durante las horas diarias de luz (Figura 20A). Este mismo gen presentó al menos una infrarregulación de dos veces en la raíz (Figura 20B) y en los brotes (Figura 20C) tras una exposición prolongada al frío. La Figura 21 representa gráficamente la expresión de las secuencias de ADNc señuelo de miR399 en diferentes tejidos en maíz y soja, como se describe en el Ejemplo 11. La Figura 21A representa gráficamente los niveles de expresión en la secuencia señuelo de miR399 de maíz del grupo 1 SEQ ID NO. 8827 (MRT4577_47862C, representada por las sondas A1ZM005814_at y AlZM005813_s_at), y la secuencia señuelo de miR399 de maíz del grupo 2 SEQ ID NO. 8829 (MRT4577_36567C, representada por la sonda A1ZM048024_at), así como la

55 secuencia de pri-miR399 de maíz SEQ ID NO. 8818 (MRT4577_22487C.6 representada por la sonda A1ZM033468_at). La Figura 21B representa gráficamente los niveles de expresión de las secuencias señuelo de miR399 de soja SEQ ID NO. 8842 (MRT3847_217257C.2, representada por la sonda A1GM031412_at), SEQ ID NO. 8844 (MRT3847_236871C.2, representada por la sonda A1GM053788_at), SEQ ID NO. 8836 (MRT3847_238967C.1, representada por la sonda A1GM035741_at), y la SEQ ID NO. 8838 (MRT3847_241832C.1, representada por la sonda A1GM069937_at). La Figura 22A representa gráficamente los datos del perfil de transcripción en diversos tejidos de soja del miR319 señuelo endógeno de soja SEQ ID NO. 8847 (MRT3847_41831C.6, representada por la sonda A1GM001017_at); La Figura 22B representa gráficamente los datos del perfil de transcripción en diversos tejidos de maíz del miR319 señuelo endógeno de maíz SEQ ID NO. 8849 (MRT4577_577703C.1, representada por la sonda

65 A1ZM012886_s_at), como se describe en el Ejemplo 11.

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A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la técnica a la cual pertenece la presente invención. En general, la nomenclatura utilizada y los procedimientos de fabricación o laboratorio descritos a 5 continuación son bien conocidos y se emplean comúnmente en la técnica. Se utilizan procedimientos convencionales para estos procedimientos, tales como los proporcionados en la técnica y diversas referencias generales. Salvo que se indique de otra forma, las secuencias de ácidos nucleicos en el texto de la presente memoria descriptiva se proporcionan, cuando se leen de izquierda a derecha, en la dirección de 5’ a 3'. Las secuencias de ácido nucleico pueden proporcionarse como ADN o como ARN, tal como se especifica; la desvelación 10 de una define necesariamente la otra, tal como sabe un experto habitual en la materia. En los casos donde se proporciona un término en singular, los inventores también contemplan aspectos de la invención descritos por el plural de ese término. La nomenclatura utilizada y los procedimientos de laboratorio descritos a continuación son bien conocidos y se emplean comúnmente en la técnica. Otros términos técnicos utilizados tienen su significado ordinario en la técnica en la que se utilizan, como se ilustra por una variedad de diccionarios técnicos. Los inventores

15 no pretenden limitarse a un mecanismo o modo de acción. Se proporcionan referencias a lo anterior solo con fines ilustrativos.

CONSTRUCCIONES DE ADN RECOMBINANTE

Se describe una construcción de ADN recombinante que incluye al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana, en el que al menos un elemento de ADN transcribible se selecciona 20 entre el grupo que consiste en: (a) un elemento de ADN que se transcribe a un precursor de miARN con la estructura replegada de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819, en el que el miARN precursor incluye un segmento contiguo de al menos 90% de los nucleótidos del maíz, arroz, o la secuencia del miARN precursor de soja; (b) un elemento de ADN que se transcribe 25 a un miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética derivado de la estructura replegada de una secuencia de un miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 8819, en el que el miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética incluye un miARN maduro modificado;

(c) un elemento de ADN que se localiza o es adyacente a una unidad de transcripción del transgén y que se

30 transcribe a ARN incluyendo un sitio de reconocimiento del miARN reconocido por un miARN maduro seleccionado entre un miARN maduro seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1 -1035, SEQ ID NOS. 2730 -3921, SEQ ID NOS. 5498 -6683, SEQ ID NOS. 8409 -8560, SEQ ID NO. 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812 -8815, SEQ ID NO. 8845, y la SEQ ID NO. 8850, o por un miARN maduro derivado de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID

35 NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819; y (d) un elemento de ADN para suprimir la expresión de un miARN endógeno derivado de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819. Se describen genes diana, cuya expresión se puede modular mediante el uso de una construcción de ARN recombinante de la presente

40 invención, en el subtítulo "Genes diana". A continuación se describen las realizaciones y utilidades de al menos un elemento de ADN transcribible.

(A) Expresión de un miARN natural en condiciones no naturales.

El al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana incluye un elemento de ADN que se transcribe a un miARN precursor con la estructura replegada de una secuencia de miARN 45 precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819, en el que el miARN precursor incluye un segmento contiguo de al menos 90% de los nucleótidos del maíz, arroz, o la secuencia del miARN precursor de soja. Se prefiere que el al menos un gen diana sea un gen endógeno de una planta, y la expresión de la construcción de ADN recombinante en la planta da como resultado la supresión del al 50 menos un gen diana. Por "miARN precursor" se entiende un ARN transcrito que es más grande que un miARN maduro procesado a partir del miARN precursor, y que normalmente se puede prever que forme una estructura replegada que contiene regiones de ARN bicatenario no perfectamente complementarias. Véase Bartel (2004) Cell, 116:281-297; Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6:376-385; Jones-Rhoades y col. (2006) Annu. Rev. Plant Biol., 57:19-53; Ambros y col. (2003) RNA, 9:277-279. Los ejemplos de microARN precursores incluyen el transcrito de 55 miARN primario (pri-miARN) así como el pre-miARN que se deriva naturalmente de un pri-miARN; Los miARN precursores incluyen también secuencias de ARN no naturales que se prevé que formen una estructura replegada que contiene regiones de ARN bicatenario no perfectamente complementarias y se procesan en vivo, generalmente mediante una o más etapas de escisión, a un miARN maduro. Por "secuencia de miARN precursor" se entiende una secuencia de ARN que incluye al menos los nucleótidos del miARN precursor, pero que puede incluir nucleótidos 60 adicionales (de tal manera que el miARN precursor incluye un segmento contiguo de al menos 90% de los nucleótidos del maíz, arroz, o la secuencia del miARN precursor de soja). Cada miARN precursor forma por sí mismo una estructura replegada que es idéntica o casi idéntica a la estructura replegada que está formada por al

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El miARN precursor no tiene que incluir todos los nucleótidos contenidos en una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922-5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819, pero incluye

5 preferentemente un segmento contiguo de al menos 80%, o al menos del 85%, o al menos del 90%, o al menos del 95%, o al menos del 97%, o al menos del 98%, o al menos del 99% de los nucleótidos de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819.

Se prefiere que el al menos un gen diana sea un gen endógeno de una planta, y, de esta manera, la expresión de la

10 construcción de ADN recombinante en la planta da como resultado la supresión del al menos un gen diana. La transcripción de la construcción de ADN recombinante en una célula de una planta transgénica modula la expresión de cualquier gen (genes endógenos o transgenes) que contienen una secuencia ("sitio de reconocimiento del miARN") que es sustancialmente complementaria y reconocida por el miARN maduro codificado por el miARN precursor. En general, la transcripción de la construcción de ADN recombinante da como resultado la supresión de

15 un gen endógeno que contiene un sitio de reconocimiento del miARN que es reconocido por el miARN maduro codificado por el miARN precursor. Se prefiere que la construcción de ADN recombinante incluya además un promotor diferente de la secuencia del miARN. Esto permite la expresión del miARN maduro en condiciones espaciales, o temporales, o inducibles bajo las cuales podría no expresarse de forma natural. Por ejemplo, la construcción de ADN recombinante puede diseñarse para incluir un promotor constitutivo y, de esta manera, expresa

20 constitutivamente un miARN maduro que se expresa naturalmente (es decir, cuando se expresa en la forma del miARN precursor endógeno bajo el control del promotor natural) solo en condiciones de oscuridad. Los promotores que son útiles con esta construcción de ADN recombinante se describen en el apartado "Promotores".

En un ejemplo no limitante, la construcción de ADN recombinante incluye un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana, en el que al menos un elemento de ADN transcribible incluye un 25 elemento de ADN que se transcribe a un miARN precursor que es un segmento contiguo que consiste en aproximadamente un 90% de los nucleótidos de la secuencia del miARN precursor de maíz que tiene la SEQ ID NO. 1136, y que está previsto que tenga una estructura replegada que es sustancialmente la misma (es decir, que tiene áreas de tallos de ARN bicatenarios y bucles o protuberancias monocatenarios en la misma o aproximadamente la misma localización) que la estructura replegada de la secuencia del miARN precursor que tiene la secuencia SEQ ID 30 NO. 1136. La estructura replegada de la secuencia del miARN precursor que tiene la SEQ ID NO. 1136 incluye aproximadamente 118 nucleótidos, con dos tallos-bucles cortos que se proyectan desde un bucle en el extremo cerrado de la estructura replegada, y dos pequeñas protuberancias en el "tallo" bicatenario principal de la estructura replegada (Figura 1). El miARN maduro procesado in planta forma un miARN precursor que es un segmento contiguo que consiste en aproximadamente un 90% de los nucleótidos de la secuencia del miARN precursor de maíz 35 que tiene la SEQ ID NO. 1136 preferentemente idéntica a la codificada por la estructura replegada de la secuencia de miARN precursor que tiene la SEQ ID NO. 1136, es decir, al miARN maduro que tiene la SEQ ID NO. 32. La transcripción de esta construcción de ADN recombinante da como resultado preferentemente la supresión de un gen endógeno que contiene un sitio de reconocimiento del miARN que es reconocido por el miARN que tiene la SEQ ID NO. 32. Mientras que la secuencia de miARN precursor que tiene la SEQ ID NO. 1136 se expresa naturalmente en

40 tejido de semilla pero no en hoja (véase la Tabla 2), la construcción de ADN recombinante puede incluir además un promotor diferente al promotor natural de la secuencia del miARN precursor que tiene la SEQ ID NO. 1136, por ejemplo, un promotor constitutivo, para permitir la transcripción de un miARN maduro que tiene la SEQ ID NO. 32 en otros tejidos además del tejido de semilla.

(B) Expresión de un miARN maduro diseñado mediante ingeniería genética.

45 El al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana incluye un elemento de ADN que se transcribe a un precursor de miARN diseñado mediante ingeniería genética derivado de la estructura replegada de una secuencia de un miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819, en el que el miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética

50 incluye un miARN maduro modificado. Se prefiere que el al menos un gen diana sea un gen endógeno de una planta

o un gen endógeno de una plaga o patógeno de la planta, y la expresión de la construcción de ADN recombinante en la planta da como resultado la supresión del al menos un gen diana. Por "diseñado mediante ingeniería genética" se entiende que los nucleótidos se cambian (se sustituyen, eliminan, o añaden) en una secuencia de un miARN precursor natural tal como una secuencia de un miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 55 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819, dando como resultado por tanto un miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética que tiene sustancialmente la misma estructura replegada que la secuencia del miARN precursor natural, pero en la que el miARN maduro que se procesa a partir del miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética tiene una secuencia modificada (es decir, diferente de la de un miARN maduro) que se diseña

60 para suprimir un gen diana diferente de los genes diana suprimidos naturalmente por la secuencia del miARN precursor natural.

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(a) Seleccionar una única secuencia diana de al menos 18 nucleótidos específica del gen diana, utilizando, por

5 ejemplo, herramientas de alineación de secuencias tales como BLAST (véanse, por ejemplo, Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol., 215:403-410; Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res., 25:3389-3402), por ejemplo, o las bases de datos de ADNc de maíz y las bases de datos de ADN genómico, para identificar ortólogos de transcritos diana y cualesquiera emparejamientos potenciales con genes no relacionados, evitando por tanto el silenciamiento no deseado de secuencias no diana.

10 (b) Analizar el gen diana para las secuencias indeseables (por ejemplo, emparejamientos con secuencias de especies no dianas, especialmente animales), y puntuación de cada segmento potencial de 19-mer para el contenido de GC, Puntuación de Reynolds (véase Reynolds y col. (2004) Nature Biotechnol., 22:326-330), y asimetría funcional caracterizada por una diferencia negativa en la energía libre ("ΔΔG") (véase Khvorova y col. (2003) Cell, 115:209-216). Preferentemente, se seleccionan las 19-mer que tienen todas o la mayoría de las

15 siguientes características: (1) una puntuación de Reynolds >4, (2) un contenido de GC entre aproximadamente 40% a aproximadamente 60%, (3) una ΔΔG negativa, (4) una adenosina terminal, (5) ausencia de un ciclo consecutivo de 4 o más de los mismos nucleótidos; (6) una localización próxima al extremo 3' del gen diana; (7) diferencias mínimas procedentes del transcrito de miARN precursor. Se seleccionan preferentemente (3 o más) 19 mer para la prueba.

20 (c) determinar el complemento inverso de las 19-mer seleccionadas para usar en la preparación de un miARN maduro modificado; el nucleótido adicional en la posición 20 se empareja preferentemente con la secuencia diana modificada, y el nucleótido en la posición 21 se selecciona preferentemente para no estar emparejado para evitar la diseminación del silenciamiento en el transcrito diana.

(d) ensayar el miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética, por ejemplo, en una prueba de Nicotiana

25 benthamiana transitoria mediada por Agrobacterium para la expresión del miARN maduro modificado y la represión diana.

y (e) clonar el miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética más eficaz en una construcción para la transformación estable del maíz (véanse las secciones bajo los encabezados "Preparación y utilización de construcciones de ADN recombinante" y "Preparación y utilización de células de plantas transgénicas no naturales y

30 plantas transgénicas no naturales").

(C) Expresión de un transgén y un sitio de reconocimiento del miARN.

La construcción de ADN recombinante incluye además una unidad de transcripción del transgén, en el que el al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana incluye un elemento de ADN que se localiza en o adyacente a la unidad de transcripción del transgén y esta se transcribe a ARN que 35 incluye un sitio reconocimiento del miARN mediante un miARN maduro derivado de una secuencia de un miARN precursor de planta seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819, y el al menos un gen diana incluye el transgén codificado por la unidad de transcripción del transgén, y en el que la expresión de la construcción de ADN recombinante en una planta da como resultado la expresión del transgén en 40 células de la planta en las que el miARN maduro no se expresa naturalmente. Se prefiere que los sitios de reconocimiento del miARN sean aquellos previstos para ser reconocidos por al menos un miARN maduro seleccionado a partir de un miARN maduro seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1 -1035, SEQ ID NOS. 2730 3921, SEQ ID NOS. 5498 -6683, SEQ ID NOS. 8409 -8560, SEQ ID NO. 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812 -8815, SEQ ID NO. 8845, y la SEQ ID NO. 8850, o por al menos un miARN maduro derivado de una

45 secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 39225497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819. La predicción de un sitio de reconocimiento se logra usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como reglas de complementariedad de secuencia, tal como se describen por Zhang (2005) Nucleic Acids Res., 33:W701-704 y por Rhoades y col. (2002) Cell, 110:513-520.

50 La predicción de un sitio de reconocimiento del miARN permite la identificación y validación de genes endógenos regulados por los miARN a partir de un miARN precursor expresado naturalmente; esto es útil, por ejemplo, para eliminar o modificar un sitio de reconocimiento del miARN en un gen endógeno para desacoplar la expresión de este gen de la desregulación por el miARN endógeno que regula naturalmente la expresión del gen. Por ejemplo, el número de emparejamientos incorrectos que implican bases en las posiciones 2 a 13 (en un sitio de reconocimiento

55 del miARN que tiene 21 nucleótidos contiguos) puede aumentarse para evitar el reconocimiento y la escisión por el miARN.

Estas construcciones de ADN recombinante son particularmente útiles para la expresión in planta del transgén en un modelo espacial, temporal, o inducible específico sin la necesidad de un promotor que tiene este patrón de expresión específico. Estas construcciones de ADN recombinante permiten, por ejemplo, la expresión restringida de un gen 60 transcrito mediante un promotor constitutivo o un promotor con la expresión más allá del tipo de célula o tejido(s) deseado(s). La expresión restringida puede restringirse espacial o temporalmente, por ejemplo, restringirse a tipos

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de tejidos o células o archivos, o a un desarrollo específico, reproductivo, crecimiento, o etapas estacionales. Cuando un miARN se expresa en condiciones concretas (por ejemplo, bajo estrés biótico tal como apiñamiento, interacciones alelopáticas o plagas o infestación de patógenos, o un estrés abiótico tal como un estrés por calor o por frío, estrés por sequía, estrés por nutrientes, estrés de metales pesados o de sales), el sitio de reconocimiento

5 del miARN correspondiente puede utilizarse para la supresión condicionalmente específica, es decir, para suprimir un transgén en una condición concreta. En un ejemplo no limitante, una construcción de ADN recombinante que codifica (a) un transgén bajo el control de un promotor constitutivo y (b) un sitio de reconocimiento del miARN reconocido por un miARN maduro que se expresa específicamente solo en condiciones de estrés hídrico, se puede usar para la expresión del transgén en una planta en condiciones sin estrés hídrico. En otro ejemplo no limitante, una construcción de ADN recombinante que codifica (a) un transgén que expresa una proteína insecticida bajo el control de un promotor específicamente inducible mediante cicatrización, y (b) un sitio de reconocimiento del miARN reconocido por un miARN maduro que se expresa en tejidos diferentes de la raíz, se puede usar para la expresión limitada de la proteína insecticida en raíces de plantas en condiciones cuando la planta está siendo atacada por una plaga de insectos.

15 La unidad de transcripción del transgén incluye al menos un transgén, y opcionalmente una secuencia adicional tal como un promotor, un potenciador del promotor, un terminador, un ARN mensajero que estabiliza o desestabiliza la secuencia (véanse, por ejemplo, Newman y col. (1993) Plant Cell, 5:701-714; Green (1993) Plant Physiol., 102:10651070; y Ohme-Takagi y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11811-11815), secuencia para la localización o el transporte del transcrito del transgén a una localización específica (por ejemplo, mitocondria, plástido, nucléolo, peroxisoma, retículo endoplasmático), u otra secuencia relacionada con el procesamiento deseado del transgén. El transgén codificado por la unidad de transcripción del transgén puede incluir uno cualquiera o más genes de interés, incluyendo una secuencia codificante, secuencia no codificante, o ambos. Los genes de interés pueden incluir cualquiera de los genes relacionados en "Genes diana", cuyos ejemplos preferidos incluyen la secuencia (codificante) traducible de los genes que codifican factores de transcripción y genes que codifican enzimas

25 implicadas en la biosíntesis o catabolismo de moléculas de interés (tales como, aminoácidos, ácidos grasos y otros lípidos, azúcares y otros hidratos de carbono, polímeros biológicos, y metabolitos secundarios incluyendo alcaloides, terpenoides, policétidos, péptidos no ribosómicos, y metabolitos secundarios de origen biosintético mixto).

(D) Supresión de un miARN endógeno o natural.

El al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana incluye un elemento de ADN para suprimir la expresión de un miARN endógeno derivado de una secuencia de un miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036-2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819. Se prefiere que el al menos un gen diana sea un gen endógeno de una planta, y la expresión del gen endógeno esté suprimida en células de la planta cuando se produce la expresión natural del miARN endógeno, y de esta manera, la expresión

35 de la construcción de ADN recombinante en las células da como resultado la expresión del gen endógeno en las células.

El elemento de ADN para suprimir la expresión incluye al menos uno de:

(a)

ADN que incluye al menos un segmento de ADN de sentido contrario que es de sentido contrario para al menos un segmento del gen diana;

(b)

ADN que incluye múltiples copias de al menos un segmento de ADN de sentido contrario que es de sentido contrario para al menos un segmento del gen diana;

(c)

ADN que incluye al menos un segmento de ADN de sentido directo que tiene al menos un segmento del gen diana;

(d) ADN que incluye múltiples copias de al menos un segmento de ADN de sentido directo que tiene al menos un 45 segmento del gen diana;

(e)

ADN que se transcribe a ARN para suprimir el gen diana formando ARN bicatenario e incluye al menos un segmento de ADN de sentido contrario que es de sentido contrario para al menos un segmento del gen diana y al menos un segmento de ADN de sentido directo que tiene al menos un segmento del gen diana;

(f)

ADN que se transcribe a ARN para suprimir el gen diana formando un único ARN bicatenario e incluye múltiples segmentos de ADN de sentido contrario en serie que son de sentido contrario para al menos un segmento del gen diana y múltiples segmentos de ADN de sentido directo en serie que tienen al menos un segmento del gen diana

(g)

ADN que se transcribe a ARN para suprimir el gen diana formando múltiples ARN bicatenarios e incluye múltiples segmentos de ADN de sentido contrario que son de sentido contrario para al menos un segmento del

55 gen diana y múltiples segmentos de ADN de sentido directo que tienen al menos un segmento del gen diana, y en los que los múltiples segmentos de ADN de sentido contrario y los múltiples segmentos de ADN con sentido están dispuestos en una serie de repeticiones invertidas;

(h)

ADN que incluye nucleótidos procedentes de un miARN de planta;

(i)

ADN que incluye nucleótidos de ARNpi;

(j)

ADN que se transcribe en un aptámero de ARN capaz de unirse a un ligando; y

(k)

ADN que se transcribe a un aptámero de ARN capaz de unirse a un ligando, y ADN que se transcribe a ARN regulador capaz de regular la expresión del gen diana, en el que la regulación es dependiente de la conformación

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Los elementos del ADN para suprimir la expresión se describen más detalladamente en el Ejemplo 3 y se representan gráficamente en las Figuras 2 y 3.

5 La construcción de ADN recombinante incluye el ADN diseñado para transcribirse a ARN monocatenario o al menos ARN parcialmente bicatenario (tal como en una disposición "tallo-bucle en contacto"), o a un ARN que asume un estructura secundaria o una configuración tridimensional (por ejemplo, un bucle grande de secuencia de sentido contrario del gen diana o un aptámero) que confiere al transcrito una característica deseada adicional, tal como una estabilidad aumentada, una semivida aumentada in vivo, o una especificidad celular o tisular. En un ejemplo, el

10 separador se transcribe a un bucle estabilizante que une la primera y segunda serie de segmentos de ARN contiguos (véase, por ejemplo, Di Giusto y King (2004) J. Biol. Chem., 279:46483-46489). En otro ejemplo, la construcción de ADN recombinante incluye el ADN que se transcribe a ARN que incluye un aptámero de ARN (por ejemplo, un aptámero que se une a un ligando específico de célula que permite el direccionamiento específico de célula o tejido del duplete de ARN recombinante.

15 La construcción de ADN recombinante se prepara mediante técnicas comúnmente utilizadas, tales como aquellas descritas en el encabezado "Elaboración y uso de construcciones de ADN recombinante" e ilustradas en los ejemplos de trabajo. La construcción de ADN recombinante es particularmente útil para preparar células de plantas transgénicas no naturales, plantas transgénicas no naturales, y semillas transgénicas como se describe a continuación en "Células de plaas transgénicas y plantas transgénicas".

20 Se pueden controlar los efectos de un miARN sobre su gen diana mediante procedimientos alternativos descritos en detalle a continuación en "Secuencias señuelo de microARN".

Genes diana

La construcción de ADN recombinante se puede diseñar para suprimir cualesquiera genes diana o genes. El gen diana puede tener una secuencia traducible (codificante), o puede ser una secuencia no codificante (tal como 25 secuencia reguladora no codificante), o ambos, y puede incluir al menos un gen seleccionado entre el grupo que consiste en un gen diana eucariota, un gen diana no eucariota, una secuencia de ADN precursora de miARN, y un promotor de microARN. El gen diana puede ser natural (endógeno) para la célula (por ejemplo, una célula vegetal o animal) en la que se transcribe la construcción de ADN recombinante, o puede ser nativo para una plaga o patógeno de la planta o animal en el que se transcribe la construcción de ADN recombinante. El gen diana puede ser un gen

30 exógeno, tal como un transgén de una planta. Un gen diana puede ser un gen natural usado como diana para la supresión, con o sin la expresión concurrente de un transgén exógeno, por ejemplo, mediante la inclusión de un elemento de expresión génica en la construcción de ADN recombinante, o en una construcción de ADN recombinante separada. Por ejemplo, puede ser deseable reemplazar un gen natural por un homólogo transgénico exógeno.

35 El gen diana puede incluir un solo gen o parte de un solo gen que se use como diana para la supresión, o puede incluir, por ejemplo, múltiples segmentos consecutivos de un gen diana, múltiples segmentos no consecutivos de un gen diana, múltiples alelos de un gen diana, o múltiples genes diana de una o más especies. Un gen diana puede incluir cualquier secuencia de cualquier especie (incluyendo no eucariotas tales como bacterias, y virus; hongos; plantas, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas, tales como plantas de cultivo, plantas ornamentales, y

40 plantas no domesticadas o salvajes; invertebrados tales como artrópodos, anélidos, nematodos, y moluscos; y vertebrados tales como anfibios, pescado, aves, mamíferos domésticos o salvajes, e incluso seres humanos.

El gen diana es exógeno para la planta en la que se va a transcribir la construcción de ADN recombinante, pero endógeno para una plaga o patógeno (por ejemplo, virus, bacterias, hongos, oomicetos, e invertebrados tales como insectos, nematodos, y moluscos) de la planta. El gen diana puede incluir múltiples genes diana, o múltiples

45 segmentos de uno o más genes. Se prefiere que, el gen o genes diana es un gen o genes de una plaga o patógeno invertebrado de la planta, dichos genes diana son particularmente útiles para proporcionar plantas transgénicas no naturales que tienen resistencia a una o más plagas o patógenos de plantas, por ejemplo, resistencia a un nematodo tal como el nematodo del quiste de la soja o nematodo del nudo de la raíz o a una plaga de insectos.

El gen diana puede tener una secuencia traducible (codificante), o puede ser una secuencia no codificante (tal como

50 secuencia reguladora no codificante), o ambos. Los ejemplos de un gen diana incluyen secuencia no traducible (no codificante), tales como, pero no de forma limitativa, regiones 5' no traducidas, promotores, potenciadores, u otras regiones transcripcionales no codificantes, regiones 3' no traducidas, terminadores, e intrones. Los genes diana incluyen genes que codifican microARN, ARN interferentes pequeños, componentes de ARN de ribosomas o ribozimas, ARN nucleolares pequeños, y otros ARN no codificantes (véase, por ejemplo, secuencias de ARN no

55 codificantes proporcionadas de forma pública en rfam.wustl.edu; Erdmann y col. (2001) Nucleic Acids Res., 29:189193; Gottesman (2005) Trends Genet., 21:399-404; Griffiths-Jones y col. (2005) Nucleic Acids Res., 33:121-124). Un ejemplo específico de un gen diana incluye un sitio de reconocimiento de microARN (esto es, el sitio de una hebra de ARN al que se une un miARN maduro e induce la escisión). Otro ejemplo específico de un gen diana incluye una

5

15

25

35

45

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secuencia precursora de microARN natural para una plaga o patógeno de la planta transgénica no natural, es decir, el transcrito primario que codifica un microARN, o los intermedios de ARN procesados a partir de este transcrito primario (por ejemplo, un pri-miARN o un pre-miARN limitado nuclear que se puede exportar desde el núcleo al citoplasma). Véanse, por ejemplo, Lee y col. (2002) EMBO Journal, 21:4663-4670; Reinhart y col. (2002) Genes y Dev., 16:161611626; Lund y col. (2004) Science, 303:95-98; y Millar y Waterhouse (2005) Funct. Integer. Genomics, 5:129-135. Los genes diana también pueden incluir secuencias traducibles (de codificación) que codifican factores de transcripción y genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis o catabolismo de moléculas de interés (tales como aminoácidos, ácidos grasos y otros lípidos, azúcares y otros hidratos de carbono, polímeros biológicos, y metabolitos secundarios incluyendo alcaloides, terpenoides, policétidos, péptidos no ribosómicos, y metabolitos secundarios de origen biosintético mixto).

Se prefiere que el gen diana sea un gen esencial de una plaga o patógenos de la planta. Los genes esenciales incluyen genes que son necesarios para el desarrollo de la plaga o patógeno hasta un estado adulto reproductivo fértil. Los genes esenciales incluyen genes que, cuando se silencian o suprimen, dan como resultado la muerte del organismo (en forma de un adulto o en cualquier estado del desarrollo, incluyendo gametos) o la incapacidad del organismo para reproducirse de manera satisfactoria (por ejemplo, esterilidad en un progenitor macho o hembra o letalidad para el zigoto, embrión, o larva). Se encuentra una descripción de los genes esenciales de nematodos, por ejemplo, en Kemphues, K. "Essential Genes" (24 de diciembre de 2005), WormBook, ed. The C. elegans Research Community, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.57.1, disponible en línea en www.wormbook.org. Los ejemplos no limitantes de genes esenciales de los nematodos incluyen la proteína espermática principal, ARN polimerasa II, y quitina sintasa (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US20040098761); los genes esenciales adicionales para el nematodo quístico de la semilla de soja se proporcionan en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2007/0271630. Se dispone públicamente de una descripción de genes de insecto en la base de datos de genoma de Drosophila (disponible en línea en flybase.bio.indiana.edu/). La mayoría de los genes de Drosophila previstos se han analizado para determinar su función mediante un cribado de cultivos celulares basado en interferencia de ARN, dando como resultado la identificación de 438 genes esenciales; véase Boutros y col. (2004) Science, 303:832-835, y material complementario disponible en línea en www.sciencemag.org/cgi/content/full/303/5659/832/DC1. Se proporciona una descripción de genes bacterianos y fúngicos esenciales en la base de datos de genes esenciales ("DEG", disponible en línea en tubic.tju.edu.cn/deg/); véase Zhang y col., (2004) Nucleic Acids Res., 32:D271-D272.

Las plagas de invertebrados de las plantas incluyen las plagas de nematodos, plagas de moluscos (babosas y caracoles), y plagas de insectos. Los fitopatógenos de interés incluyen hongos, oomicetos, bacterias (por ejemplo, las bacterias que causan el manchado de las hojas, fuego bacteriano, agalla de la corona, y la marchitez bacteriana), micoplasmas, y virus (por ejemplo, los virus que causan mosaicos, bandeo de venas, moteado, manchado, o crecimiento anormal). Véase también G. N. Agrios, "Plant Pathology" (Cuarta edición), Academic Press, San Diego, 1997, 635 pp., para las descripciones de hongos, bacterias, micoplasmas (incluyendo micoplasmas y espiroplasmas), virus, nematodos, plantas superiores parasíticas, y protozoos flagelados, todos los cuales son plagas o patógenos de plantas de interés. Véase también la compilación continuamente actualizada de plagas y patógenos de plantas y las enfermedades causadas por estos en "Common Names of Plant Diseases" de la American Phytopathological Society, compilado mediante el Committee on Standardization of Common Names for Plant Diseases de The American Phytopathological Society, 1978-2005, disponible en línea en www.apsnet.org/online/common/top.asp.

Los ejemplos no limitativos de patógenos de planta fúngicos de interés particular incluyen, por ejemplo, los hongos que provocan el moho pulverulento, herrumbre, mancha y tizón foliar, podredumbre húmeda, podredumbre de raíces, podredumbre de la corona, podredumbre de la cápsula del algodón, cancro del tallo, cancro de la varilla, marchitez vascular, tizón, o moho, incluyendo, pero no de forma limitativa, Fusarium spp., Phakospora spp., Rhizoctonia spp., Aspergillus spp., Gibberella spp., Pyricularia spp., y Alternaria spp. Los ejemplos específicos de patógenos fúngicos de plantas incluyen Phakospora pachirhizi (rota asiática de la soja), Puccinia sorghi(roya común del maíz), Puccinia polysora (roya meridional del maíz), Fusarium oxysporum y otras Fusarium spp., Alternaria spp., Penicillium spp., Rhizoctonia solani, Exserohilum turcicum (añublo foliar del maíz boreal), Bipolaris maydis (añublo foliar del maíz meridional), Ustilago maydis (tizón el maíz), Fusarium graminearum (Gibberella zeae), Fusarium verticilliodes (Gibberella moniliformis), F. proliferatum (G. fujikuroi var. intermedia), F. subglutinans (G. subglutinans), Diplodia maydis, Sporisorium holci-sorghi, Colletotrichum graminicola, Setosphaeria turcica, Aureobasidium zeae, Sclerotinia sclerotiorum, y las numerosas especies fúngicas proporcionadas en las tablas 4 y 5 de la patente de Estados Unidos 6.194.636. Los ejemplos no limitativos de patógenos de plantas incluyen patógenos clasificados anteriormente como hongos, pero clasificados más recientemente como oomicetos. Los ejemplos específicos de patógenos de plantas oomicetos de interés particular incluyen miembros del género Pythium (por ejemplo, Pythium aphanidermatum) y Phytophthora (por ejemplo, Phytophthora infestans, Phytophthora sojae) y organismos que provocan el mildiu (por ejemplo, Peronospora farinosa).

Los ejemplos no limitativos de patógenos bacterianos incluyen los micoplasmas que causan enfermedades de amarilleamiento y espiroplasmas tales como Spiroplasma kunkelii, que produce el achaparramiento del maíz, eubacteria tales como Pseudomonas avenae, Pseudomonas andropogonis, Erwinia stewartii, Pseudomonas syringae pv. syringae, Xylella fastidiosa, y las numerosas especies bacterianas proporcionadas en la Tabla 3 de la patente de Estados Unidos 6.194.636.

