CN101460517B - 使用铵转运蛋白或者葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或者法呢基磷酸合成酶（fpp）的氮代谢操作 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在具有光合活性的生物中，尤其在植物中的氮代谢操作。特别地，本发明涉及用于具有光合活性的生物中提高氮同化、累积和/或利用和/或用于增加总含氮量的方法。

Description

使用铵转运蛋白或者葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或者法呢基磷酸合成酶(FPP)的氮代谢操作
[001.0.0.1]本发明涉及在具有光合活性的生物，优选在植物中的氮代谢操作。尤其是，本发明涉及具有光合活性的生物中用于提高氮同化、累积和/或利用和/或用于增加总含氮量的方法。 
[002.0.0.1]植物营养同化对于植物生长发育是必不可少的并因此对于植物产品的数量和品质也是必要的。由于营养利用效率对植物产量和产品品质的巨大影响，大量肥料被浇灌到土地上以优化植物生长和品质。植物生产力通常受到磷、钾和氮这3种主要营养物的限制，氮通常是植物生长中这三种的限速因素。因此植物生长所需的主要营养元素是氮(N)。其是在活细胞中所发现的众多重要化合物(包括氨基酸、蛋白质(酶)、核酸和叶绿素)的组成成分。1.5％-2％的植物干物质是氮且大约16％的总植物蛋白质是氮。因此，氮的有效性是作物生长和繁殖的主要限制因素(Frink等人，1999)，并且也对蛋白质累积和氨基酸组成起主要作用。 
[003.0.0.1]植物可以利用范围广泛的氮种类，包括挥发性氨(NH3)、氮的氧化物(NOx)、矿物质氮，如硝酸盐(NO3 -)和铵盐(NH4 +)、尿素和尿素衍生物以及有机氮(氨基酸、肽等)。一些植物能够通过共生细菌或某些真菌利用大气中的氮。然而，大多数农业土壤中，硝酸盐(NO3 -)是最重要的氮源(Crawford和Glass，1998；Hirsch和Sussman，1999)。然而，铵NH4 +也起着可能被低估的重要作用，由于当NO3 -和NH4 +两种形式都存在时，即使NH4 +以比NO3 -低的浓度存在，大多数植物还是优先摄取NH4 +。 
[004.0.0.1]由于作物种植需要高氮，氮施肥是主要的全球农业投 资，每年施用八千万公吨的氮肥(以硝酸盐和/或铵的形式)(Frink等人，1999)。含氮肥料在作物生产中的大规模使用也对环境有负面结果，因为农作物只保留所施用氮的约2/3。因此，高肥料输入之后是通过沥滤、气体损耗和作物排出(crop removal)的大量输出。未吸收的氮可以随后沥滤到土壤并污染水供给(Frink等人，1999)。由于从农业生态系统到地下水和地表水的氮的大量沥滤损失，如今氮被认为是重要的污染物。氮沥滤(即作为硝酸盐从农业土地的沥滤)影响饮用水品质并造成湖泊和沿岸地区的富营养化。过量使用含氮肥料还可以导致土壤质量的最终恶化，导致环境污染和健康危害。 
[005.0.0.1]由于用在农业生产中的氮肥成本高，及此外其对于环境的有害影响，期望研发降低氮输入和/或对于具有光合活性的生物，优选栽培植物(例如作物)通过给定的氮有效性而优化氮同化、累积和/或利用并同时保持最佳生产力和品质的策略。 
优选地，用作食品和/或饲料的栽培植物应具有改良的品质，尤其是就蛋白质累积和组成而言。 
[006.0.0.1]为了有效的氮摄取同化、累积和利用，需要对与氮吸收、迁移、同化和再分配相关的复杂过程进行有效操作。不同的研究人员已经证明若干物种的基因型之间的不同氮吸收和利用(Chang &Robison，2001)。在玉米和卡诺拉(canola)中也已经报道了在不同基因型中氮摄取(例如累积)的大量证据(Weisler等人，2001；Gallais &Hirel，2004)。 
[007.0.0.1]植物中的硝酸盐摄取是被高度调节的并与其它转运和代谢途径协作(Crawford，1995)，且已经鉴定并表征了许多与硝酸盐摄取和同化相关的基因(Forde，2002)。植物通过定位到根表皮和皮层细胞质膜上的转运蛋白，使用若干不同的转运机制以广泛的硝酸盐浓度范围吸收硝酸盐，包括组成型和硝酸盐诱导型高亲和转运系统，以及硝酸盐诱导型低亲和转运蛋白(Stitt，1999)。一旦硝酸盐在根细胞的细胞质 中，就可被储存在液泡中以备后用、转运到木质部和迁移到枝条用于同化和/或储存、释放回根际、或通过硝酸盐还原酶(NR)和亚硝酸盐还原酶(NiR)还原成亚硝酸盐然后成为氨。硝酸盐向亚硝酸盐然后到氨的还原产生也可以通过GOGAT途径被同化成氨基酸的氮形式(Stitt，1999)。为了合并入氨基酸、核酸和其它化合物，NO3 -必须被还原成NH4 +。NR(硝酸盐还原酶)是NO3 -还原成氨基形式过程的第一个酶。该酶是底物诱导型酶并且被认为是氮同化中的最重要的限制性步骤。 
[008.0.0.1]原位NO3 -还原速率主要受到NO3 -摄取速度的调控，而不是受到硝酸盐还原酶活性(NRA)改变或还原性限制的调控。因此，NO3 -摄取似乎对吸收NO3 -的植物中的氮同化最重要。NRA的遗传改变在若干物种中被很好地证明。NRA受诸如环境条件和植物发育阶段的因素、以及受植物部分例如根或顶端所影响。此外，体内和体外测定通常给出不同的结果。一些研究人员在其努力将NRA与谷物产量和N相关性状相联系时发现不同的结果，N相关性状例如为总还原的植物N、谷物氮含量、谷物氮浓度和氮收获指数。 
[009.0.0.1]为了描述从土壤中摄取开始、同化、累积及最终利用氮而用于生长至成熟期和用于果实及种子成熟这一完整的氮途径的效力，已知有不同的方法。就最佳的氮获取和利用的重要性而言，按照不同的策略用于植物优化。 
[0010.0.0.1]美国专利6,727,411公开了生产在番茄果实中具有增加的游离氨基酸含量的转基因番茄的方法，该方法通过用含编码谷氨酸脱羧酶基因的反义序列的遗传构建体而转化番茄。 
[0011.0.0.1]一些情况下，氮同化途径的酶被过表达。尽管最初在如莲(Lotus)中的胞质谷氨酰胺合成酶基因的过表达不成功(Vincent等人，Planta.201(4)：424-33，1997)，近来的文献显示至少一些取得成功。WO95/09911描述转基因植物中谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶和天冬酰胺酶的过表达用于氮固定增强和产量提高。Chichkova等人，J. Exp.Bot.；(2001)报道了过表达苜蓿NADH-谷氨酸-合成酶的转基因烟草植物具有较高的碳和氮含量，而不是相比于碳的氮的特别富集。另一种情况下，例如在Long等人，Plant-Physiol.；(1996)111，2，增刊，48所述，氮同化基因的过表达，这一情况下是大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)谷氨酸-脱氢酶，没有导致氮含量的相对增加，而是鲜重及干重的显著增加。另一种情况下，ASN1基因的过表达增加了鼠耳芥属(Arabidopsis)植物种子中的氮含量(status)(Lam等人，PlantPhysiology，2003，321，926-935)。在那些过表达系的种子中，作者发现可溶种子蛋白质含量的升高、来自酸水解的种子的含量中总蛋白质升高和当在氮受限条件生长时幼苗的更高耐受性，证明那些性状紧密连锁。 
[0012.0.0.1]美国专利6,969,782公开了通过过量表达谷氨酸脱氢酶(GDH)而含有大量累积的游离氨基酸的植物。 
美国专利申请20030115638提供一种转化的植物，其具有通过导入磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)基因而增加的游离氨基酸含量。
美国专利20050044585公开了通过表达丙氨酸转氨酶基因在植物根中具有升高的氮利用蛋白质水平的那些植物。 
[0013.0.0.1]Yanagisawa等人PNAS(2004)101，20，7833-7838采用了不同的有趣方法。该作者鉴定并过表达了一种调控因子，该因子诱导编码用于碳骨架产生的酶的基因上调，在转基因鼠耳芥属植物中氨基酸含量显著增加和葡萄糖水平降低。初步分析揭示转基因植物中氮含量增加(约至30％)，表明净氮同化的促进。最值得注目的是，Dofl转基因植物展现出在低氮条件下生长提高这一农业上重要的性状。尽管似乎有前景，该方法可能具有缺陷，而这取决于植物转录因子和复杂的对应信号级联放大，这两者可能是至少在某些条件下，改变或者甚至减小所期望作用的不同内部调节和反馈机制的主体。此外，植物转录因子的功能依赖于其与其具有不同启动子的靶序列间的相互作用，使得不同植物物种之间的结果转换复杂且不可预料。
[0014.0.0.1]然而，需要能够更有效地同化和累积氮的具有光合活性的生物。此外，该具有光合活性的生物应该能够更有效地利用氮以便需要较少的氮而获得相同的产量或者由当前的氮使用水平而获得较高的产量。 
[0015.0.0.1]还需要显示生物量产量增加的具有光合活性的生物，优选具有较快的生长速率，其可导致较多的果实或种子产量。 
该新的具有光合活性的生物应在果实或种子或整个生物中呈现出较高但确定(相对于不同氨基酸的比例)的氨基酸含量。 
该新的具有光合活性的生物应在果实或种子或整个生物中呈现出较高但确定(相对于不同氨基酸的比例)的蛋白质含量。 
[0016.0.0.1]该新的具有光合活性的生物在周围介质、土壤或环境中氮含量降低的条件下也应显示这些性状中至少一种。 
[0017.0.0.1]本发明的一个实施方案中，通过用于提高氮同化、累积和/或利用而导致具有光合活性的生物的果实或种子或整个生物中总含氮量增加的方法获得这些性状。 
[0018.0.0.1]本发明的一个实施方案中，这通过氮利用效率(NUE)的增加而实现。 
本发明的一个实施方案中，将NUE定义为获得自土壤，包括氮肥的每单位氮的谷物产量。 
本发明的另一个实施方案中，NUE按照Reynolds，M.P.，J.J.Ortiz-Monasterio和A.McNab(编)，2001.Application of Physiology in WhaetBreeding，Mexico，D.F.：CIMMYT进行定义，其通过引用作为参考。 
本发明的另一个实施方案中，将NUE定义为从土壤，包括氮肥获得的每单位氮的生物量产量。 
本发明的另一个实施方案中，将NUE定义为从土壤，包括氮肥获得的每单位氮的具有光合活性的生物的总含氮量。 
[0019.0.0.1]植物也可以铵的形式摄取氮。尽管土壤中平均NH4 +浓度 经常比NO3 -的浓度低10-1000倍(Marschner HL，Mineral Nutrition inHigher Plants.London：Academic Press；1995)，但土壤浓度的差别并不必然会反映每种氮源的摄取定量。植物在可获得两种氮形式时优选摄取NH4 +，最终由于其同化需要较少能量，因为NO3 -必须在同化前被还原(Bloom等人，Plant Phys.1992，1294-1301)。 
[0020.0.0.1]已在不同生物，包括酵母和植物中表征了铵摄取系统。酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)含有三种用于铵转运蛋白的MEP基因，它们都受氮调控，在容易代谢的氮源(例如NH4 +)存在下被抑制(Marini等人，Mol Cell Biol 1997，17：4282-4293)。通过酵母突变体的互补、数据库中的同源检索和异源杂交已经克隆了编码铵转运系统的植物基因(van Wieren等人综述，Current Opinion in Plant Biology，200，3：254-261)。NH4 +转运蛋白的生理功能的实验证据主要依赖于铵转运蛋白表达和标记的铵流入之间的相关性。因为鼠耳芥属(Arabidopsis)植物以及其它植物的铵转运蛋白以基因家族形式存在，而其成员具有不同的表达类型和生理特征，使得这一情形很复杂。尽管DE4337597主张用于植物铵转运蛋白的序列及其在某些条件下，在操作氮代谢和植物生长中的应用，但在某些条件下通过植物铵转运蛋白的异常表达，没有对氮同化或植物生长起正面作用的任何证据。因此，植物中遗传改造氮同化的文献证据仍限于一些情况，而不包括转运蛋白。 
[0021.0.0.1]本发明的目的是产生一种用于在具有光合活性的生物中提高氮同化、累积和/或利用和/或用于增加总含氮量的便宜的方法，以导致果实或种子或整个生物中增加的总含氮量和提高的氮利用效率(NUE)。 
[0022.0.0.1]现在发现这一目的是通过提供本文所述发明和权利要求中表征的实施方案的方法而实现。 
[0023.0.0.1]因此，第一实施方案中，本发明涉及用于在具有光合活性的生物中提高氮同化、累积和/或利用的方法。
因此，另一个实施方案中，本发明涉及用于增加具有光合活性的生物中总含氮量的方法。 
[0024.0.0.1]因此，一个实施方案中，这是通过氮或含氮化合物的(增加的)产生而实现，其中，氮或含氮化合物是含有氮(N)的化合物。一个实施方案中，本文使用的术语“氮或含氮化合物”指“氨基酸”，优选苯丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、5-羟脯氨酸和/或丙氨酸，含“血红素-复合物”、“嘌呤”和/或“嘧啶”的化合物和/或衍生物。此外，另一个实施方案中，本文使用的术语“氮或含氮化合物”还指包括含N化合物的精细化学品组合物。 
[0025.0.0.1]因此，本发明涉及一种方法，其包括： 
(a)在非人类生物或其一或多个部分或区室中，增加或产生一种或多种如表II第3栏所示蛋白质的活性，所述蛋白质由表I第5栏所示的核酸序列所编码，和 
(b)在允许生产氮或含氮化合物的条件下使生物生长，从而生物中含N化合物和/或氮同化、累积和/或利用提高和/或总含氮量增加。 
[0026.0.0.1]因此，本发明涉及一种生产精细化学品的方法，包括： 
(a)在非人类生物或在其一个或多个部分或区室中，增加或产生一种或多种蛋白质的活性，所述蛋白质具有选自表II第3栏，应用号1和/或2和/或3，第1和/或2和/或3和/或4和/或5行分别所示蛋白质活性或具有由表I第5或7栏，应用号1和/或2和/或3中所示核酸分子编码的多肽序列，和 
(b)在允许生产氮或含氮化合物，尤其是含N化合物的条件下使生物生长。 
[0027.0.0.1]当“包括了”/“包括”及其语法变化用于本说明书时，它们被用于指所述特征、整数、步骤或组分或其组群的存在，但不排除存在或添加一种或多种其它特征、整数、步骤、组分或其组群。 
本说明书中使用的术语“表I”被用于指表IA和表IB的内容。本说明 书中使用的术语“表II”被用于指表IIA和表1IB的内容。本说明书中使用的术语“表IA”被用于指表1A内容。本说明书中使用的术语“表1B”被用于指表IB的内容。本说明书中使用的术语“表IIA”被用于指表IIA内容。本说明书中使用的术语“表1IB”被用于指表1IB的内容。一个优选的实施方案中，术语“表I”指表IB。一个优选的实施方案中，术语“表II”指表1IB。 
术语“提高的”或“增加”指相比于下面限定的参照(例如，这指相比于没有前述蛋白质活性改变的生物)，产生至少10％、20％、30％、40％或50％，优选至少60％、70％、80％、90％或100％，更优选150％、200％、300％、400％或500％更高的氮或含氮化合物，所述蛋白质具有选自如表II第3栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3所示蛋白质活性或由表I第5或7栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3所示核酸分子编码的蛋白质活性。术语“区室”指细胞的所有不同亚细胞区室，包括但不限于线粒体、液泡、细胞核、所有类型的质体，例如造粉体、叶绿体、有色体、细胞外空间、线粒体、内质网、油质体、过氧化物酶体、酵解酶体和其它区室。 
[0028.0.0.1]出人意料地，发现至少一种如表II第3栏，应用号1和/或2，各自第1或3行和/或应用号3第4和/或5行所示酿酒酵母蛋白质和/或至少一种如表II第3栏，应用号2，第2行所示的大肠埃希氏菌K12蛋白质在拟南芥中的转基因表达赋予转化的生物中含N化合物含量的增加和/或赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量。 
[0029.0.0.1]出人意料地发现，当在宿主细胞(优选在植物细胞的胞质溶胶)中表达时，至少一种如表II第3栏，应用号1，第1行所示酿酒酵母蛋白质在拟南芥中的转基因表达赋予转化的生物增加的含N化合物含量的和/或赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量。 
[0030.0.0.1]出人意料地发现，当在宿主细胞(优选在质体)中表达时，至少一种如表II第3栏，应用号2，第3行和/或应用号3，第4和/ 或5行所示酿酒酵母蛋白质和/或至少一种如表II第3栏，应用号2，第2行所示大肠埃希氏菌K12蛋白质在拟南芥中的转基因表达赋予转化的生物增加的含N化合物含量和/或赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量。 
[0031.0.0.1]根据本发明，按本文解释的术语“生物”总是指非人类生物，尤其指具有光合活性的生物，优选植物生物或指微生物。 
[0032.0.0.1]Goffeau等人，Science 274(5287)，546-547，1996和Bussey等人，Nature 387(6632增刊)，103-105(1997)已经公布了来自酿酒酵母的YPR138C的序列并且其活性被定义为NH4 +转运蛋白。因此，一个实施方案中，本发明方法包括使用来自酿酒酵母具有铵转运蛋白；铵转运蛋白nrgA超家族(优选具有NH4 +转运蛋白活性的蛋白质)的活性的基因产物或其同源物(例如如本文所示)，在如所述生物或其部分中用于生产氮或含氮化合物(即含N化合物)和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量，尤其用于增加含N化合物的量。 
因此，一个实施方案中，本发明的方法包括使用来自酿酒酵母具有铵转运蛋白；铵转运体nrgA超家族(优选具有NH4 +转运体活性的蛋白质)活性的基因产物或其同源物(例如如本文所示)用于提高氮摄取和/或同化。 
因此，一个实施方案中，本发明的方法包括使用来自酿酒酵母具有铵转运蛋白；铵转运体nrgA超家族(优选具有NH4 +转运体活性的蛋白质)活性的基因产物或其同源物(例如如本文所示)用于在氮受限的条件下增加氮摄取和/或利用和/或同化。 
Goffeau等人，Science 274(5287)，546-547，1996和Philippsen等人，Nature 387(6632增刊)，93-98(1997)已经公布了来自酿酒酵母的YNL241C序列(登录号NP_014158)，并且其活性被定义为“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Zwf1p)”。因此，一个实施方案中，本发明方法包括所述 “葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”或其同源物在如所述生物或其部分中(优选在质体中，例如如本文所示)用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增加含N化合物的量。 
因此，一个实施方案中，本发明方法包括所述“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”或其同源物优选在质体中(例如如本文所示)，用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于提高氮摄取和/或同化。因此，一个实施方案中，本发明的方法包括所述“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”或其同源物在氮受限的条件下优选在质体中(例如如本文所示)用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量，即含N化合物，尤其是用于增加氮摄取和/或利用和/或同化。 
Blattner等人，Science 277(5331)，1453-1474(1997)已经公布了来自大肠埃希氏菌的b1852的序列(登录号NP_416366)，并且其活性被定义为“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”。因此，一个实施方案中，本发明的方法包括“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”或其同源物在如所述生物或其部分中(优选在质体中，例如如本文所示)，用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增加含N化合物的量。 
因此，一个实施方案中，本发明的方法包括“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”或其同源物优选在质体中(例如如本文所示)用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量(即含N化合物)，用于提高氮摄取和/或同化。 
因此，一个实施方案中，本发明的方法包括“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”或其同源物在氮受限的条件下优选在质体中(例如如本文所示)，用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增加氮摄取和/或利用和/或 同化。 
Goffeau等人，Science 274(5287)，546-547，1996和Anderson等人，J.Biol.Chem 264，19176-19184(1989)已经公布了来自酿酒酵母的YJL167W的序列(登录号NP_012368.1)，并且其活性被定义为“法呢基焦磷酸合成酶(FPP合酶)”。因此，一个实施方案中，本发明的方法包括所述“法呢基焦磷酸合成酶(FPP合酶)”或其同源物在如所述生物或其部分中(优选在质体中，例如如本文所示)用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增加含N化合物的量。 
因此，一个实施方案中，本发明的方法包括所述“法呢基焦磷酸合成酶(FPP合酶)”或其同源物优选在质体中(例如如本文所示)，用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量(即含N化合物)，尤其用于提高氮摄取和/或同化。 
因此，一个实施方案中，本发明的方法包括所述“法呢基焦磷酸合成酶(FPP合酶)”或其同源物在氮受限的条件下优选在质体中(例如如本文所示)用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增加氮摄取和/或利用和/或同化。 
Goffeau等人，Science 274(5287)，546-547，1996和Guiard等人，EMBO J.4，3265-3272(1985)已经公布了来自酿酒酵母的YML045C的序列(登录号NP_013658.1)，并且其活性被定义为“L-乳酸细胞色素c氧化还原酶/细胞色素b2”。因此，一个实施方案中，本发明的方法包括所述“L-乳酸细胞色素c氧化还原酶/细胞色素b2”或其同源物，在如所述生物或其部分中(优选在质体中，例如如本文所示)用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量，即含N化合物，尤其是用于增加含N化合物的量。 
因此，一个实施方案中，本发明的方法包括所述“L-乳酸细胞色素c 氧化还原酶/细胞色素b2”或其同源物优选在质体中(例如如本文所示)用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量(即含N化合物)，尤其用于提高氮摄取和/或同化。 
因此，一个实施方案中，本发明的方法包括所述“L-乳酸细胞色素c氧化还原酶/细胞色素b2”或其同源物在氮受限的条件下优选在质体中(例如如本文所示)，用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量，即含N化合物，尤其是用于增加氮摄取和/或利用和/或同化。 
[0033.0.0.1]本发明的基因产物的同系物(＝同源物)可以源自任何生物，只要该同源物赋予本文提及的活性，尤其是赋予氮或含氮化合物的量或含量的增加。此外，本发明中，术语“同源物”指与本文提及或列出的所述生物所有表达了的序列的序列具有最高序列同源性的生物的序列。然而，本领域技术人员应理解，该同源物优选具有所述增加氮含量的活性并且如果已知，则在该生物中具有与至少一种蛋白质相同的生物功能或活性，所述蛋白质选自如表I第3栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3所示蛋白质，例如具有由包括如表I第5或7栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3所示序列的核酸分子所编码的多肽序列。 
一个实施方案中，表II第1或3或4或5行所示多肽中任何一种的同源物是源自真核生物具有相同或相似活性(尤其是其增加的活性赋予生物中氮或含氮化合物含量增加)的同源物。一个实施方案中，表II第3栏，第2行所示多肽的同源物是源自细菌的具有相同或相似活性(尤其是其增加的活性赋予生物或其部分中氮或含氮化合物的氮含量增加)的同源物。一个实施方案中，表II第3栏，第1或3或4或5行所示多肽的同源物是源自真菌的具有相同或相似活性且(尤其是其增加的活性赋予生物或其部分中氮或含氮化合物含量增加)的同源物。 
一个实施方案中，表II第3栏，第2行所示多肽的同源物是源自变形菌门(Proteobacteria)的具有相同或相似活性(尤其是其增加的活性赋 予生物或其部分中氮或含氮化合物含量增加)的同源物。 
一个实施方案中，表II第3栏，第1或3或4或5行所示多肽的同源物是源自子囊菌门(Ascomycota)且具有相同或相似活性(尤其其增加的活性是赋予生物或其部分中氮或含氮化合物含量增加)的同源物。 
一个实施方案中，表II第3栏，第2行所示多肽的同源物是源自γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)且具有相同或相似活性(尤其是其增加的活性赋予生物或其部分中氮或含氮化合物含量增加)的同源物。 
一个实施方案中，表II第3栏，第1或3或4或5行所示多肽的同源物是源自酵母亚门(Saccharomycotina)且具有相同或相似活性(尤其是其增加的活性赋予生物或其部分中氮或含氮化合物含量增加)的同源物。 
一个实施方案中，表II第3栏，第2行所示多肽的同源物是源自肠杆菌目(Enterobacteriales)且具有相同或相似活性(尤其是其增加的活性赋予生物或其部分中氮或含氮化合物含量增加)的同源物。 
一个实施方案中，表II第3栏，第1或3或4或5行所示多肽的同源物是源自酵母菌纲(Saccharomycetes)且具有相同或相似活性(尤其是其增加的活性赋予生物或其部分中氮或含氮化合物含量增加)的同源物。 
一个实施方案中，表II第3栏，第2行所示多肽的同源物是源自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)且具有相同或相似活性(尤其是其增加的活性赋予生物或其部分中氮或含氮化合物含量增加)的同源物。 
一个实施方案中，表II第3栏，第1或3或4或5行所示多肽的同源物是源自酵母菌目(Saccharomycetales)且具有相同或相似活性(尤其是其增加的活性赋予生物或其部分中氮或含氮化合物含量增加)的同源物。 
一个实施方案中，表II第3栏，第2行所示多肽的同源物是源自埃希氏菌属(Escherichia)且具有相同或相似活性(尤其是其增加的活性赋 予生物或其部分中氮或含氮化合物含量增加)性的同源物。 
一个实施方案中，表II第3栏，第1或3或4或5行所示多肽的同源物是源自酵母科(Saccharomycetaceae)且具有相同或相似活性(尤其是其增加的活性赋予生物或其部分中氮或含氮化合物含量增加)的同源物。 
一个实施方案中，表II第3栏，第1或3或4或5行所示多肽的同源物是源自酵母菌(Saccharomycetes)且具有相同或相似活性(尤其是其增加的活性赋予生物或其部分中氮或含氮化合物含量增加)的同源物。 
[0034.0.0.1]表II第3栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3所示多肽的同源物可能是由表I第7栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3所示核酸分子所编码的多肽或者可能是由表II第7栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3所示的多肽。 
[0035.0.0.1]其它的同源物在本文下面描述。 
[0036.0.0.1]根据本发明，蛋白质或多肽具有“本发明蛋白质的活性”或如本文所用蛋白质的活性，例如这样的蛋白质，其具有如表II第3栏，应用号1所示蛋白质的活性，只要其从头产生(de novo)的活性或其增加的表达直接或间接导致生物或其部分中(优选所述生物的细胞中)总含氮量的增加，优选含N化合物的总含氮量的增加，优选氨基酸的增加，更优选苯丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、5-羟脯氨酸和/或丙氨酸水平的增加。 
本发明的一个实施方案中，具有如表II第3栏，应用号1所示蛋白质活性的蛋白质的表达具有本发明蛋白的活性，只要其从头产生的活性或其增加的表达直接或间接导致总含氮量的增加，优选含N化合物的总含氮量的增加，优选氨基酸的增加，更优选植物叶子中苯丙氨酸、脯氨酸水平和优选在植物种子中的天冬氨酸、5-羟脯氨酸和/或丙氨酸水平的增加。
[0036.1.0.1]根据本发明，蛋白质或多肽具有“本发明蛋白质的活性”或如本文所用蛋白质的活性，例如这样的蛋白质，其具有如表II第3栏，应用号2，第2行所示蛋白质的活性，只要其从头产生的活性或其增加的活性直接或间接导致生物或其部分中(优选所述生物的细胞中)总含氮量的增加，优选含N化合物的总含氮量的增加，优选氨基酸的增加，更优选脯氨酸水平的增加。 
本发明的一个实施方案中，具有如表II第3栏，应用号2，第2行所示蛋白质活性的蛋白质的表达具有本发明蛋白质的活性，只要其是从头产生的活性或其增加的活性直接或间接导致总含氮量的增加，优选含N化合物的总含氮量的增加，优选氨基酸的增加，更优选植物叶子中脯氨酸水平的增加。 
[0036.2.0.1]根据本发明，蛋白质或多肽具有“本发明蛋白质的活性”或如本文所用蛋白质的活性，例如这样的蛋白质，其具有如表II第3栏，应用号2，第3行所示蛋白质的活性，只要其从头产生的活性或其增加的表达直接或间接导致在生物或其部分中(优选所述生物的细胞中)增加的总含氮量，优选含N化合物的总含氮量的增加，优选氨基酸的增加，更优选酪氨酸、色氨酸、异亮氨酸、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸和/或丙氨酸水平的增加。 
本发明的一个实施方案中，具有如表II第3栏，应用号2，第3行所示蛋白质活性的蛋白质的表达具有本发明的蛋白质的活性，只要其从头产生的活性或其增加的活性直接或间接导致增加的总含氮量，优选含N化合物的总含氮量的增加，优选氨基酸的增加，更优选在植物叶子中酪氨酸、色氨酸、异亮氨酸、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸和/或丙氨酸水平的增加和/或植物种子中的丙氨酸水平的增加。 
[0037.0.0.1]优选的实施方案中，蛋白质或多肽具有上述提及的选自表II第3栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3(优选应用号1)所示蛋白质的其它活性。本说明书中，如果其还具有选自如表II第3栏， 应用号1和/或应用号2和/或应用号3(优选应用号1)所示蛋白质中任何一种的生物活性或酶活性，那么该蛋白质或多肽或核酸分子或编码该蛋白质或多肽的序列的活性或优选生物活性相同或相似，即如果其与表II第3栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3，优选应用号1所示蛋白质中任何一种相比，具有原始酶活性的至少10％，优选20％，尤其优选30％，最尤其优选40％。 
[0038.0.0.1]一个实施方案中，本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽如果其源自与表达它的生物进化距离远的生物时(例如原始生物和表达生物源自不同的科、目、纲或门)，则赋予所述活性(例如增加生物或其部分中氮或含氮化合物和/或提高氮同化、累积和/或利用和/或用于增加总含氮量)。 
[0039.0.0.1]一个实施方案中，本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽赋予所述活性(例如增加生物或其部分中氮或含氮化合物和/或提高氮同化、累积和/或利用和/或用于增加总含氮量)，只要其源自与表I第4列所示的生物进化距离近的生物并且在与原始生物进化距离远的生物中表达。例如，原始生物和表达生物源自不同的科、目、纲或门，然而原始生物和表I第4列所示的生物源自相同的科、目、纲或门。 
[0040.0.0.1]术语“增加的”、“升高的”、“扩大的”、“提高的”、“提高的”或“扩增的”涉及生物中，诸如组织、种子、根、叶、花等生物的部分中，或细胞中性质的相应改变并且可互换使用。优选地，在增加或提高涉及基因产物活性增加或提高的情况下，在该体积中的总活性都增加或提高，而与基因产物的量或基因产物的比活性或两者是否增加或提高，或者编码基因产物的核酸序列或基因的量、稳定性或翻译效率是否增加或提高无关。术语“降低”“减少”或“消除”涉及生物中，诸如组织、种子、根、叶、花等的生物的部分中，或细胞中性质的相应改变。优选地，在降低、减少或消除涉及基因产物的活性的降低、减少或消除的情况下，在该体积中的总活性都降低、减少或消除，而与基因产物的量或基因产 物的比活性或两者是否降低、减少或消除，或者编码基因产物的核酸序列或基因的量、稳定性或翻译效率是否降低、减少或消除无关。 
[0041.0.0.1]术语“增加”或“减少”涉及生物中，诸如组织、种子、根、叶、花等的生物的部分中，或细胞中性质的相应改变。优选地，在增加涉及基因产物的活性增加的情况下，该体积中的总活性增加，而与基因产物的量或基因产物的比活性或两者是否增加或产生，或者编码基因产物的核酸序列或基因的量、稳定性或翻译效率是否增加无关。 
[0042.0.0.1]应理解“性质的改变”指在与对照、参照或野生型的相应体积相比，特定体积中基因产物的活性、表达水平或量或代谢物含量或元素含量改变，包括活性或表达的从头产生。 
[0043.0.0.1]术语“增加”或“减少”包括只在本发明对象的部分中改变或调控所述性质，例如，该变化可以出现在细胞的区室(如细胞器中)，或者植物的部分(如组织、种子、根、叶、花等)中，但在检测整个对象(即完整的细胞或植物)时却检测不到。优选地，增加或减少是细胞性的(cellular)，因此，术语“活性的增加”或“代谢物或元素含量的增加”涉及与野生型细胞相比的细胞性增加。 
然而，如本文所使用的术语增加或减少也包括如所提及的整个生物的性质的改变或调节。 
[0044.0.0.1]因此，术语“增加”或“减少”指酶的比活性，优选化合物或代谢物的量，例如多肽、核酸分子的量或本发明的氮或含氮化合物或编码mRNA或DNA的量可以在一定体积中增加或减少。 
[0045.0.0.1]术语“野生型”、“对照”或“参照”可互换使用，并且可以是未按本文所述的根据本发明的方法进行修饰或处理的细胞或生物的部分(例如细胞器或组织)，或生物(尤其是微生物或植物)。因此，用作野生型、对照或参照的细胞或生物的部分(例如细胞器或组织)或生物(尤其是微生物或植物)尽可能地对应于细胞、生物或其部分，并且除了本发明方法的结果不同以外，任何其它性质尽可能多地与本发明的 主题相同。因此，野生型、对照或参照被相同或尽可能相同地处理，也就是说可能只有不影响受试性质特性的条件或性质不同。 
[0046.0.0.1]优选地，任何比较都在类似条件下进行。术语“类似条件”指所有条件，例如培养或生长条件、测定条件(例如缓冲液组成、温度、底物、病原株、浓度等)在待比较的实验之间保持一致。 
[0047.0.0.1]“参照”、“对照”或“野生型”优选未按本文所述的本发明方法进行修饰或处理的并且是尽可能与本发明主题在任何其它性质上相似的对象，例如细胞器、细胞、组织、生物，尤其是植物或微生物。参照、对照或野生型在其基因组、转录组、蛋白质组或代谢组上与本发明的主题尽可能地相似。优选地，术语“参照”、“对照”或“野生型”细胞器、细胞、组织或生物(尤其是植物或微生物)指与本发明的细胞器、细胞、组织或生物(尤其是植物或微生物)或其部分在遗传上几乎相同，优选95％，更优选98％、甚至更优选99.00％，尤其是99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、99.90％、99.99％、99.999％或更高相同性的细胞器、细胞、组织或生物(尤其是植物或微生物)。最优选，“参照”、“对照”或“野生型”是除了以下不同之处外与本发明方法所使用的生物、细胞或细胞器在遗传上相同的对象(例如细胞器、细胞、组织、生物)，所述不同为负责或者赋予活性的核酸分子或由它们编码的基因产物在本发明方法中将被修改、操作、交换或导入。 
优选地，该参照、对照或野生型只在本发明多肽或本发明方法中所使用多肽的细胞活性方面(例如由本发明核酸分子水平的增加或本发明多肽或本发明方法中所使用多肽的比活性增加所致)上不同于本发明的对象，例如，其与如下蛋白质(具有选自如表II第3栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3，优选应用号1所示蛋白质活性，或由如表I第5栏，应用号1和/或应用号2，优选应用号1所示核酸分子所编码的蛋白质的活性，或其例如如表I第7栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3，优选应用号1所示同源物的活性)在表达水平或活性上相区别，其生化 或遗传造成并因此显示增加的氮或含氮化合物的量，提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加的总含氮量。 
[0048.0.0.1]如果不能提供与本发明主题相差只在于其未曾接受本发明方法处理的对照、参照或野生型，那么对照、参照或野生型可以是这样的生物，在该生物中导致活性改变从而赋予氮或含氮化合物增加的原因，或者如本文所述的核酸分子的表达已经通过如下方式被关闭或者恢复原状，所述方式为例如敲除效应基因产物的表达，例如反义抑制、使激活物或激动剂失活、激活抑制剂或拮抗剂、加入抑制性抗体进行的抑制、添加诸如激素的活性化合物、导入显性负突变体等。例如，可以通过导入失活性点突变而敲除基因产物，这导致酶活性或生物活性的抑制或导致结合辅助因子的能力失去稳定或被抑制等。 
[0049.0.0.1]因此，优选的参照物是本发明方法的起始物。优选地，在对总RNA、DNA或蛋白质或参考基因(如持家基因，例如泛素、肌动蛋白或核糖体蛋白)的活性或表达标准化和归一化后，将参照和本发明主题进行比较。 
[0050.0.0.1]存在一系列的机制，通过它们，蛋白质(例如本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽)的修饰，可以直接或间接影响氮的摄取或同化或含氮化合物的产率、产量和/或生产效率。 
[0051.0.0.1]例如，可增加多肽或核酸分子的分子数或比活性。如果在缺乏所述蛋白质的活性的生物中从头表达本发明的多肽或核酸，那么更大量的氮(或者在产生的含氮化合物的情况下)可以被同化或摄取。然而，还能够增加天然存在于生物中的基因的表达，例如，通过扩增基因数、通过改变基因的调控、或通过增加由本发明核酸分子或本发明方法中所使用核酸分子所编码的相应mRNA或相应基因产物的稳定性、或通过导入来自其它生物的同源基因，这些基因例如受到非反馈敏感性的不同调控。 
本发明的增加、减少或调节可以是组成型的，或者是瞬时的，或者 是诱导型的，所述组成型例如由稳定的永久性转基因表达或由在编码本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子的相应内源基因的稳定突变或由对赋予本发明多肽或本发明方法中使用的多肽表达的基因的表达或行为进行调节所致，所述瞬时的例如由瞬时转化或临时添加调节剂(例如激动剂或拮抗剂)所致，所述诱导型的例如在可诱导的启动子调控下，用携带本发明的核酸分子或本发明方法中所使用核酸分子的诱导型构建体转化后，添加诱导剂(例如四环素或本文下面所述的)。 
[0052.0.0.1]相比于对照、参照或野生型，在细胞、组织、细胞器、器官或生物或其部分中多肽活性量的增加优选达到至少5％，优选达到至少20％或至少50％，尤其优选达到至少70％、80％、90％或更高，尤其非常优选达到至少200％，最优选达到至少500％或更高。 
[0053.0.0.1]可以按实施例所述来检测由本发明核酸分子编码的多肽或本发明多肽的比活性。特别地，检测所述蛋白质相比于对照在细胞(例如植物细胞或微生物)中的表达和氮或含氮化合物水平的增加是容易的，并且可以按照本领域现有技术所述来进行。 
[0054.0.0.1]术语“增加”包括将化合物或活性从头导入细胞或该化合物或活性在之前是检测不到的，换言之，它是“产生的”。 
[0055.0.0.1]因此，下文中，术语“增加”也包括术语“产生”或“刺激”。增加的活性本身体现在氮或含氮化合物的量的增加。 
[0056.0.0.1]一个实施方案中，在酿酒酵母蛋白质YPR138C或其同源物(例如，如表II第5或7栏，应用号1，第1行所示)活性增加的情况下；优选赋予氮或含氮化合物增加17-24％或更多，优选赋予植物中蛋白质或氨基酸含量增加17-24％或更多。优选在植物种子或果实中赋予这一增加。 
[0057.0.0.1]一个实施方案中，在酿酒酵母蛋白质YPR138C或其同源物活性增加的情况下，优选氮或含氮化合物增加和赋予种子中辅酶Q10、富马酸、苹果酸和/或二十四烷酸的增加和/或赋予植物种子中3-磷 酸甘油酯、苯甲酸、羟基苯甲酸和/或十二烷醇的增加。 
[0058.0.0.1]一个实施方案中，在酿酒酵母蛋白质YNL241C或其同源物(例如，如表II第5或7栏，应用号2，第3行所示)优选在细胞区室(优选在质体)中增加活性的情况下，优选赋予氮或含氮化合物增加10-15％或更多，优选赋予12％或更多，优选植物中赋予氨基酸含量增加10-15％或更多，优选赋予12％或更多。优选在植物种子或果实中赋予这一增加。 
[0059.0.0.1]一个实施方案中，在大肠埃希氏菌蛋白质b1852或其同源物(例如，如表II第5或7栏，应用号2，第2行所示)优选在细胞区室(优选在质体)中活性增加的情况下，优选赋予氮或含氮化合物增加10-15％或更多，优选赋予13％或更多，优选植物中氨基酸含量增加10-15％或更多，优选赋予13％或更多，优选在种子中。 
[0059.1.0.1]一个实施方案中，在酿酒酵母蛋白质YJL167W或其同源物(例如，如表II第5或7栏，应用号3，第4行所示)优选在细胞区室(优选在质体)中活性增加的情况下，优选赋予氮或含氮化合物增加5-30％或更多，优选赋予8-26％或更多，优选在种子中。 
[0059.2.0.1]一个实施方案中，在酿酒酵母蛋白质YML054C或其同源物(例如，如表II第5或7栏，应用号3，第5行所示)优选在细胞区室(优选在质体)中活性增加的情况下，优选赋予氮或含氮化合物增加5-20％或更多，优选赋予6-15％或更多，优选在种子中。 
[0060.0.0.1]优选地，具有赋予氮或含氮化合物的量或水平增加和/或提高氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量的活性的蛋白质具有本文所述的多肽结构，尤其是包括选自表IV第7栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3，优选应用号1所示共有序列的多肽的结构，或选自表II第5或7栏，应用号1和/或应用号2和/或应用号3，优选应用号1所示多肽或如本文所述的其功能性同源物的结构，或由本文所表征的核酸分子或本发明核酸分子(例如由如表I第5或7栏，应用号1和/或应用号2 和/或应用号3，优选应用号1，所示核酸分子或其在本文所述的功能性同源物)所编码的多肽的结构，并具有本文提及的活性。 
[0061.0.0.1]由于在本发明方法中使用和由本发明核酸分子编码的蛋白质的生物活性，可以产生包括氮或含氮化合物的组合物。根据对用于本发明方法的生物体(例如微生物或植物)的选择，可以产生多种含氮化合物的组合物或混合物，例如，包括其它不同的氨基酸、脂肪酸、维生素、激素、糖类、脂类等。 
[0062.0.0.1]术语“表达”指编码性基因片段或基因的转录和/或翻译。通常，生成的产物是mRNA或蛋白质。然而，表达产物也可以包括功能性RNA，例如反义核酸、tRNA、snRNA、rRNA、RNAi、siRNA、核酶等。表达可能是系统性的、局部或暂时性的，例如限于某些细胞类型、组织器官或时期。 
[0063.0.0.1]一个实施方案中，本发明的方法包括下述步骤中的一个或多个： 
a)稳定蛋白质，该蛋白质使由本发明核酸分子所编码蛋白质或本发明多肽或本发明方法中所使用核酸分子或多肽表达增加，例如，使具有选自如表II第3栏所示蛋白质活性或其同源物(例如如表II第5或7栏所示，具有本文提及的增加活性)活性的多肽表达增加； 
b)稳定mRNA，该mRNA使由本发明核酸分子或本发明方法中所使用核酸分子编码的蛋白质表达增加，例如使具有选自如表II第3栏所示蛋白质的活性或其同源物(例如如表II第5或7栏所示)的活性的多肽表达增加，或使编码具有本文提及的增加活性的本发明多肽的mRNA表达增加； 
c)增加蛋白质的比活性，该蛋白质使具有本文提及的增加的活性，由本发明核酸分子所编码蛋白质的或本发明多肽或本发明方法中所使用核酸分子或多肽的表达增加，例如，使具有选自如表II第3栏所示蛋白质的活性或其同源物(例如如表II第5或7栏所示)的活性的多肽表达 增加，或该蛋白质降低本发明多肽或本发明方法中所使用多肽的抑制调控； 
d)产生或增加内源性或人工转录因子的表达，该因子介导这种蛋白质的表达，即其增加具有本文提及的增加活性，由本发明核酸分子或本发明方法中所使用核酸分子编码的蛋白质或本发明多肽或本发明方法中所使用多肽的表达，例如，使具有选自如表II第3栏所示蛋白质的活性或其同源物(例如，如表II第5或7栏所示)的活性的多肽表达增加； 
e)通过向生物或其部分添加一种或多种外源诱导因子，刺激蛋白质的活性，该蛋白质增加具有本文提及的增加的活性，由本发明核酸分子所编码蛋白质或本发明多肽的表达，例如，使具有选自如表II第3栏所示蛋白质的活性或其同源物(例如，如表II第5或7栏所示)的活性的多肽表达增加； 
f)表达编码蛋白质的转基因，该蛋白质增加具有本文提及的增加的活性，由本发明核酸分子所编码多肽或本发明多肽的表达，例如使具有选自如表II第3栏所示蛋白质的活性或其同源物(例如，如表II第5或7栏所示)的活性的多肽表达增加； 
g)增加使核酸分子表达增加的基因的拷贝数，该核酸分子编码具有本文提及的增加的活性，由本发明核酸分子或本发明方法中所使用核酸分子编码的多肽或本发明多肽或本发明方法中所使用的多肽，例如，编码具有选自如表II第3栏所示蛋白质的活性或其同源物(例如，如表II第5或7栏所示)的活性的多肽， 
h)通过加入正表达元件或除去负表达元件，增加编码本发明多肽或本发明方法中所使用多肽的内源基因的表达，该多肽例如是具有选自如表II第3栏所示蛋白质的活性或其同源物(例如选自如表II第5或7栏所示)的活性的多肽，例如可以使用同源重组将正调控元件(如对于植物，35S增强子)导入启动子，或者除去阻遏物元件形式的调控区。可以使用其它基因转变方法以破坏阻遏物元件或提高正元件的活性。可以通 过T-DNA或转座子诱变将正元件随机导入植物并且可以鉴定其中在接近本发明基因处整合有正元件的品系，该正元件使本发明的基因表达因而提高； 
i)以增强编码本发明蛋白质的基因表达或活性或蛋白质本身的方式调节生物的生长条件，例如微生物或植物可以在导致热激蛋白(例如本发明的热激蛋白)表达提高的较高温度状态下生长，其可以导致提高的精细化学品生产；和/或 
j)从天然或突变源中选择尤其具有本发明蛋白质的高活性的生物并将其育种到靶生物，例如原种作物(elite crop)。 
[0064.0.0.1]优选地，所述mRNA是本发明的核酸分子和/或使由本发明核酸分子所编码蛋白质或者具有本文提及活性的多肽表达增加的蛋白质是本发明的多肽，例如在增加所编码多肽的表达或活性或具有选自如表II第3栏所示蛋白质的活性或其同源物(例如，如表II第5或7栏所示)的活性的多肽活性后赋予增加的含N化合物。 
[0065.0.0.1]通常，生物的细胞或区室中的mRNA或多肽的量与编码蛋白质的量相关，从而与所述体积中编码蛋白质的总活性相关。所述相关性并非总是线性的，体积中的活性取决于分子的稳定性或者激活或抑制辅助因子的存在。此外，产物以及酶的离析物抑制(educt inhibition)是众所周知的并且描述在诸如Stryer，Biochemistry的教科书中。 
[0066.0.0.1]通常，生物的细胞或区室中的mRNA、多核苷酸或核酸分子的量与编码蛋白质的量相关，从而与所述体积中编码蛋白质的总体活性相关。所述相关性并非总是线性的，该体积中的活性取决于分子的稳定性、分子的降解或者激活或抑制性辅助因子的存在。此外，酶的产物和离析物抑制是众所周知的，例如Zinser等人“Enzyminhibitoren/Enzyme inhibitors”。 
[0067.0.0.1]可以以多种方式增加上述提及的由本发明核酸分子编码的蛋白质和/或多肽的活性。例如，通过增加基因产物数，例如通过增加 表达率(如导入较强的启动子)，或通过增加表达了的mRNA的稳定性从而增加翻译率，和/或增加基因产物的稳定性从而降低衰减的蛋白质，增加生物或其部分(如细胞或细胞器)中的活性。此外可以以降低或增加反应速率或改变(降低或增加)底物亲和力的方式影响酶的活性或周转率。本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽(例如酶)的催化中心的突变，可以调节酶的周转率，例如必需氨基酸的敲除可以导致酶活性的降低或彻底敲除，或调控剂结合位点的缺失或突变可以降低负调节，如反馈抑制(或底物抑制，如果底物水平也增加的话)。可以增加本发明的酶的比活性以便增加周转率或提高辅助因子的结合。提高编码mRNA或蛋白质的稳定性也可以增加基因产物的活性。该活性的刺激也在术语“增加的活性”的范围内。 
[0068.0.0.1]而且，可改变上述提及的核酸序列的调控从而增加基因表达。这可以利用异源调控序列或通过改变(例如突变)存在的天然调控序列而有利地实现。该有利的方法也可相互结合。 
[0069.0.0.1]通常，生物或其部分，尤其是植物细胞、植物或植物组织、其部分或细胞器或微生物中的基因产物的活性可以通过增加所述生物或其部分中特异性编码mRNA或相应蛋白质的量而提高。“蛋白质或mRNA的量”被理解为指生物、组织、细胞或细胞区室中的多肽或mRNA分子的分子数。蛋白质的量的“增加”指例如通过本文下面描述的方法之一而得到的，与野生型、对照或参照相比，在生物、组织、细胞或细胞区室或其部分中所述蛋白质的分子数的数量增加。 
[0070.0.0.1]分子数目的增加优选达到至少1％，优选大于10％，更优选达到30％或更多，尤其优选达到50％、70％或更多，尤其非常优选达到100％，最优选达到500％或更多。然而，从头表达也被认为是本发明的主题。 
