CN101600798A - 相位型小rna - Google Patents
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Abstract
本发明公开了编码可用于调节一种或多种目标基因表达的相位型小RNA的重组DNA构建体。本发明还公开了含有本发明的重组DNA构建体的转基因植物细胞、植物和种子。
Description
相关申请的交叉参考和序列表的引入
[0001]本申请要求保护美国临时专利申请60/841,608的优先权益，该临时申请于2006年8月31日申请，并整体在此引入作为参考。包含在文件“38-21(54702)A.ST25.txt”(在操作系统MS-Windows中的文件大小为21KB，于2006年8月31日记录，于2006年8月31日与美国临时专利申请60/841,608一起申请)中的序列表整体在此引入作为参考。包含在名为“38-21(55702)B.txt”的文件中的序列表与本文一起申请，并在此引入作为参考，所述文件为54kb(在MS-Windows操作系统中测量)，于2007年8月29日刻录，并以计算机可读形式位于压缩光盘(CD-R)上。
发明领域
[0002]本发明公开了可用于调节一种或多种目标基因表达的重组DNA构建体和相位型小RNA(phased small RNAs)。本发明还公开了含有本发明重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞、植物和种子。
发明背景
[0003]基因抑制方法包括使用反义、共抑制和RNA干扰。在植物中的反义基因抑制由Shewmaker等人在美国专利5,107,065、5453,566和5,759,829中描述。Inouye等人在美国专利5,190,931、5,208,149和5,272,065中公开了在细菌中使用与编码待抑制基因的mRNA互补的DNA进行基因抑制。RNA干扰或RNA介导的基因抑制已由诸如Redenbaugh等人在“Safety Assessment of GeneticallyEngineered Fruits and Vegetables”，CRC Press，1992；Chuang等人(2000)PNAS，97：4985-4990；和Wesley等人(2001)Plant J.，27：581-590中描述。
[0004]业已描述了几个涉及RNA介导的基因抑制的细胞途径，每个途径均以特征途径和特定组分来区分。参见例如Brodersen和Voinnet(2006)，Trends Genetics，22：268-280以及Tomari和Zamore(2005)Genes & Dev.，19：517-529的综述。siRNA途径包括双链RNA被非定相位切割为小干扰RNA(“siRNA”)。微RNA途径包括微RNA(“miRNA”)，其是非蛋白编码RNA，一般在约19个至约25个核苷酸之间(在植物中通常约20-24个核苷酸)，引导靶转录物的反式切割，负调节的基因表达涉及多个调节和发育途径的基因的表达；参见Ambros等人(2003)RNA，9：277-279。植物miRNA由一组特征限定，包括被DCL1加工为单特异性的约21个核苷酸的miRNA的成对茎-环前体、由具有2核苷酸的3’突出端的双链RNA前体表达单对的miRNA和miRNA*物质以及反式沉默特定靶。参见Bartel(2004)Cell，116：281-297；Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，6：376-385；Jones-Rhoades等人(2006)Annu.Rev.Plant Biol.，57：19-53；Ambros等人(2003)RNA，9：277-279。在反式作用siRNA(“ta-siRNA”)途径中，miRNA用于在为生产双链RNA前体而需要RNA依赖性RNA聚合酶的过程中引导siRNA初级转录物的同相位或者相型(in-phase)加工；反式作用siRNA由以下限定：没有二级结构、启动双链RNA生产的miRNA靶位点、需要DCL4和RNA依赖性RNA聚合酶(RDR6)，以及生产多个完全相位型约21个核苷酸的小RNA，其具有2-核苷酸的3’突出端的完全匹配的双链体(参见Allen等(2005)Cell，121：207-221)。
[0005]本发明公开了用于RNA介导的基因抑制的新途径，其基于称为“相位型小RNA基因座”的内源基因座，该基因座转录为形成单个回折结构的RNA转录物，该转录物在体内被相位性切割为多个能够抑制靶基因的小双链RNA(称为“相位型小RNA”)。相比于siRNA，相位型小RNA转录物被相位性切割。相比于miRNA，相位型小RNA转录物被DCL4或DCL4样直系同源核糖核酸酶(非DCL1)切割为大量能够沉默靶基因的小RNA。相比于ta-siRNA途径，相位型小RNA基因座转录为RNA转录物，该转录物形成杂合RNA，与RNA依赖性RNA聚合酶无关，且没有启动双链RNA生产的miRNA靶位点。基于相位型小RNA基因座设计的新重组DNA构建体可用于抑制一个或多个靶基因，无需使用miRNA、ta-siRNA或设计用于形成发夹结构以便加工为siRNA的表达载体。而且，对应于相位型小RNA的识别位点可用于在其中内源表达或作为转基因表达适宜的相位型小RNA的细胞或组织中抑制靶序列。
发明概述
[0006]一方面，本发明提供重组DNA构建体，其编码的转录物折叠为杂合RNA，该杂合RNA在体内被相位性切割为用于基因抑制的多个小双链RNA(“相位型小RNA”)，优选地，其中杂合RNA的产生与RNA依赖性RNA聚合酶无关，并被DCL4或DCL4样核糖核酸酶(例如得自任何单子叶或双子叶植物的DCL4直系同源物)在体内相位性切割。
[0007]本发明的另一方面提供重组DNA构建体，其包含的DNA转录为：(a)第一个系列的连续RNA区段，和(b)第二个系列的连续RNA区段，其中第一个系列的连续RNA区段在体内与第二个系列的RNA区段杂交，形成杂合RNA，其在体内被相位性切割为用于基因抑制的多个小双链RNA(“相位型小RNA”)。
[0008]又一方面，本发明提供重组DNA构建体，其含有有效连接在一起的启动子和转录为RNA的DNA，所述RNA包含：(a)至少1个可由在多细胞真核生物的特定细胞中表达的相位型小RNA识别的外源识别位点，和(b)要在特定细胞中抑制的靶RNA，其中靶RNA在非特定细胞的多细胞真核生物细胞中表达。
[0009]本发明的其它方面为使用本发明的重组DNA构建体为植物提供抗害虫或病原体的保护方法，以及在它们的基因组中包含本发明的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞、植物和种子。本发明的其它具体实施方案在以下的详述中公开。
附图简述
[0010]图1图示了非限制性杂合RNA，其在体内被相位性切割为多个本发明的小双链RNA(“相位型小RNA”)，如在实施例1中所述。
[0011]图2图示了基因组DNA序列(SEQ ID NO.9)的非限制性实例，其包含cDNA序列、内含子序列和回折臂，所述回折臂转录为本发明的杂合RNA，如在实施例1中所述。
[0012]图3图示了在玉米胚中使用重组DNA构建体进行基因沉默的结果，所述重组DNA构建体包含转录为RNA的DNA，所述RNA含有对应于至少1个本发明的相位型小RNA的识别位点，如在实施例2中所述。
[0013]图4图示了使用单个寡核苷酸探针对得自发育中的玉米粒的组织进行RNA印迹分析的结果，所述探针具有与内源相位型小RNA互补的序列，如在实施例2中所述。
[0014]图5图示了基于内源相位型小RNA基因座预测的相位型小RNA模板序列(SEQ ID NO.17)的二级结构，以及设计用于抑制多个靶基因的工程改造的基因抑制构建体(SEQ ID NO.32)的二级结构，如在实施例3中所述。
[0015]图6图示了在单个回折结构中含有杂合RNA的RNA转录物(SEQ ID NO.34)，所述回折结构由具有SEQ ID NO.33的序列的内源相位型小RNA基因座(LOC_Os12g42380.1|11982.m08017)预测，如在实施例4中所述。该基因座由水稻成熟颗粒和秧苗鉴定，并包含列于表4的相位型小RNA。该转录物(SEQ ID NO.34)包含5’侧翼序列(SEQ ID NO.66)和3’侧翼序列(SEQ ID NO.67)，以及位于回折结构的5’和3’臂之间的间隔区序列(SEQ ID NO.68)。转录物的5’和3’末端示于图的顶部；在图的底部显示转录物具有仅3个核苷酸的紧密转角或环。
[0016]图7A图示了沿着具有SEQ ID NO.33的序列的约2千碱基的相位型小RNA基因座的小RNA丰度，以每25万个序列的转录物(“tpq”)表示，如在实施例4中所述。图7B图示了该小RNA区域的展开图的小RNA丰度的21核苷酸分相。
[0017]图8图示了进一步表征Os06g21900相位型小RNA基因座的研究结果，如在实施例5中所述。图8A图示了对应于由Os06g21900相位型sRNA基因座克隆的前体的转录物。该前体包含的相位型小RNA分布在沿着转录物的两个区域之间。图8B图示了包含在该基因座中的两个外显子(外显子2和3，由阴影区指示)，其形成长的不完全的回折结构，该结构含有8个由约1.2kB的内含子分隔的21核苷酸的相位型小RNA。图8C图示了DNA印迹分析的结果，证实得自Os06g21900相位型sRNA基因座的相位型小RNA的表达存在于水稻籽粒中，但不存在于水稻籽苗或测试的其它植物物种中。图8D图示了转化的拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia(Col-0)生态型和突变体dcl1-7和dcl4-1的DNA印迹分析的结果；印迹用对应于相位型小RNA“P7”(SEQ ID NO.6)和“P5”(SEQ ID NO.4)、规范miRNA(miR173)和反式作用siRNA(ta-siR255)的探针分析。这些结果证实，Os06g21900相位型小RNA基因座在双子叶植物中被有效加工，并需要DCL4而非DCL1来进行相位性切割。
[0018]图9图示了由天然相位型小RNA基因座和合成相位型小RNA基因座的转录物预测的杂合RNA结构，如在实施例7中所述。图9A图示了内源Os06g21900相位型小RNA基因座(SEQ ID NO.69)的转录物的回折结构；图9B图示了由SEQ ID NO.77编码的合成相位型小RNA前体的回折结构。
发明详述
[0019]除非另有定义，否则所用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域的一般技术人员的通常理解具有相同含义。一般而言，所用的命名法和下述的生产或实验室程序在本领域众所周知并广泛使用。对这些程序使用常规方法，例如在本领域和多个一般性参考文献中提供的那些。除非另有说明，否则在本说明书文本中的核酸序列在由左至右阅读时以5’-3’方向给出。核酸序列可按照说明作为DNA或RNA提供；一个序列的公开内容必然限定另一个序列，这是本领域一般技术人员已知的。在术语以单数形式提供时，本发明还设想了以该术语的复数形式描述的本发明方面。所用的命名法和下述的实验室程序是本领域众所周知并常用的。在通过引用结合到本文中的参考文献中使用的术语和定义中存在分歧的情况下，在本申请中使用的术语应具有所给出的定义。所用的其它技术术语具有它们所使用领域的普通含义，如多个技术辞典所示例的。本发明人无意限制作用机制或作用方式。提供其参考文献仅为了阐述用途。
编码折叠为在体内被相位性切割的杂合RNA的转录物的重组DNA构建体
[0020]本发明提供重组DNA构建体，其编码的转录物折叠为杂合RNA，该杂合RNA在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA。所述“杂合RNA”是指已在基本互补的RNA链之间进行了Watson-Crick碱基配对的RNA，由此形成了在链间基本上但优选不完全碱基配对或退火的RNA；这与由两个形成完全双链RNA的完全或接近完全碱基配对的链进行的常规siRNA生产相反。在一个优选的实施方案中，“杂合RNA”包括为一个分子的组成部分的两条单链型RNA，其中两条单链基本上互补，并彼此反向平行排列，由此允许两条单链彼此碱基配对；通过分子内碱基配对形成杂合RNA。在备选的实施方案中，“杂合RNA”包括两条单链RNA，每条链都是独立分子的组成部分；通过分子间碱基配对形成杂合RNA。在特别优选的实施方案中，重组DNA编码形成回折结构的RNA转录物，该回折结构含有两个反向平行的单链臂，其中1条臂与另一条臂基本上但不完全互补，回折结构的两条臂之间的碱基配对产生基本上但不完全双链的包含错配的RNA；优选地，错配沿着杂合RNA(例如在21个连续核苷酸的给定区段中有至少1个错配)的长度分布，如在图1、图6和图8B中所示。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，杂合RNA包含来源于天然相位型小RNA基因座的转录物的结构，例如选自图1、图5、图6和图8B所示结构的结构。
[0021]杂合RNA独立于RNA依赖性RNA聚合酶产生；这与反式siRNA生产相反，在反式siRNA生产中，双链RNA通过RNA-依赖性RNA聚合酶的作用形成，RNA-依赖性RNA聚合酶使用原始RNA转录物作为模板合成互补链。优选地，形成杂合RNA的核苷酸是由重组DNA构建体转录的原始RNA转录物(“正”链)的核苷酸，而不是在第二个RNA分子上的核苷酸，例如在原始RNA转录物上通过RNA依赖性RNA聚合酶的作用形成的核苷酸(“负”链)。
[0022]体内“相位性切割”是指杂合RNA在体内被酶促加工或“切割”为较短的区段，其中切割位点沿着杂合RNA非随机分布。杂合RNA在体内被核糖核酸酶切割成多个较短的、基本上(但优选不完全)双链的区段，也就是说，多个小的基本上双链的RNA，它们以连续方式排列，如在图1、图6和图8B中所示；这与规范微RNA不同，在规范微RNA中，仅单个成熟微RNA由前体转录物显著累积。核糖核苷酸非随机地切割杂合RNA，产生多个相位型小双链RNA的频数分布；这与常规siRNA生产相反，在常规siRNA生产中，切割位点不产生siRNA的相位型频数分布。优选地，该频数分布的分相为约21个核苷酸，如在图7中所示。因此，由本发明的重组构建体产生的多个小双链RNA被称为“相位型小RNA”。术语“相位型小RNA”也适用于形成由本发明的重组构建体产生的给定小双链RNA的成对链的单链；在优选的实施方案中，所述成对链中的一条链累积至比另一条链更高的水平。
[0023]在优选的实施方案中，杂合RNA由非DCL1核糖核酸酶的核糖核酸酶在体内相位性切割。在最优选的实施方案中，杂合RNA在体内被DCL4或DCL4-样核糖核酸酶(例如得自任何单子叶或双子叶植物的DCL4直系同源物，例如但不限于商品化或农业用途的植物，如作物(尤其是用于人类食物或动物饲养的作物)、产木、产纤维、产浆或产纤维素的树和植物、蔬菜作物、果树和观赏植物，例如下文在标题“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”下列出的那些)相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA(“相位型小RNA”)。
[0024]在优选的实施方案中，杂合RNA在体内被相位性切割为至少3个小双链RNA(“相位型小RNA”)。本发明包含的各种实施方案包括重组DNA构建体，其分别产生3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13乃至更多个相位型小RNA。
[0025]每个相位型小RNA与下一个都是连续的；该排列的非限制性实例示于图1、图6和图8B。每个相位型小RNA包含两个反向平行的RNA区段，其每个均含有约20个至约27个核苷酸(例如20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸)。两个反向平行的RNA区段之间的碱基配对足以使它们形成基本上双链的RNA。在优选的实施方案中，每个小双链RNA或相位型小RNA都包含至少一个错配。错配一般包含一个或多个非碱基配对的核苷酸(在任一个区段上或在两个区段上)，在另外碱基配对的双链RNA中形成“曲折”或“凸出”或“环”。在优选的实施方案中，每个相位型小RNA均包含在一个或两个末端形成突出端的一个或多个未配对碱基；最优选地，突出端为2-核苷酸突出端，如在图1、图6和图8B中所示。
[0026]优选地，每个相位型小RNA均能够抑制靶基因。在一个实施方案中，相位型小RNA基因抑制1个靶基因；例如，每个相位型小RNA抑制单个靶基因的相同区段或单个靶基因的不同区段。在另一个实施方案中，相位型小RNA基因抑制多个靶基因。尽管本发明人没有将它们自身限于任何单一作用机制，但最优选的是，组成每个相位型小RNA的两条反向平行链之一与靶基因或序列基本上互补，或者接近完全互补，乃至完全互补，如下文的标题“靶基因”之下描述，其还提供了适宜靶基因的详细论述。
[0027]在本发明的优选实施方案中，重组DNA构建体包含来源于相位型小RNA模板序列的核苷酸序列，其选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.33、编码SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.69的DNA序列，其中至少1个在相位型小RNA模板序列中的21个连续核苷酸的区段被修饰，以抑制靶基因(即被修饰得抑制天然相位型小RNA的天然靶之外的基因)。在本发明的优选实施方案中，重组DNA构建体包含来源于相位型小RNA模板序列的核苷酸序列，其选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.17、SEQID NO.33、编码SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.69的DNA序列，其中约20个至约28个(例如20、21、22、23、24、25、26、27或28个)连续核苷酸的多个区段被修饰，使得转录物在体内被相位性切割为多个用于抑制靶基因的合成相位型小RNA。
[0028]在本发明的另一个优选实施方案中，重组DNA构建体包含至少一个核苷酸序列，其选自SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.27、编码SEQ ID NO.66的DNA序列、编码SEQ ID NO.67的DNA序列和编码SEQ ID NO.68的DNA序列。
转录为第一个系列和第二个系列的连续RNA区段的重组DNA构建体，所述连续RNA区段形成在体内被相位性切割的杂合RNA
[0029]本发明的另一方面提供重组DNA构建体，其含有的DNA转录为：(a)第一个系列的连续RNA区段，和(b)第二个系列的连续RNA区段，其中第一个系列的连续RNA区段在体内与第二个系列的RNA区段杂交，形成杂合RNA，其在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA(“相位型小RNA”)。该重组DNA构建体可以包含天然相位型小RNA基因座，例如在本文公开内容中描述，或者可以包括非天然的合成序列。最优选地，杂合RNA被DCL4或DCL4-样核糖核酸酶(例如得自任何单子叶植物或双子叶植物的DCL4直系同源物，例如在下文的标题“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”之下列出的那些)相位性切割。
[0030]在重组DNA构建体的优选实施方案中，每个RNA区段均由20-27个核苷酸组成。在特别优选的实施方案中，第一个和第二个系列包含21个核苷酸的RNA区段。构成特定小双链RNA(“相位型小RNA”)的每对小RNA可以为相同长度，也可以为不同长度，例如图8B和表4中所示。在优选的实施方案中，构成特定小双链RNA(“相位型小RNA”)的小RNA对为21个核苷酸的小RNA对。在一个实施方案中，连续RNA区段全部为相同大小。在优选的实施方案中，RNA区段全部由21个核苷酸组成。在另一个实施方案中，RNA区段大小可变；优选地，它们按照大小排列，使得当第一个系列和第二个系列的连续RNA区段杂交时，单个区段的排列方式允许相位性切割为预期的小双链RNA。在优选的实施方案中，第一个和第二个系列的连续RNA区段包含相等数量的RNA区段，它们的排列使得当第一个系列和第二个系列的连续RNA区段杂交并形成RNA双链体(杂合RNA)时，第一个系列中的给定大小的RNA区段与第二个系列中的等同大小的相应RNA区段杂交。
[0031]在重组DNA构建体的优选实施方案中，杂合RNA的链位于一个分子上，构建体进一步含有转录为间隔区的DNA，所述间隔区连接第一个和第二个系列的连续RNA区段。间隔区一般包含不对应于靶基因(尽管在某些实施方案中可以包含靶基因的有义或反义序列)的DNA。间隔区包含至少约4个核苷酸；在各个实施方案中，间隔区包含至少约4个、至少约1O个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个或至少约150个核苷酸。在一个实施方案中，间隔区为来源于天然相位型小RNA基因座的转录物的间隔区的连续核苷酸序列。间隔区的非限制性实例由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.68以及与SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.68中的任一个具有至少90％的序列同一性的间隔区提供。
[0032]在一个实施方案中，间隔区设计用于转录为单链RNA或至少部分双链的RNA(例如为“吻合茎环”排列)，或者转录为呈现以下二级结构或三维构象(例如靶基因或适体的反义序列的大环)的RNA：其赋予转录物另外的所需特征，例如增加的稳定性、增加的体内半衰期或者细胞或组织特异性。在一个实施例中，间隔区被转录为稳定环，其连接第一个和第二个系列的连续RNA区段(参见例如DiGiusto和King(2004)J.Biol.Chem.，279：46483-46489)。在另一个实施例中，间隔区转录为RNA，其含有使相位型小RNA细胞或组织特异性靶向的RNA适体(例如结合细胞特异性配体的适体)。
[0033]在许多实施方案中，重组DNA构建体进一步包含编码5’侧翼序列(例如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.66)和/或3’侧翼序列(例如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.67)的DNA，所述侧翼序列与为杂合RNA的转录物部分邻接。在重组DNA构建体的其它实施方案中，杂合RNA的链位于不同分子上。本发明的优选实施方案包含重组DNA构建体，该构建体含有至少一个来源于天然相位型小RNA基因座转录物的核苷酸序列，所述转录物选自5’侧翼序列、3’侧翼序列和间隔区序列。非限制性实施方案包括含有至少一个核苷酸序列的重组DNA构建体，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.27、编码SEQ ID NO.66的DNA序列、编码SEQ ID NO.67的DNA序列和编码SEQ ID NO.68的DNA序列。本发明的其它实施方案包括含有至少1个核苷酸序列的重组DNA构建体，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.27、编码SEQ ID NO.66的DNA序列、编码SEQ ID NO.67的DNA序列和编码SEQ ID NO.68的DNA序列中的任一个具有至少90％的序列同一性。
[0034]本发明的重组DNA构建体设计用于抑制一个或多个如在下文的标题“靶基因”之下描述的靶基因。设计构建体，使得第一个系列的每个RNA区段都与第二个系列的RNA区段杂交；由构建体转录的转录物在体内被相位性切割，产生多个对应于成对杂合RNA区段的小双链RNA(“相位型小RNA”)。优选地，每个相位型小RNA都包含至少一个错配。错配一般包含一个或多个非碱基配对的核苷酸(在任一个区段上或在两个区段上)，在其它碱基配对的双链RNA中形成“曲折”或“凸出”或“环”。在优选的实施方案中，每个相位型小RNA均包含在一个或两个末端形成突出端的一个或多个未配对碱基；最优选地，突出端为2-核苷酸突出端，如在图1、图6和图8B中所示。在优选的实施方案中，至少1个相位型小RNA设计用于抑制一个或多个靶基因；即，组成相位型小RNA的两个反向平行链之一基本上与靶基因互补。
[0035]设计第一个和第二个系列的连续RNA区段，使得当第一个系列和第二个系列的连续RNA区段杂交并形成RNA双链体(杂合RNA)时，由杂合RNA相位性切割产生的小双链RNA沉默一个或多个靶基因。最优选地，维持转录物的二级结构，使得与天然相位型小RNA基因座的二级结构(例如在图1、图6和图8B中所示)基本类似。
[0036]设计对应于针对沉默靶基因的相位型小RNA、可用于制备本发明的重组DNA构建体的RNA区段的一般方法包括以下步骤：
(a)例如通过使用序列比对工具如BLAST(参见例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.，215：403-410；Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.，25：3389-3402)，选择对例如玉米cDNA和基因组DNA数据库的靶基因特异性的至少18个核苷酸的独特靶序列，以鉴定目标转录物直系同源物和对不相关基因的任何潜在匹配，由此避免无意的非靶序列沉默。
(b)分析靶基因的不需要序列(例如匹配非靶物种尤其是动物的序列)，并记录每个潜在19聚体区段的GC含量、Reynolds记分(参见Reynolds等人(2004)Nature Biotechnol.，22：326-330)以及以自由能的负差(“ΔΔG”)表征的功能不对称(参见Khvorova等人(2003)Cell，115：209-216)。优选地，选择具有以下的全部或大部分特征的19聚体：(1)Reynolds记分＞4，(2)GC含量在约40％至约60％之间，(3)负ΔΔG，(4)末端腺苷，(5)没有4个以上的相同核苷酸的连续排列；(6)邻近靶基因的3’末端定位；(7)与工程改造的相位型siRNA前体转录物的差异最小。优选地，选择多个(3个以上)19聚体进行测试。
(c)测定用于制备合成的21聚体相位型小RNA的选定19聚体的反向互补物；在20位的附加核苷酸优选与选定的靶序列匹配，优选选择在21位的核苷酸为不配对的，以防止在靶转录物上散布沉默；
(d)在例如土壤杆菌(Agrobacterium)介导的瞬时本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)测定中测试合成的相位型小RNA对于siRNA表达和靶抑制的影响。和
(e)将最有效的相位型小RNA克隆入构建体中，以实现玉米的稳定转化(参见在标题“制备和使用重组DNA构建体”和“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”之下的章节)。
[0037]重组DNA构建体通过常用技术制备，例如在标题“制备和使用重组DNA构建体”之下描述的和在工作实施例中阐述的那些。如下文的“转基因植物细胞和转基因植物”之下所论述，重组DNA构建体尤其可用于制备转基因植物细胞、转基因植物和转基因种子。
含有外源相位型小RNA识别位点的重组DNA构建体
[0038]本发明的另一方面包括重组DNA构建体，其含有有效连接在一起的启动子和转录为RNA的DNA，所述RNA包含：(a)至少1个可由在多细胞真核生物的特定细胞中表达的相位型小RNA识别的外源识别位点，和(b)在特定细胞中将被抑制的靶RNA，其中靶RNA在非特定细胞的多细胞真核生物的细胞中表达。外源识别位点包含RNA序列，其与相位型小RNA基本上互补或接近完全互补乃至完全互补；外源识别位点与相位型小RNA杂交，导致靶RNA抑制或沉默。相位型小RNA可以由天然或内源相位型小RNA基因座转录，或者由转基因表达的合成相位型小RNA基因座转录。在重组DNA构建体的各个实施方案中，至少1个外源识别位点位于以下的至少1个中：(a)靶RNA的5’非翻译区；(b)靶RNA的3’非翻译区；和(c)靶RNA。
[0039]在非限制性实施方案中，具有选自以下的核苷酸序列的相位型小RNA识别并沉默外源识别位点：SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64和65。在优选的实施方案中，具有选自以下的核苷酸序列的相位型小RNA识别并沉默外源识别位点：SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、35、37、38、39、40、41、42、43、45、46、49、51、52、53、54、55、56、60、61、62、63、64和65。在特别优选的实施方案中，具有选自以下的核苷酸序列的相位型小RNA识别并沉默外源识别位点：SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、37、38、40、41、46、61、62、63、64和65。
非天然转基因植物细胞和转基因植物
