ES2220913T3 - Procedimiento para la transformacion de monocotiledonas utilizando el escutelo de un embrio inmaduro. - Google Patents
Procedimiento para la transformacion de monocotiledonas utilizando el escutelo de un embrio inmaduro.Info
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Abstract
Procedimiento para transformar monocotiledones que comprende transformar el escutelo de un embrión inmaduro de un monocotiledón con una bacteria perteneciente al género Agrobacterium que contiene un gen deseado, dicho embrión no habiendo sido sometido a un tratamiento de desdiferenciación, para obtener un transformante.
Description
Procedimiento para la trasformación de
monocotiledones utilizando el escutelo de un embrión inmaduro.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de transformación de monocotiledones.
Los procedimientos convencionales de
transformación de monocotiledones incluyen el procedimiento de
electroporación, el procedimiento del polietilenglicol
(procedimiento PEG), procedimiento de pistola de partículas y
otros.
El procedimiento de electroporación es un
procedimiento en el que los protoplastos y el DNA deseado se mezclan
y se forman agujeros en las membranas celulares mediante un pulso
eléctrico con el fin de introducir el DNA dentro de las células,
transformándose, de esta manera, las células. Se han introducido
diversos genes en los monocotiledones, especialmente en plantas de
arroz, siguiendo este procedimiento (Toriyama, K. et al.,
1998; Biotech. 6: 1072-1074, Shimamoto K. et
al., 1989; Nature 338: 274-276, Rhodes C. A.
et al., 1988; Science 240:204-207). Sin
embargo, este procedimiento tiene problemas en que 1) se puede
aplicar sólo a especies de plantas para las que se ha establecido el
sistema de regeneración de plantas a partir de protoplastos, 2)
puesto que lleva varios meses regenerar las plantas a partir de los
protoplastos, se requiere de un largo periodo de tiempo para obtener
los transformantes y 3) puesto que el periodo de cultivo es largo,
la frecuencia de aparición de mutantes durante el cultivo es alta de
acuerdo con esto, de manera que la frecuencia de obtención de
transformantes normales disminuye.
El procedimiento PEG es un procedimiento en el
que se mezclan el gen deseado y los protoplastos y la mezcla se
trata con PEG, introduciéndose, de esta manera, el gen dentro de los
protoplastos. Este procedimiento es diferente del procedimiento de
electroporación en que se utiliza PEG en lugar del pulso eléctrico.
La eficacia en la introducción del gen mediante este procedimiento
se piensa que es algo inferior al del procedimiento de
electroporación. Aunque existen algunas publicaciones que mencionan
que los transformantes se obtenían mediante este procedimiento, este
procedimiento no se utiliza ampliamente. Cuando se utilizan
protoplastos, este procedimiento tiene los mismos problemas que el
procedimiento de electroporación (Zhang W et al., 1988;
Theor. Appl. Genet. 76: 835-840, Datta S. K. et
al., 1990; Biotech. 8:736-740).
Recientemente, se ha publicado un documento de un
procedimiento de introducción de un gen en embriones inmaduros
tratados débilmente con un enzima de degradación de la pared celular
y callos de maíz mediante un pulso eléctrico (D'Halluin K. et
al., 1992; Plant Cell 4: 1495-1505). La
existencia del gen introducido se ha confirmado también en plantas
regeneradas. Sin embargo, solo se ha realizado un artículo en el que
se describa el éxito en la transformación.
El procedimiento de pistola de partículas es un
procedimiento en el que el gen deseado se une a partículas metálicas
finas y las partículas metálicas son disparadas a las células o
tejidos a una velocidad elevada, llevándose a cabo, así, la
transformación. De esta manera, de acuerdo con este principio, la
transformación se puede realizar en cualquiera de los tejidos. Por
lo tanto, se dice que este procedimiento es efectivo en la
transformación de las especies de plantas para las que no se hayan
establecidos los sistemas de regeneración de plantas a partir de
protoplastos.
Se han realizado diversos artículos de obtención
de transformantes de maíz con la fertilidad normal mediante
transformación de callos de maíz de tipo II (Armstrong C. L. y Green
C. E., 1985; Planta 164:207-214) mediante el
procedimiento de pistola de partículas (Gordon-Kamm
W. J. et al., 1990; Plant Cell 2: 603-618,
Fromm M. E. et al., 1990; Biotech 8:833-839,
Walters D. A. et al., 1992; Plant Mol. Biol.
18:189-200, Vain P. et al., 1993; Plant Cell
Rep. 12: 84-88). Sin embargo casi todos los
artículos utilizaban variedades fácilmente cultivables como
materiales de partida y las técnicas descritas en esos documentos no
se podían aplicar a variedades no limitadas.
Vasil et al., obtuvo callos resistentes a
Basta y plantas regeneradas introduciendo un gen bar (Thompson C. J.
et al., 1987; EMBO J. 6: 2519-2523) capaces
de acetilar la fosfinotricina, que es el componente principal en
herbicidas tales como el Basta, bialafos, etc, y el gen GUS en los
callos embriogénicos de trigo, utilizando una pistola de partículas.
Estos identificaron la actividad del enzima que es un producto de
los genes introducidos en estos callos y plantas regeneradas y
también se identificó el gen bar en estos mediante análisis de
transferencia Southern (Vasil V. et al., 1992; Biotech. 10:
667-674).
Li et al., obtuvieron plantas regeneradas
resistentes a higromicina, introduciendo un gen de resistencia a
higromicina en embriones inmaduros y callos embriogénicos de arroz
utilizando una pistola de partículas seguido de la selección de los
transformantes. Estos identificaron el gen de resistencia a
higromicina en las plantas mediante análisis de transferencia
Southern. Revelaron que la relación de segregación de las plantas
resistentes a higromicina y sensibles a higromicina en la progenie
R1 de las plantas era de 3:1 (Li et al., 1993; Plant Cell.
Resp. 12:250-255).
Christou et al., obtuvieron plantas que
son resistentes a higromicina o bialafos y que tienen una actividad
GUS introduciendo el gen bar, un gen de resistencia a higromicina y
un gen GUS en embriones inmaduros de arroz mediante la utilización
de una pistola de partículas, e identificaron los genes introducidos
en las plantas mediante análisis de transferencia Southern (Christou
P. et al., 1991; Biotech 9:957-962).
Koziel et al., obtuvieron plantas
resistentes a fosfinotricina introduciendo el gen bar y un gen
productor de la toxina Bt en embriones inmaduros de maíz mediante la
utilización de una pistola de partículas. Identificaron la
producción de una proteína de la toxina Bt en estas plantas y
también los genes introducidos ahí mediante análisis de
transferencia Southern (Koziel M. G. et al., 1993; Biotech.
11: 194-200).
Otros procedimientos incluyen 1) cultivar
semillas o embriones con DNA (Topfer R et al., 1989; Plant
Cell 1:133-139; Ledoux L. et al., 1974;
Nature 249:17-21), 2) tratar los tubos de polen (Luo
y Wu, 1988; Plant Mol. Biol. Rep. 6: 165-174), y 3)
procedimiento de liposomas (Caboche M., 1990; Physiol. Plant.
79:173-176, Neuhaus G. et al., 1987; Theor.
Appl. Genet. 75:30-36). Sin embargo, estos
procedimientos tienen problemas de eficacia en la transformación,
reproducibilidad o aplicabilidad, por lo que estos procedimientos no
son populares.
Por otro lado, se utiliza ampliamente un
procedimiento para introducir un gen utilizando el plásmido Ti de
una bacteria que pertenece al género Agrobacterium como
vector para transformar dicotiledones como los de tabaco, petunia,
rape y similares. Sin embargo, se dice que los hospedadores de las
bacterias que pertenecen al género Agrobacterium se
restringen a solo dicotiledones y que los monocotiledones no son
infectados por Agrobacterium (De Cleene M., 1976; Bot. Rev.
42:389-466).
Como para la transformación de monocotiledones
por Agrobacterium, a pesar de que se haya publicado la
transformación de asparagus (Bytebier B. et al., 1987; Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84:5345-5349) y de Dioscore
bulbifera (Schafer et al., 1987; Nature
327:529-532), se dice que este procedimiento no se
puede aplicar a otros monocotiledones, especialmente a plantas que
pertenecen a la familia Gramineae (Potrykus I., 1990;
Biotechnology 8:535-543).
Grimsley et al., publicaron que el
T-DNA de Agrobacterium en el que el DNA del
virus estriado de maíz se había insertado, se inoculó en los
meristemos apicales de plantas de maíz y se confirmó la infección de
las plantas mediante virus estriado del maíz. Puesto que los
síntomas infectados no se observan cuando el DNA del virus estriado
del maíz se inocula meramente en este, ellos interpretaron el
resultado anteriormente mencionado como una parte de la evidencia
que muestra que Agrobacterium puede introducir el DNA en el
maíz (Grimsley et al., 1987; Nature
325:177-179). Sin embargo, puesto que es posible que
los virus se repliquen incluso si no se incorporan dentro del genoma
del núcleo, el resultado no muestra que el T-DNA se
incorporara dentro del núcleo. Publicaron, subsiguientemente, que la
eficacia de la infección es la más alta cuando se inocula el
Agrobacterium en los meristemos apicales en los ápices de las
raíces de maíz (Grimsley et al., 1988; Biotech.