[0071.0.0.1]改变(即增加或减少)可以由内源或外源因子所实现。例如，可以通过向培养基或营养物中添加基因产物或前体或激活剂或激 动剂而引起或可以通过瞬时或稳定地向生物中导入所述对象而引起生物或其部分中的活性的增加。 
[0072.0.0.1]一个实施方案中，通过增加本发明多肽或本发明方法中使用的多肽在细胞溶胶或区室(如质体)中的内源水平而实现生物或其部分(例如细胞、组织、器官或细胞器等)中氮或含氮化合物的量的增加。因此，本发明的实施方案中，本发明涉及一种方法，其中增加编码如本文所述的本发明多肽或核酸分子或本发明方法中所使用核酸分子基因的基因拷贝数。此外，如本文所述的本发明多肽或本发明方法中使用的多肽的内源水平可以例如通过改变对该多肽的转录或翻译调控而增加。 
[0073.0.0.1]一个实施方案中，可以通过靶向或随机诱变本发明的内源基因而增加生物或其部分中的氮或含氮化合物的量。例如，可以使用同源重组以将正调控元件(例如对于植物而言35S增强子)导入启动子或除去阻遏元件形式调控区。此外，可以使用基因转换如Kochevenko和Willmitzer(Plant Physiol.2003 May；132(1)：174-84)以及其中的引文中所述的方法以破坏阻遏元件或增强正调控元件的活性。 
此外，可通过T-DNA或转座子诱变将正元件随机导入到(植物)基因组，并可筛选那些已将正元件整合到本发明基因附近从而增强了表达的品系。Hayashi等人，1992(Science 258：1350-1353)或Weigel等人，2000(Plant Physiol.122，1003-1013)和其中引用的其它文献已描述了通过随机整合增强子元件而激活植物基因。 
已对不同情况描述了用于鉴定在目的基因附近的插入物(其最终携带激活元件)的反向遗传策略，例如，Krysan等人，1999(Plant Cell1999，11，2283-2290)；Sessions等人，2002(Plant Cell 2002，14，2985-2994)；Young等人，2001(Plant Physiol.2001，125，513-518)；Koprek等人，2000(Plant J.2000，24，253-263)；Jeon等人2000(Plant J.2000，22，561-570)；Tissier等人，1999(Plant Cell 1999，11，1841-1852)； Speulmann等人，1999(Plant Cell 1999，11，1853-1866)。简而言之，从大的T-DNA或转座子诱变的植物种群的所有植物收获材料并且制备基因组DNA。然后，按照例如Krysan等人，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)所述的特定体系(architecture)混合基因组DNA。然后通过检测插入诱变剂(例如T-DNA或转座子)和目的基因的组合的特异性多重PCR反应筛选基因组DNA库。因此，用T-DNA或转座子边界引物和基因特异引物的特异组合对DNA库进行PCR反应。引物设计的一般规则可以再次参见Krysan等人，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)。较低水平DNA库的再次筛选导致鉴定出其中目的基因由插入诱变剂破坏的个体植物。 
还可通过常用的诱变技术获得正调控元件的增强或负调控元件的破坏或减弱；化学或辐射突变的种群的产生是常用技术且对于本领域技术人员来说是已知的。用于植物的方法由Koorneef等人1982和其中的引文以及由Lightner和Caspar在“Methods in Molecular Biology”，第82卷中描述。这些技术通常诱导点突变，该点突变可以使用诸如TILLING(Colbert等人，2001)的方法在任何已知的基因中进行鉴定。 
因此，如果通过同源重组、Tilling方法或基因转换法改变编码赋予本发明多肽以增加表达的多肽的内源基因，尤其是包括本发明核酸分子的基因，则可以增加表达水平。 
[0074.0.0.1]可以将调控序列有效地连接到内源蛋白质的编码区并且调控其转录和翻译或编码mRNA或所表达蛋白质的稳定性或衰减。为了改变和调控表达，可以改变、添加或修改启动子、UTR、剪接位点、加工信号、多腺苷酸化位点、终止子、增强子、阻遏物、转录后或翻译后修饰位点，例如通过随机整合增强子元件而激活植物基因已经描述于Hayashi等人，1992(Science 258：1350-1353)或Weigel等人，2000(PlantPhysiol.122，1003-1013)及其中的其它引文。例如，可以通过用更强的转基因启动子代替内源启动子或通过用提供更大稳定性的3’UTR代替内源 3’UTR，在不改变编码区的情况下调节内源蛋白质的表达水平。此外，可以通过导入如实施例中所述的人造转录因子来调节转录调控。可选择的启动子、终止子和UTR在下面描述。 
[0075.0.0.1]也可以通过导入合成的转录因子而增加具有上述提及的活性的内源性多肽、本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽的激活，例如在增加细胞内和/或细胞器(如质体)中的表达或活性后，所述活性赋予氮或含氮化合物增加，所述转录因子紧密结合本发明的内源多肽或本发明方法中或本发明工艺中使用的多肽或其内源同源物-编码基因的编码区，从而该合成的转录因子激活其转录。可以构建嵌合的锌指蛋白质，其包括特异的DNA结合结构域和激活结构域(例如单纯疱疹病毒的VP16结构域)。该特异的结合结构域可以结合内源蛋白质编码区的调节区。嵌合转录因子在生物(尤其是植物)中的表达导致本发明或本发明方法中使用的内源性多肽(尤其是其植物同源物)的特异表达，参见例如，WO01/52620，Oriz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，Vol.99，13290或Guan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，Vol.99，13296。 
[0076.0.0.1]根据本发明方法的又一个实施方案，使用这样的生物，即其中上述提及的基因之一或上述提及的核酸之一以所编码的基因产物与未突变的蛋白质相比，其活性受到细胞因子的影响较少或根本不受影响的方式进行突变。例如，众所周知的酶活性的调控机制是底物抑制或反馈调节机制。在本文下面相应的段落和其中列举的参考中描述用于向相应的序列导入一或多个碱基、核苷酸或氨基酸的替代、缺失和添加的方法和技术，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning，Cold SpringHabour，NY，1989。本领域的技术人员将能够利用计算机软件工具(该计算机软件工具包括用于鉴定结合位点和调节结构域的算法)通过比较本发明核酸分子或其表达产物的序列与本领域现有技术，或者通过向核酸分子或蛋白质系统地导入突变并检测那些将导致增加的比活性或增加的每体积(尤其是每细胞)活性的突变而鉴定调控结合域和调控结合位 点。 
[0077.0.0.1]因此，在生物中表达源自进化上远缘相关生物的本发明核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子或本发明多肽或本发明方法中使用的多肽是有利的，例如，真核生物宿主中使用的原核生物基因，因为这些情况下宿主细胞的调控机制可能不会削弱基因或其表达产物的活性(细胞活性或比活性)。 
[0078.0.0.1]％ 
[0079.0.0.1]对基因或其基因产物的较小调控作用应理解为指酶活性或生物活性的降低的调控，这导致基因或其产物的增加的比活性或细胞活性。酶活性或生物活性的增加应理解为表示这样的酶活性或生物活性，其相比于初始生物，增加至少10％，有利地至少20、30或40％，尤其有利地至少50、60或70％。这导致所期望的氮或含氮化合物的增加的生产力。 
[0080.0.0.1]由于将赋予本发明核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子或本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽(如下所述，例如下文提及的核酸构建体)表达的基因或多个基因，单独导入生物或者与其它基因一起导入生物，能够不仅增加朝向终产物的生物合成流量(例如指含氮化合物)，而且在生物中增加、改变或从头产生有利的，优选新型代谢组合物，例如包括各个精细化学品的较高含量(从营养生理学限制的角度)的有利的氨基酸组合物，尤其是氨基酸，如氮或含氮化合物。 
[0081.0.0.1]优选地，与本发明所述组合物或生物或其部分提供的组合物还包括较高量对动物或人的营养或健康具有正影响的代谢物或较低量的对动物或人的营养或健康具有负影响的代谢物。类似地，可增加输入或输出营养物或代谢物(包括氨基酸或其前体)所需的、细胞氨基酸生物合成所需的其它基因的数量或活性以便增加细胞内或相应的储存区室中必需或相关前体、辅助因子或中间产物的浓度。由于本发明多肽或本发明方法中所使用多肽的增加或新产生的活性或者由于本发明核酸序 列的增加的量和/或由于氨基酸生物合成中所涉及其它基因的调节(例如通过增加合成前体的酶活性或通过破坏氨基酸分解所涉及一或多个基因的活性)，能够增加宿主生物(例如植物或微生物)中氨基酸的产率、产量和/或生产效率。 
[0082.0.0.1]因此一个实施方案中，根据本发明的方法涉及一种方法，其包括： 
a)提供具有光合活性的生物，优选微生物、植物或植物组织或植物； 
b)增加本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽或其同源物(例如，如表II第5或7栏所示)，或者由本发明的核酸分子所编码的以及下面所述的多肽的活性，即，增加在生物中，优选在具有光合活性的生物中，优选微生物、植物或植物组织或植物中的氮或含氮化合物， 
c)在允许氮或含氮化合物各自在生物，优选在具有光合活性的生物中，优选微生物、植物或植物组织或植物中累积和/或生产的条件下，生长生物，优选具有光合活性的生物，优选微生物、植物或植物组织或植物， 
d)上述增加(如上所定义也包括在生物中产生活性，即从头活性)之后，例如导入和表达本发明或本发明方法或工艺所述的核酸分子后，生长并随后收获本发明的生物，优选具有光合活性的生物，优选微生物、植物或植物组织或植物。 
[0085.0.0.1]适合用于本发明所用的核酸分子以及用于本发明的方法、核酸构建体或载体(全如下所述)的生物或宿主生物(转基因生物)原则上是所有能够合成氮或含氮化合物，且适于活化、导入或刺激基因的生物。可提及的实例是植物、微生物(例如真菌、细菌、酵母菌、藻类或硅藻)、转基因的或由定点突变或与特异选择程序结合的随机突变获得的生物。优选的生物是天然能够以相当大的量累积和/或合成氮或含氮化合物的那些生物，如真菌、酵母菌、细菌或植物。原则上， 转基因动物(例如线虫(Caenorhabditis elegans))也适合作为宿主生物。 
[0086.0.0.1]当转基因生物为微生物如真核生物如真菌、藻类、硅藻或酵母时，特别是选自毛壳菌科(Chaetomiaceae)、笄霉科(Choanephoraceae)、隐球酵母科(Cryptococcaceae)、小克银汉霉科(Cunninghamellaceae)、Demetiaceae、从梗孢科(Moniliaceae)、Mortierellaceae、毛霉科(Mucoraceae)、腐霉科(Pythiaceae)、酵母科(Saccharomycetaceae)，水霉科(Saprolegniaceae)、裂殖酵母科(Schizosaccharomycetaceae)、Sodariaceae、掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、Adelotheciaceae、甲藻纲(Dinophyceae)、牛毛藓科(Ditrichaceae)或绿枝藻纲(Prasinophyceae)的真菌、藻类、硅藻或酵母，或原核生物，如细菌或蓝藻、特别是放线菌科(Actinomycetaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、蓝藻纲(Cyanophyceae)、肠杆菌科(Enterobacteriacae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)或链霉菌科(Streptomycetaceae)的细菌时，在固体或液体培养基上培养该微生物，所述培养基为技术人员所公知并适于该微生物。在生长期过后可以收获生物。 
[0087.0.0.1]然后可以将微生物或回收的(及必要时分离的)分别的氮或含氮化合物(如氨基酸)进一步直接加工成食品或动物饲料或用于其它应用，例如根据EP-B-0 533 039或EP-A-0 615 693所公开内容进行，其特别通过引用作为参考。可以通过常规方式用提取或沉淀或通过离子交换或其它本领域技术人员已知及本文下面所述的其它方法纯化发酵液或发酵产物。这些不同检查方法的产物是氨基酸或氨基酸组合物，其仍旧 包括不同量的发酵液和细胞组分，其有利地为按重量计的0-99％，优选低于按重量计的80％，尤其优选低于按重量计的50％。 
[0088.0.0.1]％ 
[0089.0.0.1]优选的菌株为选自芽孢杆菌科(Bacillaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、棒杆菌科、Nocardiaceae、分枝杆菌科、Streptomycetaceae、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)例如环状芽孢杆菌(bacillus circulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、Brevibacterium albidum、Brevibacterium album、Brevibacterium cerinum、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、Brevibacterium glutamigenes、碘短杆菌(Brevibacterium iodinum)、Brevibacterium ketoglutamicum、Brevibacterium lactofermentum、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)、Brevibacterium roseum、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、Corynebacteriumacetoglutamicum、Corynebacterium ammoniagenes、嗜谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(＝Micrococcus glutamicum)、栖糖密棒杆菌(Corynebacterium melassecola)、棒杆菌属物种(Corynebacteriumsp.)、Nocardia rhodochrous(Rhodococcus rhodochrous)、红厚合板杆菌(Mycobacterium rhodochrous)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)和大肠埃希氏菌尤其是大肠埃希氏菌K12的菌株。 
[0090.0.0.1]另外，特别优选的菌株为选自隐球酵母科、酵母科、Schizosaccharomycetacease例如假丝酵母属(Candida)、汉森氏酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的菌株，优选的菌株选自深红酵母菌(Rhodotorula rubra)、胶红类酵母菌(Rhodotorula glutinis)、Rhodotorula graminis、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)、Sporobolomyces shibatanus、酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、Candida bombicola、Candida cylindracea、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。 
[0091.0.0.1]漆树科，例如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)例如物种阿月浑子(Pistacia vera)[pistachios、Pistazie]、芒果(Mangifer indica)[芒果]或腰果(Anacardium occidentale)[腰果]；菊科(Asteraceae)例如金盏花属(Calendula)，红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、Locusta、万寿菊属(Tagetes)、缬草属(Valeriana)，例如物种金盏花(Calendula officinalis)[金盏花]、红花(Carthamus tinctorius)[红花]、矢车菊(Centaurea cyanus)[矢车菊]、菊苣(Cichorium intybus)[blue daisy]、洋蓟(Cynara scolymus)[朝鲜蓟]、向日葵(Helianthus annus)[向日葵]、莴苣(Lactucasativa)、Lactuca crispa、Lactuca esculenta、莴苣(Lactuca scariola L.ssp.Sativa)、Lactuca scariola L.var.integrata、Lactuca scariola L.var.integrifolia、生菜(Lactuca sativa subsp.romana)、Locustacommunis、Valeriana locusta[莴苣]、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)或细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)[Marigold]；伞形科(Apiaceae)例如胡萝卜属(Daucus)，例如物种胡萝卜(Daucus carota)[胡萝卜]；桦木科(Betulaceae)例如榛属(Corylus)，例如物种欧洲榛(Corylus avellana)或土耳其榛(Coryluscolurna)[榛子(hazelnut)]；紫草科(Boraginaceae)例如琉璃苣属(Borago)，例如物种琉璃苣(Borago officinalis)[玻璃苣]；十字花科(Brassicaceae)例如芸苔属(Brassica)、Melanosinapis、白芥属 (Sinapis)、拟南芥属(Arabadopsis)，例如物种欧洲油菜(Brassicanapus)、芜青(Brassica rapa ssp.)[canola、油籽油菜、turnip rape]、野欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassica juncea)、Brassica junceavar.juncea、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥(Brassica nigra)、Brassicasinapioides、Melanosinapis communis[芥菜(mustard)]、甘蓝(Brassica oleracea)[fodder beet]或拟南芥(Arabidopsis thaliana)；凤梨科(Bromeliaceae)例如凤梨属(Anana)、Bromelia，例如物种凤梨(Anana comosus)、Ananas ananas或Bromelia comosa[pineapple]；番木瓜科(Caricaceae)例如番木瓜属(Carica)，例如物种番木瓜(Caricapapaya)[papaya]；大麻科(Cannabaceae)例如大麻属(Cannabis)，例如物种大麻(Cannabis sative)[hemp]、旋花科例如番薯属(Ipomea)、旋花属(Convolvulus)，例如物种甘薯(Ipomoeabatatus)、提琴叶牵牛花(Ipomoea pandurata)、番薯(Convolvulusbatatas)、Convolvulus tiliaceus、Ipomoea fastigiata、Ipomoea tiliacea、三裂叶薯(Ipomoea triloba)、或Convolvulus panduratus[甘薯(sweetpotato)、Man of the Earth、wild potato]、藜科(Chenopodiaceae)例如甜菜属(Beta)，即物种甜菜(Beta vulgaris)、甜萝卜(Beta vulgarisvar.altissima)、Beta vulgaris var.vulgaris、沿海甜菜(Betamaritima)、Beta vulgaris var.perennis、Beta vulgaris var.conditiva或Beta vulgaris var.esculenta[甜菜(sugar beet)]；葫芦科(Cucurbitaceae)例如南瓜属(Cucubita)，例如物种笋瓜(Cucurbita maxima)、灰子南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)、或南瓜(Cucurbitamoschata)[南瓜/西葫芦(pumpkin、squash)]；胡颓子科(Elaeagnaceae)例如胡颓子属(Elaeagnus)，例如物种木犀榄(Oleaeuropaea)[橄榄(olive)]；杜鹃花科(Ericaceae)例如山月桂属(Kalmia)，例如物种宽叶山月桂(Kalmia latifolia)、狭叶山月桂(Kalmia angustifolia)、 小叶山月桂(Kalmia microphylla)、沼泽山月桂(Kalmia polifolia)、Kalmiaoccidentalis、Cistus chamaerhodendros或Kalmia lucida[美洲月桂(American laurel)、阔叶月桂(broad-leafed laurel)、山月桂(calico bush)、spoon wood、狭叶山月桂(sheep laurel)、高山月桂(alpine laurel)、沼泽月桂(bog laurel)、western bog-laurel、湿地月桂(swamp-laurel)]；大戟科(Euphorbiaceae)例如木薯属(Manihot)、Janipha、麻疯树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)，例如种木薯(Manihot utilissima)、Janipha manihot、Jatropha manihot、manihot aipil、甜木薯(Manihot dulcis)、Manihotmanihot、黑柄木薯(Manihot melanobasis)、木薯(Manihot esculenta)[木薯(manihot)、竹芋(arrowroot)、木薯(tapioca、cassava)]、或蓖麻(Ricinus communis)[castor bean、Castor Oil Bush、Castor Oil Plant、Palma Christi、Wonder Tree]；豆科(Fabaceae)例如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、音加属(Inga)、猴耳环属(Pithecellobinm)、金合欢属(Acaacia)、含羞草属(Mimosa)、苜蓿属(Medicajo)、大豆属、镰扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、Soja，例如物种豌豆(Pisum sativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、Pisum humile[豌豆(pea)]、Albizia berteriana、毛叶合欢(Albizia julibrissin)、阔荚合欢(Albizia lebbeck)、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Albiziaberteriana、Albizzia berteriana、Cathormion berteriana、Feuilleaberteriana、Inga fragrans、Pithecellobium berterianum、Pithecellobiumfragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizzia berteriana、Acaciajulibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosajulibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda julibrissin、Acaciale bbeck、山槐(Acacia macrophylla)、阔荚合欢(Albizia lebbek)、Feuilleea lebbeck、阔荚合欢(Mimosa lebbeck)、Mimosa speciosa[bastard logwood、合欢(silktree)、阔叶合欢(East Indian Walnut)]、紫苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicago varia)[紫苜蓿 (alfalfa)]、大豆(Glycine max)、大豆(Dolichos soja)、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、大豆(Glycine hispida)、大豆(Phaseolusmax)、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max)[大豆(soybean)]；牻牛儿苗科(Geraniaceae)例如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum，例如物种椰子(Cocos nucifera)、茶蔍子天竺葵(Pelargoniumgrossularioides)或Oleum cocois[椰子(coconut)]；Gramineae例如甘蔗属(Saccharum)例如物种甘蔗(Saccharum officinarum)；胡桃科(Juglandaceae)例如胡桃属(Juglans)、Wallia，例如物种胡桃(Juglans regia)、Juglansailanthifolia、Juglans sieboldiana、灰胡桃(Juglans cinerea)、Walliacinerea、Juglans bixbyi、加州核桃(Juglans californica)、印度黑核桃(Juglans hindsii)、Juglans intermedia、Juglans jamaicensis、大核桃(Juglans major)、Juglans microcarpa、黑核桃(Juglans nigra)或Wallianigra[胡桃(walnut)、黑核桃(black walnut)、核桃(common walnut)、胡桃(persian walnut)、灰胡桃(white walnut)、牛油果(butternut)、黑核桃(blackwalnut)]；樟科(Lauraceae)例如鳄梨属(Persea)、月桂属(Laurus)，例如物种月桂(laurel)(Laurus nobilis)[月桂(bay、laurel、bay laurel、sweetbay)]、鳄梨(Persea Americana)、鳄梨(Persea Americana)、鳄梨(Perseagratissima)或Persea persea[鳄梨(avocado)]；豆科(Leguminosae)例如落花生属(Arachis)，例如物种落花生(Arachis hypogaea)[花生(peanut)]；亚麻科(Linaceae)例如亚麻属(Linum)、Adenolinum，例如物种亚麻(Linumusitatissimum)、亚麻(Linum humile)、奥地利亚麻(Linumaustriacum)、苍白胡麻(Linum bienne)、窄叶亚麻(Linumangustifolium)、泻亚麻(Linum catharticum)、金黄亚麻(Linumflavum)、大花亚麻(Linum grandiflorum)、Adenolinumgrandiflorum、刘易斯亚麻(Linum lewisii)、那旁亚麻(Linummarbonense)、宿根亚麻、(Linum perenne)Linum perenne var.lewisii、Linum pratense、或石海椒(Linum trigynum)[亚麻(flax)、亚麻籽 (linseed)]；千屈菜科(Lythrarieae)例如石榴属(Punica)例如物种石榴(Punica granatum)[石榴(pomegranate)]；锦葵科(Malvaceae)例如棉属(Gossypium)，例如物种陆地棉(Gossypium hirsutum)、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)或瑟伯氏棉(Gossypium thurberi)[棉花(cotton)]；芭蕉科(Musaceae)例如芭蕉属(Musa)，例如物种香蕉(Musa nana)、小果野蕉(Musa acuminata)、粉芭蕉(Musaparadisiacal)或芭蕉属物种(Musa spp.)[香蕉(banana)]；柳叶菜科(Onagraceae)例如Camissonia、月见草属(Oenothera)，例如物种月见草(Oenothera biennis)或Camissonia brevipes[月见草(primrose)、月见草(evening primrose)]；棕榈科(Palmae)例如油棕属(Elaeis)，例如物种油棕(Elaeis guineensis)[油棕(oil plam)]；罂粟科(Papaveraceae)例如罂粟属(Papaver)，例如物种鬼罂粟(Papaver orientale)、虞美人(Papaver rhoeas)、长果罂粟(Papaverdubium)[罂粟属(poppy)、东方罂粟((oriental poppy)、虞美人(corn poppy)、长果罂粟(field poppy)、shirley poppies、field poppy、长果罂粟(long-headed poppy)、long-pod poppy]；胡麻科(Pedaliaceae)例如胡麻属(Sesamum)，例如物种胡麻(Sesamum indicum)[芝麻(sesame)]；胡椒科(Piperaceae)例如胡椒属(Piper)、Artanthe、Peperomia、Steffensia，例如物种Piper aduncum、Piper amalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、Piper auritum、蒌叶(Piper betel)、荜澄茄(Piper cubeba)、荜芨(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜拔(Piper retrofractum)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、细穗草胡椒(Peperomia elongata)、Piper elongatum、Steffensia elongata[牛角椒(Cayenne pepper)、野辣椒(wild pepper)]；禾本科(Poaceae)，例如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍属 (Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)，例如物种大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、海滨大麦(Hordeum murinum)、野芒大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)Hordeumaegiceras、Hordeum hexastichon、栽培四棱大麦(Hordeumhexastichum)、Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、野芒大麦草[大麦(barley)、珍珠大麦(pearl barley)、狐尾大麦(foxtailbarley)、wall barley、短花草地麦草(meadow barley)]、黑麦(Secalecereale)[黑麦(rye)]、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avenafatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)[燕麦(oat)]、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、石茅高梁(Sorghum halepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、HolcusSorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱(Sorghum caffrorum)、垂穗高粱草(Sorghum cernuum)，甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草(Sorghumdurra)、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱草(Sorghum nervosum)、甜高粱、Sorghum subglabrescens、Sorghumverticilliflorum、高粱、石茅(Holcus halepensis)、Sorghum miliaceummillet、黍(Panicum militaceum)[高粱(Sorghum)、黍(millet)]、稻(Oryza sativa)、阔叶稻(Oryza latifolia)[稻(rice)]、玉蜀黍(Zeamays)[玉米(corn)、包谷(maize)]、普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、玛卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum或Triticum vulgare)[小麦(wheat、breadwheat、common wheat)]、山龙眼科(Proteaceae)例如澳洲坚果属(Macadamia)例如物种全缘叶澳州坚果树(Macadamia intergrifolia) [澳大利亚坚果(macadamia)]；茜草科(Rubiaceae)例如咖啡属(Coffea)，例如咖啡属物种(Coffea spp.)、小果咖啡(Coffeaarabica)，中果咖啡(Coffea canephora)或大果咖啡(Coffea liberica)[咖啡(coffee)]；玄参科(Scrophulariaceae)例如毛蕊花属(Verbascum)例如物种毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、东方毛蕊花(Verbascum chaixii)、Verbascum densiflorum、Verbascum lagurus、Verbascum longifolium、剪秋罗毛蕊花(Verbascum lychnitis)、黑毛蕊花(Verbascum nigrum)、Verbascum olympicum、Verbascum phlomoides、紫毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或毛蕊花(Verbascum thapsus)[毛蕊花属(mullein)、white moth mullein、nettle-leaved mullein、dense-flowered mullein、silver mullein、长叶毛蕊花(long-leaved mullein)、白毛蕊花(white mullein)、黑毛蕊花(darkmullein)、greek mullein、橘色毛蕊花(orange mullein)、紫毛蕊花(purple mullein)、hoary mullein、大毛蕊花(great mullein)]；茄科(Solanaceae)例如辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)例如物种辣椒(Capsicumannuum)、Capsicum annuum var.glabriusculum、辣椒(Capsicumfrutescens)[pepper]、辣椒[甜辣椒(paprika)]、烟草(Nicotianatabacum)、花烟草(Nicotiana alata)、Nicotiana attenuata、光烟草(Nicotiana glauca)、Nicotiana langsdorffii、Nicotiana obtusifolia、Nicotiana quadrivalvis、Nicotiana repanda、黄花烟草(Nicotianarustica)、林生烟草(Nicotiana sylvestris)[烟草(tobacco)]、马铃薯(Solanum tuberosum)[马铃薯(potato)]、茄子(Solanummelongena)[茄子(egg-plant)]、番茄(Lycopersicon esculentum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum.)、Lycopersicon pyriforme、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solan umlycopersicum)[番茄(tomato)]；梧桐科(Sterculiaceae)例如可可属(Theobroma)例如 物种可可(Theobroma cacao)[可可(cacao)]；山茶科(Theaceae)例如山茶属(Camellia)，例如物种茶(Camellia sinensis)[茶(tea)]可以是本发明的或本发明中使用的核酸或多肽的供体生物或代表优选的宿主生物。 
[0092.0.0.1]特别优选的宿主植物为选自菊科例如向日葵属、万寿菊属例如向日葵、香叶万寿菊、万寿菊或细叶万寿菊[Marigold]；十字花科例如芸苔属、拟南芥属例如欧洲油菜、芜青[芸苔、油籽油菜、turniprape]或拟南芥；豆科(蝶形花科)例如大豆属(Glycine)例如大豆(Glycinemax)、Soja hispida或Soja max[大豆]；亚麻科(Linaceae)例如亚麻属(Linum)例如亚麻(Linum usitatissimum)[亚麻、亚麻子]；禾本科例如大麦属、黑麦属、燕麦属、高粱属、稻属、玉蜀黍属、小麦属例如大麦[大麦]；黑麦[黑麦]、燕麦、野燕麦、比赞燕麦、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦[燕麦]、两色蜀黍[高粱、小米]、稻、Oryza latifolia[稻]、玉蜀黍(Zea mays)[玉米]、普通小麦、硬粒小麦、圆柱小麦、Triticumhybernum、玛卡小麦、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticumvulgare)[小麦、面包小麦、普通小麦]；茄科例如茄属、番茄属例如马铃薯[马铃薯]、番茄、Lycopersicon lycopersicum.、Lycopersiconpyriforme、红茄或番茄[西红柿]的植物。进一步优选的宿主生物是棉花，例如陆地棉、树棉、海岛棉、草棉或瑟伯氏棉。 
[0093.0.0.1]原则上所有上述提及的生物也可以起供体生物的作用。 
[0094.0.0.1]对于下文所述核酸序列、含有本文提及的核酸分子的核酸构建体或用所述核酸序列或所述核酸构建体转化的生物(＝转基因生物)，“转基因”指通过遗传操作方法引起的所有那些构建体，优选其中 
a)选自如表I第5或7，第1、2、3、4和/或5行所示核酸序列或其衍生物，或 
b)遗传调控元件(例如启动子)，其功能性地连接至如表I第5或7栏，第1、2、3、4和/或5行所示核酸序列或其衍生物，或
c)(a)和(b) 
其中之一/都不存在于其天然遗传环境中或利用遗传操作方法而被改变，对于改变(作为实例)，其可以是替换、添加、缺失、倒位或插入一或多个核苷酸。“天然遗传环境”指原始生物中的天然染色体上的位置或存在于基因组文库中。在基因文库的情况下，核酸序列的天然、遗传环境优选仍保留至少部分。环境位于核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp的序列长度，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，非常特别优选至少5000bp。 
[0095.0.0.1]本发明的核酸序列或本发明的核酸构建体在产生转基因植物上的应用因而也是本发明的主题。 
[0096.0.0.1]本发明优选实施方案中，生物采用植物的形式，该植物的氮或含氮化合物的含量由于表达了本发明的核酸分子而被有利地改变。由于若干原因这对于植物育种者很重要： 
a)大量氮在细胞中以氨基酸结合的蛋白质形式存在。因此，增加的氮或含氮化合物含量反映增加的蛋白质含量并因此对饲料工业有另外的营养价值。 
b)用于氮或含氮化合物增加的氮摄取和/或累积的方法可允许降低氮肥的施用，其反过来导致成本降低和环境益处。 
c)用于增加氮摄取和/或累积的方法可维持植物生长、健康和繁殖，优选在氮受限条件下。 
[0097.0.0.1]一个实施方案中，在本发明或本发明方法中所使用多态的活性被增加或产生后，或者在本发明核酸分子或多肽的表达被产生或增加后，所产生的转基因植物可以在营养物培养基上或在营养物培养基中或者在土壤中生长并随后收获。一个实施方案中，所产生的转基因植物可以在氮受限条件下生长。 
[0098.0.0.1]植物或其部分(例如叶、根、花和/或茎和/或如下面所述的其它可收获的材料)，可以随后被直接用作食品或动物饲料或者被进 一步加工。再者，氨基酸可以通过提取或沉淀或者通过离子交换和本领域技术人员以及本文下面描述的其它已知的方法以常规方式被进一步纯化。适于多种应用且产生自这些不同加工过程的产物是氨基酸或氨基酸组合物，其可以还包括不同量的其它植物组分，有利地按重量计占0-90％，优选低于按重量计的90％，尤其优选低于按重量计的80％。有利地植物也可以被直接使用而不进一步加工，例如作为饲料或用于制取。 
[0099.0.0.1]也可通过上面描述的方法来生产化学纯的含氮化合物或化学纯的包括氮或含氮化合物的组合物。为此，氮或含氮化合物或组合物以已知的方式从本发明生物(例如微生物、非人动物或植物)，和/或生物在其上或其中生长的培养基中分离。这些化学纯的含氮化合物或所述组合物有利地应用在饲料或食品工业领域。 
[00100.0.0.1]优选的实施方案中，本发明涉及用于在具有光合活性的生物中提高氮同化、累积和/或利用的方法，其包括在生物或其部分或区室中增加或产生至少一种核酸分子的表达，该核酸分子包括选自下述内容的核酸分子，或包括与其互补的序列： 
a)编码选自如表II第5和7栏所示多肽或其片段，且其赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子， 
b)包括选自如表I第5和7栏所示核酸分子，且其赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子， 
c)由于遗传密码的简并性，可以从由(a)或(b)的核酸分子所编码的多肽序列推导出其序列，且其赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子， 
d)编码与由(a)-(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，且其赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子， 
e)在严谨性杂交条件下与(a)-(c)的核酸分子杂交，且其赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子，
f)包括通过使用如表III第7栏所示引物或引物对从cDNA文库或基因组文库扩增核酸分子所获得的核酸分子，且其赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子， 
g)编码在抗由(a)-(f)的核酸分子之一所编码多肽的单克隆抗体的辅助下所分离的多肽，且其赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子， 
h)编码包括如表IV第7栏所示共有序列的多肽，且其赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子， 
i)可在严谨性杂交条件下通过用包括(a)-(k)的核酸分子的序列之一的探针或用其具有(a)-(k)所表征核酸分子至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的片段筛选适宜的核酸文库获得的，且其赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子。 
[00101.0.0.1]一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子与表1A第5或7栏所示序列差别一个或多个核苷酸。一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子并非由表1A第5或7栏所示序列所组成； 
一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子与表1A第5或7栏所示序列的同一性小于100％、99.999％、99.99％、99.9％或99％。另一个实施方案中，该核酸分子不编码表IIA第5或7栏所示序列的多肽。 
[00102.0.0.1]一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子与表IB第5或7栏所示序列差别一个或多个核苷酸。一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子并非由表IB第5或7栏所示序列所组成； 
[00103.0.0.1]一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子与表IB第5或7栏所示序列的同一性小于100％、99.999％、99.99％、99.9％或99％。另一个实施方案中，该核酸分子不编码表1IB第5或7栏所示序列的多肽。 
[00104.0.0.1]一个实施方案中，本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子与表I第5或7栏所示的序列差别一个或多个核苷酸。 一个实施方案中，本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子并非由表I第5或7栏所示的序列所组成；一个实施方案中，本发明的核酸分子与表I第5或7栏所示序列的同一性小于100％、99.999％、99.99％、99.9％或99％。另一个实施方案中，该核酸分子不编码表II第5或7栏所示序列的多肽。 
[00105.0.0.1]除非另有指定，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本上下文中可互换使用。除非另有指定，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本上下文中可互换使用。根据使用术语“序列”的上下文，术语“序列”可指多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质。本文使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。该术语只是指分子的一级结构。 
[00106.0.0.1]因此，本文使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”包括双链和单链DNA及RNA。它们还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“加帽”、一或多个天然存在的核苷酸被类似物的置换。优选地，本发明的DNA或RNA序列包括编码本文定义的多肽的编码序列。 
[00107.0.0.1]“编码序列”是核苷酸序列，其在置于适合的调控序列的调控下时被转录成mRNA和/或被翻译成多肽。编码序列的边界在5’-末端由翻译起始密码子确定而在3’-末端由翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，而在某些情况下也可存在内含子。 
[00108.0.0.1]具有表I第5或7栏所示序列的核酸分子，源自如表II第5或7栏所示氨基酸序列或源自包括如表IV第7栏所示共有序列的多肽的核酸分子，或编码具有如表II第3、5或7栏所示多肽的酶活性或生物活性，或例如在增加其在细胞溶胶或质体中表达或活性后增加氮或含氮化合物的其的衍生物或同源物，有利地在根据本发明方法中被增 加。 
[00109.0.0.1]一个实施方案中，将所述序列单独或组合地克隆到核酸构建体。这些核酸构建体使得根据本发明方法中产生的氮或含氮化合物各自最优的累积和/或合成。 
[00110.0.0.1]对本发明方法有利的，且编码具有本发明多肽或本发明方法中使用或本发明工艺中使用的多肽(例如如表II第5栏所示，或由表I第5栏所示核酸分子所编码的蛋白质或其同源物，例如，如表II第7栏所示)活性的多肽的核酸分子，可以从通常可访问的数据库所确定。 
[00111.0.0.1]必须提及(尤其是在本文中)的那些是常见基因数据库，例如EMBL数据库(Stoesser G.等人，Nucleic Acids Res 2001，Vol.29，17-21)、GenBank数据库(Benson D.A.等人，Nucleic Acids Res 2000，Vol.28，15-18)或PIR数据库(Barker W.C.等人，Nucleic Acids Res.1999，Vol.27，39-43)。此外，能够使用生物特异的基因数据库用于确定有利的序列，就酵母而言，例如方便的SGD数据库(Cherry J.M.等人，Nucleic Acids Res.1998，Vol.26，73-80)或MIPS数据库(Mewes H.W.等人，Nucleic Acids Res.1999，Vol.27，44-48)，就大肠埃希氏菌而言的GenProtEC数据库(http://web.bham.ac.uk/bcm4ght6/res.html)而就鼠耳芥属植物而言的TAIR-数据库(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001Vol.29(1)，102-5)或MIPS数据库。 