[0040]本发明的又一方面提供在其基因组中具有任何本发明的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞。因此，本发明人要求保护在其基因组中具有重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞，所述重组DNA构建体编码的转录物折叠成杂合RNA，其在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA。本发明人还要求保护在其基因组中具有重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞，所述重组DNA构建体含有的DNA被转录为：(a)第一个系列的连续RNA区段，和(b)第二个系列的连续RNA区段，其中第一个系列的连续RNA区段在体内与第二个系列的RNA区段杂交，形成杂合RNA，其在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA(“相位型小RNA”)。本发明人进一步要求保护在其基因组中具有重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞，所述重组DNA构建体包含有效连接在一起的启动子和转录为RNA的DNA，所述RNA含有：(a)至少一个可被在多细胞真核生物的特定细胞中表达的相位型小RNA识别的外源识别位点，和(b)要在特定细胞中被抑制的靶RNA，其中靶RNA在非特定细胞的多细胞生物的细胞中表达。
[0041]还提供含有本发明的非天然转基因植物细胞的非天然转基因植物、由本发明的非天然转基因植物细胞生长的非天然转基因植物以及由非天然转基因植物生产的非天然转基因种子。本发明的非天然转基因植物包括任何发育期的植物，并包括由本文公开的非天然转基因植物细胞制备的非天然转基因再生植物，或者再生植物的非天然转基因子代植物(其可为近交或杂种子代植物)，或者此非天然转基因植物的非天然转基因种子。还提供并要求保护在其基因组中具有本发明的重组DNA构建体的非天然转基因种子。本发明的非天然转基因植物细胞、非天然转基因植物和非天然转基因种子通过本领域众所周知的方法制备，如在下文的标题“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”之下所述。
[0042]非天然转基因植物细胞可以包括分离的植物细胞(例如个体植物细胞或在人工培养基当中或之上生长的细胞)，或者可以包括在未分化组织(例如愈伤组织或任何植物细胞聚集体)中的植物细胞。非天然转基因植物细胞可以包括在至少一种分化组织中的植物细胞，所述分化组织选自叶(例如叶柄和叶片)、根、茎(例如块茎、根茎、匍匐枝、鳞茎和球茎)、柄(例如木质部、韧皮部)、木质、种子、果实(例如坚果、颗粒、新鲜果实)和花(例如雄蕊、花丝、花粉囊、花粉、心皮、雌蕊、子房、胚珠)。
[0043]本发明的非天然转基因植物细胞或非天然转基因植物可以为任何合适的目标植物细胞或植物。瞬时转化和稳定转化的植物细胞均包含在本发明中。特别优选稳定转化的转基因植物。在许多优选的实施方案中，非天然转基因植物是能育转基因植物，可由其收获种子，本发明进一步要求保护这类转基因植物的非天然转基因种子，其中所述种子优选还含有本发明的重组构建体。
[0044]在本发明的某些实施方案中，非天然植物是非天然转基因植物，植物的所有细胞(单倍体细胞可能除外)和组织均包含本发明的重组DNA构建体。在其它实施方案中，非天然植物不是完全转基因的，但都包含非天然转基因细胞或组织和非转基因的细胞或组织(例如嫁接到非转基因组织上的转基因组织)。在非限制性实施方案中，植物包含含有转基因植物细胞的非转基因接穗和转基因砧木，其中非转基因接穗和转基因砧木一起嫁接。这样的实施方案尤其可用于其中植物通常作为嫁接到砧木上的接穗(其中接穗和砧木可为相同物种或变种或者不同物种或变种的接穗和砧木)进行植物生长的情况；非限制性实例包括葡萄(例如酿酒葡萄和鲜食葡萄)、苹果、梨、温柏、鳄梨、柑橘、核果(例如桃、李子、油桃、杏、樱桃)、猕猴桃、玫瑰以及其它农业或观赏价值的植物。
[0045]本发明还包含这样的非天然植物：其就重组DNA已导入其基因组中的意义而言不是转基因的，但是其具有的基因组已通过非重组DNA技术的方法人工修饰。天然基因组序列的这类人工修饰包括插入、缺失、置换、移码、转座、复制和倒位。天然基因组序列的人工修饰通过任何方法实现，包括通过化学品(例如甲磺酸盐、甲基甲磺酸盐、硫酸二乙酯、亚硝基胍和其它烷基化剂、碱基类似物如5-溴-脱氧尿嘧啶、螯合剂如溴化乙锭、交联剂如铂以及氧化剂如亚硝酸或活性氧物质)诱变或通过物理处理(例如暴露于紫外线、放射性同位素或致电离辐射)诱变。这类诱变可以为随机的或非随机的(例如定点诱变)。诱变可以用完整植物、植物组织或植物细胞进行。诱变的一个非限制性实例是用烷基化剂处理玉米花粉。诱变一般对群体进行，之后筛选该群体，以允许选择具有所需特性的个体。这些非天然植物可以类似于以下对转基因植物所述的方式使用；例如，它们可被栽培用于生产种子或其它可收获的部分，或用于栽培子代(包括杂种代)。
靶基因
[0046]本发明的相位型小RNA和编码其的重组DNA构建体可设计用于抑制任何靶基因或基因。靶基因可为可翻译的(编码)序列，或者可以为非编码序列(例如非编码调节序列)，或这二者，并可以包含至少一个选自以下的基因：真核生物靶基因、非真核生物靶基因、微RNA前体DNA序列和微RNA启动子。靶基因针对其中重组DNA构建体被转录的细胞(例如植物或动物的细胞)可为天然的或内源的，或者对其中重组DNA构建体被转录的植物或动物的害虫或病原体可为天然的。靶基因可为外源基因，例如植物中的转基因。靶基因可为被靶向抑制的天然基因，伴有或不伴有外源转基因的同时表达，例如通过在由其转录相位型小RNA的重组DNA构建体或者在单独的重组DNA构建体中包含基因表达元件。例如，可能需要用外源转基因同源物置换天然基因。
[0047]靶基因可包括被靶向抑制的单个基因或部分单个基因，或者可以包括例如靶基因的多个连续区段、靶基因的多个非连续区段、靶基因的多个等位基因或一个或多个物种的多个靶基因。靶基因序列可包括来自任何物种(包括但不限于非真核生物，例如细菌和病毒；真菌；植物，包括单子叶和双子叶植物，例如作物、观赏植物和非家种的或野生的植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；以及脊椎动物，例如两栖动物、鱼、鸟、驯养或野生哺乳动物乃至人)的任何序列。
[0048]在一个实施方案中，靶基因对其中重组DNA构建体将转录的植物为外源的，但对植物的害虫或病原体(例如病毒、细菌、真菌、卵菌，和无脊椎动物，例如昆虫、线虫和软体动物)为内源的。靶基因可以包括多个靶基因，或者一个或多个基因的多个区段。在一个优选实施方案中，靶基因或基因为植物的无脊椎害虫或病原体的一个或多个基因。这些实施方案尤其可用于提供对一种或多种植物害虫或病原体有抗性的转基因植物，例如对线虫(例如大豆孢囊线虫或根结线虫)有抗性，或对害虫有抗性，或对至少一种致病病毒、细菌或真菌有抗性。
[0049]靶基因可为可翻译的(编码)序列，或者可为非编码序列(例如非编码调节序列)，或这二者。靶基因的非限制性实例包括非翻译(非编码)序列，例如但不限于5’非翻译区、启动子、增强子或其它非编码转录区、3’非翻译区、终止子和内含子。靶基因包括编码微RNA、小干扰RNA、核糖体或核酶的RNA组分、核仁小RNA和其它非编码RNA的基因(参见例如在rfam.wustl.edu公开提供的非编码RNA序列；Erdmann等(2001)Nucleic Acids Res.，29：189-193；Gottesman(2005)Trends Genet.，21：399-404；Griffiths-Jones等(2005)Nucleic AcidsRes.，33：121-124)。靶基因的一个具体实例包括微RNA识别位点(即在成熟miRNA结合并诱导切割的RNA链上的位点)。靶基因的另一个具体实例包括转基因植物的害虫或病原体的天然微RNA前体序列，即编码微RNA的初级转录物，或由该初级转录物加工的RNA中间体(例如限于核的pri-miRNA或可由核输出至胞质的pre-miRNA)。参见例如Lee等(2002)EMBO Journal，21：4663-4670；Reinhart等(2002)Genes & Dev.，16：161611626；Lund等(2004)Science，303：95-98；以及Millar和Waterhouse(2005)Funct.Integr Genomics，5：129-135。靶基因还可以包括编码转录因子的基因和编码酶的基因的可翻译的(编码)序列，其涉及目标分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖和其它碳水化合物、生物聚合物和次级代谢物，包括生物碱、萜类、聚酮化合物、非核糖体肽以及混合生物合成源的次级代谢物)的生物合成或分解代谢。
[0050]在许多优选实施方案中，靶基因是植物害虫或病原体的必需基因。必需基因包括害虫或病原体发育为可育生殖成体所需要的基因。必需基因包括在被沉默或抑制时导致生物体(例如成体或于任何发育阶段的生物体，包括配子)死亡或生物体不能成功繁殖(例如雄性或雌性亲代的不育性或对接合体、胚或幼虫的致死性)的基因。线虫必需基因的描述见于例如Kemphues，K.“Essential Genes”(2005年12月24日)，WormBook编辑，The C.elegans Research Community，WormBook，doi/10.1895/wormbook.1.57.l，可于www.wormbook.org在线获得。线虫必需基因的非限制性实例包括主要精子蛋白、RNA聚合酶II和几丁质合酶(参见例如美国专利申请公布号US20040098761A1)；其余的大豆孢囊线虫必需基因在2006年2月23日申请的美国专利申请11/360,355中提供。昆虫基因的描述在果蝇(Drosophila)基因组数据库(可于flybase.bio.indiana.edu/在线获得)中可公开获得。业已通过基于细胞培养物的RNA干扰筛选分析了大部分预测的果蝇基因的功能，产生438个已鉴别的必需基因；参见Boutros等(2004)Science，303：832-835以及可于www.sciencemag.org/cgi/content/full/303/5659/832/DC1在线获得的支持材料。细菌和真菌必需基因的描述在必需基因数据库(“DEG”，可于tubic.tju.edu.cn/deg/在线获得)中提供；参见Zhang等(2004)NucleicAcids Res.，32：D271-D272。
[0051]无脊椎的植物害虫包括但不限于线虫害虫、软体动物害虫(鼻涕虫和蜗牛)和昆虫害虫。目标植物病原体包括真菌、卵菌、细菌(例如引起叶斑病、火疫、冠瘿和细菌性萎蔫病的细菌)、柔膜细菌和病毒(例如引起花叶病、脉结病、斑纹(flecking)、斑点(spotting)或异常生长的病毒)。另参见G.N.Agrios，“Plant Pathology”(第4版)，Academic Press，San Diego，1997，635页关于真菌、细菌、柔膜细菌(包括支原体和螺原体)、病毒、线虫、寄生性高等植物和带鞭毛的原生动物的描述，所有这些都是目标植物害虫或病原体。另参见在美国植物病理学学会的“Common Names of Plant Diseases”上持续更新的植物害虫和病原体以及由它们引起的疾病的汇编，该汇编由美国植物病理学学会的植物疾病常用名标准化委员会编撰，1978-2005，可于www.apsnet.org/online/common/top.asp在线获得。
[0052]特定目标真菌植物病原体的非限制性实例包括例如引起白粉病、锈病、叶斑病和叶枯病、猝倒病、根腐病、颈腐病、棉铃腐病、茎溃疡病、枝溃疡病、维管萎蔫病、黑穗病或霉病的真菌，包括但不限于镰孢菌属(Fusarium spp.)、层锈菌属(Phakospora spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、赤霉菌属(Gibberella spp.)、梨孢属(Pyricularia spp.)和链格孢属(Alternaria spp.)。真菌植物病原体的具体实例包括亚洲大豆锈菌病(Phakosporapachirhizi)、玉米锈病(Puccinia sorghi)、南方玉米锈病(Pucciniapolysora)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和其它镰刀菌属(Fusariumspp.)、交链孢属(Alternaria spp.)、青霉菌属(Penicillium spp.)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、玉米黑粉病菌(Ustilago maydis)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)(玉米赤霉菌(Gibberella zeae))、串珠镰刀菌(Fusarium verticilliodes)(串珠赤霉菌(Gibberella moniliformis))、F.proliferatum(藤仓赤霉(G.fujikuroi)var.intermedia))、胶孢镰刀菌(F.subglutinans)(尖粘镰刀菌(G.subglutinans))、马伊德壳色单隔孢(Diplodia maydis)、丝黑穗病菌(Sporisorium holci-sorghi)、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)、玉蜀黍出芽短梗霉菌(Aureobasidium zeae)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)和在美国专利6,194,636(整体在此引入作为参考)的表4和5中提供的众多真菌物种。植物病原体的非限制性实例包括先前分类为真菌但最近分类为卵菌的病原体。特定目标卵菌植物病原体的具体实例包括腐霉菌属(Pythium)成员(例如瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum))和疫霉菌属(Phytophthora)成员(例如晚疫霉菌(Phytophthora infestans)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae))以及引起霜霉病的生物体(例如甜菜霜霉病菌(Peronospora farinosa))。
[0053]细菌病原体的非限制性实例包括引起萎黄病的支原体和螺原体，例如引起玉米矮缩病的玉米矮缩螺原体(Spiroplasmakunkelii)；真细菌，例如燕麦假单胞菌(Pseudomonas avenae)、须芝草假单胞菌(Pseudomonas andropogonis)、玉米细菌性枯萎欧文氏菌(Erwinia stewartii)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonassyringae pv.syringae)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；以及在美国专利6,194,636的表3中列出的众多细菌物种，该专利整体在此引入作为参考。
[0054]特定目标病毒植物病原体的非限制性实例包括玉米矮花叶病毒(MDMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV，以前称为MDMV B株)、小麦条纹花叶病毒(WSMV)、玉米枯黄矮小病毒(MCDV)、大麦黄矮病毒(BYDV)、香蕉束顶病毒(BBTV)以及以下实施例7和美国专利6,194,636的表2中列出的众多病毒，所述专利整体在此引入作为参考。
[0055]无脊椎害虫的非限制性实例包括孢囊线虫属(Heterodera spp.)，尤其是大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)、根癌线虫属(Meloidogyne spp.)、冠矛线虫属(Hoplolaimus spp.)、矮化线虫属(Tylenchorhynchus spp.)、螺旋线虫属(Helicotylenchus spp.)、根腐线虫(Pratylenchus spp.)、环线虫属(Criconema spp.)、叶芽线虫属(Aphelenchus spp.或Aphelenchoides spp.)、玉米根虫、绿盲蝽(Lygusspp.)、蚜虫和类似的吸液昆虫，例如根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae)、玉米螟、切根虫、粘虫、叶蝉、日本金龟子、蚱蜢和其它鞘翅目、双翅目和鳞翅目害虫。无脊椎害虫的具体实例包括能够侵袭作物根系统的害虫，例如北方玉米根虫(Diabrotica barberi)、南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata)、西方玉米根虫(Diabrotica virgifera)、玉米根蚜虫(Anuraphis maidiradicis)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、透翅切根夜蛾(Crymodes devastator)、番茄褐夜蛾(Feltia ducens)、泥背地老虎(Agrotis gladiaria)、梳爪叩头虫(Melanotus spp.，Aeolus mellillus)、金针虫(wireworm)(麦金针虫(Aeolus mancus))、砂地金针虫(Horistonotusuhlerii)、玉米长喙象(Sphenophorus maidis)、梯牧草象甲(Sphenophoruszeae)、早熟禾象甲(Sphenophorus parvulus)、南方玉米长喙象(Sphenophorus callosus)、食叶鳃金龟(Phyllophaga spp.)、玉米种蝇(灰地种蝇(Delia platura))、葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea)、玉米籽粟褐步甲(Stenolophus lecontei)和玉米籽细步甲(Clivinia impressifrons)。以及在美国专利6,194,636的表6中列出的寄生线虫，该专利整体在此引入作为参考。
[0056]尤其处于但不限于南半球地区(包括南美洲和中美洲)的特定目标无脊椎害虫包括蚜虫、玉米根虫、夜蛾、夜蛾科(noctuideae)、薯虫、盲蝽属(Lygus spp.)、任何半翅类昆虫、同翅类昆虫或异翅类昆虫、任何鳞翅类昆虫、任何鞘翅类昆虫、线虫、切根虫、穗虫、粘虫、蛀虫、卷叶蛾等。本发明特别包含的节肢动物害虫包括多种切根虫物种，包括切根虫(Agrotis repleta)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、切根虫(Anicla ignicans)、斑点夜蛾(granulate cutworm)(Feltia subterranea)、“gusano áspero”(Agrotis malefida)；地中海粉螟(Anagasta kuehniella)、方颈谷盗(Cathartus quadricollis)、跳甲(Chaetocnema spp)、米蛾(Corcyra cephalonica)、玉米根虫或“vaquita de San Antonio”(Diaboticaspeciosa)、甘蔗螟虫(Diatraea saccharalis)、小玉米茎蛀虫(Elasmopalpuslignosellus)、褐蝽(Euschistus spp.)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、长角谷盗(Laemophloeus minutus)、稻草尺蛾(Mocis latipes)、锯胸粉扁(Oryzaephilus surinamensis)、大斑粉螟(Pyralis farinalis)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、玉米叶蚜(Rhopalosiphum maidis)、brownburrowing bug或“chinche subterranean”(Scaptocoris castanea)、麦二叉蚜(Schizaphis graminum)、谷象(Sitophilus zeamais)、麦蛾(Sitotrogacerealella)、秋天行军虫(Spodoptera frugiperda)、大谷盗(Tenebroidesmauritanicus)、二点红蜘蛛(Tetranychus urticae)、赤拟谷盗(Triboleumcastaneum)、斜纹夜蛾(Alabama argillacea)、棉象虫(Anthonomusgrandis)、棉蚜(Aphis gossypii)、甘薯粉虱(Bemisia tabaci)、多种蓟马物种(蓟马属(Frankliniella spp.))、棉花穗虫(Helicoverpa zea)、“orugabolillera”(例如Helicoverpa geletopoeon)、烟草夜蛾幼虫(Heliothisvirescens)、椿(Nezara viridula)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、细须螨(叶螨属(Tetranychus spp.))、烟蓟马(Thrips tabaci)、温室粉虱(Trialeurodes vaporarium)、豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、玉米斑点叶甲或“astilo moteado”(Astylusatromaculatus)、“oruga de la alfalfa”(Colias lesbia)、“chinche marrón”或“chinche de los cuernos”(Dichelops furcatus)、“alquiche chico”(Edessamiditabunda)、斑蝥虫(豆芫菁属(Epicauta spp.))、“barrenador del brote”(夜小卷蛾(Epinotia aporema))、“oruga verde del yuyo Colorado”(Loxostege bifidalis)、根结线虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.))、“orugacuarteadora”(Mocis repanda)、南方绿椿象(Nezara viridula)、“chinchede la alfalfa”(Piezodorus guildinii)、苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、尺蛾“isoca medidora del girasol”(Rachiplusia nu)、yellow woolybear(Spilosoma virginica)、yellowstripedarmyworm(Spodoptera ornithogalli)、多种根象虫(象甲科)、多种铁线虫(叩甲科)和多种蛴螬(金龟科)。本发明特别包含的线虫害虫包括玉米线虫害虫(刺线虫属(Belonolaimus spp.)、毛刺线虫属(Trichodorus spp.)、长针线虫属(Longidorus spp.)、锥线虫属(Dolichodorus spp.)、粒线虫属(Anguina spp.)、根腐线虫属(Pratylenchus spp.)、根结线虫属(Meloidogyne spp.)、胞囊线虫属(Heterodera spp.))、大豆线虫害虫(大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)、根结线虫属(Meloidogyne spp.)、刺线虫属(Belonolaimus spp.))、香蕉线虫害虫(Radopholus similis、根结线虫属(Meloidogyne spp.)、螺旋线虫属(Helicotylenchus spp.))、甘蔗线虫害虫(Heterodera sacchari、短体线虫属(Pratylenchus spp.)、根结线虫属(Meloidogyne spp.))、橙线虫害虫(半穿刺线虫属(Tylenchulus spp.)、穿孔线虫属(Radopholus spp.)、刺线虫属(Belonolaimus spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.)、剑线虫属(Xiphinema spp.))、咖啡线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.))、椰子树线虫害虫(伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus spp.))、番茄线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)、刺线虫属(Belonolaimus spp.)、珍珠线虫属(Nacobbus spp.))、葡萄线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)、剑线虫属(Xiphinema spp.)、半穿刺线虫属(Tylenchulus spp.)、环线虫属(Criconemella spp.))、柠檬和酸橙线虫害虫(半穿刺线虫属(Tylenchulusspp.)、穿孔线虫属(Radopholus spp.)、刺线虫属(Belonolaimus spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.)、剑线虫属(Xiphinema spp.))、可可线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)、肾形线虫(Rotylenchulusreniformis))、菠萝线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.)、肾形线虫(Rotylenchulus reniformis))、番木瓜线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)、肾形线虫(Rotylenchulusreniformis))、柚子线虫害虫(半穿刺线虫属(Tylenchulus spp.)、穿孔线虫属(Radopholus spp.)、刺线虫属(Belonolaimus spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.)、剑线虫属(Xiphinema spp.)和蚕豆线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.))。
[0057]害虫的靶基因可包括无脊椎动物的主要精子蛋白、α微管蛋白、β微管蛋白、空泡ATP酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、RNA聚合酶II、几丁质合酶、细胞色素、miRNA、miRNA前体分子、miRNA启动子的基因以及其它基因，例如在美国专利申请公布号2006/0021087A1、PCT专利申请号PCT/US05/11816中和在美国专利申请公布号2004/0098761A1的表II中公开的基因，所述专利在此引入作为参考。病原体的靶基因可包括病毒翻译起始因子、病毒复制酶、miRNA、miRNA前体分子、真菌微管蛋白、真菌空泡ATP酶、真菌几丁质合酶、真菌MAP激酶、真菌Pac1 Tyr/Thr磷酸酶、参与营养运输的酶(例如氨基酸转运体或糖转运体)、参与真菌细胞壁生物合成的酶、角质素酶(cutinase)、黑素生物合成酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶酶、果胶裂解酶、纤维素酶、蛋白酶的基因，与植物无毒基因相互作用的基因和其它在感染植物中参与病原体的侵入和复制的基因。因此，靶基因对其中要转录重组DNA构建体的植物不需要是内源的。编码本发明的相位型小RNA的重组DNA构建体可在植物中转录，并用于抑制可能侵扰植物的病原体或害虫的基因。
[0058]适宜的靶基因的具体的非限制性实例还包括氨基酸分解代谢基因(例如但不限于编码赖氨酸-酮戊二酸还原酶(LKR)和酵母氨酸脱氢酶(SDH)的玉米LKR/SDH基因及其同源物)、玉米醇溶蛋白基因、参与脂肪酸合成的基因(例如植物微粒体脂肪酸去饱和酶和植物酰基-ACP硫酯酶，例如但不限于在美国专利号6,426,448、6,372,965和6,872,872中公开的那些酶)、参与其中对调节一种或多种中间体的水平可能有意义的多步生物合成途径的基因，例如编码用于聚羟基链烷酸酯生物合成的酶的基因(参见例如美国专利第5,750,848号)；和编码细胞周期控制蛋白的基因，例如具有细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂样活性的蛋白(参见例如在国际专利申请公布号WO 05007829A2中公开的基因)。靶基因可包括编码不需要的蛋白(例如变应原或毒素)或用于生物合成不需要的化合物的酶(例如不需要的调味或气味组分)的基因。因此，本发明的一个实施方案是通过抑制变应原或毒素改善的转基因植物或这类植物的组织，例如具有降低的变应原性的花生、大豆或小麦籽粒。靶基因可包括涉及果实成熟的基因，如多聚半乳糖醛酸酶。靶基因可包括其中表达优选限于特定细胞或组织或发育阶段的基因，或其中表达优选为瞬时的基因，也就是说，其中不一定需要组成性或整体性抑制或扩散到许多组织的抑制的基因。因此，适宜的靶基因的其它实例包括编码蛋白的基因，所述蛋白在转基因植物中表达时使转基因植物抗害虫或病原体(参见例如在美国专利第5,763,245号中公开的胆固醇氧化酶的基因)；其中表达为害虫或病原体诱导的基因；以及可诱导或恢复育性的基因(参见例如在美国专利第6,759,575号中描述的barstar/barnase基因)；在本段落中提及的所有出版物和专利都整体在此引入作为参考。