6:185-189) y que el gen virC en el plásmido
Agrobacterium es indispensable para la infección (Grimsley
et al., 1989; Mol. Gen. Genet.
217:309-316).
Gould et al. inocularon los meristemos
apicales del maíz con Agrobacterium EHA1 supervirulento que
tenía un gen de resistencia a canamicina y un gen GUS después de
haberlas lesionado con una aguja, y seleccionado los meristemos
apicales tratados de esta manera en base a su resistencia a la
canamicina. Como resultado, se obtuvieron las plantas que tienen
resistencia a canamicina. Estos confirmaron por análisis de
transferencia Southern que algunas de las semillas de las
generaciones posteriores de las plantas seleccionadas de esta manera
tenían introducidos los genes (Gould J. et al., 1991; Plant
Physiol. 95: 426-434). Esto significa que las
plantas crecen a partir de los meristemos apicales tratados con
Agrobacterium y se seleccionan en base a su resistencia a
canamicina que tienen tanto células transformadas como células no
transformadas (fenómeno quimera).
Mooney et al., intentaron introducir un
gen de resistencia a canamicina en embriones de trigo utilizando
Agrobacterium. Los embriones se trataron con un enzima para
lesionar sus paredes celulares y, a continuación, se inocularon las
células de Agrobacterium. Entre los callos tratados, se
asumió que una pequeña cantidad de callos tuvieran un aumento de
resistencia a canamicina, pero las plantas no se pudieron regenerar
a partir de estos callos. La existencia del gen de resistencia a
canamicina en estos se comprobó mediante análisis de transferencia
Southern. Como resultado, en todos los callos con resistencia, se
observó el cambio en la estructura del gen introducido (Mooney P. A.
et al., 1991; Plant Cell, Tissue, Organ Culture,
25:209-218).
Raineri et al., inocularon 8 variedades de
arroz con Agrobacterium A281 supervirulento (pTiBo542)
después de haber lesionado el escutelo de las plantas de arroz. Como
resultado, se observó el crecimiento de tejidos similar a tumores en
dos variedades, Nipponbare y Fujisaka 5. Además, las células de
Agrobacterium que contenían un plásmido que tenían un
T-DNA del cual se había extraído el gen sintetizador
de la hormona y, en su lugar, se habían insertado un gen de
resistencia a canamicina y un gen GUS dentro de éstas se inocularon
en los embriones de arroz. Como resultado, se observó el crecimiento
de callos resistentes a canamicina. Aunque se observó la expresión
del gen GUS en estos callos resistentes, no se pudieron obtener las
plantas transformadas a partir de los callos. Ellos interpretaron a
partir de estos resultados que el T-DNA de
Agrobacterium se introducía en las células de arroz (Raineri
et al., 1990; Biotech. 8:33-38).
De esta manera, se han publicado los resultados
experimentales que sugieren que la introducción de genes dentro de
las plantas que pertenecen a la familia Gramineae como el
arroz, maíz y trigo se puede conseguir utilizando
Agrobacterium. Sin embargo, todos estos tienen un problema en
la reproducibilidad y dieron resultados no convincentes puesto que
no se identificaron completamente los genes introducidos. (Potrykus
I. 1990; Biotech. 8:535-543).
Chan et al., lesionaron embriones
inmaduros de arroz que habían sido cultivados durante 2 días en
presencia de 2,4-D y, a continuación, se inocularon
en las células de Agrobacterium que tenían el gen nptII y el
gen GUS en un medio que contenía células de patata cultivadas en
suspensión. Cultivaron los embriones inmaduros inoculados de esta
manera en un medio al que se había añadido G418 para obtener plantas
regeneradas a partir de los callos inducidos. Investigaron la
existencia del gen GUS en las plantas regeneradas y estas progenies
mediante análisis de transferencia Southern y se encontró la
existencia del gen introducido tanto en R_{0} como en R_{1}
(Chan M. T. et al., 1993; Plant Mol. Biol., 22:
491-506). Estos resultados soportan la
transformación del arroz con Agrobacterium pero la frecuencia
de transformación fue tan baja como 1,6%. Además, solo se obtuvo una
planta regenerada que tenía el crecimiento normal de los 250
embriones inmaduros ensayados. La separación de embriones inmaduros
de las plantas de arroz necesita más trabajo. Por lo tanto, dicha
baja eficacia en la transformación no es a nivel práctico.
Como se ha mencionado más arriba, la introducción
de genes en plantas pertenecientes a la familia Gramineae se
lleva a cabo ahora, principalmente, mediante el procedimiento de
electroporación y el procedimiento de pistola de partículas. En el
procedimiento de electroporación, sin embargo, puesto que se
utilizan protoplastos, se requiere de un periodo de tiempo largo y
mucho trabajo para obtener plantas regeneradas. Además, existe el
peligro de que puedan surgir mutantes con una frecuencia elevada
debido al largo periodo de cultivo. Además, todavía este
procedimiento no se puede aplicar a plantas tales como el maíz para
los que no se ha establecido que el sistema de regeneración de
plantas a partir de los protoplastos. Se ha publicado un
procedimiento en el que los genes se introducen en embriones
inmaduros que han sido tratados con un enzima en tal grado que las
células no se convierten en protoplastos, mediante pulso eléctrico
(D'Halluin K. et al., 1992). Sin embargo, solo se conoce, por
ahora, un éxito en el procedimiento. Por lo tanto, es difícil decir
que el procedimiento sea popular. Dadas las situaciones, el
procedimiento de pistola de partículas mencionado más arriba se ha
aplicado al maíz, utilizando callos de tipo II o embriones
inmaduros. El procedimiento de pistola de partículas da una elevada
posibilidad de obtener los transformantes deseados pero necesita un
aparato especial, una pistola de partículas. Sin el aparato, no se
puede llevar a cabo el procedimiento de pistola de partículas.
Además, el procedimiento de pistola de partículas tiene otro
problema en que las partículas metálicas finas se dispersan a menudo
para dejar a los investigadores en peligro.
Para el maíz, se ha intentado un procedimiento
para infectar sus meristemos apicales con células de
Agrobacterium (Gould J. et al., 1991). Sin embargo, se
necesita mucho esfuerzo para aislar los puntos de crecimiento del
maíz y no es fácil siempre preparar una gran cantidad de estos. Los
inventores presentes intentaron producir en vano transformantes de
maíz mediante este procedimiento (véase Tabla 1 de más abajo).
De acuerdo con esto, un objeto de la presente
invención es proporcionar un procedimiento de transformación de
monocotiledones, con el que el tiempo requerido para la obtención de
plantas regeneradas desde el momento de la transformación es más
corto que en los procedimientos convencionales, el cual se puede
aplicar de manera general incluso a las plantas para las que todavía
no se han establecido los sistemas para regenerar plantas a partir
de protoplastos sin requerir ningún aparato especial, y con el que
la preparación de los materiales a ser utilizados es fácil.
Los inventores presentes estudiaron intensamente
las influencias de los tejidos de plantas monocotiledóneas a ser
tratadas con Agrobacterium, las condiciones de tratamiento
con Agrobacterium, las constituciones de vectores binarios,
etc, en la eficacia de introducción de genes en los monocotiledones
y, como resultado, han descubierto que los embriones inmaduros de
monocotiledones a los que no se les ha aplicado un tratamiento de
desdiferenciación, se pueden transformar con bacterias que
pertenecen al género Agrobacterium con una eficacia
drásticamente alta, que el procedimiento de transformación es
reproducible y que el objeto mencionado más arriba se puede obtener
mediante este procedimiento, completándose de esta manera la
presente invención.
Específicamente, la presente invención
proporciona un procedimiento de transformación de monocotiledones
que comprende transformar el escutelo de un embrión inmaduro de un
monocotiledón con una bacteria perteneciente al género
Agrobacterium que contiene un gen deseado, no estando
sometido dicho embrión inmaduro a un tratamiento de
desdiferenciación, para obtener un transformante.