[00112.0.0.1]本发明方法中使用的核酸分子采用分离的核酸序列的形式，其编码具有选自如表I第3栏，第1、2、3、4和/或5行所示多肽的活性或具有如表II第5和7栏第1、2、3、4和/或5行所示多肽序列并且增加氮或含氮化合物的多肽。 
[00113.0.0.1]转基因生物中生产氮或含氮化合物的方法中所使用的核酸分子有利地起源于真核生物但也可起源于原核生物或古细菌，因此，它可以源自例如微生物、动物或植物。
[00114.0.0.1]为了本发明的目的，通常复数意欲包含单数并且反之亦然。 
[00115.0.0.1]为了改善核酸序列向本方法所用转基因生物中的导入和在其中的表达，将核酸序列整合到核酸构建体和/或载体中。除本文所述的用于本发明方法的序列之外，编码氮同化或氨基酸生物合成产生(genesor)有营养价值的存储蛋白质的其它核酸序列可另外有利地存在于核酸构建体或在载体中并且可被一起导入到生物中。然而，也可通过其它、分离的核酸构建体或载体将这些其它序列导入到生物中。 
[00116.0.0.1]使用本文提及的克隆载体和转化方法，例如由下述文献所发表并引用的那些：Plant Molecular Biology and Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，第6/7章，第71-119页(1993)；F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，TransgenicPlants，vol.1，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编，AcademicPress，1993，15-38；B.Jenes等人，Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，vol.1，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编，Academic Press(1993)，128-143；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225))和下面其它引文中的那些，该核酸可用于重组修饰广泛的生物，尤其是原核或真核微生物或植物，以便它们根据本发明分别成为氮或含氮化合物更好和更有效的储藏者(accumulater)和/或生产者。此种提高了的氮的累积或含氮化合物或源自其中的产物(例如蛋白质)的生产可以通过操作的直接作用或通过该操作的间接作用而实现。 
[00117.0.0.1]在一个实施方案中，本发明的核酸分子来源于植物，如选自槭树科、漆树科、伞形科、菊科、十字花科、仙人掌科、葫芦科、大戟科、蝶形花科、锦葵科、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科、蔷薇科、杨柳科(Salicaceae)、茄科、棕榈科(Arecaceae)、凤梨科、莎草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百合科 (Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、唇形科(Labiaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、Carifolaceae、茜草科、玄参科、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科、蓼科(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或禾本科的植物并优选来源于选自伞形科、菊科、十字花科、葫芦科、蝶形花科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科的植物。优选为作物植物和本文在上文中作为宿主植物提到的植物如上文提到的科和属，例如优选物种腰果、金盏花、红花、菊苣、洋蓟、向日葵、香叶万寿菊、万寿菊、细叶万寿菊；胡萝卜；欧洲榛、土耳其榛、玻璃苣；欧洲油菜、芜青、野欧白芥、芥菜、芥菜变种(Brassica junceavar.juncea)、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥菜(Brassica nigra)、Brassicasinapioides、Melanosinapis communis、甘蓝、拟南芥、凤梨(Ananascomosus)、Ananas ananas、Bromelia comosa、番木瓜、大麻、甘薯(Ipomoea batatus)、甘薯属(Ipomoea)pandurata、旋花属(Convolvulus)batatas、Convolvulus tiliaceus、Ipomoea fastigiata、Ipomoea tiliacea、三裂叶薯、Convolvulus panduratus、甜菜、Beta vulgaris var.altissima、Beta vulgaris var.vulgaris、沿海甜菜(Beta maritime)、Beta vulgaris var.perennis、Beta vulgaris var.conditiva、Beta vulgaris var.esculenta、笋瓜、灰子南瓜、西葫芦、南瓜、Olea europaea、Manihot utilissima、Janipha manihot、Jatropha manihot.、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihot manihot、Manihotmelanobasis、Manihotesculenta、蓖麻、豌豆、Pisum arvense、Pisum humile、紫苜蓿、野苜蓿、杂交苜蓿、大豆(Glycine max Dolichos soja)、宽叶蔓豆、大豆(Glycine hispida)、Phaseolus max、Soja hispida、Soja max、椰子、茶蔍子天竺葵、Oleumcocoas、Laurus nobilis、鳄梨、落花生、亚麻、Linum humile、奥地利亚麻、苍白胡麻、窄叶亚麻、泻亚麻、金黄亚麻、大花亚麻、Adenolinum grandiflorum、刘易斯亚麻、那旁亚麻、宿根亚麻、Linum perenne var.lewisii、Linum pratense、Linum trigynum、石榴、陆地棉、树棉、海岛棉、草棉、瑟伯氏棉、香蕉、小果野蕉、粉芭蕉、Musa spp.、油棕、鬼罂粟、虞美人(Papaver rhoeas)、长果罂粟、胡麻、Piper aduncum、Piperamalago、狭叶胡椒、Piper auritum、萎叶(Piper betle)、荜澄茄、荜芨、胡椒、Piper retrofractum、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata、大麦、芒颖大麦草、海滨大麦、野芒大麦草、栽培二棱大麦、Hordeum aegiceras、Hordeum hexastichon.、栽培四棱大麦、Hordeum irregulare、大麦、野芒大麦草、燕麦、野燕麦、比赞燕麦、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦、两色蜀黍、石茅高梁、甜高梁、高粱、Andropogon drummondii、Holcusbicolor、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghumarundinaceum、卡佛尔高梁、垂穗高梁草、Sorghum dochna、Sorghumdrummondii、硬高梁草、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高梁草、甜高梁、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、蜀黍、石茅、Sorghum miliaceum millet、Panicum militaceum、玉蜀黍、普通小麦、硬粒小麦、圆柱小麦、Triticum hybemum、玛卡小麦、普通小麦(Triticum sativum)、Cofea spp.、小果咖啡、中果咖啡、大果咖啡、辣椒、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米辣(Capsicumfrutescens)、辣椒、烟草、马铃薯、茄子、番茄、Lycopersiconlycopersicum.、Lycopersicon pyriforme、红茄、番茄、可可或茶。 
[00118.0.0.1]一个实施方案中，用于氮或含氮化合物的累积和/或生产的核酸分子序列有利地起源于上面提及的宿主生物中的微生物，如真菌，如曲霉属、青霉属或麦角菌属或来源于酵母如毕赤酵母属、球拟酵母属、汉森酵母属、裂殖酵母属、假丝酵母属、红酵母属或酵母属，特别优选来源于酵母科的酵母，如优选的酵母属和特别优选的属和物种酿酒酵母。
[00119.0.0.1]熟练的技术人员知晓可以分别用于氮或含氮化合物累积和/或生产的其它适合的核酸来源。它们一般包括所有原核生物或真核生物细胞，优选单细胞微生物，如真菌，如麦角菌属或曲霉属或革兰式阳性菌，如芽孢杆菌属、棒杆菌属、微球菌属、短杆菌属、红球菌属、诺卡氏菌属、Caseobacter或节杆菌属或革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌属、黄杆菌属或沙门氏菌属，或酵母如红酵母属、汉森氏酵母属或假丝酵母属。 
[00120.0.0.1]％ 
[00121.0.0.1]然而，还可使用这样的人工序列，即其与生物中发现的核酸序列相差一或多个碱基或与生物中发现的多肽序列(尤其如表II第5或7栏所示或者是本文所述的其功能性同源物)相差一或多个氨基酸分子，优选赋予上述提及的活性(即增加其活性后赋予氮或含氮化合物的增加)的序列。本发明优选实施方案中，由根据所选宿主生物或细胞器的密码子使用而优化的核酸序列表达如表II第5或7栏所示多肽序列或者是本文所述的其功能性同源物，优选表达赋予上述提及的活性(即增加其活性后赋予氮或含氮化合物增加)的序列。 
[00122.0.0.1]根据本发明的方法，可以使用这样的核酸序列，其在需要时含有可以被整合入DNA或RNA的合成的、非天然的或修饰的核苷酸碱基。所述合成的、非天然的或修饰的碱基例如可以增加核酸分子在细胞外或在细胞内的稳定性。本发明的核酸分子可以含有与前述相同的修饰。 
[00123.0.0.1]如本上下文所使用，术语“核酸分子”还可包含位于编码基因区3’和5’端的非翻译序列，例如编码区5’端上游的至少500个、优选200个、特别优选100个核苷酸的序列和编码基因区3’端下游的至少100个、优选50个、特别优选20个核苷酸的序列。通常仅选择用于克隆和表达目的的编码区是有利的。 
[00124.0.0.1]优选地，本发明方法中使用的核酸分子或本发明的 核酸分子是分离的核酸分子。 
[00125.0.0.1]“分离的”多核苷酸或核酸分子是与核酸分子的天然来源中存在的其他多核苷酸或核酸分子相分离。分离的核酸分子可能是几kb的染色体片段，或优选是只包括基因编码区域的分子。因此，本发明的分离的核酸分子可包括5’和3’相邻的染色体区或其他相邻染色体区，但优选不包括天然存在于该核酸分子所来源的生物基因组中或染色体内该核酸分子序列的两侧的序列(例如，与编码核酸分子的5’-和3’-UTR的区域相邻的序列)。多种实施方案中，本发明方法中所使用的分离的核酸分子可以包括例如在该核酸所来源细胞的基因组DNA中天然存在于该核酸分子两侧的小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。 
[00126.0.0.1]可以使用分子生物学标准技术和本文提供的序列信息分离本方法中使用的核酸分子，例如本发明的多核苷酸或其一部分。另外，例如可以在比较算法的帮助下鉴定DNA或氨基酸水平的同源序列或同源保守序列区。前者可以在标准杂交技术(例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中所述)中被用作杂交探针来分离对本方法有用的其它核酸序列。 
[00127.0.0.1]可基于该序列或其所使用的一部分的寡核苷酸引物，另外通过聚合酶链式反应分离包括本方法中使用的核酸分子完整序列(例如本发明的多核苷酸)或其一部分的核酸分子。例如包括完整序列或其一部分的核酸分子可以通过聚合酶链式反应，使用基于该序列而产生的寡核苷酸引物而被分离，例如，可以从细胞中分离mRNA(例如，通过Chirgwin等人(1979)Biochemistry 18：5294-5299的硫氰酸胍提取法)和可以利用反转录酶的方法(例如获得自Gibco/BRL，Bethesda，MD的Moloney MLV反转录酶或获得自Seikagaku America，Inc.， St.Petersburg，FL的AMV反转录酶)产生cDNA。 
[00128.0.0.1]可以在本文所示序列(例如如表I第5或7栏，第1、2、3、4和/或5行所示的序列或源自如表II第5或7栏第1、2、3、4和/或5行所示多肽序列的核酸序列)的基础上，产生聚合酶链式反应扩增所用的合成的寡核苷酸引物，例如，如表III第7栏，第1、2、3、4和/或5行所示的引物对。 
[00129.0.0.1]此外，通过用本发明核酸分子所编码的多肽，尤其是用选自如表II第5或7栏所示序列(从该序列比对可以得到保守区并进而得到简并引物)进行蛋白质序列比对能够从多种生物中鉴定出保守区。 
[00130.0.0.1]保守区是来自不同起源的若干同源物的区域，其中在一个特定位置上显示出非常小的氨基酸变异。表IV第7栏示出的共有序列和多肽模体源自所述比对。此外，通过将蛋白质序列与由本发明的核酸所编码的多肽，尤其是表II第5或7栏所示的多肽(从该多肽比对可以得到保守区并且进而得到简并引物)进行比对能够从多种生物中鉴定出保守区。 
一个优选实施方案中，本发明方法增加包括表IV第7栏所示共有序列或多肽模体或由它们组成的多肽的活性，而另一个实施方案中，本发明涉及包括表IV第7栏所示共有序列或多肽模体或是由其组成的多肽，其中所示氨基酸中有20或更少，优选15或10，优选9、8、7或6，更优选5或4，甚至更优选3，甚至更优选2，甚至更优选1，最优选0个位置由任何氨基酸所替代。一个实施方案中，由单字母所示氨基酸中不超过15％，优选10％，甚至更优选5％、4％、3％或2％，最优选1％或0％的位置被另一种氨基酸所替代。一个实施方案中，将20或更少，优选15或10，优选9、8、7或6，更优选5或4，甚至更优选3，甚至更优选2，甚至更优选1，最优选0个氨基酸插入到共有序列或蛋白质模体中。 
共有序列源自如表II第5和7栏所列序列的多重比对。字母表示单 字母氨基酸代码并且表明氨基酸在所有比对的蛋白质中是保守的。字母X代表不在所有序列中都保守的氨基酸。一个实例，在可能某一位置只有少数给定氨基酸子集的情况下，这些氨基酸用括号给出。给定X的数目表示保守氨基酸残基之间的距离，例如Y-x(21，23)-F指在所有调查的序列中，保守的酪氨酸和苯丙氨酸残基相互隔开最少21最多23个氨基酸残基。 
从所有序列中鉴定出保守结构域并且使用标准Prosite释义的子集进行描述，例如，Y-x(21，23)-[FW]模式指保守的酪氨酸和苯丙氨酸或色氨酸相互隔开最少21最多23个氨基酸残基。 
用软件工具MEME 3.5.1版或手工鉴定保守模式。MEME由Timothy L.Bailey和Charles Elkan，Dept.of Computer Science andEngeneering，University of California，San Diego，USA所开发并且由Timothy L.Bailey和Charles Elkan[Fitting a mixture model byexpectation maximization to discover motifs in biopolymers，Proceedingsof the Second International conference on Intelligent Systems forMolecular Biology，第28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994]所描述。用于独立程序的源代码可公开获得自San Diego Supercomputer中心(http://meme.sdsc.edu)。 
为了用软件工具MEME在所有序列中鉴定共同模体，使用下面的设置：最大化大小(-maxsize)500000，-nmotifs 15，-evt 0.001，最大权重(-maxw)60，距离1e-3，分析所用序列的最小位点(-minsites)数。用于MEME的输入序列是Fasta格式的非比对序列。其它参数使用该软件版本的缺省设置。 
用软件工具Pratt 2.1版或人工产生保守结构域的Prosite模式。Prat由Inge Jonassen，Dept.of Informatics，University of Bergen，Norway所开发并且被Jonassen等人[I.Jonassen，J.F.Collins和D.G.Higgins，Findingflexible patterns in unaligned protein sequences，Protein Science 4 (1995)，1587-1595页；I.Jonassen，Efficient discovery of conservedpatterns using a pattern graph，1997年向CABIOS Febr.投稿]所描述。用于单独程序的源代码(ANSI C)是公众可获得的，例如，在如EBI(European Bioinformatics Institute)建立的生物信息中心。 
为了用软件工具Pratt产生模式，使用下面的设置：PL(最大模式长度)：100，PN(模式符号最大Nr)：100，PX(相邻x′s的最大Nr)：30，FN(可塑间隔最大Nr)：5，FL(最大可塑性)：30，FP(最大Flex.Product)：10，ON(最大模式数)：50。用于Pratt的输入序列是从软件工具MEME鉴定的展现高度相似性的蛋白质序列的不同区域。匹配该产生的模式所必需的最小序列数(CM，最小匹配序列数)设为所提供序列的至少80％。此处未提及的参数使用其的默认设置。 
保守结构域的Prosite模式可以用于检索匹配该模式的蛋白质序列。多个建立的生物信息中心提供用于在数据库检索中使用那些模式的公共网络入口(例如，PIR[蛋白质信息资源库(Protein InformationResource)，位于Georgetown University Medical Center]或ExPASy[Expert Protein Analysis System])。或者，可获得如Fuzzpro程序的单独软件，其是EMBOSS软件包的一部分。例如，Fuzzpro程序不仅允许检索完全蛋白质匹配类型，而且也允许在已进行的检索中设置多个模糊值。 
[00131.0.0.1]用ClustalW(1.83版)软件进行比对并且该软件由Thompson等人[Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting，positions-specific gap penalties andweight matrix choice.Nucleic Acids Research，22：4673-4680]所描述。用于单独程序的源代码可公开获得自European Molecular BiologyLaboratory；Heidelberg，Germany。使用ClustalW1.83版的默认参数(缺口开放罚分：10.0；缺口延长罚分：0.2；蛋白质矩阵：Gonnet； pprotein/DNA endgap：-1；蛋白质/DNA缺口距离：4)进行分析。 
[00132.0.0.1]然后可以通过PCR利用简并引物扩增具有上述提及的活性(例如在增加其表达或活性后赋予氮或含氮化物的增加)的新型蛋白质的片段，或进一步地来自其它生物的具有本发明多肽或本发明方法中使用的多肽的功能同源物。 
[00133.0.0.1]这些片段然后可用作杂交探针用于分离全基因序列。作为选择，可以利用RACE-PCR(cDNA末端的快速扩增)分离缺失的5’和3’序列。可以使用cDNA或者作为选择，使用基因组DNA作为模板以及适宜的寡核苷酸引物，按照标准PCR扩增技术来扩增本发明的核酸分子。因此扩增出的核酸分子可以克隆到适宜的载体中并且利用DNA序列分析来表征。可以利用标准合成方法，例如使用自动DNA合成仪产生对应于本方法中使用的核酸分子之一的寡核苷酸。 
[00134.0.0.1]对本发明方法有利的核酸分子可以根据它们与本文所公开的核酸分子的同源性，使用该序列或其部分作为杂交探针并按照严谨性杂交条件下的标准杂交技术进行分离。上下文中，例如，能够使用在严谨性条件下与上述核酸分子，尤其是与包括本发明方法中使用的核酸分子或编码本发明中所使用的蛋白质的核酸分子或者本发明核酸分子的核苷酸序列杂交的长度为至少15、20、25、30、35、40、50、60或更多个核苷酸，优选至少15、20或25个核苷酸的分离核酸分子。也可使用具有30、50、100、250或更多个核苷酸的核酸分子。 
[00135.0.0.1]术语“同源性”指各自的核酸分子或编码的蛋白质在功能上和/或结构上等同。与上述核酸分子同源，以及为所述核酸分子的衍生物的核酸分子是诸如所述核酸分子的变体，该变体表示具有相同生物功能(尤其是编码具有相同或基本上相同的生物功能的蛋白质)的修饰形式。它们可能是天然存在的变体(例如来自其它植物品种或物种的序列)或可能是突变体。这些突变体可天然发生或可通过诱变技术获得。等位基因变体可能是天然发生的等位基因变体以及可能是合成产生 的或基因工程改造的变体。结构等同物例如可以通过检测所述多肽对抗体的结合或通过基于计算机的预测来鉴定。结构等同物具有相似的免疫学特征，例如包含相似的表位。 
[00136.0.0.1]“杂交”指这样的核酸分子在常规的杂交条件下，优选在严谨性条件杂交，例如在例如Sambrook(Molecular Cloning；ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY(1989))或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述的严谨性条件下杂交。 
[00137.0.0.1]根据本发明，本发明核酸的DNA以及RNA分子可以用作探针。此外，作为用于功能性同源物的鉴定的模板，可以进行Northern印迹测定和Southern印迹测定。Northern印迹测定有利地提供关于所表达的基因产物的其它信息：例如表达模式、加工步骤(如剪接和加帽等)的发生。Southern印迹测定提供关于编码本发明核酸分子的基因的染色体定位和组织的其它信息。 
[00138.0.0.1]严谨性杂交条件的优选的、非限制性实例是在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中进行杂交，然后在50至65℃，例如在50℃、55℃或60℃，0.2 x SSC，0.1％ SDS中进行一或多次洗涤步骤。熟练的技术人员知道这些杂交条件作为核酸类型的函数而变化，并(例如当存在有机溶剂时)与缓冲液的温度和浓度有关。“标准杂交条件”下的温度作为核酸类型的函数而变化，例如在浓度为0.1x、0.5x、1x、2x、3x、4x或5 x SSC(pH7.2)的水性缓冲液中，介于42℃至58℃之间，优选介于45℃至50℃之间。如果诸如50％甲酰胺的有机溶剂存在于上述缓冲液中，标准条件下的温度为约40℃、42℃或45℃。对于DNA：DNA杂交体，杂交条件优选是例如0.1 x SSC和20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃、优选30℃至45℃之间。对于DNA:RNA杂交体，杂交条件优选是例如0.1 x SSC和30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或 55℃、优选45℃至55℃之间。上述杂交温度是在不存在甲酰胺的情况下，对于例如长度为约100bp(＝碱基对)且G+C含量为50％的核酸而确定的。熟练的技术人员知道借助于教科书，例如上面提及的教科书或下面的教科书确定所需的杂交条件：Sambrook等人，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory，1989；Hames和Higgins(编)1985，Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach，IRL Press，Oxford University Press，Oxford；Brown(编)1991，Essential MolecularBiology：A Practical Approach，IRL Press，Oxford University Press，Oxford。 
[00139.0.0.1]一个这样的严谨性杂交条件的其它实例是在65℃，4XSSC中杂交，然后在65℃，0.1 x SSC中洗涤1小时。或者示例性的严谨性杂交条件是42℃，50％的甲酰胺，4 x SSC。此外，洗涤步骤期间的条件可以选自由低严谨性条件(在50℃下约2X SSC)和高严谨性条件(在50℃下，优选在65℃下，约0.2 x SSC)(20 x SSC：0.3M柠檬酸钠，3M NaCl，pH7.0)界定的条件范围。此外，洗涤步骤期间的温度可从室温下(约22℃)的低严谨性条件上升至约65℃的较高的严谨性条件。盐浓度和温度两个参数都可以同时改变，或者两个参数中的一个可以保持恒定而只有另一个变化。杂交期间也可使用变性剂，例如甲酰胺或SDS。在存在50％甲酰胺的情况下，优选在42℃下进行杂交。可以根据具体情况组合相关因素，如i)处理的长度、ii)盐条件、iii)去垢剂条件、iv)竞争性DNA、v)温度和vi)探针选择，因此本文可以不提及所有的可能方案。 
[00140.0.0.1]因此，一个优选实施方案中，在68℃用Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth，Karlsruhe)进行Northern印迹预杂交2小时。在68℃用放射性标记的探针杂交过夜。在68℃使用1xSSC进行随后的洗涤步骤。 
对于Southern印迹测定，在68℃将膜与Rothi-Hybri-Quick缓冲液 (Roth，Karlsruhe)预杂交2小时。在68℃用放射性标记的探针进行杂交过夜。然后弃去杂交缓冲液并使用2xSSC；0.1％SDS短暂洗涤滤膜。在弃去洗涤缓冲液后，加入新的2xSSC；0.1％SDS缓冲液，并在68℃温育15分钟。进行该洗涤步骤2次，然后使用1xSSC；0.1％ SDS在68℃进行额外的洗涤步骤，持续10分钟。 
[00141.0.0.1]本文下面示出用于DNA杂交(Southern印迹测定)和洗涤步骤条件的其它实例： 
1.例如，可以从下述条件选择杂交条件： 
a)65℃，4 x SSC， 
b)45℃，6 x SSC， 
c)68℃，6 x SSC，100mg/ml变性片段化的鱼精DNA， 
d)68℃，6 x SSC，0.5％ SDS，100mg/ml变性鲑精DNA， 
e)42℃，6 X SSC，0.5％ SDS，100mg/ml变性片段化的鲑精DNA，50％甲酰胺， 
f)42℃，50％甲酰胺，4 x SSC， 
g)42℃，50％(v/v)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠， 
h)50℃，2x或4 x SSC(低严谨性条件)，或 
i)42℃，30-40％甲酰胺，2x或4 x SSC(低严谨性条件)。 
2.例如，可以从下述条件选择洗涤步骤： 
a)50℃，0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％ SDS。 
b)65℃，0.1 x SSC。 
c)68℃，0.1 x SSC，0.5％ SDS。 
d)42℃，0.1 x SSC，0.5％ SDS，50％甲酰胺。 
e)42℃，0.2 x SSC，0.1％ SDS。
f)65℃，2 x SSC(低严谨性条件)。 
[00142.0.0.1]来源于其它生物的具有上述活性(即赋予氮或含氮化合物增加)的多肽可以由如下其它DNA序列编码，所述其它DNA序列与表I的第5或7栏，优选表IB第5或7栏所示的序列，在宽松杂交条件下杂交并在表达时编码具有增加氮或含氮化合物的活性的肽。 
[00143.0.0.1]此外，一些应用必须在低严谨性杂交条件下进行，但对于杂交的特异性无任何影响。例如，对总DNA的Southern印迹分析可使用本发明的核酸分子探测并在低严谨性(在55℃下，于2xSSPE，0.1％ SDS中)下进行洗涤。该杂交分析可以显示仅仅编码本发明或本发明方法中使用的多肽(例如具有本文提及的增加氮或含氮化合物的活性)的基因的简单模式。这种低严谨性杂交条件的其它实例是50℃下的4x SSC或在42℃下使用30至40％甲酰胺进行的杂交。此类分子包括本发明多肽或本发明方法中使用的多肽的片段、类似物或衍生物，所述的片段、类似物或衍生物与上述氨基酸序列或它们的编码核苷酸序列的差异在于，例如单独的或组合的氨基酸和/或核苷酸缺失、插入、置换、添加和/或重组或本领域已知的任何其它修饰。然而，优选使用高严谨性杂交条件。 
[00144.0.0.1]应当使用至少5、10、15、20、25、30、35或40bp，有利地至少50、60、70或80bp，优选至少90、100或110bp的片段有利地进行杂交。最优选至少15、20、25或30bp的片段。也优选使用长度至少100bp或200，尤其优选至少400bp的片段进行的杂交。在尤其优选的实施方案中，应当使用全长核酸序列在上述条件下进行杂交。 
[00145.0.0.1]术语“片段”、“序列的片段”或“序列的部分”指所提及原始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白质序列)可以在长度上发生大范围的变化；最小长度是足以使序列至少具有与所提及的原始序 列相当的功能和/或活性的序列长度或是足以使序列在严谨性条件下与本发明的核酸分子或本发明方法中或本发明工艺中所使用的核酸分子杂交的序列长度，而最大长度不是关键的。一些应用中，最大长度通常基本上不大于提供期望的原始序列的活性和/或功能所需的长度。 
通常，该截短氨基酸序列在长度上为约5至约310个氨基酸。然而，更通常，该序列长度将是最大约250个氨基酸，优选最大约200或100个氨基酸。通常需要选择至少约10、12或15个氨基酸的序列，至多约20或25个氨基酸的最大序列。 
[00146.0.0.1]术语“表位”指抗原内特异的免疫反应性位点，其也称作抗原决定簇。这些表位可以是在聚合的组合物中单体(例如蛋白质中的氨基酸)的线性排列，或者由更复杂的二级或三级结构所组成或包括更复杂的二级或三级结构。技术人员将理解免疫原(即能够引发免疫应答的物质)是抗原；然而，诸如半抗原的一些抗原不是免疫原但可能通过结合到载体分子上而有免疫原性。术语“抗原”包括对于其可以产生抗体和/或抗体对于其有特异的免疫反应性的物质。 
[00147.0.0.1]一个实施方案中，本发明涉及本发明的或本发明方法中使用的且赋予上述提及活性(优选赋予氮或含氮化合物的增加)的多肽的表位。 
[00148.0.0.1]术语“一或多个氨基酸”指至少一个氨基酸但不超过将产生低于50％同一性的同源物的氨基酸数。优选地，同一性大于70％或80％，更优选是85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％，甚至更优选96％、97％、98％或99％的同一性。 
[00149.0.0.1]此外，本发明的核酸分子包括与上述提及的核酸分子或其部分的核苷酸序列之一互补的核酸分子。与如表I第5或7栏，优选表IB第5或7栏所示核苷酸序列之一互补的核酸分子是足以与所述核苷酸序列之一互补，使得可以与所述核苷酸序列之一杂交从而形成稳定双链的分子。优选地，在严谨性杂交条件下进行杂交。然而，本文公开 的序列之一的互补优选根据本领域技术人员公知的核酸分子碱基配对与该序列互补的序列。例如，碱基A和G分别与碱基T和U或C分别进行碱基配对，或相反。碱基的修饰可以影响参与碱基配对配偶体。 
[00150.0.0.1]本发明的核酸分子包括与表I的第5或7栏，优选表IB的第5或7栏所示核苷酸序列或其功能部分具有至少约30％、35％、40％或45％，优选至少约50％、55％、60％或65％，更优选至少约70％、80％或90％，甚至更优选至少约95％、97％、98％或99％或更高同源性并优选具有上述提及的活性，尤其是在增加其活性或编码所述序列或其同源物的基因产物的活性后，具有氮或含氮化合物增加活性的核苷酸序列。 
[00151.0.0.1]本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子包括与表I的第5或7栏，优选表IB的第5或7栏所示的核苷酸序列之一或其部分进行杂交(优选在如本文所述的严谨性条件下杂交)且编码具有上述提及的活性且如表II的第5或7栏，优选表1IB的第5或7栏所示的蛋白质，所述活性例如赋予氮或含氮化合物的增加。 
[00152.0.0.1]可选择地，与表I的第5或7栏，优选表IB的第5或7栏所示核苷酸序列之一进行杂交的核苷酸序列还具有如表II第3栏所示的蛋白质已注释的或已知的一或多种活性。 
[00153.0.0.1]另外，本发明的或本发明方法中使用的核酸分子可以只包括如表I第5或7栏，优选表IB第5或7栏所示序列之一的编码区的一部分，例如可以用作探针或引物的片段或编码本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽的生物活性部分的片段，即具有上述提及的活性，例如如果增加其活性则赋予氮或含氮化合物增加的含量。由本发明蛋白质编码基因的克隆所确定的核苷酸序列允许产生设计用于鉴定和/或克隆其在其它细胞类型或生物中的同源物的探针和引物。该探针/引物通常包括基本上纯化的寡核苷酸。该寡核苷酸通常包括在严谨性条件下与如表I第5或7栏所示序列之一的正义链、如表I第5或7栏所示序列之 一的反义链、或其天然存在的突变体中至少约12、15，优选约20或25，更优选约40、50或75个连续核苷酸进行杂交的核苷酸序列的区域。基于本发明的核苷酸序列的引物可以用于PCR反应以克隆本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽的同源物，例如，作为如本发明实施例中所述的引物，例如如实施例所示。用表III第7栏所示的引物对进行PCR将产生如表I第5或7栏，优选表IB第7栏所示多核苷酸序列的片段。 
[00154.0.0.1]引物设置是可互换的。本领域技术人员知道组合所述引物以产生期望产物，例如产生全长克隆或部分序列。基于本发明的或本发明方法中所使用核酸分子的序列的探针可以用于检测编码相同或同源蛋白质的转录物或基因组序列。该探针还可以包括连接于其上的标记基团，例如该标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子。该探针可以被用作基因组标记检测试剂盒的一部分用于鉴定表达本发明的或本发明方法中所使用多肽的细胞，例如通过测定细胞样品中编码核酸分子的水平，例如检测mRNA水平或确定是否包括本发明的或本发明方法中使用的多核苷酸的基因组基因已经突变或缺失。 
[00155.0.0.1]本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子编码包括这样的氨基酸序列的多肽或其部分，该氨基酸序列与如表II的第5或7栏，第1、2、3、4和/或5行所示氨基酸序列足够同源以至蛋白质或其部分保持参与氮或含氮化合物各自累积和/或产生的能力，尤其是包括如上面提及的或如在实施例中所述的在植物或微生物中增加蛋白质含量的活性。 
[00156.0.0.1]如本所使用，措词“足够同源”指这样的蛋白或其一部分，其具有包括与如表II第5或7栏所示氨基酸序列最小相同或等价氨基酸残基(例如，与本发明多肽序列之一的氨基酸残基有类似侧链的氨基酸残基)数的氨基酸序列，以至于蛋白质或其部分能够参与氮或含氮化合物各自的累积和/或生产。一个实施方案中，如表II第5或7栏所示的蛋白质或其部分具有例如如表II第3栏所示多肽的活性。
[00157.0.0.1]一个实施方案中，本发明的核酸分子包括编码本发明蛋白质一部分的核酸。该蛋白质与表II第5或7栏所示整个氨基酸序列具有至少约30％、35％、40％、45％或50％、优选至少约55％、60％、65％或70％，更优选至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％或94％及最优选至少约95％、97％、98％或99％或更高同源性且具有上述提及的活性，例如，优选地赋予氮或含氮化合物的增加。 
[00158.0.0.1]由本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子编码的蛋白质部分优选有生物活性，优选具有上述提及的所注释活性，例如，在增加活性后赋予氮或含氮化合物的增加。 
[00159.0.0.1]如本文所使用，术语“生物活性部分”旨在包括这样的部分(例如结构域/模体)，该部分赋予氮或含氮化合物的增加或具有结合抗体的免疫学活性，该抗体特异性结合本发明多肽或本发明生产氮或含氮化合物的方法中所使用的多肽。 
[00160.0.0.1]本发明还涉及与如表I第5或7栏所示核苷酸序列(和其部分)之一由于遗传密码简并性而不同并因此编码本发明多肽(尤其是具有上述提及活性的多肽)的核酸分子，所述活性例如在生物中赋予氮或含氮化合物的增加，例如该多肽包括如表IV第7栏所示的共有序列，或者如表II第5或7栏所示的多肽，或它们的功能性同源物。有利地，本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子包括(或在另一个实施方案中具有)编码蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质包括(或在另一个实施方案中具有)如表IV第7栏所示的共有序列，或如表II的第5或7栏所示的多肽，或其功能性同源物。又一实施方案中，本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子编码全长蛋白质，其与包括表IV第7栏所示共有序列，或表II第5或7栏所示多肽的氨基酸序列，或其功能性同源物基本上同源。然而，优选的实施方案中，本发明的核酸分子并非由如表I第5或7栏所示(优选如表1A第5或7栏所示)的序列所组成。优选地，本发明的核酸分子是表IB第5或7栏所示核酸分 子的功能性同源物或与其相同。 
[00161.0.0.1]此外，本领域技术人员应理解可在种群中存在导致氨基酸序列改变的DNA序列多态性。由于天然变异，在编码本发明多肽或本发明方法中使用的多肽或包括本发明核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子的基因中的这种遗传多态性可在种群内的个体间存在。 
[00162.0.0.1]如本文所使用，术语“基因”和“重组基因”指这样的核酸分子，其包括编码本发明多肽或本发明方法中使用的多肽或者包括本发明核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子或者编码本发明工艺中使用的多肽的开放读码框，优选来自用于氮或含氮化合物各自累积和/或产生，尤其是用于产生蛋白质的作物或微生物。该天然变异通常可以产生基因核苷酸序列的1-5％的改变。由天然变异产生而且不改变如所述的功能活性的任何以及所有此种核苷酸变异，以及在编码本发明多肽或本发明方法中使用的多肽或者包括本发明核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子的基因中产生的氨基酸多态性，都意图包括在本发明的范围中。 
[00163.0.0.1]对应于本发明核酸分子或本发明方法中所使用核酸分子的天然变异同源物的核酸分子(其也可以是cDNA)可以根据它们与本文公开的核酸分子的同源性，使用本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子或其一部分作为杂交探针，按照标准杂交技术在严谨性杂交条件下分离。 
[00164.0.0.1]因此另一个实施方案中，本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子长度为至少15、20、25或30个核苷酸。优选地，其在严谨性条件下与这样的核酸分子杂交，该核酸分子包括本发明的或本发明方法中使用的核酸分子的核苷酸序列，例如包括如表I的第5或7栏所示的序列。该核酸分子优选长度为至少20、30、50、100、250或更多个核苷酸。 
[00165.0.0.1]术语“在严谨性条件下杂交”如上所限定。一个实施 方案中，术语“在严谨性条件下杂交”旨在描述相互之间至少30％、40％、50％或65％同一性的核苷酸序列相互之间通常保持杂交时的杂交和洗涤条件。优选地，该条件通常是相互之间至少约70％、更优选至少约75％或80％，甚至更优选至少约85％、90％或95％或更高同一性的序列保持相互杂交。 
[00166.0.0.1]优选地，在严谨性条件下与表I第5或7栏，第1、2、3、4和/或5行所示序列杂交的本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子对应于本发明天然存在的核酸分子。如本文所使用“天然存在”核酸分子指具有天然发生的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如编码天然蛋白质)。优选地，该核酸分子编码具有上述提及活性的天然蛋白，例如在增加其表达或活性或者本发明或本发明方法中所使用蛋白质的活性后，赋予氮或含氮化合物的增加。 
[00167.0.0.1]除了可能存在于种群中的本发明多肽或核酸分子以及本发明方法中使用的多肽或核酸分子的天然存在的变体以外，本领域技术人员将进一步明白可以通过突变向编码本发明或本发明方法中所使用多肽的核酸分子的核苷酸序列中引入改变，从而造成所编码的多肽的氨基酸序列改变，但不改变该多肽的功能，优选不减少所述活性。 
[00168.0.0.1]例如，导致氨基酸置换的核苷酸置换可以在本发明或本发明方法中所使用核酸分子(例如如表I的第5或7栏，第1、2、3、4和/或5行所示核酸分子)的序列中的“非必需”氨基酸残基处进行。 
[00169.0.0.1]“非必需”氨基酸残基是可以自野生型序列发生改变但不改变所述多肽活性的残基，而“必需”氨基酸残基对于如上所提及的活性(例如在多肽活性增加后，导致生物中氮或含氮化合物增加)而言是必需的。然而，其它氨基酸残基(例如在具有所述活性的结构域中非保守的或仅仅是半保守的那些)对于活性可能不是必需的，从而可能易于接受改变而不改变所述活性。 
[00170.0.0.1]另外，本领域技术人员知晓生物之间的密码子使用 可以不同。因此，可调整本发明核酸分子中的密码子使用以适应表达多核苷酸或多肽的生物中的密码子使用。 
[00171.0.0.1]因此，本发明涉及编码具有上述提及活性(例如在生物或其部分中赋予氮或含氮化合物的增加)的多肽的核酸分子，该多肽含有对所述活性并非必需的氨基酸残基的改变。这样的多肽在氨基酸序列上与表II第5或7栏，优选表II B第7栏所示序列所包含的序列不同但仍然保留本文描述的所述活性。该核酸分子可以包括编码多肽的核苷酸序列，其中该多肽包括与表II的第5或7栏，优选表IIB的第7栏所示氨基酸序列至少约50％相同的氨基酸序列，并且能够在其活性(例如其表达)增加后，参与氮或含氮化合物各自增加的累积和/或产生。优选地，由该核酸分子编码的蛋白质与表II的第5或7栏，第1、2、3、4和/或5行，优选表II B的第7栏所示序列至少约60％相同，更优选与表II的第5或7栏，优选表II B的第7栏所示序列之一至少约70％相同，甚至更优选与表II的第5或7栏，优选表II B的第7栏所示序列至少约80％、90％，或95％的同源性，和最优选与表II的第5或7栏，优选表II B的第7栏所示序列至少约96％、97％、98％或99％相同。 
[00172.0.0.1]为了确定两种氨基酸序列或两种核酸分子的同源性(＝同一性)百分数，将序列以一个在另一个下面的方式书写用于最优对比(例如，可将缺口插入蛋白质或核酸的序列中以便产生与另一个蛋白质或另一个核酸的最优比对)。 
[00173.0.0.1]然后比较在对应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核酸分子。如果一个序列的一个位置由另一序列中相应位置上相同的氨基酸残基或相同的核酸分子所占据，那么该位置的分子是同源的(即，如本上下文中使用的氨基酸或核酸“同源性”相当于氨基酸或核酸“同一性”)。两序列间的同源性百分数是两个序列所共有的相同位置数的函数(即，同源性％＝相同位置数/总位置数 x 100)。因此认为术语“同源性”和“同一性”是同义词。
[00174.0.0.1]为了测定两个或多个氨基酸或两个或多个核苷酸序列的同源性(＝同一性)百分比，已经开发了若干种计算机软件程序。可以用例如fasta软件计算两个或多个序列的同源性，现已使用的fasta版本为fasta 3(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，Improved Tools forBiological Sequence Comparison.PNAS 85：2444-2448；W.R.Pearson(1990)Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA，Methods in Enzymology 183：63-98)。另一个可用于计算不同序列的同源性的程序是Biomax pedant软件(Biomax，Munich，FederalRepublic of Germany)中包含的标准blast程序。由于blast并不总是包含对象和查询的完整序列，有时偏巧导致次最佳结果。尽管如此，由于该程序十分有效，可以将其用于大量序列的比较。对于此类序列比较一般使用以下设置 
-p程序名[字符串]；-d数据库[字符串]；默认＝nr；-i查询文件[输入文件]；默认＝stdin；-e期望值(E)[实数]；默认＝10.0；-m比对查看选项：0＝配对；1＝锚定查询显示同一性；2＝锚定查询非同一性；3＝平锚定查询，显示同一性；4＝平锚定查询，非同一性；5＝锚定查询非同一性和平末端；6＝平锚定查询，非同一性和平末端；7＝XML Blast输出；8＝列表；9带注解行的列表[整数]；默认＝0；-oBLAST报告输出文件[输出文件]任选的；默认＝stdout；-F过滤查询序列(blastn为DUST，其他为SEG)[字符串]；默认＝T；-G创建缺口代价(为0则调用默认行为)[整数]；默认＝0；-E扩展缺口代价(为0则调用默认行为)[整数]；默认＝0；-X用于缺口比对的X减少值(以比特为单位)(为0则调用默认行为)；blastn 30，megablast 20，tblastx 0，其他15[整数]；默认＝0；-I在deflines中显示GI′s[T/F]；默认＝F；-q核苷酸错配罚分(只用于blastn)[整数]；默认＝-3；-r核苷酸匹配加分(只用于blastn)[整数]；默认＝1；-v针对(V)显示单行描述的数据库序列数[整数]；默认＝500；-b针对(B)显示比对的数据库序列数[整 数]；默认＝250；-f延伸命中阈值，如果为0则调用默认；blastp 11，blastn 0，blastx 12，tblastn 13；tblastx 13，megablast 0[整数]；默认＝0；-g实施缺口比对(tblastx不可用)[T/F]；默认＝T；-Q查询使用的遗传密码[整数]；默认＝1；-D DB遗传密码(只用于tblast[nx])[整数]；默认＝1；-a使用的处理器数目[整数]；默认＝1；-O SeqAlign文件[输出文件]任选的；-J信任查询注释(Believe the query defline)[T/F]；默认＝F；-M矩阵[字符串]；默认＝BLOSUM62；-W字长，如果为0则调用默认(blastn 11，megablast 28，其他3)[整数]；默认＝0；-z数据库有效长度(对于真实长度使用0)[实数]；默认＝0；-K保持区最佳命中数(默认关闭，如果使用，推荐值为100)[整数]；默认＝0；-P多个命中为0，单个命中为1[整数]；默认＝0；-Y检索空间有效长度(对于真实长度使用0)[实数]；默认＝0；-S针对数据库搜索的查询链(用于blast[nx]和tblastx)；3为两条都是，1为上方链，2为下方链[整数]；默认＝3；-T产生HTML输出[T/F]；默认＝F；-l将数据库搜索局限于GI的表[字符串]任选的；-U对FASTA序列使用小写字母过滤[T/F]任选的；默认＝F；-y以比特表示的非缺口延伸X减少值(0.0调用默认行为)；blastn 20，megablast 10，所有其他7[实数]；默认＝0.0；-Z以比特表示的最终缺口比对X减少值(0.0调用默认行为)；blastn/megablast 50，tblastx 0，所有其他25[整数]；默认＝0；-R PSI-TBLASTN检验点文件(checkpoint file)[文件输入]任选的；-nMegaBlast搜索[T/F]；默认＝F；-L查询序列上的位置[字符串]任选的；-A多个命中窗口大小，如果为0则调用默认值(blastn/megablast 0，所有其他40[整数]；默认＝0；-w移码罚分(blastx为OOF算法)[整数]；默认＝0；-t tblastn中允许连接HSP的最大内含子长度(0禁止连接)[整数]；默认＝0。 
[00175.0.0.1]通过使用Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法获得高质量的结果。因此基于所述算法的程序是优选 的。有利地，可以使用程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等人，CABIOS，5 1989：151-153)或优选使用程序Gap和BestFit(所述程序分别基于Needleman和Wunsch[J.Mol.Biol.48；443-453(1970)]以及Smith和Waterman[Adv.Appl.Math.2；482-489(1981)]的算法)进行序列的比较。两个程序都是GCG软件包[GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)；Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389及以后续页]的一部分。因此优选使用程序Gap在全序列范围上进行确定序列同源性的百分数的计算。针对核酸序列的比较使用下列标准调整进行：缺口权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000，平均错配：0.000。 
[00176.0.0.1]例如，在核酸水平上与序列SEQ ID NO：1具有80％同源性的序列应理解为指在按上述参数设置，用上述Gap程序算法与序列SEQ ID NO：1比较时具有80％同源性的序列。 