[0059]可通过设计相位型小RNA，以包含与非靶基因序列基本不相同的区域，使相位型小RNA设计用于更特异性地抑制靶基因。非靶基因可包括任何非目标性沉默或抑制的基因，无论是在含有编码相位型小RNA的重组DNA构建体的植物中还是在可能与相位型小RNA接触的生物体中。非靶基因序列可包括来自任何物种(包括但不限于非真核生物，例如细菌，和病毒；真菌；植物，包括单子叶和双子叶植物，例如作物、观赏植物和非家种的或野生植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；以及脊椎动物，例如两栖动物、鱼、鸟、驯养或野生哺乳动物乃至人)的任何序列。
[0060]在一个实施方案中，靶基因是对给定物种如给定的植物(例如但不限于农学上或商业上重要的植物，包括单子叶和双子叶植物)为内源的基因，非靶基因可为例如非靶物种如另一个植物物种的基因，或者病毒、真菌、细菌、无脊椎动物或脊椎动物乃至人的基因。一个非限制性实例为其中相位型小RNA设计用于抑制靶基因的情况，所述靶基因为对单个物种(例如西方玉米根虫(Diabrotica virgiferavirgifera LeConte))为内源的基因，但不抑制非靶基因，例如来自相关甚至密切相关的物种(例如北方玉米根虫(Diabrotica barberi Smith andLawrence)或南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata))的基因。
[0061]在其它实施方案(例如需要抑制多个物种之间的靶基因的情况)中，可能需要设计相位型小RNA来抑制其中要沉默靶基因的多个物种共有的靶基因序列。因此，可设计对一个分类特异性的(例如对属、科乃至更大的分类如门(例如病毒或节肢动物门)特异性的)但对其它分类(例如植物或脊椎动物或哺乳动物)非特异性的编码相位型小RNA的重组DNA构建体。在该实施方案的一个非限制性实例中，可选择编码相位型小RNA的重组DNA构建体，以便靶向病原性真菌(例如镰孢菌属(Fusarium spp.))，但不靶向有益真菌的任何基因序列。
[0062]在该实施方案的另一个非限制性实例中，可选择用于在玉米根虫中进行基因沉默的相位型小RNA，以对叶甲(Diabrotica)属的所有成员都是特异性的。在该实施方案的又一个实例中，可选择此靶向叶甲(Diabrotica)的相位型小RNA，以便不靶向来自有益的鞘翅类昆虫(例如通常称为瓢虫的食肉性瓢虫(predatory coccinellid beetle))或其它有益的昆虫物种的任何基因序列。
[0063]用于沉默靶基因的RNA的所需特异性程度取决于多种因素。这些因素可包括预期通过核糖核酸酶(优选DCL4或DCL4直系同源物)对杂合RNA的作用产生的相位型小RNA的大小，以及降低相位型小RNA抑制非靶基因的潜力的相对重要性。在非限制性实例中，在预期相位型小RNA为21个碱基对大小的情况下，一个特别优选的实施方案包括用于沉默靶基因的RNA，所述靶基因编码与非靶基因序列基本不同的区域，例如其中包含至少21个核苷酸的每个连续片段都在非靶基因序列的21个连续核苷酸中匹配低于21个的核苷酸区域，例如低于21个，或低于20个，或低于19个，或低于18个，或低于17个。在另一个实施方案中，与非靶基因序列基本不同的区域包括其中包含至少19个核苷酸的每个连续片段都在非靶基因序列的19个连续核苷酸中匹配低于19个的核苷酸区域，例如少于19个，或低于18个，或低于17个，或低于16个。
[0064]在某些实施方案中，可能需要设计用于沉默靶基因的相位型小RNA，以包含预期不产生不需要的多肽的区域，例如通过筛选编码相位型小RNA或每个组成相位型小RNA的重组DNA构建体，用于可编码已知的不需要多肽或这些多肽的紧密同源物的序列。不需要的多肽包括但不限于与已知的变应原性多肽同源的多肽和与已知的多肽毒素同源的多肽。编码这些潜在不需要的变应原性肽的公开可获得的序列是可用的，例如食品变态反应研究和资源计划(FARRP)变应原数据库(可在allergenonline.com获得)或食品安全数据库的生物技术信息(可在www.iit.edu/～sgendel/fa.htm获得)(另参见例如Gendel(1998)Adv.Food Nutr.Res.，42：63-92)。不需要的序列还可以包括例如那些注释为已知毒素或潜在的或已知的变应原的多肽序列，这些多肽序列包含在公开可获得的数据库中，例如GenBank、EMBL、SwissProt等，它们可通过Entrez系统(www.ncbi.nih.gov/Entrez)检索。不需要的潜在变应原性肽序列的非限制性实例包括大豆的大豆球蛋白、花生的油质蛋白和凝集素、小麦的麦谷蛋白、得自牛乳的酪蛋白、乳清蛋白和乳球蛋白，以及得自多种贝类的原肌球蛋白(allergenonline.com)。不需要的潜在毒性肽的非限制性实例包括破伤风梭菌(Clostridium tetani)的破伤风毒素tetA、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的腹泻毒素，以及毒液，例如岩螺属(Conus spp.)的芋螺毒素以及节肢动物和爬行动物的神经毒素(www.ncbi.nih.gov/Entrez)。
[0065]在一个非限制性实例中，筛选编码相位型小RNA或每个组成相位型小RNA的重组DNA构建体，以消除那些所编码多肽与已知的变应原或毒素在8个连续氨基酸内具有完全的同源性或在至少80个氨基酸内具有至少35％同一性的可转录序列；这样的筛选可在两个方向对任何以及所有可读框、对以AUG(在对应的DNA中为ATG)开始的潜在开放可读框或对所有可能的读框进行，与它们是否以AUG(或ATG)开始无关。当获得“命中结果”或匹配时，即在鉴定出所编码的潜在多肽与已知的变应原或毒素在8个连续氨基酸内具有完全同源性(或在至少约80个氨基酸内具有至少约35％同一性)的序列时，可在选择序列用于沉默靶基因的RNA时避免、消除或改变对应于命中结果的核酸序列。在一个实施方案中，设计编码相位型小RNA或每个组成相位型小RNA的重组DNA构建体，所以不包含以AUG(在对应的DNA中为ATG)开始的潜在开放读框。
[0066]可通过本领域技术人员已知的众多方法中的任一种避免、消除或改变不需要的序列。在某些情况下，结果可为一般认为天然不存在的新序列。例如，可将“干净的”序列一起连接成在编码相位型小RNA的重组DNA构建体中使用的新嵌合序列，由此避免某些序列。
[0067]申请人认识到，在某些dsRNA介导的基因沉默中，不完全匹配的dsRNA序列有可能对基因沉默有效。例如，业已表明，miRNA互补部位中心附近的错配对miRNA的基因沉默的作用强于更远处定位的错配。参见例如Mallory等(2004)EMBO J.，23：3356-3364中的图4。在另一个实施例中，业已报道，错配碱基对的位置和形成错配的核苷酸的身份均影响给定siRNA沉默靶基因的能力，而除G:U摆动碱基对之外的腺嘌呤-胞嘧啶错配被良好耐受(参见Du等(2005)Nucleic Acids Res.，33：1671-1677)。因此，每个相位型小RNA不需要总是与目标靶基因具有100％的序列互补性，而是一般应优选与目标靶基因具有显著的序列互补性，例如与目标靶基因具有约95％、约90％、约85％或约80％序列互补性。优选将杂合RNA(或每个组成相位型小RNA或RNA区段)的一条链设计得与目标靶(例如靶信使RNA或靶非编码RNA)具有显著互补性，例如与目标靶具有约95％、约90％、约85％或约80％互补性。在非限制性实例中，对于由两条21个核苷酸的链组成的组成相位型小RNA而言，两条21个核苷酸的链中的一条与靶RNA的21个连续核苷酸显著但不完全互补；优选在21位的核苷酸与靶RNA中的对应位置不匹配，以防止传递性。
[0068]相对于给定的其它标准(例如但不限于与目标靶基因的序列同一性百分率或给定序列的预测基因沉默效率)的重要性，本领域技术人员应能够判断给予筛选预测对靶基因具有更高特异性的区域或预测不产生不需要的多肽的区域的重要性。例如，对于相位型小RNA可能需要在几种物种间有活性，因此本领域技术人员可确定，更重要的是在编码相位型小RNA的重组DNA构建体中包含对几种目标物种特异性的区域，而筛选预测具有较高基因沉默效率的区域或预测产生不需要的多肽的区域不够重要。
相位型小RNA与杀虫组合物的组合
[0069]本发明的相位型小RNA和编码此相位型小RNA的重组DNA构建体可用于控制植物害虫和病原体，因此本发明进一步要求保护控制植物害虫和病原体的方法，该方法向至少一种需要防止害虫或病原体侵扰的植物细胞提供本发明的相位型小RNA。相位型小RNA一般通过在植物细胞中体内转录本发明的重组DNA构建体来提供。
[0070]用本发明的相位型小RNA控制害虫和病原体的方法可以与控制植物害虫和病原体的其它方法或组合物组合使用。因此，本发明还提供用于控制植物害虫和病原体的方法组合和组合物组合。在优选的实施方案，要组合的方法通过不同机制运行，为植物提供抗害虫或病原体的保护。例如，可通过提供设计用于沉默无脊椎害虫的基因的替代基因抑制元件(例如通过在植物中转基因表达的常规双链RNA转录物产生的工程改造过的微RNA或工程改造过的siRNA)来控制无脊椎害虫；参见例如在美国专利申请公布号2006/0200878中公开的多种用于基因抑制的重组DNA构建体和方法，该专利申请在此引入作为参考。
[0071]一个非限制性实例是控制植物昆虫害虫的方法，包括提供至少一种设计用于沉默昆虫害虫基因的相位型小RNA和提供昆虫害虫对其敏感的杀昆虫剂(例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)或“Bt”杀昆虫蛋白)。当在昆虫害虫膳食中提供Bt蛋白时(例如经由局部应用于植物或通过在植物中转基因表达)，表现出的控制昆虫害虫的作用模式与使用相位型小RNA的方法和组合物的作用模式显著不同。在优选的实施方案中，所述组合产生在控制昆虫侵扰的领域中先前不知道的协同作用。转基因植物产生一种或多种相位型小RNA分子，其抑制目标害虫的某些必需的生物学功能，连同一种或多种对目标害虫有毒的Bt杀虫蛋白一起提供了令人惊讶的协同作用。一种协同作用是降低相位型小RNA或Bt杀虫蛋白所需的表达水平。在组合在一起时，所需的每种害虫控制剂的有效剂量得以降低。
[0072]另一个非限制性实例是控制植物病毒害虫的方法，包括提供至少一个设计用于沉默病毒病原体基因的相位型小RNA和诱导病毒外壳蛋白介导的对植物抗性的组合物(例如通过在植物细胞中转基因表达病毒外壳蛋白)。在优选的实施方案中，所述组合使两种保护性组件协同增效，因而降低了每种病原体控制剂的有效剂量。
制备和使用重组DNA构建体
[0073]本发明的重组DNA构建体通过适于拟定申请的任何方法制备，考虑到例如在其中要转录构建体的植物中所需的表达类型和使用便利性。制备和使用DNA构建体和载体的一般方法在本领域众所周知，并详细描述于例如手册和实验室指引，包括Sambrook和Russell，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(第三版)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY，2001。对构建转化用的DNA构建体和载体有用的技术的实例公开于美国专利申请公布号2004/0115642A1，该申请在此引入作为参考。DNA构建体还可以使用GATEWAYTM克隆技术(可得自Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)构建，该技术使用来自噬菌体λ载体构建的Integrase/att系统的位点特异性重组酶LR克隆反应，而不是限制性内切核酸酶和连接酶。LR克隆反应公开于美国专利5,888,732和6,277,608以及美国专利申请公布号2001/283529、2001/282319和2002/0007051，所有这些文献都在此引入作为参考。GATEWAYTM克隆技术操作说明书也由Invitrogen提供，其提供了将任何需要的DNA常规克隆入含可操作的植物表达元件载体的简要说明。另一个替代的载体制造方法使用不依靠连接的克隆，其公开内容参见例如Aslandis等(1990)Nucleic Acids Res.，18：6069-6074和Rashtchian等(1992)Biochem.，206：91-97，其中将具有单链5’和3’末端的DNA片段对至少一种其它DNA片段的互补性5′和3′单链末端退火，产生随后可在体内连接和扩增的所需载体。
[0074]在某些实施方案中，重组DNA构建体的DNA序列包括已对其中要表达重组DNA构建体的植物进行了密码子优化的序列。例如，可以通过本领域已知的方法，可以使要在植物中表达的重组DNA构建体的序列的全部或部分(例如第一个基因抑制元件或基因表达元件)对植物表达进行密码子优化。参见例如美国专利5,500,365关于植物密码子优化的描述，该专利在此引入作为参考；另参见DeAmicis和Marchetti(2000)Nucleic Acid Res.，28：3339-3346。
制备和使用转基因植物细胞和转基因植物
[0075]在本发明的重组DNA构建体用于生产本发明的非天然转基因植物细胞、非天然转基因植物或非天然转基因种子的情况时，转化可包括任一种众所周知并已证实的方法和组合物。适用于植物转化的方法实际上包括任何可将DNA导入细胞中的方法，例如通过直接递送DNA(例如通过PEG介导的原生质体转化、电穿孔、与碳化硅纤维一起搅拌和加速包被DNA的颗粒)、通过土壤杆菌介导的转化、通过病毒或其它载体等。一个优选的植物转化方法是例如在美国专利5,015,580(大豆)、5,550,318(玉米)、5,538,880(玉米)、6,153,812(小麦)、6,160,208(玉米)、6,288,312(水稻)和6,399,861(玉米)和6,403,865(玉米)中描述的微粒轰击，所有这些专利都在此引入作为参考。
[0076]植物转化的另一个优选方法是土壤杆菌介导的转化。在一个优选实施方案中，本发明的非天然转基因植物细胞利用含二元Ti质粒系统的土壤杆菌通过转化获得，其中土壤杆菌携带第一种Ti质粒和第二种嵌合质粒，该嵌合质粒含野生型Ti质粒的至少一个T-DNA边界、在转化的植物细胞中有功能并与本发明的基因抑制构建体有效连接的启动子。参见例如在美国专利5,159,135中描述的二元系统，该专利在此引入作为参考。另参见De Framond(1983)Biotechnology，1：262-269；和Hoekema等，(1983)Nature，303：179。在此二元系统中，含一个或多个T-DNA边界的较小质粒可便利地构建并在适宜的替代宿主如大肠杆菌中操作，然后转移入土壤杆菌中。
[0077]用于土壤杆菌介导的植物(尤其是作物)转化的详细程序包括例如在美国专利5,004,863、5,159,135、5,518,908、5,846,797和6,624,344(棉花)；5,416,011、5,569,834、5,824,877、5,914,451、6,384,301和7,002,058(大豆)；5,591,616、5,981,840和7,060,876(玉米)；5,463,174和5,750,871(芸苔，包括油菜籽和油菜)和在美国专利申请公布号2004/0244075(玉米)、2004/0087030(棉花)和2005/0005321(大豆)中公开的程序，所有专利都在此引入作为参考。土壤杆菌介导的转化的其它程序公开于WO9506722(玉米)。已对许多植物物种报告了类似的方法，既有双子叶植物，也有单子叶植物，其中尤其包括花生(Cheng等(1996)Plant Cell Rep.，15：653)；芦笋(Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：5345)；大麦(Wan和Lemaux(1994)Plant Physiol.，104：37)；水稻(Toriyama等(1988)Bio/Technology，6：10；Zhang等(1988)Plant Cell Rep.，7：379)；小麦(Vasil等(1992)Bio/Technology，10：667；Becker等(1994)Plant J.，5：299)、苜蓿(Masoud等(1996)Transgen.Res.，5：313)；芸苔(Radke等(1992)Plant Cell Rep.，11：499-505)和番茄(Sun等(2006)Plant Cell Physiol.，47：426-431)。另参见美国专利申请公布号2003/0167537A1关于转化的拟南芥植物的载体、转化方法和生产的描述，其中转录因子通过CaMV35S启动子组成型表达，该专利申请在此引入作为参考。非天然转基因植物细胞和转基因植物还可以通过用其它载体转化获得，例如但不限于病毒载体(例如烟草蚀纹马铃薯Y病毒(TEV)、大麦条斑花叶病毒(BSMV)和在Edwardson和Christie“The Potyvirus Group：Monograph No.16，1991，Agric.Exp.Station，Univ.of Florida”中提及的病毒)、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)或在使用适宜的转化方案时的任何其它适宜的克隆载体，所述适宜的转化方案例如为细菌感染(例如采用如上所述的土壤杆菌)、二元细菌人工染色体构建体、直接递送DNA(例如经PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA摄取、电穿孔、与碳化硅纤维一起搅拌和微粒轰击)。对本领域一般技术人员应当显而易见的是，可使用和改变多种转化方法，用于由众多目标植物物种生产稳定的转基因植物。
[0078]提供含稳定整合的重组DNA的非天然转基因植物细胞和非天然转基因植物的转化方法优选在介质上的组织培养物中和受控的环境中实施。“介质”是指用于体外(即在完整的活体生物外部)培养细胞的众多营养混合物。受体细胞靶包括但不限于分生组织细胞、愈伤组织、不成熟胚或部分胚，以及配子细胞，例如小孢子、花粉、精细胞和卵细胞。任何可由其再生能育植株的细胞都可用作实施本发明的受体细胞。愈伤组织可由多种组织源发端，包括但不限于不成熟胚或部分胚、实生顶端分生组织、小孢子等。能够作为愈伤组织增殖的那些细胞可用作遗传转化的受体细胞。用于制备本发明的转基因植物的实际转化方法和材料(例如多种介质和受体靶细胞、不成熟胚的转化以及随后的能育转基因植物的再生)公开于例如美国专利6,194,636和6,232,526以及美国专利申请公布号2004/0216189，所述专利在此引入作为参考。
[0079]在一般的转化实践中，DNA在任一种转化试验中都被导入到仅少部分靶细胞中。一般使用标记基因来提供用于鉴别那些细胞的有效系统，所述细胞通过接受转基因DNA构建体并将其整合入它们的基因组中而被稳定转化。优选的标记基因提供了赋予对选择剂(例如抗生素或除草剂)抗性的选择标记。任何抗生素或除草剂(植物细胞对其可产生抗性)，都可以是有用的选择剂。潜在转化的细胞与选择剂接触。在存活细胞群中，存活细胞将是那些其中赋予抗性的基因通常被整合并以允许细胞存活的足够水平表达的细胞。可测试细胞，以进一步证实重组DNA的稳定整合。常用的选择标记基因包括对赋予抗生素(例如卡那霉素或巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)和庆大霉素(aac3和aacC4))抗性或除草剂(例如草铵膦(bar或pat)和草甘膦(EPSPS))抗性的那些基因。有用的选择标记基因和选择剂的实例描述于美国专利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047，所有这些专利都在此引入作为参考。特别优选的除草剂抗性基因是在美国专利申请公布号2007/0079393A1中作为SEQ ID NO.68公开的草甘膦乙酰转移酶，该专利特别地在此引入作为参考。还可以使用可筛选的标记或报告体，例如提供目测鉴别转化体的能力的标记。有用的可筛选标记的非限制性实例包括例如表达的蛋白通过作用于发色底物(例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(uidA)或萤光素酶(luc))而产生可检测颜色或者自身可检测(例如绿色荧光蛋白(GFP)(gfp)或免疫原性分子)的基因。本领域技术人员将认识到，许多其它有用的标记或报告体是可用的。
[0080]可通过任何适宜的方法，包括蛋白检测方法(例如蛋白质印迹、ELISA和其它免疫化学方法)、测量酶活性或核酸检测方法(例如DNA印迹、RNA印迹、PCR、RT-PCR、原位荧光杂交)，检测或测量重组DNA构建体在本发明的非天然转基因植物细胞中的转录。这样的方法是本领域一般技术人员周知的，以众多可获得的手册为证；参见例如Joseph Sambrook和David W.Russell，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，2001；Frederick M.Ausubel等(编辑)“Short Protocols in MolecularBiology”(第5版)，John Wiley and Sons，2002；John M.Walker(编辑)“Protein Protocols Handbook”(第2版)，Humana Press，2002；和Leandro
(编辑)“Transgenic Plants：Methods and Protocols”，Humana Press，2004。
[0081]在本发明的非天然转基因植物细胞中，用于检测或测量重组DNA构建体的转录的其它适宜方法包括测量其中转录重组DNA的转基因植物细胞中的靶基因抑制的直接或代理指示的任何其它性状(相对于其中不转录重组DNA的细胞)，例如毛重或显微形态性状、生长速率、产量、繁殖或募集速率、对害虫或病原体的抗性或对生物或非生物胁迫(例如水分亏缺胁迫、盐胁迫、营养胁迫、热或冷胁迫)的抗性。这些方法可使用表型性状的直接检测或代理测定(例如在植物中，这些测定包括植物部分测定，例如叶或根测定，以测定非生物胁迫的耐受性)。非限制性方法包括直接测量对无脊椎害虫的抗性(例如对植物组织的伤害)或代理测定(例如植物产量测定或生物测定，例如在国际专利申请公布号WO2005/110068A2和美国专利申请公布号US 2006/0021087A1中描述的西方玉米根虫(Diabrotica virgiferavirgifera LeConte)幼虫生物测定，所述专利在此引入作为参考，或者由Steeves等人(2006)Funct.Plant Biol.，33：991-999描述的大豆孢囊线虫生物测定，其中检测每植株的孢囊、每克根的孢囊、每植株的卵、每克根的卵和每孢囊的卵。
[0082]本发明的重组DNA构建体例如可通过表达或抑制其它基因与其它重组DNA堆叠，用于赋予其它性状(例如就转化植物而言，性状包括除草剂抗性、害虫抗性、发芽耐冷性、水分亏缺耐受性等)。用于协同降低和增加基因表达的构建体公开于美国专利申请公布号2004/0126845A1，该专利申请在此引入作为参考。
[0083]可收获转基因育性植物的种子并用于培育在其基因组中包含重组DNA构建体的本发明非天然转基因植物的子代，包括杂种代。因此，除了用本发明的重组DNA构建体直接转化植物之外，本发明的非天然转基因植物可通过使具有重组DNA的第一种植物与没有该构建体的第二种植物杂交制备。例如，可将重组DNA导入经历转化以产生转基因植物的植物系中，该植物系可与第二种植物系杂交，以将重组DNA渐渗入获得的子代中。本发明的转基因植物可与具有其它重组DNA的植物系杂交，所述其它重组DNA赋予一种或多种另外的性状(例如但不限于除草剂抗性、害虫或疾病抗性、环境逆境抗性、改良的营养物含量和产量改善)，以产生具有赋予期望的靶序列表达行为和另外性状这二者的重组DNA的子代植物。
[0084]通常，在这种用于组合性状的育种中，表现出额外性状的转基因植物是雄性系，携带基本性状的转基因植物是雌性系。此杂交的子代分离，使得一些植株将携带两个亲代性状的DNA，一些将携带一个亲代性状的DNA；这些植株可利用与亲代重组DNA相关的标记来鉴别。携带两个亲代性状的DNA的子代植株可与雌性亲代系多次回交，例如通常6-8代，以产生除其它转基因亲代系的重组DNA之外与一个原始转基因亲代系具有大致相同的基因型的子代植物。
[0085]本发明的又一方面为由本发明的非天然转基因种子培育的非天然转基因植物。本发明涉及直接由含重组DNA的转基因种子培育的转基因植物以及植物子代，包括近交或杂种植物系，其通过使直接由转基因种子培育的转基因植物与不是由相同转基因种子培育的第二种植物杂交获得。
[0086]杂交可以包括例如以下步骤：
(a)第一种亲代植物(例如非转基因的或转基因的)和按照本发明为转基因的第二种亲代植物的植物种子；
(b)将第一种和第二种亲代植物的种子培育成开花植物；
(c)用第二种亲代的花粉传粉第一种亲代的花；和
(d)收获带有已受精的花的亲代植物上产生的种子。
[0087]经常需要将重组DNA渐渗入到原种中，例如通过回交，以将特别需要的性状由一个来源转移至没有该性状的近交植物或其它植物。这可例如通过优良近交系(“A”)(回交亲本)与供体近交系(“B”)(非回交亲本)首先杂交实现，所述供体近交系携带适宜的所述性状的基因，例如按照本发明制备的构建体。首先在获得的子代中选择该杂交子代的将需要由非回交亲本“B”转移的目标性状，然后将选定的子代与优良的回交亲本“A”回交。在5代或更多代具有选择的目标性状的回交之后，子代对控制要转移的特征的基因座是半合子，但对大部分或几乎全部的其它基因而言象优良亲代一样。最后的回交代应自交，以产生对要转移的基因为纯系的子代，即一个或多个转化事件。
[0088]通过一系列育种操作，选定的DNA构建体可由一个系移至完全不同的系中，不需要进一步的重组操作。人们可因此生产对一个或多个DNA构建体为纯种的近交系植物。通过杂交不同的近交植物，人们可生产大量的具有不同DNA构建体组合的不同杂种。以此方式可生产具有经常与杂种相关的需要的农学特性(“杂种优势”)以及1个或多个DNA构建体赋予的所需特征的植物。
[0089]遗传标记可用于帮助将本发明的一个或多个DNA构建体由一种遗传背景渐渗入到另一种遗传背景中。帮助选择的标记相对于常规育种提供的优势在于，其可用于避免由表型改变引起的错误。此外，遗传标记可提供有关特定杂交的个体子代中的原种种质的相对程度的数据。例如，当具有需要性状的植物(其具有非农学需要的遗传背景)与原种亲代杂交时，遗传标记可用于选择不仅具有目标性状而且具有相对大比例的需要种质的子代。以此方式，使将一种或多种性状渐渗入到特定遗传背景中所需代数最小。在本发明的非天然转基因植物的育种中帮助选择的标记的有效性以及有用的分子标记的类型(例如但不限于SSR和SNP)论述于PCT申请公布号WO 02/062129和美国专利申请公布号2002/0133852、2003/0049612和2003/0005491，它们每个均整体在此引入作为参考。
[0090]在本发明的某些非天然转基因植物细胞和非天然转基因植物中，可能需要同时表达(或抑制)目标基因，同时还调节靶基因的表达。因此，在某些实施方案中，转基因植物包含重组DNA，该重组DNA包含用于表达至少一种目标基因的转基因转录单元和用于抑制靶基因的基因抑制元件。
[0091]因此，如本文所述，本发明的非天然转基因植物细胞或非天然转基因植物可通过使用本领域已知的或目前公开的任何适宜的瞬时或稳定的、整合或非整合的转化方法获得。重组DNA构建体可在任何植物细胞或组织中或在任何发育阶段的全株中转录。转基因植物可来源于任何单子叶或双子叶植物，例如但不限于商业或农业用途的植物，例如作物(尤其是用于人类食物或动物饲料的作物)、产木、产纤维、产浆或产纤维素的树和植物、蔬菜植物、果树和观赏植物。目标植物的非限制性实例包括谷类作物(例如小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、黑小麦、水稻、黍、高粱、昆诺阿藜、苋和荞麦)；草料作物(例如饲草和草料双子叶植物，包括苜蓿、野豌豆、三叶草等)；油籽作物(例如棉花、红花、向日葵、大豆、油菜、油菜籽、亚麻、花生和油椰子)；树类坚果(例如胡桃、腰果、榛果、美洲山核桃、扁桃、澳大利亚坚果等)；甘蔗、椰子、海枣、橄榄、甜菜、茶和咖啡；产木、产纤维、产浆或产纤维素的树和植物(例如棉花、亚麻、黄麻、苎麻、剑麻、洋麻、柳枝稷和竹)；蔬菜作物，例如豆类(例如菜豆、豌豆、小扁豆、苜蓿、花生)、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、旱芹、胡萝卜、萝卜、木薯、甘薯、山药、可可、咖啡、茶、芸苔属植物(例如甘蓝、羽衣甘蓝、芥菜和其它叶状芸苔、椰菜、花椰菜、芽甘蓝、芜箐、球茎甘蓝)、食用葫芦科植物(例如黄瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜)、食用葱属植物(例如洋葱、大蒜、韭菜、葱、细香葱)、食用茄科成员(例如番茄、茄子、马铃薯、胡椒、灯笼果)和食用藜科成员(例如甜菜、牛皮菜、菠菜、昆诺阿藜、苋)；结果作物，例如苹果、梨、柑橘类水果(例如橙子、酸橙、柠檬、柚子等)、核果(例如杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠萝、葡萄、猕猴桃、番木瓜、鳄梨、无花果、芒果和浆果；以及观赏植物，包括开花观赏植物、观赏树木和灌木、观赏地被植物和观赏草类。优选的双子叶植物包括但不限于油菜、椰菜、甘蓝、胡萝卜、花椰菜、大白菜、黄瓜、干豆、茄子、茴香、四季豆、葫芦、莴苣、甜瓜、秋葵、豌豆、胡椒、西葫芦、萝卜、菠菜、南瓜、西瓜、棉花、马铃薯、昆诺阿藜、苋、荞麦、红花、大豆、糖甜菜和向日葵。优选的单子叶植物包括但不限于小麦、燕麦、大麦、玉米(包括甜玉米和其它变种)、黑麦、黑小麦、水稻、观赏草类和饲草、高粱、黍、洋葱、韭葱和甘蔗，更优选玉米、小麦和水稻。