El procedimiento de la presente invención es el
primero que ha hecho posible la introducción reproducible de un gen
extraño deseado dentro de los monocotiledones, por ejemplo plantas
de la familia Gramineae, tales como el arroz, maíz, trigo,
cebada, etc. Hasta este momento son bien conocidos procedimientos
para la transformación de monocotiledones con células de
Agrobacterium. Como se ha mencionado más arriba, sin embargo,
es difícil decir que los procedimientos conocidos sean unos
establecidos. De acuerdo con la presente invención, contrario a
estos, los embriones inmaduros de monocotiledones, que no han sido
sometidos a un tratamiento de desdiferenciación, que no han sido
utilizados en la técnica anterior, se inoculan con células de
Agrobacterium mediante el procedimiento mejorado de acuerdo
con la presente invención, introduciéndose de esta manera, un gen
deseado en el mismo con facilidad. Puesto que el procedimiento de la
presente invención utiliza embriones inmaduros que se pueden
preparar fácilmente, los materiales para el procedimiento se pueden
obtener más fácilmente que los del estado de la técnica que utilizan
los meristemos apicales de plantas. Además, puesto que la
transformación se realiza en el escutelo de los embriones inmaduros
de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, el tiempo
necesario para regenerar las plantas a partir de los transformantes
resultantes se puede acortar cuando se compara con la transformación
de protoplastos y, adicionalmente, la frecuencia de mutación está
disminuida. Cuando se utiliza un vector superbinario para llevar a
cabo la presente invención, es posible introducir un gen deseado en
variedades que son difíciles de cultivar, tales como el maíz o
algunas variedades de arroz, con una eficacia elevada.
La Figura 1 muestra la estructura de pTOK162 que
es un ejemplo del plásmido contenido en la bacteria del género
Agrobacterium utilizable en la presente invención y la
construcción del plásmido pTOK232 utilizado en el ejemplo de la
presente invención.
La Figura 2 muestra la estructura de pSB1 y la
construcción del plásmido pSB131, como en la Figura 1.
Los monocotiledones a ser transformados mediante
el procedimiento de la presente invención no están restringidos. La
presente invención se puede aplicar a cualquier monocotiledón, como
por ejemplo, arroz, maíz, trigo, cebada, espárrago, etc. Son
preferidas las plantas que pertenecen a la familia Gramineae
que incluyen el arroz, maíz, trigo, cebada, etc. El maíz es el más
preferido.
El término "embrión inmaduro" significa aquí
el embrión de una semilla inmadura que está en el estadio de
maduración después de la polinización. El estadio de maduración de
los embriones inmaduros a ser tratados mediante el procedimiento de
la presente invención no están restringidos y los embriones
recogidos pueden estar en cualquier estadio después de la
polinización. Los embriones preferidos son los recogidos en no menos
de dos días después de su fertilización. También son preferidos los
escutelos de embriones inmaduros capaces de inducir una
desdiferenciación de los callos que tienen capacidad para regenerar
las plantas normales después de haber sido transformadas mediante el
procedimiento mencionado más abajo. Los embriones inmaduros pueden
ser preferiblemente endogámicos, F_{1} entre endogámicos, F_{1}
entre un endogámico y una variedad polinizada de manera natural y
variedades F_{1} comerciales.
"Tratamiento de desdiferenciación" significa
un procedimiento de obtención de agregaciones celulares, tales como
callos, que muestran un crecimiento desorganizado mediante cultivo
de células diferenciadas de tejidos de plantas en un medio de
desdiferenciación.
Como la Agrobacterium a ser utilizada para
la transformación, se pueden utilizar los Agrobacterium que
tienen un plásmido Ti o un plásmido Ri y que han sido hasta ahora
utilizados para la transformación de dicotiledones. Muchos de estos
Agrobacterium contienen un vector que tiene una región de DNA
originada a partir de Agrobacterium tumefaciens. El
gen codificante del carácter que se desea dar a la planta, se
inserta en este vector, o existe en un plásmido separado y se
inserta en el plásmido Ti in vivo mediante recombinación
homóloga o similares. Komari et al., desarrolló un vector que
contenía una región de DNA originada a partir de la región virulenta
(región vir) del plásmido Ti pTiBo542 contenido en un
Agrobacterium tumefaciens A281 altamente virulento que tiene
una eficacia de transformación extremamente elevada (Hood E. E.
et al., 1984; Bioetch. 2:702-709, Hood, E. E.
et al., 1986; J. Bacteriol. 168:1283-1290,
Komari, T et al., 1986; J. Bacteriol. 166:
88-94, Jin, S. et al., 1987; J. Bacteriol.
169:4417-4425, Komari, T., 1989; Plant Science,
60:223-229, ATCC 37349) (Solicitud de patente
japonesa en trámite (Kokai) Nº 4-222527). En esta
memoria, este vector puede ser referido como "vector
superbinario". Dicho vector súperbinario se puede utilizar
preferiblemente en la presente invención.
Un ejemplo de dicho vector súperbinario es
pTOK162 (Solicitud de patente en trámite (Kokai) Nº
4-222527). Su estructura se muestra en la Figura 1.
Este plásmido comprende un plásmido llamado pTOK154 que puede
replicarse tanto en Escherichia coli como en
Agrobacterium tumefaciens (pTOK154 es un plásmido que
contiene una región T, que se construyó mediante el procedimiento
descrito más abajo a partir de un plásmido conocido pGA472 que tiene
un amplio espectro de hospedadores llamado pVCK101), dentro del cual
se ha insertado un fragmento kpnI (que contiene los genes
virB, virG y virC) con un tamaño de 15,2 Kb
originado a partir de la región de virulencia de pTiBo542, habiendo
sido clonado el fragmento kpnI. En pTOK154, entre las dos secuencias
frontera de la región T, se inserta un gen de resistencia a
canamicina como gen a ser introducido en los monocotiledones. Esta
es una realización en donde el gen deseado a ser introducido en los
monocotiledones se dispone en un plásmido que tiene el fragmento de
DNA clonado originado a partir de la región virulenta de
pTiBo542.
El gen que se desea incorporar dentro de los
monocotiledones se puede insertar en un punto de restricción en la
región del T-DNA del plásmido descrito más arriba, y
el plásmido recombinante deseado se puede seleccionar dependiendo
del marcador selectivo adecuado como resistencia a una droga y
similares que tiene el plásmido. Sin embargo, si el vector, tal como
pTOK162 mostrado en la Figura 1, es grande y tiene una serie de
puntos de restricción, no siempre es fácil insertar el DNA deseado
en la región T del vector mediante procedimientos de subclonación
convencionales. En dicho caso, el DNA deseado se puede insertar en
pTOK162 utilizando la recombinación homóloga en vivo
(Herrera-Esterella L. et al., 1983; EMBO J.
2:987-995; Horsch R. H. Et al., 1984; Science
223:496-498) en las células de Agrobacterium
tumefaciens. Esto es, por ejemplo, pTOK162 se introduce
primero en Agrobacterium tumefaciens y el plásmido
pBR322 (o un plásmido similar) que contenga el DNA deseado se
introduce otra vez en el mismo. Puesto que el DNA de pTOK162 tiene
una región de homología con pBR322, el derivado de pBR322 que
contiene el gen deseado es para que se inserte en pTOK162 mediante
recombinación genética por regiones homólogas. A diferencia de
pTOK162, pBR322 no puede replicarse por sí mismo en
Agrobacterium tumefaciens. Por tanto, pBR322 puede
estar sólo vivo en Agrobacterium tumefaciens en la
forma insertada en pTOK162 (pTOK162 recombinado y pBR322 es referido
de aquí en adelante como "derivado pTOK162::pBR322").
Seleccionando los transformantes en base al marcador selectivo (como
resistencia a fármaco) específico para cada uno de pTOK162 y
derivado de pBR322, se pueden obtener transformantes de
Agrobacterium tumefaciens que contengan el derivado
pTOK162::pBR322. Los presentes inventores realizaron un estudio
introduciendo diversos plásmidos que contenían pTOK162 en
Agrobacterium tumefaciens para descubrir que, como
marcador de selección del derivado pBR322, es excelente el gen de
resistencia a espectinomicina (SP) originado a partir del trasposón
Tn7 (De Greve, H. H. et al., 1981; Plasmid
6:235-248). De esta manera, en los casos en donde ha
sido clonado ya el gen deseado en pBR322, insertando el gen SP
dentro del plásmido, se puede insertar el gen deseado en la región T
de pTOK162 mediante recombinación homóloga in vivo en
Agrobacterium tumefaciens. De manera alternativa, se
proporciona primero un plásmido que contenga un DNA originado a
partir de pBR322 y el gen SP y se puede insertar el gen deseado
dentro de este plásmido. En este caso, utilizando las secuencias
frontera de la región T, es posible obtener, finalmente, el gen de
resistencia a canamicina y el gen deseado en regiones T separadas en
pTOK162. Cuando se transforman las plantas utilizando la resistencia
a canamicina como marcador, existe una probabilidad sustancial de
que se introduzcan ambas regiones T y la introducción del gen
deseado se pueda conseguir de manera suficiente. Además, en este
caso, puesto que ambas regiones T se pueden insertar en diferentes
cromosomas, puede ser posible segregar, subsiguientemente, el gen
deseado del gen de resistencia a canamicina.