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Los ejemplos no limitativos de patógenos víricos de las plantas de especial interés incluyen el virus del mosaico enano del maíz (MDMV), virus del mosaico de la caña de azúcar (SCMV, anteriormente MDMV cepa B), virus del mosaico del trigo común (WSMV), virus del maíz enano clorótico (MCDV), virus de la cebada enana amarilla (BYDV), virus del ápice en racimo del plátano (BBTV), y los numerosos virus relacionados en la Tabla 2 de la patente de Estados Unidos 6.194.636.

Los ejemplos no limitativos de plagas de invertebrados incluyen nematodos de quistes Heterodera spp. especialmente el nematodo del quiste de la soja Heterodera glycines, nematodos del nudo de la raíz Meloidogyne spp., nematodos lanza Hoplolaimus spp., nematodos achaparrados Tylenchorhynchus spp., nematodos en espiral Helicotylenchus spp., nematodos que inducen lesiones Pratylenchus spp., nematodos de anillo Criconema spp., nematodos foliares Aphelenchus spp. o Aphelenchoides spp., gusano de la raíz del maíz, Lygus spp., pulgones e insectos chupadores de savia similares, tales como la filoxera (Daktulosphaira vitifoliae), perforadores del maíz, gusanos cortadores, gusanos soldado, langostas, escarabajos japoneses, saltamontes, y otras plagas de coleópteros, dípteros, y lepidópteros. Los ejemplos específicos de plagas de invertebrados incluyen plagas capaces de infestar el sistema radicular de las plantas de cultivo, por ejemplo, gusano de la raíz del maíz boreal (Diabrotica barbers), gusano de la raíz del maíz meridional (Diabrotica barbers), gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica barbers), áfido de la raíz del maíz (Anuraphis maidiradicis), oruga negra (Agrotis ipsilon), oruga vítrea (Crymodes devastator), oruga gruesa (Feltia ducens), oruga gris (Agrotis gladiaria), gusanos elatéridos (Melanotus spp., Aeolus mellillus), elatérido del trigo (Aeolus mancus), elatérido de la arena (Horistonotus uhlerii), picudo del maíz (Sphenophorus maidis), picudo Timothy (Sphenophorus zeae), picudo de la poa (Sphenophorus parvulus), picudo del maíz meridional (Sphenophorus callosus), escarabajo blanco (Phyllophaga spp.), gusano de la semilla del maíz (Delia platura), colaspis de la uva (Colaspis brunnea), escarabajo de la semilla de maíz (Stenolophus lecontei), escarabajo delgado de la semilla del maíz (Clivinia impressifrons), así como los nematodos parasíticos listados en la Tabla 6 de la patente de Estados Unidos 6.194.636.

Las plagas de invertebrados de especial interés, especialmente, pero sin limitarse a las regiones del hemisferio sur (incluyendo América del Sur y Central) incluyen áfidos, gusano de la raíz del maíz, spodoptera, noctuideae, escarabajo de la patata, Lygus spp., cualquier hemíptero, homóptero, o heteróptero, cualquier lepidóptero, cualquier coleóptero, nematodos, gusanos cortadores, oruga nocturna, gusanos soldado, perforadores, enrolladores de hojas, y otros. Las plagas de artrópodos especialmente abarcadas por la presente invención abarcan varias especies de gusanos cortadores incluyendo la oruga cortadora (Agrotis repleta), oruga negra (Agrotis ipsilon), gusano cortador (Anicla ignicans), gusano cortador granulado (Feltia subterranea), "gusano aspero" (Agrotis malefida); polilla de la harina mediterránea (Anagasta kuehniella), coleóptero del grano de cabeza cuadrada (Cathartus quadricollis), escarabajo pulga (Chaetocnema spp), polilla del arroz (Corcyra cephalonica), gusano de la raíz del maíz o "vaquita de San Antonio" (Diabotica speciosa), perforador de la caña de azúcar (Diatraea saccharalis), barrenador menor del maíz (Elasmopalpus lignosellus), chinche marrón (Euschistus spp.), oruga del maíz (Helicoverpa zea), gorgojo plano del grano (Laemophloeus minutus), polilla saltamontes (Mocis latipes), coleóptero del grano con dientes de sierra (Oryzaephilus surinamensis), polilla del grano molido (Pyralis farinalis), polilla del grano molido de la India (Plodia interpunctella), pulgón de la hoja de maíz (Rhopalosiphum maidis), cucaracha cavadora o "chinche subterranea"(Scaptocoris castanea), pulgón verde (Schizaphis graminum), gorgojo del grano (Sitophilus zeamais), polilla del grano de Angulema (Sitotroga cerealella), palomilla del maíz (Spodoptera frugiperda), escarabajo mauritano (Tenebroides mauritanicus), araña roja (Tetranychus urticae), escarabajo rojo de la harina (Triboleum castaneum), oruga del algodón (Alabama argillacea), gorgojo (Anthonomus grandis), pulgón del algodón (Aphis gossypii), mosca blanca de la batata (Bemisia tabaci), varias especies de arañuelas (Frankliniella spp.), oruga del algodón (Helicoverpa zea), "oruga bolillera" (por ejemplo, Helicoverpa geletopoeon), gusano del brote de tabaco (Heliothis virescens), chinche verde (Nezara viridula), polilla del gusano rosado (Pectinophora gossypiella), palomilla de la remolacha (Spodoptera exigua), ácaro rojo (Tetranychus spp.), arañuela de la cebolla (trips tabaci), mosca blanca del invernadero (Trialeurodes vaporarium), oruja de la judía aterciopelada (Anticarsia gemmatalis), escarabajo moteado del maíz o "astilo moteado" (Astylus atromaculatus), "oruga de la alfalfa" (Colias lesbia), "chinche marrón" o "chinche de los cuernos" (Dichelops furcatus), "alquiche chico" (Edessa miditabunda), meloidos (Epicauta spp.), "barrenador del brote" (Epinotia aporema), "oruga verde del yuyo colorado" (Loxostege bifidalis), nematodos del nudo de la raíz (Meloidogyne spp.), "oruga cuarteadora" (Mocis repanda), chinche verde meridional (Nezara viridula), "chinche de la alfalfa" (Piezodorus guildinii), gusano verde del trébol (Plathypena scabra), saltamontes de la soja (Pseudoplusia includens), polilla saltamontes "isoca medidora del girasol" (Rachiplusia nu), oruga lanuda (Spilosoma virginica), palomilla listada (Spodoptera ornithogalli), varios gorgojos de la raíz (familia Curculionidae), varios elatéridos (familia Elateridae), y varios escarabajos blancos (familia Scarabaeidae). Las plagas de nematodos específicamente abarcadas por la invención incluyen las plagas de nematodos del maíz (Belonolaimus spp., Trichodorus spp., Longidorus spp., Dolichodorus spp., Anguina spp., Pratylenchus spp., Meloidogyne spp., Heterodera spp.), soja (Heterodera glycines, Meloidogyne spp., Belonolaimus spp.), plátano (Radopholus similis, Meloidogyne spp., Helicotylenchus spp.), caña de azúcar (Heterodera sacchari, Pratylenchus spp., Meloidogyne spp.), naranjas (Tylenchulusspp., Radopholus spp., Belonolaimus spp., Pratylenchus spp., Xiphinema spp.), café (Meloidogyne spp., Pratylenchus spp.), palmera de coco (Bursaphelenchus spp.), tomates (Meloidogyne spp., Belonolaimus spp., Nacobbus spp.), uvas (Meloidogyne spp., Xiphinema spp., Tylenchulus spp., Criconemella spp.), limón y lima (Tylenchulus spp., Radopholus spp., Belonolaimus spp., Pratylenchus spp., Xiphinema spp.), cacao (Meloidogyne spp., Rotylenchulus reniformis), piña (Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Rotylenchulus reniformis), papaya (Meloidogyne spp., Rotylenchulus reniformis), pomelo (Tylenchulus spp.,

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Los genes diana de las plagas pueden incluir genes de invertebrados de la proteína principal del esperma, alfa tubulina, beta tubulina, ATPasa vacuolar, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, ARN polimerasa II, quitina sintasa, citocromos, miARN, moléculas precursoras de miARN, promotores de miARN, así como otros genes tales 5 como los desvelados en las publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2006/0021087, documento WO 05/110068, y en la Tabla II de la publicación de patente de Estados Unidos 2004/0098761. Los genes diana de patógenos pueden incluir los genes de los factores de inicio de la traducción vírica, replicasas víricas, miARN, moléculas precursoras de miARN, tubulina fúngica, ATPasa vacuolar fúngica, quitina sintasa fúngica, quinasas MAP fúngicas, Pac1 Tyr/Thr fosfatasa fúngica, enzimas implicadas en el transporte de nutrientes (por ejemplo, 10 transportadores de aminoácidos o transportadores de azúcares), enzimas implicadas en la biosíntesis de la pared celular fúngica, cutinasas, enzimas biosintéticas de melanina, poligalacturonasas, pectinasas, pectina liasas, celulasas, proteasas, genes que interactúan los genes de la avirulencia en plantas, y otros genes implicados en la invasión y la replicación del patógeno en la planta infectada. De este modo, un gen diana no tiene que ser exógeno para la planta en la que se transcribe la construcción de ADN recombinante. Una construcción de ADN recombinante

15 se puede transcribir en una planta y usarse para suprimir un gen de un patógeno o plaga que puede infestar a la planta.

Los ejemplos no limitantes específicos de genes diana adecuados también incluyen los genes catabólicos de aminoácidos (como el gen LKR/SDH del maíz que codifica la lisina-cetoglutarato reductasa (LKR) y la sacaropina deshidrogenasa (SDH), y sus homólogos), genes de zeína del maíz, genes implicados en la síntesis de ácidos 20 grasos (por ejemplo, ácido graso desaturasas microsomiales vegetales y acil-ACP tioesterasas vegetales, tales como los desvelados en las patentes de Estados Unidos con números 6.426.448, 6.372.965, y 6.872.872), genes implicados en rutas de biosíntesis de múltiples etapas, donde puede ser interesante regular el nivel de uno o más intermedios, tales como genes que codifican enzimas para la biosíntesis de polihidroxialcanoato (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º 5.750.848); y genes que codifican proteínas de control del ciclo celular, tales como 25 proteínas con actividad de tipo inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) (véanse, por ejemplo, los genes desvelados en el documento WO 050/07829). Los genes diana pueden incluir genes que codifican proteínas no deseadas (por ejemplo, alérgenos o toxinas) o enzimas para la biosíntesis de compuestos no deseados (por ejemplo, componentes de sabor u olor no deseados). De este modo, una realización de la invención es una planta transgénica no natural o tejido de dicha planta que mejora mediante la supresión de proteínas alergénicas o toxinas, 30 por ejemplo, un cacahuete, soja, o almendra de trigo con una alergenicidad reducida. Los genes diana pueden incluir genes implicados en la maduración de la fruta, tales como poligalactouronasa. Los genes diana pueden incluir genes cuya expresión está preferentemente limitada a una célula o tejido o estadio del desarrollo concretos, o donde la expresión es preferentemente transitoria, es decir, donde una supresión constitutiva o general, o una supresión que se propaga a través de diferentes tejidos, no se desea necesariamente. De este modo, otros ejemplos de genes

35 diana adecuados incluyen genes que codifican proteínas que, cuando se expresan en plantas transgénicas, convierten las plantas transgénicas en resistentes a plagas o patógenos (véase, por ejemplo, los genes de la colesterol oxidasa que se desvelan en la patente de Estados Unidos n.º 5.763.245); genes cuya expresión está inducida por plagas o patógenos; y genes que puede reducir o restaurar la fertilidad (véase, por ejemplo, los genes barstar/barnasa descritos en la patente de Estados Unidos n.º 6.759.575).

40 La construcción de ADN recombinante puede diseñarse para suprimir de manera más específica el gen diana, por ejemplo, diseñando la construcción de ADN recombinante para codificar un miARN maduro para incluir regiones sustancialmente no idénticas (o no complementarias) de una secuencia de un gen no diana. Los genes no diana pueden incluir cualquier gen no previsto para su silenciamiento o supresión, bien en una planta que contiene la construcción de ADN recombinante o en organismos que puedan entrar en contacto con la construcción de ADN

45 recombinante. Una secuencia de gen no diana puede incluir cualquier secuencia de cualquier especie (incluyendo no eucariotas tales como bacterias, y virus; hongos; plantas, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas, tales como plantas de cultivo, plantas ornamentales, y plantas no domesticadas o salvajes; invertebrados tales como artrópodos, anélidos, nematodos, y moluscos; y vertebrados tales como anfibios, pescado, aves, mamíferos domésticos o salvajes, e incluso seres humanos).

50 El gen diana es un gen endógeno para una especie dada, tal como una planta dada (tal como una planta importante desde el punto de vista agrícola o comercial, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas), y el gen no diana puede ser, por ejemplo, un gen de una especie no diana, tal como otra especie vegetal o un gen de un virus, hongo, bacteria, invertebrado, o vertebrado, incluso un ser humano. Un ejemplo no limitante es cuando la construcción de ADN recombinante se diseña para que suprima un gen diana que es un gen endógeno para una sola especie (por

55 ejemplo, gusano de la raíz del maíz meridional, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) pero no suprimir un gen no diana, tales como genes de especies relacionadas, incluso estrechamente relacionadas (por ejemplo, gusano de la raíz del maíz, Diabrotica barberi Smith y Lawrence, o el gusano de la raíz del maíz meridional, Diabrotica undecimpunctata).

En los casos en los que es deseable suprimir un gen diana entre múltiples especies, puede ser deseable diseñar la

60 construcción de ADN recombinante para suprimir una secuencia del gen diana común para varias especies en las que se debe silenciar el gen diana. De este modo, se puede seleccionar un duplete de ARN para que sea específico de un taxón (por ejemplo, específico de un género, familia, o incluso un taxón más grande como un mismo filum, por ejemplo, arthropoda) pero no para otros taxones (por ejemplo, plantas o vertebrados o mamíferos). En un ejemplo no limitante, se puede seleccionar una construcción de ADN recombinante para silenciamiento génico de forma que se dirija a hongos patógenos (por ejemplo, a Fusarium spp.) pero no se dirija a ninguna secuencia génica de hongos beneficiosos.

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5 En otro ejemplo no limitante, puede seleccionarse una construcción de ADN recombinante para silenciar un gen diana del gusano de la raíz del maíz para que sea específico para todos los miembros del género Diabrotica. En un ejemplo adicional de esta realización, dicha construcción de ADN recombinante dirigida a Diabrotica puede seleccionarse de tal forma que no se dirija a ninguna secuencia génica de especies de insectos beneficiosas (por ejemplo, escarabajos predadores de coccinélidos, conocidos habitualmente como mariquitas) u otras especie de

10 insecto beneficiosas.

El grado de especificidad necesario de una construcción de ADN recombinante para silenciar un gen diana depende de diferentes factores. Los factores pueden incluir el tamaño y la secuencia de ácidos nucleicos de un microARN maduro codificado mediante la construcción de ADN recombinante, y la importancia relativa de disminuir dicho miARN maduro potencial para suprimir los genes no diana. En un ejemplo no limitante, cuando se espera que dicho

15 miARN maduro tenga un tamaño de 21 pares de bases, se prefiere que esto incluya el ADN que codifica un miARN maduro para silenciar un gen diana en el que el miARN maduro incluye secuencias que son prácticamente no idénticas a las de una secuencia de un gen no diana, tal como menos de 18, o menos de 17, o menos de 16, o menos de 15 emparejamientos de los 21 nucleótidos contiguos de una secuencia de gen no diana.

Puede ser deseable diseñar la miARN maduro para silenciar un gen diana para que incluya regiones que se prevé

20 que no generen polipéptidos indeseables, por ejemplo, mediante el cribado de la construcción de ADN recombinante para detectar secuencias que pueden codificar polipéptidos indeseables conocidos u homólogos cercanos de los mismos. Los polipéptidos indeseables incluyen polipéptidos homólogos de polipéptidos alérgenos conocidos y polipéptidos homólogos de toxinas polipeptídicas conocidas. Las secuencias públicamente disponibles que codifican dichos péptidos potencialmente alergénicos están disponibles, por ejemplo, de la bases de datos de alérgenos de la

25 Food Allergy Research and Resource Program (FARRP) (disponible en allergenonline.com) o las bases de datos Biotechnology Information for Food Safety Databases (disponible en www.iit.edu/~sgendel/fa.htm) (véase también, por ejemplo, Gendel (1998) Adv. Food Nutr. Res., 42:63-92). Las secuencias indeseables también pueden incluir, por ejemplo, aquellas secuencias polipeptídicas consideradas como toxinas conocidas o como alérgenos potenciales

o conocidos e incluidos en las bases de datos públicamente disponibles como GenBank, EMBL, SwissProt, y otras,

30 donde se pueden realizar búsquedas mediante el sistema Entrez (www.ncbi.nih.gov/Entrez). Los ejemplos no limitantes de secuencias peptídicas indeseables potencialmente alergénicas incluyen la glicina de soja, oleosina y aglutinina del cacahuete, gluteninas del trigo, caseína, lactoalbúmina, y lactoglobulina la leche de vaca, y tropomiosina de varias especies de marisco (allergenonline.com). Los ejemplos no limitantes de péptidos indeseables potencialmente tóxicos incluyen la toxina tetánica tetA de Clostridium tetani, toxinas diarreicas de

35 Staphylococcus aureus, y venenos tales como conotoxinas de Conus spp. y neurotoxinas de artrópodos y reptiles (www.ncbi.nih.gov/Entrez).

En un ejemplo no limitante, la construcción de ADN recombinante se criba para eliminar dichas secuencias que se pueden transcribir que codifican polipéptidos con una homología perfecta con un alérgeno o toxina conocida para 8 aminoácidos contiguos, o con una identidad de al menos un 35% para más de al menos 80 aminoácidos; dichos 40 cribados se pueden llevar a cabo sobre cualquiera, y posiblemente todos, los marcos de lectura en ambas direcciones, en marcos de lectura abiertos potenciales que comienzan con AUG (ATG en el ADN correspondiente), o en todos los posibles marcos de lectura, independientemente de si comienzan con un AUG (o ATG) o no. Cuando se consigue una "diana" o emparejamiento, es decir, cuando se identifica una secuencia que codifica un polipéptido potencial con una homología perfecta con un alérgeno o toxina conocidos para más de 8 aminoácidos contiguos (o

45 al menos una identidad de aproximadamente un 35% para más de al menos 80 aminoácidos), las secuencias de los ácidos nucleicos correspondientes a dicha diana se pueden evitar, eliminar, o modificar cuando se seleccionan las secuencias a utilizar en el ARN para silenciar un gen diana. La construcción de ADN recombinante se puede diseñar de forma que no haya un marco de lectura abierto potencial que comience con AUG (ATG en el ADN correspondiente).

50 La evitación, eliminación de, o modificación de, una secuencia indeseada, se puede conseguir mediante cualquiera de una serie de procedimientos conocidos del experto en la materia. En algunos casos, el resultado pueden ser secuencias novedosas que no se creía que existieran de manera natural. Por ejemplo, la evitación de determinadas secuencias se puede llevar a cabo uniendo secuencias "limpias" en secuencias novedosas quiméricas a utilizar en el duplete de ARN.

55 Los solicitantes reconocen que, en algunos silenciamientos de genes mediados por microARN, es posible que secuencias de miARN con emparejamiento imperfecto sean eficaces para el silenciamiento génico. Por ejemplo, se ha demostrado que los emparejamientos incorrectos próximos al centro de un sitio complementario de miARN tienen efectos más fuerte sobre el silenciamiento génico creado por el miARN de lo conseguido por emparejamientos incorrectos más alejados. Véase, por ejemplo, la Figura 4 de Mallory y col. (2004) EMBO J., 23:3356-3364. En otro

60 ejemplo, se ha notificado que, tanto la posición de un par de bases incorrectamente emparejado y la identidad de los nucleótidos que forman el emparejamiento incorrecto alteran la capacidad de un miARN dado para silenciar un gen diana, y que los emparejamientos incorrectos adenina-citosina, además del par de bases oscilante G:U, fueron bien tolerados (véase Du y col. (2005) Nucleic Acids Res., 33:1671-1677). De este modo, una hebra dada de la construcción de ADN recombinante no tiene que tener siempre una identidad de secuencia del 100% con el gen diana previsto, sino que generalmente tendría preferentemente una identidad de secuencia sustancial con el gen

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5 diana previsto, tal como aproximadamente un 95%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 85%, o aproximadamente un 80% de identidad de secuencia con un gen diana previsto. Si se describe en términos de complementariedad, una hebra de la construcción de ADN recombinante se diseña preferentemente para que tenga una complementariedad sustancial con la diana prevista (por ejemplo, un ARN mensajero diana o un ARN diana no codificante), tal como aproximadamente un 95%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 85%, o aproximadamente un 80% de complementariedad con la diana prevista. En un ejemplo no limitante, en el caso de una construcción de ADN recombinante que codifica un miARN maduro de 21 nucleótidos, el miARN maduro se ha diseñado para que sea sustancialmente, pero no perfectamente, complementario de los 21 nucleótidos contiguos de un ARN diana; preferentemente, el nucleótido en la posición 21 está no emparejado con la posición correspondiente del ARN diana para evitar la transitividad.

15 Un experto en la materia será capaz de juzgar la importancia dada al cribado de regiones previstas para que sean más fuertemente específicas del gen diana o previstas para que no generen polipéptidos indeseables, con respecto a la importancia dada a otros criterios, tal como el porcentaje de identidad de secuencia con el gen diana previsto o la eficacia de silenciamiento génico prevista para una secuencia dada. Por ejemplo, se puede diseñar una construcción de ADN recombinante que codifica un miARN maduro para que esté activo en varias especies y, por tanto, un experto en la materia puede determinar si es más importante incluir en la construcción de ADN recombinante un ADN que codifica un miARN maduro que sea específico de varias especies de interés, pero menos importante para seleccionar regiones previstas para tener una mayor eficacia de silenciamiento génico o regiones previstas para generar polipéptidos indeseables.

Promotores

25 En general, la construcción de ADN recombinante de la presente invención incluye un promotor, funcional en una célula vegetal, y unido operativamente al elemento de ADN transcribible. En varias realizaciones, el promotor se selecciona entre el grupo que consiste en un promotor constitutivo, un promotor espacialmente específico, un promotor temporalmente específico, un promotor específico del desarrollo, y un promotor inducible.

Los promotores no constitutivos adecuados para su uso con las construcciones de ADN recombinante de la invención incluyen promotores espacialmente específicos, promotores temporalmente específicos, y promotores inducibles. Los promotores espacialmente específicos pueden incluir promotores específicos de orgánulo, célula, tejido u órgano (por ejemplo, un promotor específico de plástido, un promotor específico de raíz, un promotor específico de polen, o un promotor específico de semilla, para suprimir la expresión del primer ARN diana en plástidos, raíces, polen, o semillas, respectivamente). En muchos casos, es especialmente útil un promotor

35 específico de semilla, específico de embrión, específico de aleurona o específico de endospermo. Los promotores temporalmente específicos pueden incluir promotores que tiendan a promover la expresión durante determinadas etapas del desarrollo en el ciclo de crecimiento de una planta, o durante diferentes tiempos del día o la noche, o en diferentes estaciones del año. Los promotores inducibles incluyen promotores inducidos por agentes químicos o por condiciones ambientales tales como, aunque no de forma limitativa, estrés biótico o abiótico (por ejemplo, déficit de agua o sequía, calor, frío, altos o bajos niveles de nutrientes o sales, altos o bajos niveles de luz, o infección por una plaga o patógeno). Un promotor específico de expresión también puede incluir promotores que se expresan generalmente de manera constitutiva pero con diferentes grados o "fuerzas" de expresión, incluyendo promotores considerados comúnmente como "promotores fuertes" o como "promotores débiles".

Los promotores de particular interés incluyen los siguientes ejemplos no limitantes: un promotor de opalina sintasa

45 aislado de ADN-T de Agrobacterium; un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor; elementos promotores potenciados o elementos promotores quiméricos, tales como un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) potenciado unido a un elemento potenciador (un intrón de la proteína 70 de choque térmico de Zea mays); promotores específicos de raíz, tales como aquellos desvelados en las patentes de Estados Unidos 5.837.848;

6.437.217 y 6.426.446; un promotor de oleosina L3 de maíz, desvelado en la patente de Estados Unidos 6.433.252; un promotor para un gen nuclear de una planta que codifica una aldolasa localizada en plástido desvelado en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2004/0216189; promotores inducibles por frío desvelados en la patente de Estados Unidos 6.084.089; promotores inducibles por sal desvelados en la patente de Estados Unidos número 6.140.078; promotores inducibles por luz desvelados en la patente de Estados Unidos 6.294.714; promotores inducibles por patógenos desvelados en la patente de Estados Unidos 6.252.138; y promotores

55 inducibles por déficit de agua desvelados en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2004/0123347.

El elemento promotor puede incluir secuencias de ácido nucleico que no son promotores, elementos promotores u homólogos de los mismos de origen natural pero que pueden regular la expresión de un gen. Los ejemplos de dichas secuencias reguladoras "independientes de un gen" incluyen secuencias de ARN de origen natural o diseñadas artificialmente que incluyen una región o aptámero de unión a ligando y una región reguladora (que puede ser de acción en cis). Véase, por ejemplo, Isaacs y col. (2004) Nat. Biotechnol., 22:841-847, Bayer y Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23:337-343, Mandal y Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5:451-463, Davidson y Ellington (2005)

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Trends Biotechnol., 23:109-112, Winkler y col. (2002) Nature, 419:952-956, Sudarsan y col. (2003) RNA, 9:644-647, y Mandal y Breaker (2004) Nature Struct. Mol. Biol., 11:29-35. Dichos "riborreguladores" pueden seleccionarse o diseñarse respecto de su especificidad espacial o temporal, por ejemplo, para regular la traducción del gen exógeno solo en presencia (o ausencia) de una concentración dada del ligando adecuado.

Producción y uso de construcciones de ADN recombinante

Las construcciones de ADN recombinante de la presente invención se producen mediante cualquier procedimiento adecuado para la aplicación prevista, teniendo en cuenta, por ejemplo, el tipo de expresión deseado y la conveniencia de uso en la planta en la que se va a transcribir la construcción. Los procedimientos generales para producir y usar construcciones y vectores de ADN se conocen bien en la técnica y se describen en detalle en, por ejemplo, guías y manuales de laboratorio incluyendo Sambrook y Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (tercera edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001. Un ejemplo de tecnología útil para construir construcciones y vectores de ADN para transformación se desvela en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/0115642 A1, incorporado en el presente documento por referencia. Las construcciones de ADN también pueden construirse usando la tecnología de clonación GATEWAY™ (disponible a través de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), que usa la reacción de clonación de recombinasa LR de sitio específico del sistema integrasa/aff de la construcción de vector de bacteriófago lambda, en lugar de endonucleasas y ligasas de restricción. La reacción de clonación LR se desvela en las Patentes de Estados Unidos 5.888.732 y 6.277.608, y en las publicaciones de patente de Estados Unidos 2001/283529, 2001/282319 y 2002/0007051, que se han incorporado por referencia en el presente documento en su totalidad. El Manual de instrucciones sobre tecnología de clonación GATEWAY™, que se suministra también por Invitrogen, proporciona directrices concisas para la clonación rutinaria de cualquier ADN deseado en un vector que comprende elementos de expresión vegetales operables. Otro procedimiento de fabricación de un vector alternativo emplea clonación independiente de ligadura tal como se desvela por Aslandis y col. (1990) Nucleic Acids Res., 18:6069-6074 y Rashtchian y col. (1992) Biochem., 206:91-97, donde se liga un fragmento de ADN con extremos 5' y 3' monocatenarios a un vector deseado que puede amplificarse in vivo.

En determinadas realizaciones, la secuencia de ADN de la construcción de ADN recombinante incluye secuencia que se ha optimizado por codones para la planta en la que se va a expresar la construcción de ADN recombinante. Por ejemplo, una construcción de ADN recombinante que se va a expresar en una planta puede tener la totalidad o parte de su secuencia (por ejemplo, el primer elemento de supresión génica o el elemento de expresión génica) optimizada por codones para la expresión en una planta mediante procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.500.365, incorporada por referencia, para una descripción de la optimización por codones para plantas; véase también De Amicis y Marchetti (2000) Nucleic Acid Res., 28:33393346.

CÉLULAS DE PLANTAS TRANSGÉNICAS Y PLANTAS TRANSGÉNICAS

Se proporciona además una célula de planta transgénica no natural que incluye cualquiera de las construcciones de ADN recombinante, como se describe anteriormente bajo el encabezado "Construcciones de ADN recombinante". Se proporciona además una planta transgénica no natural que contiene la célula de planta transgénica no natural que se ha descrito anteriormente. La planta transgénica no natural incluye plantas de cualquier etapa de desarrollo, e incluye una planta regenerada preparada a partir de las células de plantas transgénicas desveladas en el presente documento, o una progenie de plantas (que pueden ser plantas endogámicas o híbridas) de la planta regenerada, o semillas de dicha planta transgénica no natural. También se proporciona una semilla transgénica que tiene en su genoma cualquiera de las construcciones de ADN recombinante que se ha descrito anteriormente. Las células de plantas transgénicas no naturales, plantas transgénicas no naturales, y semillas transgénicas se producen por procedimientos bien conocidos en la técnica, como se describe a continuación bajo el encabezado "Preparación y utilización de células de plantas transgénicas no naturales y plantas transgénicas no naturales".

La célula de planta transgénica no natural puede incluir una célula vegetal aislada (por ejemplo, células vegetales individuales o células cultivadas en o sobre un medio de cultivo artificial), o puede incluir una célula vegetal en tejido no diferenciado (por ejemplo, callo o cualquier agregación de células vegetales). La célula de planta transgénica no natural puede incluir una célula vegetal en al menos un tejido diferenciado seleccionado entre el grupo que consiste en hoja (por ejemplo, peciolo y lámina), raíz, tallo (por ejemplo, tubérculo, rizoma, estolón, bulbo, y cormo) tallo (por ejemplo, xilema, floema), madera, semilla, frutos (por ejemplo, nueces, grano, frutos carnosos), y flor (por ejemplo, estambre, filamento, antera, polen, carpelo, pistilo, ovario, óvulos).

La célula de planta transgénica no natural o la planta transgénica no natural puede ser cualquier célula vegetal adecuada o plata de interés. Las células vegetales transformadas transitoriamente o transformadas de forma estable están abarcadas en la anterior. Son particularmente preferidas las plantas transgénicas transformadas de forma estable. Se prefiere que la planta transgénica no natural sea una planta transgénica fértil a partir de la cual se pueda cosechar la semilla. y la invención reivindica adicionalmente la semilla transgénica de dichas plantas transgénicas, en las que la semilla contiene también la construcción recombinante que se ha descrito anteriormente.

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Preparación y utilización de células de plantas transgénicas no naturales y plantas transgénicas no naturales

Cuando se usa una construcción de ADN recombinante para producir una célula de planta transgénica no natural, la planta transgénica no natural, o la transformación de la semilla transgénica puede incluir cualquiera de los procedimientos y composiciones bien conocidos y demostrados. Los procedimientos adecuados para la transformación de plantas incluyen virtualmente cualquier procedimiento mediante el cual pueda introducirse ADN en una célula. tal como mediante administración directa de ADN (por ejemplo, mediante transformación de protoplastos mediada por PEG, mediante electroporación, mediante agitación con fibras de carburo de silicio, y mediante aceleración de partículas recubiertas de ADN) mediante transformación mediada por Agrobacterium, mediante vectores víricos u otros vectores, etc. Un procedimiento preferido de transformación de planta es el bombardeo de microproyectiles, por ejemplo, como se ilustra en las patentes de Estados Unidos 5.015.580 (soja), 5.550.318 (maíz),

5.538.880 (maíz), 6.153.812 (trigo), 6.160.208 (maíz), 6.288.312 (arroz) y 6.399.861 (maíz), y 6.403.865 (maíz).

Otro procedimiento de transformación de planta es la transformación mediada por Agrobacterium. En una realización preferida, la célula de planta transgénica no natural de la presente invención se obtiene mediante transformación por medio de Agrobacterium que contiene un sistema de plásmido Ti binario, en el que el Agrobacterium porta un primer plásmido Ti y un segundo plásmido quimérico que contiene al menos un borde de ADN-T de un plásmido Ti de tipo silvestre, un promotor funcional en la célula de planta transformada y unido operativamente a una construcción de supresión génica descrita. Véase, por ejemplo, el sistema binario descrito en la patente de Estados Unidos

5.159.135. incorporada por referencia. Véase también De Framond (1983) Biotechnology, 1:262-269; y Hoekema y col., (1983) Nature, 303:179. En dicho sistema binario, el plásmido menor, que contiene el borde o bordes de ADN-T, puede construirse y manipularse de manera conveniente en un hospedador alternativo adecuado, tales como E. coli, y después transferirse a Agrobacterium.