[0092]植物转化的最终目标是生产可用于人的植物。在这方面，本发明的非天然转基因植物实际上可用于被认为对种植者或消费者有价值的任何用途。例如，人们可能希望收获转基因植物自身，或者收获用于种植目的的转基因植物的转基因种子，或者可由转基因植物或其种子获得产品，例如油、淀粉、乙醇或其它发酵产物、动物饲料或人类食品、药物以及各种工业产品。例如，玉米被广泛用于食品和饲料工业以及工业用途。玉米用途的其它论述可见于例如通过引用结合到本文中的美国专利号6,194,636、6,207,879、6,232,526、6,426,446、6,429,357、6,433,252、6,437,217和6,583,338以及PCT公布号WO 95/06128和WO 02/057471。因此，本发明还提供由本发明的非天然转基因植物细胞、植物或种子生产的商品产品，包括但不限于收获的叶、根、枝、块茎、茎、果实、种子或其它植物部分、粗粉、油、提取物、发酵或消化产物、碾碎的或完整的植物粒或种子，或者任何食品或非食品产品，包括由本发明的转基因植物细胞、植物或种子生产的这些商品产品。在本文涉及的一种或多种商品或商品产品中，本发明重组DNA构建体的一种或多种核酸序列的检测实际上证明了商品或商品产品包含或来源于本发明的转基因植物细胞、植物或种子。
[0093]在优选的实施方案中，由本发明的非天然转基因植物细胞制备的非天然转基因植物，即在其基因组中具有本发明的重组DNA构建体的转基因植物，相对于没有该重组DNA构建体的植物具有至少一种另外的改变性状，所述性状选自以下性状：
(a)改善的非生物逆境耐受性；
(b)改善的生物逆境耐受性；
(c)改变的初级代谢物组成；
(d)改变的次级代谢物组成；
(e)改变的微量元素、类胡罗卜素或维生素组成；
(f)改善的产量；
(g)改善的使用氮或其它营养的能力；
(h)改变的农艺性状；
(i)改变的生长或繁殖特征；和
(j)改善的收获、储存或加工品质。
[0094]在特别优选的实施方案中，非天然转基因植物的特征在于：改善的非生物逆境耐受性(例如水分亏缺或干旱、热、冷、非最佳营养或盐水平、非最佳光照水平的耐受性)或生物逆境耐受性(例如拥挤、植化相克或受伤)；改变的初级代谢物(例如脂肪酸、油类化合物、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成；改变的次级代谢物(例如生物碱、萜类化合物、聚酮化合物、非核糖体肽和混合生物合成源的次级代谢物)组成；改变的微量元素(例如铁、锌)、类胡萝卜素(例如β-胡罗卜素、番茄红素、黄体素、玉米黄质或其它类胡萝卜素和叶黄素)或维生素(例如生育酚)组成；改善的产量(例如在非逆境条件下改善的产量或在生物或非生物逆境下改善的产量)；改善的使用氮或其它营养的能力；改变的农艺性状(例如延迟成熟；延迟衰老；早熟或晚熟；改善的耐荫性；改善的根或茎倒伏抗性；改善的茎“green snap”抗性；改变的光周期响应)；改变的生长或繁殖特征(例如有意矮化；例如可用于改善的杂交程序的有意雄性不育；改善的营养生长速率；改善的萌发；改善的雄性或雌性育性)；改善的收获、储存或加工品质(例如储存期间改善的耐虫性、改善的抗破坏性、改善的消费者吸引力)；或任何这些性状的组合。
[0095]在一个优选实施方案中，非天然转基因种子或非天然转基因植物生产的种子具有改变的初级代谢物(例如脂肪酸、油类化合物、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成；改变的次级代谢物(例如生物碱、萜类化合物、聚酮化合物、非核糖体肽和混合生物合成源的次级代谢物)组成；改变的微量元素(例如铁、锌、硫)、有机磷酸(例如植酸)、类胡萝卜素(例如β-胡罗卜素、番茄素、黄体素、玉米黄质或其它类胡萝卜素和叶黄素)或维生素(例如生育酚)组成，以及改善的收获、储存或加工品质，或这些的组合。例如，可能需要改变作物(例如油菜、棉花、红花、大豆、甜菜、向日葵、小麦、玉米或水稻)种子的氨基酸(例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或总蛋白)、油类物质(例如脂肪酸组成或总油类物质)、碳水化合物(例如单糖或淀粉)、微量元素、类胡萝卜素或维生素含量，优选组合改善的种子收获、储存或加工品质，并因此提供用于动物饲料或人类食品的改善的种子。在另一个实例中，可能需要改变植物组织中多糖(例如淀粉、纤维素或半纤维素)的数量或质量，从而用于动物饲料或人类食品，或用于发酵或生物燃料生产。在另一种情况下，可能需要改变转基因植物或转基因植物种子的天然组分的水平，例如降低具有低水平赖氨酸、甲硫氨酸或色氨酸的蛋白的水平，或增加所需氨基酸或脂肪酸的水平，或降低变应原性蛋白或糖蛋白(例如花生变应原，包括ara h 1，小麦变应原，包括麸朊和麦谷蛋白，大豆变应原，包括P34变应原、球朊、大豆球蛋白和伴大豆球蛋白)或毒性代谢物(例如木薯中的生氰糖苷、茄科成员中的茄属生物碱)的水平。
实施例
实施例1
[0096]本实施例描述了编码折叠为杂合RNA的转录物的DNA的非限制性实施方案，所述杂合RNA在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA。更具体地说，本实施例提供得自单子叶作物的、可用于制备单个重组DNA分子的核酸序列，所述重组DNA分子编码的转录物折叠为在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA的杂合RNA，与RNA依赖性RNA聚合酶无关。
[0097]通过高通量测序由成熟水稻(Oryza sativa)籽粒和多个玉米(Zea mays)组织克隆了几个RNA文库(Margulies等人(2005)Nature，437：376-380)。在由成熟稻粒和玉米根、32DAP(授粉后天数)和39DAP颗粒克隆的最丰富序列为在表1中列出的7个21聚体RNA(SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7)。
表1
| SEQID NO. | 克隆编号 | DNA序列 | 物种/组织＊ |
| 1 | 141121 | ATGCAAGTGATGTAGCGCCCC | 水稻籽粒、玉米根、玉米32DAP和39DAP颗粒 |
| 2 | 297263 | ATATAGGAGTCACTCAGGAAA | 水稻籽粒、玉米32DAP颗粒 |
| 3 | 1196700 | TCTTTGCCCTCTTTAGTGCTT | 水稻籽粒、玉米32DAP颗粒 |
| 4 | 880479 | TATGGATGGGCACCATCTTCA | 水稻籽粒、玉米32DAP颗粒 |
| 5 | 1275002 | TGGCCACCAACAACATCAGCA | 水稻籽粒、玉米32DAP颗粒 |
| 6 | 1379342 | TGCCCCACCAAGAGAACGCCG | 水稻籽粒、玉米根、玉米叶、玉米32DAP和39DAP颗粒 |
| 7 | 544819 | TGCCTGAGGAACACCACCAGG | 水稻籽粒、玉米根、玉米32DAP和39DAP颗粒 |
*DAP，授粉后天数
[0098]这7个21聚体RNA在与基因座Os6g21900处的水稻基因组比对时，分别位于含有首尾相连排列的7个和6个21核苷酸的siRNA的两个邻接区域中，并形成在图1中所示的单个回折结构。在其它文库中不存在来自该基因的siRNA，且只有极少数由回折结构的臂之间的推测环区测序。另外的测序结果表明，该回折结构含有至少3个其它潜在的21聚体RNA(与前7个21聚体和环同相位并远离)，尽管预测由这些另外的相位型小双链RNA的体内切割产生的小RNA仅以低丰度被克隆。
[0099]尽管鉴定出小RNA的许多变体，但只有正链的单个独特的21-核苷酸(21-nt)相位得到序列信息支持(表2)。“相位丰满度”表明有多少个21-nt相位被两条链中的测序小RNA占据；例如对于读框7.0和相位长度8的0.5丰满度表明正链中的全部8个21-nt读框都被占据，但在假定的负链中没有被占据。“相唯一性”代表相位型小RNA的概率记分，其考虑了小RNA在每个相位中的相位占有率和丰度。读框16.1和读框7.0代表回折结构的每一侧(示于图1，显示了前7个相位型小RNA)及其相位型小RNA丰度；该结构的分相得到高度支持(唯一性＞0.97)，而所有其它潜在的小RNA相位都没有得到序列数据支持(唯一性＜0.005)。
表2
| 读框 | 起始(相编号) | 相长度 | 相丰满度 | 相唯一性 | 小RNA丰度 | 平均拷贝 |
| 16.1 | 5099(1)，5120(2)，5141(3)，5162(4)，5183(5)，5204(6)，5246(8) | 8 | 0.43 | 0.9963 | 344，89484，3393，3121，10455，71，31 | 15271 |
| 7.0 | 3620(1)，3641(2)，3662(3)，3683(4)，3704(5)，3725(6)，3746(7)，3767(8) | 8 | 0.5 | 0.9717 | 67，6875，1289，3，151，7，67，11619 | 2510 |
| 19.0 | 3611(1)，-3630(2)，-3651(3)，3653(3)，-3693(5)，-3714(6)，-3735(7)，3737(7)，-3756(8)，3758(8) | 8 | 0.62 | 0.0049 | 27，1，1，59，1，3，6，2，1，1 | 10 |
| 16.0 | 3629(1)，3650(2)，3671(3)，-3711(5)，3713(5) | 5 | 0.5 | 0.0013 | 1，5，2，2，2 | 2 |
| 4.0 | 3638(1)，3680(3)，3722(5)，-3741(6)，3764(7) | 7 | 0.35 | 0.0011 | 17，1，2，2，1 | 5 |
| 18.0 | -5120(1)，5122(1)，-5141(2)，5164(3)，5185(4) | 4 | 0.62 | 0.001 | 1，15，1，73，17 | 21 |
| 6.0 | 3640(1)，3661(2)，3682(3)，3724(5)，3745(6)，3766(7) | 7 | 0.42 | 0.0008 | 9，3，1，1，2，2 | 3 |
| 15.0 | 5140(1)，5161(2)，5182(3)，5203(4) | 4 | 0.5 | 0.0007 | 1，71，4，4 | 20 |
| 14.0 | 3669(1)，3711(3)， | 5 | 0.3 | 0.0006 | 1，6，1 | 3 |
| 3753(5) | ||||||
| 11.0 | 5199(1)，5220(2)，5262(4) | 4 | 0.37 | 0.0004 | 1，3，1 | 2 |
| 20.0 | 3654(1)，3675(2)，-3736(5)，3780(7) | 7 | 0.28 | 0.0003 | 2，2，1，2 | 2 |
| 3.0 | 3637(1)，3658(2)，3700(4)，3721(5)，-3740(6) | 6 | 0.41 | 0.0003 | 2，1，2，1，1 | 1 |
[00100]水稻(Oryza sativa)回折结构的基因组序列和推定前体在SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11中给出。预测1个基因组DNA序列(SEQ ID NO.9)包含如在图2中所示的cDNA序列、内含子序列和回折臂，该转录物的几个可变剪接形式见于cDNA数据库。1个丰富的可变剪接转录物(SEQ ID NO.10)表明除去了一半回折结构，可能阻止小RNA生产。表达的序列标签(SEQID NO.11)被鉴定为代表SEQ ID NO.10的互补序列。规范TATA盒(由图2中加框的核苷酸指示)位于SEQ ID NO.8中预测的转录起始位点上游的34个碱基处，证实这是转录物的真正5’末端。单个回折结构因此由1个启动子转录，并独立于RNA依赖性RNA聚合酶形成在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA的杂合RNA。或者，由相同启动子转录的两个(或以上)剪接变体各自均含有每个回折结构臂的其中一个，并独立于RNA依赖性RNA聚合酶一起以反式形成在体内被相位性切割为多个小双链RNA的杂合RNA。
[00101]收集的证据证明该基因座为新型的RNA介导的调节(抑制)元件。与反式作用的siRNA不同，多个小双链RNA全部来自原始RNA转录物或前体的正链，与RNA依赖性RNA聚合酶无关，且没有启动双链RNA生产的miRNA靶位点。与微RNA不同，所述基因座在体内被切割为大量相位型小RNA，(如在以下的实施例5中所述)，该过程需要DCL4(或DCL4直系同源物)，不需要DCL1。本发明人因此称该新基因座为“相位型小RNA”基因座。
[00102]该特定相位型小RNA基因座的表达似乎主要限于玉米和水稻这二者的成熟籽粒，表明内源功能与在成熟籽粒中涉及胚发生状态的成熟或维持的基因抑制相关。依照在Allen等人(2005)Cell，121：207-221中描述的靶预测指引，预测了7个相位型小RNA(SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7)中每一个的推定靶。含有HAK2高亲和性钾转运体家族成员的这些靶的非限制性实例在表3中给出；还提供了得自公开数据库Maize Assembled Genomic Island(可在线得自magi.plantgenomics.iastate.edu，参见Fu等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102：12282-12287)的相应玉米基因座。
表3
*在magi.plantgenomics.iastate.edu可公开获得
实施例2
[00103]本实施例描述了含有有效连接在一起的启动子和转录为RNA的DNA的重组DNA构建体的非限制性实施方案，所述RNA包含：(a)至少一个可由在多细胞真核生物的特定细胞中表达的相位型小RNA识别的外源识别位点，和(b)在特定细胞中受到抑制的靶RNA，其中靶RNA要在非特定细胞的多细胞真核生物细胞中表达。更具体地说，本实施例描述了含有转录为RNA的DNA的重组DNA构建体，所述RNA含有对应于至少一个来源于内源相位型小RNA基因座的相位型小RNA的外源识别位点。
[00104]设计重组DNA构建体，以包含用于表达目标基因的基因表达元件(在该非限制性实施例中，报告基因β-葡糖苷酸酶“GUS”)和对应于本发明的至少1个相位型小RNA(例如在实施例1中所述的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7中的任一个或多个)的识别位点(靶位点)。可以设计相似的重组DNA构建体，其中包含对应于本发明的至少1个相位型小RNA的识别位点(靶位点)，以调节用于表达目标基因(其可为可翻译的或编码序列或非编码序列，包括调节序列)的基因表达元件的表达，例如在标题“靶基因”下描述的那些，或调节基因抑制元件的表达(例如有义、反义、有义和反义的组合、有义或反义的串联重复、微RNA、siRNA，以及任何设计用于降低靶基因表达的其它构建体)。
[00105]具有驱动GUS和Hsp17终止子表达的35S启动子的对照构建体(pMON94320)包括SEQ ID NO.12的部分序列，插入位点(在图3B中以粗体指示)位于GUS编码序列和Hsp17终止子之间。设计3个基于该对照构建体的另外的构建体，每个构建体均含有至少1个对应于本发明的相位型小RNA的识别位点。第一个构建体(pMON100574)包含SEQ ID NO.13的部分序列，其含有1个在实施例1中描述的21聚体相位型小RNA(SEQ ID NO.6)，以插入位点的有义方向掺入(图3C)。第二个构建体(pMON100575)包含SEQ ID NO.14的部分序列，其含有1个在实施例1中描述的21聚体相位型小RNA(SEQ ID NO.6)，以插入位点的反义方向(即作为对应于有义方向的SEQ ID NO.6的识别位点)掺入(图3D)。第三个构建体(pMON100576)包含SEQ ID NO.15的部分序列，其包含2个在实施例1中描述的21聚体相位型小RNA(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)，这二者均以插入位点的反义方向(即作为对应于有义方向的SEQ ID NO.5和SEQID NO.6的识别位点)掺入(图3E)。
[00106]使用具有序列CGGCGTTCTCTTGGTGGGGCA(SEQID NO.16，即SEQ ID NO.6的反义序列)的单个探针通过RNA印迹分析得自发育籽粒的玉米组织。结果示于图4，表明内源玉米相位型小RNA基因座转录，尤其是在发育胚中，在发育胚乳中程度较低，进一步确证了在表1中给出的克隆结果。
[00107]使用以氦粒子枪一次射击传递的约0.5μg DNA，通过颗粒轰击用重组DNA构建体转化玉米合子胚(授粉后21-22天)。将被轰击的组织在黑暗的reach-in生长室中于26℃温育24或48小时。胚用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸溶液染色(于37℃达24小时)，接着以70％乙醇清洁染色组织。由基因表达元件编码的目标基因(GUS)的表达由胚中的染色水平指示；预计GUS表达被内源玉米相位型小RNA基因座沉默。正如所料，GUS表达在用含有至少1个对应于本发明的相位型小RNA的识别位点的构建体(pMON100575和pMON100576)转化的胚中被沉默(图3A)。推测在用pMON100574转化的胚中观测到的沉默缘于以低丰度存在的内源反义转录物，如在克隆的水稻RNA文库中所观测到的(参见表2中克隆小RNA的丰度)。
[00108]对应于本发明的相位型小RNA的识别位点可用于调节构建体中转基因的表达，所述构建体含有至少1个该识别位点。因此，本发明提供含有与转录为RNA的DNA有效连接的启动子的重组DNA构建体，所述RNA包含：(a)至少1个可由在多细胞真核生物的特定细胞中表达的相位型小RNA识别的外源识别位点，和(b)在特定细胞中受到抑制的靶RNA，其中靶RNA要在非特定细胞的多细胞真核生物细胞中表达。本发明包括含有转基因和至少1个对应于本发明的1个或多个相位型小RNA的识别位点的重组DNA构建体，其可用于在组织中表达该转基因(其中表达相位型小RNA的那些组织除外)，并在其中表达相位型小RNA的组织中抑制转基因。例如，业已表明SEQ ID NO.6在水稻籽粒(实施例1)和玉米籽粒(本实施例)中表达；含有转基因(例如耐除草剂基因，如5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶)和至少1个对应于SEQ ID NO.6的识别位点的构建体至少在水稻或玉米籽粒中可用于抑制转基因。
实施例3
[00109]本实施例描述了重组DNA构建体的非限制性实施方案，所述构建体含有的DNA转录为：(a)第一个系列的连续RNA区段，和(b)第二个系列的连续RNA区段，其中第一个系列的连续RNA区段在体内与第二个系列的RNA区段杂交，形成杂合RNA，其在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA(“相位型小RNA”)。优选地，杂合RNA独立于RNA依赖性RNA聚合酶产生。本发明的重组DNA构建体可以包括合成的相位型小RNA基因座(其可转录为比由天然相位型小RNA基因座转录的转录物更长或更短的转录物)，其被设计为在体内被相位性切割为许多用于抑制一种或多种靶基因的相位型小RNA。
[00110]本实施例提供了含有得自单子叶作物的核酸序列的重组DNA构建体的实施方案，所述构建体独立于RNA依赖性RNA聚合酶转录为包含单个回折结构的RNA，其可在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA。人们发现得自单子叶作物的相位型小RNA基因座具有在图1中所示的单个回折结构(参见实施例1)。该基因座包括至少7个21聚体RNA(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7)，其每个均可被工程改造，从而以反式抑制一个靶基因或多个靶基因的表达。在本非限制性实施例中，基于该基因座的重组DNA构建体设计用于转录为单个转录物，其含有不完全的回折结构，用于在玉米中抑制多个内源基因：(1)编码赖氨酸酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶基因LKR/SDH的LKR区的信使RNA，和(2)编码显性Waxy基因的信使RNA，其编码用于淀粉合成的酶；以直链淀粉减少和支链淀粉增加为特征的“蜡质”(不含淀粉的)突变表型通常在植物纯合子被观察到为天然存在的隐性等位基因(wx/wx)，可在玉米育种中用作遗传的目测标记。
[00111]基于939个核苷酸的起始序列(SEQ ID NO.17)设计重组DNA序列，其按顺序包含：
(1)5’前导序列(SEQ ID NO.18)；
(2)回折结构的5’臂，包含第一个系列的连续RNA区段，即按照所列出的顺序(5’至3’)的7个连续21聚体(SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.7)；
(3)形成连接回折结构的5’和3’臂的环的间隔序列(SEQ ID NO.23)；
(4)回折结构的3’臂，包含第二个系列的连续RNA区段，即按照所列出的顺序(5’至3’)的7个连续21聚体(SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26)；和
(5)3’非翻译区和终止子(SEQ ID NO.27)
[00112]该起始序列(SEQ ID NO.17)可用作作为基因抑制构建体基础的相位型小RNA模板；构成回折结构的连续21聚体(或在相应的RNA转录物中的连续RNA区段)中的任一个或多个可被修饰或工程改造，以沉默靶基因，如在上文的标题“转录为第一个和第二个系列的连续RNA区段的重组DNA构建体，所述连续RNA区段形成在体内被相位性切割的杂合RNA”之下所述。在本非限制性实施方案中，被工程改造而沉默一个或多个靶基因的21聚体优选选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。优选地，形成接合回折结构的5’和3’臂的环的间隔序列(例如SEQ ID NO.23)被保持在工程改造的基因抑制构建体中。
[00113]在一个具体实施例中，选定的21聚体序列(合成相位型小RNA)分别设计用于靶向LKR(SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29)或Waxy(SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31)。这些序列被克隆到模板序列的表达相位中，以产生具有以下序列的基因抑制构建体：aatcttattctacatatttctatcttatatagaacaactagcatagctctcgttgcccagccaggttgcccagccaggttgcctggtgcacaatgagagctggctagggcggactcattctgctgttggtgcccaacgatgctagctgctactcatactagtgaagcctgccatggttctgagaaatttttggatactccgctgcgtagatatgcactaaaagcttgtatgtttcgctgactacatactatggatatcacctgtttgacaagagaaggattacataccacgatgaagatgaattggaacatgATGCAAGTGATGTAGCGCCCCATATAGGAGT CACTCAGGAAAGCGCaGCTCGCCAccGAGATGcGCCcAAGATGC AGGTGcATGCTGAcgctaTTGGcGGCCtCGCATAGATCcCTTGATaTC ACT 
cccacggcgacgccaaaaaatgcaaagttggccaacacatagctcactgcatcgtcaagtagagctgcttaatcactgagggtatatacatttagttcgccttcttcagcgttgccatggacaCCGCTcTCTGCATCaACAAAG 
tGGCCaCCAAcaacaTCAGCA 
TCCGTAGTGATTCCTATA CGGGGTGCTACTTCACTTGGATCAtgttacaatttatcttcatcgtgatatatgctccttctgttctcacataggtgatatcttaaaatgtatgaggcatatatactttctacctaatattataaagtatatgcctctatatagatcaaataaagcagaaaagtcattgttattaccaatcgtgtacttttgttctaaacatctcaactagtttaaagtatttgtctctcttga(SEQ ID NO.32)；回折结构的5’和3’臂以下划线文本指示，工程改造的21聚体以粗体字显示，有意错配的核苷酸以小写字母字体指示。还修饰了每个回折臂上的其它序列，以便保持模板序列(SEQ ID NO.17)的原始二级结构(包括错配碱基的位置)。图5图示了分别由模板序列(SEQ ID NO.17)和工程改造的基因抑制构建体(SEQ ID NO.32)转录的RNA的预测二级结构。工程改造的基因抑制构建体的表达由适宜的胚乳特异性启动子驱动，例如玉米醇溶蛋白或B32启动子(GenBank登录号X70153的核苷酸848-1259，另参见Hartings等人(1990)Plant Mol.Biol.，14：1031-1040，其在此引入作为参考)。其它的合成相位型小RNA构建体以相似的方式设计，以沉默多个靶基因，例如内源基因(例如LKR/SDH、GLABRA1、DWARF4和CLAVATA)或转基因(例如报告基因，如GUS或GFP，或选择标记，例如赋予抗生素或除草剂耐受性的基因)的组合。
实施例4
[00114]该实施例描述了折叠为杂合RNA的RNA转录物的非限制性实施方案，所述杂合RNA在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA，其中杂合RNA独立于RNA依赖性RNA聚合酶产生。更具体地说，该实施例提供了得自单子叶作物的核酸序列，其可用于制备重组DNA构建体，该重组DNA构建体编码的转录物独立于RNA依赖性RNA聚合酶折叠为杂合RNA，所述杂合RNA在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA。