Como bacterias hospedadoras pertenecientes al
género Agrobacterium, se pueden utilizar, preferiblemente,
aunque no de manera restrictiva, Agrobacterium
tumefaciens.
La introducción de un plásmido dentro de la
bacteria perteneciente al género Agrobacterium tal como
Agrobacterium tumefaciens se puede llevar a cabo
mediante un procedimiento convencional tal como el procedimiento de
triple cruce de bacterias (Ditta G. et al., 1980; Proc. Natl.
Sci. USA, 77:7347-7351).
Puesto que la Agrobacterium preparada
según se ha mencionado más arriba tiene genes de virulencia
altamente eficiente originados a partir de pTOK162, se puede lograr
la transformación de los monocotiledones con una eficacia
elevada.
Se debería indicar que en el procedimiento de la
presente invención, el gen que se desea introducir en el
monocotiledón se coloca entre las secuencias frontera de la región T
como en el estado de la técnica, y el gen deseado se puede colocar
en el plásmido Ti o en otro plásmido en el Agrobacterium.
La transformación de los embriones inmaduros de
monocotiledones mediante Agrobacterium se puede llevar a cabo
poniendo meramente en contacto los embriones inmaduros con el
Agrobacterium. Por ejemplo, se prepara una suspensión celular
del Agrobacterium que tenga una densidad de población de
aproximadamente 10^{6} a 10^{11} células/ml y los embriones
inmaduros se sumergen en esta suspensión durante aproximadamente 3 a
10 minutos. Los embriones inmaduros resultantes se cultivan, a
continuación, en un medio sólido durante varios días con
Agrobacterium los embriones a ser transformados se someten
directamente a transformación sin que sean sometidos a un
tratamiento de desdiferenciación tal como cultivarlos en presencia
de 2,4-D la transformación convencional de plantas
con Agrobacterium es tal que los embriones inmaduros a ser
transformados ahí se desdiferencian cultivándolos en presencia de
2,4-D, antes de que se lleguen a poner en contacto
con el Agrobacterium. Los inventores presentes han encontrado
que la desdiferenciación es innecesaria de acuerdo con la presente
invención. Por lo tanto, el procedimiento de la presente invención
es superior al procedimiento convencional en el que el antiguo es
más sencillo que el más reciente. Algunas plantas, especialmente
maíz tienen una eficacia de transformación reducida si se someten al
tratamiento de desdiferenciación antes de la transformación. Por lo
tanto, la eficacia de transformación de dichas plantas se puede
incrementar de acuerdo con el procedimiento de la presente invención
en el que no se lleva a cabo el pretratamiento. Además, la
transformación convencional de las plantas con Agrobacterium
utiliza una etapa de lesión de las plantas o una etapa de
tratamiento de estas con un enzima para digerir las paredes
celulares, incrementándose de esta manera, la eficacia de la
infección, antes de su transformación con Agrobacterium. El
procedimiento de la presente invención puede tener dicho
pretratamiento, pero los inventores presentes han encontrado que se
puede lograr la transformación eficiente mediante el procedimiento
de la presente invención incluso en ausencia de dicho
pretratamiento. Por esta razón, dicho pretratamiento es desfavorable
para el maíz.
Es preferido que los embriones inmaduros así
transformados se desdiferencien después, mediante un procedimiento
conocido (Green, C. E. y Phillips, R. L., 1975; Crop Science
15:417-421, Duncan, D. R. et al., 1985;
Planta 165:322-332) y las células transformadas
desdiferenciadas de esta manera se seleccionan y se hacen crecer. La
selección se puede efectuar en base a la expresión del gen deseado
citado anteriormente. Se desea que las células desdiferenciadas
estén en forma de callos que tengan la capacidad de producir plantas
normales. La regeneración de las plantas a partir de células
transformadas se puede efectuar mediante procedimientos conocidos
(Luppotto, E. y Lusardi, H. C., 1988; Maydica
XXXIII:163-177). De esta manera, las plantas
adquirieron el carácter deseado mediante la transformación,
preferiblemente se pueden regenerar las plantas transformadas
adquirieron el carácter deseado y teniendo una fertilidad normal.
Estas etapas se ilustran, concretamente, en los siguientes
ejemplos.
La presente invención será explicada más
concretamente con referencia a los siguientes ejemplos. Se debería
indicar, sin embargo, que la presente invención no está restringida
a los ejemplos.
Se escogieron como muestras las variedades de
maíz de P3732, A188, H84, B37Ht, Mo17Ht, W117Ht, Oh43, H99, W64A Ht
rhm, F1 (A188 X Black Mexican Sweet), F1 (A188 X B73Ht), F1 (B73Ht x
A188), F1 (H84 x A188), F1 (Mo17Ht x A188) y F1 (C103 x A188). La
variedad P3732 se obtuvo de IWATA RAKUNOU KYODOKUMIAI. Todos los
endogámicos y la variedad de Black Mexican Sweet se
obtuvieron del National Institue of Agrobiological Resources,
Ministry of Agriculture, Forestry & Fisheries.
Se seleccionó como muestra la variedad de arroz
de Tsukinohikari.
Las semillas de maíz se sumergieron en etanol al
70% durante un minuto y, a continuación, en hipoclorito sódico al 1%
durante 5 minutos, y se lavaron tres veces con agua esterilizada.
Después del lavado, estas se colocaron en medio sólido LS (sales
mayores LS y sales menores LS (Linsmaier E. y Skoog F. 1965;
Physiol. Plant. 18:100-127), 0,5 mg/ml de ácido
nicotínico, 0,5 mg/l de hidrocloruro de piridoxina, 1 mg/l de
hidrocloruro de tiamina, 100 mg/l de mioinositol, 100 mg/l de ácido
casamino, 700 mg/l de prolina, 20 g/l de sacarosa y 2,3 g/l de
Gelrite) y se cultivaron a 25ºC bajo iluminación. Después de
aproximadamente 4 días, los tejidos con una longitud de
aproximadamente 0,1 mm x 0,3 mm que contenían los tejidos que
contenían los ápices que dividían los tejidos se cortaron de las
plantas semilleras crecidas jóvenes y se utilizaron como
muestras.
Aproximadamente 14 días después de la
polinización, se aislaron de manera aséptica los embriones inmaduros
con una longitud de 1 a 2 mm de las puntas hembras.
Las semillas inmaduras se recogieron en los días
7 a 12 después de la floración y se esterilizaron sumergiéndolas en
etanol al 70% durante 30 segundos y, a continuación, en hipoclorito
sódico al 1% durante 10 minutos después de extraer las glumas. Los
embriones inmaduros se aislaron a partir de estos y, a continuación,
se utilizaron como muestras.
El gen de resistencia a higromicina (HPT), el gen
de resistencia a fosfinotricina (PPT) (bar) y el gen GUS se
insertaron dentro de la región T del plásmido Ti para obtener los
siguientes plásmidos:
Un plásmido en el que el gen GUS que contenía el
primer intrón del gen de la catalasa de caster beans y un gen
de resistencia a higromicina se ligaron (Nakamura et al.,
1991; Plant Biotechnology II (Nakamura et al., Extra Issue of
GENDAI KAGAKU, pág. 123-132), presentado por el Dr.
Nakamura en Nagoya University).
El fragmento ClaI (2,5 kb) que contenía el
gen de resistencia a espectinomicina originado a partir de Tn7 se
trató con el fragmento klenow para despuntar sus extremos. El
fragmento resultante se insertó en el sitio SamI de pUC19
para obtener un plásmido pTOK107 (5,2 kb) que tenía los genes
resistencia a ampicilina y resistencia a espectinomicina.
El pTOK107 así obtenido se trató con EcoRI
e HindIII y el fragmento resultante de 2,5 kb que contenía el
gen de resistencia a espectinomicina se ligó al fragmento
EcoRI-HindIII (2,7 kb) de pGA482 para obtener pTOK170
(5,2 kb) que contenía el gen de resistencia a espectinomicina y que
tiene los sitios HindIII y HpaI.
Un vector pIG221 en el que se había ligado el
primer intrón de la catalasa del caster beans y el gen GUS al
promotor 35S (Ohta et al., 1990, presentado por Dr. Nakamura
en la Universidad de Nagoya) se digirió con EcoRI y lo
resultante se trató con fragmento klenow para despuntar sus
extremos. En el resultante, se insertó un engarce de HindIII
(pCAAGCTTG; código 4660P comercialmente disponible de TAKARA SHUZO).