[00177.0.0.1]现有技术中，两个多肽之间的同源性被理解为指在程序算法GAP(Wisconsin Package Version 10.0，University of Wisconsin，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA)，按下列参数设置的辅助下进行比较而计算的每种情况下完整序列长度的氨基酸序列同一性： 
缺口权重：8                 长度权重：2 
平均匹配：2,912             平均错配：-2，003 
[00178.0.0.1]例如，在蛋白质水平上与序列SEQ ID NO：2具有80％同源性的序列应理解为指在按上述参数设置，用上述程序算法与序列SEQ ID NO：2比较时具有80％同源性的序列。 
[00179.0.0.1]通过置换、插入或缺失源自本发明如表II第5或7栏所示多肽之一的功能等效物与本发明如表II第5或7栏所示多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，尤其优选至少85％或90％、91％、92％、93％ 或94％，尤其非常优选至少95％、97％、98％或99％的同源性，并以具有与表II第5或7栏所示多肽基本上相同的性质为特征。 
[00180.0.0.1]通过置换、插入或缺失源自本发明如表I第5或7栏，优选表I B第7栏，第1、2、3、4和/或5行所示核酸序列的功能等效物与本发明如表II第5或7栏所示多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，尤其优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，尤其非常优选至少95％、97％、98％或99％的同源性，并且编码具有与如表II的第5或7栏所示多肽基本上相同性质的多肽。 
[00181.0.0.1]功能等效物的“基本上相同的性质”首先应理解为指该功能等效物具有上述提及的活性，例如当增加生物(例如微生物、植物、植物或动物的组织、植物或动物的细胞、或其部分)中的所述功能等效物的蛋白质含量、活性或功能时，赋予氮或含氮化合物含量的增加。 
[00182.0.0.1]通过向本发明核酸分子的核苷酸序列(尤其是表I的第5或7栏所示的核苷酸序列)导入一个或多个核苷酸置换、添加或缺失以将一个或多个氨基酸置换、添加或缺失导入所编码蛋白质中而可以产生编码表II第5或7栏，优选表II B第7栏所示蛋白质序列的同源物的核酸分子。可以通过标准技术(例如定点诱变和PCR-介导的诱变)向诸如表I的第5或7栏所示序列的编码序列中导入突变。 
[00183.0.0.1]优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是用具有相似侧链的一个氨基酸残基替代另一个氨基酸残基。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。 
[00184.0.0.1]因此，本发明多肽或本发明方法中使用的多肽中预测的非必需氨基酸优选被来自相同家族的另一个氨基酸残基所替代。或者，在另一个实施方案中，可以通过例如饱和诱变沿着本发明或本发明方法中使用的核酸分子的编码序列的全长或部分随机导入突变，并且可以对产生的突变体筛选本文所述的活性，以鉴定保持上述提及的活性或者甚至具有该活性增加的突变体，所述活性例如赋予氮或含氮化合物含量的增加。 
[00185.0.0.1]对本文所示序列之一进行诱变后，可以重组表达编码的蛋白质并且可以使用，例如本文所述的测定法(参见实施例)确定该蛋白质的活性。 
[00186.0.0.1]通常可进入的数据库实体针对通过Gap检索可以发现本发明方法中使用的核酸分子的最大同源物。 
尤其是在本上下文中必须提及的那些数据库是常见基因数据库，例如EMBL数据库(Stoesser G等人，Nucleic Acids Res 2001，Vol.29，17-21)、GenBank数据库(Benson D.A等人，Nucleic Acids Res 2000，Vol.28，15-18)或PIR数据库(Barker W.C.等人，Nucleic Acids Res.1999，Vol.27，39-43)。此外，能够使用生物特异的基因数据库来确定有利的序列，就酵母菌而言例如方便的SGD数据库(Cherry J.M.等人，Nucleic Acids Res.1998，Vol.26，73-80)或MIPS数据库(Mewes H.W.等人，Nucleic Acids Res.1999，Vol.27，44-48)，就大肠埃希氏菌而言是GenProtEC数据库(http://web.bham.ac.uk/bcm4ght6/res.html)，而就鼠耳芥属植物而言是TAIR-数据库(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001 Vol.29(1)，102-5)或MIPS数据库。 
[00187.0.0.1]具有如表I第5或7栏(优选表IB第7栏所示序 列)的核酸序列，或者源自如表II第5或7栏，第1、2、3、4和/或5行(优选表IIB第7栏所示序列)的核酸序列的同源物也包括等位变体，其与所示核苷酸序列或上述提及的衍生的核酸序列或其同源物、衍生物或类似物或它们一部分之一具有至少约30％、35％、40％或45％的同源性，优选至少约50％、60％或70％，更优选至少约90％、91％、92％、93％、94％或95％，甚至更优选至少约96％、97％、98％或99％或更高的同源性。等位变体尤其包含可以通过核苷酸的缺失、插入或置换而从所示序列(优选从表I第5或7栏所示序列)或从衍生的核酸序列获得的功能变体，然而，目的是有利地保留或增加所获得的合成蛋白质的酶活性或生物活性。 
[00188.0.0.1]本发明的一个实施方案中，本发明的或本发明方法中使用的核酸分子包括如表I第5或7栏，优选表I B第7栏所示序列中的一或多种，一个实施方案中优选该核酸分子尽可能少地包括表I第5或7栏，(优选表I B第7栏)所示序列中任何一个之外的其它核苷酸序列。一个实施方案中，核酸分子包括少于500、400、300、200、100、90、80、70、60、50或40个其它核苷酸。又一实施方案中，核酸分子包括少于30、20或10个其它核苷酸。一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子与表I第5或7栏，优选表I B第7栏所示序列相同。 
[00189.0.0.1]还优选，本发明方法中使用的核酸分子中一或多种，其编码包括选自如表II第5或7栏(优选表II B第7栏，第1、2、3、4和/或5行)所示序列的多肽。一个实施方案中，核酸分子编码少于150、130、100、80、60、50、40或30个其它氨基酸。又一实施方案中，编码的多肽包括少于20、15、10、9、8、7、6或5个其它氨基酸。一个实施方案中，本发明方法中使用的编码的多肽与表II第5或7栏，优选表II B第7栏所示序列相同。 
[00190.0.0.1]一个实施方案中，本发明的或本方法中使用的核酸分子编码包括如表II第5或7栏，优选表II B第7栏所示序列的多肽， 包括少于100的个其它核苷酸。又一实施方案中，所述核酸分子包括少于30个的其它核苷酸。一个实施方案中，本方法中使用的核酸分子与编码表II第5或7栏，优选表II B第7栏所示序列的编码序列相同。 
[00191.0.0.1]还具有本发明多肽赋予氮或含氮化合物增加这一必需酶活性(即其活性本质上不被降低)的多肽(＝蛋白质)是具有野生型生物活性或酶活性的至少10％或20％，优选30％或40％，尤其优选50％或60％，尤其非常优选80％或90％或更高的多肽，有利地，该活性与表II第5或7栏所示多肽(优选与表II第3和5栏所示序列)的活性相比实质上不降低，并且在相同条件下表达。 
一个实施方案中，本发明的多肽是由如表II B第7栏所示序列组成或包括该序列的同源物。 
[00192.0.0.1]如表I第5或7栏所示序列或如表II第5或7栏所示的衍生序列的同源物也指编码和非编码DNA序列的截短序列、cDNA、单链DNA或RNA。所述序列的同源物也应理解为指包括非编码区(例如UTR、终止子、增强子或启动子变体)的衍生物。可以通过一个或多个核苷酸替换、插入和/或缺失修饰所述核苷酸序列的上游启动子，而不干扰启动子、开放读码框(＝ORF)或远离ORF的3’调节区(如终止子或其他3’调节区)的功能性或活性。此外，能够通过修饰其序列，或者通过用更有效的启动子(甚至是来自异源生物的启动子)完全代替其而增加启动子的活性。适合的启动子是本领域技术人员已知的并且在本文下面提及。 
[00193.0.0.1]又一个实施方案中，根据本发明的方法包括下述步骤： 
(a)选择在细胞溶胶和/或细胞器(例如质体或线粒体)中表达本发明多肽的生物或其部分； 
(b)诱变该选定的生物或其部分； 
(c)比较诱变的生物或其部分中所述多肽的活性或表达水平与该选 定生物或其部分中所述多肽的活性或表达； 
(d)选择诱变的生物或其部分，其相比于该选定的生物或其部分，包括所述多肽增加的活性或表达水平； 
(e)可选地，生长或培植该生物或其部分。 
[00194.0.0.1]有利地，根据本发明诱变该选定的生物。根据本发明，诱变是生物的基因组中任何遗传信息的改变，这指生物的核酸(优选DNA)中并非由正常分离或遗传重组过程所造成的任何结构或组成的改变。该突变可自发地发生，或者可由下面所述的诱变剂诱导。可以随机或选择性地诱导此类改变。此两种情况下，生物的遗传信息被修饰。通常，这导致增加细胞内或生物内有关基因的基因产物活性的情形。 
[00195.0.0.1]在特异的或所谓的定点诱变的情况下，突变特定基因并且因而遏制、降低或增加(优选增加)其活性和/或所编码基因产物的活性。在随机诱变时，偶然突变一或多个基因，并且遏制、降低或增加(优选增加)其活性和/或其基因产物的活性。 
[00196.0.0.1]出于诱变大的生物种群的目的，可以用DNA构建体转化该种群，该构建体用于尽可能多地激活生物的基因，优选所有基因。例如，构建体可以含有强启动子或一或多个增强子，该构建体能够转录激活其整合位点附近的基因。利用这一方法，通过随机整合活性构建体，能够显著诱变(例如激活)生物几乎所有的基因。此后，熟练技术人员可以鉴定那些在其中已激活了本发明基因的诱变株系，这反过来导致氮或含氮化合物所期望的增加。 
[00197.0.0.1]也可以通过诱变调控区或编码区而激活本发明的基因。在随机诱变时，大量生物进行诱变剂处理。以几乎使每个基因按照统计学上突变一次的方式选择所述试剂的量和处理的强度。用于随机诱变的方法以及各自的试剂是本领域技术人员公知的。例如，该方法由A.M.van Harten[(1998)，“Mutation breeding：theory and practicalapplications”，Cambridge University Press，Cambridge，UK]，E Friedberg， G Walker，W Siede[(1995)，“DNA Repair and Mutagenesis”，Blackwell Publishing]或K.Sankaranarayanan，J.M.Gentile，L.R.Ferguson[(2000)“Protocols in Mutagenesis”，Elsevier Health Sciences]所公开。如本领域技术人员所知，生物细胞中的自发突变率非常低并且对于生物诱变可利用大量化学、物理或生物试剂。这些试剂被称作诱变物或诱变剂。如前所述，可利用三种不同的诱变剂(化学、物理或生物试剂)。 
[00198.0.0.1]化学诱变因素有不同类型，可以通过其作用模式来区分。例如碱基类似物，如5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤。其他化学剂因素与DNA相互作用，如硫酸、亚硝酸、羟胺，或其它烷化剂，如单功能剂(如甲磺酸乙酯、硫酸二甲酯、甲磺酸甲酯)、双功能剂(如二氯乙基硫醚、丝裂霉素、亚硝基胍-二烷基亚硝胺、N-亚硝基胍衍生物、N-烷基-N-硝基-N-亚硝基胍)、ntercalating染料，如吖啶、溴乙啶。 
[00199.0.0.1]物理诱变剂例如是电离辐射(X射线)、UV辐射。可利用不同形式的辐射并且它们是强诱变剂。可以区分两种主要辐射类型：a)非电离辐射(例如UV光)或诸如X射线的电离辐射。生物诱变物，例如转座元件，例如IS元件，例如IS100，转座子例如Tn5、Tn10、Tn916或Tn1000或噬菌体如Muamplac、P1、T5、λplac等。将此噬菌体DNA导入适当微生物中的方法对熟练技术人员是众所周知的(参见Microbiology，第三版，Davis，B.D.，Dulbecco，R.，Eisen，H.N.和Ginsberg，H.S.编辑，Harper International Edition，1980)。普通的转座子诱变方法是在基因内或附近(例如启动子或终止子区)插入转座元件并因此失去该基因的功能。在生物基因组内定位转座子的方法是本领域技术人员众所周知的。 
[00200.0.0.1]优选地，使用化学或生化方法诱变生物。优选的化学方法是用N-甲基-N-硝基-亚硝基胍诱变。 
[00201.0.0.1]Spee等人(Nucleic Acids Research，Vol.21，No.3， 1993：777-778)公开了其它生物方法。Spee等人教导一种使用dITP用于随机诱变的PCR方法。这一由Spee等人描述的方法被Rellos等人(Protein Expr.Purif.，5，1994：270-277)改进。Stemmer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91，1994：10747-10751)描述了体外重组技术在分子诱变上的应用。Moore等人(Nature Biotechnology Vol.14，1996：458-467)描述了PCR与重组方法组合用于增加酯酶对于对-硝基苄酯的酶活性。Greener等人在Methods in Molecular Biology(Vol.57，1996：375-385)中描述了酶诱变的其它途径。Greener等人使用特异的大肠埃希氏菌XL1-Red来产生具有增加的抗生素抗性的大肠埃希氏菌突变体。 
[00202.0.0.1]一个实施方案中，根据本发明的蛋白质或本文表征的核酸分子起源于真核或原核生物，例如非人动物、植物、微生物(例如真菌、酵母菌、藻类、硅藻或细菌)。可以有利地被用于本发明方法的核酸分子起源于酵母菌，例如酵母科，具体为酵母属或酵母菌属，例如假丝酵母属、汉森氏酵母属、毕氏酵母属、耶氏酵母属、赤酵母属(Rhodotorula)或裂殖酵母属且特别有利地来自物种酿酒酵母。 
[00203.0.0.1]一个实施方案中，可以有利地用于本发明方法中的核酸分子起源于细菌，例如变形菌门，尤其是γ-变形菌纲，更优选肠杆菌目，例如来自肠杆菌科，特别是大肠杆菌属、沙门菌属(salmonella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)，有利地来自物种大肠埃希氏菌K12。 
[00204.0.0.1]如果在本发明方法中将植物选作供体生物，那么原则上，该植物可与受体植物是任何系统发育关系。供体和受体植物可属于相同的科、属、物种、品种或系，导致待整合的核酸与受体植物基因组中相应部分之间的同源性增加。这也类似地应用于微生物作为供体和受体生物上。 
使用来自进化关系非常远的物种的核酸分子也可能是有利的，因为它们可展现对于内源调控机制降低的敏感性并且此种序列可能不被内源 沉默机制所识别。 
[00205.0.0.1]因此，本发明一个实施方案涉及来自植物(例如作物，例如来自欧洲油菜(B.napus)；大豆(Glycine max)；向日葵、稻、棉花、亚麻或玉米)或它们的同源物的核酸分子在本发明方法中的应用。 
[00206.0.0.1]因此，一个实施方案中，本发明涉及一种核酸分子，其包括选自下述内容的核酸分子： 
a)编码选自如表II，优选表II B第5和7栏所示多肽或其片段的核酸分子，并且其在具有光合活性的生物或其部分中，赋予提高的氮同化、累积和/或利用； 
b)包括选自如表I，优选表I B第5和7栏所示核酸分子的核酸分子，且其在具有光合活性的生物或其部分中赋予提高的氮同化、累积和/或利用； 
c)由于遗传密码的简并性，可以从由(a)或(b)的核酸分子所编码的多肽序列推导出其序列，且其在具有光合活性的生物或其部分中赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子； 
d)编码与由(a)-(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，且其在具有光合活性的生物或其部分中赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子； 
e)在严谨性杂交条件下与(a)-(c)的核酸分子杂交，且其在具有光合活性的生物或其部分中赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子； 
f)包括通过使用如表III第7栏所示引物或引物对扩增来自cDNA文库或基因组文库核酸分子而获得的核酸分子，且其在具有光合活性的生物或其部分中赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子； 
g)编码在抗由(a)-(f)的核酸分子之一所编码多肽的单克隆抗体辅助下所分离的多肽，且其在具有光合活性的生物或其部分中赋予提高 的氮同化、累积和/或利用的核酸分子； 
h)编码包括如表IV第7栏所示共有序列的多肽，且其在具有光合活性的生物或其部分中赋予提高的氮同化、累积和/或利用的核酸分子；和 
i)可在严谨性杂交条件下使用包括(a)-(k)的核酸分子序列之一的探针或用其具有至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的(a)-(k)所表征核酸分子的片段筛选适宜的核酸文库获得的，且其在具有光合活性的生物或其部分中赋予提高的氮同化、累积和/或利用核酸分子； 
或者包含与上述序列互补的序列；其中优选地，根据(a)-(i)的核酸分子与表1A或IB第5或7栏所示序列差别一或多个核苷酸。一个实施方案中，核酸分子并非由表IA或IB第5或7栏所示序列组成。一个实施方案中，核酸分子与表IA或IB第5或7栏所示序列的同一性小于100％、99.999％、99.99％、99.9％或99％。另一个实施方案中，该核酸分子不编码表IIA或IIB第5或7栏所示序列的多肽。另一个实施方案中，本发明的核酸分子与表IA或IB第5或7栏所示序列具有至少30％、40％、50％或60％的同一性且同一性小于100％、99.999％、99.99％、99.9％或99％。又一实施方案中，该核酸分子不编码表IIA或IIB第5或7栏所示序列的多肽。因此，一个实施方案中，本发明的核酸分子与表IA或IB第5或7栏所示核酸分子差别至少一或多个核苷酸。因此，一个实施方案中，本发明核酸分子编码的多肽与表IIA或IIB第5或7栏所示多肽差别至少一或多个氨基酸。因此，一个实施方案中，由根据(a)-(i)的核酸分子序列所编码的蛋白质不由表IIA或IIB第5或7栏所示序列组成。又一实施方案中，本发明的蛋白质与表IIA或IIB第5或7栏所示蛋白质序列具有至少30％、40％、50％或60％的同一性且与表IIA或IIB第5或7栏所示序列的同一性小于100％，优选小于99.999％、99.99％或99.9％，更优选小于99％、98％、97％、96％或 95％。 
[00207.0.0.1]将本方法中使用的核酸序列有利地导入核酸构建体，优选能够在生物(优选植物或微生物)中表达该核酸分子的表达盒。优选地，将表IA或IB第5或7栏应用号2和/或应用号3所示的核酸序列以编码融合蛋白的方式导入核酸构建体，其另外含有编码质体靶向性序列的核酸序列，其在翻译时将表IA或IB第5或7栏所示核酸序列编码的多肽导向质体区室。本领域技术人员熟悉此类核酸构建体的设计。因此，本发明还涉及一种核酸构建体(优选一种表达构建体)包括与一或多个调控元件或信号功能性连接的本发明的核酸分子。因此，本发明还涉及一种核酸构建体(优选一种表达构建体)包括与质体靶向性序列功能性连接的本发明的核酸分子，优选表IA或IB第5或7栏应用号2和/或应用号3所示的序列。 
[00208.0.0.1]如本文所述，该核酸构建体也可以包括待导入生物或细胞中的其它基因。将调控基因(例如诱导子、阻遏子或酶的基因，由于其酶活性而参与生物合成途径中一或多个基因的调控)导入宿主生物并在其中表达是可能的且有利的。这些基因可以是异源的或同源的。此外，也可有利地存在其它生物合成基因，或者这些基因可定位在一或多种其它核酸构建体上。有利地用作生物合成基因的基因是氨基酸代谢、糖酵解、三羧酸代谢的基因或其组合。如本文所述，调控序列或因子可以优选地对所导入基因的表达起正效应，从而使其增加。因此，可通过使用强转录信号(例如启动子和/或增强子)有利地在转录水平发生调控元件的增强。然而此外，翻译增强也是可能的，例如通过增加mRNA稳定性或通过插入翻译增强子序列。 
[00209.0.0.1]原则上，该核酸构建体可以包括本文所述的调控序列和其它与所包括的基因表达相关的序列。因此，可以将本发明的核酸构建体用作表达盒并因此可以直接用于导入植物，或者可将其导入载体。因此在一个实施方案中，该核酸构建体是包括微生物启动子或微生 物终止子或两者都包括的表达盒。另一个实施方案中该表达盒包括植物启动子或植物终止子或两者都包括。另一个实施方案中，该表达盒包含植物质体靶向性序列。 
[00210.0.0.1]因此，一个实施方案中，根据本发明的方法包括下述步骤： 
(a)导入核酸构建体，其包括本发明的或本发明方法中使用的或编码本发明的或本发明方法中所使用多肽的核酸分子；或 
(b)向细胞或生物或其部分(优选植物、植物细胞或微生物)中导入包括调控序列或因子的核酸分子，该核酸分子的表达增加本发明的或本发明方法中使用的或编码本发明的或本发明方法中使用的多肽的核酸分子的表达，和 
(c)在细胞、细胞溶胶或细胞器(例如质体或线粒体或两者中，优选在质体或优选在细胞溶胶或生物中)表达由该核酸构建体或在(a)或(b)中提及的核酸分子编码的基因产物。 
[00211.0.0.1]导入并表达核酸构建体后，有利地培养该转基因生物或细胞随后收获。该转基因生物或细胞可能是原核或真核生物，例如微生物、植物细胞、植物组织、优选作物，或其部分。 
[00212.0.0.1]为了将核酸分子导入核酸构建体(例如作为表达盒的部分)，以本领域技术人员已知的方式方便地对编码的基因片段进行扩增和连接反应。优选按照与用于Pfu DNA聚合酶或Pfu/Taq DNA聚合酶混合物的方法类似的程序。根据待扩增的序列选择引物。应以使扩增物包含从起始到终止密码子的编码序列的方式来恰当地选择引物。扩增后，适当分析扩增物。例如，分析可考虑质量和数量并且在用凝胶电泳分离后进行。此后，扩增物可以根据标准方法(例如Qiagen)进行纯化。纯化扩增物的等分试样可用于随后的克隆步骤。适合的克隆载体通常是熟练技术人员已知的。 
[00213.0.0.1]特别地，它们包括能够在易于处理的克隆体系中进 行复制的载体，例如基于细菌酵母或昆虫细胞(例如杆状病毒表达)系统，也就是说，尤其是保证在大肠埃希氏菌中有效克隆且能够在植物中稳定转化的载体。尤其必须提及的载体是多种适于T-DNA介导的转化的二元和共整合载体系统。此种载体系统的特征通常是它们至少含有vir基因和T-DNA边界序列，该vir基因是农杆菌属物种介导的转化所需的。 
[00214.0.0.1]通常，载体系统优选也包括其它的顺式调控区例如启动子和终止子和/或选择标记，利用它们可以鉴定适当转化的生物。就共整合载体系统而言，vir基因和T-DNA序列位于同一载体上，而二元系统基于至少两个载体，其一携带vir基因但没有T-DNA，而第二个携带T-DNA但没有vir基因。由于这一事实，最后提及的载体相对要小，易于操作且能够在大肠埃希氏菌和农杆菌属物种中复制。这些二元载体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。根据本发明优选使用的那些是Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。Hellens等人，Trends in Plant Science(2000)5，446-451给出了二元载体及其应用的综述。 
[00215.0.0.1]对于载体制备，可首先使用限制性内切酶使载体线性化然后以适当的方式进行酶修饰。此后，纯化载体，然后在克隆步骤中使用等分试样。在克隆步骤中，使用连接酶将酶切的和必要时纯化的扩增物和同样制备的载体片段克隆到一起。本上下文中，特异的核酸构建体，或载体或质粒构建体可具有一个或者多个编码的基因片段。这些构建体中的编码的基因片段优选有效地连接到调控序列。特别地，该调控序列包括植物序列如上述启动子和终止子和最终在编码的片段和启动子之间的靶向性序列。有利地可以在微生物，尤其是大肠埃希氏菌和/或根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中在选择性条件下稳定地繁殖该构建体并且能够使异源DNA转化植物或其它微生物。根据具体实施方案，构建体是基于二元载体(overview of a binary vector：Hellens等人，2000)。通常其含有用于在微生物例如大肠埃希氏菌和根癌农杆菌中操作 的原核生物调控序列，例如复制原点和选择标记。载体还可以含有用于将DNA转化到植物基因组的农杆菌T-DNA序列或用于将DNA转化到其它真核生物细胞(例如酵母菌属的物种)的其它真核生物调控序列或者用于将DNA转化到其它原核生物细胞(例如棒杆菌属或芽孢杆菌属的物种)的其它原核生物调控序列。对于转化植物优选包括全部农杆菌T-DNA序列中约25个碱基对的右边界序列。通常，根据本发明的植物转化载体构建体含有来自右边界区和来自左边界区的T-DNA序列，其含有对位点特异性作用酶的适宜的识别位点，其反过来由一些vir基因所编码。 
[00216.0.0.1]适当的宿主生物为技术人员众所周知。有利的生物为本申请上文所述。它们具体包括真核生物或真细菌，例如原核生物或古细菌。有利的宿主生物为选自以下的微生物：放线菌科、芽胞杆菌科、短杆菌科、棒杆菌科、肠杆菌科、戈登氏菌科、微球菌科、分枝杆菌科、诺卡氏菌科、假单胞菌科、根瘤菌科或链霉菌科、毛壳菌科、笄霉科(Choanephoraceae)、隐球酵母科、小克银汉霉科、暗梗胞科(Demetiaceae)，丛梗孢科(Moniliaceae)，被孢霉科(Mortierellaceae)、毛霉科、腐霉科、酵母科(Sacharomycetaceae)、水霉科、裂殖酵母属、Sodariaceae、掷孢酵母科、瘤座孢科、Adelotheciaceae、甲藻纲、牛毛藓科和绿枝藻纲。优选单细胞微生物例如真菌、细菌或原生动物，例如真菌如麦角菌属或曲霉属，或革兰氏阳性菌如杆菌属、棒杆菌属、微球菌属、短杆菌属、红球菌属、诺卡氏菌属、Caseobacter或节杆菌属，或革兰氏阴性菌如大肠埃希氏菌属、黄杆菌属或沙门氏菌属，或酵母如红酵母属、汉森氏酵母属、毕赤酵母属、Yerrowia、酵母属、裂殖酵母属或假丝酵母属。 
[00217.0.0.1]本发明方法特别有利地选择的宿主生物为选自包括以下属和种的微生物：异常汉森酵母、Candida utilis、Clavicepspurpurea、环状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种、Brevibacterium albidum、Brevibacterium album、Brevibacterium cerinum、黄色短杆菌、Brevibacterium glutamigenes、碘短杆菌、Brevi-bacterium ketoglutamicum、Brevibacterium lactofermentum、扩展短杆菌、Brevibacterium roseum、解糖短杆菌、短杆菌属物种、乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumaceto acidophilum)、Corynebacteriumacetoglutamicum、Corynebacterium ammoniagenes、谷氨酸棒杆菌(＝Micrococcus glutamicum)、栖糖密棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)、棒杆菌属物种或大肠埃希氏菌，特别是大肠埃希氏菌K12及其所述菌株。 
[00218.0.0.1]根据本发明有利地优选根癌农杆菌属或植物宿主生物。优选的植物选自以下科：槭树科、漆树科、伞形科、菊科、伞形科、桦木科、紫草科、十字花科、凤梨科、仙人掌科、Caricaceae、石竹科，大麻科(Cannabaceae)，旋花科(Convolvulaceae)，藜科(Chenopodiaceae)，胡颓子科(Elaeagnaceae)、牻龙儿苗科(Geraniaceae)，禾本科(Gramineae)，胡桃科(Juglandaceae)，樟科(Lauraceae)，豆科(Leguminosae)，亚麻科(Linaceae)，葫芦科(Cucurbitaceae)，莎草科，大戟科，豆科(蝶形花科)，锦葵科(Malvaceae)，睡莲科、罂粟科、蔷薇科、杨柳科、茄科、棕榈科、鸢尾科、百合科、兰科、龙胆科、唇形科(Labiaceae)、木兰科、毛莨科、Carifolaceae、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科、堇菜科、灯心草科、禾本科、多年生草本、饲料作物、蔬菜和观赏植物。 
[00219.0.0.1]特别优选选自以下科的植物：伞形科、菊科、十字花科、葫芦科、豆科(蝶形花科)、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科。特别有利的为具体的作物植物。因此，优选有利的植物属于花生(peanut)、油籽油菜、卡诺拉(canola)、向日葵、红花、橄榄、芝麻、榛子、almond、鳄梨(avocado)、月桂、西葫芦(pumpkin)/南瓜(squash)、亚麻子、大豆、阿月浑子(pistachio)、琉璃苣、玉米、 小麦、黑麦、燕麦、高梁(sorghum)和黍、黑小麦、稻、棉花、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、fodder beet、茄子和多年生草本及饲料植物、油椰、蔬菜(芸苔、根类蔬菜、块茎类蔬菜、豆荚类蔬菜、果实类蔬菜、葱蒜类蔬菜(onion vegetables)、叶类蔬菜和茎类蔬菜)、荞麦(buckwheat)、Jerusalem artichoke、蚕豆(broad bean)、vetches、扁豆(lentil)、矮生菜豆(dwarf bea)、羽扇豆(lupin)、三叶草(clover)和苜蓿属。 
[00220.0.0.1]为将本发明的核酸分子或本发明方法所使用的核酸分子引入植物中，已经证明首先将其转化到中间宿主(如细菌或单细胞真核生物细胞)是有利的。已经证明转化大肠埃希氏菌在本文中是恰当的，转化可以以本身已知的方式进，例如通过热激或电穿孔的方法。因此，可以分析转化大肠埃希氏菌菌落的克隆率。这可借助PCR进行。可以借助通过将菌落的等分试样进行所述PCR来定义的菌落数确认质粒构建体的同一性和完整性。对于该目的，通常使用来自载体序列的通用引物，例如可以将正向引物安排在编码基因片段的起始ATG上游，反向引物安排在编码基因片段的终止密码子下游。通过电泳分离扩增物并评估其数量和质量。 
[00221.0.0.1]随后将(任选地确认的)核酸构建体用于转化植物或其他宿主，如其他真核细胞或其他原核细胞。为此首先需要从中间宿主获得构建体。例如，可以通过类似于常规质粒分离的方法从细菌宿主中得到构建体(如质粒)。 
[00222.0.0.1]还可以将本发明核酸分子或本发明方法所使用的核酸分子引入修饰的病毒载体，如用于在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体或植物病毒载体，如烟草花叶病毒或基于马铃薯X病毒的载体。引起表达来自修饰的病毒基因组的蛋白质的途径包括例如用从重组病毒基因组的cDNA拷贝体外转录的感染性RNA接种烟草，所述病毒基因组包含本发明的核酸分子或本发明方法所使用的核酸分子。另一途径利用从接种 根癌农杆菌的伤口转化整个植物，所述根癌农杆菌含有重组正义RNA病毒的cDNA拷贝。用于不同靶标(如生产植物)中表达的不同的载体和病毒为技术人员所公知。 
[00223.0.0.1]已知大量用于植物转化的方法。根据本发明，由于将异源DNA稳定整合到植物基因组中是有利的，因此已证明T-DNA介导的转化特别合适。为此目的，首先需要用包括本发明核酸分子的编码的基因片段或相应的质粒构建体转化适当的载体，尤其是农杆菌。这可以本身已知的方式进行。例如，可以通过电穿孔或热激的方法将根据上文详细描述所产生的所述本发明核酸构建体或所述表达构建体或所述质粒构建体转化入进感受态农杆菌中。原则上，必须在一方面共整合载体形成和另一方面用二元载体转化之间进行区别。在第一个方案中，含有编码基因片段或本发明核酸分子或本发明方法所使用的核酸分子的构建体不具有T-DNA序列，而通过在农杆菌中与带有T-DNA的构建体同源重组形成共整合载体或构建体。T-DNA以Ti或Ri质粒的形式存在于农杆菌中，在所述质粒中外源DNA合适地取代了癌基因。如果使用二元载体，可以通过细菌缀合或直接转移将它们转移到农杆菌中。这些农杆菌有利地已包括携带vir基因的载体(现在称为辅助Ti(Ri)质粒) 
[00224.0.0.1]如果将与T-DNA一起转化植物或植物细胞，还可以便利地与核酸构建体或本发明的载体一起使用一或多个标记，借助该标记可以分离或选择转化了的生物，如农杆菌或转化的植物细胞。这些标记基因使得可以通过一系列不同原理来鉴定本发明核酸分子的成功转移，所述方法例如借助荧光、发光或人眼可见波长范围内的光视觉鉴定、通过对除草剂或抗生素的抗性、通过已知为营养标记(营养缺陷型标记)或抗营养标记、通过酶分析或通过植物激素。可能提到的这些标记的实例为GFP(＝绿色荧光蛋白)、荧光素/荧光素酶系统、β-半乳糖苷酶及其有色底物(如X-Gal)、除草剂抗性(如咪唑啉酮、草甘膦、膦丝菌素或磺酰脲)、抗生素抗性(如博来霉素、潮霉素、链霉素、卡那 霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素)、仅举数例营养标记(如利用甘露糖或木糖)或抗营养标记(如对2-脱氧葡萄糖或D-氨基酸的抗性)。此处仅列出了少数可能的标记。熟练技术人员对这些标记非常熟悉。根据生物和选择方法优选使用不同的标记。 
[00225.0.0.1]一般需要T-DNA位于植物核酸构建体编码的基因片段的一侧或两侧。这在使用根癌农杆菌或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)转化时特别有用。根据本发明优选的方法是借助根癌农杆菌的转化。然而，生物射弹方法也可以有利地用于将本发明方法的序列导入，还可能使用PEG方法导入。可以以本身已知的方式培养转化了的农杆菌，从而可便利地用于植物转化。以惯例的方式生长或提供用于转化的植物或植物部分。随后使转化了的农杆菌作用于植物或植物部分，直至达到足够的转染率。可以以不同形式使农杆菌作用于植物。例如，可使用形态发生的植物细胞或组织的培养物。转移T-DNA之后，细菌一般被抗生素清除，并诱导植物组织再生。这尤其通过使用适当的植物激素来完成以便起始诱导愈伤组织形成并随后启动枝发育。 
[00226.0.0.1]将外源基因转移入植物基因组称作转化。为此，利用所述用于转化及从植物组织或植物细胞再生植株的方法进行瞬时或稳定转化。有利的转化方法是植物中转化。为此，可以例如使农杆菌作用于植物种子或用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，已经证明使转化了的农杆菌的悬液作用于完整植物或至少花原基是特别便利的。随后继续生长植物直至获得被处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。为了选择转化的植物，通常将转化中获得的植物材料置于选择条件下，以便从未转化的植物中区分出转化了的植物。例如，可以播种以前述方式收获的种子并在初始生长期后通过喷撒进行适当的选择。另外的可能性是(必要时在灭菌后)在使用适当选择试剂的 琼脂平板上生长种子，以使只有转化的种子能成长为植株。其他有利的(尤其是针对植物而言)转化方法为熟练技术人员所已知并在下文进行描述。 
[00227.0.0.1]其他有利和合适的方法为通过聚(乙二醇)诱导的DNA摄取的原生质体转化、使用基因炮的“生物射弹”方法(称为微粒轰击的方法)、电穿孔、在DNA溶液中孵育干胚、微注射和农杆菌属物种介导的基因转移。所述方法描述于例如B.Jenes等人，Techniques forGene Transfer，出自：Transgenic Plants，Vol 1，Engineering andUtilization，S.D.Kung和R.Wu编，Academic Press(1993)128-143和Potrykus Annu.Rev.Plant Physio.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225。优选地将待表达的核酸或构建体克隆到适合转化根癌农杆菌的载体中，例如pBinl9(Bevan等人，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。转化了这一载体的农杆菌可以随后按已知方式用于转化植物，尤其是作物，如烟草植物，例如将有划痕的叶片或叶片节段浸泡在农杆菌溶液中，随后在合适的培养基中培养。利用根癌农杆菌的植物转化由例如
Figure G2007800201189D0086084930QIETU
和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述，或此外从F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，出自TransgenicPlants，Vol 1，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编，Academic Press，1993，15-38页可知。 
[00228.0.0.1]可以将前述核酸分子与其他基因组合在一起克隆到本发明的核酸构建体或载体中，或者通过向宿主细胞，有利地为植物细胞或微生物中转化若干核酸构建体或载体(包括质粒)导入不同的基因。 
[00229.0.0.1]除了表I第5或7栏所示序列或其衍生物以外，另外有利地在生物中表达和/或突变其他基因。尤其有利地，在生物(如植物或微生物)中额外表达至少一个氨基酸生物合成途径的其他基因，例如L-赖氨酸、L-苏氨酸和/或L-甲硫氨酸。还可以有利地修饰天然基因的 调控，以至基因和/或其基因产物不再接受生物中存在的调控机制的调控。这引起所需氨基酸的增加的合成，例如，反馈调节不再以相同程度存在或完全不存在。此外，将表I第5或7栏所示序列与普遍支持或增强靶生物生长或产量的基因组合也可能是有利的，所述基因例如引起微生物较快生长率的基因或产生胁迫、病原体或除草剂抗性植物的基因。 
[00230.0.0.1]在本发明方法的又一有利的实施方案中，本方法中使用的生物是那些生物，其中同时突变了至少一个前述基因或一个前述核酸，以使得与未突变蛋白质相比相应蛋白质的活性受代谢物影响的程度较小或完全不受影响(并且尤其是根据本发明的氮或含氮化合物的各自累积或生产未受影响)，或者以使得其特异酶活性增加。前后关系中的较低影响指与起始生物相比酶活性的调控减少至少10％，有利地减少至少20、30或40％，特别有利地减少至少50、60、70、80或90％，从而与起始生物相比该酶的活性得到了由提及的这些数字所述的增加。酶活性的提高指与起始生物相比，提高至少10％、有利地至少20、30、40或50％，特别有利地至少60、70、80、90、100、200、300、500或1000％的酶活性。这引起生物中提高的氮同化、累积和/或利用。 
[00231.0.0.1]本发明方法的又一有利的实施方案中，本方法中使用的生物是那些其中同时减弱含N化合物降解蛋白质(尤其是通过降低相应基因的表达率)的生物。 
[00232.0.0.1]本发明方法的另一个实施方案中，本方法中使用的生物是那些以部分降低或完全阻断相应蛋白质酶或生物活性的方式同时突变了至少一个前述核酸或前述基因的生物。酶活性或生物活性的降低指与起始生物相比活性降低至少10％、有利地至少20、30或40％、特别有利地至少50、60或70％，优选降低的更多。 
[00233.0.0.1]如果旨在用若干构建体或载体转化宿主细胞(尤其是植物细胞)，那么在后续转化中必须去除先前转化的标记或采用其他标记。可以通过熟练技术人员熟悉的方法如下文所述从宿主细胞(尤其 是植物细胞)中去除标记。特别地，没有标记(特别是没有抗生素抗性)的植物是本发明尤其优选的实施方案。 
[00234.0.0.1]本发明方法中，本发明方法中使用的核酸序列有利地有效连接一或多个调控信号以增加基因表达。这些调控序列旨在允许特异的基因表达和蛋白质表达。视宿主生物(例如植物或微生物)而定，这可指例如基因只在诱导后表达和/或过表达，或组成型地表达和/或过表达。这些调控序列是例如结合诱导物或阻遏物并从而调控核酸表达的序列。除了这些新调控序列以外，或作为这些序列的替代，这些序列的天然调控仍可存在于实际结构基因之前，并在适当时经遗传修饰，以关闭天然调控并增加基因表达。然而，适合作为表达盒(＝表达构建体＝基因构建体)的本发明核酸构建体还可以在结构上更简化，也就是说在核酸序列或其衍生物之前不插入其它调控信号，并且没有去除天然启动子及其调控。取而代之的是以使调控不再发生和/或增加基因表达的方式突变了天然调控序列。还可以将这些修饰的启动子独立地导入到以局部序列形式存在的天然基因之前(＝带有部分本发明核酸序列的启动子)以提高活性。此外，基因构建体还可以有利地包括一或多个与启动子有效连接的称为增强子的序列，并且它们使得核酸序列的表达增加。此外，可以在DNA序列的3’端插入其它有利序列，例如其他调控元件或终止子。 
[00235.0.0.1]编码本发明蛋白质的核酸分子和编码其他多肽的核酸分子可存在于一个核酸构建体或载体中或者存在于若干个中。有利地，在核酸构建体或载体中只存在本发明核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子或其编码的一个拷贝。可以在宿主生物中共同表达若干个载体或核酸构建体或载体。本发明的核酸分子或核酸构建体或载体可以插入载体并以游离形式存在于细胞中。如果优选稳定转化，则使用在数个世代中稳定复制或插入到基因组中的载体。在植物的情况下，可能发生向质体基因组的整合或尤其是向核基因组的整合。为了在宿主基因组中 插入多于一个的基因，待表达的基因共同存在于一个基因构建体中，例如前述携带多个基因的载体。 
[00236.0.0.1]通常，基因表达率的调控序列相对本发明核酸分子或本发明方法中所使用核酸分子的编码序列或其他编码的基因片段而位于其上游(5’)、其间和/或下游(3’)。它们尤其调控转录和/或翻译和/或转录物的稳定性。表达水平取决于与其他细胞调控系统的结合，例如细胞的蛋白质生物合成和降解系统。 
[00237.0.0.1]调控序列包括转录和翻译调控序列或信号，例如位于上游(5’)，尤其关系到转录或翻译起始的调控序列，例如启动子或起始密码子和位于下游(3’)，尤其关系到调控转录或翻译终止和转录物稳定性的序列，例如多腺苷酸化信号或终止密码子。调控序列可以存在于转录的编码区以及转录的非编码区(如内含子)，例如剪接位点。细胞中调控本发明核酸表达并可以使用的启动子原则上是所有能够在目的生物(如微生物或植物)中刺激基因转录的启动子。在这些生物中起作用的合适的启动子是众所周知的。它们可以是组成型或诱导型启动子的形式。合适的启动子可以促使多细胞真核生物中的发育和/或组织特异性表达，因此在植物中可以有利地使用叶、根、花、种子、气孔、块茎或果实特异性的启动子。 
[00238.0.0.1]如上所述，调控序列或因子可以对所导入基因的表达具有正效应从而增加其表达。因此，可以通过使用强转录信号(如强启动子和/或强增强子)在转录水平有利地增强表达。此外，还可能在翻译水平增强表达，例如通过导入翻译增强子序列(例如增强子，例如提高核糖体与转录物的结合)或通过增加mRNA的稳定性(例如通过用已知赋予转录物高稳定性的编码3’UTR区域取代3’UTR编码区或通过消除转录物的不稳定性而稳定转录物)，从而比野生型更频繁地翻译mRNA分子。例如在植物中富含AU的元件(ARE)和DST(下游)元件使转录物不稳定。诱变研究证明了两个保守结构域ATAGAT和GTA 区内的残基对于不稳定性功能是必需的。因此去除或突变这些元件显然会导致更稳定的转录物、更高的转录物率和更高的蛋白质活性。转录增强子也是包括烟草花叶病毒5’非翻译前导序列并增加蛋白质/RNA比率的“超驱动序列”(Gallie等人，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。 
[00239.0.0.1]增强子通常定义为可以不依赖于位置和方向而刺激基因转录的顺式作用元件。已经在植物中鉴定出不同的增强子，其可以是组成型或组织或刺激特异性地刺激转录。组成型增强子的公知实例为来自35S启动子的增强子(Odell等人，1985，Nature 313：810-812)或ocs增强子(Fromm等人，1989，Plant Cell 1：977：984)。其他的实例为在双子叶和单子叶植物中赋予高水平组成型表达的G-框模体四聚体(Ishige等人，1999，Plant Journal，18，443-448)或petE—在转基因烟草和马铃薯植物中作为基因表达的定量性增强子的富含A/T序列(Sandhu等人，1998；Plant Mol Biol.37(5)：885-96)。除此以外，已经描述了种类繁多的用于特异性表达模式(如器官特异性表达或应答于生物或非生物胁迫的诱导型表达)的顺式作用元件。实例为提供病原体或创伤诱导的表达(Rushton，2002，Plant Cell，14，749-762)或保卫细胞特异性表达(Plesch，2001，Plant Journal 28，455-464)的元件。 
[00240.0.0.1]用于在微生物中表达本发明核酸分子的有利的调空序列存在于例如被有利地用于革兰氏阴性细菌中的启动子中，例如cos、tac、rha、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq-、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL启动子。其他有利的调控序列存在于例如革兰氏阳性细菌启动子amy、dnaK、xylS和SPO2、酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、UASH、MCB、PHO、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中，启动子特别有利的是组成型、组织或区室特异型和诱导型的。“启动子”在本文中一般应理解为核酸分子中介导核酸分子的编码序列片段表达的调控序列。启动子一般位于编码序列片段上游。然而，一些元件(例如表达增强元件，例如增强子)也可位于 下游或甚至是转录区中。 
[00241.0.0.1]原则上，天然启动子与其调控序列(如上文提及的那些)能够一起用于新方法。还可以有利地额外或单独使用合成启动子，特别是当它们如WO 99/16890中所述介导种子特异性表达时。 
[00242.0.0.1]本方法中使用的核酸分子的表达可能需要单独进行或组合其他基因或核酸。可以通过同时转化若干个独立的适当核酸构建体(即表达构建体)或优选地通过在一个构建体上组合若干表达盒来导入多个赋予有利基因表达的核酸分子。还可以转化若干载体，每次逐步向受体生物中导入若干个表达盒。 
[00243.0.0.1]如上所述，应有利地通过所导入的生物合成基因3’端(终止密码子之后)的合适终止子来终止所导入基因的转录。可用于该目的的终止子为例如OCS1终止子、nos3终止子或35S终止子。同启动子的情况相同，每个基因应使用不同的终止子序列。可用于微生物中的终止子为例如fimA终止子、txn终止子或trp终止子。该终止子可以是rho-依赖型或rho-非依赖型的。 
[00244.0.0.1]可有利地在核酸构建体中使用不同的植物启动子例如USP、LegB4、DC3启动子或来自荷兰芹的泛素启动子或其他本文提到的启动子和不同的终止子。 
[00245.0.0.1]由于重复序列模体可导致重组事件或沉默或在植物中导致T-DNA不稳定，因此为保证与其他生物合成基因组合的本发明方法所使用核酸分子稳定整合至转基因植物的多个世代，本方法中使用的每个编码区应在其自身(优选独有)的启动子的调控下表达。 
[00246.0.0.1]有利地，以这样的方式构建核酸构建体：即启动子之后是用于将待表达核酸有利地插入到多聚接头中的适当的切割位点，适当时其后有位于多聚接头之后的终止子。适当时，重复这一顺序若干次从而在一个构建体中组合若干个基因并因此为了表达而可以将其导入到转基因植物中。该顺序有利地重复至多三次。为进行表达，核酸序列 通过合适的切割位点(如在启动子后的多聚接头中的位点)插入。如上文所述，每个核酸序列具有其自身的启动子并在必要时具有其自身的终止子是有利的。然而，如果宿主或靶生物中可以进行多顺反子转录，还可以在启动子后(和适当时在终止子前)插入若干核酸序列。在本文中，核酸构建体中的插入位点或所插入核酸分子的顺序不是决定性的，也就是说核酸分子可以插入盒中第一个或最后一个位点而对表达没有本质影响。然而，还可以在构建体中仅使用一种启动子类型。但是如所述，这可能引起不希望的重组事件或沉默效应。 
[00247.0.0.1]因此，优选的实施方案中，本发明的核酸构建体在植物中赋予本发明核酸分子或本发明方法中所使用核酸分子(以及可选择地其他基因)的表达，并包括一或多个植物调控元件。所述本发明核酸构建体有利地包含植物启动子或植物终止子或植物启动子和植物终止子。 
[00248.0.0.1]“植物”启动子包括在植物细胞中介导编码序列片段表达的调控元件。因此，植物启动子不需要为植物来源的，而可来源于病毒或微生物，尤其是例如来自攻击植物细胞的病毒。 
[00249.0.0.1]植物启动子也可以来源于植物细胞，例如来自由如本文所述核酸构建体或载体所转化的植物。 
这也应用于其他“植物”调控信号，例如“植物”终止子。 
[00250.0.0.1]适合于植物表达的核酸构建体优选包括能够在植物细胞中调控基因表达的调控序列，这些调控序列有效连接以使每个序列可以实现其功能。因此，该核酸构建体还可以包括转录终止子。转录终止的实例为多腺苷酸化信号。优选的多腺苷酸化信号为源于根癌农杆菌T-DNA的序列，例如称为章鱼碱合酶的Ti-质粒pTiACH5的基因3(Gielen等，EMBO J.3，(1984)：835及后续页)或其功能等效物，但是所有在植物中有功能活性的其他终止子也是合适的。 
[00251.0.0.1]适于植物表达的核酸构建体优选还包括其他有效连 接的调控元件，例如翻译增强子，例如包括烟草花叶病毒5’-非翻译前导序列的超驱动序列，其增加蛋白质/RNA比率(Gallie等人，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。 