Los procedimientos detallados para la transformación de plantas mediada por Agrobacterium, especialmente de plantas de cultivo, incluyen, por ejemplo, los procedimientos desvelados en las patentes de Estados Unidos 5.004.863, 5.159.135, y 5.518.908 (algodón); 5.416.011, 5.569.834, 5.824.877 y 6.384.301 (soja); 5.591.616 y

5.981.840 (maíz); 5.463.174 (brassicas), y en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2004/0244075 (maíz). Se han comunicado procedimientos similares para muchas especies vegetales, tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas, incluyendo, entre otros, cacahuete (Cheng y col. (1996) Plant Cell Rep., 15: 653); espárrago (Bytebier y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:5345); cebada (Wan y Lemaux (1994) Plant Physiol., 104:37); arroz (Toriyama y col. (1988) Bio/Technology, 6:10; Zhang y col. (1988) Plant Cell Rep., 7:379; trigo (Vasil y col. (1992) Bio/Technology, 10:667; Becker y col. (1994) Plant J., 5:299), alfalfa (Masoud y col. (1996) Transgen. Res., 5:313); y tomate (Sun y col. (2006) Plant Cell Physiol., 47:426-431). Véase también una descripción de vectores, procedimientos de transformación, y de producción de plantas de Arabidopsis thaliana transformadas donde se expresan factores de transcripción de manera constitutiva por un promotor CaMV35S, en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2003/0167537. Las células de plantas transgénicas y las plantas transgénicas pueden obtenerse también mediante transformación con otros vectores, tales como, aunque no de forma limitativa, vectores víricos (por ejemplo, los potivirus del grabado del tabaco (TEV), los virus del mosaico estriado de la cebada (BSMV), y los virus a los que se hace referencia en Edwardson y Christie, "The Potyvirus Group: Monografía n.º 16, 1991, Agric. Exp. Station, Univ. de Florida), plásmidos, cósmidos, YAC (cromosomas artificiales de levaduras), BAC (cromosomas artificiales bacteriano) o cualquier otro vector de clonación adecuado, cuando se usa con un protocolo de transformación adecuado, por ejemplo, infecciones bacterianas (por ejemplo, con Agrobacterium como se ha descrito anteriormente), construcciones de cromosomas artificiales bacterianos binarios, administración directa de ADN (por ejemplo, mediante transformación mediada por PEG, captación de ADN mediada por desecación/inhibición, electroporación, agitación con fibras de carburo de silicio, y bombardeo de microproyectiles) Será evidente para una persona normalmente experta en la técnica que se pueden usar diversas metodologías de transformación y modificarse para la producción de plantas transgénicas estables de cualquier número de especies vegetales de interés.

Los procedimientos de transformación para proporcionar células vegetales transgénicas y plantas transgénicas que contengan ADN recombinante integrado de manera estable se ponen en práctica preferentemente en cultivo tisular en medio y en un ambiente controlado. "Medio" se refiere a las numerosas mezclas de nutrientes que se usan para cultivar células in vitro, es decir, fuera del organismo vivo intacto. Las dianas de células receptoras incluyen células meristemáticas, callo, embriones inmaduros o partes de embriones, y gametocitos, tales como microesporas, polen, esperma, y ovocitos. Cualquier célula a partir de la cual pueda regenerarse una planta fértil se contempla como una célula receptora útil para la práctica de la invención. Pueden iniciarse callos a partir de diversas fuentes de tejido, incluyendo, aunque no de forma limitativa, embriones inmaduros o partes de embriones, plantones de meristemos y microesporas. Aquellas células que son capaces de proliferar en forma de callo pueden servir como células receptoras para la transformación genética. Los procedimientos y materiales de transformación prácticos para producir plantas transgénicas no naturales de la presente invención (por ejemplo, diversos medios y células diana receptoras, transformación de embriones inmaduros, y la posterior regeneración de plantas transgénicas fértiles) se desvelan, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 6.194.636 y 6.232.526 y en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2004/0216189. Las plantas transgénicas incluyen tejidos o partes de plantas transgénicas, tales como portainjertos transgénicos o injertos transgénicos o material de vástagos, que se pueden usar en combinación con tejidos o partes de plantas no transgénicas.

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En la práctica general de la transformación, se introduce ADN solo en solo un pequeño porcentaje de células diana en un experimento cualquiera de transformación. Generalmente se usan genes marcadores para proporcionar un sistema eficaz para la identificación de aquellas células que se transforman de manera estable mediante la recepción e integración de una construcción de ADN transgénica en sus genomas. Los genes marcadores preferidos proporcionan marcadores de selección que confieren resistencia a un agente de selección, tal como un antibiótico o herbicida. Cualquiera de los antibióticos o herbicidas a los que puede ser resistente una planta pueden ser agentes de selección útiles. Las células potencialmente transformadas se exponen al agente de selección. En la población de células supervivientes se encontrarán aquellas células en donde, en general, se integra el gen que confiere resistencia y se expresa a niveles suficientes para permitir la supervivencia celular. Las células pueden ensayarse adicionalmente para confirmar la integración estable del ADN recombinante. Los genes marcadores de selección usados comúnmente incluyen aquellos que confieren resistencia a los antibióticos, tales como kanamicina o paromomicina (nptll), higromicina B (aph IV) y gentamicina (aac3 y aacC4) o resistencia a herbicidas, tales como glufosinato (bar o pat) y glifosato (EPSPS). Los ejemplos de genes marcadores de selección y de agentes de selección útiles se ilustran en las patentes de Estados Unidos 5.550.318, 5.633.435, 5.780.708, y 6.118.047. Los marcadores de exploración o indicadores, tales como marcadores que proporcionan una capacidad para identificar visualmente transformantes, también pueden emplearse. Los ejemplos no limitativos de marcadores de exploración útiles incluyen, por ejemplo, un gen que expresa una proteína que produce un color detectable actuando sobre un sustrato cromogénico (por ejemplo, beta glucuronidasa (GUS) (uidA) o luciferasa (luc)) o que es detectable por sí mismo, tal como la proteína fluorescente verde (GFP) (gfp) o una molécula inmunogénica. Los expertos en la materia reconocerán que hay disponibles para su uso otros marcadores o indicadores útiles.

Se puede conseguir detectar o medir el cambio resultante en la expresión del gen diana (o la expresión simultánea de un gen de interés) obtenido mediante transcripción de la construcción recombinante en la planta transgénica no natural de la invención mediante cualesquiera procedimientos adecuados, incluyendo procedimientos de detección de proteínas (por ejemplo, transferencias Western, ELISA, y otros procedimientos inmunoquímicos), mediciones de la actividad enzimática, o procedimientos de detección de ácidos nucleicos (por ejemplo, transferencias Southern, transferencias Northern, PCR, RT-PCR, hibridación fluorescente in situ). Dichos procedimientos son bien conocidos por las personas expertas en la técnica como se evidencia por los numerosos manuales disponibles; véanse, por ejemplo, Joseph Sambrook y David W. Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (tercera edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001; Frederick M. Ausubel y col. (editores) "Short Protocols in Molecular Biology" (quinta edición), John Wiley and Sons, 2002; John M. Walker (editor) "Protein Protocols Handbook" (segunda edición), Humana Press, 2002; y Leandro Pena (editor) "Transgenic Plants: Methods and Protocols", Humana Press, 2004.

Otros procedimientos adecuados para detectar o medir el cambio resultante en la expresión del gen diana (o la expresión simultánea de un gen de interés) obtenido mediante la transcripción del ADN recombinante en la planta transgénica no natural de la invención incluye la medición de cualquier otro rasgo que sea una indicación directa o próxima de la expresión del gen diana (o la expresión simultánea de un gen de interés) en la planta transgénica en la que se transcribe el ADN recombinante, con respecto a uno en el que no se transcribe el ADN recombinante, por ejemplo, rasgos morfológicos evidentes o microscópicos, velocidades de crecimiento, rendimiento; velocidades reproductivas o de reclutamiento, resistencia a plagas o patógenos, o resistencia al estrés biótico o abiótico (por ejemplo, estrés por déficit de agua, estrés salino, estrés por nutrientes, estrés por calor o frío). Dichos procedimientos pueden usar mediciones directas de un rasgo fenotípico o ensayos aproximados (por ejemplo, en plantas, estos ensayos incluyen ensayos con partes de plantas, tales como ensayos de hojas o raíces para determinar la tolerancia al estrés abiótico).

Las construcciones de ADN recombinante de la invención pueden agruparse con otros ADN recombinantes para conferir rasgos adicionales (por ejemplo, en el caso de plantas transformadas, rasgos que incluyan resistencia a herbicidas, resistencia a plagas, tolerancia a la germinación en frío, tolerancia al déficit hídrico) por ejemplo, expresando o suprimiendo otros genes. Las construcciones para la disminución y aumento coordinado de la expresión génica se desvelan en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2004/0126845.

Las semillas fértiles de plantas transgénicas se pueden cosechar y utilizarse para hacer crecer generaciones de progenie, incluyendo generaciones híbridas, de plantas transgénicas no naturales de la presente invención que incluyen la construcción de ADN recombinante en su genoma. De este modo, además de la transformación directa de una planta con una construcción de ADN recombinante, las plantas transgénicas no naturales pueden prepararse cruzando una primera planta que tenga el ADN recombinante con una segunda planta que carezca de la construcción. Por ejemplo, el ADN recombinante puede introducirse en una línea de plantas que sea susceptible de transformación para producir una planta transgénica no natural. que puede cruzarse con una segunda línea de plantas para introducir por introgresión el ADN recombinante en la descendencia resultante. Una planta transgénica no natural con un ADN recombinante (que efectúa un cambio en la expresión de un gen diana) puede cruzarse con una línea de plantas que tiene otro ADN recombinante que confiere uno o más rago(s) adicionales (tales como la resistencia a herbicidas, resistencia a plagas o enfermedades, resistencia al estrés ambiental, contenido de nutrientes modificado, y mejora del rendimiento) para producir plantas descendientes que tienen ADN recombinante que confiere tanto el comportamiento de expresión de la secuencia diana deseada como los rasgos adicionales.

Típicamente, en dicho cruzamiento para combinar rasgos, la planta transgénica que dona el rasgo adicional puede

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ser una línea masculina y la planta transgénica que porta los rasgos básicos es la línea femenina. La descendencia de este cruce se segrega de tal forma que algunas de las plantas portarán el ADN para ambos rasgos progenitores y algunas portarán el ADN para un rasgo progenitor; dichas plantas pueden identificarse mediante marcadores asociados con ADN recombinante progenitor. Las plantas descendientes que portan ADN para ambos rasgos progenitores pueden retrocruzarse en la línea progenitora hembra múltiples veces, por ejemplo, usualmente 6 a 8 generaciones, para producir una planta descendiente con sustancialmente el mismo genotipo que una línea progenitora transgénica original, pero para el ADN recombinante de la otra línea progenitora transgénica.

Se desvela además una planta transgénica no natural que crece a partir de la semilla transgénica anteriormente mencionada. Se contemplan plantas transgénicas no naturales que crecen directamente a partir de semillas transgénicas que contienen el ADN recombinante así como generaciones descendientes de plantas, incluyendo líneas de plantas puras o híbridas, producidas mediante el cruzamiento de una planta transgénica cultivada directamente a partir de semillas transgénicas en una segunda planta no cultivada a partir de la misma semilla transgénica.

El cruzamiento puede incluir, por ejemplo, las siguientes etapas:

(a)

semillas de plantas de la primera planta progenitora (por ejemplo, no transgénica o una transgénica) y una segunda planta progenitora que es transgénica, de acuerdo con la invención;

(b)

cultivar las semillas de la primera y la segunda planta progenitora en plantas que portan flores;

(c)

polinizar una flor del primer progenitor con polen del segundo progenitor; y

(d)

cosechar semillas producidas en la planta progenitora que porta la flor fertilizada.

A menudo es deseable introducir mediante introgresión ADN recombinante en variedades de élite, por ejemplo, mediante retrocruzamiento, para transferir un rasgo específico deseable de una fuente a una planta pura u otra que carezca de ese rasgo. Esto puede lograrse, por ejemplo, cruzando en primer lugar un endógamo superior ("A") (progenitor recurrente) con un individuo de puro donante ("B") (progenitor no recurrente), que porta el gen o los genes adecuados para el rasgo en cuestión, por ejemplo, una construcción preparada de acuerdo con la presente invención. La descendencia de este cruce se selecciona en primer lugar en la descendencia resultante respecto del rasgo deseado que se va a transferir a partir del progenitor "B" no recurrente, y después se vuelve a emparejar la descendencia seleccionada con el progenitor recurrente "A". Después de cinco o más generaciones de retrocruzamientos con selección respecto del rasgo deseado, la descendencia puede ser esencialmente hemicigótica para los loci que controlan la característica que se está transfiriendo, pero son como el progenitor superior para la mayoría o prácticamente todos los demás genes. La última generación de retrocruzamiento podría autoemparejarse para proporcionar descendencia que son de raza pura para el gen o los genes que se estén transfiriendo, es decir, uno o más eventos de transformación.

Mediante una serie de manipulaciones de cruzamientos, puede moverse una construcción de ADN seleccionada desde una línea a una línea completamente diferente sin la necesidad de manipulación recombinante adicional. Por lo tanto se pueden producir plantas puras que son raza pura para una o más construcciones de ADN. Mediante el cruzamiento de diferentes plantas endogámicas, se puede producir un gran número de híbridos diferentes con diferentes combinaciones de construcciones de ADN. De este modo, pueden producirse plantas que tengan las propiedades agrícolas deseables asociadas frecuentemente con los híbridos ("vigor del híbrido"), así como las características deseables conferidas por una o más construcciones de ADN.

Se pueden usar marcadores genéticos para ayudar en la introgresión de una o más construcciones de ADN de la invención desde un fondo genético a otro. La selección asistida por marcadores ofrece ventajas con respecto a reproducción convencional, ya que se puede usar para evitar errores causados por las variaciones fenotípicas. Además, los marcadores genéticos pueden proporcionar datos relativos al grado relativo de germoplasma de élite en la progenie individual de un cruce en particular. Por ejemplo, cuando una planta con un rasgo deseado que tiene por otra parte un fondo genético no agronómicamente deseable se cruza con un precursor de élite, se pueden usar los marcadores genéticos para seleccionar la descendencia que no solo posea el rasgo de interés, sino también una proporción relativamente grande del germoplasma deseado. De este modo, el número de generaciones requeridas para introducir uno o más rasgos en un fondo genético concreto se minimiza. La utilidad de la selección asistida por marcador en la reproducción de plantas transgénicas no naturales de la presente invención, así como los tipos de marcadores moleculares útiles, tales como aunque sin limitarse a SSR y SNP, se describen en el documento WO 02/062129 y en las publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos números 2002/0133852, 2003/0049612, y 2003/0005491.

En determinadas células de plantas transgénicas no naturales y plantas transgénicas no naturales, puede ser deseable expresar (o suprimir) de forma simultánea un gen de interés aunque regulando también la expresión de un gen diana. De este modo, en esos casos, la planta transgénica no natural contiene ADN recombinante que incluye además un elemento de expresión génica (o de supresión) para expresar al menos un gen de interés, y la regulación de la expresión de un gen diana se efectúa preferentemente con la expresión simultánea (o supresión) de al menos un gen de interés en la planta transgénica.

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De este modo, tal como se describe en el presente documento, las células de plantas transgénicas no naturales o las plantas transgénicas no naturales pueden obtenerse mediante el uso de cualquier procedimiento de transformación integrador o no integrador, transitorio o estable adecuado conocido en la técnica o actualmente desvelado. Las construcciones de ADN recombinante pueden transcribirse en cualquier célula o tejido vegetal o en una planta completa en cualquier estado de desarrollo. Las plantas transgénicas pueden proceder de cualquier planta monocotiledónea o dicotiledónea, tales como plantas de interés comercial o agrícola, tales como plantas de cultivo (especialmente plantas de cultivo usadas para alimentación humana o animal), árboles productores de madera o de pulpa, plantas vegetales, plantas de fruto, y plantas ornamentales. Los ejemplos no limitantes de plantas de interés incluyen plantas de cultivo de grano (tales como trigo, avena, cebada, maíz, centeno, triticale, arroz, mijo, sorgo, quinoa, amaranto, y alforfón); plantas de cultivo forrajero (tales como las hierbas forrajeras y las dicotiledóneas de forrajeras, incluyendo alfalfa, arveja y trébol); plantas de cultivo de semillas oleaginosas (tales como algodón, cártamo, girasol, soja, canola, colza, lino, cacahuetes, y palma de aceite); nueces de árbol (tales como nuez, anacardo, avellana, pecana y almendra); caña de azúcar, coco, palmera datilera, aceite de oliva, remolacha azucarera, té, y café; árboles productores de madera o de pulpa; plantas de cultivos vegetales, tales como legumbres (por ejemplo, alubias, guisantes, lentejas, alfalfa, cacahuete), lechuga, espárrago, alcachofa, apio, zanahoria, rábano, las brasicáceas (por ejemplo, repollo, col rizada, mostazas, y otras brasicáceas foliares, brécol, coliflor, coles de Bruselas, nabo, colinabo), cucurbitáceas comestibles (por ejemplo, pepino, melón, calabaza de verano, calabaza de invierno), alliums comestibles (por ejemplo, cebollas, ajo, puerros, chalotas, cebollinos), miembros comestibles de las solanáceas (por ejemplo, tomates, berenjenas, patatas, pimientos, alquequenjes), y miembros comestibles de las quenopodiáceas (por ejemplo, remolacha, acelga, espinaca, quinoa, amaranto); plantas de cultivos frutales, tales como manzana, pera, frutos cítricos (por ejemplo, naranja, lima, limón, pomelo, y otros), frutas con hueso (por ejemplo, albaricoque, melocotón, ciruela, nectarina), plátano, piña, uva, kiwi, papaya, aguacate, y bayas; y plantas ornamentales, tales como plantas de flor ornamentales, árboles y arbustos ornamentales, tréboles ornamentales, y hierbas ornamentales. Las plantas dicotiledóneas preferidas incluyen canola, brécol, repollo, zanahoria, coliflor, col china, pepino, legumbres secas, berenjena, hinojo, judías verdes, calabazas, lechugas, melón, quimbombó, guisantes, pimientos, calabacitas, rábanos, espinaca, calabaza, sandía, algodón, patata, quinoa, amaranto, alforfón, cártamo, soja, remolacha azucarera, y girasol. Las monocotiledóneas preferidas incluyen trigo, avena, cebada, maíz (incluido el maíz dulce y otras variedades), centeno, triticale, arroz, césped ornamental y hierbas forrajeras, sorgo, mijo, cebollas, puerros, y caña de azúcar, más preferentemente maíz, trigo, y arroz.

La meta última en la transformación de plantas es producir plantas que sean útiles para el hombre. A este respecto, se pueden usar plantas transgénicas no naturales para prácticamente cualquier fin de valor para el productor o al consumidor Por ejemplo, se puede desear cosechar la propia planta transgénica, o cosechar la semilla transgénica de la planta transgénica para fines de plantación, o se pueden preparar productos a partir de la planta transgénica o su semilla tal como aceite, almidón, etanol u otros productos de fermentación, alimentación animal o alimentos para seres humanos, agentes farmacéuticos, y diversos productos industriales. Por ejemplo, el maíz se usa extensamente en alimentos y en las industrias alimentarias, así como en aplicaciones industriales. Se puede encontrar una descripción adicional de los usos del maíz, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 6.194.636, 6.207.879, 6.232.526, 6.426.446, 6.429.357, 6.433.252, 6.437.217, y 6.583.338, y los documentos WO 95/06128 y WO 02/057471. De este modo, se desvelan también productos de uso habitual producidos a partir de una célula de una planta transgénica planta, o semillas de la presente invención, incluyendo las hojas recogidas, raíces, brotes, tubérculos, tallos, frutos, semillas, u otras partes de una planta cosechadas, alimentos, aceites, extractos, productos de fermentación o digestión, granos o semillas trituradas o completas de una planta, o cualquier producto alimentario

o producto no alimentario incluyendo productos de uso habitual producidos a poartir de una célula de una planta transgénica, planta, o semillas como se define en el presente documento anteriormente. La detección de una o más secuencias de ácidos nucleicos de las construcciones de ADN recombinante en uno o más usos habituales o productos de uso habitual contemplados en el presente documento es evidencia de hecho de que los usos habituales o los productos de uso habitual contienen o se derivan de dicha célula de planta transgénica, planta, o semilla.

La planta transgénica no natural preparada a partir de la célula de planta transgénica no natural es una planta transgénica que tiene en su genoma una construcción de ADN recombinante anteriormente mencionada y tiene al menos un rasgo alterado adicional, en relación a una planta que carece de la construcción de ADN recombinante, seleccionado entre el grupo de rasgos que consiste en:

(a)

tolerancia al estrés abiótico mejorada;

(b)

tolerancia al estrés biótico mejorada;

(c)

composición de metabolitos primarios modificada;

(d)

composición de metabolitos secundarios modificada;

(e)

elemento traza modificado, carotenoides, o composición de vitaminas;

(f)

rendimiento mejorado;

(g ) capacidad mejorada de usar nitrógeno u otros nutrientes;

(h)

características agronómicas modificadas;

(i)

características de crecimiento o reproductivas modificadas; y

(j)

cosecha, almacenamiento, o calidad del procesamiento mejorados.

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Se prefiere que la planta transgénica no natural esté caracterizada por: tolerancia mejorada al estrés abiótico (por ejemplo, tolerancia al déficit de agua o sequía, calor, frío, niveles de nutrientes o de sal no óptimos, niveles de luz no óptimos) o de estrés biótico (por ejemplo, superpoblación, alelopatía, o heridas); por un metabolito primario modificado (por ejemplo, ácido graso, aceite, aminoácido, proteína, azúcar, o carbohidratos); un metabolito secundario modificado (por ejemplo, alcaloides, terpenoides, policétidos, péptidos no ribosómicos, y metabolitos secundarios de origen biosintético mixto); una composición modificada de elementos traza (por ejemplo, hierro, cinc), carotenoides (por ejemplo, beta-caroteno, licopeno, luteína, zeaxantina, u otros carotenoides y xantofilas), o vitaminas (por ejemplo, tocoferoles) rendimiento mejorado (por ejemplo, rendimiento mejorado en condiciones no estresantes o rendimiento mejorado en condiciones de estrés biótico o abiótico); capacidad mejorada de usar nitrógeno u otros nutrientes; características agronómicas modificadas (por ejemplo, maduración retardada; senescencia retardada; madurez temprana o tardía; tolerancia a la sombra mejorada; resistencia mejorada al acame de la raíz o tallo; resistencia mejorada al "quebrado en verde" de los tallos; respuesta modificada al fotoperiodo); características de crecimiento o reproductivas modificadas (por ejemplo, enanismo intencionado; esterilidad masculina intencional, utilidad, por ejemplo, en procedimientos de hibridación mejorados; velocidad de crecimiento vegetativo mejorada; germinación mejorada; fertilidad masculina o fertilidad femenina mejoradas); cosecha, almacenamiento, o calidad del procesamiento mejorados (por ejemplo, resistencia mejorada a plagas durante el almacenamiento, resistencia mejorada a la rotura, mejor aspecto para los consumidores); o cualquier combinación de estos rasgos.

Se prefiere que, la semilla transgénica, o semilla producida por la planta transgénica no natural, tenga una composición modificada de un metabolito primario (por ejemplo, ácido graso, aceite, aminoácido, proteína, azúcar, o carbohidratos), un metabolito secundario modificado (por ejemplo, alcaloides, terpenoides, policétidos, péptidos no ribosómicos, y metabolitos secundarios de origen biosintético mixto), una composición modificada de elementos traza (por ejemplo, hierro, cinc), carotenoides (por ejemplo, beta-caroteno, licopeno, luteína, zeaxantina, u otros carotenoides y xantofilas), o vitaminas (por ejemplo, tocoferoles), una cosecha, almacenamiento, o calidad del procesamiento mejorados, o una combinación de estos. Por ejemplo, puede ser deseable modificar el aminoácido (por ejemplo, lisina, metionina, triptófano, o la proteína total) aceite (por ejemplo, composición de ácido graso o aceite total), carbohidratos (por ejemplo, azúcares o almidones simples), elementos traza, carotenoides, o el contenido de vitaminas de las semillas de plantas de cultivos (por ejemplo canola, algodón, cártamo, soja, remolacha azucarera, girasol, trigo, maíz, o arroz), preferentemente en combinación con una cosecha de semillas, almacenamiento, o calidad del procesamiento mejorados, y proporcionar de esta manera una semilla mejorada para su uso en alimentación animal y alimentos para seres humanos. En otros casos, puede ser deseable cambiar los niveles de componentes naturales de la planta o semilla transgénica de una planta transgénica, por ejemplo, para disminuir los niveles de proteínas con bajos niveles de lisina, metionina, o triptófano, o para aumentar los niveles de un aminoácido o ácido graso deseado, o para disminuir los niveles de una proteína o glucoproteína alérgena (por ejemplo, alérgenos del cacahuete que incluyen ara h 1, alérgenos del trigo que incluyen gliadinas y gluteninas, alérgenos de la soja que incluyen el alérgeno P34, globulinas, glicininas, y conglicininas) o de un metabolito tóxico (por ejemplo, glucosidasas cianógenas en mandioca, alcaloides de solanum en miembros de la Solanáceas

PROCEDIMIENTOS DE SUPRESIÓN GÉNICA

Se desvela además un procedimiento para realizar la supresión génica, que incluye las etapas de: (a) proporcionar una planta transgénica no natural incluyendo una planta regenerada preparada a partir de una célula de planta transgénica no natural, o una planta descendiente de la planta regenerada (como se ha descrito anteriormente bajo el encabezado "Células de plantas transgénicas y plantas transgénica"); y (b) transcribir la construcción de ADN recombinante en la planta transgénica no natural; en la que la transcripción produce un ARN que es capaz de suprimir el al menos un gen diana de la planta transgénica no natural, y mediante lo cual, el al menos un gen diana se suprime con respecto a su expresión en ausencia de transcripción de la construcción de ADN recombinante.

El al menos un gen diana es al menos un gen seleccionado entre el grupo que consiste en un gen nativo de la planta transgénica, un transgén de la planta transgénica, y un gen nativo de una plaga o patógeno vírico, bacteriano, fúngico o de invertebrado de la planta transgénica. Los genes diana adecuados se han descrito anteriormente bajo el encabezado "Genes diana". En algunas realizaciones, el al menos un gen diana es un único gen diana. En otras realizaciones, el al menos un gen diana son varios genes diana. La supresión de un gen diana incluye la supresión no específica, por ejemplo, la expresión constitutiva, así como expresión específica, por ejemplo, espacialmente específica, temporalmente específica, específica del desarrollo, o la supresión génica inducible. La especificidad de la supresión del al menos un gen diana se consigue mediante técnicas conocidas del experto en la materia, tales como la selección de un promotor que tiene el patrón de expresión específico deseado, o mediante la selección de un sitio de reconocimiento de microARN que se reconoce por un miARN maduro que tiene el patrón de expresión específico deseado.

La transcripción de la construcción de ADN recombinante se lleva a cabo por medios conocidos en la materia. La transcripción puede ser constitutiva o no específica, por ejemplo, bajo el control de un promotor constitutivo. En otros casos, la transcripción se produce en condiciones específicas espaciales, temporales, o inducibles. Por ejemplo, la construcción de ADN recombinante puede incluir un promotor específico espacial, temporal, o inducible. En otro ejemplo, la construcción de ADN recombinante puede incluir un interruptor ribosómico (ADN que se transcribe a un aptámero de ARN capaz de unirse a un ligando, y ADN que se transcribe a ARN regulador capaz de regular la expresión del gen diana, en el que la regulación es dependiente de la conformación del ARN regulador, y la conformación del ARN regulador está afectada alostéricamente por el estado de unión del aptámero de ARN) permitiendo de esta forma que la transcripción de la construcción de ADN recombinante se controle mediante el estado de unión del aptámero de ARN y, por tanto, mediante la presencia (o ausencia) del ligando.

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5 Se desvela además un procedimiento para realizar en paralelo la supresión génica de al menos un gen dina y de la expresión génica de al menos un gen de interés, que incluye las etapas de: (a) proporcionar una planta transgénica no natural incluyendo una planta regenerada preparada a partir de la célula de planta transgénica no natural, o una planta descendiente de la planta regenerada (como se ha descrito anteriormente bajo el encabezado "Células de plantas transgénicas y plantas transgénica"), en la que la construcción de ADN recombinante incluye además un

10 elemento de expresión génica para expresar el al menos un gen de interés; y (b) transcribir la construcción de ADN recombinante en la planta transgénica no natural, en el que, cuando la construcción de ADN recombinante se transcribe en la planta transgénica no natural, se produce un ARN transcrito que es capaz de suprimir el al menos un gen diana y un ARN transcrito que codifica el al menos un gen de interés, mediante lo cual, el al menos un gen diana se suprime con respecto a su expresión en ausencia de transcripción de la construcción de ADN recombinante y se

15 expresa en paralelo el al menos un gen de interés.

Un gen de interés puede incluir cualquier secuencia codificante o no codificante de cualquier especie (incluyendo no eucariotas tales como bacterias, y virus; hongos; plantas, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas, tales como plantas de cultivo, plantas ornamentales, y plantas no domesticadas o salvajes; invertebrados tales como artrópodos, anélidos, nematodos, y moluscos; y vertebrados tales como anfibios, pescado, aves, y mamíferos. Los 20 ejemplos no limitantes de una secuencia no codificante a expresar mediante un elemento de expresión génica incluyen regiones 5’ no traducidas, promotores, potenciadores, u otras regiones transcripcionales no codificantes, regiones 3' no traducidas, terminadores, intrón, microARN, secuencias de ADN precursor de miARN, ARN interferentes pequeños, componentes de ARN de ribosomas o ribozimas, ARN nucleolares pequeños, aptámeros de ARN capaces de unirse a un ligando, y otros ARN no codificantes. Los ejemplos no limitantes de un gen de interés 25 incluyen además secuencias traducibles (codificantes), tales como genes que codifican los factores de transcripción y los genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis o el catabolismo de moléculas de interés (tales como aminoácidos, ácidos grasos y otros lípidos, azúcares y otros hidratos de carbono, polímeros biológicos, y metabolitos secundarios incluyendo alcaloides, terpenoides, policétidos, péptidos no ribosómicos, y metabolitos secundarios de origen biosintético mixto). Un gen de interés puede ser un gen natural para la célula (por ejemplo, una célula vegetal) 30 en la que la construcción de ADN recombinante de la invención se va a transcribir, o puede ser un gen no natural. Un gen de interés puede ser un gen marcador, por ejemplo, un gen marcador seleccionable que codifica un antibiótico, antifúngico, o resistencia a herbicidas, o un gen marcador que codifica un rasgo fácilmente detectable (por ejemplo, en una célula vegetal, fitoeno sintasa u otros genes que transmiten un pigmento concreto a la planta),

o un gen que codifica una molécula detectable, tal como una proteína fluorescente, luciferasa, o un polipéptido único

35 o ácido nucleico "marca" detectable por procedimientos de detección de proteínas o ácidos nucleicos, respectivamente). Los marcadores seleccionables son genes de interés de especial utilidad para identificar un procesamiento correcto de las construcciones. Los genes de interés incluyen aquellos genes también descritos anteriormente como genes diana, en el encabezado "Genes diana".

El gen de interés a expresar mediante el elemento de expresión génica puede incluir al menos un gen seleccionado

40 entre el grupo que consiste en un gen diana eucariota, un gen diana no eucariota, y una secuencia de ADN precursora de miARN. El gen de interés puede incluir un único gen o varios genes (tales como múltiples copias de un solo gen, múltiples alelos de un solo gen, o múltiples genes, incluidos genes de múltiples especies). El elemento de expresión génica puede incluir secuencias de péptidos autohidrolizables, por ejemplo, situadas entre múltiples secuencias que codifican uno o más polipéptidos (véase, por ejemplo, las secuencias autoescindibles 2A y "2Alike"

45 procedentes de diversas especies, incluyendo virus, tripanosomas, y bacterias, desvelados en Donnelly y col. (2001), J. Gen. Virol., 82:1027-1041). Además, el elemento de expresión génica puede incluir secuencias que "saltan" ribosomas, por ejemplo, situadas entre múltiples secuencias que codifican uno o más polipéptidos (véase, por ejemplo, las secuencias que saltan ribosomas del aftovirus virus de la enfermedad del pie y la boca (FMDV) 2A desveladas por Donnelly y col. (2001), J. Gen. Virol., 82:1013-1025).

50 MIARNA SENSIBLES AL ESTRÉS ABIÓTICO

Se describen además miARN que presentan un patrón de expresión que es sensible al estrés abiótico, por ejemplo, un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la regulación del miARN mediante el estrés por nutrientes, un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la regulación del miARN mediante el estrés por agua, o un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la regulación del miARN

55 mediante el estrés por temperatura.

Los Ejemplo 6 -11 describen un novedoso miARN que fue identificado en plantas de cultivo y que recibió el nombre trivial de miRMON18, que presenta un patrón de expresión caracterizado por la supresión del miARN bajo estrés por nutrientes (es decir, deficiencia de nitrógeno, deficiencia de fosfato, o deficiencia tanto de nitrógeno como de fosfato). El miRMON18 maduro es un miARN de 21 nucleótidos que tiene la secuencia 60 UUAGAUGACCAUCAGCAAACA y se clonó a partir del librerías de ARN pequeño de arroz (SEQ ID NO. 393), maíz (SEQ ID NO. 3227), y soja (SEQ ID NO. 8742). Se identificaron secuencias precursoras en el arroz (SEQ ID NO.

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1763) y en el maíz (SEQ ID NO. 3936).

Las construcciones de ADN recombinantes se describen con mayor detalle bajo el encabezado "Construcciones de ADN recombinante" anterior y son de utilidad con cualquiera de los miARN desvelados en el presente documento, por ejemplo, un miARN maduro seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1 -1035, SEQ ID NOS. 2730 -3921, SEQ ID NOS. 5498 -6683, SEQ ID NOS. 8409 -8560, SEQ ID NO. 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812 -8815, SEQ ID NO. 8845, y la SEQ ID NO. 8850, o un miARN maduro derivado de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819. La descripción de las construcciones de ADN recombinante también se aplica a los miARN que tienen un patrón de expresión particular, tal como un miARN sensible al estrés por nutrientes en plantas (por ejemplo, miRMON18 y otros miARN descritos en los Ejemplos) como se describe en esta sección. La siguiente descripción se dirige a miRMON18 pero también es aplicable a otros miARN regulados mediante estrés abiótico, especialmente un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la supresión del miARN en condiciones de estrés por nutrientes, un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la supresión del miARN bajo el estrés por agua, o un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la supresión del miARN bajo el estrés por temperatura; los ejemplos no limitantes de miARN regulados por estrés abiótico incluyen miR399 y miR319.