Se extrajo un fragmento que contenía el promotor 35S y el intrón del
gen GUS, digiriendo el vector resultante con HindIII, y el
fragmento se insertó en el sitio HindIII de un plásmido pGL2
(J. Paszkowski, obtenido de Friedrich Miescher Institute) que
contenía el gen de resistencia a higromicina ligado al promotor 35S,
para obtener pGL2-IG (7,6 kb). El plásmido pGL2
anteriormente mencionado se obtuvo insertando un gen de resistencia
a higromicina (Gritz L. y Davis J, 1983; Gene
25:179-188) en pDH51 (Pietrazak et al., 1986;
Nucleic Acids Research 14:5857-5868). El fragmento
obtenido tratando pTOK170 con HpaI se ligó a un fragmento PvuII (5,2
kb) de pGL2-IG para obtener pTOK229 (10,1 kb).
La inserción de los genes deseados (gen de
resistencia a higromicina y intrón del gen GUS) dentro del vector
superbinario pTOK162 obtenido insertando los genes virB,
virC y virG procedentes de Agrobacterium A281
supervirulento, se llevó a cabo mediante recombinación homóloga.
Esto es, puesto que ambos vectores contienen una región procedente
de un plásmido de E. coli pBR322, en las células bacterianas
seleccionadas por resistencias a espectinomicina y canamicina, sólo
está contenido el plásmido generado por recombinación de ambos
plásmidos. El plásmido que comprende el vector súperbinario en el
que se insertan el gen de resistencia a higromicina y el intrón GUS
es referido como pTOK232 (véase Figura 1).
En la Figura 1 y en la Figura 2 mencionadas más
abajo, "SP" significa gen de resistencia a espectinomicina,
"HPT" significa gen de resistencia a higromicina, "NPT"
significa gen de resistencia a canamicina, "TC" significa gen
de resistencia a tetraciclina, "BAR" significa gen de
resistencia a fosfinotricina, "IG" significa intrón del gen
GUS, "BR" significa secuencia frontera derecha del
T-DNA, "BL" significa secuencia frontera
izquierda del T-DNA, "virB",
"virB" y "virG" significan regiones
vir originadas a partir de Agrobacterium
supervirulento A281, "COS" significa región COS del fago
lambda, "K" significa enzima de restricción del sitio
KpnI y "H" significa enzima de restricción del sitio
HindIII.
Se digirió pTOK170 con BamHI y
BgIII y, a continuación, se circularizó para dar pYS138. Este
pYS138 se digirió con EcoRI y Asp7181 y, a
continuación, se trató con DNA polimerasa T4. Dentro de éste se
insertó el delineador de SalI
(5'-GGTCGACC-3') y lo resultante se
circularizó para dar pYS151. Este PYS se digirió con SalI, y
se insertó un fragmento SalI (4,7 kb) que tenía
T-DNA de pGA643 (An et al., Plant Molecular
Biology Manual A3:1-19, Kluwer Academic, Dordrecht,
1988) en el punto de escisión para dar pTOK235. Este pTOK235 se
cortó en su sitio SacII, sus extremos se despuntaron con DNA
polimerasa T4, se insertó en el mismo un engarce de HindIII
(5'-CAAGCTTG-3') y lo resultante se
circularizó. El plásmido así obtenido se refirió como pTOK246. Este
pTOK246 se digirió con HindIII y EcoRI para eliminar
la mayoría del T-DNA y se insertó en el mismo un
fragmento HindIII-EcoRI (2,2 Kb) que tenía un gen que
se había preparado ligando un gen acetiltransferasa fosfinotricina
(patente japonesa Kohyo Koho
Hei-1-503434) al promotor 35S (gen
bar que tiene la capacidad de conferir resistencia a fosfinotricina
a las plantas) para obtener pSB25. Además, este pSB25 se digirió con
HindIII, y se insertó en el mismo un fragmento HindIII
(3,1 kb) aislado de pIG221 y que tenía el promotor 35S y un intrón
GUS, para construir pSB31. De esta manera, este pSB31 es un vector
intermedio que tiene el intrón del gen GUS y el gen de resistencia a
fosfinotricina (bar), ambos expresándose en plantas.
pVCK101 (Knauf et al., Plasmid
8:45-54; 1982) se digirió con EcoRI, se trató
con la DNA polimerasa T4 y se circularizó por lo que se suprimió su
sitio EcoRI. Este fue digerido, además, con BglII y, a
continuación, se circularizó por lo que se suprimió el sitio
BglII. El plásmido resultante se llamó pVCK101Q. Este
pVCK101Q se digirió con HindIII y XhoI y se ligó a un
pUC18 que se había digerido con HindIII y SalI, para
dar pTOK150. Este pTOK150 se digirió con HindIII y se trató
con DNA polimerasa T4. Se insertó en el punto de corte un engarce
EcoRI (5'-CCGAATTCGG-3') y lo
resultante se circularizó para dar pTOK239 que tenía un sitio
EcoRI en lugar de un sitio HindIII. PGA482 se digirió
con HpaI, se insertó en este un engarce XhoI
(5'-CCTCGAGG-3') y lo resultante se
circularizó para dar pTOK236. Este pTOK236 se digirió con
XbaI y EcoRI para aislar un fragmento de 2,6 kb. Se
digirió pTOK239 con EcoRI y XbaI para eliminar un
fragmento de 2,7 kb. El fragmento XbaI-EcoRI de 2,7 kb
de pTOK236 se insertó en este y el resultante se circularizó para
dar pNB1. Este pNB1 es un tipo de vector aceptor y no contiene ni
T-DNA ni los DNA de las regiones que dan lugar a
virulencia.
Se digirió el pNB1 con KpnI y se insertó
ahí un fragmento KpnI de 15,2 kb que tenía los genes
virB y virG en la región de virulencia de pTiBo542
(American Type Culture Collection Nº de acceso 37349). Lo resultante
se circularizó para dar pSB1. Este pSB1 es un vector aceptor. Cuando
se inserta un vector intermedio que tiene T-DNA en
este para dar un vector híbrido, el vector híbrido resultante se
puede combinar con un plásmido auxiliar para construir un vector
súperbinario.
Como en el caso de pTOK232, se insertó pSB31 en
pSB1 mediante recombinación homóloga para construir pSB131 (véase
Fig. 2).
Las cepas LBA4404 y EHA101 de las que se suprimió
la región de T-DNA se utilizaron como bacterias
hospedadoras. La cepa LBA4404 tiene un plásmido auxiliar PAL4404
(que tiene una región vir completa) y está disponible en la
American Type Culture Collection (ATCC 37349). La cepa EHA101 tiene
un plásmido auxiliar que tiene la región vir procedente del
Agrobacterium súpervirulento A281 y está disponible por Hood
E.E. et al., 1986 (mencionado más arriba).
Los diversos vectores binarios descritos en (2)
se introdujeron en estas dos cepas de Agrobacterium, y las
cepas descritas más abajo se utilizaron para introducir los genes.
Los plásmidos se introdujeron en las cepas de Agrobacterium
mediante cruzamiento triple (Ditta G et al., 1980; Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77: 7347-7351).
LBA4404(pTOK232)
LBA4404(pSB131)
EHA101 (pIG121Hm)
Las colonias obtenidas cultivando las cepas de
Agrobacterium en medio AB (Drlica K. A. y Kado C. I., 1974;
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71:3677-3681) se
recogieron durante 3 a 10 días con un bucle de platino y se
suspendieron en medio LS para la suspensión celular (que comprende
sales mayores LS, sales menores LS, 0,5 mg/ml de ácido nicotínico,
0,5 mg/ml de hidrocloruro de piridoxina, 1 mg/ml de hidrocloruro de
tiamina, 100 mg/ml de mioinositol, 1,5 mg/l de
2,4-D, 1 g/l de ácido casamino, 100 uM de
acetosiringona, 0,2 M de sacarosa y 0,2 M de glucosa) para la
inoculación en plantas de maíz pero en un medio AA modificado (que
comprenda sales inorgánicas mayores AA, aminoácidos AA y vitaminas
AA (Toriyama K. y Hinata K., 1985; Plant Sci., 41:
179-183), sales menores MS (Murashige T. y Skoog F.,
1962; Physiol. Plant., 15:473-497), 1,0 g/l de ácido
casamino, 100 \muM de acetosiringona, 0,2 M de sacarosa y 0,2 M de
glucosa) para la inoculación en plantas de arroz. La población de
células de cada medio se ajustó para que fuera de 3 x 10^{9} a 5 x
10^{9} células/ml. Las suspensiones se utilizaron para la
inoculación en las plantas.