[00252.0.0.1]用于在基因表达构建体中有效连接的其他优选序列为将基因产物靶向特定细胞区室所需的靶向性序列(可参阅Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)285-423的综述及其中的引文)，所述细胞区室例如液泡、细胞核、所有类型的质体(如造粉体、叶绿体、色质体)、胞外空间、线粒体、内质网、油质体、过氧化物酶体、酵解酶体和细胞的其他区室或胞外。本文必须提到的序列尤其是本身已知的信号肽或转运肽编码序列。例如质体转运肽编码序列使表达产物靶向植物细胞的质体中。还已知真核生物的靶向性序列和较少量的原核生物的靶向性序列可有利地与本发明核酸分子有效连接以实现在所述区室之一或胞外的表达。尤其优选如表I A或I B第5或7栏，应用号2或3所示核酸序列与用于靶向质体区室的靶向性序列的有效连接。为在植物中表达，如上文所述核酸分子必须与合适启动子有效连接或包括该启动子，该启动子使基因在正确的时间点和以细胞或组织特异性方式表达基因。有用的启动子为组成型启动子(Benfey等人，EMBO J.8(1989)：2195-2202)，例如来源于植物病毒的启动子，如35S CAMV(Franck等人，Cell 21(1980)285-294)、19SCaMV(也参阅US 5352605和WO84/02913)、34S FMV(Sanger等人，Plant.Mol.Biol.，14，1990：433-443)、荷兰芹泛素启动子或植物启动子例如专利US4,962,028中所述的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶(Rubisco)小亚基启动子，或植物启动子PRP1(Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993))、SSU、PGEL1、OCS(Leisner(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85(5)：2553-2557)、lib4、usp、mas(Comai(1990)Plant Mol Biol 15(3)：373-381)、STLS1、ScBV(Schenk(1999)Plant Mol Biol 39(6)：1221-1230)、B33、SAD1或SAD2(亚麻启动子，Jain等人，Crop Science，39(6)， 1999：1696-1701)或nos(Shaw等人(1984)Nucleic Acids Res.12(20)：7831-7846)。根据本发明的蛋白质在植物中稳定的组成型表达可以是有利的。然而，如果由于代谢操作可能引起植物生长延迟而使收获前的后期表达有利时，则本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽的诱导型表达是有利的。 
[00253.0.0.1]还可以如上文所述通过化学诱导型启动子促进植物基因的表达(参阅Gatz 1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108的综述)。当需要以时间特异性的方式表达基因时，化学诱导型启动子尤其合适。这些启动子的实例为水杨酸可诱导型启动子(WO95/19443)和脱落酸可诱导型启动子(EP 335 528)、四环素可诱导型启动子(Gatz等人(1992)Plant J.2，397-404)、环己醇或乙醇可诱导型启动子(WO 93/21334)或本文所述的其他启动子。 
[00254.0.0.1]其他合适的启动子是与生物或非生物胁迫条件反应的启动子，例如病原体可诱导型的PRP1基因启动子(Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、番茄热可诱导型的hsp80启动子(US5,187,267)、马铃薯冷可诱导型的α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)或创伤可诱导型的pinII启动子(EP-A-0 375 091)或本文所述的其他启动子。 
[00255.0.0.1]优选的启动子尤其是在发生氮或含氮化合物如氨基酸或蛋白质的生物合成的组织和器官中、种子细胞(例如胚乳细胞和发育的胚细胞)中引起基因表达的启动子。合适的启动子为油菜的油菜籽蛋白基因启动子(US 5,608,152)、蚕豆的USP启动子(Baeumlein等人，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67)、鼠耳芥属植物的油质蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆的菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)、芸苔的Bce4启动子(WO 91/13980)、大豆的arc5启动子、胡萝卜的DcG3启动子或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)和在单子叶植物(如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等)中 引起种子特异性表达的启动子。有利的种子特异性启动子为蔗糖结合蛋白质启动子(WO 00/26388)、菜豆蛋白启动子和油菜籽蛋白启动子。必需考虑的合适启动子为大麦Ipt2或Ipt1基因的启动子(WO95/15389和WO 95/23230)和如WO 99/16890中所述的启动子(来自大麦醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻谷醇溶蛋白基因、小麦麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高梁kasirin基因和黑麦的裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。其他合适的启动子为Amy32b、Amy6-6和Aleurain(US 5,677,474)、Bce4(油菜)(US 5,530,149)、大豆球蛋白(大豆，EP 571 741)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(大豆，JP 06/62870)、ADR12-2(大豆，WO98/08962)、异柠檬酸酶(油菜，US 5,689,040)或α-淀粉酶(大麦，EP781 849)。其他可供在植物中表达基因使用的启动子为诸如DE-A19644478中所述的叶特异型启动子或诸如豌豆petE启动子的光调控性启动子。 
[00256.0.0.1]其他合适的植物启动子为胞质FBP酶启动子或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等人，EMBO J.8，1989，2445)、大豆磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶启动子(GeneBank登录号U87999)、或EP-A-249676中所述的noden特异性启动子。 
[00257.0.0.1]其他尤其适合的启动子为引起质体特异性表达的启动子。合适的启动子例如WO 95/16783和WO 97/06250中描述的病毒RNA聚合酶启动子和WO 99/46394中描述的鼠耳芥属植物clpP启动子。 
[00258.0.0.1]除了前述的若干病毒和细菌启动子以外，用于在尽可能多的组织中(尤其也是在叶中)强表达异源序列的其他启动子优选为肌动蛋白或泛素基因的植物启动子，如稻肌动蛋白1启动子。组成型植物启动子的其他实例为甜菜V-ATP酶启动子(WO 01/14572)。合成的组成型启动子的实例为超级启动子(WO 95/14098)和来自G-框的启 动子(WO 94/12015)。适当时，还可另外使用化学诱导型启动子，参考EP-A 388186、EP-A 335528、WO 97/06268。 
[00259.0.0.1]如本文已经提到的，可能适用的其他调控序列适当时还包括靶向表达产物的转运和/或定位的序列。本文中必须提到的序列尤其是本身已知的信号肽或转运肽编码序列。例如，质体转运肽编码序列能够将表达产物靶向植物细胞的质体中。 
[00260.0.0.1]如上文所述，优选的受体植物尤其是可以以适当的方式转化的植物。这些包括单子叶和双子叶植物。尤其必须提及的植物为用于农业的植物(如谷类和草)，例如小麦属物种(Triticum spp.)、玉玉蜀黍、大麦、燕麦、黑麦、稻、Pennisetum glaucum、两色蜀黍、黑小麦(Triticale)、剪股颖属物种(Agrostis spp.)、蒺藜草(Cenchrusciliaris)、鸭芋(Dactylis glomerata)、苇状洋芋(Festucaarundinacea)、黑麦草属物种(Lolium spp.)、苜蓿属物种(Medicagospp.)和甘蔗属物种(Saccharum spp.)、豆类和油料作物例如芥菜、欧洲油菜、大豆(Glycine max)、落花生、陆地棉、鹰嘴豆(Cicerarietinum)、向日葵(Helianthus annuus)、冰豆(Lens culinaris)、亚麻、白芥(Sinapis alba)、白车轴草(Trifolium repens)和Vicianarbonensis，蔬菜和水果例如香蕉、葡萄、番茄、芦笋(asparagus)、卷心菜、西瓜、猕猴桃、马铃薯、甜菜、木薯和菊苣(chicory)，树例如咖啡(Coffea species)、柑桔属物种(Citrus spp.)、桉树物种(Eucalyptus spp.)、云杉属物种(Picea spp.)，松属物种(Pinus spp.)和杨属物种(Populus spp.)，药用植物和树和花。 
[00261.0.0.1]本发明的一个实施方案还涉及产生载体的方法，该载体包括载体中的本文所表征的核酸分子、本发明的核酸分子或本发明的表达盒的插入物。例如，可以如本文就核酸构建体或如下文转化或转染的描述或如实施例中所示将载体导入细胞(例如微生物或植物细胞)中。瞬时或稳定转化宿主或靶细胞是可能的，然而优选稳定转化。本发 明的载体优选为适合在植物中表达本发明多肽的载体。因此该方法还可以包括一或多个将调控序列(特别是介导在微生物或植物中表达的信号)整合至载体中的步骤。 
[00262.0.0.1]因此，本发明还涉及载体，所述载体包括本文所表征的作为适合植物表达的核酸构建体的一部分的核酸分子或本发明的核酸分子。 
[00263.0.0.1]本发明有利的载体包括编码本发明蛋白质的核酸分子、本发明方法中使用的核酸分子或适合植物表达的核酸构建体，所述构建体含有单独或与其他基因(例如氨基酸代谢的生物合成或调控基因，例如本文上述的基因)组合使用的核酸分子。根据本发明，术语“载体”是指能够转运其所连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，是指可以连接额外DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，额外的DNA片段可以连接到病毒基因组。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制原点的细菌载体)。其他优选的载体在被引入宿主细胞后完全或部分整合在宿主细胞基因组中，并因此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。在本文中，这些载体被称作“表达载体”。如上文所述，它们能够自主复制或可以部分或完全整合到宿主基因组中。通常适合于DNA重组技术的表达载体常为质粒形式。由于质粒是最常用的载体形式，本说明书中“质粒”和“载体”可互换使用。然而，本发明也意图包括发挥类似功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体。术语载体另外还包括熟练技术人员已知的其他载体，例如噬菌体、病毒(例如SV40、CMV、TMV)、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒(phagemid)、粘粒和线性或环状DNA。 
[00264.0.0.1]有利地用于本方法的重组表达载体包括本发明核酸分子或本发明的核酸构建体，该构建体形式适合在宿主细胞中表达本发明的或本文所述的核酸分子。因此，该重组表达载体包括一或多个基于 用于表达的宿主细胞而选择的并与待表达的核酸序列有效连接的调控信号。 
[00265.0.0.1]在重组表达载体中，“有效连接”指目的核酸分子以可能表达该核酸分子的方式与调节信号连接：它们以使两个序列实现指定的预计功能的方式彼此连接(例如在体外转录/翻译体系或当载体导入宿主细胞时在宿主细胞中) 
[00266.0.0.1]术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子以及其他表达调控元件(例如多腺苷酸化信号)。这些调控序列描述于例如Goeddel：Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)或参见Gruber和Crosby，出自Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson编，第7章，89-108，CRC Press，Boca Raton，Florida，包括其中引述的参考文献。调控序列包括调控核苷酸序列在多种类型宿主细胞中组成型表达的序列，以及只在特定宿主细胞中和特定条件下调控核苷酸序列直接表达的序列。熟练技术人员会理解表达载体的设计可基于这些因素，例如待转化宿主细胞的选择、需要蛋白质的表达水平等。上文中描述了优选的调控序列选择，例如启动子、终止子、增强子等。认为术语调控序列包含在术语调控信号内。上文描述了若干有利的调控序列，尤其是启动子和终止子。通常，描述为有利于适合表达的核酸构建体的调控序列也可用于载体。 
[00267.0.0.1]可以特别设计所使用的重组表达载体，以在原核和/或真核细胞中表达本方法中使用的核酸分子。由于载体构建的中间步骤经常出于简单性考虑而在微生物中进行，因此这是有利的。例如，根据本发明的基因和其他基因可使用WO 98/01572中所述转化方法和载体在细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母和其他真菌细胞(见Romanos，(1992)，Yeast 8：423-488；van den Hondel，(1991)，出自More Gene Manipulations in Fungi，J.W.Bennet & L.L.Lasure，编， 396-428页Academic Press：San Diego；和van den Hondel，C.A.M.J.J.(1991)，出自Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.F.等人编1-28页Cambridge University Press：Cambridge)，藻类(Falciatore等人，1999，Marine Biotechnology 1，3：239-251)中表达，优选在多细胞植物细胞中表达(参阅Schmidt，R.和Willmitzer，L.，(1988)Plant CellRep.583-586；Plant Molecular Biology and Biotechnology，C Press，BocaRaton，Florida，6/7章，71-119页(1993)；F.F.White，出自TransgenicPlants，Bd.1，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编，AcademicPress(1993)，128-43；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225及其引用的参考文献)。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press：San Diego，CA(1990)中进一步讨论。作为替换，重组表达载体的序列可以体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。 
[00268.0.0.1]可以使用包括调控融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体在原核生物中表达蛋白质。典型的融合表达载体尤其为pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)等，其中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖-E-结合蛋白质和蛋白A与重组靶蛋白质融合。合适的诱导型非融合大肠埃希氏菌表达载体的实例尤其为pTrc(Amann等人，(1988)Gene 69：301-315)和pET 11d载体[Studier等人，GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，California(1990)60-89]。pTrc载体的靶基因表达是基于通过宿主RNA聚合酶转录杂合体trp-lac融合启动子。从pET 11d载体表达靶基因基于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的T7-gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主株系BL21(DE3)或HMS174 (DE3)由在lacUV5启动子的转录调控下的携带有T7 gn1基因的定居λ原噬菌体提供。 
[00269.0.0.1]适合原核生物的其他载体是熟练技术人员已知的，这些载体例如大肠埃希氏菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列(如pBR322)、pUC系列(如pUC18或pUC19)、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCl；链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；芽孢杆菌中的pUB110、pC194或pBD214；棒杆菌中的pSA77或pAJ667。 
[00270.0.0.1]另一个实施方案中，表达载体为酵母表达载体。用于酿酒酵母的表达载体的实例包含pYeDesaturasec1(Baldari等人，(1987)Embo J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人，(1987)Gene 54：113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。适用于其他真菌(如丝状真菌)的载体构建的载体和方法包含van den Hondel，(C.A.M.J.J.[(1991)，J.F.Peberdy编，1-28页，Cambridge University Press：Cambridge或More Gene Manipulations in Fungi，J.W.Bennet和L.L.Lasure编，396-428页：Academic Press：San Diego]详细描述的那些。其他适合的酵母载体的实例为2цM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。 
[00271.0.0.1]可作为实例提及的其它载体是真菌中的pALS1、pIL2或pBB116或者植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。 
[00272.0.0.1]作为替换，可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达核酸序列。能够在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包含pAc系列(Smith等人，(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170： 31-39)。 
[00273.0.0.1]前述提及的载体只是可能合适载体的小范围概括。其他质粒是熟练技术人员已知的并在例如Cloning Vectors(Pouwels P.H.等人，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985 ISBN 0444904018)中有所描述。适合原核和真核细胞的其他表达系统参阅Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版第16和17章Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。 
[00274.0.0.1]因此，本发明的一个实施方案涉及一种载体，其中本发明的核酸分子有效连接到允许在原核或真核或者原核和真核宿主中表达的调控序列。 
[00275.0.0.1]因此，本发明的一个实施方案涉及一种宿主细胞，其稳定或瞬时转化了本发明的载体或本发明的核酸分子或本发明的核酸构建体。 
[00276.0.0.1]本发明也涉及用于产生本发明多肽的方法，该多肽在本发明的宿主细胞中表达，优选在微生物或转基因植物细胞中表达。 
[00277.0.0.1]一个实施方案中，产生多肽的方法中使用的核酸分子来自微生物，优选来自原核或原生动物细胞，并以真核生物作为宿主细胞。例如，一个实施方案中，用来自原核或真菌或藻类或另一种微生物(但不是来自植物)的核酸分子在植物细胞或植物中产生该多肽。 
[00278.0.0.1]熟练技术人员了解尽管具有相同编码序列，但在不同生物中表达的蛋白质和DNA在许多方面和特性(例如DNA调节和印迹)上存在差异，例如甲基化或翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化、乙酰化、十四烷酰化、ADP-核糖基化、法尼基化、羧化、硫酸化、泛素化等。优选地，相应蛋白质的细胞表达调控在调控内源蛋白质或另一种真核蛋白质的活性和表达的调控机制上相应地存在差异。原核或真核生物中所表达蛋白质的一个主要差异是糖基化的数量和模式。例如在大肠埃 希氏菌中没有糖基化蛋白质。酵母中表达的蛋白质在糖基化蛋白质中具有高甘露糖含量，而在植物中糖基化模式是复杂的。 
[00279.0.0.1]优选通过重组DNA技术产生本发明的多肽。例如，将编码蛋白质的核酸分子克隆进载体(如上文所述)，将载体导入宿主细胞中(如上文所述)并在宿主细胞中表达所述多肽。然后可以通过适当的纯化方案使用标准蛋白质纯化技术从细胞中分离所述多肽。除了重组表达以外，可以使用标准肽合成技术化学合成本发明的多肽或肽。 
[00280.0.0.1]此外，可以从细胞(例如内皮细胞)中分离赋予生物或其部分氮或含氮化合物增加的天然多肽，例如使用如下所述的本发明抗体，尤其是，抗如表II第3栏所示蛋白质的抗体。例如，抗如表II第5或7栏所示多肽或其抗原部分的抗体，所述抗体可以通过标准技术，利用包括上述提及的序列或由该序列组成的多肽(例如本发明的多肽或其部分)产生。优选特异结合如表II第5或7栏所示多肽的单克隆抗体。 
[00281.0.0.1]一个实施方案中，本发明涉及具有由本发明的核酸分子或本发明方法中使用的或由本发明方法获得的核酸分子所编码的氨基酸序列的多肽。所述多肽优选赋予前述活性，尤其是，多肽在(例如通过增加该多肽的表达或比活性)增加细胞性活性后赋予细胞或生物或其部分氮或含氮化合物的增加。 
[00282.0.0.1]一个实施方案中，本发明涉及一种多肽，该多肽具有选自如表II第5或7栏所示序列或由选自如表I第5或7栏所示核酸分子或其功能性同源物编码。 
[00283.0.0.1]一个有利的实施方案中，本发明的方法中增加包括选自如表IV第7栏所示的共有序列或由该共有序列组成的多肽的活性，而另一个实施方案中，本发明涉及包括表IV第7栏所示共有序列或由该共有序列组成的多肽，其中有20或较少、优选15或10、优选9、8、7 或6、更优选5或4、甚至更优选3、甚至更优选2、甚至更优选1、最优选0个指定位置的氨基酸可以由任一氨基酸置换，在又一实施方案中，该指定位置的氨基酸可以被置换和/或缺失。一个实施方案中，本发明涉及包括多肽的本发明方法或涉及包括超过一个的如表IV第7栏所示(单个品系的)共有序列的多肽。 
[00284.0.0.1]一个实施方案中，不超过15％，优选10％，甚至更优选5％、4％、3％、或2％，最优选1％或0％的由单个字母表示的氨基酸位置上的氨基酸由另一种氨基酸置换，或者在另一个实施方案中缺失或被置换。另一个实施方案中，由(X)表示的非保守氨基酸的一段序列的长度变化为20％，优选15或10％，甚至更优选5％、4％、3％、2％或最优选只有1％。 
[00285.0.0.1]一个实施方案中，20或更少，优选15或10，优选9、8、7或6，更优选5或4，甚至更优选3，甚至更优选2，甚至更优选1，最优选0个氨基酸插入了共有序列，或者在另一个实施方案中，缺失和/或被置换。 
[00286.0.0.1]共有序列源自如表II所列序列的多重比对。字母表示单字母氨基酸代码并且表明该氨基酸在所有比对的蛋白质中保守。字母X代表在所有序列中不保守的氨基酸。一个实例，在只有小的给定氨基酸子集可能存在于某一位置的情况下，这些氨基酸在括号中给出。给定X的数目表示保守氨基酸残基之间的距离，例如Y-x(21，23)-F指在所有调查的序列中，保守的酪氨酸和苯丙氨酸残基相互隔开最少21和最多23个氨基酸残基。 
[00287.0.0.1]从所有序列中鉴定出保守结构域并且使用标准Prosite释义的子集进行描述，例如，Y-x(21，23)-[FW]模式指保守的酪氨酸由最少21最多和23个氨基酸残基从苯丙氨酸或色氨酸隔开。 
[00288.0.0.1]用软件工具MEME(3.5.1版)或手工鉴定保守模式。MEME是由Timothy L.Bailey和Charles Elkan，Dept.of Computer Science and Engeneering，University of California，San Diego，USA所开发并且由Timothy L.Bailey和Charles Elkan[Fitting a mixture model byexpectation maximization to discover motifs in biopolymers，Proceedingsof the Second International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology，第28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994]所描述。用于独立程序的源代码可公开获得自San Diego Supercomputercenter(http://meme.sdsc.edu)。 
[00289.0.0.1]为了用软件工具MEME在所有序列中鉴定共同模体，使用下面的设置：最大化大小500000，-nmotifs 15，-evt 0.001，最大权重60，距离1e-3，分析所用序列的最小位点数。用于MEME的输入序列是Fasta格式的非比对序列。其它参数使用该软件版本的默认设置。 
[00290.0.0.1]用软件工具Pratt(2.1版)或人工产生保守结构域的Prosite模式。Prat由Inge Jonassen，Dept.of Informatics，University ofBergen，Norway所开发并且被Jonassen等人[I.Jonassen，J.F.Collins和D.G.Higgins，Finding flexible patterns in unaligned protein sequences，Protein Science 4(1995)，第1587-1595页；I.Jonassen，Efficientdiscovery of conserved patterns using a pattern graph，1997年向CABIOSFebr.投稿]所描述。用于单独程序的源代码(ANSI C)是公众可获得的，例如，在如EBI(European Bioinformatics Institute)建立的生物信息中心。 
[00291.0.0.1]为了用软件工具Pratt产生模式，使用下面的设置：PL(最大模式长度)：100，PN(模式符号最大Nr)：100，PX(相邻x′s的最大Nr)：30，FN(可塑间隔最大Nr)：5，FL(最大可塑性)：30，FP(最大Flex.Product)：10，ON(最大模式数)：50。用于Pratt的输入序列是从软件工具MEME鉴定的展现高度相似性的蛋白质序列的不同区域。匹配该产生的模式所必需的最小序列数(CM，最小匹配序列数)设为所提供序列的至少80％。此处未提及的参数使用其的 默认设置。 
[00292.0.0.1]保守结构域的Prosite模式可以用于检索匹配该模式的蛋白质序列。多个建立的生物信息中心提供用于在数据库检索中使用那些模式的公共网络入口(例如，PIR[蛋白质信息资源库(ProteinInformation Resource)，位于Georgetown University Medical Center]或ExPASy[Expert Protein Analysis System])。或者，可获得如Fuzzpro程序的单独软件，其是EMBOSS软件包中的一部分。例如，Fuzzpro程序不仅允许检索完全蛋白质匹配类型，而且也允许在已进行的检索中设置多个模糊值。 
[00293.0.0.1]用ClustalW(1.83版)软件进行比对并且该软件由Thompson等人[Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting，positions-specific gap penalties andweight matrix choice.Nucleic Acids Research，22：4673-4680]所描述。用于单独程序的源代码可公开获得自European Molecular BiologyLaboratory；Heidelberg，Germany。使用ClustalW 1.83版的默认参数(缺口开放罚分：10.0；缺口延长罚分：0.2；蛋白质矩阵：Gonnet；pprotein/DNA endgap：-1；蛋白质/DNA缺口距离：4)进行分析。 
[00294.0.0.1]一个有利的实施方案中，本发明方法包括增加包括了植物或微生物特异共有序列或由该共有序列组成的多肽。因此，一个实施方案中，本发明涉及包括了植物或微生物特异共有序列或由该共有序列组成的多肽。 
一个实施方案中，所述本发明的多肽与表IIA或IIB第5或7栏所示序列差别一或多个氨基酸。一个实施方案中，多肽与表IIA或IIB第5或7栏所示序列相差大于1、2、3、4、5、6、7、8、或9个氨基酸，优选大于10、15、20、25或30个氨基酸，甚至更优选大于40、50或60个氨基酸，优选地，本发明多肽序列与表IIA或IIB第5或7栏所示序列相差不 超过80％或70％的氨基酸，优选不超过60％或50％，更优选不超过40％或30％，甚至更优选不超过20％或10％。另一个实施方案中，所述多肽不由表IIA或IIB第5或7栏所示序列组成。 
[00295.0.0.1]一个实施方案中，本发明多肽包括之前公众未知的任一序列。一个实施方案中，本发明的多肽起源于非植物细胞(尤其源于微生物)且在植物细胞中表达。一个实施方案中，本发明涉及由本发明或本发明方法中使用的核酸分子编码的、活性尚未描述的多肽。进一步优选的实施方案中，本发明的多肽包括表II第5或7栏应用号2或3所示任何序列及其它质体靶向性序列。 
[00296.0.0.1]一个实施方案中，本发明涉及赋予生物或其部分中氮或含氮化合物增加的多肽，其由本发明的核酸分子或由本发明方法中使用的核酸分子所编码。 
一个实施方案中，本发明的多肽与表IIA或IIB第5或7栏所示序列差别一或多个氨基酸。另一个实施方案中，所述多肽不由表IIA或IIB第5或7栏所示序列组成。再一实施方案中，本发明所述多肽的同一性小于100％、99.999％、99.99％、99.9％或99％。一个实施方案中，所述多肽并非由表IA或IB第5或7栏所示核酸分子编码的序列所组成。一个实施方案中，所述多肽是具有质体靶向性序列的融合肽。 
[00297.0.0.1]一个实施方案中，本发明涉及具有如表II第3栏所示蛋白质活性的多肽，其与表IIA或IIB第5或7栏所示序列差别一或多个氨基酸，优选大于5、6、7、8或9个氨基酸，优选大于10、15、20、25或30个氨基酸，甚至更优选大于40、50或60个氨基酸但甚至更优选小于70％的氨基酸，更优选小于50％，甚至更优选小于30％或25％，更优选20％或15％，甚至更优选小于10％。 
[00298.0.0.1]本申请中使用的术语“蛋白质”和“多肽”可互换。“多肽”涉及氨基酸(氨基酸序列)聚合物但并不涉及分子的特定长度。因此肽和寡肽包括于多肽的定义中。该术语还涉及或包括多肽的翻译后修 饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。定义包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽、具有取代键(Substituted linkage)以及本领域已知的其他修饰的多肽，两者都是天然存在和非天然存在。 
[00299.0.0.1]优选地，多肽为分离的。“分离的”或“纯化的”蛋白质或核酸分子或其生物活性部分基本上不含细胞物质(通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其他化学品(化学合成时)。 
[00300.0.0.1]措词“基本上不含细胞物质”包括本发明多肽的制剂，其中蛋白质从天然或重组产生它的细胞的细胞组分中分离。一个实施方案中，“基本上不含细胞物质”一语包括具有低于约30％(干重)“污染性蛋白质”，更优选低于约20％的“污染性蛋白质”，还更优选低于约10％的“污染性蛋白质”，并最优选低于约5％的“污染性蛋白质”的制剂。术语“污染性蛋白质“涉及并非本发明多肽的多肽。重组产生本发明多肽或其生物活性部分时，还优选基本上不含培养基，即培养基小于蛋白质制剂体积的约20％，更优选小于约10％，并最优选小于约5％。“基本上不含化学前体或其他化学品”一语包括制剂，其中本发明多肽从蛋白质合成中涉及的化学前体或其他化学品中分离。术语“基本上不含化学前体或其他化学品”包括具有低于约30％(干重)的化学前体或非本发明化学品的多肽的制剂，优选低于约20％的化学前体或非本发明化学品的多肽，还更优选低于约10％的化学前体或非本发明化学品的多肽，并最优选低于约5％的化学前体或非本发明化学品的多肽。优选的实施方案中，分离的蛋白质或其生物活性部分没有来源于产生本发明多肽的同一生物的污染蛋白质。通常，通过重组技术产生这些蛋白质。 
[00301.0.0.1]非本发明化学品的多肽是诸如不具有如表II第3、5或7所示多肽的活性和/或氨基酸序列的多肽。 
[00302.0.0.1]本发明多肽可以参与本发明的方法。该多肽或其部分优选包括这样的氨基酸序列，其与如表II第5或7栏所示氨基酸序列 足够同源以致该蛋白质或其部分保持赋予本发明活性的能力。蛋白质的部分优选如本文所述的生物活性部分。优选地，本发明方法中使用的多肽具有与如表II第5或7栏所示序列相同的氨基酸序列。 
[00303.0.0.1]此外，该多肽可以具有由与本发明的核酸分子的核苷酸序列杂交(优选在如上所述的严谨性条件下杂交)的核苷酸序列所编的氨基酸序列。因此，该多肽具有由核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列与如表I第5或7栏所示核苷酸序列之一具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％，优选至少约75％、80％、85％或90，和更优选至少约91％、92％、93％、94％或95％，和甚至更优选至少约96％、97％、98％、99％或更高同源性。本发明优选的多肽优先具有至少一种本发明及本文所述的活性。本发明优选的多肽包括由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与表I第5或7栏所示核苷酸序列杂交(优选在严谨性条件下杂交)或如上所述是其同源物。 
[00304.0.0.1]因此，如本文详细说明的本发明多肽可以由于天然变异或诱变而在氨基酸序列上与表II第5或7栏所示序列不同。因此，该多肽包括与表IIA或IIB第5或7所示全长氨基酸序列具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％，优选至少约75％、80％、85％或90％，更优选至少约91％、92％、93％、94％或95％，最优选至少约96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列。 
[00305.0.0.1]为比较氨基酸序列，可以使用如上所述的相同算法或核酸序列。使用Needleman及Wunsch或Smith及Waterman算法得到高质量结果。因此优选基于所述算法的程序。序列有利的比较可以使用程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等人，CABIOS，5 1989：151-153)或优选地使用程序Gap和BestFit，其分别基于Needleman及Wunsh的算法(J.Mol.Biol.48；443-453(1970))和 Smith及Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981))的算法。两个程序都是GCG软件包(Genetics Computer Group，575 ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)；Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389及后续页)的一部分。因此优选在整个序列范围上使用Gap程序完成测定序列同源性百分比的计算。氨基酸序列的比较使用了以下标准调整：缺口权重：8，长度权重：8，平均匹配：2.912，平均错配：-2.003。 
[00306.0.0.1]本发明多肽的生物活性部分包括这样的肽，其包括了源自本发明的或本发明方法中使用的多肽的氨基酸序列的氨基酸序列，例如如表II第5或7栏所示氨基酸序列或者其蛋白质同源物的氨基酸序列，多肽的生物活性部分包括比本发明多肽或本发明方法中所使用多肽的全长或比本文描述的本发明多肽或本发明方法中所使用多肽的全长同源物蛋白质少的氨基酸，并表现至少一种本发明或本发明方法中所使用多肽的活性。 
[00307.0.0.1]通常，生物(或免疫)活性部分(即肽，例如长度为5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多个氨基酸的肽)包括具有至少一种本发明或本发明方法中使用的多肽的活性或表位的结构域或模体。此外，可以通过重组技术制备其中缺失了多肽其他区域的其他生物活性部分，并评估一种或多种本文所述的活性。 
[00308.0.0.1]对本发明核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子操作可导致实质上具有如表II第3栏所示多肽活性但与所述野生型蛋白质序列不同的蛋白质。可能提高这些蛋白质的效率或活性，可能以比通常细胞中更多的数目存在，或与野生型蛋白质相比可能降低效率或活性。 
[00309.0.0.1]引起本发明多肽或本发明方法中使用的多肽增加所述活性的任何诱变策略都并非意图限制；这些策略的变化对本领域技术人员将是显而易见的。使用这些策略并结合本文公开的机制，可以利用 本发明的核酸分子和多肽或本发明方法中使用的多肽来产生表达一或多种野生型蛋白质或者一或多种突变蛋白质的编码核酸分子或本发明的多肽分子的植物或其部分，以提高所需化合物的产率、产量和/或产生效率。 
[00310.0.0.1]该所需化合物可能是植物的任何天然产物，包括生物合成途径的终产物和天然存在的代谢途径的中间产物以及没有天然存在于所述细胞的代谢中，但由本发明所述细胞产生的分子。优选地，化合物为包括氮或含氮化合物的组合物。 
[00311.0.0.1]％ 
[00312.0.0.1]本发明还提供嵌合或融合蛋白。 
[00313.0.0.1]如本文所使用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括一种多肽，其有效连接到不赋予上述提及活性(尤其是当其活性增加时，不赋予细胞或生物或其部分氮或含氮化合物含量增加)的多肽上。 
[00314.0.0.1]一个实施方案中，提及的“本发明的蛋白质(＝多肽)”或如表II第5或7栏所示的是指具有与本发明多肽或本发明方法中使用的多肽相对应的氨基酸序列的多肽，然而表II第5或7栏未显示的“非本发明的多肽”或“其他多肽”是指具有与本发明多肽基本上不同源，优选与表II第5或7栏所示多肽基本上不同源的蛋白质相对应氨基酸序列的多肽，例如，不赋予本文所述或所注释或对如表II第3栏所示序列已知的活性且源于相同或不同生物的蛋白质。一个实施方案中，非表II第5或7栏所示的“非本发明的多肽”或“其他多肽”不赋予生物或其部分中氮或含氮化合物的增加。 
[00315.0.0.1]在融合蛋白中，术语“有效连接”旨在指本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽和“其他多肽”或其部分彼此融合，使得两个序列都发挥对所使用序列期望的预期功能。可以将“其他多肽”融合于本发明的或本发明方法中使用的多肽的N-端或C-端。例如，一个实施方案中，融合蛋白为GST-LMRP融合蛋白，其中本发明的多肽或本发明方 法中使用的多肽的序列与GST序列的C-端融合。这样的融合蛋白可以促进本发明重组多肽或本发明方法中使用的多肽的纯化。 
另一个实施方案中，融合蛋白为N-端含有异源信号序列的本发明多肽或本发明方法中使用的多肽。某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，可以通过使用异源信号序列来增加本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽的表达和/或分泌。如上文已述，靶向性序列对基因产物靶向特异细胞区室是必须的(可参阅Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)285-423的综述及其引用的参考文献)，所述细胞区室例如液泡、细胞核、所有类型的质体(如造粉体、叶绿体、色质体)、胞外空间、线粒体、内质网、油质体、过氧化物酶体、酵解酶体和细胞中的其他区室或胞外。本文必须提到的序列特别为本身已知的信号肽或转运肽编码序列。例如质体转运肽编码序列能将表达产物靶向植物细胞的质体中。还已知真核生物的靶向性序列和较少量的原核生物的靶向性序列并且其可以有利地与本发明的核酸分子有效连接以实现在所述区室之一或胞外表达。因此，本发明多肽的一个优选实施方案中，具体地，包含如表II第5或7栏所示序列的多肽与质体靶向性序列“有效连接”产生功能性融合蛋白，该靶向性序列能够将融合蛋白靶向质体区室并且介导本发明多肽的输入，特别地介导包含如表II第5或7栏所示序列的多肽向质体区室的输入。 
[00316.0.0.1]优选地，通过标准重组DNA技术产生本发明的嵌合或融合蛋白。例如，按照常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段按阅读框架地连接在一起，例如通过使用平末端或粘末端用于连接、限制性内切酶消化以提供合适的末端、适当补平粘性末端、碱性磷酸酶处理以防止非预期的连接和酶连接。可以通过常规技术包括自动化DNA合成仪合成融合基因。或者，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，这产生两个相连基因片段之间可以随后退火并再扩增以产生嵌合基因序列的互补突出端(参见例如Current Protocols in Molecular Biology， Ausubel等人编，John Wiley & Sons：1992)。此外，市售许多已经编码融合部分(例如GST多肽)的表达载体。可以将本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子克隆进此种表达载体从而将融合部分与编码的蛋白质按阅读框架地连接。 
[00317.0.0.1]此外，可以使用合适的计算机程序执行本发明蛋白质的结构化模体的折叠模拟和计算机重新设计(Olszewski，Proteins 25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.11(1995)，675-679)。可以使用蛋白质折叠的计算机模拟进行详细的肽和蛋白质模型的构象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。可以使用合适的程序通过计算机协助检索互补肽序列来鉴定本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽与其底物或结合因子或其他相互作用蛋白质之间的相互作用位点(Fassina，Immunomethods(1994)，114-120)。其他用于设计蛋白质和肽的合适计算机系统描述于现有技术，例如在Berry，Biochem.Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann.N.Y.Acad.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry 25(1986)，5987-5991中。上述计算机分析获得的结果可以用于例如制备本发明的蛋白质或其片段的肽模拟物(peptidomimetics)。该蛋白质天然氨基酸序列的拟肽类似物可以非常有效地模拟亲本蛋白质(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，将容易获得的非手性Q氨基酸残基整合到本发明的蛋白质或其片段中导致胺键由脂肪族链的聚亚甲基单元取代，从而提供构建肽模拟物的方便策略(Banerjee，Biopolymers 39(1996)，769-777)。 
[00318.0.0.1]其他系统中的小肽激素强效模拟肽类似物描述于现有技术(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)。也可以通过经由连续的胺烷化而合成肽模拟物组合文库并检测产生的化合物(例如它们的结合和免疫性质)来鉴定本发明蛋白质合适的肽模拟物。肽模拟物组合文库的产生方法及其用途描述于现有技术，例 如Ostresh，Methods in Enzymology 267(1996)，220-234和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715。 
[00319.0.0.1]此外，可以使用本发明蛋白质的三维和/或晶体结构来设计本发明蛋白质的生物活性的肽模拟物抑制剂(Rose，Biochemistry35(1996)，12933-12944；Rutenber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。 
[00320.0.0.1]此外，可使用本发明蛋白质的三维和/或晶体结构和鉴定的本发明多肽或本发明方法中使用的多肽与其底物或结合因子相互作用位点来鉴定或设计具有调节的结合或转换活性的突变体。例如，可以调节本发明多肽的活性中心和调节参与催化反应的氨基酸残基以增加或减少底物结合而激活或改进多肽。活性中心和催化反应相关氨基酸的鉴定促进筛选具有活性增加的突变体。 
[00321.0.0.1]本文示出的序列也以表I、II、III或IV，第3栏所述的其蛋白质名称描述。 
[00322.0.0.1]特别优选的实施方案中，本发明的多肽也不具有由表II的第5或7栏所示序列编码的那些蛋白质的序列。 
[00323.0.0.1]本发明的一个实施方案也涉及抗体，其特异地结合本发明的多肽或其部分，即该蛋白质的特异片段或表位。 
[00324.0.0.1]可以使用本发明的抗体在任何生物(优选植物)中鉴定并分离在本文所述植物中制备的本发明的多肽和编码基因。这些抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或合成抗体以及抗体片段，如Fab、Fv或scFv片段等。可以通过最初描述于
Figure G2007800201189D0113090223QIETU
和Milstein，Nature 256(1975)，495以及Galfr6，Meth.Enzymol.73(1981)，3的技术制备单克隆抗体，其包括小鼠骨髓瘤细胞与源自免疫哺乳动物的脾细胞的融合。 
[00325.0.0.1]此外，可以通过使用例如Harlow和Lane“Antibodies，A Laboratory Manual”，CSH Press，Cold Spring Harbor， 1988中所述的方法获得前述肽的抗体或其片段。可以使用该抗体进行本发明蛋白质的免疫沉淀和免疫定位以及监测该蛋白质(例如在重组生物中)的合成，及鉴定与本发明蛋白质相互作用的化合物。例如可以使用BIAcore系统中所用的表面等离子共振来增加噬菌体抗体选择效率，产生亲和力剧增的结合本发明蛋白质表位的噬菌体抗体单一文库(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。在许多情况下，抗体与抗原的结合现象与其他的配体/抗配体结合是等效的。 
[00326.0.0.1]一个实施方案中，本发明涉及包括本发明核酸分子的互补序列的反义核酸分子。 
[00327.0.0.1]改变表达水平和/或活性的方法为本领域技术人员已知，并包括例如过表达、共抑制、使用核酶、正义和反义策略或其他基因沉默方法，如RNA干扰(RNAi)或启动子甲基化。“正义链”指双链DNA分子中与其mRNA转录物同源的链。“反义链”包含与“正义链”互补的倒转序列。 
另外，可以通过在本发明核酸分子的调控或编码区引入突变来改变表达水平和/或活性。此外，可以表达特异结合目的多肽并因此阻断其活性的抗体。蛋白质结合因子可以是例如适配体(Famulok M和Mayer G(1999)Curr Top Microbiol.Immunol.243：123-36)或抗体或抗体片段或单链抗体。已对获得这些因子的方式有所描述并且是熟练技术人员熟知的。例如，已利用细胞质scFv抗体在经遗传修饰的烟草植物中调节植物色素A蛋白质的活性(Owen M等人(1992)Biotechnology(NY)10(7)：790-794；Franken E等人(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8(4)：411-416；Whitelam(1996)Trend Plant Sci.1：286-272)。本发明进一步优选的实施方案中，通过内部调节物的修饰可以改变表达水平和/或活性。本领域技术人员了解可以用于修饰本发明基因或蛋白质的表达水平的内部调节物的不同选择。示例性实施方案中，负转录调节物 (例如本发明核酸的阻遏物)例如通过反义或RNAi抑制而被抑制或敲除，导致本发明核酸增强的表达。类似地，可以通过突变或反义或RNAi抑制对本发明蛋白质的别构抑制剂进行下调。 
[00328.0.0.1]“反义”核酸分子包括与编码蛋白质的“正义”核酸分子互补的核苷酸序列，例如与双链cDNA分子编码链互补或与编码mRNA序列互补。因此，反义核酸分子可以通过氢键与正义核酸分子结合。反义核酸分子可以与调控或表达本发明多肽或本发明方法中所使用多肽的核酸分子的整个编码链(如本发明核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子编码链)互补，或只与其部分互补。 
[00329.0.0.1]％ 
[00330.0.0.1]％ 
[00331.0.0.1]％ 
[00332.0.0.1]％ 
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[00350.0.0.1]％ 
[00351.0.0.1]％. 
[00352.0.0.1]％. 