De este modo, se describe una construcción de ADN recombinante que incluye al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana, en el que al menos un elemento de ADN transcribible se selecciona entre el grupo que consiste en: (a) un elemento de ADN que se transcribe a un precursor de miARN con la estructura replegada de una secuencia de miRMON18 precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1763 y SEQ ID NO. 3936 y se procesa para dar un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de UUAGAUGACCAUCAGCAAACA (SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742); (b) un elemento de ADN que se transcribe a un miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética derivado de la estructura replegada de una secuencia de un miRMON18 precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NO. 1763 y SEQ ID NO. 3936, en el que el miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética incluye un miARN miRMON18 maduro modificado; (c) un elemento de ADN que se localiza o es adyacente a una unidad de transcripción del transgén y que se transcribe a ARN incluyendo un sitio de reconocimiento del miARN reconocido por un miARN maduro derivado de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763 y SEQ ID NO. 3936; y (d) un elemento de ADN para suprimir la expresión de un miARN endógeno derivado de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1763 y SEQ ID NO. 3936. Estas realizaciones dirigidas a miRMON18 se describen más detalladamente a continuación.

(A) Expresión de un miRMON18 natural en condiciones no naturales

Se describe una construcción de ADN recombinante que incluye al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana, en el que el al menos un elemento de ADN que se transcribe a un precursor de miARN con la estructura replegada de una secuencia de miRMON18 precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1763 y SEQ ID NO. 3936 y se procesa para dar un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742, y el al menos un gen diana es un gen endógeno de una planta, y en el que la expresión de la construcción de ADN recombinante en la planta da como resultado la supresión del al menos un gen diana. Se prefiere que el miARN precursor incluye un segmento contiguo de al menos 90% de los nucleótidos de la secuencia precursora de miRMON18, Dichas construcciones son especialmente útiles para la expresión de miRMON18 en un patrón de expresión diferente al patrón de expresión del miRMON18 natural (por ejemplo, en diferentes tejidos, en diferentes momentos, o en diferentes niveles de expresión).

El miRMON18 precursor no tiene que incluir todos los nucleótidos contenidos en una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1763 y SEQ ID NO. 3936, pero incluye preferentemente un segmento contiguo de al menos 80%, o al menos del 85%, o al menos del 90%, o al menos del 95%, o al menos del 97%, o al menos del 98%, o al menos del 99% de los nucleótidos de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre las SEQ ID NO. 1763 y SEQ ID NO. 3936. Se prefiere que el miARN precursor incluye un segmento contiguo de al menos 90% de los nucleótidos de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre las SEQ ID NO. 1763 y SEQ ID NO. 3936. Independientemente de la secuencia de nucleótidos específica utilizada, el precursor de miRMON18 forma una estructura replegada que es idéntica o casi idéntica a la estructura replegada formada por la secuencia precursora de amiRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763 y SEQ ID NO. 3936 y que se procesa in vivo en una o más etapas para dar un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742.

Se prefiere que el al menos un gen diana sea un gen endógeno de una planta que incluya al menos un sitio de reconocimiento de miRMON18 (sitio diana), y la expresión de la construcción de ADN recombinante en la planta da como resultado la supresión del al menos un gen diana. Además, se prefiere que el al menos un gen diana sea un gen endógeno de una planta y, de esta manera, la expresión de la construcción de ADN recombinante en la planta da como resultado la supresión del al menos un gen diana. Además, se prefiere que la construcción de ADN recombinante incluya además un promotor diferente al promotor de miRMON18 natural. Esto permite la expresión del miARN miRMON18 maduro en condiciones espaciales, o temporales, o inducibles bajo las cuales podría no

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expresarse de forma natural. Por ejemplo, la construcción de ADN recombinante se puede diseñar para que incluya un promotor constitutivo y, de esta manera, expresar constitutivamente un miRMON18 maduro que tiene un patrón de expresión caracterizado por la supresión del miARN en condiciones de estrés por nutrientes (es decir, deficiencia de nitrógeno, deficiencia de fosfato, o deficiencia tanto de nitrógeno como de fosfato); esto daría como resultado la supresión constitutiva del gen diana miRMON18. En otro ejemplo, la construcción de ADN recombinante se puede diseñar para que incluya un promotor inducible específico de la raíz y expresar de esta manera un miRMON18 maduro en la raíz tras la inducción; esto daría como resultado la supresión del gen diana miRMON18 en el tejido radicular tras la inducción. Los promotores que son útiles con esta construcción de ADN recombinante se describen en el apartado "Promotores".

(B) Expresión de un miARN maduro diseñado mediante ingeniería genética derivado de miRMON18.

Se describe una construcción de ADN recombinante que incluye al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana, en la que el al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana incluye un elemento de ADN que se transcribe a un precursor de miARN diseñado mediante ingeniería genética derivado de la estructura replegada de una secuencia de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre las SEQ ID NO. 1763 y SEQ ID NO. 3936, en la que el miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética incluye un miARN miRMON18 maduro modificado, en la que el al menos un gen diana sea un gen endógeno de una planta o un gen endógeno de una plaga o patógeno de la planta, y en el que la expresión de la construcción de ADN recombinante en la planta da como resultado la supresión del al menos un gen diana.

Se prefiere que el al menos un gen diana sea un gen endógeno de una planta o un gen endógeno de una plaga o patógeno de la planta, y la expresión de la construcción de ADN recombinante en la planta da como resultado la supresión del al menos un gen diana. Los genes diana adecuados se han descrito anteriormente bajo el encabezado "Genes diana". Por "diseñado mediante ingeniería genética" se entiende que los nucleótidos se cambian (se sustituyen, eliminan, o añaden) a una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763 y SEQ ID NO. 3936, dando como resultado por tanto un miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética que tiene sustancialmente la misma estructura replegada que la secuencia del miRMON18 precursor natural, pero en la que el miARN maduro que se procesa a partir del miRMON18 precursor diseñado mediante ingeniería genética tiene una secuencia modificada (es decir, diferente de la de un miRMON18 maduro) que se diseña para suprimir un gen diana diferente de los genes diana suprimidos naturalmente por la secuencia del miRMON18 precursor natural. Un procedimiento general no limitante para determinar cambios en los nucleótidos de la secuencia precursora de miRMON18 natural para producir el miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética se ha descrito anteriormente bajo el encabezado "Expresión de un miARN maduro diseñado mediante ingeniería genética".

(C) Expresión de un transgén y un sitio de reconocimiento de miRMON18.

Se describe una construcción de ADN recombinante que incluye al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana, e incluye además una unidad de transcripción del transgén, en el que el al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana incluye un elemento de ADN que se localiza en o adyacente a la unidad de transcripción del transgén y esta se transcribe a ARN que incluye un sitio reconocimiento del miARN mediante un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742 o mediante un miARN miRMON18 derivado de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763 y SEQ ID NO. 3936, y el al menos un gen diana incluye el transgén codificado por la unidad de transcripción del transgén, y en el que la expresión de la construcción de ADN recombinante en una planta da como resultado la expresión del transgén en células de la planta en las que el miARN miRMON18 maduro no se expresa naturalmente. La predicción de un sitio de reconocimiento miRMON18 se logra usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como reglas de complementariedad de secuencia, tal como se describen por Zhang (2005) Nucleic Acids Res., 33:W701-704 y por Rhoades y col. (2002) Cell, 110:513-520; los ejemplos no limitantes de sitios de reconocimiento de miRMON18 se proporcionan en los Ejemplos de trabajo siguientes.

La predicción de un sitio de reconocimiento del miRMON18 permite la identificación y validación de genes endógenos regulados por un miRMON18 maduro a partir de un miRMON18 precursor expresado naturalmente; esto es útil, por ejemplo, para eliminar o modificar un sitio de reconocimiento del miRMON18 en un gen endógeno para desacoplar la expresión de este gen de la desregulación por el miRMON18 endógeno que regula naturalmente la expresión del gen. En una realización, el número de emparejamientos incorrectos (especialmente los correspondientes a las posiciones 2 a 13 del miRMON18 maduro) entre un sitio de reconocimiento de miRMON18 y un miRMON18 maduro puede aumentarse para prevenir el reconocimiento y la escisión mediante un miRMON18 endógeno.

Las construcciones de ADN recombinante son particularmente útiles para la expresión in planta del transgén a restringir de acuerdo con la expresión endógena de miRMON18, es decir, el transgén se expresa cuando el miRMON18 se suprime, tal como en condiciones de estrés por nutrientes (es decir, deficiencia de nitrógeno, deficiencia de fosfato, o deficiencia tanto de nitrógeno como de fosfato). La expresión del transgén se puede controlar adicionalmente mediante el uso de un promotor apropiado. En un ejemplo no limitante, una construcción de ADN recombinante que codifica (a) un transgén bajo el control de un promotor específico de la raíz y (b) un sitio de reconocimiento del miARN reconocido por un miRMON18 maduro que se expresa específicamente solamente en condiciones de deficiencia de nitrógeno (o fosfato), se utiliza para la expresión del transgén en raíces de una planta en condiciones de deficiencia de nitrógeno (o fosfato).

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5 La unidad de transcripción del transgén incluye al menos un transgén, y, opcionalmente una secuencia adicional tal como un promotor, un potenciador del promotor, un terminador, un ARN mensajero que estabiliza o desestabiliza la secuencia (véanse, por ejemplo, Newman y col. (1993) Plant Cell, 5:701-714; Green (1993) Plant Physiol., 102:10651070; y Ohme-Takagi y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11811-11815), secuencia para la localización o el transporte del transcrito del transgén a una localización específica (por ejemplo, mitocondria, plástido, nucléolo,

10 peroxisoma, retículo endoplasmático), u otra secuencia relacionada con el procesamiento deseado del transgén. El transgén codificado por la unidad de transcripción del transgén puede incluir uno cualquiera o más genes de interés, incluyendo una secuencia codificante, secuencia no codificante, o ambos. Los genes de interés pueden incluir cualquiera de los genes relacionados en "Genes diana", cuyos ejemplos preferidos incluyen la secuencia (codificante) traducible de los genes que codifican factores de transcripción y genes que codifican enzimas

15 implicadas en la biosíntesis o catabolismo de moléculas de interés (tales como aminoácidos, ácidos grasos y otros lípidos, azúcares y otros hidratos de carbono, polímeros biológicos, y metabolitos secundarios incluyendo alcaloides, terpenoides, policétidos, péptidos no ribosómicos, y metabolitos secundarios de origen biosintético mixto).

(D) Supresión de un miRMON18 endógeno o natural.

Se describe una construcción de ADN recombinante que incluye al menos un elemento de ADN transcribible para

20 modular la expresión de al menos un gen diana, en el que el al menos un elemento de ADN transcribible incluye un elemento de ADN para suprimir la expresión de un miARN miRMON18 maduro endógeno derivado de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763 y SEQ ID NO. 3936, en la que el al menos un gen diana es un gen endógeno de una planta, y en la que la expresión del gen endógeno esté suprimida en células de la planta cuando se produce la expresión natural del miARN miRMON18 maduro endógeno y, en la

25 que la expresión de la construcción de ADN recombinante en las células da como resultado la expresión del gen endógeno en las células. Dichas construcciones son especialmente útiles para la supresión de un nativo de un miRMON18 natural o endógeno y, por tanto, para permitir la expresión de genes que tienen uno o más sitios de reconocimiento de miRMON18. Se prefiere que el al menos un gen diana sea un gen endógeno de una planta e incluya uno o más sitios de reconocimiento de miRMON18, y la expresión del gen endógeno esté suprimida en

30 células de la planta cuando se produce la expresión natural del miRMON18 maduro endógeno, y de esta manera, la expresión de la construcción de ADN recombinante en las células da como resultado la expresión del gen endógeno diana en las células.

El elemento de ADN para suprimir la expresión incluye al menos uno de:

(a) ADN que incluye al menos un segmento de ADN de sentido contrario que es de sentido contrario para al 35 menos un segmento del gen diana;

(b)

ADN que incluye múltiples copias de al menos un segmento de ADN de sentido contrario que es de sentido contrario para al menos un segmento del gen diana;

(c)

ADN que incluye al menos un segmento de ADN de sentido directo que tiene al menos un segmento del gen diana;

40 (d) ADN que incluye múltiples copias de al menos un segmento de ADN de sentido directo que tiene al menos un segmento del gen diana;

(e) ADN que se transcribe a ARN para suprimir el gen diana formando ARN bicatenario e incluye al menos un segmento de ADN de sentido contrario que es de sentido contrario para al menos un segmento del gen diana y al menos un segmento de ADN de sentido directo que tiene al menos un segmento del gen diana;

45 (f) ADN que se transcribe a ARN para suprimir el gen diana formando un único ARN bicatenario e incluye múltiples segmentos de ADN de sentido contrario en serie que son de sentido contrario para al menos un segmento del gen diana y múltiples segmentos de ADN de sentido directo en serie que tienen al menos un segmento del gen diana

(g) ADN que se transcribe a ARN para suprimir el gen diana formando múltiples ARN bicatenarios e incluye

50 múltiples segmentos de ADN de sentido contrario que son de sentido contrario para al menos un segmento del gen diana y múltiples segmentos de ADN de sentido directo que tienen al menos un segmento del gen diana, y en los que los múltiples segmentos de ADN de sentido contrario y los múltiples segmentos de ADN con sentido están dispuestos en una serie de repeticiones invertidas;

(h) ADN que incluye nucleótidos procedentes de un miARN de planta; 55 (i) ADN que incluye nucleótidos de ARNpi;

(j)

ADN que se transcribe en un aptámero de ARN capaz de unirse a un ligando; y

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ADN que se transcribe a un aptámero de ARN capaz de unirse a un ligando, y ADN que se transcribe a ARN regulador capaz de regular la expresión del gen diana, en el que la regulación es dependiente de la conformación del ARN regulador, y la conformación del ARN regulador está afectada alostéricamente por el estado de unión

60 del aptámero de ARN.

Los elementos del ADN para suprimir la expresión se describen más detalladamente en el Ejemplo 3 y se La construcción de ADN recombinante puede incluir el ADN diseñado para transcribirse a ARN monocatenario o al

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5 menos ARN parcialmente bicatenario (tal como en una disposición "tallo-bucle en contacto"), o a un ARN que asume un estructura secundaria o una configuración tridimensional (por ejemplo, un bucle grande de secuencia de sentido contrario del gen diana o un aptámero) que confiere al transcrito una característica deseada adicional, tal como una estabilidad aumentada, una semivida aumentada in vivo, o una especificidad celular o tisular. En un ejemplo, el separador se transcribe a un bucle estabilizante que une la primera y segunda serie de segmentos de ARN

10 contiguos (véase, por ejemplo, Di Giusto y King (2004) J. Biol. Chem., 279:46483-46489). En otro ejemplo, la construcción de ADN recombinante incluye el ADN que se transcribe a ARN que incluye un aptámero de ARN (por ejemplo, un aptámero que se une a un ligando específico de célula que permite el direccionamiento específico de célula o tejido del duplete de ARN recombinante.

(E) Transgenes que no responden a miARN, incluyendo transgenes que no responden a miRMON18.

15 También se describe una construcción de ADN recombinante que incluye una secuencia de un transgén sintético que no responde a miARN que es insensible a un miARN maduro dado, en el que la secuencia de transgén sintético que no responde a miARN: (a) se deriva de una secuencia sensible a miARN natural por deleción o modificación de todos los sitios de reconocimiento del miARN natural reconocidos por el miARN maduro dado dentro de la secuencia sensible a miARN natural, y (b) no se reconoce por el miARN maduro dado. Esto incluye una construcción de ADN

20 recombinante que incluye una secuencia de un transgén sintético que no responde a miARN que es insensible a un miARN maduro seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1 -1035, SEQ ID NOS. 2730 -3921, SEQ ID NOS. 5498 6683, SEQ ID NOS. 8409 -8560, SEQ ID NO. 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812 -8815, SEQ ID NO. 8845, y la SEQ ID NO. 8850, o insensible a un miARN maduro derivado de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408,

25 SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819, en el que la secuencia de transgén sintético que no responde a miARN: (a) se deriva de una secuencia sensible a miARN natural por deleción o modificación de todos los sitios de reconocimiento del miARN natural reconocidos por el miARN maduro dado dentro de la secuencia sensible a miARN natural, y (b) no se reconoce por el miARN maduro dado. La predicción de un sitio de reconocimiento se logra usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como reglas

30 de complementariedad de secuencia, tal como se describen por Zhang (2005) Nucleic Acids Res., 33:W701-704 y por Rhoades y col. (2002) Cell, 110:513-520.

Se prefiere una construcción de ADN recombinante que incluya una secuencia de un transgén sintético que no responde a miRMON18, en la que la secuencia de un transgén sintético que no responde a miRMON18: (a) se deriva de una secuencia sensible a miRMON18 natural por deleción o modificación de todos los sitios de

35 reconocimiento del miARN miRMON18 natural (es decir, deleción o modificación de cualquier sitio de reconocimiento que se reconozca por un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742 o mediante un miARN miRMON18 derivado de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763 y SEQ ID NO. 3936) dentro de la secuencia sensible a miRMON18 natural, y (b) no se reconoce por un miARN miRMON18 maduro.

40 (F) Promotores del miARN sensibles al estrés abiótico, incluyendo los promotores de miRMON18.

También se describe una construcción de ADN recombinante que incluye un promotor de un miARN que tiene un patrón de expresión caracterizado por la regulación del estrés abiótico, por ejemplo, un promotor de un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la regulación del miARN mediante el estrés por nutrientes, un promotor de un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la regulación del miARN mediante el 45 estrés por agua, o un promotor de un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la regulación del miARN mediante el estrés por temperatura. Se prefiere que incluya una construcción de ADN recombinante que incluya un promotor de un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la regulación del miARN mediante el estrés por nutrientes, en el que el estrés por nutrientes comprende al menos una deficiencia de nutrientes seleccionada entre el grupo que consiste en deficiencia de nitrógeno y deficiencia de fosfato. El promotor

50 puede ser el de un miARN que se suprime debido a la deficiencia por nitrógeno. En otro caso, el promotor puede ser el de un miARN que se suprime debido a la deficiencia por fosfato. En otro caso más, el promotor puede ser el de un miARN que se suprime debido a la ocurrencia simultánea de deficiencias en nitrógeno y en fosfato. En casos adicionales, el promotor puede ser el de un miARN que se regula en exceso por una deficiencia en nitrógeno o una deficiencia en fosfato.

55 Se prefiere especialmente una construcción de ADN recombinante que incluya un promotor de un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la supresión del miARN en condiciones de estrés por nutrientes, en el que el estrés por nutrientes comprende al menos una deficiencia de nutrientes seleccionada entre el grupo que consiste en deficiencia de nitrógeno y deficiencia de fosfato, y en el que el promotor incluye al menos uno de: (a) el promotor del miARN del maíz que presenta en el tejido foliar una expresión intensa en condiciones de suficiente

60 nitrógeno y supresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno; (b) el promotor del miARN del maíz que presenta en el tejido foliar una expresión intensa en condiciones de suficiente fosfato y supresión en condiciones de deficiencia de fosfato; (c) un promotor de miRMON18 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8804; (d) un fragmento de al menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos que tienen al menos una identidad del 85% con un segmento de la SEQ ID NO. 8804. También se prefiere que el promotor está unido operativamente a al menos

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5 uno de: (a) un elemento de supresión génica, y (b) un elemento de expresión génica; preferentemente, esto es de utilidad para expresar la construcción de ADN recombinante en una planta.

Los ejemplos no limitantes incluyen el promotor que tiene la secuencia de nucleótidos 211 -2172 de SEQ ID NO. 8800; un fragmento de al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, o al menos 10 500 nucleótidos contiguos que tienen al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% de identidad con los nucleótidos 211 -2172 de SEQ ID NO. 8800, en la que el fragmento tiene actividad del promotor en al menos un tejido vegetal que se caracteriza por una fuerte expresión en condiciones de nitrógeno suficiente y supresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno, o la fuerte expresión en condiciones de fosfato suficiente y supresión en condiciones de deficiencia de fosfato; y un fragmento de al menos aproximadamente 50, al menos 15 aproximadamente 100, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, o al menos 500 nucleótidos contiguos que tienen al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos 98% de identidad con la SEQ ID NO. 8804, en la que el fragmento tiene actividad del promotor en al menos un tejido vegetal que se caracteriza por una fuerte expresión en condiciones de nitrógeno suficiente y supresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno, o la fuerte expresión en

20 condiciones de fosfato suficiente y supresión en condiciones de deficiencia de fosfato.

(G) Células de plantas transgénicas y plantas transgénicas sensibles al estrés abiótico.

Se describe además una célula de planta transgénica no natural que incluye cualquiera de las construcciones de ADN recombinante desveladas bajo este encabezado ("miARN sensibles al estrés abiótico"). Se prefiere una planta transgénica no natural preparada a partir de una célula de planta transgénica no natural que incluye una 25 construcción de ADN recombinante que incluye al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana, en el que el al menos un elemento de ADN que se transcribe a un precursor de miARN con la estructura replegada de una secuencia de miRMON18 precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NO. 1763, SEQ ID NO. 3936, y la SEQ ID NO. 8800, en el que el miARN precursor incluye un segmento contiguo de al menos el 90% de los nucleótidos de la secuencia precursora de miRMON18 y que se procesa para 30 obtener un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de UUAGAUGACCAUCAGCAAACA (SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742) y el al menos un gen diana es un gen endógeno de una planta e incluye un dominio SPX y, de esta manera, la expresión de la construcción de ADN recombinante en la planta da como resultado la supresión del al menos un gen diana; por lo general, la construcción de ADN recombinante incluye además un promotor diferente al promotor de miRMON18 natural para impulsar la expresión del miRMON18

35 maduro.

Se prefiere además una planta transgénica no natural preparada a partir de una célula de planta transgénica no natural que incluye una construcción de ADN recombinante que incluye al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana, en el que el al menos un elemento de ADN transcribible incluye un elemento de ADN para suprimir la expresión de un miARN miRMON18 maduro endógeno derivado de 40 una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763, SEQ ID NO. 3936, y la SEQ ID NO. 8800, el al menos un gen diana es un gen endógeno de una planta e incluye un dominio SPX, y la expresión del gen endógeno esté suprimida en células de la planta cuando se produce la expresión natural del miARN miRMON18 maduro endógeno y, en la que la expresión de la construcción de ADN recombinante en las células da como resultado la expresión del gen endógeno en las células. Los elementos de ADN adecuados para suprimir la

45 expresión de un miARN miRMON18 maduro endógeno se describen en el encabezado "Supresión de un miRMON18 endógeno o natural".

SECUENCIAS SEÑUELO DE MICROARN

Los microARN vegetales regulan sus genes diana mediante el reconocimiento y la unión a una secuencia casi perfectamente complementaria sitio de reconocimiento de miARN) en el transcrito diana, seguido por la escisión del 50 transcrito mediante enzimas RNasa III tales como Ago1. En plantas, no se toleran determinados emparejamientos incorrectos entre un sitio de reconocimiento de miARN dado y el correspondiente miARN maduro, especialmente, nucleótidos incorrectamente emparejados en las posiciones 10 y 11 del miARN maduro. Las posiciones en el miARN maduro se proporcionan en la dirección de 5’ a 3’; por claridad, la Figura 7D representa gráficamente ejemplos de miARN, miR827 (SEQ ID NO. 8744) y miRMON18 (SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742), con

55 flechas numeradas que indican las posiciones 1, 10, y 21 del miARN maduro; el nucleótido en la posición 10 está también subrayado. La complementariedad perfecta entre un sitio de reconocimiento de miARN dado y el correspondiente miARN maduro se necesita, normalmente, en las posiciones 10 y 11 del miARN maduro. Véase, por ejemplo, Franco-Zorrilla y col. (2007) Nature Genetics, 39:1033-1037; y Axtell y col. (2006) Cell, 127:565-577.

Esta característica de los miARN vegetales se aprovechó para conseguir las reglas que predicen una "secuencia 60 señuelo de microARN", es decir, una secuencia que puede reconocerse y unirse a un miARN maduro endógeno que

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da como resultado un emparejamiento de bases entre la secuencia señuelo de miARN y el miARN maduro endógeno, formando de este modo un duplete de ARN resistente a la escisión que no se escinde debido a la presencia de emparejamientos incorrectos entre las secuencias señuelo de miARN y el miARN maduro. Los emparejamientos incorrectos incluyen los emparejamientos incorrectos habituales (por ejemplo, G-A, C-U, C-A) así 5 como el par oscilante G:U y los indeles (inserciones o deleciones de nucleótidos). En general, estas reglas definen

(1) los emparejamientos incorrectos necesarios, y (2) los emparejamientos incorrectos que se permiten pero que no son necesarios.

Los emparejamientos incorrectos necesarios incluyen: (a) al menos 1 emparejamiento incorrecto entre la secuencia

señuelo de miARN y el miARN maduro endógeno en las posiciones 9, 10, u 11 del miARN maduro endógeno, o 10 como alternativa, (b) 1, 2, 3, 4, o 5 inserciones (es decir, nucleótidos adicionales) en una posición de la secuencia

señuelo de miARN correspondiente a las posiciones 9, 10, u 11 del miARN maduro endógeno. En realizaciones

preferidas, existe bien (a) al menos 1 emparejamiento incorrecto entre la secuencia señuelo de miARN y el miARN

maduro endógeno en las posiciones 10 y/u 11 del miARN maduro endógeno, o (b) al menos 1 inserción en una

posición de la secuencia señuelo de miARN correspondiente a las posiciones 10 y/u 11 del miARN maduro 15 endógeno.

Los emparejamientos incorrectos que se permiten, pero que no son necesarios, incluyen: (a) 0, 1, o 2

emparejamientos incorrectos entre la secuencia señuelo de miARN y el miARN maduro endógeno en las posiciones

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, y 9 del miARN maduro endógeno, y (b) 0, 1, 2, o 3 emparejamientos incorrectos entre la

secuencia señuelo de miARN y el miARN maduro endógeno en las posiciones desde la 12 hasta la última posición 20 del miARN maduro endógeno (es decir, en la posición 21 de un miARN maduro de 21 nucleótidos), en el que cada

uno de los emparejamientos incorrectos en las posiciones desde la 12 hasta la última posición del microARN maduro

endógeno es adyacente a al menos un par de bases complementario (es decir, de forma que no hay más de dos

emparejamientos incorrectos contiguos en las posiciones desde la 12 hasta la última posición del microARN maduro

endógeno). En realizaciones preferidas, no existen emparejamientos incorrectos (es decir, todos los pares de bases 25 son complementarios) en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, y 8 del miARN maduro endógeno.

La secuencia señuelo de miARN consiste en 36 nucleótidos. Las realizaciones específicamente reivindicadas

incluyen las secuencias señuelo de miARN de 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, y 31 nucleótidos. En

ejemplos no limitantes, una secuencia señuelo de miARN (para un miARN maduro de 21 nucleótidos) que tiene un

emparejamiento incorrecto necesario que consiste en una inserción de 4 nucleótidos en la posición 10 del miARN 30 maduro y un emparejamiento incorrecto permitido que consiste en la inserción de 1 nucleótido en la posición 20 del

miARN maduro tiene un total de 26 nucleótidos; una secuencia señuelo de miARN (para un miARN maduro de 25

nucleótidos) que tiene un emparejamiento incorrecto necesario que consiste en una inserción de 5 nucleótidos en la

posición 11 del miARN maduro y emparejamientos incorrectos permitidos que consisten en un emparejamiento

incorrecto convencional en la posición 20 del miARN maduro y la inserción de 1 nucleótido en la posición 23 del 35 miARN maduro tendrá un total de 31 nucleótidos.

De este modo, se describe una construcción de ADN recombinante que se transcribe a un transcrito de ARN que

incluye al menos una secuencia señuelo miARN que reconoce y se une a un miARN maduro endógeno pero que no

se escinde (por ejemplo, que no se escinde mediante una proteína Argonauta o una proteína análoga a AGO), en la

que el miARN endógeno es al menos un miARN seleccionado entre (a) miARN maduro seleccionado entre un 40 miARN maduro seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1-1035, SEQ ID NOS. 2730 -3921, SEQ ID NOS. 5498 -6683,

SEQ ID NOS. 8409 -8560, SEQ ID NO. 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812 -8815, SEQ ID NO. 8845, y la

SEQ ID NO. 8850, o (b) un miARN maduro derivado de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada

entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561

8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819; y la secuencia señuelo de miARN incluye 45 una secuencia ARN de entre 19 y 36 nucleótidos contiguos de ARN, en la que la secuencia señuelo de miARN

reconoce y se une al miARN maduro endógeno, dando como resultado el emparejamiento de bases entre dicha

secuencia señuelo de miARN y el miARN maduro endógeno, formando de esta manera un duplete de ARN

resistente a la escisión que incluye: (a) al menos un emparejamiento incorrecto entre dicha secuencia señuelo de

miARN y dicho miARN maduro endógeno en las posiciones 9, 10, u 11 de dicho miARN maduro endógeno, o al 50 menos una inserción en una posición de dicha secuencia señuelo de miARN correspondiente a las posiciones 10-11

de dicho miARN maduro endógeno, (b) 0, 1, o 2 emparejamientos incorrectos entre dicha secuencia señuelo de

miARN y dicho miARN maduro endógeno en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, y 9 de dicho miARN maduro

endógeno, y (c) 0, 1, 2, o 3 emparejamientos incorrectos entre dicha secuencia señuelo de miARN y dicho miARN

maduro endógeno en las posiciones desde la 12 hasta la última posición de dicho miARN maduro endógeno, en el 55 que cada uno de dichos emparejamientos incorrectos en las posiciones desde la 12 hasta la última posición de dicho

microARN maduro endógeno es adyacente a al menos un par de bases complementario.

Las construcciones de ADN recombinante incluyen al menos una secuencia señuelo de miARN, y pueden incluir

múltiples secuencias señuelo de miARN (bien múltiples copias de una sola secuencia señuelo de miARN, o copias

de diferentes secuencias señuelo de miARN, o una combinación de ambos). En un ejemplo, múltiples copias de una 60 secuencia señuelo de miARN se disponen en tándem en una construcción de ADN recombinante diseñada para

disminuir la actividad del miARN maduro correspondiente. En otro ejemplo, la actividad de diferentes miARN

maduros se disminuye mediante la expresión de una única construcción de ADN quimérico recombinante que se transcribe a varias secuencias señuelo de miARN diferentes. La expresión de secuencias señuelo de miARN se puede impulsar mediante varios promotores, incluyendo, aunque no de forma limitativa, promotores específicos de tejidos, específicos de células, temporalmente específicos, inducibles, o constitutivos, por ejemplo, cualquiera de los promotores descritos en el encabezado "Promotores". Las secuencias señuelo de miARN se pueden situar en

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5 diferentes posiciones de un transcrito. En una construcción de ADN recombinante prevista para transcribirse también a una secuencia codificante, secuencia no codificante (por ejemplo, un miARN), o ambos, la secuencia señuelo de miARN se sitúa preferentemente en un intrón o después de la señal de poliadenilación, para permitir la transcripción normal de la secuencia codificante, secuencia no codificante, o ambos.

Como alternativa, se pueden usar secuencias señuelo análogas para regular la actividad de otros ARN pequeños

10 implicados en la supresión génica mediada por el ARN bicatenario, incluyendo los ARN de interferencia pequeños de actuación en trans (ta-ARNip), transcritos de ARNip de sentido contrario naturales (nat-ARNip), y ARN pequeños en fase (como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2008/0066206). Estas secuencias señuelo análogas de ta-ARNip, secuencias señuelo nat-ARNip, y secuencias señuelo de ARN pequeño en fase se pueden predecir usando esencialmente las mismas reglas que las utilizadas para predecir las secuencias

15 señuelo de miARN, y tienen utilidades similares a las de las secuencias señuelo de miARN.

La secuencia señuelo de miARN puede ser una secuencia de origen natural o una secuencia artificial. En una realización, la al menos una secuencia señuelo de miARN incluye una secuencia señuelo de miARN de origen natural, por ejemplo, una secuencia señuelo de miARN endógena identificada mediante bioinformática. En otra realización, la al menos una secuencia señuelo de miARN incluye una secuencia señuelo de miARN sintética, por

20 ejemplo, una que se ha diseñados ab inifio para unirse a un miARN maduro dado para formar un duplete de ARN resistente a la escisión.