Los tejidos muestra se lavaron con agua
esterilizada y se sumergieron en las suspensiones anteriormente
descritas de cepas de Agrobacterium durante 3 a 10 minutos,
después de que las muestras de los ápices de la raíz se hubieran
partido con una aguja de vidrio (casera) mientras que los embriones
inmaduros estaban como estaban. Después de la inmersión, las
muestras de ápices de la raíz se transplantaron en el medio LS
modificado (que comprende sales de LS mayor, sales menores de LS,
0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de hidrocloruro de
piridoxina, 1 mg/ml de hidrocloruro de tiamina, 100 mg/l de
mioinositol, 0,1 mg/l de quinetina, 1,0 mg/l de ácido casamino y 2,3
g/l de Gelrite) que contenía 100 \muM de acetosiringona, 20 g/l de
sacarosa y 10 g/l de glucosa y se cultivaron en este a 25ºC bajo
iluminación durante 2 a 3 días. Después de esto, estas se lavaron
con agua esterilizada que contenía 250 mg/l de cefotaxima y, a
continuación, se mantuvieron en cultivo en el medio LS que tenía la
misma concentración de cefotaxima. Después de la inmersión, los
embriones inmaduros se transplantaron a un medio LSD1.5 (que
comprendía sales mayores LS, sales menores LS, 0,5 mg/ml de ácido
nicotínico, 0,5 mg/ml de hidrocloruro de piridoxina, 1mg/ml de
hidrocloruro de tiamina, 100 mg/ml de mioinositol, 1,5 mg/l de
2,4-D, 700 mg/l de prolina, 500 mg/l de MES y 8 g/l
de agar) que contenía 100 \muM de acetosiringona, 20 g/l de
sacarosa y 10 g/l de glucosa, y se cultivaron a 25ºC en la oscuridad
durante 1 a 5 días. A continuación, sin que fueran lavadas (esto es
debido a que si se lavan, la velocidad de regeneración de las
plantas transformadas se vuelve baja), los embriones inmaduros de
esta manera infectados se continuaron cultivando en un medio de
crecimiento LDS1.5 de callos (que tenía la misma composición que el
medio LDS1.5 anteriormente mencionado excepto en que no contenía
glucosa y acetosiringona) que contenía 250 mg/ml de cefotaxima. Por
otro lado, los embriones inmaduros de arroz sumergidos se
transplantaron en un medio sólido 2N6 (que comprendía sales
inorgánicas N6 y vitaminas (Chu C. C., 1978; Proc. Symp. Plant
Tissue Culture, Science Press Peking, pág. 43-50), 1
g/l de ácido casamino, 2 mg/l de 2, 4-D y 2 g/l de
Gelrite) que tuvo las mismas concentraciones de acetosiringona,
sacarosa y glucosa como se ha mencionado más arriba, y cultivadas a
25ºC en la oscuridad durante 2 a 5 días. Después de esto, los
embriones inmaduros, infectados de esta manera, se lavaron con agua
esterilizada que contenía 250 mg/l de cefotaxima y cultivados en
medio sólido 2N6 que tenía la misma concentración de cefotaxima
durante 3 días a una semana.
Inmediatamente después de que el cultivo
anteriormente mencionado en presencia de cepas de
Agrobacterium, los tejidos se sumergieron en un tampón
fosfato 0,1 M (pH 6,8) que contenía Tritón X-100 al
0,1% a 37ºC durante una hora. Después de lavar las cepas de
Agrobacterium con el tampón fosfato, se añadió un tampón
fosfato que contenía 1 mM de ácido
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónico
(X-gluc) y metanol al 20%. Después de incubar a 37ºC
durante 24 horas, se contaron el número de tejidos coloreados de
azul bajo microscopio y se describen los porcentajes de estos
respecto al número de las muestras ensayadas. En la valoración de
las actividades GUS de los callos resistentes a higromicina y callos
resistentes a fosfinotricina que se piensan que se transforman en
células después de la selección, así como en la valoración de las
actividades GUS de las plantas transformadas, se cortaron partes de
los callos o plantas resistentes y se sometieron a la misma tinción
GUS.
Los embriones inmaduros de maíz infectados con
Agrobacterium se cultivaron en medio de crecimiento de callos
LSD1.5 que contenía 250 mg/l de cefotaxima y de 0 a 100 mg/l de
higromicina o de 0 a 20 mg/l de PPT, durante aproximadamente 8
semanas para seleccionar los callos resistentes. Estos callos
resistentes se colocaron en un medio LSZ (que tenía la misma
composición que el medio de crecimiento de callos LSD1.5, excepto en
que este no contiene 2,4-D pero contiene 50 mg/l de
zeatina) y se cultivaron a 25ºC bajo iluminación, regenerándose de
esta manera los callos.
Los embriones inmaduros de arroz se cultivaron en
medio sólido 2N6 que contenía 250 mg/l de cefotaxima y 50 mg/l de
higromicina durante 3 a 4 semanas, y se seleccionaron los callos
resistentes. Además, los callos resistentes se cultivaron en medio
N6-7 (que comprendía sales inorgánicas N6, vitaminas
N6, 2 g/l de ácido casamino, 1 mg/l de 2,4-D, 0,5
mg/l de 6BA, 30 g/l de sorbitol, 20 g/l de sacarosa y 2 g/l de
Gelrite) que contenía 100 mg/l de higromicina durante 2 a 3 semanas
y, a continuación, se transplantaron en medio N6S3 para la
regeneración de las plantas (que comprende la mitad de
concentraciones de sales inorgánicas mayores N6, sales inorgánicas
menores N6, vitaminas N6, 1 g/l de ácido casamino, 0,2 mg/l de NAA,
1 mg/l de quinetina y 3 g/l de Gelrite) que contenía 50 mg/l de
higromicina. Todos los medios utilizados contenían 250 mg/l de
cefotaxima.
Las plantas transformadas de primera generación
obtenidas mediante inoculación de LBA4404 (pSB131) y selección
mediante PPT se autofertilizaron para obtener semillas de segunda
generación. Las semillas se sembraron y se recogieron los trozos de
hojas procedentes de las plantas semilleras jóvenes aproximadamente
dos semanas después de la siembra. Se examinó la expresión del gen
GUS. Además de una parte de las hojas de estas plantas semilleras
jóvenes, se aplicó Basta diluido 500 veces (un herbicida que
contiene PPT como ingrediente principal, disponible comercialmente
de HOECHST) y se comprobó la resistencia a PPT dos semanas después
de la aplicación de Basta. Además, se cruzó la primera generación de
plantas transformadas con no transformadas (variedad A188) y los
embriones inmaduros se recogieron aproximadamente dos semanas
después del cruce, y los embriones inmaduros recogidos se colocaron
en medio LSD1.5 para la inducción de los callos que contenía 10 mg/l
de PPT. Los embriones inmaduros se cultivaron a 25ºC durante 3
semanas en la oscuridad y se evaluó la resistencia a PPT en base a
si se formaban o no los callos en el cultivo. Las plantas
transformadas obtenidas mediante inoculación con LBA4404 (pTOK233) y
la selección con higromicina también se cruzaron con no
transformadas (variedad: A188) y se examinó la expresión del gen GUS
en plantas semilleras jóvenes de las plantas de segunda
generación.
De las plantas semilleras jóvenes de la primera
generación de transformantes de maíz que se habían obtenido mediante
selección con PPT después de infectar con la cepa LBA4404 (pSB131) y
de la segunda generación de plantas, se extrajeron los DNA mediante
el procedimiento de Komari et al. (Komari et al.,
1989; Theor. Appl. Genet. 77: 547-552). Los DNA
extraídos de esta manera se digirieron con un enzima de restricción
BamHI. Los fragmentos resultantes se sometieron a la
detección de los genes introducidos mediante análisis de
transferencia Southern utilizando el gen GUS y el gen bar como
sondas. La longitud de la región de DNA del sitio BamHI en la región
de T-DNA hasta el terminal de la secuencia frontera
L era de aproximadamente 2,3 Kb para el gen GUS y aproximadamente
2,7 kb para el gen bar (véase Fig. 2). El análisis de transferencia
Southern se llevó a cabo de acuerdo con la descripción en Molecular
Cloning (Sambrook et al., 1989; Cold Spring Harbor Laboratory
Press).
Con el fin de confirmar que se podía conseguir la
transformación utilizando tejidos de crecimiento puntual (tejidos de
los ápices de raíces) publicados por Gould et al. (Gould J.
et al., 1991; Plant Physiol. 95: 426-434), se
trataron los tejidos aislados de ápices de raíces de maíz aislados
con la cepa de Agrobacterium EHA101 (pIG121Hm) anteriormente
descrita, y se determinó la actividad GUS de las plantas crecidas.
Mientras no se observó expresión del gen GUS en los tejidos no
tratados con la cepa de Agrobacterium, se observó la
expresión del gen GUS en las manchas cortadas con la aguja en los
tejidos tratados con la cepa de Agrobacterium. Las plantas
obtenidas cultivando los tejidos se ensayaron por su actividad GUS.
Sin embargo, ninguna planta exhibió la actividad GUS. La vecindad
del punto de crecimiento es un tejido muy fino, de tal manera que no
es fácil que la aguja perfore el tejido muy fino para infectar el
tejido con Agrtobacterium. Los resultados de esta experimento
muestran que la transformación infectando la vecindad del punto de
crecimiento con Agrobacterium requiere una experiencia
elevada en cortar y perforar el punto de crecimiento, etc.