[00353.0.0.1]本发明的另一个实施方案还涉及产生转基因宿主或宿主细胞(例如真核或原核细胞，优选转基因微生物、转基因植物细胞或转基因植物组织或转基因植物)的方法，其包括向植物、植物细胞或植物组织中导入本发明的核酸构建体、本发明的载体或本发明的核酸分子。 
[00354.0.0.1]本发明的另一个实施方案还涉及瞬时产生转基因宿主或宿主细胞，真核或原核细胞(优选转基因微生物、转基因植物细胞或转基因植物组织或转基因植物)的方法，其包括向植物、植物细胞或植物组织中导入根据本发明的核酸构建体、根据本发明的载体或本文表征的包含在本发明核酸构建体或者本发明的核酸分子中的核酸分子，其中导入的核酸分子、核酸构建体和/或载体不整合进宿主或宿主细胞的基因组中。因此在宿主繁殖中，就导入的核酸分子、核酸构建体和/或载体而言转化体是不稳定的。 
[00355.0.0.1]本发明的方法中，如果转基因生物采用植物形式，则还可理解为是生长以提高氮同化、累积和/或利用的植物细胞、植物组织、植物器官例如根、新枝、茎、种子、花、块根或叶，或整株植物。 
[00356.0.0.1]生长应理解为指例如在营养物培养基上或中培养转基因植物细胞、植物组织或植物器官，或在基质上或中(例如水培、盆栽培养料)或大田土壤上培养整株植物。一个具体实施方案中，生长指转基因植物、植物细胞、植物组织在氮受限条件下生长。 
[00357.0.0.1]本方法另一个有利实施方案中，可以在诸如藻类的 单细胞的植物细胞(参见Falciatore等人，1999，Marine Biotechnology 1(3)：239-251及其中引文)和在高等植物的植物细胞(例如种子植物例如作物)中表达核酸分子。植物表达载体的实例包括本文详述的或Becker，D.[(1992)Plant Mol.Biol.20：1195-1197]和Bevan，M.W.[(1984)，Nucl.Acids Res.12：8711-8721；Vectors for Gene Transfer inHigher Plants；出自Transgenic Plants，卷1，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编，Academic Press，1993，第15-38页]中的那些。二元载体及其用途的综述见Hellens，R.[(2000)，Trends in Plant Science，卷5No.10，446-451。 
[00358.0.0.1]本发明的一个实施方案中，植物表达载体包含附图(图1和/或图2)中描述的那些。 
[00359.0.0.1]可以通过常规转化或转染技术将载体DNA导入原核或真核细胞。术语“转化”和“转染”包括结合和转导，并如本发明文中所用旨在包含多种用于向宿主细胞中导入外源核酸分子(例如DNA)的现有方法，包括磷酸钙共沉淀或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、PEG介导的转染、脂质转染法、天然感受态、化学方法介导的转移、电穿孔法或粒子轰击。适合用于转化宿主细胞包括植物细胞的方法可以见于Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989)以及其他实验室手册，例如Methods in Molecular Biology，1995，卷44，Agrobacterium protocols，Gartland和Davey编，Humana Press，Totowa，New Jersey。 
[00360.0.0.1]开发上述用于转化及从植物组织或植物细胞再生植株的方法用于瞬时或稳定转化植物。合适的方法是通过聚乙二醇诱导的DNA摄取的原生质体转化、使用基因枪的生物射弹方法—也被称作微粒轰击法、电穿孔、在DNA溶液中孵育干胚、微注射和农杆菌属物种介导的基因转移。上述方法描述于例如B.Jenes等人，Techniques for Gene Transfer，出自Transgenic Plants，第一卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编，Academic Press(1993)128-143和Potrykus Annu.Rev.Plant Physio.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225。待表达的构建体优选克隆到适合转化根癌农杆菌的载体中，例如pBinl9(Bevan等人，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。随后转化了这一载体的农杆菌可以用于按已知方式转化植物特别是作物植物，如烟草植物，例如将有划痕的叶片或叶片节段浸泡在农杆菌溶液中，随后在合适的培养基中培养它们。依靠根癌农杆菌的植物转化由例如和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述，或此外公知于F.F.White，Vectors forGene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编，Academic Press，1993，15-38页。 
[00361.0.0.1]为选择本发明成功转移至宿主生物的本发明核酸分子、载体或核酸构建体，使用上文已详细描述的标记基因是有利的。已知在核酸分子稳定或瞬时整合进植物细胞时，只有少数细胞摄取外源DNA并整合进其基因组(如果需要的话)，这取决于所用表达载体和所用转染技术。为鉴定和选择这些整合体，通常将编码可选择标记(如上文所述，例如抗生素抗性)的基因与目的基因一起导入宿主细胞。植物中优选的选择标记包括赋予抗除草剂(例如草甘磷或gluphosinate)抗性的标记。其他合适的标记例如编码糖或氨基酸(如β-半乳糖苷酶、ura3或ilv2)生物合成途径相关基因或突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)基因(也被称作乙酰乳酸合酶(ALS)基因或用于D-氨基酸代谢酶的基因的标记。编码诸如荧光素酶、gfp或其他荧光基因的标记同样是合适的。其他在文献中命名的标记有时作为第二标记，编码抗除草剂抗性的基因，例如草胺膦(＝草铵膦(glufosinate)，BASTATM，LibertyTM，由bar基因编码)，草甘膦(＝N-(磷酰基甲基)甘氨酸，Roundup ReadyTM，由5-烯醇式丙酮基莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶基因＝epsps编 码)，磺酰脲类(＝StapleTM，由乙酰乳酸合酶基因编码)，咪唑啉酮[＝IMI，咪草烟，甲氧咪草烟(imazamox)，ClearfieldTM，由乙酰羟酸合酶(AHAS)基因编码，也被称作乙酰乳酸合酶(ALS)基因]或溴苯腈(＝BuctrilTM，由oxy基因编码)或编码诸如潮霉素或G418抗生素的基因也用于选择。此外，负选择标记例如细菌胞嘧啶脱氨酶(由codA基因编码)也用于质体转化。 
这些标记和上述标记可以用于突变体，这些基因在所述突变体中由于例如通过常规方法被缺失而没有功能。另外，编码可选择标记的核酸分子可以与编码本发明多肽或本方法所使用多肽的核酸分子在同一载体中导入宿主细胞或者在单独的载体中导入。例如可以通过选择鉴定稳定转染了所导入核酸的细胞(例如整合了可选择标记的细胞存活而其他细胞死亡)。 
[00362.0.0.1]由于一旦核酸成功导入转基因宿主细胞就不再需要或不希望有标记基因(通常特别是对抗生素和除草剂抗性的基因)，因此用于导入核酸的本发明方法有利地使用能够去除或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法被称作共转化。共转化方法同时使用两个载体进行转化，一个带有本发明的核酸，而第二个带有标记基因。大部分的转化体接受(和在植物情况下)包括全部两个载体(至多40％的转化体以及以上)。在农杆菌转化的情况下，转化体通常只接受部分载体，即通常代表表达盒的侧翼为T-DNA的序列。随后可以通过杂交从转化植物中去除标记基因。另一种方法中，整合进转座子的标记基因用于与所需核酸一起转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶资源杂交，或者用赋予转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定转化转化体。在某些情况下(约10％)，一旦成功发生转化后转座子就跳出宿主细胞基因组并丢失。在另外一些情况下，转座子跳跃到不同的位置。在这些情况下，必须通过杂交消除标记基因。在微生物学中发展了使检测这些事件成为可能或更容易的方法。另一种有利的方法依赖于已知的重组系统，其优越 性为可以省却杂交消除。该类型已知最好的系统为已知的Cre/lox系统。Cre1是去除位于loxP序列之间序列的重组酶。如果标记基因整合到loxP序列之间，它在成功转化后通过表达重组酶而被去除。其他重组系统为HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等人，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等人，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。可以将本发明的核酸序列定点地整合进植物基因组中。当然，这些方法也可以用于微生物，例如酵母、真菌或细菌。 
[00363.0.0.1]转化了本发明表达载体的农杆菌同样可以已知方式(例如有划痕的叶片或叶片节段浸泡在农杆菌溶液中，随后在合适的培养基中培养)用于植物转化，例如试验植物，例如鼠耳芥属植物或作物，如谷类、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、卡诺拉、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡萝卜、辣椒、油籽油菜、树薯、木薯、葛、万寿菊、苜蓿、莴苣以及多种树木、坚果和藤本物种，尤其是含油作物，如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油籽油菜、棉花、椰子、油棕榈、红花或可可豆。 
[00364.0.0.1]除了体细胞转化(必须再生为完整植物的)以外，还可以转化植物分生组织细胞，尤其是发育为配子的细胞。在该情况下，转化的配子遵循天然植物发育产生转基因植物。因此，例如用农杆菌处理鼠耳芥属植物的种子并从一定比例的发育植物被转化并因此成为转基因的获得种子(Feldman，KA和Marks MD(1987).Mol GenGenet 208：274-289；Feldmann K(1992).出自C Koncz，N-H Chua和JShell编，Methods in Arabidopsis Research.，Word Scientific，Singapore，274-289页)。替代方法基于重复去除花序(influorescences)和用转化的农杆菌在盒中孵育切除位点，由此转化的种子同样可以在之后的时间点获得(Chang(1994).Plant J.5：551-558；Katavic(1994).Mol GenGenet，245：363-370)。然而，特别有效的方法为真空渗透方法及其改进 的方法，如“花浸入”方法。在真空渗透鼠耳芥属植物的情况下，用农杆菌悬浊液处理低压下的完整植物(Bechthold，N(1993).C R Acad SciParis Life Sci，316：1194-1199)，而在“花浸入”方法的情况中，发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬浊液一起短时孵育(Clough，SJ undBent，AF(1998).The Plant J.16，735-743)。一定比例的转基因种子在两种情况中都可以收获，通过在前述选择条件下培育，可以将这些种子从非转基因种子中区分。另外稳定转化质体是有利的，因为质体在多数作物中是母系遗传的，这减少或消除了通过花粉的转基因外流危险。一般通过Klaus等，2004(Nature Biotechnology 22(2)，225-229)中图示展示的方法完成叶绿体基因组的转化。简言之，将待转化的序列和与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间的选择标记基因一起克隆。这些同源侧翼序列指导定点整合至原质体系中。已经描述了许多不同植物物种的质体转化，综述可以得自Bock(2001)Transgenic plastids in basicresearch and plant biotechnology.J Mol Biol.2001 Sep 21；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)Progress towards commercialization ofplastid transformation technology.Trends Biotechnol.21，20-28。最近已经报导了无标记质体转化体形式的其他生物技术进展，所述转化体可以通过瞬时共整合标记基因而产生(Klaus等人，2004，NatureBiotechnology 22(2)，225-229)。 
[00365.0.0.1]经遗传修饰的植物细胞可以通过本领域技术人员熟悉的所有方法再生。适当的方法可以见于前述S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或
Figure 2007800201189100002G2007800201189D0118090433QIETU
和Willmitzer的文献。 
[00366.0.0.1]因此，本发明也涉及一种植物细胞，其包括本发明的核酸构建体、本发明的核酸分子或本发明的载体。 
[00367.0.0.1]因此，本发明涉及用于任何作为本发明部分而被表征的核酸进行转基因的细胞，所述核酸例如赋予细胞或生物或其部分中氮或含氮化合物的增加，例如本发明的核酸分子或本发明方法中使用的 核酸分子、本发明的核酸构建体、本发明的反义分子、本发明的载体或编码本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽(例如如表II第5或7栏所示)的核酸分子。由于上述活性，细胞或生物中的氮或含氮化合物含量增加。例如，由于调控或操作，本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽或本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子的细胞活性增加，例如由于细胞或生物或其部分中本发明主题增加的表达或比活性。一个实施方案中，本文中具有如表II第5或7栏所示多肽活性的多肽的转基因指由于基因组的调控或操作，细胞或生物或其部分中如表II第3栏所示多肽(例如具有如表II第5或7栏所示序列)的所注释活性增加。实例在上文本发明方法中描述。 
[00368.0.0.1]“转基因”(例如关于含有所述核酸分子的核酸分子、核酸构建体或载体或用所述核酸分子、核酸构建体或载体转化的生物)指通过重组方法产生的所有对象，其中 
a)核酸序列，或 
b)与该核酸序列有效连接的遗传调控序列，例如启动子，或 
c)(a)和(b) 
不位于其天然遗传环境中或通过重组方法被修饰，修饰的实例为替换、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基。天然遗传环境指原始生物中的天然染色体基因座或基因组文库中的存在形式。在基因组文库的情况下，优选至少保留核酸序列天然遗传环境的一部分。环境至少位于核酸序列的一侧并且具有至少50bp的序列长度，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，非常特别优选至少5000bp。 
[00369.0.0.1]当通过非天然的合成的“人工”方法(如诱变)进行修饰后，天然存在的表达盒——例如天然存在的本发明多肽的启动子与相应蛋白质编码序列的组合——成为转基因表达盒。这些方法已描述于(US 5,565,350；WO 00/15815；也见上文)。 
[00370.0.0.1]此外，也可以转化植物细胞、植物组织或植物以便 (过)表达其它酶和蛋白质，该表达支持氮或含氮化合物的增加。 
[00371.0.0.1]然而，转基因还指本发明的核酸位于其在生物基因组中的天然位置上，但是与天然序列相比序列已被修饰和/或天然序列的调控序列已被修饰。优选地，转基因/重组还应理解为本发明方法中使用的核酸的转录发生于基因组的非天然位置，也就是说核酸的表达是同源的，或优选异源的。该表达可以是瞬时的，或是稳定整合进基因组的序列。 
[00372.0.0.1]本发明使用的术语“转基因植物”还涉及转基因植物的后代，例如T1、T2、T3和后续植物世代或BC1、BC2、BC3和后续植物世代。因此，本发明的转基因植物可以被栽培并自交或与其他个体杂交以获得其它本发明的转基因植物。转基因植物还可通过无性繁殖转基因植物细胞来获得。本发明还涉及可来自本发明的转基因植物种群的转基因植物材料。该材料包括植物细胞和其所有表现形式的某些组织、器官和植物部分，例如种子、叶、花药、纤维、块茎、根、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶(cotelydon)、叶柄、收获的材料、植物组织、繁殖组织和来自真实的转基因植物和/或可以用于产生转基因植物的细胞培养物。 
[00373.0.0.1]任何根据本发明获得的转化植物可以用于传统的育种方案中或体外植物繁殖以产生更多的具有相同特性的转化植物和/或可用于向相同或相关物种的其他变种中引入相同特性。这样的植物也是本发明的一部分。从转化植物获得的种子遗传上也含有相同的特性并属于本发明的一部分。如前所述，本发明原则上适用于任何植物和作物，所述植物和作物可以本领域技术人员已知的任何转化方法转化。 
[00374.0.0.1]特别优选的实施方案中，根据本发明的生物、宿主细胞、植物细胞、植物、微生物或植物组织是转基因的。 
[00375.0.0.1]因此，本发明涉及转化了至少一种根据本发明的核酸分子、核酸构建体或载体的转基因生物及细胞、细胞培养物、组织、 部分(例如就植物生物而言的植物组织，如叶、根等)或来自这些生物或完整植物的繁殖材料。术语“重组(宿主)”和“转基因(宿主)”在上下文中可互换使用。当然，这些术语不仅涉及所述的宿主生物或靶细胞，而且涉及这些生物或细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响在后续的世代中可能形成某些修饰，使得这些后代不一定与亲本细胞完全相同，但其仍属于本文使用的术语范围内。 
[00376.0.0.1]适合用于根据本发明方法或作为宿主的生物为所有能够各自累积或同化氮或含氮化合物的真核或原核生物。用作宿主的生物为微生物(例如细菌、真菌、酵母或藻类)、非人类动物或植物(例如双子叶或单子叶植物)。 
[00377.0.0.1]原则上，所有的植物可用作宿主生物，特别是上述作为来源生物体的植物。优选的转基因植物为例如选自槭树科、漆树科、伞形科、菊科、十字花科、仙人掌科、葫芦科、大戟科、豆科、锦葵科、睡莲科、罂粟科、蔷薇科、杨柳科、茄科、棕榈科、凤梨科、莎草科、鸢尾科、百合科、兰科、龙胆科、唇形科、木兰科、毛莨科、Carifolaceae、茜草科、玄参科、石竹科、杜鹃花科、蓼科、堇菜科、灯心草科或禾本科等科的植物且优选来自于选自伞形科、菊科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科等科的植物。作物植物优选，例如有利地选自花生、油籽油菜、卡诺拉(canola)、向日葵、红花、橄榄、芝麻、榛子、almond、鳄梨、月桂、西葫芦/南瓜、亚麻子、大豆、阿月浑子、琉璃苣、玉米、小麦、黑麦、燕麦、高梁和黍、黑小麦、稻、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、茄子、紫苜蓿和多年生草本及饲料植物、油椰、蔬菜(芸苔、根类蔬菜、块茎类蔬菜、豆荚类蔬菜、果实类蔬菜、葱蒜类蔬菜、叶类蔬菜和茎类蔬菜)、荞麦(buckwheat)、Jerusalem artichoke、蚕豆、vetches、扁豆、dwarf bean、羽扇豆、三叶草和苜蓿属的植物，提到的只是其中一部分。
[00378.0.0.1]优选的植物细胞、植物器官、植物组织或植物部分来源于所提到的植物科的下面来源生物，优选来自上述植物属，更优选来自上述植物种。 
[00379.0.0.1]本发明方法中合成的含有氮或者含氮化合物(例如氨基酸或者蛋白质)的转基因植物可直接推向市场，而不需要分离合成的化合物。在本发明方法中，植物应理解为所有植物部分、植物器官，例如叶、茎、根、块根或种子或繁殖材料或收获材料或完整植株。在本文中，种子包括种子的所有部分，例如种皮、表皮细胞、种子细胞、胚乳或胚组织。然而，本发明方法中积累的或者同化的氮还可从植物中以其游离氨基酸或结合在蛋白质中的形式而分离。通过该方法产生的氨基酸可通过从生物生长的培养物中或田间收集生物而收集。这可通过植物部分(优选植物种子、植物果实、植物块根等)的表达、研磨和/或抽提、盐沉淀和/或离子交换层析来实现。 
[00380.0.0.1]另一方面，本发明还涉及本发明转基因植物的可收获部分和繁殖材料，其含有表达本发明核酸分子的转基因植物细胞或含有显示本发明多肽或本发明方法中所使用多肽的增加的细胞活性(例如所述蛋白质的增加的表达水平或更高的活性)的细胞。 
[00381.0.0.1]原则上，可收获部分可以是植物的任何有用部分，例如花、花粉、苗、块茎、叶、茎、果实、种子、根等。繁殖材料包括例如种子、果实、切枝、苗、块茎、根状茎等。可收获部分或繁殖材料优选种子、果实、苗或块茎。 
[00382.0.0.1]本发明还涉及本发明转基因生物和细胞、细胞培养物、来自它们的部分(例如如上所述转基因植物生物的根、叶等)的应用，以及涉及用于生产食物或饲料、药物或精细化学品(优选饲料)的如上所述转基因繁殖材料例如种子或果实等。 
[00383.0.0.1]因此另一个实施方案中，本发明涉及核酸分子、生物(例如微生物、植物、植物细胞或植物组织)、载体或本发明多肽用 于制造脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、脂质、蜡酯、(多)糖和/或多羟基脂肪酸酯，和/或其代谢产物，尤其是类固醇激素、胆固醇、前列腺素、三酰甘油、胆汁酸和/或产生细胞、组织和/或植物的酮体)的用途。大量机制影响脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、蜡酯、脂质、(多)糖和/或多羟基脂肪酸酯，和/或其代谢产物，尤其是类固醇激素、胆固醇、三酰甘油、前列腺素、胆汁酸和/或酮体或其他上述结合这类改变蛋白质的精细化学品的产率、产量和/或生产效率。在植物情况下，通过例如增加许多产物的底物(例如细胞中脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、脂质、蜡酯、(多)糖和/或多聚羟基脂肪酸酯，和/或其代谢产物尤其是前列腺素、类固醇激素、胆固醇、三酰甘油、胆汁酸和/或酮体)乙酰辅酶A的表达，可能增加产生的所述化合物的数量从而允许收获和纯化的大幅简化或植物情况下更有效的划分。此外，一个或更多所述代谢产物，辅助因子、前体分子和适当生物合成途径的中间化合物数量的增加可能是必需的。因此，通过增加与重要营养物例如碳源(即糖)、氮源(即氨基酸、铵盐)、磷酸盐和硫输入相关的转运蛋白的数量和/或活性，可能由于移除了任何生物合成方法上的营养物供给限制而改善乙酰辅酶A及其上述代谢产物的产生。尤其是，可能增加所述化合物(例如脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、蜡酯、脂质、(多)糖和/或多聚羟基脂肪酸酯，和/或其代谢产物特别是类固醇激素、胆固醇、前列腺素、三酰甘油、胆汁酸和/或酮体分子等)在植物中的产率、产量和/或生产效率。 
[00384.0.0.1]生物(优选本发明植物)显示出甚至在氮受限条件下提高的氮同化、累积和/或利用。结果是生物(优选本发明的植物)也显示出提高的生长、生物量和/或产率，优选在氮受限条件下。
[00385.0.0.1]一个实施方案中，本发明涉及鉴定赋予生物中提高的氮同化、累积和/或利用的基因产物的方法，包括下述步骤： 
[00386.0.0.1]将样品(例如细胞、组织、植物或微生物或核酸文 库)的核酸分子与本发明的核酸分子接触(例如杂交)，该样品可以含有编码在表达后赋予提高的氮同化、累积和/或利用的基因产物的候选基因； 
[00387.0.0.1]鉴定在松弛严谨性条件下与本发明的核酸分子，尤其是与如表I第5或7栏，优选表IB第5或7栏所示核酸分子序列杂交的核酸分子，任选地，分离全长cDNA克隆或完整基因组克隆； 
[00388.0.0.1]将候选核酸分子导入适合提高的氮同化、累积和/或利用的宿主细胞，优选植物细胞或微生物； 
a)在宿主细胞中表达经鉴定的核酸分子； 
b)测定宿主细胞中提高的氮同化、累积和/或利用的水平；和 
c)鉴定核酸分子及其基因产物，与野生型相比其表达赋予表达后宿主细胞中氮同化、累积和/或利用的提高。 
[00389.0.0.1]松弛杂交条件为：标准杂交操作后，可在低至中度严谨性条件下进行洗涤步骤，相对于例如60℃-68℃使用0.1％ SDS的严谨洗涤条件，通常使用40℃-55℃和含有0.1％ SDS的2xSSC和0.2xSSC之间的盐条件的洗涤条件。其他严谨性杂交条件实例可见于上列参考文献。通常洗涤步骤以增加的严谨度和长度重复，直到检测到有用的信号噪声比并依赖于许多因素，如靶标(例如其纯度、GC含量、大小等)、探针(例如其长度、是RNA还是DNA探针)、盐条件、洗涤或杂交温度、洗涤或杂交时间等。 
[00390.0.0.1]另一个实施方案中，本发明涉及鉴定赋予生物中提高的氮同化、累积和/或利用的基因产物的方法，其包括下列步骤： 
[00391.0.0.1]例如通过在数据库中进行同源性检索，鉴定生物的核酸分子；所述生物可以含有编码在表达后赋予提高的氮同化、累积和/或利用的基因产物的候选基因，该基因与本发明核酸分子至少20％，优选25％，更优选30％，甚至更优选35％、40％或50％，甚至更优选60％、70％或80％，最优选90％或95％或更高的同源性；
[00392.0.0.1]将候选核酸分子导入适于氮同化、累积和/或利用提高的宿主细胞，优选植物细胞或微生物中； 
a)在宿主细胞中表达鉴定的核酸分子； 
b)测定宿主细胞中提高的氮同化、累积和/或利用的水平；和 
c)鉴定核酸分子及其基因产物，与野生型相比其表达赋予表达后宿主细胞中氮同化、累积和/或利用的提高。 
最终也可以根据步骤(a)的相同或相似3D结构或通过上述方法鉴定赋予提高的氮同化、累积和/或利用增加的基因产物。 
[00393.0.0.1]所鉴定的核酸分子可以然后以与本发明的核酸分子相同的方式用于生产具有提高的氮同化、累积和/或利用的产物或生物。 
[00394.0.0.1]因此，一个实施方案中，本发明涉及各自累积或产生氮或含氮化合物的方法，包括(a)根据前述步骤(a)-(f)或(a)-(e)鉴定核酸分子并从生物中回收游离的或结合的含氮化合物，尤其是蛋白质，该生物与野生型相比具有由分离的核酸分子所编码多肽的增加的细胞活性。 
[00395.0.0.1]另外，一个实施方案中，本发明涉及鉴定刺激所述植物提高氮同化、累积和/或利用的化合物的方法，其包括： 
a)将表达本发明多肽或其mRNA的细胞与候选化合物在细胞培养条件下接触； 
b)测定所述多肽或所述mRNA表达的增加 
c)与无所述候选化合物时产生的标准反应比较表达水平；由此，比标准增加的表达则表明该化合物刺激氮同化、累积和/或利用的提高。 
[00396.0.0.1]此外一个实施方案中，本发明涉及筛选本发明多肽或本发明方法中所使用多肽的活性的激动剂或拮抗剂的方法，其包括： 
a)在允许本发明或本发明方法中使用的多肽表达的条件下，将表达根据本发明多肽的细胞、组织、植物或微生物与候选化合物或包括 多种化合物的样品接触； 
b)测定细胞、组织、植物或微生物或培养或保持细胞、组织、植物或微生物的培养基中提高的氮同化、累积和/或利用水平或者多肽表达水平；并 
c)通过将测量的氮同化、累积和/或利用水平或者本发明的或本发明中使用的多肽表达水平与无所述候选化合物或包括所述多种化合物的样品时测量的标准氮同化、累积和/或利用水平或者多肽表达水平比较来鉴定激动剂或拮抗剂；由此比标准水平增加则说明该化合物或包括所述多种化合物的样品为激动剂，而比标准水平减少则说明该化合物或包含所述多种化合物的样品为拮抗剂。 
[00397.0.0.1]此外，一个实施方案中，本发明涉及鉴定赋予植物或微生物中提高的氮同化、累积和/或利用的化合物的方法，其包括步骤： 
a)在适当条件下培养细胞或组织或微生物或者保持植物，这些细胞或组织或微生物或植物表达本发明多肽或编码所述多肽的核酸分子以及能够同多肽相互作用的读出系统，所述适当条件在化合物或包括多种化合物的样品存在下允许所述读出系统与多肽相互作用，并在允许所述读出系统和本发明的或本发明方法中使用的多肽表达的条件下能够提供应答化合物与所述多肽结合的可检测信号；和 
b)通过检测所述读出系统产生信号的存在或不存在或增加来鉴定化合物是否为有效的激动剂。 
[00398.0.0.1]可以通过在存在降低生长量的氮或含氮化合物各自累积或合成抑制剂下培养生物(例如微生物)，从而筛选赋予氮或含氮化合物生产增加的基因产物或激动剂。与对照相比，在这些条件下较好的生长(例如较高的分生率或高干物质)将鉴定出赋予氮同化、累积和/或利用提高的基因或基因产物或激动剂。 
[00399.0.0.1]可以设想通过例如寻找对阻断氮或含氮化合物合成 的药物抗性并观察该效应是否依赖于如表II第5或7栏所示多肽或其同源物的活性或表达(例如在用药物培养后与具有低和高的表II第5或7栏所示蛋白质活性几乎相同的生物的表型比较)来筛选提高的氮同化、累积和/或利用。 
[00400.0.0.1]所述化合物可能是化学合成的或微生物产生的和/或包括在来自例如植物、动物或微生物(如病原体)的样品(如细胞提取物)中。此外，所述化合物可能是本领域已知的，但迄今尚不了解其能够抑制或活化本发明多肽。反应混合物可能是不含细胞的提取物或者可能包括细胞或组织培养物。本发明方法合适的设置为本领域技术人员已知，并例如一般描述于Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，第三版(1994)，特别是17章。该化合物可例如加入反应混合物、培养基中、注射进细胞中或喷撒到植物上。 
[00401.0.0.1]如果在本发明方法中鉴定了含有化合物的样品，则可以从鉴定为含有能够活化或增加生物或其部分中氮或含氮化合物含量的化合物的原始样品中分离该化合物，或者可以进一步细分原始样品(例如如果由多种不同化合物组成)以降低每个样品中不同物质的数量，并重复原始样品的细分方法。根据样品的复杂性，可以进行上述步骤若干次，优选直至根据本发明的方法所鉴定的样品只包括有限的几种或一种物质。优选地，所述样品包括化学和/或物理特性类似的物质，并最优选所述物质是相同的。优选地，以适合植物育种或植物细胞或组织培养应用的形式进一步制备根据上述方法鉴定的化合物或其衍生物。 
[00402.0.0.1]可以由本发明方法测试和鉴定的化合物可能是表达文库(例如cDNA表达文库)、肽、蛋白质、核酸、抗体、小有机化合物、激素、肽模拟物、PNA等(Milner，Nature Medicine 1(1995)，879-880；Hupp，Cell 83(1995)，237-245；Gibbs，Cell 79(1994)，193-198及上文引用的参考文献)。所述化合物还可以是已知抑制剂或激活剂的功能型衍生物或类似物。制备化学衍生物和类似物的方法为本领域技术人员 所熟知，并描述于例如Beilstein，Handbook of Organic Chemistry，Springer edition New York Inc.，175 Fifth Avenue，New York，N.Y.10010U.S.A.和Organic Synthesis，Wiley，New York，USA。另外，可以根据本领域已知的方法测试所述衍生物和类似物的效果。另外，可以(例如根据上述方法)使用合适衍生物和类似物的肽模拟物和/或计算机辅助设计。本发明方法中使用的细胞或组织优选为上文实施方案中描述的本发明宿主细胞、植物或植物组织。 
[00403.0.0.1]因此，本发明另一个实施方案中涉及根据鉴定本发明激动剂的方法得到或鉴定的化合物，所述化合物为本发明的或本发明方法中使用的多肽的激动剂。 
[00404.0.0.1]因此，一个实施方案中，本发明还涉及由用于鉴定本发明化合物的方法所鉴定的化合物。 
[00405.0.0.1]所述化合物为例如本发明多肽的同源物。可以通过诱变，如不连续点突变或截短本发明多肽产生本发明多肽的同源物。本文使用的术语“同源物”指蛋白质的变体形式，所述变体发挥本发明多肽活性激动剂的作用。所述蛋白质的激动剂可以保留基本上相同的本发明多肽生物活性或是其子集。尤其是，所述激动剂赋予本发明的多肽表达水平增加和/或在生物或其部分中该激动剂的表达赋予生物或其部分中增加的氮同化，累积和/或利用。 
[00406.0.0.1]一个实施方案中，本发明涉及特异地识别本发明的化合物或激动剂的抗体。 
[00407.0.0.1]本发明也涉及一种诊断组合物，其包括前述核酸分子、载体、蛋白质、抗体中至少一种或本发明的化合物和任选地用于检测的适宜方法。 
[00408.0.0.1]本发明的诊断组合物适用于从细胞中分离mRNA和在杂交条件下用包括如上所述核酸探针的探针接触所得到的mRNA、检测与探针杂交mRNA的存在，并藉此检测细胞中蛋白质的表达。检测本 发明蛋白质存在的其他方法包括本领域所熟知的免疫技术，例如酶联免疫吸附测定。另外，还可以使用本发明的核酸分子作为植物育种中的分子标记或引物。适当的检测方法为本领域技术人员所公知，例如杂交测定的缓冲液和溶液(如前述的溶液和缓冲液)以及例如如Sambrook等人描述的用于Southern、Western、Northern等印迹的方法是公知的。 
[00409.0.0.1]另一个实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，该试剂盒包括核酸分子、载体、宿主细胞、多肽、反义核酸、抗体、植物细胞、植物或植物组织、可收获部分、繁殖材料和/或根据本发明的方法鉴定的化合物或激动剂或拮抗剂。 
[00410.0.0.1]本发明试剂盒的化合物可被(任选地与缓冲液和/或溶液一起或在缓冲液和/溶液中)包装在容器(如瓶)中。适当时，可以在同一个容器中包装一个或多个所述组分。除此以外(或另选的)，一个或多个所述组分可吸附到固体支持物(如硝化纤维素膜、玻璃平板、芯片或尼龙膜或微孔板的孔)中。该试剂盒可以用于任何本文描述的方法和实施方案，例如生产宿主细胞、转基因植物、药物组合物、检测同源序列、鉴定拮抗剂或激动剂，作为食品或饲料或作为其添加剂、作为植物处理的补充物等。 
[00411.0.0.1]另外，试剂盒可以包括将该试剂盒用于任何所述实施方案，尤其是用于产生具有提高的氮同化、累积和/或利用的生物或其部分的说明书。 
[00412.0.0.1]一个实施方案中，所述试剂盒还包括编码前述蛋白质中一种或多种的核酸分子、和/或抗体、载体、宿主细胞、反义核酸、植物细胞或植物组织或植物。 
[00413.0.0.1]另一个实施方案中，本发明涉及生产农业组合物的方法：提供核酸分子、载体或本发明多肽或本发明方法中所使用的多肽，或包括用于鉴定所述化合物、激动剂或拮抗剂的本发明方法的步骤；和配制核酸分子、载体或本发明多肽或本发明方法中所使用多肽或 激动剂，或根据本发明方法或工艺鉴定的化合物，或使用以可用作农业组合物的形式存在的本发明的主题。 
[00414.0.0.1]另一个实施方案中，本发明涉及生产“含氮化合物”(生产支持植物培养组合物)的方法，其包括本发明方法的步骤；和以可用于如农业组合物的形式配制鉴定的化合物。 
[00415.0.0.1]“可用于农业的组合物”应理解为这种组合物符合规定杀菌剂、植物营养物、除草剂等含量的法律。优选地，此种组合物对受保护的植物和饲以其的动物(包括人类)无任何损害。 
[00416.0.0.1]本发明还与涉及其他用途和方法的若干实施方案相关。本文所述的核酸分子、多肽、蛋白质同源物、融合蛋白、引物、载体、宿主细胞可以用于一个或多个以下方法：鉴定如前述可用于氮或含氮化合物生产的植物和相关生物；绘制基因组图；鉴定和定位目的序列；研究进化；确定功能所需区域；调控活性。 
[00417.0.0.1]本发明的核酸分子具有多种用途。首先，它们可用于鉴定生物或其近亲。此外，它们可用于鉴定微生物或植物混和种群中其存在或其近亲。通过在严格条件下用跨越本发明基因独有区域的探针探查从单一或混和植物种群的培养物中提取的基因组DNA，可以确定是否使用了本发明或是否存在生物或其近亲。 
[00418.0.0.1]另外，本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子可与亲缘物种的序列足够同源，以致这些核酸分子可作为构建亲缘生物基因组图谱中的标记。 
[00419.0.0.1]因此，本发明涉及用于繁育具有提高的氮同化、累积和/或利用的植物的方法，包括： 
(a 提供根据本发明方法生产的(优选(过)表达本发明核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子的)第一植物变种； 
(b 将第一植物变种与第二植物变种杂交；和 
通过分析分子标记在代表第一植物变种的子代中的分布及其(过 量)累积氮或(过量)生产含氮化合物的能力来选择过量累积氮或过量生产含氮化合物的子代植物。 
此外，本文公开的核酸分子，尤其是表I A或B第5或7栏所示核酸分子可与亲缘物种序列足够同源以致这些核酸分子可用作标记而用于构建亲缘生物的基因组图谱或用于联合作图。此外，对应于本文公开的核酸(尤其是表I A或B第5或7栏所示核酸分子)或其同源物的基因组区域的天然变异可导致本文公开的蛋白质(尤其是包括表II A或B第5或7栏所示多肽或包括表IV第7栏所示共有序列或多肽模体的蛋白质)及其同源物的活性改变，结果造成氮或含氮化合物生产的天然改变。结果是天然变异最终也以更有效的等位变体的形式存在，该等位变体已导致氮或含氮化合物生产的相对增加。可以鉴定本文公开的核酸分子(尤其是包括如表I A或B第5或7栏所示核酸分子的核酸)的不同变体并用作标记辅助育种以增加氮或含氮化合物的生产，该变体对应于不同的氮或含氮化合物的生产水平。 
因此，本发明涉及育种氮或含氮化合物生产增加的植物的方法，包括： 
a)基于如本文所述增加的本发明核酸表达，尤其是包括如表I A或B第5或7栏所示核酸分子的核酸分子或包括如表II A或B第5或7栏所示多肽的多肽或包括如表IV第7栏所示的共有序列或多肽模体的多肽或本文所述的其同源物的增加的表达，选择具有增加的氮或含氮化合物生产的第一植物变种； 
b)将氮或含氮化合物的生产水平与编码所述多肽的基因或所述核酸分子的表达水平或基因组结构相关联； 
c)将第一植物变体与第二植物变体杂交，该第二植物变体在氮或含氮化合物的生产水平上显著不同，和 
d)通过所述多肽或核酸分子的表达水平或编码本发明所述多肽的基因或核酸分子的基因组结构，鉴定哪个后代变体的氮或含氮化合物生产 水平上得到增加， 
一个实施方案中，根据步骤(b)的基因的表达水平增加。 
[00420.0.0.1]关于在育种中使用分子标记的细节可以见于Kumar等人1999(Biotech Adv.，17：143-182)和Peleman和van der Voort 2003(Trends Plant Sci.2003 Jul；8(7)：330-334)。 
分子标记可以例如涉及本发明的核酸分子和本发明方法中使用的核酸分子和/或其表达水平。因此，该分子标记可以是用于鉴定本发明核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子的基因组存在或基因组定位的探针或PCR引物对，例如在Southern印迹分析或PCR或其表达水平中，即Northern印迹分析或定量PCR中。 
因此，一个实施方案中，本发明涉及本发明的核酸分子或编码本发明多肽的核酸分子作为分子标记在育种，尤其是在繁育分别生产高或低精细化学品中的应用。 
[00421.0.0.1]本发明核酸分子还可用于进化和蛋白质结构研究。可以通过比较本发明或本发明方法中使用的序列与来自其他生物的编码类似酶的那些序列来评估生物间的进化亲缘关系。类似地，这样的比较可以评估序列中的哪些区域是保守的，而哪些不是，这可帮助确定酶行使功能所必需的蛋白质区域。这一类型的确定对蛋白质工程研究是有价值的，并可给出关于蛋白质可以承受何种诱变而不丧失功能的提示。 
[00422.0.0.1]因此，本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子可以用于鉴定在表达后赋予氮或含氮化合物增加的其他核酸分子。 
[00423.0.0.1]另外，本发明的核酸分子或本发明方法中使用的核酸分子或赋予本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽表达(优选包括本发明核酸分子)的基因片段可以用于标记辅助的育种或氮或含氮化合物衍生性状的联合作图。 
[00424.0.0.1]因此，本发明的核酸、本发明的多肽或本发明方法 中使用的多肽、本发明的核酸构建体、本发明的生物、宿主细胞、微生物、植物、植物组织、植物细胞或其部分、本发明的载体、用本发明的方法鉴定的激动剂、用本发明的方法鉴定的核酸分子可以用于生产含N化合物或含N-化合物和一或多种其它精细化学品。 
因此，本发明的核酸或用本发明的方法鉴定的核酸分子或其互补序列、本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽、本发明的核酸构建体、本发明的生物、宿主细胞、微生物、植物、植物组织、植物细胞或其部分、本发明的载体、用本发明的方法鉴定的拮抗剂、本发明的抗体、本发明的反义分子可以用于在生物或其部分(如细胞)中降低氮或含氮化合物。 
[00425.0.0.1]另外，本发明的核酸、本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽、本发明的核酸构建体、本发明的生物、宿主细胞、微生物、植物、植物组织、植物细胞或其部分、本发明的载体、用本发明方法鉴定的拮抗剂或激动剂、本发明的抗体、本发明的反义分子或用本发明的方法鉴定的核酸分子可以用于制备农业组合物。 
[00426.0.0.1]另外，本发明的核酸、本发明的多肽或本发明方法中使用的多肽、本发明的核酸构建体、本发明的生物、宿主细胞、微生物、植物、植物组织、植物细胞或其部分、本发明的载体、用本发明方法鉴定的拮抗剂或激动剂、本发明的抗体、本发明的反义分子或用本发明的方法鉴定的核酸分子可以用于鉴定和生产能够调控生物或其部分中氮或含氮化合物水平的化合物，如果所述被鉴定的化合物应用于生物或其部分(即作为其食物的部分或在生长培养基或培养基中)，优选鉴定和产生赋予生物或其部分中氮或含氮化合物水平增加的化合物。 
[00427.0.0.1]这些及其他实施方案公开并包含在本发明的说明书和实施例中。可使用如电子设备从公共图书馆中检索到关于任何用于本发明的方法、用途和化合物之一的其他文献。例如可以利用在互联网上提供的公共数据库“Medline”，例如通过网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html而进入。其他数据库和地址如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.infobiogen.fr/、 http://www.fmi.ch/biologv/research-tools.html、http://www.tigr.org/为本领域技术人员已知，并可以使用例如http://www.lycos.com获得。Berks，TIBTECH 12(1994)，352-364中给出了用于回溯检索和最新文献通报的生物技术专利信息的综述和专利信息相关资源的调查。 
[00428.0.0.1]由下面的实施例来说明本发明。本发明的实施例说明了基本的发明而并非旨在限制本发明的主题。本发明申请所引用的所有参考、专利申请、专利和已发表的专利申请的内容在此通过引用作为参考。
[00429.0.0.1]实施例1：从酿酒酵母克隆SEQ ID NO：689用于在植物中表达 
[00430.0.0.1]除非另有说明，使用Sambrook等人，MolecularCloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor 1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press中描述的标准操作程序。 
[00431.0.0.1]按Pfu Turbo或DNA Herculase聚合酶(Stratagene)操作程序中所述PCR扩增SEQ ID NO：689。 
[00432.0.0.1]Pfu Turbo DNA聚合酶操作程序的组成如下：1x PCR缓冲液(Stratagene)，0.2mM每种dNTP，100ng酿酒酵母(菌株S288C；Research Genetics，Inc.，现为Invitrogen)基因组DNA，50pmol正向引物，50pmol反向引物，2.5u Pfu Turbo DNA聚合酶。扩增循环如下： 
[00433.0.0.1]94-95℃ 3分钟循环一次，随后进行28-36个循环，每个循环都包括95℃ 1分钟或94℃ 30秒、50℃ 45秒、50℃ 30秒或55℃30秒和72℃ 210-480秒，然后72℃ 8分钟循环一次，然后4℃。Herculase聚合酶操作程序的组成如下：1x PCR缓冲液(Stratagene)，0.2mM每种dNTP，100ng酿酒酵母(菌株S288C；Research Genetics，Inc.，现为Invitrogen)基因组DNA，50pmol正向引物，50pmol反向引物，2.5u Herculase聚合酶。扩增循环如下： 
[00434.0.0.1]94℃ 2-3分钟循环一次，随后进行25-30个循环，每个循环都包括94℃ 30秒、55-60℃ 30秒和72℃ 5-10分钟，然后72℃ 10分钟循环一次，然后4℃。 
[00435.0.0.1]为SEQ ID NO：689的基因选择下述引物序列： 
i)正向引物(SEQ ID NO：949)atggctcggg gtgacggaca t 
ii)反向引物(SEQ ID NO：950)tcatgcttct tttgcgtgat gcaat 
[00436.0.0.1]此后，按照标准操作程序(Qiagen)将该扩增物在 QIAquick柱上纯化。 
[00437.0.0.1]克隆经由Pfu Turbo DNA聚合酶产生的PCR产物时，根据标准操作程序(MBI Fermentas)用SmaI限制性切割载体DNA(30ng)并加入高盐缓冲液终止。限制性切割的载体片段通过Nucleobond柱使用标准操作程序(Macherey-Nagel)纯化。此后，线性化的载体按照标准操作程序(MBI Fermentas)去磷酸化。 
[00438.0.0.1]将通过Pfu Turbo DNA聚合酶产生的PCR产物用标准操作程序(例如MBI Fermentas)使用T4DNA聚合酶磷酸化并克隆到经加工的二元载体中。 
[00439.0.0.1]通过Herculase DNA聚合酶产生的PCR产物的DNA末端使用Pfu Turbo DNA聚合酶在第二步合成反应中补平。补平DNA末端的操作程序的组成如下：0.2mM补平dTTP和1.25u Pfu TurboDNA聚合酶。反应在72℃孵育30分钟。然后将PCR产物用标准操作程序(例如MBI Fermentas)使用T4DNA聚合酶磷酸化并且也克隆到经加工的载体中。 
[00440.0.0.1]使用包括选择盒(启动子、选择标记、终止子)和带有启动子的表达盒、克隆盒和T-DNA边界序列间的终止子序列的二元载体。除在克隆盒内的那些之外，二元载体不含SmaI切割位点。可以使用的二元载体为本领域技术人员已知；二元载体及其用途的综述可以在Hellens，R.，Mullineaux，P.和Klee H.，[(2000)“A guide toAgrobacterium binary vectors”，Trends in Plant Science，卷5 No.10，446-451中找到。根据所使用的载体，也可有利地通过其它限制性酶完成克隆。可以通过使用合适的PCR扩增引物将合适有利的切割位点加在ORF上。 
[00441.0.0.1]将约30ng制备好的载体和确定量的制备好的扩增物混合并通过连接酶连接。 
[00442.0.0.1]在同一反应容器中添加感受态大肠埃希氏杆菌细胞 (菌株DH5-α)并在1℃孵育20分钟，然后在42℃热激90秒并冷却至4℃，以转化连接好的载体。然后添加完全培养基(SOC)并将混合物在37℃孵育45分钟。然后将全部混合物涂布在含有抗生素(根据使用的二元载体选择)的琼脂平板上并在37℃孵育过夜。 
[00443.0.0.1]克隆步骤的结果通过扩增验证，该扩增使用结合在整合位点上游和下游的引物，从而允许扩增插入物。另外，在PCR反应中使用上述基因特异引物以及上游和下游引物的组合，以鉴定具有正确插入方向的克隆。按Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL)操作程序所述进行扩增。 
[00444.0.0.1]扩增循环如下：94℃ 5分钟循环1次，随后进行35个循环，每个循环都包括94℃ 15秒、50-60℃ 15秒和72℃ 5分钟，然后72℃ 10分钟循环1次，然后于4℃保温。 
[00445.0.0.1]检测若干菌落，但仅将在其中检测到期望大小PCR产物的一个菌落用于下面的步骤。 
[00446.0.0.1]将此阳性菌落的一部分转化到装有完全培养基(LB)的反应容器中并于37℃过夜孵育。该LB培养基含有选择的适于使用的二元载体(见上文)和其中出现的抗性基因的抗生素，以选择克隆。 
[00447.0.0.1]按照Qiaprep标准操作程序(Qiagen)说明进行质粒制备 
[00448.0.0.1]实施例2：产生表达SEQ ID NO：689的转基因植物 