De este modo, una construcción de ADN recombinante que se transcribe a un transcrito de ARN que incluye al menos una secuencia señuelo miRMON18 que reconoce y se une a un miRMON18 maduro endógeno pero que no se escinde (por ejemplo, que no se escinde mediante una proteína Argonauta o una proteína análoga a AGO), en la 25 que el miRMON18 endógeno es al menos uno seleccionado entre (a) un miRMON18 maduro, o (b) un miARN maduro derivado de una secuencia precursora de miRMON18 vegetal; y la secuencia señuelo de miRMON18 incluye una secuencia ARN de entre aproximadamente 19 y aproximadamente 36 nucleótidos contiguos de ARN, en la que la secuencia señuelo de miRMON18 reconoce y se une al miRMON18 maduro endógeno, dando como resultado el emparejamiento de bases entre la secuencia señuelo de miRMON18y el miRMON18 maduro endógeno, 30 formando de esta manera un duplete de ARN resistente a la escisión que incluye: (a) al menos 1 emparejamiento incorrecto entre la secuencia señuelo de miRMON18 y el miRMON18 maduro endógeno en las posiciones 9, 10, u 11 del miRMON18 maduro endógeno, o al menos una inserción en una posición de la secuencia señuelo de miRMON18 correspondiente a las posiciones 10-11 del miRMON18 maduro endógeno, (b) 0, 1, o 2 emparejamientos incorrectos entre la secuencia señuelo de miRMON18 y el miRMON18 maduro endógeno en las 35 posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, y 9 del miRMON18 maduro endógeno, y (c) 0, 1, 2, o 3 emparejamientos incorrectos entre la secuencia señuelo de miRMON18 y el miRMON18 maduro endógeno en las posiciones desde la 12 hasta la última posición del miRMON18 maduro endógeno (es decir, en el que cada uno de los emparejamientos incorrectos en las posiciones desde la 12 hasta la última posición del miRMON18 maduro endógeno es adyacente a al menos un par de bases complementario; y en la que la al menos una secuencia señuelo de miRMON18 reconoce y se une, 40 pero no se escinde, mediante un miARN miRMON18 maduro. Se prefiere que el miRMON18 maduro tenga la secuencia de la SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 874, o sea un miARN maduro derivado de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763 y SEQ ID NO. 3936. Se describe además un procedimiento para proporcionar una planta de cultivo transgénico que tiene un rendimiento aumentado en al menos una deficiencia de nutrientes seleccionada entre la deficiencia de nitrógeno y la deficiencia de fosfato,

45 que incluye la expresión en la planta de cultivo transgénico no natural de una construcción de ADN recombinante que se transcribe a un transcrito de ARN que incluye al menos una secuencia señuelo de miRMON18.

Se describe además una construcción de ADN recombinante que se transcribe a un transcrito de ARN que incluye al menos una secuencia señuelo miR399 que reconoce y se une a un miR399 maduro endógeno pero que no se escinde (por ejemplo, que no se escinde mediante una proteína Argonauta o una proteína análoga a AGO), en la 50 que el miR399 endógeno es al menos uno seleccionado entre (a) un miR399 maduro, o (b) un miARN maduro derivado de una secuencia precursora de miR399 seleccionada entre las SEQ ID NOS. 8816 -8819; y la secuencia señuelo de miR399 incluye una secuencia ARN de entre 19 y 36 nucleótidos contiguos de ARN, en la que la secuencia señuelo de miR399 reconoce y se une al miR399 maduro endógeno, dando como resultado el emparejamiento de bases entre dicha secuencia señuelo de miR399 y el miR399 maduro endógeno, formando de 55 esta manera un duplete de ARN resistente a la escisión que incluye: (a) al menos 1 emparejamiento incorrecto entre la secuencia señuelo de miR399 y el miR399 maduro endógeno en las posiciones 9, 10, u 11 del miR399 maduro endógeno, o al menos una inserción en una posición de la secuencia señuelo de miR399 correspondiente a las posiciones 10-11 del miR399 maduro endógeno, (b) 0, 1, o 2 emparejamientos incorrectos entre la secuencia señuelo de miR399 y el miR399 maduro endógeno en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, y 9 del miR399 maduro 60 endógeno, y (c) 0, 1, 2, o 3 emparejamientos incorrectos entre la secuencia señuelo de miR399 y el miR399 maduro endógeno en las posiciones desde la 12 hasta la última posición del miR399 maduro endógeno (es decir, en el que cada uno de los emparejamientos incorrectos en las posiciones desde la 12 hasta la última posición del miR399 maduro endógeno es adyacente a al menos un par de bases complementario; y en la que la al menos una secuencia

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señuelo de miR399 reconoce y se une, pero no se escinde, mediante un miR399 maduro. Se prefiere que el miR399 maduro tenga la secuencia de la SEQ ID NO. 8812 -8815 o que sea un miR399 maduro derivado de una secuencia precursora de miR399 seleccionada entre las SEQ ID NOS. 8816 -8819. Se describe además un procedimiento para proporcionar una planta de cultivo transgénico que tiene un rendimiento aumentado en al menos una

5 deficiencia de nutrientes seleccionada entre la deficiencia de nitrógeno y la deficiencia de fosfato, que incluye la expresión en la planta de cultivo transgénico no natural de una construcción de ADN recombinante que se transcribe a un transcrito de ARN que incluye al menos una secuencia señuelo de miR399.

Otra realización más de la presente invención es la supresión de una secuencia señuelo de miARN endógena, por ejemplo, mediante un elemento de supresión génica (como el descrito bajo el encabezado "Elemento de ADN para

10 suprimir la expresión"), especialmente impulsada por un promotor específico de una célula o tejido o un promotor inducible.

Cualquier de estas construcciones de ADN recombinante descritas en el presente documento se puede preparar por técnicas normalmente utilizadas, tales como aquellas descritas en el encabezado "Elaboración y uso de construcciones de ADN recombinante" e ilustradas en los ejemplos de trabajo. Las construcciones de ADN

15 recombinante son particularmente útiles para preparar células de plantas transgénicas no naturales, plantas transgénicas no naturales, y semillas transgénicas como se describe a continuación en "Células de planta transgénicas y plantas transgénicas".

Las construcción de ADN recombinante que incluyen una secuencia señuelo de miARN son útiles para proporcionar patrones de expresión únicos de un miARN sintético que se diseña mediante ingeniería genética para suprimir un 20 gen endógeno; esto es especialmente deseable para prevenir fenotipos adversos causados mediante la expresión indeseable del miARN sintético en algunos tejidos. Por ejemplo, el miARN sintético se puede usar para suprimir el gen endógeno solamente en tejidos específicos de una planta, por ejemplo, mediante la expresión en la planta de una construcción de ADN recombinante que incluye (a) un promotor constitutivo que impulsa la expresión del miARN sintético, y (b) un promotor específico de tejido que impulsa la expresión de una secuencia señuelo de miARN

25 diseñada para secuestrar el miARN sintético.

Se describen además procedimientos útiles para proporcionar plantas de cultivo mejoradas. Esto incluye un procedimiento para proporcionar una plantas de cultivo transgénica no natural que tiene al menos un rasgo alterado que incluye la expresión, en la plantas de cultivo transgénica no natural, una construcción de ADN recombinante que se transcribe a un transcrito de ARN que incluye al menos una secuencia señuelo de miARN que reconoce y se une 30 a un miARN maduro endógeno pero que no se escinde (por ejemplo, que no se escinde mediante una proteína Argonauta o una proteína análoga a AGO), en el que el miARN endógeno es al menos un miARN seleccionado entre

(a) miARN maduro seleccionado entre un miARN maduro seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1-1035, SEQ ID NOS. 2730 -3921, SEQ ID NOS. 5498 -6683, SEQ ID NOS. 8409 -8560, SEQ ID NO 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812 -8815, SEQ ID NO. 8845, y la SEQ ID NO. 8850, o (b) un miARN maduro derivado de una 35 secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819; y la secuencia señuelo de miARN incluye una secuencia ARN de entre 19 y 36 nucleótidos contiguos de ARN, en la que la secuencia señuelo de miARN reconoce y se une al miARN maduro endógeno, dando como resultado el emparejamiento de bases entre dicha secuencia señuelo de miARN y el miARN maduro endógeno, 40 formando de esta manera un duplete de ARN resistente a la escisión que incluye: (a) al menos un emparejamiento incorrecto entre dicha secuencia señuelo de miARN y dicho miARN maduro endógeno en las posiciones 9, 10, u 11 de dicho miARN maduro endógeno, o al menos una inserción en una posición de dicha secuencia señuelo de miARN correspondiente a las posiciones 10-11 de dicho miARN maduro endógeno, (b) 0, 1, o 2 emparejamientos incorrectos entre dicha secuencia señuelo de miARN y dicho miARN maduro endógeno en las posiciones 1, 2, 3, 4, 45 5, 6, 7, 8, y 9 de dicho miARN maduro endógeno, y (c) 0, 1, 2, o 3 emparejamientos incorrectos entre dicha secuencia señuelo de miARN y dicho miARN maduro endógeno en las posiciones desde la 12 hasta la última posición de dicho miARN maduro endógeno, en el que cada uno de dichos emparejamientos incorrectos en las posiciones desde la 12 hasta la última posición de dicho microARN maduro endógeno es adyacente a al menos un par de bases complementario, dando como resultado por tanto la mencionada planta de cultivo transgénico no

50 natural que presenta al menos un rasgo alterado, con respecto a una planta de cultivo que no expresa la construcción de ADN recombinante, seleccionado entre el grupo de rasgos que consiste en:

(i)

tolerancia al estrés abiótico mejorada;

(ii)

tolerancia al estrés biótico mejorada;

(iii) resistencia mejorada a una plaga o un patógeno de dicha planta; 55 (iv) composición de metabolitos primarios modificada;

(v) composición de metabolitos secundarios modificada; ((iv) elemento traza modificado, carotenoides, o composición de vitaminas;

(vii) rendimiento mejorado;

(viii) capacidad mejorada de usar nitrógeno u otros nutrientes; 60 (ix) características agronómicas modificadas;

(x)

características de crecimiento o reproductivas modificadas; y

(xi)

cosecha, almacenamiento, o calidad del procesamiento mejorados.

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Se describe además un procedimiento para proporcionar una planta de cultivo transgénica no natural que tiene al menos un rasgo alterado que incluye suprimir en la planta de cultivo transgénica no natural al menos una secuencia señuelo de miARN endógeno que reconoce y se une a un miARN maduro endógeno pero que no se escinde (por ejemplo, que no se escinde mediante una proteína Argonauta o una proteína análoga a AGO), en el que el miARN 5 endógeno es al menos un miARN seleccionado entre (a) miARN maduro seleccionado entre un miARN maduro seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1-1035, SEQ ID NOS. 2730 -3921, SEQ ID NOS. 5498 -6683, SEQ ID NOS. 8409 -8560, SEQ ID NO 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812 -8815, SEQ ID NO. 8845, y la SEQ ID NO. 8850, o (b) un miARN maduro derivado de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561 -8417, SEQ ID 10 NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819; y la secuencia señuelo de miARN incluye una secuencia ARN de entre 19 y 36 nucleótidos contiguos de ARN, en la que la secuencia señuelo de miARN reconoce y se une al miARN maduro endógeno, dando como resultado el emparejamiento de bases entre dicha secuencia señuelo de miARN y el miARN maduro endógeno, formando de esta manera un duplete de ARN resistente a la escisión que incluye: (a) al menos un emparejamiento incorrecto entre dicha secuencia señuelo de miARN y dicho miARN maduro 15 endógeno en las posiciones 9, 10, u 11 de dicho miARN maduro endógeno, o al menos una inserción en una posición de dicha secuencia señuelo de miARN correspondiente a las posiciones 10-11 de dicho miARN maduro endógeno, (b) 0, 1, o 2 emparejamientos incorrectos entre dicha secuencia señuelo de miARN y dicho miARN maduro endógeno en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, y 9 de dicho miARN maduro endógeno, y (c) 0, 1, 2, o 3 emparejamientos incorrectos entre dicha secuencia señuelo de miARN y dicho miARN maduro endógeno en las 20 posiciones desde la 12 hasta la última posición de dicho miARN maduro endógeno, en el que cada uno de dichos emparejamientos incorrectos en las posiciones desde la 12 hasta la última posición de dicho microARN maduro endógeno es adyacente a al menos un par de bases complementario; dando como resultado por tanto la mencionada planta de cultivo transgénico no natural que presenta al menos un rasgo alterado, con respecto a una planta de cultivo que no expresa la construcción de ADN recombinante, seleccionado entre el grupo de rasgos que

25 consiste en:

(i)

tolerancia al estrés abiótico mejorada;

(ii)

tolerancia al estrés biótico mejorada;

(iii) resistencia mejorada a una plaga o un patógeno de dicha planta;

(iv) composición de metabolitos primarios modificada;

30 (v) composición de metabolitos secundarios modificada; ((iv) elemento traza modificado, carotenoides, o composición de vitaminas;

(vii) rendimiento mejorado;

(viii) capacidad mejorada de usar nitrógeno u otros nutrientes;

(ix) características agronómicas modificadas; 35 (x) características de crecimiento o reproductivas modificadas; y

(xi) cosecha, almacenamiento, o calidad del procesamiento mejorados.

La supresión de la al menos una secuencia señuelo de miARN endógeno se consigue por cualquier medio, incluyendo la expresión en la planta de cultivo transgénica no natural de un elemento de supresión génica (por ejemplo, tales como los elementos de ADN para suprimir la expresión descritos en el encabezado "Supresión de un

40 miARN endógeno o natural"), o mediante cualquier otro medio de supresión génica.

En un ejemplo no limitante, una planta transgénica expresa en exceso, en condiciones de suficiencia de nutrientes, al menos una secuencia señuelo de miARN de un miARN que se expresa de forma natural en niveles elevados en condiciones de suficiencia de nutrientes y a bajos niveles en condiciones de deficiencia de nutrientes, dando como resultado de esta forma una comportamiento o rendimiento mejorado bajo deficiencia de nutrientes y una mejora en

45 la utilización de los nutrientes por la planta. Por ejemplo, miRMON18 y miR399 se expresan en bajos niveles en condiciones de deficiencia de nitrógeno o fosfato, y a niveles elevados en condiciones de nitrógeno y fosfato suficientes, y de esta forma, sus genes diana naturales quedan suprimidos durante las condiciones de deficiencia de nitrógeno o fosfato y se expresan en niveles relativamente elevados en condiciones de suficiencia de nitrógeno y fosfato; esto da como resultado una mejora en la utilización del de nitrógeno y/o fosfato por la planta transgénica. De

50 este modo, una planta transgénica que expresa en exceso una construcción de ADN recombinante que incluye al menos una secuencia señuelo de miRMON18 (o al menos una secuencia señuelo de miR399) da como resultado un mayor nivel de expresión de los genes diana miRMON18 naturales (o de los genes diana miR399 naturales) en condiciones de suficiente nitrógeno y fosfato, con respecto a una planta en la que no se expresa la construcción de ADN recombinante. En un ejemplo no limitante, se espera que una planta transgénica que exprese en exceso una

55 construcción de ADN recombinante que incluye al menos una secuencia señuelo de miRMON18 acumule niveles relativamente elevados de las dianas de miRMON18 naturales (por ejemplo, genes que contienen un dominio SPX, tales como los genes representados gráficamente en la Figura 12, tal como se describe en los Ejemplos 7, 9, y 10).

La presente invención se explica de forma adicional en los siguientes Ejemplos. Los ejemplos no abarcados por el alcance de las reclamaciones se han incluido con fines ilustrativos.

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Ejemplo 1

Este ejemplo describe realizaciones no limitantes de los procedimientos para identificar microARN de plantas de cultivo (arroz y maíz) y sus estructuras precursoras (replegadas), útiles en la preparación de construcciones de ADN 5 recombinante de la presente invención. Varias bibliotecas de ARN pequeño (19 a 25 nucleótidos) se clonaron a partir de grano maduro y plantones de arroz maduro (Oryza sativa cv. Nipponbare) (3 réplicas), a partir de hojas y semillas de maíz (maíz, Zea mays) (39 días después de la polinización) mediante secuenciación de alto rendimiento (Margulies y col. (2005) Nature, 437:376-380). Las secuencias obtenidas de esta manera se utilizaron para la predicción del miARN en secuencias genómicas de arroz y secuencias genómicas de maíz, respectivamente,

10 empleando un conjunto de reglas derivado de miARN caracterizados anteriormente, seguido por inspección manual para eliminar estructuras replegadas mal previstas. El ARN pequeño que se emparejó perfectamente con el ARNt anotado, ARNr, transposón/retrotransposón y otras repeticiones conocidas, y los genomas de cloropastos o mitocondrias se excluyeron del análisis.

Se usó la versión 4.0 de la anotación del genoma del arroz del Institute for Genomic Research (públicamente

15 disponible en www.tigr.org) para predecir dos segmentos genómicos flanqueantes de ~310 nucleótidos en los que un ARN pequeño dado se localizó cerca del extremo izquierdo o derecho del segmento (proporcionando de esta manera bien una secuencia que consiste en 280 nucleótidos más el ARN pequeño más 10 nucleótidos, o bien una secuencia que consiste en 10 nucleótidos más el ARN pequeño más 280 nucleótidos. La estructura replegada de cada segmento obtenido de cada manera se predijo utilizando el programa RNAfold en el paquete Vienna como se

20 describe en Hofacker y col. (1994) Monatsh. f. Chemie, 125:167-188. Para facilitar la predicción de la estructura, a cada ARN pequeño se le asignó una pseudoabundancia de 2.

Las estructuras se filtraron basándose en las características de los miARN precursores validados modificados a partir de los derivados por Jones-Rhoades y col. (2006) Annu. Rev. Plant. Biol., 57:19-53. Para los miARN de arroz, los requisitos de filtración incluyeron: (1) el ARN pequeño debe localizarse completamente en un brazo de la 25 estructura replegada prevista (tallo-bucle); (2) el ARN pequeño y su segmento homólogo en el brazo opuesto deben tener secuencias de nucleótidos de al menos un 75% de complementariedad entre sí, y (3) el ARN pequeño y su homólogo, cuando forman el duplete imperfecto, no deben contener una protuberancia simétrica mayor de 3 nucleótidos o una protuberancia asimétrica mayor de 2 nucleótidos. Las estructuras previstas que satisfacen los anteriores criterios se filtraron además seleccionando (1) solo los ARN pequeños de 20 o 21 nucleótidos de longitud

30 y que tienen un uracilo como la base del extremo 5'; o (2) los ARN pequeños que se secuenciaron al menos 10 veces. Las etapas de filtrado finales incluyeron: (1) seleccionar ARN pequeños con menos de 23 emparejamientos perfectos en el genoma para eliminar los elementos repetitivos, y (2) el segmento utilizado para la predicción podría no incluir los ARN pequeños de la hebra negativa. En los casos donde se identificaron múltiples solapamientos de ARN pequeño, se seleccionó el miembro más abundante del clúster como la secuencia representativa.

35 En el caso de la predicción del miARN de maíz, se modificaron los procedimientos de predicción/filtración a partir de los utilizados para miARN de arroz, ya que aún no se encuentra disponible un genoma completo de maíz. Se analizaron los ARN pequeños procedentes de las bibliotecas de hojas y semillas de maíz de manera independiente para facilitar el uso de las abundancias de los ARN pequeños para la predicción del miARN. Se cartografiaron los ARN pequeños con Maize Assembled Gene Islands (MAGI versión 4), un conjunto de datos de secuencias

40 genómicas de maíz ensambladas públicamente disponible como se describe en Fu y col. (2005), Proc. Natl. Acad. Sca. USA, 102:12282-12287. Se excluyeron las secuencias de ARN pequeños que surgen de las hebras más y menos. Se predijeron las estructuras replegadas de microARN y se filtraron utilizando los mismos requisitos que para el arroz, y se inspeccionaron además manualmente para eliminar estructuras con regiones de bucle grandes (>100 nucleótidos) o muy desemparejadas. Los miARN caracterizados anteriormente excluidos por filtros se

45 utilizaron como indicador de falsos negativos.

Un total de 260676 ARN pequeños únicos de arroz en el intervalo de tamaños de 19-25 nucleótidos se analizaron para los presuntos miARN novedosos. Tras filtrado e inspección manual, se identificaron 840 ARN pequeños correspondientes a 1072 loci, como miARN de arroz novedosos. De las 27 familias de miARN conocidas presentes en la base de datos de miARN "miRBase" (disponible en microrna.sanger.ac.uk/sequences/) y en la secuencia única 50 original se capturaron un conjunto de 22 familias tras el filtrado. Se estimó una tasa de falsos negativos del 18,5 por ciento basándose en los miARN caracterizados (miRBase), lo que indica que la mayoría de miARN se capturaron con esta solución. De un total de 126691 ARN pequeños de semillas de maíz, se identificaron 116 miARN de maíz novedosos correspondientes a 281 loci de secuencias genómicas de maíz en la versión 4.0 de MAGI; de manera similar, de un total de 53103 ARN pequeños de hoja de maíz, se identificaron 79 miARN novedosos de maíz 55 correspondientes a 302 loci. Los miARN de arroz y maíz y sus correspondientes secuencias precursoras de miARN, así como la posición de los nucleótidos del miARN maduro en cada secuencia precursora de miARN, se denominan por su número de identificación de secuencia respectivo en la Tabla 1 como sigue: miARN de semillas de maíz (SEQ ID NOS. 1-116), miARN de hojas de maíz (SEQ ID NOS. 117 -195), miARN de arroz (SEQ ID NOS. 196 -1035), secuencias precursoras de miARN de semillas de maíz (SEQ ID NOS. 1036 -1316), secuencias precursoras de 60 miARN de hojas de maíz (SEQ ID NOS. 1317 -1618), y secuencias precursoras de miARN de arroz (SEQ ID NOS. 1619 -2690). El total de 174 miARN novedosos predichos de los miARN del maíz (que representan 528 loci

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Tabla 1: miARN y miARN precursores de maíz y arroz

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Tabla 2: miARN de maíz

ID ARN

SEQ ID NO. Homólogo* Predicho en almendra de maíz Predicho en hoja de maíz

15996 19644 25372 35979 36116 56811 59250 432006 1392730

3 4 7 9 10 133 16 138 32 ptc-miR390c osa-miR396e ptc-miR172f ath-miR167d osa-miR528 ptc-miR396e ptc-miR398c sbi-miR164c ath-miR171a y y y y y n y y y y y y y y y y y n

*"ptc", Populus trichocarpa; "osa", Oryza sativa; "ath", Arabidopsis thaliana; "sbi", Sorghum bicolor

5 Ejemplo 2

Se predijeron los genes del arroz previstos para ser diana de los miARN de arroz novedosos a partir de la versión

4.0 de anotación del genoma de arroz del Institute for Genomic Research (públicamente disponibles en www.tigr.org), basándose en las reglas de complementariedad de secuencia, descritas en Zhang (2005) Nucleic Acids Res., 33:W701-704 y por Rhoades y col. (2002) Cell, 110:513-520. Estas dianas previstas eran secuencias 10 que incluían al menos un sitio de reconocimiento del miARN reconocido por un miARN maduro seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1-1035, SEQ ID NOS. 2730 -3921, SEQ ID NOS. 5498 -6683, SEQ ID NOS. 8409 -8560, SEQ ID NO. 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812 -8815, SEQ ID NO. 8845, y la SEQ ID NO. 8850 o por un miARN maduro derivado de una secuencia de un miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID

15 NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819. La Tabla 3 relaciona ejemplos no limitantes de sitios de reconocimiento del miARN (SEQ ID NOS. 2691-2729) que son reconocidos por un miARN maduro de arroz (SEQ ID NO. 197).

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Este ejemplo describe realizaciones no limitantes de la construcción de ADN recombinante en la que al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana incluye un elemento de ADN para suprimir la expresión de un miARN endógeno derivado de una secuencia de un miARN precursor de planta

5 seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036 -2690, SEQ ID NOS. 3922 -5497, SEQ ID NOS. 6684 -8408, SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816 -8819. Más específicamente, este ejemplo ilustra los ejemplos no limitantes de elementos del ADN para suprimir la expresión de un gen diana, por ejemplo, un miARN endógeno o una secuencia señuelo de un miARN endógeno.

La Figura 2A representa gráficamente de manera esquemática los ejemplos no limitantes de elementos del ADN

10 para suprimir la expresión de un gen diana, por ejemplo, un miARN endógeno. Estos elementos de ADN incluyen al menos un primer elemento de supresión del gen ("GSE" o "GSE1") para suprimir al menos un primer gen diana, en el que el primer elemento de supresión del gen está incluido en un intrón flanqueado en uno o ambos lados por un ADN que no codifica proteínas. Estos elementos de ADN utilizan un intrón (en muchas realizaciones, se prefiere un intrón derivado de una región 5' no traducida o un intrón potenciador de la expresión) para liberar un elemento de

15 supresión del gen sin requerir la presencia de ningún exón de codificación de proteínas (secuencia de codificación). Estos elementos de ADN pueden incluir al menos un segundo elemento de supresión del gen ("GSE2") para suprimir al menos un segundo gen diana, al menos un elemento de expresión del gen ("GEE") para expresar al menos un gen de interés (que puede ser una secuencia codificante o no codificante o ambas), o ambos. En las realizaciones que contienen un elemento de expresión génica opcional, el elemento de expresión génica puede localizarse en el

20 exterior (por ejemplo, adyacente a) del intrón. En algunas realizaciones, el intrón que contiene el primer elemento de supresión del gen se encuentra en 3' respecto a un terminador.

Para diferenciar más claramente los elementos de ADN de la invención (que contienen al menos un elemento de supresión del gen incluido en un único intrón flanqueado en uno o ambos lados por un ADN que no codifica proteínas) de los procedentes de la técnica anterior, la Figura 2B representa gráficamente de manera esquemática 25 ejemplos de construcciones de ADN recombinante de la técnica anterior. Estas construcciones pueden contener un elemento de supresión del gen que se localiza adyacente a un intrón flanqueado por una secuencia de codificación de proteína, o entre dos intrones discretos (en los que no está incluido el elemento de supresión del gen en ninguo de los dos intrones discretos), o puede incluir un elemento de expresión génica que incluye un elemento de supresión del gen incluido en un intrón que está flanqueado por múltiples exones (por ejemplo, exones que incluyen

30 la secuencia de codificación de una proteína).

La Figura 3 representa gráficamente ejemplos no limitantes de elementos del ADN para suprimir la expresión de un gen diana, por ejemplo, un miARN endógeno, útiles en las construcciones de ADN recombinante de la invención. Cuando se dibujan como una única hebra (Figuras 3A a 3E) se representan gráficamente de forma convencional en la dirección 5' a 3' de la transcripción (izquierda a derecha); las flechas indican la secuencia de sentido contrario 35 (punta de la flecha apuntando a la izquierda), o la secuencia de sentido directo (punta de la flecha apuntando a la derecha). Estos elementos de ADN pueden incluir: ADN que incluye al menos un segmento de ADN de sentido contrario que es de sentido contrario para al menos un segmento del al menos un primer gen, o ADN que incluye múltiples copias de al menos un segmento de ADN de sentido contrario que es de sentido contrario para al menos un segmento del al menos un primer gen diana (Figura 3A); ADN que incluye al menos un segmento de ADN de 40 sentido directo que tiene al menos un segmento del al menos un primer gen diana, o ADN que incluye múltiples copias de al menos un segmento de ADN de sentido directo que tiene al menos un segmento del al menos un primer gen diana (Figura 3B); ADN que se transcribe a ARN para la supresión del al menos un primer gen diana formando un ARN bicatenario e incluye al menos un segmento de ADN de sentido contrario que es de sentido contrario para al menos un segmento del al menos un gen diana y al menos un segmento de ADN de sentido directo que tiene al 45 menos un segmento del al menos un primer gen diana (Figura 3C Figura 3D); ADN que se transcribe a ARN para suprimir el al menos un primer gen diana formando 50 múltiples ARN bicatenarios e incluye múltiples segmentos de ADN de sentido contrario que son de sentido contrario para al menos un segmento del al menos un primer gen diana y múltiples segmentos de ADN de sentido directo que tienen al menos un segmento del al menos un primer gen diana, y en el que dichos múltiples segmentos de ADN de sentido contrario y los múltiples segmentos de ADN de sentido directo se disponen en una serie de repeticiones invertidas (Figura 3E); y ADN que incluye nucleótidos derivados de un miARN, o ADN que incluye nucleótidos de

55 ARNip (Figura 3F).

La Figura 3F representa gráficamente diversas disposiciones no limitantes de ARN bicatenario que se puede transcribir a partir de realizaciones de elementos de ADN para suprimir la expresión de un gen diana, por ejemplo, un miARN endógeno, útiles en las construcciones de ADN recombinante de la invención. Cuando se forma dicho ARN bicatenario, puede suprimir uno o más genes diana, y puede formar un único ARN bicatenario o múltiples ARN 60 bicatenarios o un "tallo" o múltiples "tallos" de un único ARN bicatenario. Cuando se forman múltiples "tallos" de un ARN bicatenario, se pueden disponer en disposiciones de "cabeza de martillo" u "hoja de trébol". En algunas realizaciones, los tallos bicatenarios pueden formar una disposición de "pseudonudo" (por ejemplo, donde el ARN

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del separador o el bucle de un tallo bicatenario forma parte de un segundo tallo bicatenario); véanse, por ejemplo, las representaciones gráficas de arquitecturas de pseudonudos en Staple y Butcher (2005) PLoS Biol., 3(6):e213. El separador de ADN (localizado entre o adyacente a las regiones de ARNds) es opcional pero suele estar incluido y generalmente incluye ADN que no corresponde al gen diana (aunque en algunas realizaciones puede incluir ADN de

5 sentido directo o de sentido contrario del gen diana). El separador de ADN puede incluir la secuencia que se transcribe a ARN monocatenario o al menos ARN parcialmente bicatenario (tal como en una disposición "tallo-bucle en contacto"), o a un ARN que asume un estructura secundaria o una configuración tridimensional (por ejemplo, un bucle grande de secuencia de sentido contrario del gen diana o un aptámero) que confiere al transcrito una característica deseada adicional, tal como una estabilidad aumentada, una semivida aumentada in vivo, o una especificidad celular o tisular.

Se puede encotrar una descripción adicional de elementos del ADN y procedimientos para suprimir la expresión de un gen diana, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2006/0200878, que se ha incorporado por referencia al presente documento.

Ejemplo 4

15 Este ejemplo describe realizaciones no limitantes de procedimientos para utilizar microARN, precursores de microARN, sitios de reconocimiento de microARN, y promotores de microARN para modular la expresión la expresión de al menos un gen diana.

Se desvelan diversas utilidades potenciales de un miARN o su sitio de reconocimiento mediante el patrón de expresión del miARN. Es útil el conocimiento de la distribución espacial o temporal o la inducibilidad de la expresión de un miARN maduro dado, por ejemplo, para diseñar construcciones recombinantes que se van a expresar de una manera específica espacial o temporal o induciblemente. Un procedimiento no limitante para determinar un patrón de expresión del miARN maduro es mediante aislamiento del miARN maduro (o su precursor) y analizar el patrón de expresión mediante transferencias Northern con una sonda adecuada (es decir, sondas específicas del miARN maduro o del miARN precursor).

25 La Figura 4 representa gráficamente un ejemplo no limitante de los resultados de análisis de transferencia Northern para los miARN maduros aislados de diferentes tejidos de maíz. Una sonda se hibrida con los miARN maduros de dos familias (miR156 y miR157). Los miARN maduros individuales se expresaron a diferentes niveles en células o tejidos específicos, por ejemplo, Zm-miR390 no se expresó, o se expresó solo a niveles bajos, en la raíz y en la hoja adulta, y miR156 se expresó en raíces, hojas, y estambres. De este modo, por ejemplo, la construcción de ADN recombinante de la presente invención que incluye una unidad de transcripción del transgén impulsada por un promotor constitutivo y un sitio de reconocimiento del miARN reconocido por un miARN miR390 maduro de maíz es útil para la expresión del transgén en tejidos de la raíz y en hojas adultas pero no en tejidos donde el miR390 maduro se expresa a niveles elevados. Para ilustrar adicionalmente el uso de las construcciones y los procedimientos de la invención para controlar la expresión de un transgén, se usó un gen indicador como el propio

35 transgén, o como un derivado del transgén. Por ejemplo, cuando se desea la expresión de un gen indicador (por ejemplo, la proteína fluorescente verde, GFP) en tallo de maíz y en tejido de mazorca inmadura, se incluye un sitio miR156 diana en un casete de expresión de GFP y se expresa en una planta de maíz transgénico de forma estable bajo el control del promotor CaMV 35S. En tejidos (por ejemplo, raíces, hojas, y estambres) donde miR156 se expresa fuertemente, la expresión de GFP está suprimida. La supresión del fenotipo puede limitarse a tipos de células muy específicos en los tejidos suprimidos, mostrando las células adyacentes la expresión o un gradiente de expresión de GFP adyacente a aquellas células que expresan el miR156 maduro.

Otro procedimiento no limitante para determinar un patrón de expresión del miARN maduro es analizar los perfiles de transcripción de las secuencias de ácido nucleico que incluyen la secuencia del miARN maduro, por ejemplo, siguiendo un procedimiento general que incluye las etapas de:

45 (a) proporcionar una secuencia de miR inicial que incluye la región del tallo-bucle, por ejemplo, a partir de las secuencias de miR públicamente disponibles en la base de datos "miRBase" (disponible en línea en microrna.sanger.ac.uk/sequences);

(b)

aplicar algoritmos de análisis de la secuencia, tales como BLAST que es bien conocido en la técnica (véase Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol., 215:403-410) para identificar secuencias homólogas o idénticas (por ejemplo, a partir de secuencias patentadas en micromatrices tipo probesets preparadas con ADN de genoma completo); y

(c)

analizar los perfiles de transcripción de las secuencias probesets homólogas identificadas en la etapa (b) e identificar los miARN que tienen un patrón de expresión en los tejidos deseados (es decir, tejidos reproductivos masculinos o femeninos).