[00115]按照在实施例1中详述的方法，由水稻(Oryza sativa)成熟籽粒和籽苗RNA文库鉴定出第二个“相位型小RNA”基因座。该基因座LOC_Os12g42380.1|11982.m08017具有DNA序列GATTCTCCCCTGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCTCAATCGGGCGAAGCCGCCCTCGCCGCCGTCGCGGCGGCGGCGGCGAGGGCGAGCTCCTGCGAGAGATCCTCCGCCGCCTCATGCCTCGCGCGCGCGCTCCCGCTCCCGCTCTCGCCTGCAGTATTTGTTCCATTGCCGCGCACCACTTTCCGGTGGGCGGCGGGCAATGCTAGGGGTTAAGAGACCTTCTCTCCCCGAGATGGAGGCGCCGGGCGGCGCGGCGGGGGACGCGGAGGAGGAAGTTGATGCCCGGATCCGCTGGGTTCCATGGTGGCTGCTATGGAATGGTGGAATTGCTTGGATGGCCACGAAGGGGATCGACGCCAATTGTTTGGCGACCTCTACGATAGAATCGCGTCGAGTCGGGGTGTTCTTTCCTGTTATTACTAGAAGTAGTTGAATTTCGTGATTGAACACACAAGGAAGCTTGATATCGCGTCGGGGGTGTTCTTTCCTGTTATTACTAGATGTAGTTGGGTTTCGTGATTGAACACCTAAGGAAAGGAAGCTTGATAAATGGAAGATAGTCCAGCAAGTTTTGAAGATGATAGAAAATTTGAGCGCGTCGTAGTAACTGTCGTCCACGATCACGTCCAGTGTTGTTCATGGCATGGGGGATGGAGTCAGGATCCTTGAGGCGTCTGCTCCTGTTGCACTGCTTCATGCCTTTCCTGCCTTCTAGGATGCTTAAGATGGTTGCGAAGTCAGGTGCTTGGGAGTTCATGAAGCGGTCATAATCAATTTCGCTCTCTGTAGTACTTTCTCTGGTGTCTTCCCCGTTGCTTCCTTTTGGAAGAAAAGCGTCCTTTAGAATCTCTTGAGAGAGTGCACTTTCTCCCTCTCCTGCCATCAGTAGTGCCTTTATTTTCGCTTGGTTTCCGCATCATCAGGTGGCACTTATAGAAATTATTTTATGGAGGAAAAAGCATTGTATGGCATGATAGAAATATCCTTATGGATAAAACTAGGACACTTGCAAGTGTTCAATGGGAGTCACCTTACCTTTTTTGCCTACCTGTCTGCATTTCATGAATGGGATTCCTTCTCCTGCGCCGGTGCTGTCTTCTCAAATGGGAAATGGAGGCAAGCATCTGCCCTGTTCCATGGTGGCAGCCATGGAATGATGGGATTTCTTTGATGGTCATAAAGGAGATCAAAACCAACGGTTGGCAATCTCTGCAGGGATGATGAACCAGGCTTGTAATATCTGTTGCTGATTTCTTTGGAAGACATAACGGCAAGCTTCATGGGGCACGATGGATTTCAGATGGTTGCTTCAGCCATGTCTCAAGATTCAGTTGATGGACCTCAAGTTTCTGGGTGCAGTGCCACGAGTCTTGGTCAGCCCAAGAGTAAGCGCAGGACTGGTGACAAGGCAAGAGGGGAGAAGAAGGCACTCAAAGTTAAGATTAACCTTGCCAGCCCGGCCAAAAAAATTAAGAAAAGTAGCAAAAAGAAGGGCAAAAAGGGCACTGTTGCTGGCAGGATAGGGAGAAAATGCACTCTCTCAAGAGATTCTAAAGGGCGCTTTCTTCCAAGAGAGAGTAAGGGGGGAGACATCGGAGGAAATGCTACAGAGAGTGAAGTTGATTATGACCGCTTCATGAACTTTCAGGCACCTGACTTCGCTACCATCTTAAGTATTTTGAAAGGCTGGAAAGGCATGAAGCAATGTAACAAGATCAGGCGCCTCAAGGATCCTGACTTCGTCCCTCTCATGAACGTCATGAGCAACACTGGATATGTGACCGAGGATGATGGTCACTATGATGTGCTGAAAGTCTTGATGCATGCAGATGGCTGGTCTGCATAGTGATTCAAGCTCTCAAATCAAAACATTCAGGCCTATGGCCTTGTTGCTAGAACAGTGGTTTCTTCTTTCACCTTTAAAACTTGATGGACTTTGTTCCATTTATCTTAGAAATTTTGTTGCCCTTGAGTCCGGTGGATATGTACTGGAGTATGCTATACTGGGTGATTTAATGGTGATAATGTTAAATCTTGATACTAGTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO.33)，相唯一性记分0.959，高度支持具有以下序列的预测的RNA转录物：AGUCCAGCAAGUUUUGAAGAUGAUAGAAAAUUUGAGCGCGUCGUAGUAACUGUCGUCCACGAUCACGUCCAGUGUUGUUCAUGGCAUGGGGGAUGGAGUCAGGAUCCUUGAGGCGUCUGCUCCUGUUGCACUGCUUCAUGCCUUUCCUGCCUUCUAGGAUGCU UAAGAUGGUUGCGAAGUCAGGUGCUUGGGAGUUCAUGAAGCGGUCAUAAUCAAUUUCGCUCUCUGUAGUACUUUCUCUGGUGUCUUCCCCGUUGCUUCCUUUUGGAAGAAAAGCGUCCUUUAGAAUCUCUUGAGAGAGUGCACUUUCUCCCUCUCCUGCCAUCAGUAGUGCCUUUAUUUUCGCUUGGUUUCCGGCAAAAAGGGCACUGUUGCUGGCAGGAUAGGGAGAAAAUGCACUCUCUCAAGAGAUUCUAAAGGGCGCUUUCUUCCAAGAGAGAGUAAGGGGGGAGACAUCGGAGGAAAUGCUACAGAGAGUGAAGUUGAUUAUGACCGCUUCAUGAACUUUCAGGCACCUGACUUCGCUACCAUCUUAAGUAUUUUGAAAGGCUGGAAAGGCAUGAAGCAAUGUAACAGAUCAGGCGCCUCAAGGAUCCUGACUUCGUCCCUCUCAUGAACGUCAUGAGCAACACUGGAUAUGUGACCGAGGAUGAUGGUCACUAUGAUGUGCUGAAA(SEQ ID NO.34)，并含有如在图6中所示的序列和单个回折结构。图7A图示了沿着完整序列(约2千碱基)的siRNA丰度，以每25万个序列的转录物(“tpq”)表示，图7B图示了siRNA区和得自该基因座的小RNA丰度的21-核苷酸分相的展开图。
[00116]如同在实施例1中所述的相位型小RNA基因座一样，预测具有SEQ ID NO.33的基因座转录为RNA(SEQ ID NO.34)，其独立于RNA依赖性RNA聚合酶形成杂合RNA，并在体内被相位性切割为多个小双链RNA。与反式作用的siRNA不同，多个小双链RNA全部得自原始RNA转录物或前体正链，独立于RNA-依赖性RNA聚合酶，没有启动双链RNA生产的miRNA靶位点。与微RNA不同，基因座在体内被切割为大量相位型小RNA，(如以下实施例5中所述)，该过程需要DCL4或DCL4直系同源物，不需要DCL1。
[00117]关于该基因座(SEQ ID NO.33)的相位型小RNA的数据在表4中提供。这些相位型小RNA大部分由水稻小RNA文库克隆，还在由籽粒(授粉后32天和授粉后39天)和根(V9期)制备的玉米(Zeamays)RNA文库中鉴定出几个，表明在玉米中存在类似的相位型小RNA基因座。由该基因座(SEQ ID NO.33)预测的转录物(SEQ ID NO.34)还包括5’侧翼序列AGUCCAGCAAGUUUUGAAGAUGAUAGAAAAUUUGAGCGCGUCGUAGUAACUGUCGUCCACGA(SEQ ID NO.66)和3’侧翼序列GAGGAUGAUGGUCACUAUGAUGUGCUGAAA(SEQ ID NO.67)，以及位于回折结构的5’和3’臂之间的间隔序列UUUAUUUUCGCUUGGUUUCCGGCAAAAAGGG(SEQ ID NO.68)，该间隔序列包含3-核苷酸的转角。图6图示了每个小RNA沿着由水稻基因座(SEQ ID NO.33)预测的杂合RNA(回折)结构(SEQ IDNO.34)的5’和3’臂的相对位置。这些小RNA大部分但不是全部是21聚体。预测由SEQ ID NO.59编码的小RNA含有27个核苷酸，包括8个未配对核苷酸的大凸出；预测修饰该序列，使该小RNA更接近两个螺旋转角(约21个核苷酸)，从而加工该小RNA。
实施例5
[00118]本实施例描述了编码折叠为杂合RNA的转录物的DNA的非限制性实施方案，所述杂合RNA在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA(“相位型小RNA”)，其中杂合RNA独立于RNA依赖性RNA聚合酶产生。Os06g21900相位型sRNA基因座(在实施例1中描述，并具有在图1中所示的部分结构)在体内被加工为多个相位型小RNA；多个小双链RNA全部来源于前体正链，这使它们与反式作用的siRNA区分开来。再者，与微RNA不同，所述基因座包含大量相位型小RNA。该实施例提供了相位型小RNA基因座的进一步表征，其与规范微RNA和反式作用的siRNA明显不同。
[00119]进一步表征位于水稻染色体6上的Os06g21900相位型sRNA基因座。由文库克隆LIB4833-001-R1-N1-G10测序作图至该基因座的898个核苷酸的前体，发现其具有DNA序列AATCTTATTCTACATATTTCTATCTTATATAGAACAACTAGCATAGCTCTCGTTGCCCAGCCAGGTTGCCCAGCCAGGTTGCCTGGTGCACAATGAGAGCTGGCTAGGGCGGACTCATTCTGCTGTTGGTGCCCAACGATGCTAGCTGCTACTCATACTAGTGAAGCCTGCCATGGTTCTGAGAAATTTTTGGATACTCCGCTGCGTAGATATGCACTAAAAGCTTGTATGTTTCGCTGACTACATACTATGGATATCACCTGTTTGACAAGAGAAGGATTACATACCACGATGAAGATGAATTGGAACATGATGCAAGTGATGTAGCGCCCCATATAGGAGTCACTCAGGAAAGCACAGAAGAGGGAGAAGATGTAGACGGTGCCCATCCACATGCTGACGCTATTGGCGGCCTCGGCGTTCTCCTGGTGGAGCACCTGCCTGAGGAACACCACCAGGCCCACGGCGACGCCAAAAAATGCAAAGTTGGCCAACACATAGCTCACTGCATCGTCAAGTAGAGCTGCTTAATCACTGAGGTATATACATTTAGTTCGCCTTCTTCAGCGTTGCCATGGACCTGGTGATGTTCTTCCGGCGGGTGCCCCACCAAGAGAACGCCGTGGCCACCAACAACATCAGCATATGGATGGGCACCATCTTCATCTTTGCCCTCTTTAGTGCTTTCCGTAGTGATTCCTATACGGGGTGCTACTTCACTTGGATCATGTTACAATTTATCTTCATCGTGATATATGCTCCTTCTGTTCTCACATAGGTGATATCTTAAAATGTATGAGGCATATATACTTTCTACCTAATATTATAAAGTATATGCCTCTATATAGATCAAATAAAGCAGAAAAGTCATTGTTATTACAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO.69)；相应转录物含有的相位型小RNA(参见实施例1)沿着转录物分布在两个区之间(图8A)。该基因座包含两个外显子(外显子2和3，由阴影区域指示)，它们形成长的不完全回折结构，该结构含有8个21-核苷酸的相位型小双链RNA，由约1.2kB的内含子分隔(图8B)。没有发现匹配外显子1的小RNA，也没有任何miRNA靶序列可以启动所鉴定的反式作用的siRNA分相(参见Allen等人(2005)Cell，121：207-221；Vaucheret(2005)Sci.STKE，2005，e43；和Yoshikawa等人(2005)Genes Dev.，19：2164-2175)。最丰富的相位型小RNA的RNA凝胶印迹分析证实，表达对水稻籽粒是特异性的(图8C)。两个最丰富的相位型小RNA(“P7”，SEQ ID NO.6，和“P4”，SEQ ID NO.3)没有一个在水稻籽苗或测试的其它植物物种中检测到。
[00120]相位型小RNA形成新型的调节性小RNA，其与规范微RNA(miRNA)和反式作用的siRNA均不同。本文公开的相位型小RNA在某种程度上使人联想到拟南芥中的miR163，在拟南芥中，测序siRNA的两个相位，单个小RNA(miR163自身)显著累积；参见Allen等人(2004)Nat.Genet.，36：1282-1290；以及Kurihara和Watanabe(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，101：12753-12758。然而，相位型小RNA明显与miR163不同，因为大量相位型小RNA被加工，并可以由单个转录物分离。相位型小RNA基因座是单个扩展的不完全的回折结构(例如在图1、图6或图8B中所示的基因座)，因此也与在拟南芥中鉴定的反式作用的siRNA基因座明显不同，siRNA基因座需要RNA依赖性RNA聚合酶(RDR6)来产生双链RNA，由该双链RNA加工相位型siRNA。
[00121]Os06g21900相位型小RNA基因座的展开回折结构提示，该前体未经规范miRNA途径加工。相位型小RNA的定相位特征进一步表明，它们是由DCL4或DCL4直系同源物而非DCL1加工的结果。为进一步证实本文公开的相位型小RNA是独特的且与规范微RNA(miRNA)和反式作用的siRNA不同，将Os06g21900相位型小RNA基因座的全长cDNA转化入拟南芥Columbia(Col-0)生态型和突变体(dcl1-7(DCL1敲除)和dcl4-1(DCL4敲除))中。提取RNA，并使用对应于相位型小RNA“P7”(SEQ ID NO.6)和“P5”(SEQ ID NO.4)、规范miRNA(miR173)和反式作用siRNA(ta-siR255)的探针进行印迹分析(图8D)。
[00122]相位型21-核苷酸小RNA在得自Col-0和dcl1-7的转化事件中高度表达，但在dcl4-1突变体中，不存在21-核苷酸的相位型sRNA，仅观测到微弱的24-核苷酸小RNA(类似于对ta-siR255所观测到的)。这些数据与DCL4在同相加工小RNA中的功能一致，但与反式作用的siRNA不同，对于本文公开的相位型小RNA基因座而言，不需要miRNA启动位点。这些数据还证实，得自单子叶作物的相位型小RNA基因座在双子叶植物中也被有效加工。因此，相位型sRNA通过与规范微RNA(miRNA)和反式作用的siRNA这二者不同的途径被加工。如在本文公开的其它实施例中所述，相位型小RNA基因座可用作设计重组DNA构建体的模板，该构建体编码的转录物折叠为杂合RNA，该杂合RNA在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA，或者作为设计重组DNA构建体的模板，该构建体含有的DNA转录为：(a)第一个系列的连续RNA区段，和(b)第二个系列的连续RNA区段，其中第一个系列的连续RNA区段在体内与第二个系列的RNA区段杂交，形成杂合RNA，该杂合RNA在体内被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA(“相位型小RNA”)。
实施例6
[00123]该实施例描述了重组DNA构建体的非限制性实施方案，该构建体包含的DNA转录为：(a)第一个系列的连续RNA区段，和(b)第二个系列的连续RNA区段，其中第一个系列的连续RNA区段在体内与第二个系列的RNA区段杂交，形成杂合RNA，该杂合RNA在体内被相位性切割成多个用于基因抑制的小双链RNA(“相位型小RNA”)。
[00124]本实施例提供了包含来源于单子叶作物的核酸序列的重组DNA构建体的实施方案，该构建体独立于RNA依赖性RNA聚合酶转录为含有单个回折结构的RNA，其在体内可被相位性切割为多个用于基因抑制的小双链RNA。本实施例为设计用于抑制多个靶基因的重组DNA构建体。修饰Os06g21900相位型小RNA基因座(参见实施例1)来抑制如下的3个靶基因：分别用对应于拟南芥的GL1、IDA和LFY基因的区段的核苷酸替代标识号1196700(SEQ ID NO.3)、1379342(SEQ ID NO.6)和544819(SEQ ID NO.7)的相位型小RNA的核苷酸，产生的序列为GGTACCAATCTTATTCTACATATTTCTATCTTATATAGAACAACTAGCATAGCTCTCGTTGCCCAGCCAGGTTGCCCAGCCAGGTTGCCTGGTGCACAATGAGAGCTGGCTAGGGCGGACTCATTCTGCTGTTGGTGCCCAACGATGCTAGCTGCTACTCATACTAGTGAAGCCTGCCATGGTTCTGAGAAATTTTTGGATACTCCGCTGCGTAGATATGCACTAAAAGCTTGTATGTTTCGCTGACTACATACTATGGATATCACCTGTTTGACAAGAGAAGGATTACATACCACGATGAAGATGAATTGGAACATGATGCAAGTGATGTAGCGCCCCATATAGGAGTCACTCAGGACTCCACGGTCATTGTGTATCATGTAGACGGTGCCCATCCACATGCTGACGCTATTGGCGGCCTTGGTCCTTCATAGAGACCCAACCTAACAGTGAACGTACTGTCGCCCCACGGCGACGCCAAAAAATGCAAAGTTGGCCAACACATAGCTCACTGCATCGTCAAGTAGAGCTGCTTAATCACTGAGGTATATACATTTAGTTCGCCTTCTTCAGCGTTGCCATGGAGCGACAGAACGTTCACGGTTAGGTTGTGTCTCTTTGAAGGACCATGGCCACCAACAACATCAGCATATGGATGGGCACCATCTTCATGATGAACAATGACGGTGGAGTCCGTAGTGATTCCTATACGGGGTGCTACTTCACTTGGATCATGTTACAATTTATCTTCATCGTGATATATGCTCCTTCTGTTCTCACATAGGTGATATCTTAAAATGTATGAGGCATATATACTTTCTACCTAATATTATAAAGTATATGCCTCTATATAGATCAAATAAAGCAGAAAAGTCATTGTTATTACGTTAAC(SEQ ID NO.70)。分析该序列，亚克隆入包含草甘磷抗性选择标记的双子叶植物二元载体(pMON97890)中，并使用如在Clough和Bent(1998)，Plant J.，16：735-743中所述的浸花法技术转化入拟南芥中。使用草甘磷选择产生的事件，筛选选定植物的预期表型，即由于GL1抑制而没有毛状体(Marks和Feldmann(1989)Plant Cell，1：1043-1050)、通过IDA抑制防止花瓣脱离(Butenko等人(2003)Plant Cell，15：2296-2307)以及由于LFY抑制的花至叶转变(Schwab等人(2006)Plant Cell，18：1121-1133)。
实施例7
[00125]本实施例描述了重组DNA构建体的非限制性实施方案，该构建体含有的DNA转录为：(a)第一个系列的连续RNA区段，和(b)第二个系列的连续RNA区段，其中第一个系列的连续RNA区段在体内与第二个系列的RNA区段杂交，形成杂合RNA，该杂合RNA在体内被相位性切割成多个用于基因抑制的小双链RNA(“相位型小RNA”)。更具体地说，本实施例描述了转录为RNA的重组DNA构建体，所述RNA在体内被相位性切割为相位型小RNA，用于在植物中对多种病毒进行基因抑制。
[00126]相位型小RNA设计用于靶向经济学上重要的感染番茄的双生病毒、番茄斑萎病毒和马铃薯X病毒的高度同源区域。这些病毒包括番茄黄叶卷缩病毒(多米尼加共和国分离株)、番茄叶卷缩新德里病毒、番茄严重叶卷缩病毒、胡椒huasteco黄脉病毒、胡椒金色花叶病毒、香瓜梨(Pepino)花叶病毒、番茄斑点枯萎病毒、花生胚芽坏死病毒和辣椒(Capsicum)褪绿病毒。同源区域允许以有限的一组相位型小RNA来控制许多病毒；另外，预计这些保守区域不大可能发展出抗性，因为碱基变化应阻止或防止相位型小RNA的抑制。在选择用于抑制的靶序列时考虑Reynolds记分、功能不对称和miRNA特性。利用多个相位型小RNA来改善沉默和防止抗性。
[00127]在本非限制性实施例中，将用于抑制多个病毒标靶的核苷酸序列用来置换众多相位型小RNA的天然序列(即各21个连续核苷酸的区段)，所述相位型小RNA来源于支架序列(Os06g21900 cDNA，SEQ ID NO.69)，具有需要时被改变的额外核苷酸，以便保护存在于天然前体转录物中的二级结构。置换21-核苷酸区段包括两个用于抑制双生病毒的序列：TGGTACAACGTCATTGATGAC(SEQ ID NO.71)和TGGACCTTACATGGCCCTTCA(SEQ ID NO.72)，1个用于抑制马铃薯X病毒的序列：TAATTGTGCAGCTCATCACCC(SEQ IDNO.73)，3个用于抑制番茄斑萎病毒的序列(1个针对这些三组分病毒的每个区段)：TAGATGGGAAATATAGATATC(SEQ ID NO.74，靶向番茄斑萎病毒M区段)，TGCTTATATGTATGTTCTGTA(SEQ IDNO.75，靶向番茄斑萎病毒L区段)，TCAAGAGTCTTTGAAAGAAAG(SEQ ID NO.76，靶向番茄斑萎病毒S区段)。将置换区段掺入编码合成相位型小RNA前体(即在体内被相位性切割为用于在植物中基因抑制多种病毒的相位型小RNA的RNA转录物)的DNA序列中，AATCTTATTCTACATATTTCTATCTTATATAGAACAACTAGCATAGCTCTCGTTGCCCAGCCAGGTTGCCCAGCCAGGTTGCCTGGTGCACAATGAGAGCTGGCTAGGGCGGACTCATTCTGCTGTTGGTGCCCAACGATGCTAGCTGCTACTCATACTAGTGAAGCCTGCCATGGTTCTGAGAAATTTTTGGATACTCCGCTGCGTAGATATGCACTAAAAGCTTGTATGTTTCGCTGACTACATACTATGGATATCACCTGTTTGACAAGAGAAGGATTACATACCACGATGAAGATGAATTGGAACATG
CCCACGGCGACGCCAAAAAATGCAAAGTTGGCCAACACATAGCTCACTGCATCGTCAAGTAGAGCTGCTTAATCACTGAGGTATATACATTTAGTTCGCCTTCTTCAGCGTTGCCATGGA
TGTTACAATTTATCTTCATCGTGATATATGCTCCTTCTGTTCTCACATAGGTGATATCTTAAAATGTATGAGGCATATATACTTTCTACCTAATATTATAAAGTATATGCCTCTATATAGATCAAATAAAGCAGAAAAGTCATTGTTATTAC(SEQ ID NO.77)，其中下划线文本指示用于抑制病毒的置换21-核苷酸区段(相位型小RNA)的位置，粗体文本指示回折结构中的核苷酸，小写字母字体指示被改变以保持如在天然前体转录物中存在的二级结构的核苷酸。图9A图示了内源Os06g21900相位型小RNA基因座(SEQ ID NO.69)的转录物的回折结构；图9B图示了由SEQ ID NO.77编码的合成相位型小RNA前体的回折结构。
实施例8
[00128]本实施例描述了在体内被相位性切割为用于基因抑制的相位型小RNA的RNA靶的鉴定。更具体地说，本实施例描述了由天然相位型小RNA基因座产生的相位型小RNA的靶的鉴定。
[00129]使用miRSite算法，由植物cDNA数据库预测由具有SEQ ID NO.33的基因座产生的相位型小RNA(参见表4)调节的推定靶基因。miRSite通过比较输入miRNA和靶cDNA数据集之间的序列相似性预测miRNA靶。基于经实验验证的miRNA靶建立的规则(Allen等人(2005)Cell，121：207-221)记分miRNA：靶对(或类似地，相位型小RNA：靶对)。简而言之，错配对和单个核苷酸空位记分为1，G:U对记分为0.5，碱基2-13的错配对记分加倍，沿着靶的长度求和。预测的靶按照其罚分排列，记分低于4.5被视为推定的靶。就保守miRNA或相位型小RNA而言，优先给出存在于直系同源基因和位置中的靶。表5提供了预计由具有SEQ ID NO.33的基因座的相位型小RNA调节的靶基因(和在靶基因RNA转录物中鉴定的识别位点)的非限制性实例；还显示了相位型小RNA和识别位点的比对。
[00130]使用称为RNA连接酶介导的cDNA 5’末端快速扩增(“5’RLM-RACE”)的技术经实验验证植物(例如水稻和玉米)中的预测靶；参见例如Kasschau等人(2003)Dev.Cell，4：205-217，和Llave等人(2002)Science，297：2053-2056。该方法依赖RNA适体分子连接至切割位点的5’末端，并取决于由包括Ago1的RNAase III酶所留下的5’磷酸。测序产生的PCR产物，对准核苷酸10和11之间的预测miRNA(或相位型小RNA)切割位点的克隆相对于miRNA(或相位型小RNA)5’末端的相对数目提供了miRNA(或相位型小RNA)活性评价。5’RLM-RACE测定的结果用于证实任何相位型小RNA对预测靶的切割。
[00131]鉴定和验证由天然表达的相位型小RNA基因座的相位型小RNA调节的内源基因，可用于例如消除或改变内源基因中的相位型小RNA识别位点，以便分离该基因的表达，所述基因由天然调节该基因表达的相位型小RNA的调节。例如，可增加涉及2-13位碱基的错配数目(在具有连续的21个核苷酸的相位型小RNA识别位点中)，以防止被相位型小RNA识别和切割。
[00132]本文公开并要求保护的所有材料和方法都可以按照以上公开内容的说明获得和使用，无需过度试验。尽管已依据优选实施方案和说明性实施例描述了本发明的材料和方法，但对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对本文描述的材料和方法实施改变。所有这些对本领域技术人员显而易见的类似置换和修改都被认为属于由随附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念。
序列表
<110>Allen，Edwards
Guo，Liang
Heisel，Sara E.
Ivashuta，Sergey I.
Zhang，Yuanji I.
<120>相型小RNA
<130>38-21(54702)B
<150>60/841,608
<151>2006-08-31
<160>97
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>水稻(Oryza sativa)
<400>1
augcaaguga uguagcgccc c 21
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>2
auauaggagu cacucaggaa a 21
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>3
ucuuugcccu cuuuagugcu u 21
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>4
uauggauggg caccaucuuc a 21
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>5
uggccaccaa caacaucagc a 21
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>6
ugccccacca agagaacgcc g 21
<210>7
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>7
ugccugagga acaccaccca g 21
<210>8
<211>5521
<212>DNA
<213>水稻
<400>8
aaaatttcta ccatctcact tttgtaataa taccataaat gctttgccat atgtaaaacc 60
gttcgagtag cgacaacacc ggttctataa aagttgttcc ctttccacgt acttataagc 120
ttatctagtg tgcacgcatt ccctttccac gtatttccac gtatttccat taaccttatc 180
ttgtgtgcac gcataaggta catgggtaat aacatgttct tggaagtggt ccttacctac 240
accgctatat aaagcgacgc ctctcattgc gacaccacca atcttattct acatatttct 300
atcttatata gaacaactag catagctctc gttgcccagc caggttgccc agccaggttg 360
cctggtgcac aatgagagct ggctagggcg gactcattct gctgttggtg cccaacgatg 420
ctagctgcta ctcatactag tgaagcctgc catggttctg agaaattttt ggatactccg 480
ctgcgtagat atgcactaaa agcttgtatg tttcgctgac tacatactat ggtgagatcc 540
taaagtatta cctatttatt taccttttta tagtttctat atattacttc agatgacgag 600
atcatttagc acgcataaac aagtcacaaa ttattaagta aaattctttc aagtttttgc 660