[00449.0.0.1]将1ng分离的质粒DNA电穿孔转化入根癌农杆菌菌株GV 3101 pMP90感受态细胞中(Koncz和Schell，Mol.Gen.Gent.204，383-396，1986)。农杆菌菌株的选择取决于二元载体的选择。可能的菌株及其特征的综述可见于Hellens，R.，Mullineaux，P.和Klee H.，(2000)“A guide to Agrobacterium binary vectors”，Trends in Plant Science，卷5 No.10，446-451。此后，加入完全培养基(YEP)并将该混合物转移进 新反应容器中在28℃孵育3小时。此后，将所有的反应混合物涂布在添加了各自抗生素(例如对GV3101 pMP90用利福平和庆大霉素)的YEP琼脂平板上，并涂布用于二元载体选择的另一种抗生素，并在28℃孵育48小时。 
[00450.0.0.1]然后使用实施例2中产生的含有质粒构建体的农杆菌用于植物转化。 
[00451.0.0.1]借助吸管头从琼脂平板上挑出菌落并用3ml液体TB培养基吸收，该培养基根据农杆菌菌株和二元质粒也含有合适的抗生素。在28℃和120转/分钟下培养预培养物48小时。 
[00452.0.0.1]将400ml含有与上述相同的抗生素的LB培养基用于主要培养物。将预培养物转移到主要培养物。在28℃和120转/分钟下生长18h。4000转/分钟离心后，将沉淀物在渗入培养基(MS培养基，10％蔗糖)中重悬浮。 
[00453.0.0.1]为了培养用于转化的植物，将设有滤网底部的平皿(Piki Saat 80，绿色(green)，30x20x4.5cm，来自Wiesauplast，Kunststofftechnik，德国)用GS90基质(标准土壤，Werkverband E.V.，德国)半充满。用0.05％的Proplant溶液(Chimac-Apriphar，Belgium)给平皿加水过夜。将拟南芥C24的种子(Nottingham Arabidopsis StockCentre，UK；NASC Stock N906)散布在平皿上，大约每个平皿1000粒种子。用罩盖上平皿并置于层化设备(8h，110μmol/m2/s-1，22℃；16h，黑暗，6℃)中。五天后，将平皿置于短日照人工气候室中(8h 130μmol/m2/s-1，22℃；16h，黑暗20℃)，它们在那里保持大约10天直到第一片真叶形成。 
[00454.0.0.1]将幼苗转移至包含相同基质的盆中(Teku盆，7cm，LC系列，P
Figure G2007800201189D0086114217QIETU
ppelmann GmbH & Co，德国制造)。每盆移入五棵植物。然后将盆放回短日照人工气候室使植物继续生长。 
[00455.0.0.1]10天后，将植物转移进温室内(辅助光照，16h，340μE， 22℃；8h，黑暗，20℃)，在那里允许它们再生长17天。 
[00456.0.0.1]为了转化，将刚开始开花的六周龄鼠耳芥属植物浸渍在上述先前用10μl Silwett L77(Crompton S.A.，Osi Specialties，瑞士)处理过的农杆菌悬浮液中10秒。所述方法描述于Clough和Bent，1998(Clough，JC and Bent，AF.1998 Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana，Plant J.16：735-743)。 
[00457.0.0.1]随后将植物在加湿室内放置18小时。此后，将盆送回温室使植物继续生长。植物在温室中再保持10周直到可以收获种子。 
[00458.0.0.1]根据为了选择转化的植物而使用的抗性标记，在温室中培养收获的种子并进行喷药选择，或先灭菌然后在添加了各自选择试剂的琼脂平板上生长。
Figure G2007800201189D0142124633QIETU
抗性情况下，以2到3天的间隔用0.02％ 
Figure 2007800201189100002G2007800201189D0142124633QIETU
喷洒幼苗四次，并允许转基因植物结种子。将转基因拟南芥植物的种子保存在冰箱中(-20℃)。 
[00459.0.0.1]实施例3：氮含量分析 
[00460.0.0.1]使用Dumas法对样品中的氮进行测定，该方法依赖于实验材料的完全燃烧。在高温炉中加热样品并在纯氧存在下使其迅速燃烧。收集燃烧产物(主要是CO2、H2O、NOx和N2)并使其平衡。使气体混合物的等分试样通过热铜以除去任何氧气以及将NO2转换成N2。然后使样品通过除去CO2和H2O的捕捉器。通过热导检测器测量剩余氮。 
对于叶材料或种仁，使用均质化的冻干材料。就鼠耳芥属植物种子而言，直接分析种子而无需预处理。 
[00461.0.0.1]在锡箔杯中称量4-7mg样品和15mg钨(VI)氧化物(WO3)。使用商用元素分析仪(例如ELEMENTAR vario EL III，ELEMENTAR，Hanau，德国)进行分析。 
[00462.0.0.1]表VI示出由双35S启动子调控的酵母ORF YPR138c (对应于SeqID NO：689)转化的转基因植物种子中增加的总含氮量。第1栏示出所测量的元素，第2栏示出作为相对标准差的野生型变量，第3栏示出转化有SEQ ID NO：689的不同转基因系相对于被标准化为“1”的野生型对照在元素含量上的平均变化，第4栏示出不同转基因系的标准差和第5栏示出观察到的最大变化。不出所料，氮的相对增加对应于碳含量的相对减少。 
  
参数 野生型变量(RSD；％) 均值 SD 最大变化
％N 0.05 1.17 0.06 1.24
％C 0.01 0.90 0.03 0.87
[00463.0.0.1]实施例4：提高的氮利用效率 
在氮供应受限的条件下针对生长筛选植物(鼠耳芥属植物) 
为了筛选转基因植物，使用特异的培养设施。出于高通量的目的，在氮供应受限的条件下在琼脂平板上筛选植物的生物量产量(改良自Estelle和Somerville，1987)。筛选流程(pipeline)由三种标准(level)组成。如果生物量产量相比于野生植物显著提高，则使转基因系进行下一种标准。每种标准中重复次数和统计严谨性都增加。 
为了播种，借助牙签将存于冰箱(于-20℃)的种子从Eppendorf管中取出并转移到平板上。在每个平板(12 x 12cm)上总计水平分布约15-30粒种子。 
播种后，使平板在4℃于黑暗进行层化2-4天。层化后，在20℃，环境湿度60％和CO2浓度约400ppm下以16h光照，8h黑暗的节律使实验植物生长22-25天。所用光源产生类似于光强约100μE/m2/s-1的日光色谱的光。 
在生长20-25天后，通过转基因植物的芽和根的生物量产量与野生型对照植物的相比而评估氮受限条件下提高的生长。
在如双35S启动子的强组成型启动子的调控下，表达酵母ORFYPR138c(对应于SEQ ID NO：689)的转基因系相比于野生型对照植物显示出氮受限条件下提高的芽和根生物量产量。 
[00464.0.0.1]实施例5：通过过表达本发明表征的多核苷酸(例如源自酵母属物种，大肠埃希氏杆菌或其它生物)而改造黑麦草(ryegrass) 
[00465.0.0.1]若干不同黑麦草变种的种子可以用作转化用的外植体源，包括可从Svalof Weibull种子公司得到的商品变种Gunne或变种Affinity。种子依次用1％ Tween20 1分钟，100％漂白剂60分钟表面消毒，用去离子水和蒸馏水漂洗三次，每次5分钟，然后在潮湿的无菌滤纸上于暗处萌发3-4天。然后再用1％ Tween20 1分钟，75％漂白剂5分钟消毒苗，用ddH2O洗涤三次，每次5分钟。 
[00466.0.0.1]将表面消毒的种子置于含有Murashige和Skoog基础盐和维生素、20g/l蔗糖、150mg/l天冬酰胺、500mg/l酪蛋白水解物、3g/l Phytagel、10mg/l BAP和5mg/l麦草畏的愈伤组织诱导培养基上。于25℃暗处孵育培养皿4周，以使种子萌发并诱导胚发生愈伤组织。 
[00467.0.0.1]在愈伤组织诱导培养基上四周后，剪掉苗的芽和根，将愈伤组织移至新鲜培养基上，再持续培养四周，然后转移至MSO培养基在光下培养两周。将数块愈伤组织(11-17周龄)或者紧张(strain)通过10目网筛然后置于愈伤组织诱导培养基上，或者在250mL三角瓶里于100mL液体黑麦草愈伤组织诱导培养基(与用于愈伤组织诱导的含琼脂的培养基相同)中培养。三角瓶用箔包好并在23℃于暗处以175转/分钟摇一周。用40-目筛网筛分液体培养物并收集细胞。筛网上收集的馏分涂布于固体黑麦草愈伤组织诱导培养基上，并于暗处25℃培养一周。然后将愈伤组织转移至含有1％蔗糖的MS培养基上并培养2周。 
[00468.0.0.1]可以通过农杆菌属物种或粒子轰击法完成转化。制备 的表达载体含有pUC载体中的组成型植物启动子和基因cDNA。按照生产商的说明书使用Qiagen试剂盒从大肠埃希氏杆菌细胞中制备质粒DNA。在培养皿中无菌滤纸的中央涂布大约2g胚发生愈伤组织。在滤纸上加入含有10g/l蔗糖的液体MSO的等分试样。按照Sanford等人，1993的方法用质粒DNA包裹金颗粒(1.0μm大小)并按如下参数将其递送给胚发生愈伤组织：每次轰击500μg颗粒和2μg DNA、1300psi、从停止盘到愈伤组织盘的靶距离为8.5cm、每盘愈伤组织轰击一次。 
[00469.0.0.1]轰击后将愈伤组织转移回新鲜的愈伤组织发育培养基，并在黑暗中室温保持1周时间。然后将愈伤组织转移至光下25℃的生长条件，以在合适的选择剂(如250nM Arsenal，5mg/l PPT或50mg/L卡那霉素)下开始胚分化。出现对选择剂具有抗性的芽，且一旦生根便转移到土壤中。 
[00470.0.0.1]通过PCR分析原代转基因植物(T0)的样品以确认T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交确认，其中DNA在1％琼脂糖凝胶中电泳并转移至带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。按制造商的推荐使用PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche Diagnostics)通过PCR制备地高辛标记探针。 
[00471.0.0.1]转基因T0黑麦草植物通过切除分蘖进行无性繁殖。移植的分蘖在温室中维持两个月直至良好建立。除去芽并使其生长两周。 
[00472.0.0.1]可以用实施例3所述的元素分析仪来分析转基因黑麦草种子增加的氮含量。 
[00473.0.0.1]实施例6：通过过表达本发明表征的多核苷酸(例如来源于酵母属物种、大肠埃希氏杆菌或另一种生物)而改造大豆植物 
[00474.0.0.1]根据下述对Texas A&M专利US 5,164,310中所述方法的改良转化大豆。若干商品大豆变种可以通过该方法转化。通常用栽培种Jack(可从Illinois Seed Foundation获得)进行转化。种子通过在 70％(v/v)乙醇中浸泡6分钟并在添加了0.1％(v/v)Tween的25％商用漂白剂(NaOCl)中浸泡20分钟来消毒，然后用无菌双蒸水漂洗4次。通过从每个苗上取下胚根、下胚轴和一个子叶来繁殖七天苗。然后，将带有一片子叶的上胚轴转移至培养皿中新鲜的萌发培养基上，并在25℃，16小时光周期(大约100μE-m-2s-1)下孵育三周。从3-4周龄植物上切下叶腋节(长度约4mm)。切除叶腋节并在农杆菌属LBA4404培养物中孵育。 
[00475.0.0.1]已经描述了许多不同的用于植物转化的二元载体系统(例如An，G.在Agrobacterium Protocols.Methods in MolecularBiology 44卷，47-62页，Gartland KMA和MR Davey编，Humana Press，Totowa，New Jersey)。很多是基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)所述的pBIN19载体，它包括两侧与来源于根癌农杆菌Ti质粒的左侧和右侧边界序列相连的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成——选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。如上所述可以使用多种选择标记基因，包括编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)(US专利57673666和6225105)的鼠耳芥属植物基因。类似地，如上所述多种启动子可以用于调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境调节的基因转录。本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以提供性状基因的组成型表达。 
[00476.0.0.1]共培养处理后，洗涤外植体并转移至添加了500mg/L特美汀的选择培养基。切除芽并置于芽伸长培养基上。长于1cm的芽在移植进土壤前置于生根培养基上2到4周。 
[00477.0.0.1]原代转基因植物(T0)通过PCR分析以确认T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交确认，其中DNA在1％琼脂糖凝胶中电泳并转移至带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。按制造商的推荐使用PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche Diagnostics)通过PCR 制备地高辛标记探针。 
[00478.0.0.1]可以用实施例3所述的元素分析仪来分析转基因大豆种子的氮含量增加。 
[00479.0.0.1]实施例7：通过过表达本发明表征的多核苷酸(例如来源于酵母属物种、大肠埃希氏杆菌或另一种生物)来改造玉米植物 
[00480.0.0.1]使用Ishida等人(1996.Nature Biotech 14745-50)所述方法的改良对玉米(Zea Mays L.)进行转化。在玉米中，转化是基因型依赖性的且只有特定的基因型才可用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是转化供体材料的优良来源(Fromm等人，1990，Biotech 8：833-839)，但也可成功地使用是其它基因型。授粉后大约11天(DAP)，当未成熟胚大约1到1.2mm长时，从玉米植物收集穗。将未成熟胚与携带“超级二元”载体的根癌农杆菌共培养，并通过器官发生来再生转基因植物。日本烟草(Japan Tobacco)的超级二元载体系统在WO专利WO 94/00977和WO 95/06722中有所描述。可以按所述构建载体。可以使用包括编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)(US专利6025541)的玉米基因在内的多种选择标记基因。类似地，可以使用多种启动子调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境调节的基因转录。本实施例中，可以使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供性状基因的组成型表达。 
[00481.0.0.1]可以在愈伤组织诱导培养基上培养切除的胚，然后在含有作为选择剂的咪唑啉酮的玉米再生培养基上培养。培养皿在25℃光照下孵育2-3周，或直到芽发育。可以从每个胚上将嫩芽移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周直到根发育。将生根的芽移植到温室土壤中。可以从对咪唑啉酮除草剂显示耐受性以及转基因PCR检测为阳性的植物中生产T1种子。 
[00482.0.0.1]单基因座插入T-DNA的T1世代以3:1的比例分离转 基因。含有一或两个转基因拷贝的那些后代对咪唑啉酮除草剂耐受。可以用实施例3所述的元素分析仪来分析转基因玉米种子的氮含量增加。 
[00483.0.0.1]实施例8：通过过表达本发明表征的多核苷酸(例如来源于酵母属物种、大肠埃希氏杆菌或另一种生物)来改造小麦植物 
[00484.0.0.1]通过如Ishida等人(1996 Nature Biotech.14745-50)所述的方法进行小麦转化。通常使用栽培种Bobwhite(可从CYMMIT，Mexico获得)进行转化。将未成熟胚与载有“超级二元”载体的根癌农杆菌共培养并通过器官发生再生转基因植物。日本烟草的超级二元载体系统在WO专利WO 94/00977和WO 95/06722中有所描述。可以按所述构建载体。可以使用包括编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)(US专利6025541)的玉米基因在内的多种选择标记基因。类似地，可以使用多种启动子调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境调节的基因转录。可以使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以提供性状基因的组成型表达。 
[00485.0.0.1]与农杆菌属物种一起孵育后，可以在愈伤组织诱导培养基上培养胚，然后在含有作为选择剂的咪唑啉酮的再生培养基上培养。培养皿在25℃光照下培养2-3周，或直到芽发育。从每个胚上将嫩芽移至生根培养基并在25℃培养2-3周直到根发育。将生根的芽移植到温室土壤中。从对咪唑啉酮除草剂显示耐受性以及转基因PCR检测为阳性的植物中产生T1种子。 
[00486.0.0.1]单基因座插入T-DNA的T1世代以3:1的比例分离转基因。含有一或两个转基因拷贝的那些后代对咪唑啉酮除草剂耐受。纯合的T2植物表现出相似的表型。可以用实施例3所述的元素分析仪来分析转基因小麦种子的氮含量增加。 
[00487.0.0.1]实施例9：过表达本发明表征的多核苷酸(例如来源于 酿酒酵母、大肠埃希氏杆菌或另一种生物)来改造油菜籽油菜/卡诺拉植物 
[00488.0.0.1]根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)，可以使用5-6天龄幼苗的子叶叶柄和下胚轴作为进行组织培养的外植体并进行转化。商品栽培种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准变种，但可以使用其它变种。 
[00489.0.0.1]使用含有二元载体的根癌农杆菌LBA4404转化卡诺拉。已经描述了许多不同的用于植物转化的二元载体系统(例如An，G.在Agrobacterium Protocols.Methods in Molecular Biology 44卷，47-62页，Gartland KMA和MR Davey编，Humana Press，Totowa，NewJersey)。很多是基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)所述的pBIN19载体，它包括两侧与来源于根癌农杆菌Ti质粒的左侧和右侧边界序列相连的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成——选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)(US专利57673666和6225105)的鼠耳芥属植物基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境调节的基因转录。可以使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以提供性状基因的组成型表达。 
[00490.0.0.1]通过在70％乙醇中浸泡2分钟，然后在含有一滴Tween20的30％ Clorox中浸泡10分钟来表面消毒卡诺拉种子，随后用无菌的蒸馏水漂洗三次。然后使种子在不含激素、1％蔗糖、0.7％Phytagar的减半浓度MS培养基中于23℃光照16小时下体外萌发5天。从体外苗上切下带有子叶的子叶柄外植体，并通过将柄外植体的切口端浸入细菌悬液来接种农杆菌属物种。然后将外植体在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％ Phytagar的MSBAP-3培养基上于23℃，16小时光照下培养两天。与农杆菌属物种共同培养两天后，将叶柄外植体移至含有3 mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7天，然后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀以及选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到芽再生。当芽长5-10mm时将其切下并移至芽伸长培养基(含有0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)上。将长约2cm的芽移至生根培养基(MSO)上用于诱导根。 
[00491.0.0.1]原代转基因植物(T0)的样品可以通过PCR分析确认T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交确认，其中DNA在1％琼脂糖凝胶中电泳并转移至带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。按制造商的推荐使用PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche Diagnostics)通过PCR制备地高辛标记探针。 
[00492.0.0.1]可以用实施例3所述的元素分析仪来分析转基因卡诺拉种子的氮含量增加。 
[00493.0.0.1]实施例10：通过过表达本发明表征的多核苷酸(例如来源于酵母属物种、大肠埃希氏杆菌或另一种生物)来改造苜蓿植物 
[00494.0.0.1]可以使用(McKersie等人，1999 Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿(紫苜蓿)的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖的，因此需要再生植物。获得再生植物的方法已有描述。例如，它们可以选自栽培种Rangelander(Agriculture Canada)或如BrownDCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4：111-112)所述的任何其它商品苜蓿变种。或者，可以选择RA3变种(威斯康辛大学)用于组织培养(Walker等人，1978 Am J Bot 65：654-659)。 
[00495.0.0.1]将叶柄外植体与根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等人，1999 Plant Physiol 119：839-847)或含有二元载体的LBA4404的过夜培养物共培养。已经描述了许多不同的用于植物转化的二元载体系统(例如An，G.在Agrobacterium Protocols.，Methods in MolecularBiology，第44卷，47-62页，Gartland KMA和MR Davey编，Humana Press，Totowa，New Jersey)。很多是基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)所述的pBIN19载体，它包括两侧与来源于根癌农杆菌Ti质粒的左侧和右侧边界序列相连的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成——选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)(US专利57673666和6225105)的鼠耳芥属植物基因。类似地，多种启动子可以用于调节性状基因以提供组成型、发育、组织或环境调节的基因转录。可以使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)以提供性状基因的组成型表达。 
[00496.0.0.1]外植体可以在含有288mg/L脯氨酸、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4、以及100μM乙酰丁香酮的SH诱导培养基上在暗处共培养三天。可以在减半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤外植体并涂布在不含乙酰丁香酮而含有合适的选择剂及抑制农杆菌属物种生长的合适抗生素的相同SH诱导培养基上。数周后，将体细胞胚移至不含生长调节物、不含抗生素的50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。随后体细胞胚在减半浓度的Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的苗移植到盆中并在温室中培养。 
[00497.0.0.1]通过结节扦插和在Turface生长培养基中生根来繁殖T0转基因植物。除去植物的叶子并培养至约10cm的高度(除叶后约两周)。 
[00498.0.0.1]可以用实施例3所述的元素分析仪来分析转基因苜蓿种子的氮含量增加。 
[00499.0.0.1]实施例11：从植物制备同源序列 
可以在标准或改变条件下于温室生长不同植物。可以按照Jones，Dunsmuir和Bedbrook(1985)EMBO J.4：2411-2418的操作程序提取RNA。将约1g不同器官的组织材料在液氮中研磨。将粉末转移到13ml 含4.5ml NTES缓冲液(100mM NaCI，10mM Tris/HCl pH7.5，1mMEDTA，1％ SDS的无RNase水)和3ml苯/氯仿/异戊醇(25/24/1)的Falcon管中，立即混合并于冰上保存。使用离心机(Sorval；SM24或SS34转子)于7000转/分钟下离心混合物10min。将上清转移到新管中，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2；在无RNase的水中)和1体积异丙醇，混合，于-20℃存放1h或过夜。7000转/分钟离心混合物10min。弃上清并且用70％乙醇(v/v)洗涤沉淀。7000转/分钟离心混合物5min。弃上清并且空气干燥沉淀。加入1ml无RNase的水并允许DNA/RNA沉淀于4℃冰上溶解。将核酸溶液转移到2ml离心管并加入1ml的4M乙酸锂。混合后，于4℃保存溶液至少3h或过夜。14000转/分钟离心混合物10min，弃上清并且用70％乙醇洗涤沉淀，空气干燥并且溶解在200μl无RNase的水中。 
可以按照制造商的操作程序使用总RNA构建cDNA文库(例如使用ZAP-cDNA合成和克隆试剂盒，Stratagene，La Jolla，USA)。基本上，第一链合成时使用oligo(dT)接头-引物从而对信使RNA(mRNA)加引物并且使用反转录酶反转录。第二链cDNA合成后，将双链cDNA与Uni-ZAP XR载体连接。该Uni-ZAP XR载体允许pBluescript噬菌粒体内切除。pBluescript噬菌粒的多接头具有两侧为T3和T7启动子的21个独特克隆位点和用于DNA测序的6个不同引物位点的选择。克隆期望的5引物(5prime)末端的系统性一次循环测序(Systematic single runsequencing)可以允许对序列进行初步注释，例如借助pedant pro软件包(Biomax，München)。可以根据用标准算法(如blastp或缺口)的同源性检索来鉴定本发明的或本发明方法中所使用核酸的克隆。所鉴定的具有同一性或高同源性的推定全长克隆可以进行进一步测序以便获得完整序列。 
可以以类似的方式通过从如上所述的多种植物源制备各自的cDNA文库来鉴定其它新的同源序列。然后可以用本发明可获得的序列在低严 谨性条件下筛选文库，例如如Sambrook等人，Molecular Cloning：Alaboratory manual，Cold Spring Harbor 1989，Cold Spring HarborLaboratory Press所述。可以将纯化的阳性克隆进行体内切除和完全测序。使用blastp或缺口程序对原始和新序列的配对序列比对允许鉴定直系同源物，即来自不同生物的同源性序列，其将具有至少30％的序列同一性。此外，可以由若干已获得的旁系同源物比对而鉴定的功能上重要的氨基酸残基或结构域的保守性可以鉴定新序列为新的直系同源物。 
或者，可以将文库进行大量测序并且所获得序列可以存储在序列数据库中，其随后可以通过不同检索算法筛选推定的直系同源物，例如用本发明氨基酸序列检索获得的核酸序列的tbastn算法。使用具有最高序列同一性的克隆用于测定完整序列，并且如上所述可以鉴定直系同源物。
[0001.0.0.2]至[0018.0.0.2]参见[0001.0.0.1]至[0018.0.0.1] 
[0019.0.2.2]氧化性戊糖磷酸途径是公知的生物合成过程的还原力的主要来源(例如脂肪酸合成和氮同化(Neuhaus和Emes，Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol 200，51：111-140)。此外，其提供生物合成过程的代谢中间产物。在细胞溶胶和质体中都发现这一途径的酶，而活性的准确分布在植物物种和生长条件之间变化。氧化性戊糖磷酸途径的一种重要酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，其由不同基因编码分散的细胞溶胶的和质体的同工酶。已在高等植物中区分了两类质体G6PDH。尽管两种质体活性由增加的NADPH/NADP+所抑制并且被二硫苏糖醇所失活，但一种酶对两种调节形式触发尤为较不敏感。从含铵培养基转移到包括硝酸盐的培养基后，拟南芥中编码这些同工型的基因的表达增加，这表明较不敏感的G6PDH同工酶参与供应用于铁氧还蛋白-依赖型反应的NADPH(Wang等人，Plant Cell 2000，12：1491-15009)。其它近来对大麦根的研究鉴定了大麦中应答暴露于铵盐或谷氨酸盐而诱导的类似质体的同工型(Esposito等人，Physiol Plant 2001，113：469-476)。 
[0020.0.2.2]尽管已充分建立了氧化性戊糖磷酸途径的基本特征，该途径在植物中如何运转的细节以及其如何影响其它过程(如氮固定)仍旧存在大部分猜测(Krüger和von Schaewen，Current Opinion in PlantBiology，2003，6：236-264综述)。 
[0020.1.2.2]已知法呢基焦磷酸合成酶(FPP合酶)为具有二甲基-烯丙基-转移酶(transtransferase)和香叶基转移酶(geranyl-transtransferase)活性的细胞溶胶型酶(Wang等人，Plant Journal，43，413-424，2005；Barth等人，Physiologica Plantarium，121，282-293，2004；Glichet等人，Curr.Opinion Plant Biol.，6，530-535，2003)。FPP合酶催化异戊烯二磷酸(IPP)与二甲基烯丙基二磷酸和香叶基二磷酸的依次1’-4缀合，形成用于异戊二烯和甾醇生物合成的C15法呢基焦磷酸单元。但不清楚甾醇生物合成或蛋白质法呢基化如何参与细胞(优选植物 或其部分)中氮含量的增加，优选通过产生或增加细胞器(优选质体)中的FPP合酶的活性。 
[0020.2.2.2]已知L-乳酸细胞色素c氧化还原酶/细胞色素b2是线粒体内膜空间的组分，其为乳酸利用所需。但不清楚细胞色素b2活性可如何参与细胞(优选植物或其部分)中氮含量的增加，优选通过产生或增加细胞器(优选质体)中的细胞色素bs2的活性。 
[0021.0.0.2]至[0023.0.0.2]参见[0021.0.0.2]至[0023.0.0.2] 
[0024.0.2.2]因此，一个实施方案中，这是通过氮或含氮化合物的累积或生产而实现。一个实施方案中，本文使用的术语“氮或含氮化合物”指含有“氨基酸”的蛋白质或其它含氮化合物如“血红素-复合物”、含“嘌呤”和/或“嘧啶”的化合物和/或衍生物。此外，另一个实施方案中，本文使用的术语“氮或含氮化合物”还指包括含N化合物的精细化学品的组合物。 
[0025.0.0.2]因此，本发明涉及一种方法，其包括 
(a)在微生物或植物的细胞器中，增加或产生一种或多种如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质的活性，所述蛋白质由表I应用号2和/或应用号3第5栏所示核酸序列编码， 
(b)在微生物或植物的质体中，或在其一或多个部分中，增加或产生如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质的活性，所述蛋白质由表I应用号2和/或应用号3第5栏所示核酸序列编码，和 
(c)在允许于所述生物中或该生物周围的培养基中累积和/或生产氮或含氮化合物(例如含N化合物)的条件下，使生物生长。 
[0026.0.0.2]因此，本发明涉及分别累积和/或生产氮或含氮化合物的方法，包括： 
a)在非人类生物的细胞器中，增加或产生选自如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质的活性，所述蛋白质由选自如表I第5栏所示的核酸序列编码，或
b)在非人类生物或其一或多个部分中，增加或产生选自如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质的活性，所述蛋白质由选自如表I应用号2和/或应用号3第5栏所示的核酸序列编码，其与编码转运肽的核酸序列结合；或 
c)在非人类生物或其一或多个部分中，增加或产生选自如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质的活性，所述蛋白质由选自如表I应用号2和/或应用号3第5栏所示的核酸序列编码，其与编码叶绿体定位序列的核酸序列结合；和 
d)在允许于所述生物中累积氮和/或生产含N化合物的条件下，使生物生长。 
[0027.0.0.2]有利地，在上述提及的方法中，在植物质体中增加或产生选自如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质的活性，该蛋白质由选自如表I应用号2和/或应用号3第5栏所示的核酸序列所编码。 
[0028.0.0.2]原则上，编码转运肽的核酸序列可以分离自每种生物，例如微生物例如藻类或含有质体(优选叶绿体)的植物。“转运肽”是氨基酸序列，编码其的核酸序列与相应的结构基因一起翻译。这意味着转运肽是所翻译蛋白质完整的一部分并且形成蛋白质的氨基末端延伸。转运肽和结构基因被翻译成所谓的“前蛋白质”。通常，转运肽在蛋白质输入到正确细胞器(例如质体)时或之后立即从前蛋白质上被切除以产生成熟蛋白质。转运肽通过促进蛋白质运输通过细胞内膜保证成熟蛋白质的正确定位。优选的编码转运肽的核酸序列源自编码最终驻留在质体中的蛋白质的核酸序列并源自(stem from)选自下述属的生物： 
[0029.0.0.2]伞藻属(Acetabularia)、鼠耳芥属、芸苔属、辣椒属、衣藻属(Chlamydomonas)、Cururbita、杜氏藻属(Dunaliella)、裸藻属(Euglena)、黄菊属(Flaveria)、大豆属、向日葵属、大麦 属、浮萍属(Lemna)、黑麦草属(Lolium)、番茄属(Lycopersion)、苹果属(Malus)、苜蓿属(Medicago)、日中花属(Mesembryanthemum)、烟草属、Oenotherea、稻属、碧冬茄属(Petunia)、菜豆属、立碗藓属(Physcomitrella)、松属(Pinus)、豌豆属、萝卜属(Raphanus)、蝇子草属(Silene)、白芥属、茄属、Spinacea、Stevia、聚球藻属(Synechococcus)、小麦属和玉蜀黍属。 
[0030.0.0.2]有利地，有益地用于本发明方法的此种转运肽源自编码选自下述蛋白质的核酸序列： 
[0031.0.0.2]核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶、5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶、乙酰乳酸合酶、叶绿体核糖体蛋白质CS17、Cs蛋白、铁氧还蛋白、质体蓝素、核酮糖二磷酸羧化酶活化酶、色氨酸合成酶、酰载体蛋白、质体伴侣蛋白-60、细胞色素c552、22-kDA热激蛋白、33-kDa放氧提高蛋白1(Oxygen-evolving enhancer protein 1)、ATP合酶γ亚基、ATP合酶δ亚基、叶绿素-a/b-结合蛋白II-1、放氧提高蛋白2、放氧提高蛋白3、光系统I：P21、光系统I：P28、光系统I：P30、光系统I：P35、光系统I：P37、甘油-3-磷酸乙酰转移酶、叶绿素a/b结合蛋白、CAB2蛋白、羟甲基胆色烷合酶、丙酮酸正磷酸二激酶、CAB3蛋白、质体铁蛋白、铁蛋白、早期光诱导蛋白、谷氨酸-1-半醛转氨酶、原叶绿素酸酯还原酶、淀粉粒结合淀粉酶合酶、光系统II的集光叶绿素IIa/b-结合蛋白、主要花粉致敏原Lol p 5a、质体ClpB ATP-依赖型蛋白酶、超氧化物歧化酶、铁氧还蛋白NADP氧化还原酶、28-kDa核糖核蛋白、31-kDa核糖核蛋白、33-kDa核糖核蛋白、乙酰乳酸合酶、ATP合酶CF0亚基1、ATP合酶CF0亚基2、ATP合酶CF0亚基3、ATP合酶CF0亚基4、细胞色素f、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、谷氨酰胺合酶、谷氨酰胺合酶2、碳酸酐酶、GapA蛋白、热激蛋白21、磷酸易位蛋白、质体ClpA ATP-依赖型蛋白酶、质体核糖体蛋白CL24、质体核糖体蛋白CL9、质体核糖体蛋白PsCL18、质体核糖体蛋白PsCL25、DAHP合酶、淀粉磷酸化 酶、根酰基载体蛋白II、甜菜醛脱氢酶、GapB蛋白、谷氨酰胺合酶2、磷酸核酮糖激酶、亚硝酸还原酶、核糖体蛋白L12、核糖体蛋白L13、核糖体蛋白L21、核糖体蛋白L35、核糖体蛋白L40、丙糖磷酸-3-磷酸丙糖(phosphoglyerate)-磷酸易位蛋白、铁氧化还原蛋白-依赖型谷氨酸合酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、NADP-依赖型苹果酸酶和NADP-苹果酸脱氢酶。 
[0032.0.0.2]更优选地，编码转运肽的核酸序列源自编码最终驻留在质体中的蛋白质的核酸序列并源自选自下述物种的生物： 
[0033.0.0.2]地中海伞藻(Acetabularia mediterranea)、拟南芥、芸苔(Brassica campestris)、欧洲油菜、辣椒、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Cururbita moschata、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、杜氏盐藻(Dunaliella tertiolecta)、裸藻(Euglena gracilis)、Flaveria trinervia、大豆(Glycine max)、向日葵、大麦、浮萍(Lemna gibba)、黑麦草(Lolium perenne)、番茄(Lycopersion esculentum)、苹果(Malus domestica)、野苜蓿、紫苜蓿、冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)、白花丹叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)、林生烟草(Nicotiana sylvestris)、烟草、Oenotherea hookeri、稻、碧冬茄(Petunia hybrida)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、球蒴藓(Physcomitrella patens)、Pinustunbergii、豌豆、蓝花子(Raphanus sativus)、Silene pratensis、白芥、马铃薯、菠菜(Spinacea oleracea)、甜菊(Stevia rebaudiana)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、普通小麦和玉蜀黍。 
[0034.0.0.2]甚至更优选核酸序列编码转运肽，如von Heijne等人，[Plant Molecular Biology Reporter，Vol.9(2)，1991：104-126]所公开，其通过引用作为参考。表V示出由von Heijne等人公开的一些转运肽的实例。根据本发明(特别是实施例)中的公开内容，熟练技术人员能够 将von Heiine等人公开的其它核酸序列与表I应用号2和/或应用号3第5和7栏所示核酸序列相连接。最优选的编码转运肽的核酸序列源自菠菜属(Spinacia)，例如叶绿体30S核糖体蛋白质PSrp-1、根酰基载体蛋白II、酰基载体蛋白、ATP合酶：γ亚基、ATP合酶：δ亚基、细胞色素f、铁氧还蛋白I、铁氧还蛋白NADP氧化还原酶(＝FNR)、亚硝酸还原酶、磷酸核酮糖激酶、质体蓝素或碳酸酐酶。熟练的技术人员将认识到可以从定位质体的蛋白质中轻易分离多种其它编码转运肽的核酸序列，该定位质体的蛋白质作为前体由核基因表达并随后被靶向质体。此种转运肽编码序列可以用于构建其它表达构建体。本发明方法有利地使用的且作为本发明核酸序列和蛋白质一部分的转运肽，其长度通常为20-120个氨基酸，优选25-110、30-100或35-90个氨基酸，更优选40-85个氨基酸和最优选45-80个氨基酸并且翻译后起将蛋白质导向质体(优选叶绿体)的作用。编码此种转运肽的核酸序列位于编码成熟蛋白质的核酸序列上游。为了将转运肽编码核酸与编码待靶向蛋白质的核酸进行正确分子结合，经常需要将其它碱基对导入结合位置，这些碱基对形成用于不同核酸分子结合的限制性酶识别序列。这一程序可在成熟的输入蛋白质的N-末端产生非常少的额外氨基酸，该氨基酸通常且优选不干扰蛋白质功能。任何情况下，必须细心选择在结合位置形成限制性酶识别序列的其它碱基对，以便避免形成终止密码子或编码强烈影响蛋白质折叠的氨基酸(如脯氨酸)的密码子。优选此种额外密码子编码小的，结构柔性氨基酸，例如甘氨酸或丙氨酸。 
[0035.0.0.2]如上所提及，编码如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质及其同源物的核酸序列(如表I第5和7栏所公开)各自与编码转运肽的核酸序列结合。这一编码转运肽的核酸序列保证将蛋白质运输到质体。待表达基因的核酸序列及编码转运肽的核酸序列有效连接。因此，转运肽与编码如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质及其同源物的核酸序列(如表I应用号2和/或应用号3，第5和7栏所 公开)按阅读框架地融合。 
[0036.0.0.2]根据本发明术语“细胞器”应指例如“线粒体”或优选“质体”(通篇“复数”应包括“单数”，反之亦然)。本发明的术语“质体”意图包括多种质体形式，包括原质体、叶绿体、有色体、老化质体(gerontoplast)、白色体、造粉体、油质体和白色质体，优选叶绿体。它们都具有共同的前述原质体祖先。 
[0037.0.0.2]其它转运肽由Schmidt等人，[J.Biol.Chem.，Vol.268，No.36，1993：27447-27457]、Della-Cioppa等人，[Plant.Physiol.84，1987：965-968]、de Castro Silva Filho等人，[Plant Mol.Biol.，30，1996：769-780]、Zhao等人，[J.Biol.Chem.Vol.270，No.11，1995：6081-6087]、 等人，[Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.196，No.3，1993：1414-1421]、Keegstra等人，[Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，40，1989：471-501]、Lubben等人，[Photosynthesis Res.，17，1988：173-194]和Lawrence等人，[J.Biol.Chem.，Vol.272，No.33，1997：20357-20363]公开。Kermode Allison R.在Critical Reviews in Plant Science 15(4)：285-423(1996)名为“Mechanisms of Intracellular ProteinTransport and Targeting in Plant Cells”中公开了关于靶向的综述。 
[0038.0.0.2]有利的用于本发明方法并形成本发明核酸序列一部分的转运肽序列通常富含羟基化氨基酸残基(丝氨酸和苏氨酸)，这两种残基通常组成总氨基酸的20-35％。他们通常具有无Gly、Pro和带电残基的氨基末端区域。此外，他们有许多小的疏水氨基酸(例如缬氨酸和丙氨酸)并且通常缺乏酸性氨基酸。此外，他们通常具有富含Ser、Thr、Lys和Arg的中间区域。总体来讲，他们经常具有净正电荷。 
[0039.0.0.2]或者，编码转运肽的核酸序列可根据现有技术公开的转运肽序列结构部分或全部化学合成。所述天然或化学合成的序列可以直接地或通过接头核酸序列连接到编码成熟蛋白质的序列，该接头长度通常可小于500个碱基对，优选小于450、400、350、300、250或200个 碱基对，更优选小于150、100、90、80、70、60、50、40或30个碱基对和最优选小于25、20、15、12、9、6或3个碱基对并且按阅读框架连接编码序列。另外有利的编码转运肽的核酸序列可包括源自一种以上的生物和/或化学源的序列并且可包括源自成熟蛋白质的氨基末端区域的核酸序列，该序列以其天然状态与转运肽连接。本发明的优选实施方式中，所述成熟蛋白质的氨基末端区域长度通常可小于150个氨基酸，优选小于140、130、120、110、100或90个氨基酸，更优选小于80、70、60、50、40、35、30、25或20个氨基酸和最优选小于19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个氨基酸。但是即使较短或较长的片段也是可以的。此外，促进蛋白质运输到其它细胞区室(例如液泡、内质网、高尔基体、乙醛酸循环体、过氧化物酶体或线粒体)的靶向性序列也可以是本发明核酸序列的一部分。由所述本发明核酸序列翻译的蛋白质是一种融合蛋白，这意味着编码转运肽(例如表V所示，优选表中最后一个)的核酸序列与表I应用号2和/或应用号3第5和7栏所示核酸序列连接。本领域技术人员能够以功能性的方式将所述序列连接。有利地，转运肽部分在运输优选进入质体时，从表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质部分上被切除。优选的表V最后一行所示转运肽的所有切割产物优选在表II第5和7栏所提及蛋白质的起始甲硫氨酸之前具有N-末端氨基酸序列QIA CSS或QIA EFQLTT。表II第5和7栏所提及蛋白质的起始甲硫氨酸之前也可能有其它短氨基酸序列，其范围在1至20个氨基酸，优选2至15个氨基酸，更优选3至10个氨基酸，最优选4至8个氨基酸。在氨基酸序列QIA CSS的情况下，起始甲硫氨酸前的三个氨基酸源自LIC(＝无需连接的克隆)表达盒。在大肠埃希氏杆菌基因表达的情况下优选所述短氨基酸序列。在氨基酸序列QIAEFQLTT的情况下，起始甲硫氨酸前的六个氨基酸源自LIC盒。在酿酒酵母基因表达的情况下优选所述短氨基酸序列。熟练的技术人员理解其它短序列也可用于表达表I应用号2和/或应用号3，第5和7栏所提及的 基因。此外，熟练技术人员明白基因表达时并非必需该短序列的事实。 
表V：von Heijne等人公开的转运肽实例 
  
转运肽   生物     转运肽       SEQID NO： 参考文献        
1   地中海伞藻         MASIMMNKSVVLSKECAK PLATPKVTLNKRGFATTIATKNREMMVWQPFNNKMF  ETFSFLPP            960       Mol.Gen.       Genet.218：445-452(1989)     
2    拟南芥                   MAASLQSTATFLQSAKIATAPSRGSSHLRSTQAVGKSFGLETSSARLTCSFQSDFKDFTGKCSDAVKIAGFALATSALVVSGASAEGAPK      971          EMBOJ.     8：3187-   3194(1989)          
3     拟南芥                         MAQVSRICNGVQNPSLICN LSKSSQRKSPLSVSLKTQQ HPRAYPISSSWGLKKSGM  TLIGSELRPLKVMSSVSTA EKASEIVLQPIREISGLIKLP                    972             Mol.Gen.       Genet.210：437-442(1987)                                
4     拟南芥                         MAAATTTTTTSSSISFSTKP SPSSSKSPLPISRFSLPFSLNPNKSSSSSRRRGIKSSSP SS ISAVLNTTTNVTTTPSPTK  PTKPETF              ISRFAPDQPRKGA         973             Plant Physiol.85：1110-1117(1987)                              
5 拟南芥 MITSSLTCSLQALKLSSPF 974 J.Biol.Chem.