La variedad de la muestra fue P3732 en todos los
experimentos.
Los embriones inmaduros de las diferentes
variedades de maíz se trataron con la cepa de Agrobacterium.
El gen GUS se expresó en una proporción elevada en todas las
variedades de maíz ensayadas. El tamaño del punto del gen GUS
expresado en cada muestra ensayada era tal que se observaba
visualmente de manera clara. De esta manera, el gen GUS se expresaba
en un rango amplio de células. No se observó ninguna diferencia en
la velocidad de expresión del gen entre las cepas LBA4404 (pTOK232)
y LBA4404 (pSB131). A partir de los resultados, se estableció que
los embriones inmaduros de maíz son adecuados como materiales a ser
infectados y transformados con Agrobacterium con eficacia
elevada.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Cepa 1: EHA101(pIG121Hm), 2:
LBA4404(pTOK232), 3: LBA4404(pSB131).
Chan et al., utilizaron embriones
inmaduros de plantas de arroz que habían sido precultivadas
(tratamiento de desdiferenciación) en medio N_{6}RD (comprendiendo
N_{6} sales inorgánicas, vitaminas N_{6}, 30 g/l de sacarosa, 2
mg/l de 2, 4-D, 8 g/l de agarosa) durante 2 días,
como materiales a ser transformados con Agrobacterium (Chan
M. T. et al., 1993; Plant Mol. Biol. 22:
491-506). Con el fin de volver a confirmar si el
procedimiento de Chan et al., es o no efectivo también en el
caso de utilizar embriones inmaduros de plantas de maíz, los
embriones inmaduros de maíz (variedad: A188) que se habían
precultivado en medio LSD1.5 para la inducción de los callos durante
2 días se intentaron transformar con Agrobacterium. La
inoculación y el cultivo en presencia de Agrobacterium se
llevaron a cabo de la misma manera que la mencionada más arriba. La
cepa de Agrobacterium utilizada fue LAB4404(pSB131).
Como control, los embriones inmaduros de la misma variedad de maíz
se sometieron al mismo ensayo inmediatamente después de recogerlos.
Tres días después del co-cultivo con
Agrobacterium, los embriones inmaduros de ambos grupos de
ensayo se sometieron a tinción de GUS. Como resultado, casi todos
los embriones inmaduros ensayados inmediatamente después de
recogerlos se tiñeron mientras que ninguno de los embriones
inmaduros ensayados después del pre-cultivo se tiñó
(véase Tabla 3). Estos resultados indican claramente que la
transformación del maíz no se consigue si se utilizan los embriones
inmaduros pre-cultivados de maíz.
Los callos que se habían seleccionado en un medio
que contenía 30 mg/l o 50 mg/l de higromicina y se había verificado
que tenían resistencia a higromicina en un medio que contenía 75
mg/l de higromicina, se sometieron a tinción GUS con el resultado de
que todos los callos expresaban el gen GUS. El DNA que se había
extraído de estos callos de acuerdo con el procedimiento de Komari
et al., (Komari et al., 1989; Theor. Appl. Genet.
77:547-552) se utilizó como plantilla para llevar a
cabo la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) utilizando
cebadores capaces de amplificar el gen GUS
(5'-ATGTTACGTCCTGTAGAAAC-3',
5'-ATGGTGCGCCAGGAGAGTTG-3'). La
reacción se llevó a cabo utilizando 1 \mul de la disolución de
DNA, una mezcla de los dos cebadores de 5 pM de cada uno, 200 \muM
de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, un tampón de PCR
(comercialmente disponible de TAKARA SHUZO) y 2,5 U de DNA
polimerasa Amplitag (comercialmente disponible de TAKARA SHUZO),
siendo el volumen total de 100 \muL. Se repitieron 30 ciclos de la
reacción, de acuerdo con el siguiente perfil de temperaturas para un
ciclo: es decir, el perfil de temperaturas para un ciclo de la
reacción comprendía 94ºC durante un minuto, 55ºC durante 2 minutos
y, a continuación, 72ºC durante 3 minutos, todo en un THERMOCYCLER
DNA (comercialmente disponible de PARKIN ELMER CETUS CORP.). El
producto de la PCR se separó mediante electroforesis en gel de
agarosa al 0,7%. Cuando se utilizó el DNA extraído procedente de
callos no infectados con Agrobacterium como plantilla, no se
detectó ningún fragmento amplificado; mientras que cuando se
utilizaba el DNA extraído de LBA4404 (pTOK232) o el DNA extraído de
los callos que tenían la resistencia a higromicina, como plantilla,
se detectó, mediante electroforesis, un fragmento amplificado de 1,8
kb teñido con bromuro de etidio. Además, la PCR se llevó a cabo
utilizando cebadores capaces de amplificar la región de 795 pb que
tiene el codón de iniciación VirG de Agrobacterium
(5'-GACGTTTATGAAGTAGGCGAGA-3',
5'-TAAAAACGCGAGGAGAAGATTG-3').
Cuando se utilizó como plantilla el LBA4404 (pTOK232), se detectó un
fragmento amplificado de 0,8 kpb; mientras que cuando se utilizaron
el DNA extraído de callos resistentes y el DNA extraído de callos no
infectados con Agrobacterium, como plantillas, no se detectó
ningún fragmento amplificado. A partir de estos resultados, se
consideró que la expresión del gen GUS en todos los callos que
tenían la resistencia a higromicina no resultó del
Agrobacterium adherido a los callos sino resultó del gen GUS
introducido y que los callos compactos y nodales que habían crecido
en los medios que tenían concentraciones incrementadas en lo que
respecta a las etapas de higromicina eran transformantes.
Después del cocultivo con Agrobacterium,
se seleccionaron los callos resistentes a higromicina o resistentes
a PPT en medios que contenían de 30 a 100 mg/l de higromicina o de 5
a 20 mg/l de PPT. En la selección de higromicina, en primer lugar,
se obtuvieron callos resistentes a higromicina del 11 al 27% de los
embriones inmaduros; mientras que en la selección posterior con PPT,
se obtuvieron los callos resistentes a PPT del 35 al 64% de los
embriones inmaduros (véanse tablas 4 y 6). Estos callos se colocaron
en un medio de regeneración que contenía higromicina o PPT, con lo
que las plantas se regeneraron con una elevada frecuencia. Las hojas
de las plantas regeneradas se tiñeron mediante tinción GUS,
resultando en la expresión del gen GUS en muchas de las plantas
(véanse tablas 5 y 6). Estos datos mostraron que estas plantas eran
plantas transformadas. La frecuencia de dar las plantas
transformadas era especialmente elevada en la selección con PPT y
existía una pequeña diferencia entre los experimentos, siempre dando
plantas transformadas independientes a partir del 10% o más de
embriones inmaduros ensayados (véase Tabla 6). Los resultados
sugieren que el procedimiento utilizado en estos experimentos es un
procedimiento de transformación estable capaz de producir
transformantes con una frecuencia elevada. A continuación, los
callos resistentes a PPT que se habían cultivado y seleccionado bajo
las mismas condiciones de todas las maneras, desde la inoculación
hasta la propagación de los callos, se colocaron en un medio de
regeneración que contenía una concentración elevada (20 mg/l) de PPT
y un medio de regeneración que no contenía PPT con el fin de
comprobar la expresión de GUS. En las plantas regeneradas en el
medio que contenía PPT, el número de plantas quiméricas y escapes
(GUS-) era pequeño. Esto certifica el efecto de la selección
obtenida mediante la adición de PPT durante la regeneración (véase
Tabla 7).
Para la selección con higromicina, los callos se
co-cultivaron con Agrobacterium y, a
continuación, se cultivó más en presencia de higromicina que tenía
las concentraciones indicadas, cada una durante 2 a 3 semanas.
El DNA total extraído del transformante se
digirió con BamHI para obtener los fragmentos de DNA. Estos
fragmentos de DNA se sometieron a análisis de transferencia
Southern, utilizando el gen bar o el gen GUS como sonda, con el fin
de detectar el gen introducido en los transformantes de primera
generación. Como resultado, se observó la existencia del gen
introducido en todos los transformantes ensayados cuando se utilizó
como sonda cualquiera de uno de los genes. El número de copias de
los genes introducidos fueron uno o varios. El fragmento
BamHI que tenía el gen bar en el plásmido pSB131 tenía 2,7 kb
y el fragmento BamHI que tenía el gen GUS en el plásmido
pSB131 tenía 2,3 kb, mientras que todos los transformantes ensayados
mostraron una banda que tenía aproximadamente 3 kb o más. Estos
resultados soportan la introducción del gen bar y del gen GUS dentro
de los cromosomas de la planta. Además, las longitudes de los
fragmentos de DNA detectados variaban dependiendo de sus orígenes.