Preferentemente, se añade una cuarta etapa:

55 (d) para las secuencias probesets homólogas para las que se encuentran los perfiles de transcripción deseados, confirmando la identificación del gen de miARN ya sea mediante alineación de la secuencia de tallo-bucle de la secuencia miR inicial con la secuencia probeset, o bien para miARN potencialmente novedosos, determinar que se prevé que la secuencia se pliegue en una estructura de tallo-bucle característica de un miARN. También preferentemente, se usa una etapa opcional, en el que se incluyen una o más comparaciones BLAST frente a conjuntos de datos de secuencias adicionales diferentes del conjunto de datos de la secuencia probeset (antes de la etapa (b) anterior), permitiendo la identificación adicional de sondas que no se encuentran comprendidas en la región replegada prevista del gen miR; falsos positivos, por ejemplo, debido a los emparejamientos en los conjuntos de datos de secuencias adicionales que incluyen cóntigos cortados y empalmados incorrectamente, que se identifiquen por su ausencia de características de miARN tales como una estructura replegada adecuada, y se eliminen.

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La Figura 5 representa gráficamente los perfiles de transcripción de las secuencias probeset que se identificaron, utilizando el procedimiento descrito en los párrafos anteriores, que incluye secuencias de miARN precursor que tienen patrones de expresión específicos de tejido reproductor masculino de maíz (polen). Dichos miARN precursores son adecuados para su uso en construcciones de ADN recombinante de la presente invención diseñada para la expresión de un miARN natural (en este ejemplo, un miARN específico de polen) en condiciones no naturales (por ejemplo, bajo el control de un promotor diferente del promotor natural del miARN precursor). Estos miARN precursores son también útiles para proporcionar una secuencia "estructural" que puede modificarse o diseñarse mediante ingeniería genética para suprimir un gen diana diferente del gen diana natural o endógeno. Un ejemplo no limitante de una construcción de ADN recombinante de la presente invención incluye un promotor constitutivo fuerte que se usa para impulsar la expresión de la unidad de transcripción del transgén que codifica una proteína o fragmento de proteína insecticida de Bacillus thuringiensis ("Bt") y un sitio de reconocimiento para un miARN específico de polen, dando como resultado una expresión de Bt fuerte en tejidos de la planta excepto para el polen. Adicionalmente, los promotores naturales de estos precursores de miARN son útiles para la expresión específica de polen de cualquier gen de interés

En una estrategia alternativa, se identificó un sitio de reconocimiento de miARN existente (natural o endógeno), por ejemplo, usando las reglas de complementariedad de secuencia, descritas en Zhang (2005) Nucleic Acids Res., 33:W701-704 y por Rhoades y col. (2002) Cell, 110:513-520. El sitio de reconocimiento del miARN natural se muta (por ejemplo, mediante mutagénesis química) lo suficiente para reducir o evitar la escisión (véase Mallory y col. (2004) Curr. Biol., 14:1035-1046). De este modo, un gen que contiene un sitio de reconocimiento de un miARN natural y que tiene efectos deseables, por ejemplo, un tamaño aumentado de la hoja o la semilla, puede mutarse y de esta manera expresarse a niveles mayores que si estuviera presente el sitio de reconocimiento del miARN natural no mutado o endógeno. Una realización es sustituir un gen natural con un homólogo diseñado mediante ingeniería genética, en el que un miARN natural se ha mutado o incluso eliminado, que es menos susceptible a la escisión por un miARN dado.

Otro ejemplo específico de esta estrategia es la inclusión de uno o más sitios de reconocimiento de un miARN maduro no sustancialmente expresado en raíces de maíz pero expresado en la mayoría de otros tejidos (tales como, aunque no de forma limitativa, miRNA162, miRNA164, o miARN390 como se representa gráficamente en la Figura4) en una construcción de ADN recombinante para la expresión de la proteína o fragmento de proteína insecticida de Bacillus thuringiensis ("Bt", véanse, por ejemplo, las secuencias insecticidas de B. thuringiensis y los procedimientos de uso de las mismas desvelados en la patente de Estados Unidos con número 6.953.835 y en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos número 60/713.111, presentadas el 31 de agosto de 2005, que se incorporan por referencia en el presente documento) como el transgén, por ejemplo, en una construcción que incluye el casete de expresión e35S/Bt/hsp17. Al incluir uno o más de estos sitios de reconocimiento en el casete de expresión se reduce la expresión de los transcritos en la mayoría de tejidos diferentes de la raíz, pero mantiene niveles de expresión del ARN diana de Bt elevados en raíces, tal como es deseable para controlar plagas tales como el gusano de la raíz del maíz. En realizaciones similares, se incluyen combinaciones de diferentes sitios de reconocimiento del miARN en la construcción para conseguir el patrón de expresión deseado en uno o más tejidos específicos.

Ejemplo 5

Este ejemplo describe realizaciones no limitantes de micro ARN de plantas de cultivo y sus estructuras precursoras (replegadas), útiles en la preparación de construcciones de ADN recombinante de la presente invención. Se obtuvo un total de 1327933 ARN pequeños únicos (20 a 24 nucleótidos de longitud) mediante secuenciación de alto rendimiento de 30 bibliotecas de maíz (maíz) (Margulies y col. (2005) Nature, 437:376-380). Las secuencias obtenidas se utilizaron para predecir los microARN de maíz y sus estructuras precursoras procedentes de secuencias genómicas de maíz utilizando los procedimientos descritos anteriormente en el Ejemplo 1. En total, 1192 ARN pequeños en 1576 secuencias genómicas de maíz patentadas se predijeron como nuevos miARN. Los miARN de maíz y sus correspondientes miARN precursores, así como la posición de los nucleótidos del miARN maduro en cada secuencia precursora de miARN, se denominan por sus números de identificación de secuencia respectivos en la Tabla 4 como sigue: miARN de maíz (SEQ ID NOS. 2730 -3921) y secuencias precursoras de miARN de maíz (SEQ ID NOS. 3922 -5497).

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Este ejemplo describe realizaciones no limitantes de micro ARN de plantas de cultivo y sus estructuras precursoras (replegadas), útiles en la preparación de construcciones de ADN recombinante de la presente invención.

Se prepararon bibliotecas de ARN pequeño de maíz (maíz, Zea mays) o de soja (Glycine max) que crece bajo estrés

5 hídrico y condiciones de control (Tabla 5). Se evaluaron las etapas de sequía para la soja utilizando un sistema de puntuación relativa de 1,0 (sin efecto o control) a 4,0: en la Figura 6 se ilustran los ejemplos de las plantas de soja en cada etapa. Las secuencias de ARN pequeño obtenidas de esta manera se utilizaron para predecir novedosos microARN adicionales y sus estructuras precursoras (replegadas) a partir de secuencias genómicas de maíz o soja, respectivamente, utilizando los procedimientos descritos anteriormente en el Ejemplo 1. A partir del maíz, se

10 predijeron 1186 miARN de maíz en 1725 secuencias genómicas de maíz, y a partir de soja, se predijeron 134 miARN de soja en 181 secuencias genómicas de soja (Tabla 6). Estos miARN y sus correspondientes secuencias precursoras de miARN, así como la posición de los nucleótidos del miARN maduro en cada secuencia precursora de miARN, se denominan por sus números de identificación de secuencia respectivos en la Tabla 6 como sigue: miARN de maíz (SEQ ID NOS. 5498 -6683), secuencias de miARN precursor de maíz (SEQ ID NOS. 6684 -8408), miARN

15 de soja (SEQ ID NOS. 8409 -8560), y secuencias de miARN precursor de soja (SEQ ID NOS. 8561 -8417).

Tabla 5

Número de biblioteca

Planta de cultivo Tejido Estadío de desarrollo Tratamiento

42

maíz (Zea mays) hoja joven de tejido sumidero V8 control

43

maíz (Zea mays) hoja joven de tejido sumidero V8 sequía leve

44

maíz (Zea mays) hoja joven de tejido sumidero V8 control

45

maíz (Zea mays) hoja joven de tejido sumidero V8 sequía intensa

46

maíz (Zea mays) raíz V8 control

47

maíz (Zea mays) raíz V8 sequía leve

48

maíz (Zea mays) raíz V8 control

38

soja (Glycine max) hoja de plántula plántula control

39

soja (Glycine max) hoja de plántula combinada plántula sequía, etapa 3.0 y 3.5 combinada*

40

soja (Glycine max), raíz maduro control

41

soja (Glycine max) raíz madura combinada maduro sequía, todas las etapas 1.5 y 3.5 combinadas*

* Para las bibliotecas 39 y 41 preparadas a partir de soja, las muestras de las etapas indicadas se combinaron; Se evaluaron las etapas de sequía para la soja utilizando un sistema de puntuación relativo como sigue: 1.0 = sin efecto 1.5 = meristemo o un trifolio marchito 2.0 = dos trifolios marchitos 2.5 = todos los trifolios marchitos 3.0 = trifolio inferior completamente seco y quebradizo. 3.5 = todos los trifolios, pero el superior completamente seco y quebradizo, el trifolio superior todavía blando 4,0 = todo completamente seco y quebradizo

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El microARN y sus precursores y promotores, especialmente los que tienen un patrón de expresión diferencial entre condiciones de agua suficiente y agua insuficiente (sequía o estrés hídrico), son útiles en los rasgos deseables diseñados mediante ingeniería genética (por ejemplo rendimiento aumentado, germinación mejorada) en cultivos que pueden experimentar estrés hídrico. Se encontró una utilidad similar en otros miARN (y sus precursores o promotores) que tienen patrones de expresión específicos para otras condiciones de estrés abiótico o biótico por ejemplo, miARN que tiene un patrón de expresión diferencial entre condiciones de nutrientes suficientes y nutrientes insuficientes, o entre condiciones estresadas térmicamente y no estresadas térmicamente. Los procedimientos adecuados incluyen la introducción de un sitio de reconocimiento de un miARN exógeno en una secuencia, la deleción o modificación de un sitio de reconocimiento de un miARN endógeno a partir de una secuencia, el diseño mediante ingeniería genética de una secuencia de un miARN natural o un miARN precursor a fin de reconocer una secuencia diferente de la secuencia diana endógena, y el uso de un miARN promotor para proporcionar un patrón de expresión concreto.

Ejemplo 6

Este ejemplo describe la identificación de un miARN de plantas de cultivo (miRMON18) que tiene un patrón de expresión específico caracterizado por una fuerte expresión en condiciones de nitrógeno suficientes y de supresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno, o una fuerte expresión en condiciones de fosfato suficientes y de supresión en condiciones de deficiencia de fosfato.

Los ARN pequeños se clonaron y se identificaron los presuntos miARN a partir de una variedad de tejidos y estadios de desarrollo en arroz (Oryza sativa cv. Nipponbare), maíz ( Zea mays var. LH244), y soja (Glycine max var. A3525), según las técnicas anteriormente descritas en los Ejemplos 1 y 5. Las abundancias del ARN pequeño se normalizaron entre las bibliotecas y se calcularon como transcritos por cuarto de millón de secuencias (tpq). Un miARN maduro presunto (ARN pequeño número 370903, al que se asignó el nombre común "miRMON18") con la secuencia UUAGAUGACCAUCAGCAAACA se identificó en bibliotecas de ARN pequeño de arroz (SEQ ID NO. 393), maíz (SEQ ID NO. 3227), y soja (SEQ ID NO. 8742). Esta secuencia no se emparejó con ningún miARN conocido en miRBase.

Se identificó una secuencia precursora de miRMON18 a partir del genoma del arroz como CCAUGAACCUGUUUUGUUGCUGGUCAUCUAGCUACCCGUGCAUGCCUGGAGAUU GGAGAAUAAUUGACGAUGCAGCAGUCGGCUUAUUGGCUCUUGGGCACGCGUGGU UAGAUGACCAUCAGCAAACAAGUUCGUGAG, (SEQ ID NO. 1763, Figura 7B). Se identificó otra presunta secuencia precursora de miRMON18 a partir de los datos genómicos disponibles del maíz como CUCCGAACCUGUUUUGUUGGUGGUCAUUUAACCAUGCAUGCUUCGAUCGAUGGA UUGGUGCAUGCAUGGAUUAUUGCAUAGUGUGAUGCAUGUGGCGCAUCAGUGCAU GGUUAGAUGACCAUCAGCAAACAUGUUCUUGAG (SEQ ID NO. 3936, Figura 7A). La posición del miRMON18 maduro se ha representado anteriormente en texto subrayado en estas secuencias del precursor (SEQ ID NO. 1763 y la SEQ ID NO. 3936). Se predijo que cada miRMON18 precursor formaba una estructura replegada (Figura 7A y 7B), con el miARN maduro (miRMON18) situado en el brazo 3’ de la estructura replegada, con el miARN* previsto ("miRMON18*") situado en el brazo 5’; esto era consistente con la abundancia mucho mayor del miRMON18 maduro con respecto a la del miRMON18* observada en el locus simple MRT4577_378723C.3 del maíz. Una estructura replegada que tiene la secuencia UGCAACCCUUGAAUGUGUUUGUUGAUUGAUAUCUACACAUGUUGAUCAUCCUUGUGUUGAUCGAUUGGUUU AGAUGACCAUCAACAAACUCUUUCGUGGUUUUGCA (SEQ ID NO. 8743, Figura 7C) se identificó en Arabidopsis thaliana como el precursor de un miARN maduro relacionado con la secuencia UUAGAUGACCAUCAACAAACU (miR827, SEQ ID NO. 8744). El miR827 maduro se observó solamente en baja abundancia en Arabidopsis thaliana. La alineación de dos miARN maduros muestra que el miR827 difiere de miRMON18 en dos nucleótidos (Figura 7D). Esta diferencia en dos nucleótidos entre miRMON18 y miR827 parece estar conservada entre monocotiledóneas y dicotiledóneas, donde miRMON18 se ha identificado en maíz (Zea mays), arroz (Oryza sativa), y caña de azúcar (Saccharum officinarum, no se muestran los datos) y miR827 se ha identificado en dicotiledóneas (Arabidopsis thaliana).

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Las transferencias Northern comprobaron la expresión del miRMON18 de 21-mer en muestras de tejido de al menos el arroz (grano y semilla) y maíz (almendra, hoja, y raíz) procedentes de plantas en condiciones normales de crecimiento (sin estrés), como se representa gráficamente en la Figura 8A. Los microARN precursores originados como transcritos poliadenilados generados por la ARN polimerasa II y un perfil de transcripción convencional del miRMON18 precursor del maíz (SEQ ID NO. 3936, correspondiente al probeset A1ZM068928_at) confirmaron adicionalmente una expresión elevada en endospermo, callo, y plántulas de maíz Figura 8B), donde la expresión en otros tejidos de esta muestra está por debajo del umbral de detección de 500 unidades.

La expresión del miRMON18 precursor del maíz (SEQ ID NO. 3936) se analizó en tejidos de maíz procedentes de plantas crecidas en condiciones deficientes en agua (sequía) (Figura 9A), condiciones frías (Figura 9B), y condiciones deficientes en nitrógeno (Figura 9C), La expresión del miRMON18 precursor se vio poco afectada, relativamente, por las condiciones del agua en la raíz, brote, mazorca, almendra, y estambre, donde la expresión en hojas y tallo aumentó en condiciones de deficiencia de agua con respecto a las condiciones de agua suficiente (Figure 9A); la expresión también se vio poco afectada, relativamente, por la temperatura (Figura 9B). Sin embargo, la expresión de miRMON18 fue muy sensible a las condiciones del nitrógeno, observándose una supresión de aproximadamente 2 veces en limitación de nitrógeno (nitrato de amonio 2 milimolar), con respecto a la expresión observada con suficiente nitrógeno (nitrato de amonio 20 milimolar) (Figura 9C). Este patrón de expresión sensible al nitrógeno se comprobó mediante cuantificación de imagen de fósforo en las transferencias Northern de muestras de ARN pequeño, que mostraron una supresión promedio de 9,6 veces en el miRMON18 maduro de 21-mer en 3 puntos temporales (Figura 10A

En otro experimento, se hizo crecer el maíz en un sistema hidropónico con fosfato suficiente hasta el estadio V3, a continuación, se privó de fosfato durante un máximo de 3 días. Se tomaron muestras de tejido foliar a 1 y 3 días después de haber comenzado la privación de fosfato. A los 3 días, las plantas volvieron a la suficiencia de nitrógeno, y se recuperaron las muestras tomadas a los 30 minutos y 6 horas. Se tomaron muestras de control para cada punto temporal de plantas crecidas de forma continua bajo suficiencia de fosfato. La Figura 10B representa gráficamente los resultados de las transferencias Northern analizadas con una sonda de miRMON18 y demuestran que, en este experimento, el miARN miRMON18 maduro mostró en el tejido foliar una expresión intensa en condiciones de suficiente fosfato, y una supresión en condiciones de deficiencia de fosfato.

Ejemplo 7

Este ejemplo describe la identificación de genes que tienen sitios de reconocimiento de miARN (sitios de reconocimiento de miRMON18) regulados de forma natural mediante un miARN de plantas de cultivo (miRMON18 ) que tiene un patrón de expresión caracterizado por una fuerte expresión en condiciones de nitrógeno suficientes y de supresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno, o una fuerte expresión en condiciones de fosfato suficientes y de supresión en condiciones de deficiencia de fosfato.

Las dianas presuntas del miRMON18 maduro (UUAGAUGACCAUCAGCAAACA, SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742) se identificaron y se incluyó un clado de genes en la familia del dominio ("SYG1/Pho81/XPR1"). Se asignó al dominio SPX el identificador de familia/dominio de proteínas Pfam PF03105, y se trata de un dominio hidrófobo descubierto en el extremo N de varias proteínas, que incluye, de forma típica, un tramo de aproximadamente 180 restos con tres subdominios más pequeños de 35-47 aminoácidos; véanse, por ejemplo, la entrada SPX de la base de datos Pfam actualmente conservada en el Janelia Farms Research Campus del Howard Hughes Medical Institute, disponibles para el público en pfam.janelia.org/family?acc=PF03105.

La mayoría de las proteínas en la familia del dominio SPX incluye otros dominios conservados en su extremo C. Por ejemplo, varias proteínas de la familia del dominio SPX incluyen también, en su extremo C, un dominio EXS ("ERD1, XPR1, y SYG1"), Pfam PF03124, que está posiblemente implicado en la clasificación de proteínas; véanse, por ejemplo, pfam.janelia.org/family?acc=PF03124. Otras proteínas SPX incluyen un dominio conservado VTC (chaperona del transportador vacuolar 2), Pfam PF09359; véanse, por ejemplo, pfam.janelia.org/family?acc=PF09359. Varias proteínas SPX incluyen un dominio conservado MFS_1 o MFS ("superfamilia del facilitador mayor"), Pfam PF07690, que está implicado en el transporte de pequeños solutos tales como azúcares pequeños y sales inorgánicas en respuesta a gradientes iónicos quimiosmóticos; véase Las proteínas SPX incluyen las codificadas por los genes PHO, que están implicadas en la carga de fosfato inorgánico en el xilema de las raíces; véanse, por ejemplo, Wang y col. (2004) Plant Physiol., 135:400-411, que han descrito la identificación de varios homólogos de PHO1, la conservación del dominio SPX en estas proteínas, y la expresión predominante del promotor de PHO1 en los tejidos vasculares de raíces, hojas, tallos, o flores, así como en algunos tejidos no vasculares. Las proteínas de la familia del dominio SPX están posiblemente implicadas en la transducción de la señal asociada a la proteína G (y, por tanto, son posiblemente sensores de fosfato inorgánico); véase Ticconi y Abel (2004) Trends Plant Sci., 9:548-555. Los genes PHO1 incluyen tanto el dominio SPX como un dominio EXS. Los miembros del clado PHO también incluyen un dominio RING (At1g02860 y At2g38920), o un dominio MFS (At4g22990, At4g11810, y At1g63010); véase Wang y col. (2004) Plant Physiol., 135:400-411, especialmente la Figura 3 y la Figura 6d.

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Recientemente, se ha notificado que un gen denominado NLA es necesario para la adaptación a una baja disponibilidad de nitrógeno en Arabidopsis thaliana; véase Peng y col., (2007) Plant Cell, 50:320-337. NLA ("AtNLA", locus At1g02860), que tiene asignado el número de registro UniProtKB/Swiss-Prot Q2V4F9, tiene la secuencia de MRT3702_101115C, SEQ ID NO. 8745; la anotación de la proteína NLA está disponible para el público en beta.uniprot.org/uniprot/Q2V4F9 and at pfam.janelia.org/protein?id=Q94C80_ARATH. El gen NLA de Arabidopsis que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8745 contiene un dominio SPX, un dominio MFS_1, y un dominio RING, e incluye la secuencia de un sitio de reconocimiento de miR827 (diana) TGTTTGTTGATGGTCATCTAA (SEQ ID NO. 8746) situado en las posiciones de los nucleótidos de 135 a 155, que se validó como diana para miR827 de Arabidopsis. El NLA codifica una ubiquitina ligasa dedo de cinc RING de tipo C3HC4 (AT1G02860.1, SEQ ID NO. 8747); la mutación de este gen perturba la adaptabilidad de Arabidopsis a la limitación de nitrógeno.

Se secuenciaron diez clones adicionales del gen AtNLA. Los clones 1, 4, y 5 contenían una secuencia parcial AtNLA (SEQ ID NO. 8748). El clon 2 contenía una secuencia AtNLA que carece del dominio SPX (SEQ ID NO. 8749). El clon 3 contenía una secuencia AtNLA que carece del dominio RING (SEQ ID NO. 8750). El clon 6 contenía un fragmento genómico AtNLA (SEQ ID NO. 8751) con un sitio de reconocimiento de miR827 perturbado (secuencia diana) situado en las posiciones de nucleótidos 2142 -2162. El clon 7 contenía otra secuencia AtNLA (At1g63010, SEQ ID NO. 8752). El clon 8 contenía otro fragmento genómico AtNLA (At1g63010, SEQ ID NO. 8753) con un sitio de reconocimiento de miR827 perturbado (secuencia diana) situado en las posiciones de nucleótidos 2142 -2162. El clon 9 contenía otra secuencia AtNLA (At1g63010, SEQ ID NO. 8754) que carece del dominio SPX. El clon 10 contenía una secuencia AtNLA (At1g63010, SEQ ID NO. 8755) que carece del dominio MFS.

Se ensamblaron numerosos ADNc "virtuales" a partir de las secuencias genómicas y de ADNc del maíz, que describen genes independientes dianas de miRMON18. La primera de estas novedosas dianas de miRMON18 ("SPX_MFS_117961287", derivada de BAC en GI:117961287) tenía la secuencia de la SEQ ID NO. 8756 e incluía un codón de inicio ATG en las posiciones de nucleótidos 326 -328 y un codón de detención TGA en las posiciones de nucleótidos 2414 -2416; el marco de lectura abierto más largo (marco de traducción = 2) codificado por SEQ ID NO. 8756 tenía la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 8757. Una versión de corte y empalme alternativo de esta primera novedosa diana génica de miRMON18 es la SEQ ID NO. 8758 SEQ ID NO. 8758 tenía la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 8759.

La segunda de estas dianas novedosas de miRMON18 tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8760 ("SPX_MFS2", derivada de BAC en GI:118200525) e incluyó un codón de inicio ATG en las posiciones de nucleótidos 201 -203 y un codón de terminación TGA en las posiciones de nucleótidos 2295-2297; el marco de lectura abierto más largo (marco de traducción = 3) codificado por SEQ ID NO. 8760 tenía la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 8761. Una versión de corte y empalme alternativo de esta segunda novedosa diana génica de miRMON18 es la SEQ ID NO. 8762 ("SPX_MFS_117961287_2"), que incluye un codón de inicio ATG en las posiciones de nucleótidos 145 -147 y un codón de terminación TGA en las posiciones de nucleótidos 1189 -1191; el marco de lectura abierto más largo (marco de traducción = 1) codificado por SEQ ID NO. 8762 tenía la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 8763.

Una tercera diana de miRMON18 novedosa incluyó secuencias de ADNc reunidas procedentes de datos EST y que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8764 (derivada de BAC en GI: 126116193) e incluyó dos posibles codones de inicio ATG en las posiciones de nucleótidos 217 -219 y 1034 -1036 y un codón de terminación TGA en las posiciones de nucleótidos 2093 -2095. Se predijeron dos proteínas para los dos posibles marcos de lectura abiertos por homología; la primera proteína (prevista con un desplazamiento de marco de 1) contenía 625 aminoácidos y tenía la secuencia de la SEQ ID NO. 8765, y la segunda proteína contenía 353 aminoácidos y tenía la secuencia de la SEQ ID NO. 8766.

Los péptidos codificados por estos novedosos genes diana de miRMON18 del maíz se alinearon usando ClustalW (versión 1.82); la alineación resultante de los múltiples alineamientos de secuencia se representa gráficamente en la Figura 11, y muestra el dominio SPX del maíz (indicado por la secuencia subrayada), cuando está presente) y el El trabajo de clonación adicional derivado de BAC115312385 confirmó la secuencia de la primera diana de miRMON18 ("SPX_MFS_117961287", SEQ ID NO. 8756) y proporcionó la secuencia genómica SPX_MFS2 SEQ ID NO. 8767 en la que se identificó adicionalmente una secuencia líder (indicada por el texto en cursiva), intrones en 5’ (indicados por el texto subrayado), exones (indicados por el texto en mayúsculas), y el sitio de reconocimiento de miRMON18 (situado en los nucleótidos 2628 -2648 de la SEQ ID NO. 8767 en indicados por el texto en mayúsculas y negrita):

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Se realizó una búsqueda en las bases de datos de transcritos TIGR para el dominio SPX:MFS que codifica las secuencias de los genes SPX. La identificación de dichos genes respalda la existencia de una ruta de regulación conservada en las plantas superiores. Se descubrieron presuntos sitios diana de miRMON18 mediante la búsqueda de una secuencia conservada complementaria de miRMON18 en la región 5’ no traducida del codón de inicio. Se identificó una presunta diana de miRMON18 (TGA40434_29760) en uvas (Vitis vinifera) con la secuencia de la SEQ ID NO. 8768, con el sitio de reconocimiento de miRMON18 situado en los nucleótidos 323 -343 de la SEQ ID NO. 8768. De manera similar, se identificó una diana de miRMON18 (TA5852_4236) en lechugas (Lactuca sativa) con la secuencia, SEQ ID NO. 8769, con el sitio de reconocimiento de miRMON18 situado en los nucleótidos 64 -84 de la SEQ ID NO. 8769.

Los genes ortólogos que contienen el dominio SPX que incluyen genes análogos a NLA se identificaron e diversas especies entre las que se incluyen maíz, arroz, y soja. Donde la secuencia está disponible, se identificaron las secuencias diana presuntas de miRMON18 o miR827 (sitios de reconocimiento) en la 5’UTR. La Figura 12 representa gráficamente el árbol filogenético construido para identificar los genes SPX identificados usando las secuencias de aminoácidos alineadas mediante ClustalW, donde los valores de arranque se determinaron usando 10000 iteraciones; los genes que contienen un sitio de reconocimiento de miRMON18 previsto (en genes de especies diferentes de Arabidopsis thaliana) o un sitio de reconocimiento de miR827 previsto (en genes de Arabidopsis thaliana) que se ha validado experimentalmente se indican en texto en negrita. Además del AtNLA del gen NLA de Arabidopsis thaliana que contiene los dominios SPX y RING (MRT3702_101115C, At1g02860, SEQ ID NO. 8770, que incluye un sitio de reconocimiento de miR827 en los nucleótidos 135 -155, y que codifica la proteína con la secuencia de la SEQ ID NO. 8771), los genes incluidos en el árbol filogenético son el gen análogo a NLA del maíz ZmNLA (SEQ ID NO. 8772, que codifica la proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8773), el gen análogo a NLA de la soja GmNLA (SEQ ID NO. 8774, que codifica la proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8775), el gen análogo a NLA del arroz OsNLA (SEQ ID NO. 8776, que codifica la proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8777); las secuencias de Arabidopsis At1g63010 (SEQ ID NO. 8778, que incluye un sitio de reconocimiento de miR827 en los nucleótidos 153 -173, y que codifica la proteína con la secuencia de la SEQ ID NO. 8779), AT2g26660 (SEQ ID NO. 8780, que codifica la proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8781), y AT5g20150 (SEQ ID NO. 8782SEQ ID NO. 8783); las secuencias de arroz Os02g45520 (SEQ ID NO. 8784, que incluye un sitio de reconocimiento de miRMON18 en los nucleótidos 395 -415, y que codifica la proteína con la secuencia de la SEQ ID NO. 8785) y Os04g48390 (SEQ ID NO. 8786, que incluye un sitio de reconocimiento de miRMON18 en los nucleótidos 334 -354, y que codifica la proteína con la secuencia de la SEQ ID NO. 8787); y las secuencias de maíz MRT4577_36529C (SEQ ID NO. 8788, que incluye un sitio de reconocimiento de miRMON18 en los nucleótidos 1660 -1680, y que codifica la proteína con la secuencia de la SEQ ID NO. 8789), MRT4577_51705C (SEQ ID NO. 8790, que codifica la proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8791), MRT4577_375264C (SEQ ID NO. 8792, que codifica la proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8793), MRT4577_46983C (SEQ ID NO. 8794, que codifica la proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8795), MRT4577_340665C (SEQ ID NO. 8796, que codifica la proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8797), y MRT4577_319995C (SEQ ID NO. 8798, que codifica la proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8799).

Varias kilobases de secuencia estaban disponibles en dirección 3' de la secuencia de codificación análogas a NLA del maíz y arroz, en las cuales no se identificó un sitio diana de miRMON18 en un trabajo de secuenciación preliminar. Basándose en los datos de perfil de expresión, parece que el nivel de ARN de ZmNLA (SEQ ID NO. 8772) no responde a la disponibilidad de nitrógeno. Por el contrario, el clado del dominio SPX-MFS (SEQ ID NO.

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8788, SEQ ID NO. 8786, SEQ ID NO. 8784, y la SEQ ID NO. 8778) mostrados en la Figura 12 está suprimido en condiciones de nitrógeno suficientes en maíz y en Arabidopsis y se predice que está regulado por miRMON18; las secuencias de este clado contienen un sitio de reconocimiento de miRMON18 (o miR827) validado experimentalmente. El clado SPX mostrado en la parte superior del árbol (SEQ ID NO. 8798, SEQ ID NO. 8796, SEQ ID. NO. 8794, SEQ ID NO. 8782, SEQ ID NO. 8780, SEQ ID NO. 8792, y la SEQ ID NO. 8790)(Figura 12) contiene solamente un dominio SPX identificable, está suprimido por una limitación de nitrógeno, y también se prevé que esté regulado por miRMON18. En el maíz, los datos TxP que corresponden a los genes del clado 1 (SEQ ID NO. 8798, SEQ ID NO. 8796, SEQ ID NO. 8794, SEQ ID NO. 8792, y la SEQ ID NO. 8780) se correlacionaron con la expresión del miRMON18 precursor; la expresión tanto del miRMON18 precursor como de los genes del clado 1 estuvo regulada en exceso en condiciones de nitrógeno suficientes. Los genes del clado 2 de SPX-MFS (SEQ ID NO. 8788, SEQ ID NO. 8786, SEQ ID NO. 8784, y la SEQ ID NO. 8778) quedaron suprimidos directamente por miRMON18, mientras que los genes del clado 1 carecen de diana directa, lo que sugiere que miRMON18 puede regular indirectamente la expresión de los genes del clado 1 mediante la supresión de los genes del clado 2.

Ejemplo 8

Este ejemplo describe la identificación de un miARN de plantas de cultivo (miRMON18) que tiene un patrón de expresión caracterizado por una fuerte expresión en condiciones de nitrógeno suficientes y de supresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno, o una fuerte expresión en condiciones de fosfato suficientes y de supresión en condiciones de deficiencia de fosfato.

La caracterización adicional del gen miRMON18 del maíz implicó el emparejamiento BLAST de un miRMON18 precursor (SEQ ID NO. 3936) con bibliotecas de ADNc y elementos de micromatriz, y la clonación mediante PCR inversa de una secuencia genómica de miRMON18 (SEQ ID NO. 8800) del maíz (Zea mays var. LH244) usando los cebadores de PCR inversa basados en una secuencias de ADNc (SEQ ID NO. 8801) del clon LIB5025-018-A1-XP1-B6. Esta secuencia genómica de miRMON18 (SEQ ID NO. 8800) tiene la secuencia anotada representa gráficamente en la Figura 13, donde el transcrito de miRMON18 se proporciona en mayúsculas en los nucleótidos 2173 -2788 de la SEQ ID NO. 8800. Esta secuencia genómica también incluyó un elemento promotor de miRMON18 en minúsculas en los nucleótidos 211 -2172 de la SEQ ID NO. 8800SEQ ID NO. 8800, una secuencia TATA convencional (que finaliza en los 25 nucleótidos en dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción) en minúscula subrayada en los nucleótidos 2144 2147 de la SEQ ID NO. 8800, el miRMON18 maduro como texto en mayúscula subrayado en los nucleótidos en los nucleótidos 2419 -2439 de la SEQ ID NO. 8800, y el miRMON18* como texto en mayúscula subrayado en los nucleótidos 2322 -2341 de la SEQ ID NO. 8800.