agacctttgg gtatctttct cactttttat gtctttttta acctcaaaag tcacatgtac 720
attcaactgc attcatgtcc aaatctttct agaatgattg cttggtcttt gtttcgttac 780
tacggtgatt tttcagcatg catataagtt cctcttcgtt cttcgtttct cctttcaagg 840
attgatctat ctaggggaga taggaatcaa gcaaattgtt caccgtccca tgcactatat 900
gctagatccc attgtttttt ctttttaaat aatgccattt cacgaggtac cattgcttta 960
gaaaaaaaat ggtcagtaac gagattttaa tatctagcct gtcttttata agatatacca 1020
ggtgtcttct ataagatata ccaggtaaat atagtaccat agaattttct aacggttcaa 1080
ccagggacaa tttgttttca cctagctgcg tacacaccca ttttatccac gcgcttctta 1140
aataggttaa aaaatataaa acaaattggt agcatagatt ttctttaaag agacgtaaaa 1200
tatattatga tgacaaatac ctcttgtcca accaggctca aattattact ctaaactgtt 1260
ttacaccaaa acttcagcct aaacagaaac atgcctggtt atacatgcca ggagattgct 1320
tgttcggttt ggagaggatt gagggattcc gcaccactaa aggtgtgtaa taaatcccct 1380
ccaatctcac ttcttgagga tcaatcgaac atcacattaa aagaaaaaac atgtttggtg 1440
cacgttctta aataaaggcg gagtacaaac gtctgtcgaa cagcaccaat gcaaacaact 1500
gaatttaaca gccatttcat gataattata tatatatata tatatatata aaagatgtat 1560
ctagctagac tatatatatg tggtcatcct gtggactgga gctgatcccc tccacctccg 1620
gctcgatgcc cttgaacaac cgcgcgaaca cgatgaacac gacgaggtcc acggcggaca 1680
gcacggcgag ggtgatgaag gagcggtcga ggtggccgcg gtcgagctcg gccaggatcc 1740
accccgccgt ccctccgccg gtccgccgcc gcgaggcgac gccgctgatg gcgctcacca 1800
tcaccatgct ggcgtagttc cccagcgaga tggacgccat gcacagcgag ctccccaggc 1860
tcttcacccc ctccggcgac tgcacgttga agaactccag ctgccccacg tacacgaaca 1920
cctccgacgc gcccatcacc gcgtactgcg gcgcctgcca cagcacgctc atggcgcggc 1980
cgccggcgcc ggatcggcgg cggcggtgga cctcgacgac cgccgcggcg accatgccga 2040
gcagcgcgat cacgaggccc gcgcccatgc gcttgagctc gccgacgccg cgcgggttct 2100
tggtcagcct cgccgccgcg ggcaccagga cgtagtggga gaaggcgagc gtggcgagca 2160
cgccggcgac gtcgaacacc gacatggacg cggccggcgc gttgaacagg cccaggatgt 2220
cggtgtccat ggccgcgcct tgctccacga acaaggacga catctgggtg aactccacgg 2280
agtagacgat gctgcagatc cagatgggca ccatgctcac cacgcacttg gcctcctcca 2340
cctgcgtcac cgtgcacagt ctccacgggt tcttggcgtt cccgtcgtgg tagtcctcct 2400
cggtcgccgt cgccgccttg tcaagaaacc tgagctggtc gctgtgggcg agcttgccga 2460
cgccacggat cgccgagccc tcgccatcga cctcgtggag gtggtcgccg ggcggcggca 2520
cgatgtgccg cttgcggtac gcggcgacga acacctgggc gatgcgggtg agcgggttgc 2580
cggcaggtcg gacccggcgg tagcgcggcg tgccgaggag aaagagcgcg agcgcgagcg 2640
cggcggcggc ggtggagacc cagaagccgg cgacccaccg gcccctgtcc tcgaagaaca 2700
ccaggacgga gttgtagaag agggagccga cgttgagcga gaggtagaag aggcagaaga 2760
aggcctgctt gcgccgccgc tcgccggggt cggcgtcgtc gaactggtcg gcgccgaacg 2820
tcgccaccga cggctggtac ccgccgttcc cgaacgccgc catgtagatg gacaggtaga 2880
acaccgcgac gccacgccgg gacggcgccg cgcactgcct gagcccgccg ccgtcgccgc 2940
accccggcgg ctccaccagc aagaaccacg acaacagcga caggagcatc aacccctgca 3000
tgccaaaaca cacaagaaat taaacttgtc tcatgcatca actgctgaca ctcttaacct 3060
tataataact ttaaacttat aattcagttt tgctattttc agtcgtctga aatcaaaatt 3120
gcacatatgc tctgtttttt acataattaa gattgtttaa aatgttgaca cagtatttat 3180
gttgttatat tttatactac tgctgagttt atcctgatat ctgactgcat atttttcagg 3240
atatcacctg tttgacaaga gaaggattac ataccacgat gaagatgaat tggaacatga 3300
tgcaagtgat gtagcgcccc atataggagt cactcaggaa agcacagaag agggagaaga 3360
tgtagacggt gcccatccac atgctgacgc tattggcggc ctcggcgttc tcctggtgga 3420
gcacctgcct gaggaacacc accaggccca cggcgacgcc aaaaaatgca aagttggcca 3480
acacatagct cactgcatcg tcaagtagag ctgcttaatc actgaggtaa aataaatatt 3540
ttaatttctt ttggatcaaa ccactatata tgcccccatt ttgcattgca gtgttgttca 3600
acactggtta gtttatctct actatatatc ttaaaagcac agtcatcctt attcccattc 3660
tatccataag aaacactaga aaaaactaac caattgagag aaaaatatgg gagaagagaa 3720
aaaaaaatta aaccacattc accatatcac atccgtttgc aaggcacggt cctatgacta 3780
gtattgtata aaatgataga ttgttctcca cattatattg gtataaatac tggactatta 3840
gtaaatcaaa cactattaac cacgaaaaaa aagagagagt tgggatgaga ttgtggggat 3900
taaattttta ccaagaagta gtgccattgt catctttcct cttgaagtct tcagttctgg 3960
gcttccctgg aaatgttggg tctgatcttc agtgtgcaca aatgactcat tgtatatcat 4020
ggaattgcat ggagagcatg atcccacaga ttcaacatct tccattggct tttaaaaaaa 4080
agtagttgag gaaaaaggtg tcacaactca cttaccactc tactagaaag taataaggat 4140
agactaaaaa ttttagagtt tttattcttg gtttgattaa ttcgccgaca aataataagt 4200
acaaacagaa caaatgattc tgaagtgtta cctatcatat tcaattataa tattcaacgt 4260
aacaagtagc aatctaaagg acatcatctt ggggaggtac ttaattggta cttcctccat 4320
tccaaaatgt ttgacgccgt tgacttttta aaatatgttt gaccgtttgt cttattcaaa 4380
aaatttaagt aattattaat tcttttccta tcatttgatt tattgttaaa tatactttta 4440
tgtatatata tagttttata tatttcataa aagtttttga ataagacgaa cggtcaaaca 4500
tatttaaaaa agccaacggc gtcaaacatt taaggaagga gggagtataa tataaaaaga 4560
atatgatgtt tttaggtttt gtcctcttct tgaagaggta tatgccttct taccatttta 4620
gaaatacctc gccataccgg agatatcaaa ctaattgcat aatttcacaa atcatattta 4680
taaatgtttt ttattttatt tttaaacttt gctaggtata tacatttagt tcgccttctt 4740
cagcgttgcc atggacctgg tgatgttctt ccggcgggtg ccccaccaag agaacgccgt 4800
ggccaccaac aacatcagca tatggatggg caccatcttc atctttgccc tctttagtgc 4860
tttccgtagt gattcctata cggggtgcta cttcacttgg atcatgttac aatttatctt 4920
catcgtgata tatgctcctt ctgttctcac ataggtgata tcttaaaatg tatgaggcat 4980
atatactttc tacctaatat tataaagtat atgcctctat atagaatcaa ataaagcaga 5040
aaagtcattg ttattaccaa tcgtgtactt ttgttctaaa catctcaact agtttaaagt 5100
atttgtctct cttgagcaat gggtttaaac ctctccacgg atgggagaga acctctacta 5160
tttgattgtt ccaacttttg acacaataga aacacagatg atactgaagg tatgaaaggt 5220
aaatagttag ttaaggttcc aatcattcaa atgctggaaa gtacatttac ttctatttta 5280
aactattaag gggtaaaaaa aaacagatat acgctcttac tctgatctca aatgccatga 5340
tctctgcaga tcccacggtg tcgggaacct tcaatacgaa tatatatata aaaaagaaaa 5400
gatcagtaag gaaatgtttg atctgctagc cttagttttc atattattaa attttagaaa 5460
atacaagtaa gattataaaa ttataagttt gctacaatat ttatgtctga acatagtata 5520
a 5521
<210>9
<211>2454
<212>DNA
<213>水稻
<220>
<221>其它特征
<222>(1)..(2454)
<223>N为A、T、G或C
<220>
<221>不确定
<222>(1)..(2454)
<223>在全部n位置都不确定
<400>9
aatcttattc tacatatttc tatcttatat agaacaacta gcatagctct cgttgcccag 60
ccaggttgcc cagccaggtt gcctggtgca caatgagagc tggctagggc ggactcattc 120
tgctgttggt gcccaacgat gctagctgct actcatacta gtgaagcctg ccatggttct 180
gagaaatttt tggatactcc gctgcgtaga tatgcactaa aagcttgtat gtttcgctga 240
ctacatacta tgctagacta tatatatgtg gtcatcctgt ggactggagc tgatcccctc 300
cacctccggc tcgatgccct tgaacaaccg cgcgaacacg atgaacacga cgaggtccac 360
ggcggacagc acggcgaggg tgatgaagga gcggtcgagg tggccgcggt cgagctcggc 420
caggatccac cccgccgtcc ctccgccggt ccgccgccgc gaggcgacgc cgctgatggc 480
gctcaccatc accatgctgg cgtagttccc cagcgagatg gacgccatgc acagcgagct 540
ccccaggctc ttcaccccct ccggcgactg cacgttgaag aactccagct gccccacgta 600
cacgaacacc tccgacgcgc ccatcaccgc gtactgcggc gcctgccaca gcacgctcat 660
ggcgcggccg ccggcgccgg atcggcggcg gcggtggacc tcgacgaccg ccgcggcgac 720
catgccgagc agcgcgatca cgaggcccgc gcccatgcgc ttgagctcgc cgacgccgcg 780
cgggttcttg gtcagcctcg ccgccgcggg caccaggacg tagtgggaga aggcgagcgt 840
ggcgagcacg ccggcgacgt cgaacaccga catggacgcg gccggcgcgt tgaacaggcc 900
caggatgtcg gtgtccatgg ccgcgccttg ctccacgaac aaggacgaca tctgggtgaa 960
ctccacggag tagacgatgc tgcagatcca gatgggcacc atgctcacca cgcacttggc 1020
ctcctccacc tgcgtcaccg tgcacagtct ccacgggttc ttggcgttcc cgtcgtggta 1080
gtcctcctcg gtcgccgtcg ccgccttgtc aagaaacctg agctggtcgc tgtgggcgag 1140
cttgccgacg ccacggatcg ccgagccctc gccatcgacc tcgtggaggt ggtcgccggg 1200
cggcggcacg atgtgccgct ggggttagtc ngggacgaac acctgggcga tgcgggtgag 1260
cgggttgccg gcaggtcgga cccggcggta gcgcggcgtg ccgaggagaa agagcgcgag 1320
cgcgagcgcg gcggcggcgg tggagaccca gaagccggcg acccaccggc ccctgtcctc 1380
gaagaacacc aggacggagt tgtagaagag ggagccgacg ttgagcgaga ggtagaagag 1440
gcagaagaag gcctgcttgc gccgccgctc gccggggtcg gcgtcgtcga actggtcggc 1500
gccgaacgtc gccaccgacg gctggtaccc gccgttcccg aacgccgcca tgtagatgga 1560
caggtagaac accgcgacgc cacgccggga cggcgccgcg cactgcctga gcccgccgcc 1620
gtcgccgcac cccggcggct ccaccaccca caaccacgac aacagcgaca ggagcatcaa 1680
ccccacgatg aagatgaatt ggaacatgat gcaagtgatg tagcgcccca tataggagtc 1740
actcaggaaa gcacagaaga gggagaagat gtagacggtg cccatccaca tgctgacgct 1800
attggcggcc tcggcgttct cctggtggag cacctgcctg aggaacacca ccaggcccac 1860
ggcgacgcca aaaaatgcaa agttggccaa cacatagctc acaagaagta gtgccattgt 1920
catctttcct cttgaagtct tcagttctgg gcttccctgg aaatgttggg tctgatcttc 1980
agtgtgcaca aatgactcat tgtatatcat ggaattgcat ggagagcatg atcccacaga 2040
ttcaacatct tccattggca ttttagaaat acctcgccat accggagata tcaaactggt 2100
gatgttcttc cggcgggtgc cccaccaaga gaacgccgtg gccaccaaca acatcagcat 2160
atggatgggc accatcttca tctttgccct ctttagtgct ttccgtagtg attcctatac 2220
ggggtgctac ttcacttgga tcatgttaca atttatcttc atcgtgatat atgctccttc 2280
tgttctcaca taggtgatat cttaaaatgt atgaggcata tatactttct acctaatatt 2340
ataaagtata tgcctctata tagaatcaaa taaagcagaa aagtcattgt tattaccaat 2400
cgtgtacttt tgttctaaac atctcaacta gtttaaagta tttgtctctc ttga 2454
<210>10
<211>684
<212>DNA
<213>水稻
<400>10
aatcttattc tacatatttc tatcttatat agaacaacta gcatagctct cgttgcccag 60
ccaggttgcc cagccaggtt gcctggtgca caatgagagc tggctagggc ggactcattc 120
tgctgttggt gcccaacgat gctagctgct actcatacta gtgaagcctg ccatggttct 180
gagaaatttt tggatactcc gctgcgtaga tatgcactaa aagcttgtat gtttcgctga 240
ctacatacta tggatatcac ctgtttgaca agagaaggat tacataccac gatgaagatg 300
aattggaaca tgatgttctt ccggcgggtg ccccaccaag agaacgccgt ggccaccaac 360
aacatcagca tatggatggg caccatcttc atctttgccc tctttagtgc tttccgtagt 420
gattcctata cggggtgcta cttcacttgg atcatgttac aatttatctt catcgtgata 480
tatgctcctt ctgttctcac ataggtgata tcttaaaatg tatgaggcat atatactttc 540
tacctaatat tataaagtat atgcctctat atagatcaaa taaagcagaa aagtcattgt 600
tattaccaat cgtgtacttt tgttctaaac atctcaacta gtttaaagta tttgtctctc 660
ttgaacaaaa aaaaaaaaaa aaaa 684
<210>11
<211>564
<212>DNA
<213>水稻
<220>
<221>其它特征
<222>(1)..(564)
<223>N为A、T、G或C
<220>
<221>不确定
<222>(1)..(564)
<223>在全部n位置都不确定
<400>11
aatcttattc tacatatttc tatcttatat agaacaacta gcatagctct cgttgcccag 60
ccaggttgcc cagccaggtt gcctggtgca caatgagagc tggctagggc ggactcattc 120
tgctgttggt gcccaacgat gctagctgct actcatacta gtgaagcctg ccatggttct 180
gagaaatttt tggatactcc gctgcgtaga tatgcactaa aagcttgtat gtttcgctga 240
ctacatacta tggatatcac ctgtttgaca agagaaggat tacataccac gatgaagatg 300
aattggaaca tgatgcaagt gatgtagcgc cccatatagg agtcactcag gaaagcacag 360
aagagggaga agatgtagac ggtgcccatc cacatgctga cgctattggc ggcctcggcg 420
ttctcctggt ggagcacctg cctgaggaac accaccaggc ccacggcgac gccaaaaaat 480
gcaaagntgg ccaacacata gctcactgca tcgncaagna gagctgcnta atcactgagg 540
gatatccatt tannntggnc ttct 564
<210>12
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>12
atcgtcggct acagcctcgg gaattctctg catgcgtttg gacgtatgct cattcag 57
<210>13
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>13
atcgtcggct acagcctcgg gaattctgcc ccaccaagag aacgccgtct gcatgcgttt 60
ggacgtatgc tcattcag 78
<210>14
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>14
atcgtcggct acagcctcgg gaattccggc gttctcttgg tggggcatct gcatgcgttt 60
ggacgtatgc tcattcag 78
<210>15
<211>99
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>15
atcgtcggct acagcctcgg gaattctgct gatgttgttg gtggccacgg cgttctcttg 60
gtggggcatc tgcatgcgtt tggacgtatg ctcattcag 99
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>16
cggcgttctc ttggtggggc a 21
<210>17
<211>939
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>17
aatcttattc tacatatttc tatcttatat agaacaacta gcatagctct cgttgcccag 60
ccaggttgcc cagccaggtt gcctggtgca caatgagagc tggctagggc ggactcattc 120
tgctgttggt gcccaacgat gctagctgct actcatacta gtgaagcctg ccatggttct 180
gagaaatttt tggatactcc gctgcgtaga tatgcactaa aagcttgtat gtttcgctga 240
ctacatacta tggatatcac ctgtttgaca agagaaggat tacataccac gatgaagatg 300
aattggaaca tgatgcaagt gatgtagcgc cccatatagg agtcactcag gaaagcacag 360
aagagggaga agatgtagac ggtgcccatc cacatgctga cgctattggc ggcctcggcg 420
ttctcctggt ggagcacctg cctgaggaac accaccaggc ccacggcgac gccaaaaaat 480
gcaaagttgg ccaacacata gctcactgca tcgtcaagta gagctgctta atcactgagg 540
gtatatacat ttagttcgcc ttcttcagcg ttgccatgga cctggtgatg ttcttccggc 600
gggtgcccca ccaagagaac gccgtggcca ccaacaacat cagcatatgg atgggcacca 660
tcttcatctt tgccctcttt agtgctttcc gtagtgattc ctatacgggg tgctacttca 720
cttggatcat gttacaattt atcttcatcg tgatatatgc tccttctgtt ctcacatagg 780
tgatatctta aaatgtatga ggcatatata ctttctacct aatattataa agtatatgcc 840
tctatataga tcaaataaag cagaaaagtc attgttatta ccaatcgtgt acttttgttc 900
taaacatctc aactagttta aagtatttgt ctctcttga 939
<210>18
<211>312
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>18
aatcttattc tacatatttc tatcttatat agaacaacta gcatagctct cgttgcccag 60
ccaggttgcc cagccaggtt gcctggtgca caatgagagc tggctagggc ggactcattc 120
tgctgttggt gcccaacgat gctagctgct actcatacta gtgaagcctg ccatggttct 180
gagaaatttt tggatactcc gctgcgtaga tatgcactaa aagcttgtat gtttcgctga 240
ctacatacta tggatatcac ctgtttgaca agagaaggat tacataccac gatgaagatg 300
aattggaaca tg 312
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>19