Esto indica que los genes se insertaron en diferentes regiones en
los cromosomas del maíz. Por lo tanto, se confirmó que los
fragmentos de DNA detectados no se originaron a partir de las
bacterias restantes en las plantas.
Las hojas obtenidas de las plantas de segunda
generación mediante cruce de los transformantes obtenidos por
selección a higromicina con no transformantes se tiñeron con GUS. La
relación de plantas GUS positivas respecto a las plantas GUS
negativas fue de aproximadamente 1:1 según lo esperado (Tabla
9).
Las hojas de las plantas no transformadas se
tiñeron por GUS y todas eran negativas, mientras que todas las hojas
de los transformantes de segunda generación obtenidos mediante
autofertilización, los transformantes eran GUS positivos excepto un
transformante. Además, se aplicó Basta a las hojas. Como resultado,
todas las hojas de las plantas no transformadas murieron en
aproximadamente 2 semanas mientras que las hojas de los
transformantes eran saludables excepto la planta GUS negativa (Tabla
10). Tanto la expresión del gen GUS como la resistencia a PPT
exhibió segregación genética de acuerdo con dos factores de
segregación. Además, los embriones inmaduros recogidos de las
plantas no transformadas se cultivaron en un medio que contenía PPT.
Como resultado, se inhibió el crecimiento de los embriones y no se
indujeron a los callos. Por otro lado, con los embriones inmaduros
de ambas líneas recogidas de las plantas R0 obtenidas mediante
cruzamiento de los transformantes y no transformantes, se indujeron
los callos en aproximadamente un 50% de los embriones inmaduros
colocados y los callos crecieron bien en el mismo medio (Tabla 11).
Los callos crecidos se tiñeron por GUS. Como resultado, en todos los
callos, la totalidad de los callos se tiñeron de azul.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los DNA se extrajeron de las plantas de segunda
generación obtenidas mediante autofertilización del transformante nº
21 mostrado en la Tabla 10, y se intentaron detectar los genes
introducidos mediante análisis de transferencia Southern de la misma
manera que la mencionada más arriba. En todas las plantas excepto
para la planta que era GUS negativa y sensible al PPT, se detectaron
los genes introducidos cuando cualquiera de los genes se utilizaba
como sonda (Tabla 12). Los números de las copias del gen bar y del
gen GUS en las plantas en las que se confirmó la existencia de los
genes introducidos, eran idénticos y la longitud de cada banda era
idéntica a la detectada en la planta de primera generación. A partir
de estos resultados, se confirmó que los genes introducidos en el
maíz utilizando Agrobacterium de acuerdo con el procedimiento
de la presente invención se introducen en los núcleos de las plantas
y quedan adheridas de manera estable a la siguiente generación de
acuerdo con las leyes de Mendel.
Se observó una elevada tasa de expresión del gen
GUS se observó también en los embriones inmaduros de arroz en los
que se había introducido el gen GUS se había introducido, como en
los embriones inmaduros de maíz que tienen el gen GUS.
Especialmente, se observó la expresión del gen GUS con una eficacia
elevada cuando se utilizó la cepa LBA4404(pSB131) que tenía
el vector súperbinario (véase Tabla 13).
Los vectores binarios utilizados en este
experimento no causaron la expresión del gen GUS en las células de
Agrobacterium. Basado en el gen GUS en los embriones
inmaduros de arroz que se habían cocultivado con
Agrobacterium como el índice, se ha verificado que las
células de Agrobacterium son útiles para insertar el gen
dentro de las células de maíz y arroz.
Los embriones inmaduros de arroz infectados con
Agrobacterium se sometieron a selección de callos resistentes
a higromicina en un medio que contenía 50 mg/l de higromicina. Como
resultado, se obtuvieron los callos resistentes con una tasa elevada
cuando se utilizaba la cepa que tenía un vector súperbinario (véase
Tabla 14). Los callos producidos, seleccionados de esta manera,
regeneraron las plantas con facilidad después de transferirlos a un
medio de regeneración de plantas que contenía el marcador de
selección (véase Tabla 14). Las hojas de las plantas regeneradas se
examinaron con respecto a la expresión del gen GUS en el mismo, con
el resultado de que el gen GUS se expresaba en todas las plantas
regeneradas. Estos datos mostraron que las plantas regeneradas eran
plantas transformadas. La cepa de Agrobacterium EHA101
(pIG121Hm) tiene una región de virulencia del pTiBo542
súpervirulento pero no tiene un vector súperbinario. Las cepas
utilizadas por Chan et al., eran del mismo tipo. Por lo
tanto, como los resultados de este ejemplo, ellos obtuvieron una
eficacia de transformación extremadamente baja (Chan M. T. et
al., 1993; Plant Mol. Biol., 22:491-506). El
presente ejemplo ha clarificado que la utilización de las cepas que
tienen un vector súperbinario resulta en la producción de las
plantas transformadas procedentes de embriones inmaduros de arroz
con una eficacia drásticamente elevada.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Para investigar la presencia del gen introducido,
se sometieron tres plantas transformadas aleatorias e independientes
obtenidas tratando los embriones inmaduros de arroz con la cepa
LBA4404 (pTOK232) a la reacción de la polimerasa en cadena. Ambos
extremos de sus regiones estructurales se utilizaron como cebadores
del gen GUS y del gen HPT. El DNA del no transformante y de un
plásmido que tenía uno de los genes GUS y HPT se utilizaron como
control. Como resultado, los tres transformantes obtenidos mediante
tratamiento con LBA4404 (pTOK232) dieron un fragmento amplificado de
1,1 kb del gen HPT, como los del plásmido control. Todos los
transformantes que tenían el gen GUS también dieron un fragmento
amplificado de 1,8 kb, similar a los del plásmido control. Sin
embargo, los no transformantes no dieron estos fragmentos. Estos
resultados verificaron que todas las plantas muestras ensayadas en
este experimento son plantas transformadas que tienen el gen
introducido por Agrobacterium.
Como se ha mencionado más arriba, el
procedimiento de la presente invención es un procedimiento de
transformación de monocotiledones, con el que el periodo de tiempo
requerido desde la transformación a la regeneración de plantas es
corto, que se puede aplicar de manera general a las plantas que no
tienen ningún procedimiento de regeneración de las plantas a partir
de los protoplastos, que no necesita un equipo especial y en el que
es fácil la preparación del material a ser utilizado. Por lo tanto,
la presente invención se puede aplicar a la reproducción de plantas
monocotiledóneas que tienen las características deseadas.
Claims (15)
1. Procedimiento para transformar monocotiledones
que comprende transformar el escutelo de un embrión inmaduro de un
monocotiledón con una bacteria perteneciente al género
Agrobacterium que contiene un gen deseado, dicho embrión no
habiendo sido sometido a un tratamiento de desdiferenciación, para
obtener un transformante.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde dicho monocotiledón es una planta perteneciente a la
familia Gramineae.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2, en donde dicha planta perteneciente a la familia Gramineae
es maíz.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2, en donde dicha planta perteneciente a la familia Gramineae
es arroz.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde dicho embrión inmaduro se somete a transformación sin
pretratamiento en el que dicho embrión inmaduro se trata con un
enzima o se lesiona.
6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde dicho monocotiledón es maíz y dicho embrión inmaduro se
somete a transformación sin pretratamiento en el que dicho embrión
inmaduro se trata con un enzima o se lesiona.
7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde el escutelo de dicho embrión
inmaduro es, después de haber sido transformado, desdiferenciado y
las células transformadas se seleccionan y crecen mientras están en
estado desdiferenciado.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
7, en donde los transformantes con fertilidad normal se regeneran a
partir de las células transformadas que se han seleccionado y hecho
crecer mientras están en un estado desdiferenciado.
9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha bacteria es una perteneciente
al género Agrobacterium que contiene un plásmido Ti o el
plásmido Ri y que tiene un plásmido que contiene un fragmento de DNA
originado a partir de la región de virulencia de un plásmido Ti
pTiBo542 de Agrobacterium tumifaciens.
10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha bacteria perteneciente al
género Agrobacterium es Agrobacterium tumifaciens.
11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha bacteria perteneciente
al género Agrobacterium utilizado para la transformación,
tiene una población celular de 10^{6} a 10^{11} células/ml.
12. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho embrión inmaduro es uno
en el estadio de no menos de dos días después de la
polinización.
13. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, en donde el escutelo de dicho embrión
inmaduro es uno capaz de inducir un callo que tiene la capacidad de
regenerar una planta normal.
14. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7 u 8, en donde el tejido cultivado que se ha
desdiferenciado a partir del embrión inmaduro para la selección,
crecimiento y desdiferenciación es un callo que se origina en el
escutelo de un embrión inmaduro.
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicho embrión inmaduro es uno de un
endogámico, F1 entre endogámicos, F1 entre un endogámico y una
variedad polinizada de manera natural o variedades F1
comerciales.
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