Para comprobar el patrón de expresión del promotor de miRMON18, dos construcciones de ADN recombinante (SEQ ID NO. 8802 y SEQ ID NO. 8803) se construyeron en un vector binario que incluyó 1 promotor de actina del arroz que impulsa la neomicina fosfotransferasa II (nptII) como marcador seleccionable. La construcción (SEQ ID NO. 8802) en el plásmido pMON111971 incluyó un promotor de miRMON18 (SEQ ID NO. 8804) y una secuencia líder de miRMON18 (SEQ ID NO. 8805) que impulsa la expresión de un gen GUS (SEQ ID NO. 8806) seguido por una secuencia de terminación NOS (SEQ ID NO. 8807). La construcción (SEQ ID NO. 8803) en el plásmido pMON111967 contenía un intrón DnaK (SEQ ID NO. 8808) y también incluyó un promotor de miRMON18 (SEQ ID NO. 8804), una secuencia líder de miRMON18 (SEQ ID NO. 8805), un gen GUS (SEQ ID NO. 8806) seguido por una secuencia de terminación NOS (SEQ ID NO. 8807). Los vectores se transformaron en maíz usando transformación mediada por Agrobacterium y selección con antibióticos usando técnicas convencionales, como las que se describen en el encabezado "Preparación y Utilización de células de plantas transgénicas no naturales y plantas transgénicas no naturales". Se observó una fuerte expresión de GUS impulsada por el promotor de miRMON18 en las hojas de maíz transformada en condiciones de nitrógeno suficientes y de fosfato suficientes. La expresión de GUS se suprimió en las hojas de maíz transformadas en condiciones de deficiencia de nitrógeno o de deficiencia de fosfato.

Una secuencia alternativa del promotor de miRMON18 de utilidad para impulsar la expresión de un transgén con el patrón de expresión del gen miRMON18 natural (es decir, fuete expresión en condiciones de nitrógeno suficientes y supresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno, o fuerte expresión en condiciones de fosfato suficientes y de supresión en condiciones de deficiencia de fosfato) incluye el promotor que tiene la secuencia de nucleótidos 211 2172 de la SEQ ID NO. 8800; un fragmento de al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, o al menos 500 nucleótidos contiguos que tienen al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% de identidad con los nucleótidos 211 -2172 de SEQ ID NO. 8800, en la que el fragmento tiene actividad del promotor en al menos un tejido vegetal que se caracteriza por una fuerte expresión en condiciones de nitrógeno suficiente y supresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno, o la fuerte expresión en condiciones de fosfato suficiente y supresión en condiciones de deficiencia de fosfato; y un fragmento de al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, o al menos 500 nucleótidos contiguos que tienen al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos 98% de identidad con la SEQ ID NO. 8804, en la que el fragmento tiene actividad del promotor en al menos un tejido vegetal que se caracteriza por una fuerte expresión en condiciones de nitrógeno suficiente y supresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno, o la fuerte expresión en condiciones de fosfato suficiente y supresión en condiciones de deficiencia de fosfato. La identificación de las secuencias de promotor alternativas se confirmó por técnicas rutinarias, tales como la comprobación de una secuencia TATA dentro de la secuencia del promotor y la validación de la actividad del promotor en al menos un tejido vegetal (por ejemplo, analizando una construcción de ADN recombinante que incluye el promotor que impulsa la expresión de un gen indicador tal como GUS o luciferasa tanto en experimentos de expresión transitoria como en plantas transformadas de manera estable).

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Ejemplo 9

Este ejemplo describe la identificación de sitios de reconocimiento de un miARN de plantas de cultivo (miRMON18) que tiene un patrón de expresión caracterizado por una fuerte expresión en condiciones de nitrógeno suficientes y de supresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno, o una fuerte expresión en condiciones de fosfato suficientes y de supresión en condiciones de deficiencia de fosfato. También se desvelan procedimientos para usar el miARN, el promotor de miARN, y un sitio de reconocimiento de miARN. Los ejemplos no limitantes incluyen un procedimiento para proporcionar una planta de cultivo transgénica no natural que tiene un rendimiento mejorado en condiciones de deficiencia de nitrógeno o fosfato, mediante la expresión en la planta de cultivo transgénica de una construcción de ADN recombinante que incluye un transgén insensible a miRMON18, y un procedimiento para proporcionar una planta de cultivo transgénica no natural que tiene un rendimiento mejorado en condiciones de deficiencia de nitrógeno o fosfato, mediante la expresión, en la planta de cultivo transgénica, de una construcción de ADN recombinante que incluye un sitio de reconocimiento de miRMON18 que se ha añadido a la secuencia de un gen que normalmente es insensible a miRMON18.

La predicción de un sitio de reconocimiento se logra usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como reglas de complementariedad de secuencia, tal como se describen por Zhang (2005) Nucleic Acids Res., 33:W701704 y por Rhoades y col. (2002) Cell, 110:513-520. Un procedimiento no limitante para validar de manera experimental sitios de reconocimiento de miARN previstos es la técnica conocida como amplificación rápida mediada por ARN ligasa de extremos 5' del ADNc ("5' RLM-RACE" o "5' RACE"), que identifica patrones de escisión de miARN; véanse, por ejemplo, Kasschau y col. (2003) Dev. Cell, 4:205-217, y Llave y col. (2002) Science, 297:20532056. Esta estrategia se basa en la ligadura de una molécula adaptadora de ARN al extremo 5' del sitio de escisión y es dependiente del fosfato 5' dejado por enzimas RNasa III, incluyendo AgoI. Los productos resultantes de la PCR se secuencian, y el número relativo de clones que se alinean con el sitio de escisión previsto del miARN entre los nucleótidos 10 y 11 en relación al extremo 5' de miARN proporciona una estimación de la actividad de miARN. La Figura 14 representa gráficamente la escisión prevista por miRMON18 de las secuencias del arroz Os02g45520 (SEQ ID NO. 8784) y Os04g48390 (SEQ ID NO. 8786) y la secuencia del maíz MRT4577_36529C (SEQ ID NO. 8788). Los resultados de los ensayos 5’ RLM-RACE se usaron para confirmar la escisión de los sitios de reconocimiento previstos para miRMON18 (sitios diana) en las secuencias de arroz Os02g45520 (SEQ ID NO. 8784) y Os04g48390 (SEQ ID NO. 8786), para las cuales 3 de 24 clones, y 13 de 16 clones, respectivamente, se habían secuenciado, y para las que se ha descubierto que tienen el patrón de escisión previsto (entre los nucleótidos 10 y 11 con respecto al extremo 5' de miRMON18). Los experimentos 5’-RACE también validaron parcialmente el sitio de reconocimiento de miRMON18 en la secuencia SPX_MFS2 del maíz SEQ ID NO. 8767 (no se muestran los datos).

Otro procedimiento no limitante para validar experimentalmente los sitios de reconocimiento de miARN previstos es examinar los niveles de expresión de la diana presunta, por ejemplo, mediante experimentos de perfil de transcripción. Se predice que el nivel de expresión de una diana auténtica de un miARN sería elevado cuando el miARN no se expresa, y bajo cuando el miARN se expresa. De este modo, se predice que una diana de miRMON18 tendría una expresión más alta cuando miRMON18 no se expresa (es decir, en condiciones de deficiencia de nitrógeno o de deficiencia de fosfato), y una baja expresión cuando miRMON18 se expresa (es decir, en condiciones de nitrógeno suficientes y de fosfato suficientes). La Figura 15B representa gráficamente los perfiles de expresión de la secuencia MRT4577_36529C del maíz (SEQ ID NO. 8788), que contiene un sitio de reconocimiento de miRMON18 previsto. MRT4577_36529C (SEQ ID NO. 8788) no se ve afectado por la disponibilidad de agua o la temperatura (sin diferencias importantes en los niveles del transcrito observados entre condiciones de agua suficiente o sequía o entre temperatura frías o normales; no se muestran los datos), pero mostró mayores niveles de expresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno que en condiciones suficientes de nitrógeno, es decir, un patrón de expresión opuesto al de miRMON18 como se muestra en la Figura 15A (véanse también la Figura 9 y la Figura 10), lo que indica que MRT4577_36529C (SEQ ID NO. 8788) está regulada ciertamente por miRMON18.

Estos datos verifican que miRMON18 regula los genes que contienen el dominio SPX conservado. La expresión de RMON18 se suprime durante la deficiencia de nitrógeno o la deficiencia de fosfato, permitiendo que los genes regulados por miRMON18 endógeno se expresen en estas condiciones. La manipulación de la expresión bien del miARN miRMON18 maduro o de las dianas de miRMON18 (genes que incluyen al menos un sitio de reconocimiento de miRMON18) es útil para alterar la respuesta de una planta a la deficiencia de nitrógeno o la deficiencia de fosfato.

Un aspecto de la presente invención incluye un procedimiento para proporcionar una planta de cultivo transgénica no natural que tiene un rendimiento mejorado en condiciones de deficiencia de nitrógeno o fosfato, mediante la expresión en la planta de cultivo transgénica de un gen insensible a miRMON18. Una realización es expresar en una planta de cultivo transgénica no natural una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de un transgén sintético que no responde a miRMON18, en la que la secuencia de un transgén sintético que no responde a miRMON18: (i) se deriva de una secuencia sensible a miRMON18 natural por deleción o modificación de todos los sitios de reconocimiento del miARN miRMON18 comprendidos en la secuencia sensible a miRMON18 natural (es decir, eliminación o alteración de los nucleótidos de la secuencia natural sensible a miRMON18 que se reconoce por un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742 o mediante un miARN miRMON18 derivado de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763, SEQ ID NO. 3936, y la SEQ ID NO. 8800), y (b) no se reconoce por un miARN miRMON18 maduro. En un ejemplo no limitante, el sitio de reconocimiento de miRMON18 en cualquiera de los genes que contienen el dominio SPX conservado representado gráficamente en la Figura 12 se elimina o modifica de forma que el gen SPX modificado ya no reconoce ni se une a un miRMON18 maduro endógeno (SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742) y, por tanto, queda desacoplado de la regulación de miRMON18 y, por tanto, de la influencia de la deficiencia de nitrógeno o de fosfato. En un ejemplo específico no limitante, el gen MRT4577_36529C del maíz (SEQ ID NO. 8788) se puede desacoplar de la regulación por miRMON18 y, por tanto, de la influencia de la deficiencia de nitrógeno o fosfato mediante la expresión de un gen MRT4577_36529C modificado cuyo sitio de reconocimiento de miRMON18 en su región no traducida 5’ (nucleótidos 1660 -1680 de la SEQ ID NO. 8788) se ha eliminado o modificado de tal forma que el gen MRT4577_36529C modificado ya no reconoce ni se une a un miRMON18 maduro (SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742). El MRT4577_36529C modificado insensible a miRMON18 se expresa usando promotores constitutivos o específicos de tejido en el maíz, aumentando la captación de nutrientes y el uso en condiciones de nitrógeno suficientes y de fosfato suficientes y dando como resultado un rendimiento mejorado en condiciones normales y, preferentemente, también en condiciones de deficiencia de nitrógeno o de deficiencia de fosfato.

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Como alternativa, el sitio de reconocimiento de miRMON18 se diseña mediante ingeniería genética dentro de los genes normalmente insensibles a miRMON18 que se deben suprimir en condiciones de nitrógeno suficientes y expresar durante las condiciones de deficiencia de nitrógeno; esto es un enfoque útil, por ejemplo, con un gen transportador de nitrógeno que proporciona un comportamiento o rendimiento mejorado cuando se expresa en condiciones de limitación de nitrógeno o fosfato, pero no proporciona beneficios cuando se expresa en condiciones no limitantes.

Ejemplo 10

Se describen a continuación ejemplos no limitantes adicionales de procedimientos y construcciones de ADN recombinante de utilidad en la mejora del uso del nitrógeno o fosfato basándose en la manipulación de la expresión génica de miRMON18 o el gen SPX.

(A) Modulación de la expresión del gen SPX para mejorar el uso de nitrógeno en condiciones limitantes. En esta realización, un gen diseñado mediante ingeniería genética que contenía el dominio SPX para que careciera de un sitio de reconocimiento de miRMON18 (o en Arabidopsis thaliana, un sitio de reconocimiento de miR827site) en la UTR en 5’ UTR se expresó en plantas. El desacoplamiento del gen SPX del miRMON18 endógeno (o en Arabidopsis thaliana, miR827) en lo que respecta a la regulación, proporciona adaptación a la disponibilidad de nutrientes en condiciones de suficiente nitrógeno o fosfato, y da como resultado un aumento del rendimiento. Un resultado deseable para aumentar la expresión del clado SPX-MFS (SEQ ID NO. 8788, SEQ ID NO. 8786, SEQ ID NO. 8784, y la SEQ ID NO. 8778) (Figura 12) es el aumento del contenido de proteínas en al menos un tejido vegetal (tal como hojas, tallo, raíz, o semillas en condiciones de suficiente nitrógeno o fosfato mediante el aumento de la disponibilidad de nutrientes en los tejidos sumidero. Varios vectores (véase la Tabla 7) se evaluaron en Arabidopsis thaliana para modelar la función de los genes SPX.

El fenotipo previsto de la regulación en exceso de AtNLA (At1g02860, que contiene un dominio SPX-RING, SEQ ID NO. 8745) en una planta es una adaptación constitutiva a condiciones de bajo contenido en nitrógeno o bajo contenido en fósforo y mejora el transporte global y el uso de los nutrientes por la planta; se predice un fenotipo similar para la regulación en exceso de los genes relacionados del clado SPX-RING (, SEQ ID NO. 8770, SEQ ID NO. 8774, y la SEQ ID NO. 8776) (Figura 12). Los vectores con números del 1 al 5 son transcritos quiméricos que incluyen regiones no traducidas no dirigidas 5’ y 3’ y la región de codificación de AtNLA (SEQ ID NO. 8745); el vector número 6 incluye un fragmento genómico AtNLA (SEQ ID NO. 8745) que incluye la secuencia procedente del promotor endógeno AtNLA a través de la secuencia de terminación (para prevenir la expresión ectópica) pero donde el sitio de reconocimiento del miR827 natural se han eliminado o modificado para prevenir el reconocimiento por un miR827 maduro.

El fenotipo previsto de la regulación en exceso de los genes del clado SPX-MFS (SEQ ID NO. 8788, SEQ ID NO. 8786, SEQ ID NO. 8784, y la SEQ ID NO. 8778) (Figura 12) es un aumento en el transporte de nutrientes (especialmente nitrógeno y/o fosfato), especialmente de los tejidos fuente a los tejidos sumidero, dando como resultado un aumento del rendimiento. Los vectores números 7, 9, y 10 son transcritos quiméricos que incluyen regiones no traducidas no dirigidas 5’ y 3’ y la región de codificación de At1g63010 (SEQ ID NO. 8778); el vector número 8 incluye un fragmento genómico At1g63010 (SEQ ID NO. 8778) que incluye la secuencia procedente del promotor endógeno At1g63010 a través de la secuencia de terminación (para prevenir la expresión ectópica) pero donde el sitio de reconocimiento del miR827 natural se han eliminado o modificado para prevenir el reconocimiento por un miR827 maduro; el vector número 11 es un transcrito quimérico que incluye regiones no traducidas no dirigidas 5’ y 3’ y la región de codificación de Os04g48390 (SEQ ID NO. 8786); el vector número 12 incluye un fragmento genómico Os04g48390 (SEQ ID NO. 8786) que incluye la secuencia procedente del promotor endógeno Os04g48390 a través de la secuencia de terminación (para prevenir la expresión ectópica) pero donde el sitio de reconocimiento del miRMON18 natural se han eliminado o modificado para prevenir el reconocimiento por un miRMON18 maduro (o, en Arabidopsis thaliana, por un miR827 maduro).

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5 Los efectos de regular en exceso los genes del clado SPX de función no clasificada, pero cuya represión se predice en casos de baja disponibilidad de nitrógeno se evaluaron mediante la expresión de MRT4577_319995C (SEQ ID NO. 8798) con los vectores 13 -15 (Tabla 7).

Se realizaron experimentos de expresión similares en el maíz. Los vectores (Tabla 7) que incluyen genes con un dominio SPX conservado (véase la Figura 12) se construyen y transforman en maíz. Las variantes de vectores 10 incluyen un vector que incluye la secuencia genómica del gen SPX y los vectores que incluyen el ADNc clonado del gen SPX impulsado por el promotor natural. En ejemplos no limitantes, los vectores 16 -18 usan la secuencia de codificación derivada de MRT4577_36529C (SEQ ID NO. 8788), y tienen un sitio de reconocimiento miRMON18 perturbado, que permite la expresión del transgén solamente en condiciones de suficiente nitrógeno cuando se expresa el promotor natural. Una tercera construcción para expresar solamente el dominio MFS de

15 MRT4577_36529C (SEQ ID NO. 8788), que representa una isoforma natural procedente de corte y empalme alternativo que carece de SPX, también se preparó y sometió a ensayo para determinar la asimilación de nitrógeno en el maíz.

Tabla 7

Vector n.º

Construcción* Patrón de expresiónprevisto

1

35S:AtNLA constitutivo

2

35S:AtNLA que carece del dominio SPX constitutivo

3

35S:AtNLA que carece del dominio RING constitutivo

4

FDA/PPDK:AtNLA específico de hojas

5

RCc3:AtNLA específico de raíz

6

promotor AtNLA:AtNLA con el sitio de reconocimiento de miR827 perturbado expresión de AtNLA natural

7

35S:At1g63010 constitutivo

8

promotor At1g63010:At1g63010 con el sitio de reconocimiento de miR827 perturbado expresión de At1g63010 natural

9

35S:At1g63010 que carece del dominio SPX constitutivo

10

35S:At1g63010 que carece del dominio MFS constitutivo

11

35S:Os04g48390 constitutivo

12

promotor Os04g48390:Os04g48390 con el sitio de reconocimiento de miRMON18 perturbado

13

35S:MRT4577_319995C constitutivo

14

FDA/PPDK: MRT4577_319995C específico de hojas

15

RCc3: MRT4577_319995C específico de raíz

16

ADNc del promotor ZmSPXMFS:ZmSPXMFS: Terminador ZmSPXMFS

17

ADNg del promotor ZmSPXMFS:ZmSPXMFS: Terminador ZmSPXMFS

18

ADNc del promotor ZmSPXMFS:ZmMFS: Terminador ZmSPXMFS

*35S, promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) de 35S; FDA, promotor de la fructosa bifosfato aldolasa (promotor de la vaina del haz); PPDK, promotor de la piruvato ortofosfato diquinasa (promotor de células mesófilas); RCc3, promotor del gen RCc3 del arroz (promotor específico de la raíz)

(B) Expresión génica bajo suficiente cantidad de nitrógeno usando un promotor de MIRMON18. En esta realización,

20 se utiliza un promotor de miRMON18 para eliminar los fenotipos indeseables (tipos fuera de rango) resultantes de la expresión de transgenes en condiciones de limitación de nitrógeno. Por ejemplo, cuando el nitrógeno no limita la expresión de la asparagina sintetasa, proporciona un fenotipo deseable con alto contenido en proteínas. EN condiciones limitadas de nitrógeno, la expresión en exceso de la asparagina sintetasa ocasiona una reducción del rendimiento. La expresión de la asparagina sintetasa impulsada por el promotor miRMON18 proporciona un fenotipo de alta producción de proteínas con suficiente disponibilidad de nitrógeno, pero en condiciones limitadas de nitrógeno, el transgén se desactiva evitando la penalización del rendimiento. Se construyeron vectores incluyendo el promotor de miRMON18 del maíz (SEQ ID NO. 8804), la secuencia líder de miRMON18 del maíz (SEQ ID NO. 8805), y una estructura replegada de miRMON18 fusionada con un gen de la asparagina sintetasa. Los ejemplos no limitantes de un gen de la asparagina sintetasa incluyen una asparagina sintetasa de soja (Glycine max) (SEQ ID NO. 8809), una asparagina sintetasa de Galdieria sulphuraria (SEQ ID NO. 8810), y una asparagina sintetasa de maíz (Zea mays) (SEQ ID NO. 8811). Estos vectores se transformaron en maíz, y el rendimiento y la calidad de las proteínas se evaluaron en las plantas de maíz transgénico resultante en condiciones de limitación de nitrógeno y nitrógeno suficiente.

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(C)

Supresión génica en condiciones de limitación de nitrógeno utilizando una secuencia del sitio de reconocimiento de miRMON18. Un ejemplo no limitante de esta realización es una construcción de ADN recombinante que incluye una unidad de transcripción de un transgén y un sitio de reconocimiento exógeno de miRMON18, en la que la expresión de la construcción de ADN recombinante en una planta da como resultado la expresión del transgén cuando el miARN miRMON18 maduro no se expresa. La 5’UTR de los genes que contienen el dominio SPX de las plantas superiores confiere la supresión de ARNm en condiciones de nitrógeno suficiente a través de la regulación realizada mediante un miRMON18 o miR827 maduro endógeno. En una realización no limitativa de la presente invención, la 5’UTR de un gen SPX regulado por miRMON18 o miR827, tales como, aunque no de forma limitativa, AtNLA (SEQ ID NO. 8770), At1g63010 (SEQ ID NO. 8778), Os02g45520 (SEQ ID NO. 8784), Os04g48390 (SEQ ID NO. 8786), y MRT4577_36529C (SEQ ID NO. 8788), se incorporan a la secuencia líder de una casete de expresión de un transgén. Esto da como resultado la supresión del transgén en condiciones de suficiente nitrógeno, independientemente de la secuencia promotora utilizada, para eliminar los tipos fuera de rango asociados con una expresión del transgén no regulada. En una realización preferida, la secuencia de 4 nucleótidos conservada AUG(G/U) presente en el sitio de escisión del sitio de reconocimiento de miRMON18 o miR827 se cambia a GUGG para prevenir el inicio no intencionado, a la vez que preserva el emparejamiento de bases en el ARNm maduro. Como alternativa, se incorporan sitios de reconocimiento miRMON18 o miR827 sintéticos a las regiones no traducidas, o dentro de la región codificante sin alterar la función de las proteínas, para conferir supresión en condiciones de suficiente nitrógeno.

En otro ejemplo, la 5’ UTR de Os04g48390 (SEQ ID NO. 8786) se fusiona a GUS impulsada por un promotor constitutivo; conteniendo una versión la secuencia endógena del arroz que tiene AUG en el sitio de escisión de miRMON18, y se construye otra versión en la que el AUG del sitio de escisión de miRMON18 se ha modificado a GUG. Una tercera construcción, con sitios de reconocimiento en tándem (dos o más) sintéticos de miRMON18 introducidos en la 3’ UTR también se sometió a evaluación. Estos vectores se evaluaron en plantas de maíz transformadas crecidas en condiciones de nutrientes (nitrógeno o fosfato) variables, y se analizaron varios tejidos para determinar la expresión de GUS.

(D)

Expresión ectópica de MIRMON18 para limitar la expresión génica de SPX. En esta realización, la expresión de miRMON18 (o, en Arabidopsis, miR827) está impulsada por un promotor constitutivo o específico de tejido, que da como resultado la supresión de todos los genes regulados por miRMON18 (o regulados por miR827) tales como los genes SPX conservados. Un ejemplo no limitante incluye el vector pMON107261 (Figura 16), que incluye un promotor CaMV 35S que impulsa la expresión del transcrito miRMON18 de maíz (por ejemplo, los nucleótidos 2173 2788 de la SEQ ID NO. 8800). Se evaluaron los fenotipos de plantas de maíz transgénico y Arabidopsis transformadas con este vector, y las plantas mostraron rasgos mejorados, tales como un rendimiento aumentado en condiciones de limitación de nitrógeno o fosfato.

Ejemplo 11

Este ejemplo describe una construcción de ADN recombinante que se transcribe a un transcrito de ARN que incluye al menos una secuencia señuelo miARN que reconoce y se une a un miARN maduro endógeno pero que no se escinde. En una realización preferida de la presente invención, el miARN maduro endógeno es uno que es sensible al estrés por nutrientes, por ejemplo, un miARN maduro cuya expresión está bien regulada en exceso o regulada por defecto en condiciones de deficiencia de nutrientes, con respecto a la expresión con suficiencia de nutrientes. Más específicamente, este ejemplo describe secuencias señuelo de miARN para los miARN maduros (miR827, miRMON18, y miR399) que son sensibles al estrés por nutrientes.

Los Ejemplos 6 -10 describen dos miARN, miR827 (SEQ ID NO. 8744) y miRMON18 (SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227SEQ ID NO. 8742) que presentan un patrón de expresión caracterizado por la regulación del miARN mediante el estrés por nutrientes (por ejemplo, supresión del miARN en condiciones de deficiencia de nitrógeno, deficiencia de fosfato, o deficiencia tanto de nitrógeno como de fosfato). Otro miARN, miR399, identificado en Arabidopsis thaliana, tiene la secuencia UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUG (SEQ ID NO. 8812); se identificó un miARN idéntico mediante secuenciación de ARN pequeño en el maíz (SEQ ID NO. 8813) arroz (SEQ ID NO. 8814), y soja (SEQ ID NO. 8815).

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Se descubrió que el gen miR399 del maíz era sensible a la disponibilidad de nitrógeno. Se identificaron los precursores de miR399 en bases de datos de ADNc patentadas, e incluyen la secuencia de ADNc Zm-miR399 ADNc (MRT4577_22484C.8) que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8816, que contiene un precursor de Zm-miR399 (SEQ ID NO. 8817) en los nucleótidos 71-175 de la SEQ ID NO. 8816, y otra secuencia de ADNc de Zm-miR399 (MRT4577_22487C.6) que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8818, que contiene un precursor de Zm-miR399 (SEQ ID NO. 8819) en los nucleótidos 136 -330 de la SEQ ID NO. 8818. Las estructuras replegadas de los precursores miR399 de maíz se representan gráficamente en la Figura 17A; la Figura 17B representa gráficamente los resultados de los experimentos de perfil de la transcripción con la sonda AlZM033468_at correspondiente al MRT4577_22487C.6 (SEQ ID NO. 8818), que demuestran que el Zm-miR399 pri-miARN (SEQ ID NO. 8817) está suprimido en condiciones deficientes de nitrógeno (barras negras) y se expresa en condiciones suficientes de nitrógeno (barras blancas).

En Arabidopsis thaliana, se ha notificado que miR399 es sensible a la disponibilidad de fosfato inorgánico y a la supresión de un clado de genes entre los que se incluyen el gen PHO2 de Arabidopsis thaliana (At2g33770, que codifica una E2 conjugasa) y presuntos ortólogos de PHO2 de varias plantas. La privación de fosfato inorgánico induce la expresión de miR399; la expresión en exceso de miR399 en condiciones de agotamiento de fosfato reprime la expresión de PHO2 y conduce a elevadas concentraciones de fosfato en las hojas. Véanse Fujii y col. (2005) Curr. Biol., 15: 2038-2043; Chiou y col. (2006) Plant Cell, 18:412-421; Aung y col. (2006) Plant Physiol. 141:1000-1011; y Bari y col. (2006) Plant Physiol., 141:988-999.

Se notificó que un motivo de 23 nucleótidos conservados descubierto en el transcrito IPS1 de Arabidopsis thaliana y en otros miembros de la familia de genes Mt4-TPSI tenía una secuencia complementaria de miR399 salvo por un bucle incorrectamente emparejado correspondiente a las posiciones 10 y 11 del miR399 maduro, que evita la escisión del duplete miR399:IPS1; véase Franco-Zorrilla y col. (2007) Nature Genetics, 39:1033-1037. Una secuencia similar no escindible que también contiene emparejamientos incorrectos correspondientes a las posiciones 10 y 11 del miARN maduro se ha notificado para miR390; véase Axtell y col. (2006) Cell, 127:565-577.

Se desarrollaron reglas para predecir una "secuencia señuelo de microARN", es decir, una secuencia que puede reconocerse y unirse a un miARN maduro endógeno que da como resultado un emparejamiento de bases entre la secuencia señuelo de miARN y el miARN maduro endógeno, formando de este modo un duplete de ARN resistente a la escisión que no se escinde debido a la presencia de emparejamientos incorrectos entre las secuencias señuelo de miARN y el miARN maduro. En general, estas reglas definen (1) los emparejamientos incorrectos necesarios, y

(2) los emparejamientos incorrectos que se permiten pero que no son necesarios. Los emparejamientos incorrectos incluyen los emparejamientos incorrectos habituales (por ejemplo, G-A, C-U, C-A) así como el par oscilante G:U y los indeles (inserciones o deleciones de nucleótidos).

Los emparejamientos incorrectos necesarios incluyen: (a) al menos 1 emparejamiento incorrecto entre la secuencia señuelo de miARN y el miARN maduro endógeno en las posiciones 9, 10, u 11 del miARN maduro endógeno, o como alternativa, (b) 1, 2, 3, 4, o 5 inserciones (es decir, nucleótidos adicionales) en una posición de la secuencia señuelo de miARN correspondiente a las posiciones 9, 10, u 11 del miARN maduro endógeno. En realizaciones preferidas, existe bien (a) al menos 1 emparejamiento incorrecto entre la secuencia señuelo de miARN y el miARN maduro endógeno en las posiciones 10 y/u 11 del miARN maduro endógeno, o (b) al menos 1 inserción en una posición de la secuencia señuelo de miARN correspondiente a las posiciones 10 y/u 11 del miARN maduro endógeno.

Los emparejamientos incorrectos que se permiten, pero que no son necesarios, incluyen: (a) 0, 1, o 2 emparejamientos incorrectos entre la secuencia señuelo de miARN y el miARN maduro endógeno en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, y 9 del miARN maduro endógeno, y (b) 0, 1, 2, o 3 emparejamientos incorrectos entre la secuencia señuelo de miARN y el miARN maduro endógeno en las posiciones desde la 12 hasta la última posición del miARN maduro endógeno (es decir, en la posición 21 de un miARN maduro de 21 nucleótidos), en el que cada uno de los emparejamientos incorrectos en las posiciones desde la 12 hasta la última posición del microARN maduro endógeno es adyacente a al menos un par de bases complementario (es decir, de forma que no hay más de dos emparejamientos incorrectos contiguos en las posiciones desde la 12 hasta la última posición del microARN maduro endógeno). En realizaciones preferidas, no existen emparejamientos incorrectos (es decir, todos los pares de bases son complementarios) en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, y 8 del miARN maduro endógeno.

Estas reglas se emplearon para identificar, a partir de bases de datos de ADNc patentadas, secuencias de maíz o soja que contienen secuencias señuelo de miARN endógeno. La Tabla 8 proporciona secuencias señuelo de miARN endógeno del maíz (Zea mays) para miRMON18 (SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742); los emparejamientos incorrectos en la secuencia señuelo de miARN están indicados mediante un texto subrayado en la alineación entre el miARN y la secuencia señuelo de miARN.

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SEQ ID NO.

Secuencia señuelo de miRMON18 ADNc identificador del maíz y SEQ ID NO.(posición de nucleótidos de la secuencia señuelo de miARN codificada en el ADNc) Alineación entre miRMON18 proporcionada en dirección 3’ a 5’(anterior) y la secuencia señuelo demiARN proporcionada en dirección 5’ a 3’ (posterior)

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La Tabla 9 proporciona secuencias señuelo de miARN endógeno del maíz (Zea mays) para miR399 (SEQ ID NO. 8812, SEQ ID NO. 8813, SEQ ID NO. 8814, o la SEQ ID NO. 8815); los emparejamientos incorrectos en la secuencia señuelo de miARN están indicados mediante un texto subrayado en la alineación entre el miARN y la secuencia señuelo de miARN.

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Se identificaron las secuencias señuelo miR399 del microARN en la hebra negativa de dos secuencias de ADNc (SEQ ID NO. 8831 y SEQ ID NO. 8833). Un análisis de traducción en seis marcos de las secuencias de ADNc proporcionadas en la Tabla 9 no revelaron ningún marco de lectura abierto largo, y las búsquedas BLAST de estas mismas secuencias no identificaron ninguna proteína en bases de datos públicas, lo que indica que es probable que estos genes sean secuencias no codificantes. La alineación de las secuencias de ADNc de maíz en las secuencias señuelo de miR399 se representa gráficamente en la Figura 18, con la secuencia de consenso proporcionada como la SEQ ID NO. 8834, y revela al menos dos grupos de genes que contienen las secuencias señuelo de miR399: el primer grupo contiene los genes estrechamente relacionados MRT4577_47862C.7 (SEQ ID NO. 8827), MRT4577_521786C.1 (SEQ ID NO. 8831), y MRT4577_135578C.1 (SEQ ID NO. 8833), y el segundo grupo contiene MRT4577_36567C.8 (SEQ ID NO. 8829). Solamente había una diferencia de 1 nucleótido entre la secuencia señuelo de miARN del primer grupo de genes del maíz que contienen la secuencia señuelo miR399 (SEQ ID NO. 8827, SEQ ID NO. 8831, y la SEQ ID NO. 8833) y el sitio "mimético" de IPS1 de miR399 de Arabidopsis thaliana (AT3G09922.1) notificado por Franco-Zorrilla y col. (2007) Nature Genetics, 39:1033-1037; la G conservada en la posición 12 de la SEQ ID NO. 8826, SEQ ID NO. 8830, y la SEQ ID NO. 8832 está sustituida por una C en el sitio "mimético" de miR399 de Arabidopsis". Sin embargo, la homología entre los genes del maíz (SEQ ID NO. 8827, SEQ ID NO. 8831, y la SEQ ID NO. 8833) y el gen IPS1 de Arabidopsis thaliana (AT3G09922.1) se limitó a la secuencia señuelo del sitio miARN.

La Tabla 10 proporciona secuencias señuelo de miARN endógeno de soja (Glycine max) para miR399 (SEQ ID NO. 8812, SEQ ID NO. 8813, SEQ ID NO. 8814, o la SEQ ID NO. 8815); los emparejamientos incorrectos en la secuencia señuelo de miARN están indicados mediante un texto subrayado en la alineación entre el miARN y la secuencia señuelo de miARN. Se usaron los datos del perfil de transcripción para comparar la expresión de las secuencias de ADNc señuelo del miARN endógeno y los correspondiente miARN precursores; el probeset incluyó A1GM035741_at (correspondiente a la SEQ ID NO. 8836), A1GM069937_at (correspondiente a la SEQ ID NO. 8838), A1GM074873_at (correspondiente a la SEQ ID NO. 8840), A1GM031412_at (correspondiente a la ), y A1GM053788_at (correspondiente a la SEQ ID NO. 8844).