gcacagaaga gggagaagat g 21
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>20
tagacggtgc ccatccacat g 21
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>21
ctgacgctat tggcggcctc g 21
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>22
gcgttctcct ggtggagcac c 21
<210>23
<211>123
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>23
cccacggcga cgccaaaaaa tgcaaagttg gccaacacat agctcactgc atcgtcaagt 60
agagctgctt aatcactgag ggtatataca tttagttcgc cttcttcagc gttgccatgg 120
acc 123
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>24
tggtgatgtt cttccggcgg g 21
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>25
tccgtagtga ttcctatacg g 21
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>26
ggtgctactt cacttggatc a 21
<210>27
<211>210
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>27
tgttacaatt tatcttcatc gtgatatatg ctccttctgt tctcacatag gtgatatctt 60
aaaatgtatg aggcatatat actttctacc taatattata aagtatatgc ctctatatag 120
atcaaataaa gcagaaaagt cattgttatt accaatcgtg tacttttgtt ctaaacatct 180
caactagttt aaagtatttg tctctcttga 210
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>28
tgacatcaag tgatctatgc g 21
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>29
tacacctgca tctttggcac a 21
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>30
tctccttggc gagcggcgca t 21
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>31
ttgtggatgc agaaagcggt g 21
<210>32
<211>939
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>32
aatcttattc tacatatttc tatcttatat agaacaacta gcatagctct cgttgcccag 60
ccaggttgcc cagccaggtt gcctggtgca caatgagagc tggctagggc ggactcattc 120
tgctgttggt gcccaacgat gctagctgct actcatacta gtgaagcctg ccatggttct 180
gagaaatttt tggatactcc gctgcgtaga tatgcactaa aagcttgtat gtttcgctga 240
ctacatacta tggatatcac ctgtttgaca agagaaggat tacataccac gatgaagatg 300
aattggaaca tgatgcaagt gatgtagcgc cccatatagg agtcactcag gaaagcgcag 360
ctcgccaccg agatgcgccc aagatgcagg tgcatgctga cgctattggc ggcctcgcat 420
agatcccttg atatcacttt gtggatgcag aaagcggtgc ccacggcgac gccaaaaaat 480
gcaaagttgg ccaacacata gctcactgca tcgtcaagta gagctgctta atcactgagg 540
gtatatacat ttagttcgcc ttcttcagcg ttgccatgga caccgctctc tgcatcaaca 600
aagtgacatc aagtgatcta tgcgtggcca ccaacaacat cagcatacac ctgcatcttt 660
ggcacatctc cttggcgagc ggcgctttcc gtagtgattc ctatacgggg tgctacttca 720
cttggatcat gttacaattt atcttcatcg tgatatatgc tccttctgtt ctcacatagg 780
tgatatctta aaatgtatga ggcatatata ctttctacct aatattataa agtatatgcc 840
tctatataga tcaaataaag cagaaaagtc attgttatta ccaatcgtgt acttttgttc 900
taaacatctc aactagttta aagtatttgt ctctcttga 939
<210>33
<211>2072
<212>DNA
<213>水稻
<400>33
gattctcccc tgcgccgccg ccgccgccgc cgcctcaatc gggcgaagcc gccctcgccg 60
ccgtcgcggc ggcggcggcg agggcgagct cctgcgagag atcctccgcc gcctcatgcc 120
tcgcgcgcgc gctcccgctc ccgctctcgc ctgcagtatt tgttccattg ccgcgcacca 180
ctttccggtg ggcggcgggc aatgctaggg gttaagagac cttctctccc cgagatggag 240
gcgccgggcg gcgcggcggg ggacgcggag gaggaagttg atgcccggat ccgctgggtt 300
ccatggtggc tgctatggaa tggtggaatt gcttggatgg ccacgaaggg gatcgacgcc 360
aattgtttgg cgacctctac gatagaatcg cgtcgagtcg gggtgttctt tcctgttatt 420
actagaagta gttgaatttc gtgattgaac acacaaggaa gcttgatatc gcgtcggggg 480
tgttctttcc tgttattact agatgtagtt gggtttcgtg attgaacacc taaggaaagg 540
aagcttgata aatggaagat agtccagcaa gttttgaaga tgatagaaaa tttgagcgcg 600
tcgtagtaac tgtcgtccac gatcacgtcc agtgttgttc atggcatggg ggatggagtc 660
aggatccttg aggcgtctgc tcctgttgca ctgcttcatg cctttcctgc cttctaggat 720
gcttaagatg gttgcgaagt caggtgcttg ggagttcatg aagcggtcat aatcaatttc 780
gctctctgta gtactttctc tggtgtcttc cccgttgctt ccttttggaa gaaaagcgtc 840
ctttagaatc tcttgagaga gtgcactttc tccctctcct gccatcagta gtgcctttat 900
tttcgcttgg tttccgcatc atcaggtggc acttatagaa attattttat ggaggaaaaa 960
gcattgtatg gcatgataga aatatcctta tggataaaac taggacactt gcaagtgttc 1020
aatgggagtc accttacctt ttttgcctac ctgtctgcat ttcatgaatg ggattccttc 1080
tcctgcgccg gtgctgtctt ctcaaatggg aaatggaggc aagcatctgc cctgttccat 1140
ggtggcagcc atggaatgat gggatttctt tgatggtcat aaaggagatc aaaaccaacg 1200
gttggcaatc tctgcaggga tgatgaacca ggcttgtaat atctgttgct gatttctttg 1260
gaagacataa cggcaagctt catggggcac gatggatttc agatggttgc ttcagccatg 1320
tctcaagatt cagttgatgg acctcaagtt tctgggtgca gtgccacgag tcttggtcag 1380
cccaagagta agcgcaggac tggtgacaag gcaagagggg agaagaaggc actcaaagtt 1440
aagattaacc ttgccagccc ggccaaaaaa attaagaaaa gtagcaaaaa gaagggcaaa 1500
aagggcactg ttgctggcag gatagggaga aaatgcactc tctcaagaga ttctaaaggg 1560
cgctttcttc caagagagag taagggggga gacatcggag gaaatgctac agagagtgaa 1620
gttgattatg accgcttcat gaactttcag gcacctgact tcgctaccat cttaagtatt 1680
ttgaaaggct ggaaaggcat gaagcaatgt aacaagatca ggcgcctcaa ggatcctgac 1740
ttcgtccctc tcatgaacgt catgagcaac actggatatg tgaccgagga tgatggtcac 1800
tatgatgtgc tgaaagtctt gatgcatgca gatggctggt ctgcatagtg attcaagctc 1860
tcaaatcaaa acattcaggc ctatggcctt gttgctagaa cagtggtttc ttctttcacc 1920
tttaaaactt gatggacttt gttccattta tcttagaaat tttgttgccc ttgagtccgg 1980
tggatatgta ctggagtatg ctatactggg tgatttaatg gtgataatgt taaatcttga 2040
tactagttca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2072
<210>34
<211>675
<212>RNA
<213>水稻
<400>34
aguccagcaa guuuugaaga ugauagaaaa uuugagcgcg ucguaguaac ugucguccac 60
gaucacgucc aguguuguuc auggcauggg ggauggaguc aggauccuug aggcgucugc 120
uccuguugca cugcuucaug ccuuuccugc cuucuaggau gcuuaagaug guugcgaagu 180
caggugcuug ggaguucaug aagcggucau aaucaauuuc gcucucugua guacuuucuc 240
uggugucuuc cccguugcuu ccuuuuggaa gaaaagcguc cuuuagaauc ucuugagaga 300
gugcacuuuc ucccucuccu gccaucagua gugccuuuau uuucgcuugg uuuccggcaa 360
aaagggcacu guugcuggca ggauagggag aaaaugcacu cucucaagag auucuaaagg 420
gcgcuuucuu ccaagagaga guaagggggg agacaucgga ggaaaugcua cagagaguga 480
aguugauuau gaccgcuuca ugaacuuuca ggcaccugac uucgcuacca ucuuaaguau 540
uuugaaaggc uggaaaggca ugaagcaaug uaacagauca ggcgccucaa ggauccugac 600
uucgucccuc ucaugaacgu caugagcaac acuggauaug ugaccgagga ugauggucac 660
uaugaugugc ugaaa 675
<210>35
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>35
ucacguccag uguuguucau g 21
<210>36
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>36
gcauggggga uggagucagg a 21
<210>37
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>37
uccuugaggc gucugcuccu g 21
<210>38
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>38
uugcacugcu ucaugccuuu c 21
<210>39
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>39
cugccuucua ggaugcuuaa g 21
<210>40
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>40
augguugcga agucaggugc u 21
<210>41
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>41
ugggaguuca ugaagcgguc a 21
<210>42
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>42
uaaucaauuu cgcucucugu a 21
<210>43
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>43
guacuuucuc uggugucuuc c 21
<210>44
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>44
ccguugcuuc cuuuuggaag a 21
<210>45
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>45
aaagcguccu uuagaaucuc u 21
<210>46
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>46
ugagagagug cacuuucucc c 21
<210>47
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>47
ucuccugcca ucaguagugc c 21
<210>48
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>48
cacuguugcu ggcaggauag g 21
<210>49
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>49
gagaaaaugc acucucucaa g 21
<210>50
<211>20
<212>RNA
<213>水稻
<400>50
agauucuaaa gggcgcuuuc 20
<210>51
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>51
uuccaagaga gaguaagggg g 21
<210>52
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>52
gagacaucgg aggaaaugcu a 21
<210>53
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>53
cagagaguga aguugauuau g 21
<210>54
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>54
accgcuucau gaacuuucag g 21
<210>55
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>55
caccugacuu cgcuaccauc u 21
<210>56
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>56
uaaguauuuu gaaaggcugg a 21
<210>57
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>57
aaggcaugaa gcaauguaac a 21
<210>58
<211>20
<212>RNA
<213>水稻
<400>58
gaucaggcgc cucaaggauc 20
<210>59
<211>27
<212>RNA
<213>水稻
<400>59
cugacuucgu cccucucaug aacguca 27
<210>60
<211>23
<212>RNA
<213>水稻
<400>60
ugagcaacac uggauaugug acc 23
<210>61
<211>21
<212>RNA
<213>玉米
<400>61
uccuugaggc gucugcuccu g 21
<210>62
<211>21
<212>RNA
<213>玉米
<400>62
uugcacugcu ucaugccuuu c 21
<210>63
<211>21
<212>RNA
<213>玉米
<400>63
ugggaguuca ugaagcgguc a 21
<210>64
<211>21
<212>RNA
<213>玉米
<400>64
ugagagagug cacuuucucc c 21
<210>65
<211>21
<212>RNA
<213>玉米
<400>65
caccugacuu cgcuaccauc u 21
<210>66
<211>62
<212>RNA
<213>水稻
<400>66
aguccagcaa guuuugaaga ugauagaaaa uuugagcgcg ucguaguaac ugucguccac 60
ga 62
<210>67
<211>30
<212>RNA
<213>水稻
<400>67
gaggaugaug gucacuauga ugugcugaaa 30
<210>68
<211>31
<212>RNA
<213>水稻
<400>68
uuuauuuucg cuugguuucc ggcaaaaagg g 31
<210>69
<211>898
<212>DNA
<213>水稻
<400>69
aatcttattc tacatatttc tatcttatat agaacaacta gcatagctct cgttgcccag 60
ccaggttgcc cagccaggtt gcctggtgca caatgagagc tggctagggc ggactcattc 120
tgctgttggt gcccaacgat gctagctgct actcatacta gtgaagcctg ccatggttct 180
gagaaatttt tggatactcc gctgcgtaga tatgcactaa aagcttgtat gtttcgctga 240
ctacatacta tggatatcac ctgtttgaca agagaaggat tacataccac gatgaagatg 300
aattggaaca tgatgcaagt gatgtagcgc cccatatagg agtcactcag gaaagcacag 360
aagagggaga agatgtagac ggtgcccatc cacatgctga cgctattggc ggcctcggcg 420
ttctcctggt ggagcacctg cctgaggaac accaccaggc ccacggcgac gccaaaaaat 480
gcaaagttgg ccaacacata gctcactgca tcgtcaagta gagctgctta atcactgagg 540
tatatacatt tagttcgcct tcttcagcgt tgccatggac ctggtgatgt tcttccggcg 600
ggtgccccac caagagaacg ccgtggccac caacaacatc agcatatgga tgggcaccat 660
cttcatcttt gccctcttta gtgctttccg tagtgattcc tatacggggt gctacttcac 720
ttggatcatg ttacaattta tcttcatcgt gatatatgct ccttctgttc tcacataggt 780
gatatcttaa aatgtatgag gcatatatac tttctaccta atattataaa gtatatgcct 840
ctatatagat caaataaagc agaaaagtca ttgttattac aaaaaaaaaa aaaaaaaa 898
<210>70
<211>892
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>70
ggtaccaatc ttattctaca tatttctatc ttatatagaa caactagcat agctctcgtt 60
gcccagccag gttgcccagc caggttgcct ggtgcacaat gagagctggc tagggcggac 120
tcattctgct gttggtgccc aacgatgcta gctgctactc atactagtga agcctgccat 180
ggttctgaga aatttttgga tactccgctg cgtagatatg cactaaaagc ttgtatgttt 240
cgctgactac atactatgga tatcacctgt ttgacaagag aaggattaca taccacgatg 300
aagatgaatt ggaacatgat gcaagtgatg tagcgcccca tataggagtc actcaggact 360
ccacggtcat tgtgtatcat gtagacggtg cccatccaca tgctgacgct attggcggcc 420
ttggtccttc atagagaccc aacctaacag tgaacgtact gtcgccccac ggcgacgcca 480
aaaaatgcaa agttggccaa cacatagctc actgcatcgt caagtagagc tgcttaatca 540
ctgaggtata tacatttagt tcgccttctt cagcgttgcc atggagcgac agaacgttca 600
cggttaggtt gtgtctcttt gaaggaccat ggccaccaac aacatcagca tatggatggg 660
caccatcttc atgatgaaca atgacggtgg agtccgtagt gattcctata cggggtgcta 720
cttcacttgg atcatgttac aatttatctt catcgtgata tatgctcctt ctgttctcac 780
ataggtgata tcttaaaatg tatgaggcat atatactttc tacctaatat tataaagtat 840
atgcctctat atagatcaaa taaagcagaa aagtcattgt tattacgtta ac 892
<210>71
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>71
tggtacaacg tcattgatga c 21
<210>72
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>72
tggaccttac atggcccttc a 21
<210>73
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>73
taattgtgca gctcatcacc c 21
<210>74
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>74
tagatgggaa atatagatat c 21
<210>75
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>75
tgcttatatg tatgttctgt a 21
<210>76
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>76
tcaagagtct ttgaaagaaa g 21
<210>77
<211>880
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>77
aatcttattc tacatatttc tatcttatat agaacaacta gcatagctct cgttgcccag 60
ccaggttgcc cagccaggtt gcctggtgca caatgagagc tggctagggc ggactcattc 120
tgctgttggt gcccaacgat gctagctgct actcatacta gtgaagcctg ccatggttct 180
gagaaatttt tggatactcc gctgcgtaga tatgcactaa aagcttgtat gtttcgctga 240
ctacatacta tggatatcac ctgtttgaca agagaaggat tacataccac gatgaagatg 300
aattggaaca tgtggacctt acatggccct tcaatatagg agtcactcag gagtcatccg 360
tgacgttata ccagacatcc atatttccca tccactttct cttagagacc cttgtgggtg 420
atgagttgca cagttacctg cttatatgta tgttctgtac ccacggcgac gccaaaaaat 480
gcaaagttgg ccaacacata gctcactgca tcgtcaagta gagctgctta atcactgagg 540
tatatacatt tagttcgcct tcttcagcgt tgccatggat acagaaaata catatcagcg 600
ggtaattgtg cagctcatca ccctcaagag tctttgaaag aaagtagatg ggaaatatag 660
atatctggta caacgtcatt gatgactccg tagtgattcc tatactgaag ggccacgtaa 720
ggtgcacatg ttacaattta tcttcatcgt gatatatgct ccttctgttc tcacataggt 780
gatatcttaa aatgtatgag gcatatatac tttctaccta atattataaa gtatatgcct 840
ctatatagat caaataaagc agaaaagtca ttgttattac 880
<210>78
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>78
gugagaaagu gcccucucuc a 21
<210>79
<211>2040