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Se usaron los perfiles de transcripción para comparar la expresión de las secuencias de ADNc señuelo del miR399 endógeno de maíz y los correspondientes miR399 precursores del maíz en diferentes condiciones de nitrógeno. El gen señuelo de miR399 del grupo 1 MRT4577_47862C.7 (SEQ ID NO. 8827) mostró una regulación por defecto de aproximadamente dos veces en condiciones de deficiencia de nitrógeno en hojas de maíz (Figure 19A); El gen señuelo de miR399 del grupo 2 MRT4577_36567C.8 (SEQ ID NO. 8829) mostró una regulación por defecto aún más intensa de al menos diez veces o mayor en condiciones de deficiencia de nitrógeno en hojas de maíz (Figura 19B). Estos resultados se verificaron mediante transferencias Northern que medían la expresión de miR399 maduro (Figura 19C) y de la secuencia señuelo de miR399 MRT4577_47862C.7 (SEQ ID NO. 8827) (Figura 19D). Se realizaron transferencias Northern con 5 microgramos por hilera de ARN total de hojas V6 procedentes de maíz crecido en condiciones de bajo (2 milimolar) o alto (20 milimolar) contenido en nitrógeno, y la misma transferencia sondeó el miR399 maduro de 21 nucleótidos (Figura 19C) y la secuencia señuelo de miR399 MRT4577_47862C.7 (SEQ ID NO. 8827) (Figura 19D, con la banda principal a aproximadamente 600 pb). Los elevados niveles de expresión de las secuencias señuelo dl miR399 de maíz en condiciones de suficiente nitrógeno imitan los elevados niveles de expresión de los miR399 precursores durante la suficiencia de nitrógeno (Figura 17B).

Se usaron experimentos de perfiles de transcripción similares para comparar la expresión de las secuencias de ADNc señuelo del miR399 endógeno de maíz y los correspondientes miR399 precursores del maíz en diferentes condiciones de temperatura. El gen señuelo de miR399 del grupo 2 MRT4577_36567C.8 (SEQ ID NO. 8829) presentó al menos una expresión de diez veces o más mayor en condiciones de nitrógeno suficiente en hoja de maíz, especialmente durante las horas diarias de luz (Figura 20A). Este mismo gen presentó al menos una infrarregulación de dos veces en la raíz (Figura 20B) y en los brotes (Figura 20C) tras una exposición prolongada al frío.

La expresión de las secuencias de ADNc señuelo de miR399 endógeno también se comparó en diferentes tejidos, tanto del maíz como de la soja. La Figura 21A representa gráficamente los niveles de expresión en la secuencia señuelo de miR399 de maíz del grupo 1 SEQ ID NO. 8827 (MRT4577_47862C, representado por las sondas A1ZM005814_at y A1ZM005813_s_at), y la secuencia señuelo de miR399 de maíz del grupo 2 SEQ ID NO. 8829 (MRT4577_36567C, representada por la sonda A1ZM048024_at), así como la secuencia de pri-miR399 de maíz SEQ ID NO. 8818 (MRT4577_22487C.6 representada por la sonda A1ZM033468_at). La Figura 21B representa gráficamente los niveles de expresión de las secuencias señuelo de miR399 de soja SEQ ID NO. 8842 (MRT3847_217257C.2, representada por la sonda A1GM031412_at), SEQ ID NO. 8844 (MRT3847_236871C.2, representada por la sonda A1GM053788_at), SEQ ID NO. 8836 (MRT3847_238967C.1, representada por la sonda A1GM035741_at), y la SEQ ID NO. 8838 (MRT3847_241832C.1, representada por la sonda A1GM069937_at).

Estos datos confirman un novedoso patrón de expresión de sensibilidad al nitrógeno en plantas de cultivo incluidos el maíz y la soja tanto para el miR399 maduro (y los miR399 precursores) así como para las secuencias señuelo de miR399 endógeno. Entre las diferentes utilidades del miR399 se incluyen la expresión en exceso del miR399 maduro (por ejemplo, mediante la expresión en exceso de una secuencia pri-miR399), la expresión de un miR399 diseñado mediante ingeniería genética para suprimir un gen distinto del originalmente considerado como diana por un miR399 maduro natural, expresión de un transgén (secuencia codificante o no codificante o ambas) bajo el control del promotor miR399, expresión de un transgén en el que se ha añadido o eliminado un sitio de reconocimiento del miR399, expresión en exceso de una secuencia señuelo de miR399, y supresión de una secuencia señuelo de miR399 endógeno.

La Tabla 11 proporciona secuencias señuelo de miARN endógeno de la soja (Glycine max) y maíz (Zea mays) para miR319, UUGGACUGAAAGGAGCUCCU (SEQ ID NO. 8845), que se ha identificado en numerosas especies vegetales incluidas Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Zea mays, y Glycine max (véanse los ejemplos públicamente disponibles en la miRBase, microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences/query.pl?terms=miR319); los emparejamientos incorrectos en la secuencia señuelo de miARN están indicados mediante un texto subrayado en la alineación entre el miARN y la secuencia señuelo de miARN. La Figura 22A SEQ ID NO. 8847 (MRT3847_41831C.6, representada por la sonda A1 GM001017_at); La Figura 22B representa gráficamente los datos del perfil de transcripción en diversos tejidos de maíz del miR319 señuelo endógeno de maíz SEQ ID NO. 8849 (MRT4577_577703C.1, representada por la sonda A1ZM012886_s_at).

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Entre los genes diana regulados por miR319 se encuentran los genes TCP implicados en el desarrollo de las hojas y los genes MYB implicados en el desarrollo de las flores. Una realización de la presente invención es la alteración de la arquitectura foliar o floral de una planta, o de un modelo de desarrollo, mediante la supresión de la transcripción de un miR319 maduro endógeno en una planta transgénica, o la alteración de la actividad del miR319 endógeno mediante la expresión en exceso de una secuencia señuelo de miR319 en una planta transgénica.

En otro ejemplo más, miR398b (SEQ ID NO. 8850) ha demostrado regular la expresión de CSD1 y CSD2 (cobre/cinc superóxido dismutasa); véase Sunkar y col. (2006) Plant Cell, 18:2051-2065. La superóxido dismutasa ayuda a la eliminación de las especies reactivas del oxígeno (ROS) convirtiendo el O2 en H2O2 y minimiza el daño potencial producido por el superóxido o por los ROS derivados de superóxido. miR398 está algo regulada defectivamente por el estrés oxidativo y fuertemente regulada defectivamente por la disponibilidad de Cu; véase Yamasaki y col. (2007)

J. Biol. Chem., 282:16369-16378. Una realización de la presente invención incluye la expresión de un transcrito quimérico que incluye secuencias señuelo de miR398b(por ejemplo, SEQ ID NOS. 8851 -8852) bajo el control de un promotor inducible por estrés oxidativo, dando como resultado la supresión adicional de la actividad de miR398b y una acumulación mayor de CSD1 y CSD2 y protección frente al estrés en condiciones de estrés.

Se desvela una construcción de ADN recombinante que comprende: (a) una secuencia de un transgén sintético que no responde a miRMON18, en la que dicha secuencia de un transgén sintético que no responde a miRMON18: (i) se deriva de una secuencia sensible a miRMON18 natural por deleción o modificación de todos los sitios de reconocimiento del miARN miRMON18 comprendidos en dicha secuencia sensible a miRMON18 natural, y (ii) no se reconoce por un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742; o (b) una secuencia de un transgén sintético que no responde a miARN, en la que dicha secuencia de un transgén sintético que no responde a miARN: (i) se deriva de una secuencia sensible a miARN natural por deleción o modificación de todos los sitios de reconocimiento del miARN natural reconocidos por al menos un miARN maduro específico seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1-1035, SEQ ID NOS. 2730-3921, SEQ ID NOS. 5498-6683, SEQ ID NOS. 8409-8560, SEQ ID NO. 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812-8815, SEQ ID NO. 8845, y la SEQ ID NO. 8850 dentro de dicha secuencia sensible a miARN natural, y (ii) no se reconoce por dicho al menos un miARN maduro específico; o (c) una secuencia de un transgén sintético que no responde a miR399, en la que dicha secuencia de un transgén sintético que no responde a miR399: (i) se deriva de una secuencia sensible a miR399 natural por deleción o modificación de todos los sitios de reconocimiento del miARN miR399 comprendidos en dicha secuencia sensible a miR399 natural, y (ii) no se reconoce por un miARN miR399 maduro; o (d) una secuencia de un transgén sintético que no responde a miR319, en la que dicha secuencia de un transgén sintético que no responde a miR399: (i) se deriva de una secuencia sensible a miR399 natural por deleción

o modificación de todos los sitios de reconocimiento del miARN miR319 comprendidos en dicha secuencia sensible a miR319 natural, y (ii) no se reconoce por un miARN miR319 maduro. Una construcción de ADN recombinante que comprende al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana, en el que dicho al menos un elemento de ADN transcribible se selecciona entre el grupo que consiste en:

(a)

(i) un elemento de ADN que se transcribe a un precursor de miARN con la estructura replegada de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036-2690, SEQ ID NOS. 39225497, SEQ ID NOS. 6684-8408, SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816-8819, en el que dicho miARN precursor comprende un segmento contiguo de al menos 90% de los nucleótidos de dicha secuencia precursora de miARN vegetal, y dicha construcción de ADN recombinante comprende opcionalmente además un promotor diferente al promotor natural de dicha secuencia precursora de miARN natural; o (ii) un elemento de ADN que se transcribe a un precursor de miARN con la estructura replegada de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036-2690, SEQ ID NOS. 3922-5497, SEQ ID NOS. 6684-8408, SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816-8819, en el que dicho precursor de miARN comprende un segmento contiguo de al menos 90% de los nucleótidos de dicha secuencia precursora de miARN vegetal, y dicho al menos un gen diana es un gen endógeno de una planta, y dicha construcción de ADN recombinante comprende opcionalmente además un promotor diferente al promotor natural de dicha secuencia precursora de miARN natural, y, en la que la expresión de dicha construcción de ADN recombinante en dicha planta da como resultado la supresión de dicho al menos un gen diana;

(b)

(i) un elemento de ADN que se transcribe a un precursor de miARN con la estructura replegada de una secuencia precursora de miRMON18 y que se procesa para obtener un miARN miRMON18 maduro, y dicha construcción de ADN recombinante comprende opcionalmente además un promotor diferente al promotor natural de dicha secuencia precursora de miRMON18 natural; o (ii) un elemento de ADN que se transcribe a un precursor de miARN con la estructura replegada de una secuencia precursora de miRMON18 y que se procesa para obtener un miARN miRMON18 maduro, y dicho al menos un gen diana es un gen endógeno de una planta, y dicha construcción de ADN recombinante comprende opcionalmente además un promotor diferente al promotor natural de dicha secuencia precursora de miRMON18 natural, y, en la que la expresión de dicha construcción de ADN recombinante en dicha planta da como resultado la supresión de dicho al menos un gen diana;

(c)

(i) un elemento de ADN que se transcribe a un miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética derivado de la estructura replegada de una secuencia de un miARN precursor seleccionado entre una secuencia precursora de miARN vegetal seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036-2690, SEQ ID NOS. 3922-5497, SEQ ID NOS. 6684-8408, SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816-8819,

en el que dicho miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética comprende un miARN maduro modificado; o (ii) un elemento de ADN que se transcribe a un miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética derivado de la estructura replegada de una secuencia de un miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036-2690, SEQ ID NOS. 3922-5497, SEQ ID NOS. 6684-8408, SEQ ID NOS. 85618417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816-8819, en el que dicho miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética comprende un miARN maduro modificado, en la que dicho al menos un gen diana sea un gen endógeno de una planta o un gen endógeno de una plaga o patógeno de dicha planta y, en la que la expresión de dicha construcción de ADN recombinante en dicha planta da como resultado la supresión de dicho al menos un gen diana;

(d)

(i) un elemento de ADN que se transcribe a un miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética derivado de la estructura replegada de una secuencia precursora de un miRMON18, en el que dicho miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética comprende un miARN miRMON18 maduro modificado; o (ii) un elemento de ADN que se transcribe a un miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética derivado de la estructura replegada de una secuencia precursora de un miRMON18, en el que dicho miARN precursor diseñado mediante ingeniería genética comprende un miARN miRMON18 maduro modificado, en la que dicho al menos un gen diana sea un gen endógeno de una planta o un gen endógeno de una plaga o patógeno de dicha planta y, en la que la expresión de dicha construcción de ADN recombinante en dicha planta da como resultado la supresión de dicho al menos un gen diana;

(e)

(i) un elemento de ADN que se localiza o es adyacente a una unidad de transcripción del transgén y que se transcribe a ARN que comprende un sitio de reconocimiento del miARN reconocido por un miARN maduro seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1-1035, SEQ ID NOS. 2730-3921, SEQ ID NOS. 5498-6683, SEQ ID NOS. 8409-8560, SEQ ID NO. 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812-8815, SEQ ID NO. 8845, y la SEQ ID NO. 8850 o por un miARN maduro derivado de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036-2690, SEQ ID NOS. 3922-5497, SEQ ID NOS. 6684-8408, SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816-8819; o (ii) un elemento de ADN que se localiza o es adyacente a una unidad de transcripción del transgén y que se transcribe a ARN que comprende un sitio de reconocimiento del miARN reconocido por un miARN maduro seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1-1035, SEQ ID NOS. 2730-3921, SEQ ID NOS. 5498-6683, SEQ ID NOS. 8409-8560, SEQ ID NO. 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812-8815, SEQ ID NO. 8845, y la SEQ ID NO. 8850, o por un miARN maduro derivado de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036-2690, SEQ ID NOS. 39225497, SEQ ID NOS. 6684-8408, SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816-8819, y dicho al menos un gen diana comprende el transgén codificado por la unidad de transcripción del transgén, y en el que la expresión de dicha construcción de ADN recombinante en una planta da como resultado la expresión dicho transgén en células de la planta en las que dicho miARN maduro no se expresa naturalmente;

(f)

(i) un elemento de ADN que se localiza o es adyacente a una unidad de transcripción del transgén y que se transcribe a ARN que comprende un sitio de reconocimiento del miARN reconocido por un miARN miRMON18 maduro o por un miARN maduro procedente de una secuencia precursora de miRMON18; o (ii) un elemento de ADN que se localiza o es adyacente a una unidad de transcripción del transgén y que se transcribe a ARN que comprende un sitio de reconocimiento del miARN reconocido por un miARN miRMON18 maduro o por un miARN maduro procedente de una secuencia precursora de miRMON18, y dicho al menos un gen diana comprende el transgén codificado por la unidad de transcripción del transgén, y en el que la expresión de dicha construcción de ADN recombinante en una planta da como resultado la expresión dicho transgén en células de la planta en las que dicho miARN miRMON18 maduro no se expresa naturalmente

(g)

(i) un elemento de ADN para suprimir la expresión de un miARN endógeno derivado de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036-2690, SEQ ID NOS. 3922-5497, SEQ ID NOS. 6684-8408, SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816-8819; o

(ii)

un elemento de ADN para suprimir la expresión de un miARN endógeno derivado de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036-2690, SEQ ID NOS. 3922-5497, SEQ ID NOS. 6684-8408, SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816-8819, en el que dicho al menos un gen diana es un gen endógeno de una planta, y la expresión de dicho gen endógeno esté suprimida en células de dicha planta cuando se produce la expresión natural de dicho miARN endógeno, y, en la que la expresión de dicha construcción de ADN recombinante en las células da como resultado la expresión de dicho gen endógeno en dichas células; y

(h)

(i) un elemento de ADN para suprimir la expresión de un miARN miRMON18 maduro endógeno derivada de una secuencia precursora de miRMON18, dicho al menos un gen diana es un gen endógeno de una planta, y la expresión de dicho gen endógeno esté suprimida en células de dicha planta cuando se produce la expresión natural de dicho miARN miRMON18 maduro endógeno, y, en la que la expresión de dicha construcción de ADN recombinante en las células da como resultado la expresión de dicho gen endógeno en dichas células; o (ii) un elemento de ADN para suprimir la expresión de un miARN miRMON18 maduro endógeno derivada de una secuencia precursora de miRMON18, en el que dicho al menos un gen diana es un gen endógeno de una planta, y la expresión de dicho gen endógeno esté suprimida en células de dicha planta cuando se produce la expresión natural de dicho miARN miRMON18 maduro endógeno, y, en la que la expresión de dicha construcción de ADN recombinante en las células da como resultado la expresión de dicho gen endógeno en dichas células.

(a)

un promotor de un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la regulación mediante estrés abiótico;

(b)

un promotor de un miARN que presenta un patrón de expresión caracterizado por la regulación mediante estrés por nutrientes, en el que dicho estrés por nutrientes comprende al menos una deficiencia de nutrientes seleccionada entre el grupo que consiste en deficiencia de nitrógeno y deficiencia de fosfato;

(c)

el promotor del miARN del maíz que presenta en el tejido foliar una expresión intensa en condiciones de suficiente nitrógeno y supresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno;

(d)

el promotor del miARN del maíz que presenta en el tejido foliar una expresión intensa en condiciones de suficiente fosfato y supresión en condiciones de deficiencia de fosfato;

(e)

un promotor de miRMON18 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8804; y

(f)

un fragmento de al menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos que tienen al menos una identidad del 85% con un segmento de la SEQ ID NO. 8804;

imagen204

imagen205

en el que dicho promotor está unido operativamente con al menos un elemento de supresión génica y un elemento de expresión génica.

La construcción de ADN recombinante que se ha definido anteriormente, en la que dicho promotor está unido operativamente con al menos la región codificante de un gen de la asparagina sintetasa.

Una construcción de ADN recombinante que se transcribe a un transcrito de ARN que comprende al menos una secuencia señuelo miARN que reconoce y se une a un miARN maduro endógeno pero que no se escinde, en el que dicho miARN endógeno es al menos un miARN seleccionado entre

(a)

un miARN maduro seleccionado entre miARN maduros seleccionados entre la SEQ ID NOS. 1-1035, SEQ ID NOS. 2730-3921, SEQ ID NOS. 5498-6683, SEQ ID NOS. 8409-8560, SEQ ID NO. 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812-8815, SEQ ID NO. 8845, y la SEQ ID NO. 8850 o

(b)

un miARN maduro derivado de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036-2690, SEQ ID NOS. 3922-5497, SEQ ID NOS. 6684-8408, SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816-8819; y dicha secuencia señuelo de miARN comprende una secuencia ARN de entre aproximadamente 19 y aproximadamente 36 nucleótidos contiguos de ARN, en el que dicha secuencia señuelo de miARN reconoce y se une a dicho miARN maduro endógeno, dando como resultado el emparejamiento de bases entre dicha secuencia señuelo de miARN y dicho miARN maduro endógeno, formando de esta manera un duplete de ARN resistente a la escisión que comprende: (a) al menos un emparejamiento incorrecto entre dicha secuencia señuelo de miARN y dicho miARN maduro endógeno en las posiciones 9, 10, u 11 de dicho miARN maduro endógeno, o al menos una inserción en una posición de dicha secuencia señuelo de miARN correspondiente a las posiciones 10-11 de dicho miARN maduro endógeno, (b) 0, 1, o 2 emparejamientos incorrectos entre dicha secuencia señuelo de miARN y dicho miARN maduro endógeno en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, y 9 de dicho miARN maduro endógeno, y (c) 0, 1, 2, o 3 emparejamientos incorrectos entre dicha secuencia señuelo de miARN y dicho miARN maduro endógeno en las posiciones desde la 12 hasta la última posición de dicho miARN maduro endógeno, en el que cada uno de dichos emparejamientos incorrectos en las posiciones desde la 12 hasta la última posición de dicho microARN maduro endógeno es adyacente a al menos un par de bases complementario.

La construcción de ADN recombinante que se ha definido anteriormente, en la que dicha al menos una secuencia señuelo de miARN comprende (a) una secuencia señuelo de miARN de origen natural, o (b) una secuencia señuelo de miARN sintética, o (c) tanto una secuencia señuelo de miARN de origen natural como una secuencia señuelo de miARN sintética.

La construcción de ADN recombinante que se ha definido anteriormente, en la que dicha al menos una secuencia señuelo de miARN reconoce y se une pero no se escinde por al menos un microARN seleccionado entre el grupo que consiste en: (a) un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227,

o la SEQ ID NO. 8742 o un miARN maduro derivado de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763, SEQ ID NO. 3936, y la SEQ ID NO. 8800; (a) un miR399 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8815, SEQ ID NO. 8816, SEQ ID NO. 8817, o la SEQ ID NO. 8818 o un miARN maduro derivado de una secuencia precursora de miR399 seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO. 8819, SEQ ID NO. 8820, SEQ ID NO. 8821, y la SEQ ID NO. 8822; y (c) un miR319 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8845.

Una célula de planta transgénica no natural que comprende una construcción de ADN recombinante como se ha definido anteriormente. Una planta transgénica no natural que comprende una planta regenerada preparada a partir de la célula de planta transgénica no natural que se ha definido anteriormente, o una descendencia vegetal de una planta regenerada preparada a partir de la célula de planta transgénica no natural que se ha definido anteriormente, en el que dicha planta transgénica no natural tiene al menos un rasgo alterado, con respecto a una planta que carece de dicha construcción de ADN recombinante, en relación a una planta que carece de la construcción de ADN recombinante, seleccionada entre el grupo de rasgos que consisten en: tolerancia al estrés abiótico mejorada; tolerancia al estrés biótico mejorada; resistencia mejorada a una plaga o un patógeno de dicha planta; composición de metabolitos primarios modificada; composición de metabolitos secundarios modificada; elemento traza modificado, carotenoides, o composición de vitaminas; rendimiento mejorado; capacidad mejorada de usar nitrógeno u otros nutrientes; características agronómicas modificadas; características de crecimiento o reproductivas modificadas; y una cosecha, almacenamiento, o calidad del procesamiento mejorados.

imagen206

Un procedimiento para realizar la supresión génica, que comprende:

(a)

proporcionar una planta transgénica no natural que comprende una planta regenerada preparada a partir de una célula de planta transgénica no natural que comprende una construcción de ADN recombinante de la reivindicación 2, o una descendencia vegetal de una planta regenerada preparada a partir de una célula de planta transgénica no natural que comprende una construcción de ADN recombinante como se ha definido anteriormente; y

(b)

transcribir dicha construcción de ADN recombinante en dicha planta transgénica no natural;

en la que dicha transcripción produce un ARN que es capaz de suprimir dicho al menos un gen diana de dicha planta transgénica no natural, mediante lo cual, dicho al menos un gen diana se suprime con respecto a su expresión en ausencia de transcripción de dicha construcción de ADN recombinante. El procedimiento que se ha definido anteriormente, en el que dicho al menos un gen diana es al menos un gen seleccionado entre el grupo que consiste en un gen natural para dicha planta transgénica, un transgén de dicha planta transgénica no natural, y un gen natural de una plaga o patógeno vírico, bacteriano, fúngico o de invertebrado de la planta transgénica.

El procedimiento que se ha definido anteriormente, en el que dicho al menos un gen diana son varios genes diana.

El procedimiento que se ha definido anteriormente, en el que dicha supresión génica una supresión espacialmente específica, temporalmente específica, específica del desarrollo, o la supresión génica inducible.

Un procedimiento para realizar en paralelo la supresión génica de al menos un gen dina y de la expresión génica de al menos un gen de interés, que comprende:

(a)

proporcionar una planta transgénica no natural que comprende una planta regenerada preparada a partir de una célula de planta transgénica no natural que comprende una construcción de ADN recombinante de la reivindicación 2, o una descendencia vegetal de una planta regenerada preparada a partir de una célula de planta transgénica no natural que comprende una construcción de ADN recombinante de la reivindicación 2, en la que dicha construcción de ADN recombinante comprende además un elemento de expresión génica para expresar dicho al menos un gen de interés; y

(b)

transcribir dicha construcción de ADN recombinante en dicha planta transgénica no natural, en el que, cuando dicha construcción de ADN recombinante se transcribe en dicha planta transgénica no natural, se produce un ARN transcrito que es capaz de suprimir dicho al menos un gen diana y un ARN transcrito que codifica dicho al menos un gen de interés, mediante lo cual, dicho al menos un gen diana se suprime con respecto a su expresión en ausencia de transcripción de la construcción de ADN recombinante y se expresa en paralelo dicho al menos un gen de interés.

Un planta transgénica no natural preparada a partir de una célula de planta transgénica no natural que comprende una construcción de ADN recombinante como se ha definido anteriormente, en la que dicho al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana comprende un elemento de ADN que se transcribe a un miARN precursor con la estructura replegada de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763, SEQ ID NO. 3936, y la SEQ ID NO. 8800, en la que dicho miARN precursor comprende un segmento contiguo de al menos el 90% de los nucleótidos de dicha secuencia precursora de miRMON18 y se procesa para obtener un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742 y dicho al menos un gen diana es un gen endógeno de una planta, y, en la que la expresión de dicha construcción de ADN recombinante en dicha planta da como resultado la supresión de dicho al menos un gen diana, en la que dicho al menos un gen diana comprende un dominio SPX.

Un planta transgénica no natural preparada a partir de una célula de planta transgénica no natural que comprende una construcción de ADN recombinante como se ha definido anteriormente, comprendiendo dicha construcción de ADN recombinante además una unidad de transcripción del transgén, en el que dicho al menos un elemento de ADN transcribible para modular la expresión de al menos un gen diana comprende un elemento de ADN que está situado en o adyacente a dicha unidad de transcripción del transgén y que se transcribe a ARN que comprende un sitio de reconocimiento de miARN reconocido por un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742 o mediante un miARN miRMON18 derivado de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763, SEQ ID NO. 3936, y la SEQ ID NO. 8800, y dicho al menos un gen diana comprende el transgén codificado por la unidad de transcripción del transgén, y en el que la expresión de dicha construcción de ADN recombinante en una planta da como resultado la expresión dicho transgén en células de la planta en las que dicho miARN miRMON18 maduro no se expresa naturalmente, en la que

imagen207

Un procedimiento para proporcionar una planta de cultivo transgénico no natural que tiene al menos un rasgo alterado, que comprende suprimir en dicha planta de cultivo transgénica no natural al menos una secuencia señuelo de miARN endógena, dando como resultado por tanto la mencionada planta de cultivo transgénico no natural que 5 presenta al menos un rasgo alterado, con respecto a una planta de cultivo que no expresa dicha construcción de ADN recombinante, seleccionada entre el grupo de rasgos que consisten en: tolerancia al estrés abiótico mejorada; tolerancia al estrés biótico mejorada; resistencia mejorada a una plaga o un patógeno de dicha planta; composición de metabolitos primarios modificada; composición de metabolitos secundarios modificada; elemento traza modificado, carotenoides, o composición de vitaminas; rendimiento mejorado; capacidad mejorada de usar nitrógeno

10 u otros nutrientes; características agronómicas modificadas; características de crecimiento o reproductivas modificadas; y una cosecha, almacenamiento, o calidad del procesamiento mejorados.

Un procedimiento para proporcionar una planta de cultivo transgénica no natural que tiene un rendimiento mejorado en condiciones de deficiencia de nitrógeno o fosfato, que comprende expresar en dicha planta de cultivo transgénicano natural la construcción de ADN recombinante que se ha definido anteriormente.

15

Claims (9)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1.

   Un procedimiento para disminuir la actividad del miARN en una célula vegetal que comprende expresar en una célula vegetal una construcción de ADN recombinante que comprende un promotor heterólogo unido operativamente a un ADN que codifica al menos una secuencia señuelo de un miARN sintético que consiste en 19 a 36 nucleótidos de ARN contiguos, en el que la secuencia señuelo de dicho miARN sintético se reconoce y une, pero no se escinde, por un miARN expresado en dicha célula vegetal, dando como resultado un emparejamiento de bases entre dicha secuencia señuelo de miARN sintético y dicho miARN maduro, formando por tanto un duplete de ARN resistente a la escisión que comprende al menos un emparejamiento incorrecto entre dicha secuencia señuelo de miARN sintético y dicho miARN maduro en las posiciones 9, 10, u 11 de dicho miARN vegetal maduro, o al menos una inserción en una posición de dicha secuencia señuelo de miARN sintético correspondiente a las posiciones 10-11 de dicho miARN maduro, por lo cual disminuye la actividad de dicho miARN maduro en la mencionada célula vegetal, con respecto a aquella en la que dicha construcción de ADN recombinante no se expresa en dicha célula vegetal.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho duplete de ARN resistente a la escisión además comprende (a) 1 o 2 emparejamientos incorrectos entre dicha secuencia señuelo de miARN sintético y dicho miARN maduro en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, y 9 de dicho miARN maduro, (b) 1, 2, o 3 emparejamientos incorrectos entre dicha secuencia señuelo de miARN sintético y dicho miARN maduro en las posiciones desde la 12 hasta la última posición de dicho miARN maduro, en el que cada uno de dichos emparejamientos incorrectos en las posiciones desde la 12 hasta la última posición de dicho microARN maduro es adyacente a al menos un par de bases complementarias, o (c) una combinación de (a) y (b).

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho miARN maduro es al menos un miARN maduro seleccionado entre (a) un miARN maduro seleccionado entre las SEQ ID NOS. 1-1035, SEQ ID NOS. 2730-3921, SEQ ID NOS. 5498-6683, SEQ ID NOS. 8409-8560, SEQ ID NO. 8742, SEQ ID NO. 8744, SEQ ID NOS. 8812-8815, SEQ ID NO. 8845, y la SEQ ID NO. 8850, o (b) un miARN maduro derivado de una secuencia de miARN precursor de planta seleccionada entre las SEQ ID NOS. 1036-2690, SEQ ID NOS. 3922-5497, SEQ ID NOS. 6684-8408, SEQ ID NOS. 8561-8417, SEQ ID NO. 8743, SEQ ID NO. 8800, y SEQ ID NOS. 8816-8819.

4. 4.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha al menos una secuencia señuelo de miARN sintético se reconoce y se una, pero no se escinde, mediante al menos un miARN maduro seleccionado entre: (a) un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742 o un miARN maduro derivado de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763, SEQ ID NO. 3936, y la SEQ ID NO. 8800; (b) un miR399 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8815, SEQ ID NO. 8816, SEQ ID NO. 8817, o la SEQ ID NO. 8818 o un miARN maduro derivado de una secuencia precursora de miR399 seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO. 8819, SEQ ID NO. 8820, SEQ ID NO. 8821, y la SEQ ID NO. 8822; y (c) un miR319 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8845.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho promotor se selecciona entre promotores espacialmente específicos, promotores temporalmente específicos, y promotores inducibles.

6. 6.

   Una célula vegetal transgénica no natural en la que la actividad de dicho miARN maduro se ha disminuido por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. 7.

   Una planta transgénica no natural regenerada a parir de célula vegetal transgénica no natural de la reivindicación 6, o una descendencia vegetal de una planta regenerada preparada a partir de la célula vegetal transgénica no natural de la reivindicación 6, en la que dicha planta transgénica no natural comprende y expresa la construcción de ADN recombinante de la reivindicación 1, y en la que dicha planta transgénica no natural tiene al menos un rasgo alterado, con respecto a una planta que carece de dicha construcción de ADN recombinante, seleccionado entre los rasgos; tolerancia al estrés abiótico mejorada; tolerancia al estrés biótico mejorada; resistencia mejorada a una plaga

   o un patógeno de dicha planta; composición de metabolitos primarios modificada; composición de metabolitos secundarios modificada; composición de oligoelementos, carotenoides, o vitaminas modificada; rendimiento mejorado; capacidad mejorada de usar nitrógeno u otros nutrientes; características agronómicas modificadas; características de crecimiento o reproductivas modificadas; y una cosecha, almacenamiento, o calidad del procesamiento mejorados.

8. 8.

   Una planta de cultivo transgénica no natural que tiene al menos un rasgo alterado, en la que dicha planta de cultivo transgénica no natural comprende y expresa la construcción de ADN recombinante de la reivindicación 1, dando como resultado por tanto la mencionada planta de cultivo transgénica no natural que presenta al menos un rasgo alterado, con respecto a una planta de cultivo que no expresa dicha construcción de ADN recombinante, seleccionado entre los rasgos; tolerancia al estrés abiótico mejorada; tolerancia al estrés biótico mejorada; resistencia mejorada a una plaga o un patógeno de dicha planta; composición de metabolitos primarios modificada; composición de metabolitos secundarios modificada; composición de oligoelementos, carotenoides, o vitaminas modificada; rendimiento mejorado; capacidad mejorada de usar nitrógeno u otros nutrientes; características agronómicas modificadas; características de crecimiento o reproductivas modificadas; y una cosecha, almacenamiento, o calidad del procesamiento mejorados.

9. 9.

   La planta de cultivo transgénica no natural de la reivindicación 8 que tiene un rendimiento mejorado en condiciones de deficiencia de nitrógeno o de fosfato, en la que dicha al menos una secuencia señuelo de miARN sintético se reconoce y se une, pero no se escinde, mediante al menos un miARN maduro seleccionado entre: (a) un miARN miRMON18 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 393, SEQ ID NO. 3227, o la SEQ ID NO. 8742

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   imagen2

   5 o un miARN maduro derivado de una secuencia precursora de miRMON18 seleccionada entre la SEQ ID NO. 1763, SEQ ID NO. 3936, y la SEQ ID NO. 8800; (b) un miR399 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8815, SEQ ID NO. 8816, SEQ ID NO. 8817, o la SEQ ID NO. 8818 o un miARN maduro derivado de una secuencia precursora de miR399 seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO. 8819, SEQ ID NO. 8820, SEQ ID NO. 8821, y la SEQ ID NO. 8822; y (c) un miR319 maduro que tiene la secuencia de la SEQ ID NO. 8845.

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