<212>DNA
<213>水稻
<400>79
ccacgcgtcc gccaaaagtg aactgtgaac cggacgatcc aggcatccag ctaaccgctt 60
ccccctcgtc gcgctcgcgc cgcgccgcgc ctcgcctcca ccagctacgc cgtcacgcga 120
gctcacggcc cgggggcctc ggaagcacaa ccaccacgcg tccacgccga agccacgagg 180
agagcctgtc tctcctccgg ggattctatc gccggctggt ctcagcggcg ccacttggag 240
caggcggcac ccgctccgta ctgctgctga tttggtgagc gcgggcagcc gcgggatggg 300
agatctggtg gcgtgatggt gagcccgggc agtaaccggg gcggcctgtc gcgcgtatcg 360
acgcggggcg gcgtcgccgg gccggggagc ccgcgcgcct ctcctgccgc gaccgctttc 420
gcggcgctac ggcgcaggtg gcggtgggcg cccccgggct cgtcgacgct ggagcgcgcg 480
gcccgcgcgt tcctgctggc ctccgcagcg ctcgtgctct cctgcgcgct ctacctctac 540
gtgctgcgct acgtcggccg gggaggtcgc gccttcgccg ccgcgggctt cgtcggggac 600
gccgtcctgg gcctcggcgg cgagccgtgc gacgtgttcg acggcgcctg ggtgcccgac 660
gacaccggcc tccgcccgct ctacaatagc tccgggtgcc cgttcgctga gcgcgggttt 720
gactgcctcg ccaacgggcg gaacgacact gggtacctca agtggcggtg gaagccgcgc 780
cggtgcggcg tgccgcggtt tgcggcccgc accgcgctgg agcggctgcg cgggaagcgg 840
gtggtgttcg tgggggattc catgagccgc tcgcagtggg agtccttcat atgcatgctc 900
atggccggcg tggatgaccc caggacggtc ttcgaggtga acgggaacga gatcaccaag 960
acgatacgcc acctggcggt caggttcgcg tctcacggcc tcaccgtgga attcttccgg 1020
tccgtgttcc tcgtgcagga gcatcctgcc ccgcggcatg cccccaagag ggtcaaatcc 1080
actttgaggc ttgacaggat ggataatttc agccggaaat gggtcaattc ggacgtactg 1140
attttcaaca ctgggcattg gtggacaccg accaaattgt ttgatacggg ttgctatttt 1200
caggctggac gttctcttaa attaggtaca tccattgatg ctggtttcag gatggcactg 1260
gagacctggg cctcatgggt acaaaaaaga gttgatttaa accgaacaca tgtattcttt 1320
cgcacatatg agccatcgca ttggggggat acaagccaaa aggtgtgtga ggtaacagag 1380
cagccttcat cagaggccaa aggaaatgat aagagtgaat ttggggctat acttgctgat 1440
gttgtaacca acatgaaagt tcctatcaca gtactaaatg taactttaat gggatcgttt 1500
cgaagtgatg cacatgttgg cacttggagt tatcctccca ctatacttga ttgcagccac 1560
tggtgtcttc ctggagtccc tgatgcttgg aacgaactcg tgttttcgta ccttttgaca 1620
aatggttggc gaaacatggc gggctgaatt ttttggcagc acaatctacc cgcacctatt 1680
gcattgtgat atttgacatt accaggtata ctagagaatt aacatacgtc cgggacaagg 1740
cagctgcagc tgctaggtgg ttcactggac ttctacattc ttttcttctt tttgattttt 1800
gactcgtata cacggtgaag catgctacat gcaactagag ttgtatgtag ttggtaaggg 1860
attagaaggc cttggcattc gttctatttg ctcaatttac taacggttca ttttattatg 1920
ttgttaaaaa tcgagtttgt attgtaacct gtatgtacaa acatttactt gatacattgt 1980
gagaaagtgc cctctctcaa ttggattgat aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040
<210>80
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>80
gggcgaaggu gaacucucuc a 21
<210>81
<211>2523
<212>DNA
<213>水稻
<400>81
cggacgcgtg gggcgtgcgt ggtctccttc ctctcgtggc gacgaccgag cggccgtcgc 60
tgcttacgtg cccagtcctg ttcgtccctt cgccggcgac ggccacgacc tggttatagg 120
caaagtttgt cctgaactgt tcatcatggt ggaaggctgg gtattctctg ctttgttagt 180
ggtgtttcta gcgttcacaa caccttgcga gtcattctac ttgccaggta gttatatgca 240
cacatatcag caaggtgaag taataagggc gaaggtgaac tctctcactt ccattgagac 300
agaactaccc ttcagttact acagccttcc atactgtcgt cccagagatg gggttaagaa 360
gagtgctgaa aacttaggcg agcttctgat gggtgatcaa atagataatt ctccgtaccg 420
tttccgtgta aatgtcaacg aatctctgta tctgtgtact acaaccccac ttgacgaggc 480
taatgtgaag ctcctcaagc agcgtagcca tgatctatac caggtgaaca tgattcttga 540
caatcttcct gtgaggaggt tcacagagca gaatggaata accatccagt ggacaggcta 600
tccagttggt tatattccag aaggcacttc tgatgtctac atcatcaatc acctgaaatt 660
taaggtcttg gtccataagt atgaaggagg cgaagtaaag gtagttggga ctggggaagg 720
aatggaagtg atctcagaga ctgacaaaga tgccaattct ggatatgaga ttgtgggatt 780
tgaagttgtc ccatgcagcg tgaagcgtga tcctgaatcc atattgaagc ttaatatgta 840
tgataaagtc gatcctgtga actgccctgt ggagttggaa aaatctcaat tggttaggga 900
gaaagagaag attactttta cttatgaggt tgaatttgta aacagtgata tcaggtggcc 960
atcacggtgg gatgcatacc tgaagatgga gggttcgaag attcactggt tttcaattat 1020
gaactctttg atggtaattc tatttttggc tggcattgta tttgtcatat tcttgcgtac 1080
agtgaggagg gacttgactc ggtatgagga gttggataag gaggcccaag ctcagatgaa 1140
tgaggagctc tctggttgga agcttgttgt tggagatgtc ttcagagaac caacctcacc 1200
gaagctgctc tgtgtcatga ttggcgatgg ggttcagatt ttgggtatgg caattgttac 1260
cattttcttt gccgcatttg gcttcatgtc tcctgcatcg agaggaatgt tgttgacagg 1320
gatgatagtc ttttatatgt tacttggaat tgtgtctggg tatgctgctg tcaggctctg 1380
gaggacttta aaaggaacgt ccgagggatg gaggtctgtc tcctggtcaa ctgcttgttt 1440
cttccctggc attgtcttca ttgtcctcac tgtgttaaac ttcatgctgt ggacaagaaa 1500
tagtactgga gcccttccca tctcactttt ctttggcctt ttgtccttgt ggttctgtgt 1560
ctccgtgcca cttacccttt taggtggttt ctttggcaca agggctgagc caatagaatt 1620
ccctgttcga accaatcaga taccaagaga aatccctacg aagaagtact cattgctctt 1680
catacttggt gctggaactc taccttttgg aacactcttc atcgagctct tcttcattct 1740
ttctagtatt tggcttggaa ggttctatta cgtgtttggc ttcctccttg tcgtgcttct 1800
tttgctgatt gtggtgtgtg ctgaggtatc agttgttctt acctacatgc atctctgcgc 1860
ggaggactgg aggtggtggt ggaaagcttt ctttgcttct ggaacagtgg ccctttatgt 1920
gttcctttac tctatcaact acttggtgtt tgatctcaga agcttgagtg ggccagtttc 1980
tgctattctc tacattggat actctttcgt tgtctccctt gccattatgc tagcgactgg 2040
taccgttggc ttcctgacgt cgttctcttt tgtccactac cttttctcat cagtcaagat 2100
tgattgaaga tccagggttg tctttacaca aaatcacctg tgagctcaaa tgatatgacc 2160
attgcatctt gaaggccttt cacagagcag tgctgtttgt aatgtagctt attaccgaga 2220
gtctgagact gctgtacctt gtaatgaata gtatatttca gcagatgtgt tttgaagttt 2280
gtcacacttt gctacagcat tttgttgacc tgccaatact gtaggaaaag tcttgcgttt 2340
attatcccat ggtgccattt tgttgtctgt ttctttctgc aagattggct tgcagctgga 2400
gaactatacg ttcttatggt ataatctaca tgtgcaaaat gtttcccatc caaaaaaaaa 2460
aaaaaaatca gttcagaagt caccttcttt cgtgaatgtt ttgattccct gaggctactt 2520
tat 2523
<210>82
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>82
gccagaaggu gcacugucuc a 21
<210>83
<211>530
<212>DNA
<213>水稻
<400>83
gcagatgata gacacgacta aagattacat tcaagcgctg agcattgtgc cgacaagaga 60
gttggccttg cagacgtctc agattttcat cgaagtttca aagcacttga aagcccgcgt 120
gatggtgacc accggaggca cgaatttgaa ggacgacata atgcgtatat acgaaaacgt 180
tcacgttatc attgcgactc ccggtcgcat actcgatctg atggagaaga aggttgccaa 240
gatgaacaac tgtcaaatgc ttgttctcga cgaagccgac aaacttctgt ctcgggattt 300
ccaggggctc ctcgatcgag tcatctcgtt cttgccgcaa gaaagacaaa tccttctcta 360
ttcagctacg ttcccgatga ccgttgaaga attcatgcgc cgtcacctca agaacgccta 420
cgagatcaac cttatggagg agctcacact caagggagtg acacagtact acgctttcgt 480
acaggaacgc cagaaggtgc actgtctcaa cacgcttttc tcgaaacttc 530
<210>84
<211>20
<212>RNA
<213>水稻
<400>84
ggaaggccua agcagugcaa 20
<210>85
<211>2229
<212>DNA
<213>水稻
<400>85
atggcttcaa gggcggtcat cagaagaagg aagtatcttt tggatcatgt taacgcacct 60
accctctcat tgtccccctt ctctaccttc caacatggaa gatctggttc tgaggatgaa 120
tcaagaatcg gacagcgatt tcttgagcaa agctctgggg attccaaatg ggagcaaggg 180
cagtatggtg tgaaattgat aaagggagat ctactagccc ttggtaatgg gcttctgcgg 240
cgcccagccc atgggatttc tctacctgct tatggaattg gaaggaagga atttgggttg 300
cctatgggtg ctagacattt gctgcagtca gtccgcacag cctcaactgc aacagctggg 360
caacctaagt tggatattga agatgaacag agtgaggatc agaaacagaa caaaaggaaa 420
aaggaggcat ccccagaaga atgtgatcag gctgtggaag gcctaagcag tgcaaaagct 480
aaagccaaag ctaagcaggt acaagaatct gtaaaggctg gccaatcaat tgtacgaaaa 540
ttctgggcga ggcttctggg tattggtcct gctctccgag ctgttgcttc gatgagcaga 600
gctgattggg ctgcaaagct gaagcactgg aaggatgaat ttgtgtcaac gctgcagcat 660
tactggttag ggacaaagct actctgggca gatgtgagga tttcgtcaag attactggtg 720
aaacttgctg gtggaaagaa cctttcaaga agagagagac aacaactgac ccgtacaaca 780
gcagatatct tcaggctggt accttttgct gtgttcatca ttgttccatt catggagttc 840
ttacttccag tgttcctcaa gttatttcca aatatgcttc cctcaacttt ccaagacaag 900
atgaaagaag aggaagcgtt gaaaaggaaa ctgaaagcaa gaatggagta tgccaagttt 960
ttgcaagata ctgcaaaaga aatggcaaag gaagttcaaa catcacgtag tggagaaata 1020
aaacaaacag ccgaagatct tgatgaattt ttgaacaagg ttaggagagg tgaacatgtc 1080
tcaaatgatg aaatcttgaa cttcgcgaag ctgtttaatg atgagctgac tttggataac 1140
atgagcagac cacgcttggt aaacatgtgc aaatatatgg gtattcgacc tttcggtact 1200
gaccactact tgaggttcat gcttcgcaaa aaactgcaag acattaagaa tgacgataag 1260
atgattcaag ctgagggtgt tgagtctctc tctgaagagg aacttcggca agcctgtcgt 1320
gaacgtggtc acctaggttt gctgtcaaca gaagaaatgc gccaacagct ccgagattgg 1380
ttggatctct cacttaatca tgctgtgcca tcctctcttc tcatactttc aagagctttt 1440
accgtatctg ggaaaatgaa gcctgaggag gctgttgtag caaccttatc ttctctacca 1500
gatgaagttg tggatacagt tgggaccgta ttgccatctg aagattcggt ttctgagagg 1560
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aaagagaaag aagaaaaagc gaaacaagag aaagaagaaa aggccaaact caaagaacca 1680
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gaagaactga gagaagcaaa acagcacgat aaggaaaagc tctgtaattt tagtcgagca 1800
ctggctgtac tggcatccgc atcgtctgtt agcaaggagc gtcaagagtt cctcagcctt 1860
gtcaacaaag agattgaact gtataactct atgcttgaaa aggagggtac agaaggtgaa 1920
gaggaagcta agaaagctta catggctgct agagaagagt cggacaaggc tgctgaggtt 1980
gatgaagaag aaaaggtctc atcggcgctg attgagaagg ttgatgctat gctccagaaa 2040
ttagaaaagg agattgatga cgtggatgca caaattggaa accgatggca aattcttgat 2100
agggatcttg atggcaaggt gactcctgag gaggtagcgt cagcagcagc ttatctgaag 2160
gatacaatag gaaaggaagg cgtccaagag cttgtcagca acctctctaa agacaaaggt 2220
cctccctga 2229
<210>86
<211>22
<212>RNA
<213>水稻
<400>86
gaaauucaug gaagcagugc ag 22
<210>87
<211>1521
<212>DNA
<213>水稻
<400>87
atggccgcct cctcttcctt cctcgccgcc ggccgccgcc tgatccgcct cggctgcggc 60
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gccgccgccg cctcctcccc cgcctctcct cgcggccaca gcggggggag gaagccggcg 180
cggcccccga gcctgcagtc cacgctgtgg ccgctgggcc acccgggcac gctcctggtg 240
ccggagatcg agcggtgggc ggccaagcca ggcaaccgcc tccgccacgt cgagctcgag 300
cgcatcgtca aggagctccg caagcgacgc cgccaccgcc aggccctcga ggtctctgaa 360
tggatgaatg ccaagggaca tgtaaaattt ctgccaaagg atcacgctgt tcacctggat 420
ttgattggtg aaattcatgg aagcagtgca gccgagactt acttcaacaa cctgccagat 480
aaagataaga cagaaaaacc ctatggtgca cttcttaact gctacacacg ggaactcctg 540
gttgaaaaat cgttggctca ttttcagaag atgaaagagt tgggttttgt gttttccaca 600
ctcccctaca acaacatcat gggtctgtat acgaacctag ggcagcatga aaaggttcct 660
tcagtaattg cagagatgaa aagcaatggt atcgttcctg acaatttcag ctacagaata 720
tgcattaact cttatggcac aagggctgat tttttcggga tggaaaacac ccttgaagag 780
atggagtgtg aacctaaaat cgttgttgat tggaacacgt atgctgtcgt ggcaagcaac 840
tacattaagg gcaacataag ggagaaagca ttctctgcct taaagaaagc agaagcaaaa 900
ataaatataa aagattcaga ttcctataac cacctgattt ccttgtatgg acatctgggg 960
gacaaatcag aggtcaatag gctgtgggcg ctccaaatgt cgaactgcaa taggcatatt 1020
aataaggatt acactacaat gcttgcagtg ctcgtgaaac ttaatgagat tgaagaagct 1080
gaagtgttgc tgaaagagtg ggagtcgagc ggaaatgcat ttgacttcca agttccaaat 1140
gtcctgctca ctggataccg ccagaaggac ttgctggaca aggctgaggc acttctggat 1200
gatttcttga agaagggaaa gatgcctcct tcaaccagct gggcaattgt ggcagctggc 1260
tatgcggaga aaggtgatgc tgcgaaagca tatgagctga caaagaatgc cctatgtgta 1320
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aaggttaaag atgcagtgta a 1521
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<213>水稻
<400>88
ggaaggccug aagcaugcaa 20
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<212>DNA
<213>水稻
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cgtgcctttt ccgtcgtccc attcgccagg ggggaacggc aaagggcatc gtcgcaaaca 60
atcaagttcc acaaactcgc atctcatctg cttcgactcc accgaggact cccttctttc 120
ctcccactcc catctgctct cctcgccgcc acctgcgccg tcagagcacg gagcagtccg 180
cgaccacgct ttcgctgccg ctctccgaca ggcgacggag ccgcagctcc agtcgcagtc 240
ggctcccctg aattcgggct cgccaaatac cctccaatcg tctgcgtccg tcgtccggga 300
cttccggtgc aactgaatcc ggcaccacct gtgcggcctg tcatggcact tggaagagga 360
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Claims (19)
1.一种编码折叠成杂合RNA的转录物的重组DNA构建体，所述杂合RNA在体内被相位性切割成多个具有抑制基因作用的小双链RNA。
2.权利要求1的重组DNA构建体，其中所述杂合RNA的产生与RNA依赖性RNA聚合酶无关。
3.权利要求1的重组DNA构建体，其中所述杂合RNA在体内被DCL4或DCL4直系同源物相位性切割成多个具有基因抑制作用的小双链RNA。
4.权利要求1的重组DNA构建体，其中所述多个小双链RNA含有至少3个小双链RNA。
5.权利要求1的重组DNA构建体，其中所述杂合RNA含有得自天然相位型小RNA基因座的转录物的结构。
6.权利要求1的重组DNA构建体，其中所述构建体含有得自相位型小RNA模板序列的核苷酸序列，其中在所述相位型小RNA模板序列中的至少1个21个连续核苷酸的区段被修饰以抑制靶基因。
7.权利要求1的重组DNA构建体，其中所述小双链RNA各自均含有至少1个错配。
8.权利要求1的重组DNA构建体，其中所述基因抑制为1个靶基因的基因抑制。
9.权利要求1的重组DNA构建体，其中所述基因抑制为多个靶基因的基因抑制。
10.一种重组DNA构建体，所述构建体含有的DNA转录为：
(a)第一个系列的连续RNA区段，和
(b)第二个系列的连续RNA区段，
其中所述第一个系列的连续RNA区段在体内与所述第二个系列的RNA区段杂交，形成杂合RNA，所述杂合RNA在体内被DCL4或DCL4直系同源物相位性切割成多个具有抑制基因作用的小双链RNA。
11.权利要求10的重组DNA构建体，其中所述RNA区段各自由20至27个核苷酸组成。
12.权利要求10的重组DNA构建体，其中所述第一个系列和第二个系列包含21个核苷酸的RNA区段。
13.权利要求10的重组DNA构建体，其中所述杂合RNA的链位于一个分子上，所述构建体还含有被转录为间隔区的DNA，所述间隔区连接所述第一个和第二个系列的连续RNA区段。
14.权利要求10的重组DNA构建体，其中所述杂合RNA的链位于不同分子上。
15.权利要求10的重组DNA构建体，其含有至少1个得自天然相位型小RNA基因座转录物的核苷酸序列，所述转录物选自5’侧翼序列、3’侧翼序列和间隔序列。
16.一种含有启动子和与其有效连接的、转录为RNA的DNA的重组DNA构建体，所述RNA含有：
(a)至少一个可被相位型小RNA识别的外源识别位点，所述相位型小RNA在多细胞真核生物的特定细胞中表达，和
(b)在所述特定细胞中被抑制的靶RNA，
其中所述靶RNA在所述特定细胞之外的所述多细胞真核生物的细胞中表达。
17.权利要求16的重组DNA构建体，其中所述至少1个外源识别位点位于至少以下其中之一中：
(a)所述靶RNA的5’非翻译区；
(b)所述靶RNA的3’非翻译区；和
(c)所述靶RNA。
18.一种在其基因组中具有权利要求1、权利要求10或权利要求16的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞。
19.一种非天然转基因植物，所述植物含有权利要求18的非天然转基因植物细胞。
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