[0718]   
转运肽   生物     转运肽       SEQID NO： 参考文献        
    AHGSTPLSSLSKPNSFPNHRMPALVPV              2652763-2767(1990)      
6    拟南芥                   MASLLGTSSSAIWASPSLSSPSSKPSSSPICFRPGKLFGSKLNAGIQIRPKKNRSRYH  VSVMNVATEINSTEQVVG  KFDSKKSARPVYPFAAI    975          EMBO J.    9：1337-  1346(1990)          
7  拟南芥       MASTALSSAIVGTSFIRRSPAPISLRSLPSANTQSLFGLKSGTARGGRVVAM         976    Plant Phvsiol.93：572-577 (1990)      
8  拟南芥       MAASTMALSSPAFAGKAVNLSPAASEVLGSGRVTNRKTV                977    Nucl.Acids Res.14：4051-4064(1986)       
9    拟南芥                   MAAITSATVTIPSFTGLKL AVSSKPKTLSTISRSSSATRAPPKLALKSSLKDFGVIAV ATAASIVLAGNAMAMEVL  LGSDDGSLAFVPSEFT     978          Gene 65：59-69(1988)                                    
10       拟南芥                   MAAAVSTVGAINRAPLSLNGSGSGAVSAPASTFLGKKVVTVSRFAQSNKKSNGSFKVLAVKEDKQTDGDRW RGLAYDTSDDQIDI     961          Nucl.Acids Res.17：2871     (1989)                    
[0719]   
转运肽   生物     转运肽       SEQID NO： 参考文献        
11   拟南芥       MkSSMLSSTAWTSPAQAT MVAPFTGLKSSASFPVTRKANNDITSITSNGGRVSC   962    Plant Mol.Biol.11：745-759(1988)     
12       拟南芥                   MAASGTSATFRASVSSAPS SSSQLTHLKSPFKAVKYTP LPSSRSKSSSFSVSCTIAKDPPVLMAAGSDPALWQRPD  SFGRFGKFGGKYVPE      963          Proc.Natl.     Acad.Sci.USA，86：4604-4608 (1989)        
13       芸苔             MSTTFCSSVCMQATSLAA  TTRISFQKPALVSTTNLSF NLRRSIPTRFSISCAAKPETVEKVSKIVKKQLSLKDDQ  KVVAE                964          Nucl.Acids Res.15：7197     (1987)                    
14     欧洲油菜           MATTFSASVSMQATSLAT TTRISFQKPVLVSNHGRTNLSFNLSRTRLSISC      965       Eur.J.       Biochem.174：287-295      (1988)       
15   莱茵衣藻     MQALSSRVNIAAKPQRAQRLVVRAEEVKAAPKKEVGPKRGSLVK           966    Plant Mol.Biol.12：463-474(1989)     
16 南瓜 MAELIQDKESAQSAATAA AASSGYERRNEPAHSRKFL 967 FEBS Lett.238：424-430       
[0720]   
转运肽   生物     转运肽       SEQID NO： 参考文献        
    EVRSEEELLSCIKK   (1988)
17     菠菜         MSTINGCLTSISPSRTQLK NTSTLRPTFIANSRVNPSSSVPPSLIRNQPVFAAPAPIITPTL                  968       J.Biol.Chem. 265：105414-5417(1990)  
18     菠菜         MTTAVTAAVSFPSTKTTSL SARCSSVISPDKISYKKVPLYYRNVSATGKMGPIRAQI  ASDVEAPPPAPAKVEKMS   969       Curr.Genet.13：517-522        (1988)         
19   菠菜     MTTAVTAAVSFPSTKTTSL SARSSSVISPDKISYKKVPLYYRNVSATGKMGPIRA     970     
[0040.0.0.2]除了借助例如表V所提及的靶向性序列将如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示序列(优选通常在细胞核中所编码的序列)单独或与其它靶向性序列组合靶向优选的质体之外，本发明的核酸可以直接导入质体基因组中。优选地，表I应用号2和/或应用号3第5和7栏所示核酸序列以受在质体中有活性的启动子调控的方式直接导入质体基因组中。
因此，优选的实施方案中，将表I应用号2和/或应用号3第5和7栏所示核酸序列直接导入质体并在其中表达。 
[0041.0.0.2]本说明书上下文中的术语“导入”将指通过“转染”、“转导”或优选“转化”将核酸序列插入生物中。
[0042.0.0.2]如果已将核酸序列导入质体，则质体(例如叶绿体)已被外生的(优选外源)核酸序列“转化”，这是指该序列穿过了膜或质体的膜。可将外源DNA整合(共价连接)到组成质体基因组的质体DNA中，或其保持未整合(例如，通过包括叶绿体复制原点)。“稳定”整合的DNA序列是通过质体复制而被遗传，从而将具有整合的DNA序列特征的新质体转移给后代的那些序列。 
[0043.0.0.2]为了表达，本领域技术人员熟知将核酸分子导入不同细胞器(例如优选质体)的不同方法。该方法例如被Pal Maiga(Annu.Rev.Plant Biol.，2004，55：289-313)、Thomas Evans(WO2004/040973)、Kevin E.McBride等人，(US5,455,818)、Henry Daniell等人，(US 5,932,479 and US 5,693,507)和Jeffrey M.Straub等人，(US6,781,033)公开。优选的方法是源自小孢子(microspore-derived)的下胚轴或子叶组织(其未成熟且因此含有大量质体)叶组织的转化并且随后在选择培养基上从所述转化的植物材料中再生芽。关于轰击植物材料或使用独立复制穿梭载体的转化方法是熟练技术人员公知的。但也可以用PEG介导的质体转化或携带双元载体的农杆菌属物种转化。质体转化中有用的标记是阳性选择标记，例如氯霉素、链霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星(amikamycin)、壮观霉素、三嗪和/或林可霉素抗性基因。文献中提到的其它标记经常作为第二标记，编码抗除草剂抗性的基因，例如草胺膦(＝草铵膦、BASTATM、LibertyTM，由bar基因编码)、草甘膦(＝N-(磷酰基甲基)甘氨酸、Roundup ReadyTM，由5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶基因＝epsps编码)、磺酰脲类(＝StapleTM，由乙酰乳酸合酶基因编码)、咪唑啉酮[＝IMI，咪草烟、甲氧咪草烟、ClearfieldTM，由乙酰羟酸合酶(AHAS)基因编码，也被称作乙酰乳酸合酶(ALS)基因]或溴苯腈(＝BuctrilTM，由oxy基因编码)，或编码诸如潮霉素或G418抗生素的基因也用于进一步选择。在当转化大部分基因组拷贝时的情况下，这些第二标记是有用的。此外，负选择标记例如细 菌胞嘧啶脱氨酶(由codA基因编码)也用于质体转化。 
[0044.0.0.2]为了增加转化体鉴定的可能性，还可以(diserable)使用除了所述基因以外或非上述抗性基因的报告基因。报告基因例如β-半乳糖苷酶、β-葡萄醛酸糖苷酶(GUS)、碱性磷酸酶和/或绿色荧光蛋白基因(GFP)。 
[0045.0.0.2]对于本发明的方法，通过转化质体阻断种内特异转基因流动是非常有益的，因为大量物种(例如玉米、棉花和稻)具有非常严格的质体母性遗传。通过将表I应用号2和/或应用号3第5和7栏指定的基因或其片段放入植物质体中，这些基因将不会出现在所述植物的花粉中。 
本发明又一优选的实施方案涉及所谓“叶绿体定位序列”的应用，其中第一RNA序列或分子能够从细胞内外环境或质体外运输或“陪伴”第二RNA序列到叶绿体中，第二RNA序列例如从选自由表I应用号2和/或应用号3第5和7栏所示序列或者编码选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质的序列所转录的RNA序列。一个实施方案中，叶绿体定位信号与全长或完整类病毒序列基本上相似或互补。该叶绿体定位信号可由转录成叶绿体定位RNA的DNA序列编码。术语“类病毒”指天然存在的单链RNA分子(Flores，C R Acad Sci III.2001 Oct；324(10)：943-52)。类病毒通常含有约200-500个核苷酸并通常以环形分子存在。含有叶绿体定位信号的类病毒实例包括但不限于ASBVd、PLMVd、CChMVd和ELVd。类病毒序列或其功能部分可以与选自如表I应用号2和/或应用号3第5和7栏所示序列或者编码选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质的序列以这样的方式相融合，即使得类病毒序列将由如表I应用号2和/或应用号3第5和7栏所示序列或编码如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质的序列所转录的序列运输到叶绿体中。优选的实施方案使用改良的ASBVd(Navarro等人，Virology.2000 Mar 1；268(1)：218-25)。
[0046.0.2.2]又一具体实施方案中，由不同核酸编码要在质体中表达的蛋白质，例如选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质。此种方法公开于WO 2004/040973，其通过引用作为参考。WO2004/040973教导了一种方法，其涉及通过叶绿体定位序列将对应于基因或基因片段的RNA运输到叶绿体中。将要在植物或植物细胞中表达的基因断裂成核酸片段，该核酸片段被导入植物的不同区室(例如细胞核、质体和/或线粒体)中。描述了其它植物细胞，其叶绿体含有融合于编码本发明方法所使用蛋白质片段的RNA一端的核酶，以致该核酶可以将运输的融合RNA反式剪接为编码该基因片段的RNA以形成，并视情况而定使核酸片段重新连接为完整mRNA，该mRNA例如编码选自由表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示的功能性蛋白质。 
[0047.0.2.2]本发明优选的实施方案中，将本发明方法中使用的选自如表I应用号2和/或应用号3第5和7栏所示核酸序列转化有代谢活性的质体。那些质体应优选在目的植物或植物组织中，最优选绿色植物组织(例如叶或子叶或种子)中发现的叶绿体中保持高拷贝数。 
[0048.0.2.2]为了在质体中良好表达，将如表I应用号2和/或应用号3第5和7栏所示核酸序列导入表达盒，该表达盒优选使用在质体中有活性的启动子和终止子，分别优选叶绿体启动子和叶绿体终止子。该启动子的实例包括来自菠菜或豌豆的psbA启动子，来自玉米的rbcL启动子和atpB启动子。 
[0049.0.2.2]出人意料地发现，选自如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质例如通过与至少一种例如表V所提及的靶向性序列连接而在植物(例如拟南芥)质体中的转基因表达赋予转化的生物以增加的氮或含氮化合物含量。 
[0050.0.0.2]至[0051.0.0.2]参见[0027.0.0.1]至[0028.0.0.1] 
[0052.0.0.2]至[0053.0.0.2]参见[0030.0.0.1]至[0031.0.0.1]
[0054.0.0.2]一个实施方案中，本发明的方法中增加或产生选自如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质或其同源物的活性，优选所述肽与至少一种例如表V所提及的转运肽相连接。 
另一个实施方案中，本发明方法中选自如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质的活性在生物或生物细胞的亚细胞区室(例如细胞器如质体或线粒体)中增加或产生。 
[0055.0.0.2]Goffeau等人，Science 274(5287)，546-547，1996和Philippsen等人，Nature 387(6632增刊)，93-98(1997)已经公布了来自酿酒酵母的YNL241C序列(登录号NP_014158)，并且其活性被定义为“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Zwf1p)”。因此一个实施方案中，本发明的方法包括优选在质体中(例如如本文所示)使用所述“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”或其同源物，而在如所述生物或其部分中用于生产氮或含氮化合物和/或赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增加含N化合物的量。 
因此一个实施方案中，本发明的方法包括优选在质体中(例如如本文所示)使用所述“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”或其同源物而生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于提高氮摄取和/或同化。因此一个实施方案中，本发明方法包括在氮受限的条件下，优选在质体中(例如如本文所示)使用所述“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”或其同源物，用于生产氮或含氮化合物和/或赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增加氮摄取和/或利用和/或同化。 
Blattner等人，Science 277(5331)，1453-1474(1997)已经公布了来自大肠埃希氏杆菌的b1852的序列(登录号NP_416366)，并且其活性被定义为“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”。因此一个实施方案中，本发明的方法包括优选在质体(例如如本文所示)中使用“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”或其同源物，而在如所述生物或其部分中用于生产氮或含氮化合物和/或用于 赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增加含N化合物的量。 
因此一个实施方案中，本发明的方法包括优选在质体中(例如如本文所示)使用“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”或其同源物，而用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量(即含N化合物)，用于提高氮摄取和/或同化。 
因此一个实施方案中，本发明的方法包括在氮受限的条件下，优选在质体中(例如如本文所示)使用“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”或其同源物，而用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增加氮摄取和/或利用和/或同化。 
Goffeau等人，Science 274(5287)，546-547，1996和Anderson等人，J.Biol.Chem 264，19176-19184(1989)已经公布了来自酿酒酵母的YJL167W的序列(登录号NP_012368.1)，并且其活性被定义为“法呢基焦磷酸合成酶(FPP合酶)”。因此一个实施方案中，本发明的方法包括所述优选在质体中(例如如本文所示)使用“法呢基焦磷酸合成酶合成酶(FPP合酶)”或其同源物，而在如所述生物或其部分中生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增加含N化合物的量。 
因此一个实施方案中，本发明的方法包括优选在质体中(例如如本文所示)使用所述“法呢基焦磷酸合成酶(FPP合酶)”或其同源物，而用于生产氮或含氮化合物和/或用于提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量(即含N化合物)，尤其用于提高氮摄取和/或同化。 
因此一个实施方案中，本发明的方法包括在氮受限的条件下，优选在质体中(例如如本文所示)使用所述“法呢基焦磷酸合成酶(FPP合酶)”或其同源物，而用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增 加氮摄取和/或利用和/或同化。 
Goffeau等人，Science 274(5287)，546-547，1996和Guiard等人，EMBO J.4，3265-3272(1985)已经公布了来自酿酒酵母的YML045C的序列(登录号NP_013658.1)，并且其活性被定义为“L-乳酸细胞色素c氧化还原酶/细胞色素b2”。因此一个实施方案中，本发明的方法包括优选在质体中(例如如本文所示)使用所述“L-乳酸细胞色素c氧化还原酶/细胞色素b2”或其同源物，而在如所述生物或其部分中用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增加含N化合物的量。 
因此一个实施方案中，本发明的方法包括优选在质体中(例如如本文所示)使用所述“L-乳酸细胞色素c氧化还原酶/细胞色素b2”或其同源物，而用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量(即含N化合物)，尤其用于提高氮摄取和/或同化。 
因此，一个实施方案中，本发明的方法包括在氮受限的条件下，优选在质体中(例如如本文所示)使用所述“L-乳酸细胞色素c氧化还原酶/细胞色素b2”或其同源物，用于生产氮或含氮化合物和/或用于赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或增加总含氮量(即含N化合物)，尤其是用于增加氮摄取和/或利用和/或同化。 
[0056.0.0.2]至[0058.0.0.2]参见[0033.0.0.1]至[0035.0.0.1] 
[0059.0.0.2]至[0078.0.0.2]参见[0036.1.0.1]至[0055.0.0.1] 
[0079.0.0.2]例如，多肽或核酸分子的分子数或比活性可能增加。如果在缺乏所述蛋白质的活性的生物中从头表达本发明的多肽或核酸，优选单独选自如表I应用号2和/或应用号3，第5和7栏提及的核酸分子或优选与例如表V提及的转运肽连接，或者另一个实施方案中，通过将所述核酸分子导入转基因生物的细胞器(例如质体或线粒体)，那么可以生产更大量的含N化合物。然而，也可以修饰生物中天然存在的基因 表达，例如通过在编码序列前(5引物(5prime))整合编码质体靶向性序列的核酸分子，产生例如导向质体的功能性前蛋白。 
[0080.0.2.2]一个实施方案中，在酿酒酵母YNL241C或其同源物(例如如表II第5或7栏第3行所示)活性增加的情况下，优选在细胞区室中(优选在质体中)，优选赋予氮或含氮化合物的增加为9％至12％或更多，优选赋予植物中氨基酸含量的增加为14％至27％或更多。 
[0061.0.2.2]一个实施方案中，在酿酒酵母蛋白质YNL241C或其同源物活性增加的情况下(优选在细胞区室中，优选在质体中)，优选赋予植物叶子中氮或含氮化合物和脂肪酸、植物甾醇、果糖和/或种子中碳水化合物的增加。 
[0062.0.2.2]一个实施方案中，在大肠埃希氏杆菌蛋白质b1852或其同源物(例如如表II第5或7栏第2行所示)活性增加的情况下，优选在细胞区室中(优选在质体中)活性增加的情况下，优选赋予氮或含氮化合物(优选总含氮量)的增加为6％至13％或更多，优选赋予植物中氨基酸含量的增加为28％至62％或更多。 
[0063.0.2.2]一个实施方案中，在酿酒酵母蛋白质YJL167W或其同源物(例如如表II第5或7栏应用号3第4行所示)活性增加的情况下，优选在细胞区室中(优选在质体中)活性增加的情况下，优选赋予氮或含氮化合物的增加为5％至30％或更多，优选为8％至26％或更多，优选在种子中增加。 
[0064.0.2.2]一个实施方案中，在酿酒酵母蛋白质YML054C或其同源物(例如如表II第5或7栏应用号3第5行所示)活性增加的情况下，优选在细胞区室中(优选在质体中)活性增加的情况下，优选赋予氮或含氮化合物的增加为5％至20％或更多，优选为6％至15％或更多，优选在种子中增加。 
[0065.1.0.2]至[0067.0.0.2]参见[0060.0.0.1]至[0062.0.0.1] 
[0068.0.0.2]一个实施方案中，本发明的方法包括下述步骤中的一 或多个： 
a)稳定蛋白质，该蛋白质优选在细胞区室(优选质体)中赋予具有本文提及的增加含N化合物活性的，由本发明核酸分子编码的蛋白质或本发明多肽的增加的表达，例如，赋予具有选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质活性或其同源物活性的多肽增加的表达；和/或 
b)稳定mRNA，该mRNA增加由本发明核酸分子所编码蛋白质的表达，在本发明的意义下，其为编码转运肽核酸序列和选自如表I，应用号2和/或应用号3第5和7栏所示核酸序列(例如编码具有选自如表II应用号2和/或应用号3第5或7栏所示蛋白质的活性或其同源物活性的多肽的核酸序列)的融合，或增加编码具有本文提及的含N化合物增加活性的本发明多肽的mRNA的表达；和/或 
c)增加蛋白质的比活性，该蛋白质优选在细胞区室(优选质体中)增加具有本文提及的含N化合物增加的活性，由本发明核酸分子所编码蛋白质或本发明多肽的表达，例如，增加具有选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质活性或其同源物活性的多肽的表达，或该蛋白质降低本发明多肽的抑制性调控；和/或 
d)产生或增加内源或人工转录因子的表达，该因子优选在细胞区室(优选质体中)介导蛋白质的表达，该蛋白质增加具有本文提及的含N化合物增加活性，由本发明核酸分子编码的蛋白质或本发明多肽的表达，例如，增加具有选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质活性或其同源物活性的多肽的表达；和/或 
e)通过向生物或其部分添加一种或多种外源诱导因子，刺激蛋白质活性，该蛋白质优选在细胞区室(优选质体)中赋予具有本文提及的含N化合物增加活性，由本发明的核酸分子所编码蛋白质或本发明多肽增加的表达，例如，赋予具有选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质活性或其同源物活性的多肽的增加的表达；和/或
f)表达编码蛋白质的转基因，该蛋白质优选在细胞区室(优选质体)中赋予具有本文提及的含N化合物增加活性，由本发明的核酸分子所编码的多肽或本发明的多肽增加的表达，例如赋予具有选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质活性或其同源物活性的多肽增加的表达；和/或 
g)增加赋予核酸分子增加的表达的基因拷贝数，该核酸分子编码具有本文提及的含N化合物增加活性，由本发明核酸分子编码的多肽或本发明的多肽，例如，赋予具有选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质活性或其同源物活性增加的表达；和/或 
h)通过加入正表达或除去负表达元件，优选在细胞区室(优选质体)中增加编码本发明多肽(例如具有选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质活性或其同源物活性的多肽)的内源基因的表达，例如可以使用同源重组或者将正调控元件导入(如对于植物而言的35S增强子)到启动子，或者除去阻遏物元件形式的调节区。可以使用其它基因转变方法以破坏阻遏物元件或提高正元件的活性。可以通过T-DNA或转座子诱变将正元件随机导入植物并且可以鉴定其中在接近本发明基因处整合有正元件的品系，由此增强本发明基因的表达；和/或 
i)以增强编码本发明蛋白质的基因表达或活性或蛋白质本身的方式调节生物的生长条件，例如，微生物或植物可以在导致热激蛋白表达增强的较高温度方式下生长，其可以导致提高的氮或含氮化合物的生产；和/或 
j)从天然或突变源中选择尤其具有本发明蛋白质的高活性的生物和将其育种到靶生物，例如原种作物；和/或 
k)通过加入质体靶向性序列将具有本文提及的含N化合物增加活性，由本发明核酸分子编码的蛋白质或本发明多肽导向质体，例如将具有选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质活性或其同源物活性的多肽导向质体；和/或
l)在质体中通过本发明的核酸序列(优选以含有导致本发明核酸或多肽在质体中表达的所述序列的表达盒形式)稳定或瞬时转化，有利地稳定转化细胞器(优选质体)产生具有本文提及的含N化合物增加活性，由本发明核酸分子编码的蛋白质或本发明多肽的表达，例如产生具有选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质活性或其同源物活性的多肽的表达； 
m)通过将优选在质体启动子调控下的本发明核酸整合到质体基因组，产生具有本文提及的含N化合物增加活性，由本发明核酸分子编码的蛋白质或本发明多肽的表达，例如产生具有选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示蛋白质活性或其同源物活性的多肽的表达。 
[0069.0.0.2]至[0078.0.0.2]参见[0064.0.0.1]至[0073.0.0.1] 
[0078.1.2.2]还可想到通过同源重组或其它位点特异性整合方法将编码质体靶向信号的核酸序列(如表V示出)导入基因组，使得内源基因与靶向性序列功能性融合且蛋白质被重新导向质体。最终整合也可以随机发生且选择期望的融合事件。 
[0079.0.0.2]至[0104.0.0.2]参见[0074.0.0.1]至[0099.0.0.1] 
[0105.0.2.2]一个优选的实施方案中，本发明涉及用于氮或含氮化合物分别累积和/或生产的方法，其在生物或其部分，优选细胞区室，例如质体或线粒体中包括或产生至少一种包括选自下述内容的核酸分子的表达： 
a)优选编码至少成熟形式的选自如表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示多肽或其片段，且赋予生物或其部分中氮或含氮化合物量的增加的核酸分子； 
b)优选包括至少成熟形式的选自如表I应用号2和/或应用号3第5和7栏所示核酸分子的核酸分子； 
c)由于遗传密码的简并性，可以从由(a)或(b)的核酸分子所编码多肽序列推导其序列，且赋予生物或其部分中氮或含氮化合物量的增 加的核酸分子； 
d)编码与由(a)-(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，且赋予生物或其部分中氮或含氮化合物量的增加的核酸分子； 
e)在严谨性杂交条件下与(a)-(c)的核酸分子杂交，且赋予生物或其部分中氮或含氮化合物量的增加的核酸分子； 
f)编码多肽且赋予生物或其部分中氮或含氮化合物量增加的核酸分子，该多肽通过置换、缺失和/或添加由核酸分子(a)-(d)(优选(a)-(c))所编码多肽的氨基酸序列的一或多个氨基酸而获得。 
g)编码由(a)-(e)(优选(a)-(c))的核酸分子之一所编码多肽的片段或表位，且赋予生物或其部分中氮或含氮化合物量的增加的核酸分子； 
h)包括使用如表III应用号2和/或应用号3第7栏所示引物通过扩增来自cDNA文库或基因组文库扩增核酸分子所获得的核酸分子，且赋予生物或其部分中氮或含氮化合物量的增加的核酸分子； 
i)在抗由(a)-(h)(优选(a)-(c))的核酸分子之一所编码多肽的单克隆抗体辅助下，编码(例如从表达文库)所分离的多肽，且赋予生物或其部分中氮或含氮化合物量的增加的核酸分子； 
j)编码包括选自如表IV应用号2和/或应用号3第7栏所示共有序列的多肽，且赋予生物或其部分中氮或含氮化合物量的增加的核酸分子； 
k)包括一或多个编码一种氨基酸序列的核酸分子且赋予生物或其部分中氮或含氮化合物量的增加的核酸分子，该氨基酸序列是编码表II应用号2和/或应用号3第5和7栏所示多肽结构域的多肽的氨基酸序列；和 
l)可在严谨性杂交条件下通过用包括(a)-(k)(优选(a)-(c))的核酸分子序列之一的探针或用具有至少15nt、优选20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的(a)-(k)(优选(a)-(c))表征的核酸分子片段筛选适宜的核酸文库获得的，且赋予生物或其部分中氮或含氮化合物量的增加的核酸分子； 
或其包括其互补序列。 
[0106.0.2.2]具有表I应用号2和/或应用号3，第5和7栏所示序列的核酸分子，源自表II应用号2和/或应用号3，第5和7栏所示氨基酸序列或源自包括表1V应用号2和/或应用号3，第7栏所示共有序列的多肽的核酸分子或其衍生物或其同源物有利地在本发明的方法中通过细胞溶胶或细胞器(例如质体或线粒体或两者，优选质体)中表达而增加，该衍生物或同源物编码具有如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质的酶活性或生物活性或在其表达或活性增加后赋予氮或含氮化合物的增加的多肽。 
[0107.0.2.2]本发明方法中使用的核酸分子采用分离的核酸序列的形式，其编码具有选自如表II应用号2和/或应用号3第3栏所示蛋白质活性并且通过在细胞或细胞器(例如质体或线粒体或两者中，优选质体)中表达增加而赋予氮或含氮化合物的增加的多肽。 
[0108.0.0.2]至[0210.0.0.2]参见[0101.0.0.1]至[0203.0.0.1] 
[0211.0.0.2]根据本发明上述提及的核酸序列有利地以翻译前蛋白的方式与编码转运肽的核酸序列功能性地连接，该转运肽能够将多肽导向诸如质体的细胞器。另一个优选的实施方案中，根据本发明上述提及的核酸分子有利地与在质体中发挥功能的启动子区功能性地连接，如RNA操纵元启动子与rbcL基因的5`UTR融合，而在另一个优选的实施方案中与同整合位点同源的原质体系序列连接。有用的整合位点的实例是trnV-rps12/7(Skidar等人，Plant Cell Rep.1998，18：20-24及其它报道)、thr rbvL-aacD位点(Svab等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：913-917)、trnI-trnA位点(De Cosa等人，2001，Nat.Biotech.19，71-74)、rps7-ndhB位点(Hou等人，2003，Transgenic Res.12，111-114)和 ndhF-trnL位点(Zhang等人，2001c，Plant Physiol.127，131-141)。 
[0212.0.0.2]编码转运肽的核酸序列有利地源自编码最终留在质体中的蛋白质的核酸序列且其来源于选自下述属的生物： 
伞藻属、鼠耳芥属、芸苔属、衣藻属(Chlamydomonas)、Cururbita、杜氏藻属、裸藻属、黄菊属、大豆属、向日葵属、大麦属、浮萍属、黑麦草属、番茄属、苹果属、日中花属、烟草属、Oenotherea、稻属、Petúnia、菜豆属、立碗藓属、松属、豌豆属、萝卜属、蝇子草属、白芥属、茄属、Spinacea、小麦属和玉蜀黍属(Zea)。 
[0213.0.0.2]优选地，转运肽源自选自下列的蛋白质： 
核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶、5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶、乙酰乳酸合酶、叶绿体核糖体蛋白质CS17、Cs蛋白、铁氧还蛋白、质体蓝素、核酮糖二磷酸羧化酶活化酶、色氨酸合成酶、酰载体蛋白、质体伴侣蛋白-60、细胞色素氧化酶c552、22-kDA热激蛋白、33-kDa放氧提高蛋白1、ATP合成酶γ亚基、ATP合成酶δ亚基、叶绿素-a/b-结合蛋白II-1、放氧提高蛋白2、放氧提高蛋白3、光系统I：P21、光系统I：P28、光系统I：P30、光系统I：P35、光系统I：P37、甘油-3-磷酸转酰酶、叶绿素a/b结合蛋白、CAB2蛋白、羟甲基胆色烷合成酶、丙酮酸正磷酸二激酶、CAB3蛋白、质体铁蛋白、铁蛋白、早期光诱导蛋白、谷氨酸-1-半醛转氨酶、原叶绿素酸酯还原酶、淀粉粒结合淀粉酶合成酶、光系统II的集光叶绿素IIa/b-结合蛋白、主要花粉致敏原Lol p 5a、质体ClpB ATP-依赖型蛋白酶、超氧化物歧化酶、铁氧还蛋白NADP氧化还原酶、28-kDa核糖核蛋白、31-kDa核糖核蛋白、33-kDa核糖核蛋白、乙酰乳酸合酶、ATP合酶CF0亚基1、ATP合酶CF0亚基2、ATP合酶CF0亚基3、ATP合酶CF0亚基4、细胞色素f、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、谷氨酰胺合酶、谷氨酰胺合酶2、碳酸酐酶、GapA蛋白、热激蛋白21、磷酸易位蛋白、质体ClpA ATP-依赖型蛋白酶、质体核糖体蛋白CL24、质体核糖体蛋白CL9、质体核糖体蛋白PsCL18、质体核糖体蛋 白PsCL25、DAHP合酶、淀粉磷酸化酶、根酰基载体蛋白II、甜菜醛脱氢酶、GapB蛋白、谷氨酰胺合酶2、磷酸核酮糖激酶、亚硝酸还原酶、核糖体蛋白L12、核糖体蛋白L13、核糖体蛋白L21、核糖体蛋白L35、核糖体蛋白L40、丙糖磷酸-3-磷酸丙糖(phosphoglyerate)-磷酸易位蛋白、铁氧化还原蛋白-依赖型谷氨酸合酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、NADP-依赖型苹果酸酶和NADP-苹果酸脱氢酶。原质体系序列优选源自靶生物自身的原质体系并有利地源自下述整合位点之一：trnV-rps12/7(Skidar等人，Plant Cell Rep.1998、18：20-24及其它报道)、rbvL-aacD(Svab等人，1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917)、trnI-trnA(DeCosa等人，2001、Nat.Biotech.19、71-74)rps7-ndhB(Hou等人，2003、Transgenic Res.12、111-114)或ndhF-trnL位点(Zhang等人，2001c、Plant Physiol.127、131-141)。 
[0214.0.0.2]将本方法中使用的核酸序列有利地导入核酸构建体，优选导入表达盒，其使得可以在生物，优选植物或微生物(例如藻类)中，有利地在那些生物的质体中表达核酸分子。 
[0215.0.0.2]原则上，核酸构建体可以包括本文描述的调控序列和其它用于表达所包括基因的相关序列。因此，本发明的核酸构建体可以用作表达盒并因此可以用于直接导入植物，或可将其导入载体。因此一个实施方案中，核酸构建体是包括微生物启动子或微生物终止子或两者的表达盒。另一个实施方案中，表达盒包含植物启动子或植物终止子或两者。另一个实施方案中，表达盒包括用于由质体RNA聚合酶转录的序列。 
[0216.0.0.2]因此，一个实施方案中，本发明的方法包括下述步骤： 
在细胞或生物或其部分中，优选在植物、植物细胞或微生物(优选在细胞器，例如其质体)中，导入 
(a)核酸构建体，其包括本发明的或本发明方法中使用的或编码 本发明的或本发明方法中使用的多肽的核酸分子；或 
(b)核酸分子，包括调控序列或因子，其表达增加本发明的或本发明方法中使用的或编码本发明的或本发明方法中使用多肽的核酸分子的表达； 
(c)在细胞或生物或其部分中表达(a)或(b)中提及的核酸构建体或核酸分子所编码的基因产物。 
[0217.0.0.2]至[0370.0.0.2]参见[0204.0.0.1]至[0357.0.0.1] 
[0371.0.2.2]本发明的一个实施方案中，植物表达载体包括如附图：图3和/或图4所述的那些。 
[0372.0.0.2]至[0441.0.0.2]参见[0359.0.0.1]至[0428.0.0.1] 
[0442.0.2.2]实施例1：克隆用于在植物中表达的根据SEQ ID NO：1,327,987或1156的本发明序列 
[0443.0.2.2]除非另有指定，使用由Sambrook等人，MolecularCloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor 1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press所述的标准操作程序。 
[0444.0.22]按Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶(Stratagene)操作程序所述，通过PCR扩增本发明序列 
[0445.0.2.2]Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶操作程序的成分如下：1x PCR缓冲液(Stratagene)，0.2mM每种dNTP，100ng酿酒酵母(菌株S288C；Research Genetics，Inc.，现为Invitrogen)或大肠埃希氏杆菌(菌株MG1655；E.coli Genetic Stock Center))基因组DNA，50pmol正向引物，50pmol反向引物，2.5u Pfu Turbo或HerculaseDNA聚合酶。扩增循环如下： 
[0446.0.2.2]酿酒酵母：94-95℃ 3分钟循环一次，随后进行25-36 个循环，每个循环都包括95℃ 1分钟或94℃ 30秒、50℃ 45秒、50℃30秒或55℃ 30秒和72℃ 210-480秒，然后72℃ 8分钟循环一次，然后4℃。 
[0447.0.2.2]大肠埃希氏杆菌：94℃ 2-3分钟循环一次，随后进行25-30个循环，每个循环都包括94℃ 30秒、55-60℃ 30秒和72℃ 5-10min，然后72℃ 10分钟循环一次，然后4℃。 
[0448.0.2.2]出于克隆的目的将下述连接物序列加入酿酒酵母ORF特异引物(参见表IV)中： 
i)正向引物：5′-GGAATTCCAGCTGACCACC-3′SEQ ID NO：985 
ii)反向引物：5′-GATCCCCGGGAATTGCCATG-3′SEQ ID NO：986 
出于克隆的目的将下述连接物序列加入大肠埃希氏杆菌ORF特异引物中： 
iii)正向引物：5′-TTGCTCTTCC-3′SEQ ID NO：979 
iiii)反向引物：5`-TTGCTCTTCG-3′SEQ ID NO：980 
因此，为了扩增并克隆酿酒酵母SEQ ID NO：327，使用由连接物序列i)和ORF特异序列SEQ ID NO：675组成的引物，和由连接物序列ii)和ORF特异序列SEQ ID NO：676组成的第二引物。为了扩增并克隆大肠埃希氏杆菌SEQ ID NO：1，使用由连接物序列iii)和ORF特异序列SEQ ID NO：317组成的引物，和由连接物序列iiii)和ORF特异序列SEQ ID NO：318组成的第二引物。 
为了扩增并克隆酿酒酵母SEQ ID NO：987，使用由连接物序列i)和ORF特异序列SEQ ID NO：1147(如表III第7栏第4行所示)组成的引物和由连接物序列ii)和ORF特异序列SEQ ID NO：1148(如表III第7栏第4行所示)组成的第二引物。
为了扩增并克隆酿酒酵母SEQ ID NO：1156，使用由连接物序列i)和ORF特异序列SEQ ID NO：1184(如表III第7栏第5行所示)组成的引物和由连接物序列ii)和ORF特异序列SEQ ID NO：1185(如表III第7栏第5行所示)组成的第二引物。 
[0449.0.2.2]用于将表达的蛋白质靶向质体的二元载体的构建 
为了组成型表达，用于克隆靶向性序列的二元载体是1bxSuperResgen SEQ ID NO：958和1bxSuperColi SEQ ID NO：957。为了在种子中强表达，用于克隆靶向性序列的二元载体是1bxUSPResgenSEQ ID NO：1194(图3)和1bxUSPColi SEQ ID NO：1195(图4)，其含有USP启动子(Baeumlein等人，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67)。其它有用的二元载体是熟练技术人员已知的；二元载体及其用途的综述可以参见Hellens，R.，Mullineaux，P.和Klee H.，[(2000)“Aguide to Agrobacterium binary vectors”，Trends in Plant Science，Vol.5No.10，446-451]。该载体已同样装配有合适的启动子和靶向性序列。 
[0450.0.2.2]从菠菜(Spinacia oleracea)扩增基因FNR的靶向性序列 
为了从菠菜扩增FNR基因的靶向性序列，从四周龄菠菜植物叶子中提取基因组DNA(DNeasy Plant Mini Kit，Qiagen，Hilden)。gDNA用作PCR模板。 
为了能够将转运序列克隆到载体1bxSuperResgen，向正向和反向引物中都添加EcoRI限制性酶识别序列，而为了克隆到载体1bxSuperColi，向正向引物添加PmeI限制性酶识别序列并向反向引物添加NcoI位点。 
FNR5EcoResgen ATA gAA TTC gCA TAA ACT TAT CTT CATAgT TgC C SEQ ID NO：983 
FNR3EcoResgen ATA gAA TTC AgA ggC gAT CTg ggC CCTSEQ ID NO：981 
FNR5PmeColic ATA gTT TAA ACg CAT AAA CTT ATC TTC ATA gTT gCC SEQ ID NO：984 
FNR3NcoColic ATA CCA Tgg AAg AgC AAg Agg CgA TCT gggCCC T SEQ ID NO：982 
从菠菜扩增的序列SEQ ID NO：959包括5′UTR(bp1-166)和编码区(bp167-275和353-419)。该编码区由从bp276到bp352的内含子序列所打断。 
Gcataaacttatcttcatagttgccactccaatttgctccttgaatctcctccacccaatacataatccactcctccatcacccacttcactactaaatcaaacttaactctgtttttctctctcctcctttcatttcttattcttccaatcatcgtactccgccatgaccaccgctgtcaccgccgctgtttctttcccctctaccaaaaccacctctctctccgcccgaagctcctccgtcatttcccctgacaaaatcagctacaaaaaggtgattcccaatttcactgtgttttttattaataatttgttattttgatgatgagatgattaatttgggtgctgcaggttcctttgtactacaggaatgtatctgcaactgggaaaatgggacccatcagggcccagatcgcctct 
将由引物FNR5EcoResgen和FNR3EcoResgen得到的PCR片段用EcoRI消化并且与已经由EcoRI消化了的载体1bxSuperResgen SEQ IDNO：958或1bxUSPResgen SEQ ID NO：1194连接。通过测序检测FNR靶向性序列的正确方向。在这一连接步骤中产生的载体分别是1bxSuperTPFNRResgen或1bxUSPTPFNRResgen。 
将由引物FNR5PmeColic和FNR3NcoColic得到的PCR片段用PmeI和NcoI消化并且与已经由SmaI和NcoI消化了的载体1bxSuperColic SEQ ID NO：957或1bxUSPColic SEQ NO：1195连接。在这一连接步骤中产生的载体分别是1bxSuperTPFNRColic或1bxUSPTPFNRColic。 
[0451.0.2.2]为了分别从酿酒酵母中克隆SEQ ID NO：327，987或1156的ORF，用限制性酶NcoI处理载体DNA。为了从大肠埃希氏杆菌克隆诸如SEQ ID NO：1的ORF，用限制性酶PacI和NcoI按照标准操作程序(MBI Fermentas)处理载体DNA。通过在70℃失活20min停止反应并按标准操作程序(Qiagen)用QIAquick柱纯化产物。
然后按照标准操作程序(MBI Fermentas)用T4 DNA聚合酶处理代表所扩增ORF的PCR产物和载体DNA以生产单链突出端，程序参数为：针对载体用1单位T4 DNA聚合酶37℃，2-10min和1u T4 DNA聚合酶15℃，10-60min产物。 
通过添加高盐缓冲液停止反应并且在QIAquick柱中按照标准操作程序(Qiagen)纯化。 
[0452.0.0.2]将约30ng制备好的载体和限定量的已制备扩增物混合并在65℃杂交15min，随后37℃，0.1℃/1秒，随后37℃，10min，随后0.1℃/1秒，然后4℃。 
[0453.0.0.2]在同一反应容器中添加感受态大肠埃希氏杆菌细胞(菌株DH5-α)并在1℃孵育20分钟，然后在42℃热激90秒并冷却至4℃，以转化连接好的载体。然后添加完全培养基(SOC)并将混合物在37℃孵育45分钟。然后将全部混合物涂布在含有0.05mg/ml卡那霉素的琼脂平板上并在37℃孵育过夜。 
[0454.0.0.2]克隆步骤的结果通过扩增验证，该扩增使用结合在整合位点上游和下游的引物，从而允许扩增插入物。按Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL)操作程序进行所述扩增。 
[0455.0.0.2]扩增循环如下：94℃ 5分钟循环1次，随后进行35个循环，每个循环包括94℃ 15秒、50-60℃ 15秒和72℃ 5分钟，然后72℃ 10分钟循环1次，然后于4℃保温。 
[0456.0.0.2]检测若干菌落，但仅将检测到含有期望大小的PCR产物的一个菌落用于下面的步骤。 
[0457.0.0.2]将此阳性菌落的一部分转移到装有补充了卡那霉素(50μg/ml)的完全培养基(LB)的反应容器中并于37℃过夜孵育。 
[0458.0.0.2]按照Qiaprep标准操作程序(Qiagen)说明进行质粒制备。
[0459.0.2.2]实施例2：产生分别表达SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：327或SEQ ID NO：987或SEQ ID NO：1156的转基因植物 
[0460.0.0.2]将1-5ng分离的质粒DNA电穿孔转化入根癌农杆菌菌株GV 3101 pMP90(Koncz和Schell，Mol.Gen.Gent.204，383-396，1986)的感受态细胞中。此后，加入完全培养基(YEP)并将该混合物转移进新反应容器中在28℃孵育3小时。此后，将所有的反应混合物涂布在添加了各自抗生素(例如利福平(0.1mg/ml)、庆大霉素(0.025mg/ml)和卡那霉素(0.05mg/ml))的YEP琼脂平板上，并在28℃孵育48小时。 
[0461.0.0.2]该含有质粒构建体的农杆菌可随后用于植物转化。 
[0462.0.0.2]借助吸管头从琼脂平板上挑出菌落并用3ml液体TB培养基吸收，该培养基如上所述也含有合适的抗生素。在28℃和120转/分钟下培养预培养物48小时。 
[0463.0.0.2]将400ml含有与上述相同的抗生素的LB培养基用于主要培养物。将预培养物转移到主要培养物中。在28℃和120转/分钟下生长18h。4000转/分钟离心后，将沉淀物在渗入培养基(MS培养基，10％蔗糖)中重悬浮。 
[0464.0.0.2]为了培养用于转化的植物，将设有滤网底部的平皿(Piki Saat 80，绿色，30 x 20 x 4.5cm，来自Wiesauplast，Kunststofftechnik，德国)用GS90基质(标准土壤，Werkverband E.V.，德国)半充满。用0.05％的Proplant溶液(Chimac-Apriphar，Belgium)给平皿给平皿加水过夜。将拟南芥C24的种子(Nottingham ArabidopsisStock Centre，UK；NASC Stock N906)散布在平皿上，大约每个平皿1000粒种子。用罩盖上平皿并置于层化设备(8h，110μmol/m2/s-1，22℃；16h，黑暗，6℃)中。五天后，将平皿置于短日照人工气候室中(8h 130μmol/m2/s-1，22℃；16h，黑暗20℃)，将其在那里保持大约10天直到第一片真叶形成。
[0465.0.0.2]将幼苗转移至包含相同基质的盆中(Teku盆，7cm，LC系列，
Figure G2007800201189D0186093320QIETU
 GmbH & Co，德国制造)。每盆移入五棵植物。然后将盆放回短日照人工气候室使植物继续生长。 
[0466.0.0.2]10天后，将植物转移进温室内(辅助光照，16h，340μE，22℃；8h，黑暗，20℃)，在那里允许其再生长17天。 
[0467.0.0.2]为了转化，将刚开始开花的六周龄鼠耳芥属植物在上述先前用10μl Silwett L77(Crompton S.A.，Osi Specialties，瑞士)处理过的农杆菌悬浮液中浸渍10秒。所述方法描述于Clough和Bent，1998(Clough，JC and Bent，AF.1998 Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana，Plant J.16：735-743)。 
[0468.0.0.2]随后将植物在加湿室内放置18小时。此后，将盆送回温室使植物继续生长。在温室中再保持植物10周直到可以收获种子。 
[0469.0.0.2]根据为了选择转化的植物而使用的抗性标记，在温室中种植收获的种子并进行喷药选择，或先灭菌然后在添加了各自选择试剂的琼脂平板上培养。由于含有bar基因作为抗性标记的载体，以2到3天的间隔用0.02％ 
Figure G2007800201189D0186132251QIETU
喷洒幼苗四次，并允许转基因植物结种子。将转基因拟南芥植物的种子保存在冰箱中(-20℃)。 
[0470.0.0.2]随后将植物在加湿室内放置18小时。此后，将盆送回温室使植物继续生长。在温室中再保持植物10周直到可以收获种子。 
[0471.0.0.2]实施例3：氮含量分析 
[0472.0.0.2]使用Dumas法对样品中的氮进行确定，该方法依赖于实验材料的完全燃烧。在高温熔炉中加热样品并在纯氧存在下使其迅速燃烧。收集燃烧产物(主要是CO2、H2O、NOx和N2)并使其平衡。使气体混合物的等分试样通过热铜并除去任何氧气以及将NO2转换成N2。然后将样品通过除去CO2和H2O的捕捉器。通过热导检测器测量剩余氮。
对于叶材料或种仁的分析，使用均质化的冻干材料。就鼠耳芥属植物种子而言，直接分析种子而无需预处理。 
[0473.0.0.2]在锡箔杯中称量4-7mg样品和15mg钨(VI)氧化物(WO3)。使用商用元素分析仪(例如ELEMENTAR vario EL III，ELEMENTAR，Hanau，德国)进行分析。 
[0474.0.2.2]表VII示出在质体区室中在如上所述的USP启动子调控下分别表达大肠埃希氏杆菌ORF酵母ORF b1852(对应于SEQ IDNO：1)或酿酒酵母ORF YNL241c(对应于SEQ ID NO：327)或酿酒酵母ORF YJL167W(对应于SEQ ID NO：987)或酿酒酵母ORFYML054C(对应于SEQ ID NO：1156)的转基因植物的种子中增加总含氮量。第1栏示出在质体区室中表达的所分析的ORF，第2栏示出所测元素，第3栏示出作为“相对标准差”的野生型变量，第4栏示出分别转化有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：327或SEQ ID NO：987或SEQ IDNO：1156的不同转基因系相对于被标准化为“1”的野生型对照而言在元素含量上的平均变化，第5栏示出不同转基因系的标准差和第6栏示出观察到的最大变化。不出所料，氮的相对增加对应于碳含量的相对减少。 
  
  ORF     参数 野生型变量          (RSD；％)  相对于野生型            对照，平均值   SD         最大变化
b1852 ％N 0.05 1.06 0.08 1.13
b1852  YNL241CYNL241CYJL167W ％C％N％C％N 0.010.050.01na   1.011.090.961.08 0.010.040.020.1  0.991.120.941.26
YJL167W ％C na 0.96 0.37 0.89
YML054C ％N na 1.06 0.06 1.15
YML054C ％C na 0.99 0.02 0.95
[0862] [0475.0.2.2]实施例4：提高的氮利用效率 
为了检测转基因系的提高的氮利用效率，在氮受限条件下使植物生长： 
在质体区室中分别表达大肠埃希氏杆菌ORF酵母ORF b1852(对应于SeqID NO：1)或酿酒酵母ORF YNL241c(对应于SEQ ID NO：327)或酿酒酵母ORF YJL167W(对应于SEQ ID NO：987)或酿酒酵母ORFYML054C(对应于SEQ ID NO：1156)的转基因系显示在氮受限条件下与野生型对照植物相比提高的生长和减少的氮缺乏症状(白化、生长迟缓、衰老)。
Figure G2007800201189D01891
Figure G2007800201189D01901
Figure G2007800201189D01911
Figure G2007800201189D01921
Figure G2007800201189D01931
Figure G2007800201189D01951
Figure G2007800201189D01961
Figure G2007800201189D01981
Figure G2007800201189D02001

Claims (16)

1.一种用于在植物中提高氮同化、累积和/或利用和/或用于增加总含氮量的方法，其包括：
a、在植物细胞器中增加或产生由SEQ ID NO：689所示核酸序列编码的蛋白质的活性，或
b、在植物，或在其一或多种部分中增加或产生由SEQ ID NO：689所示核酸序列编码的蛋白质的活性，该核酸序列与编码转运肽的核酸序列连接；或
c、或在植物，或在其一或多种部分中增加或产生由SEQ ID NO：689所示核酸序列编码的蛋白质的活性，该核酸序列与编码叶绿体定位序列的核酸序列连接；和
d、在允许提高氮同化、累积和/或利用和/或用于增加总含氮量的条件下使植物生长。
2.一种用于在植物中提高氮同化、累积和/或利用和/或用于增加总含氮量的方法，其包括在植物或其部分或其区室中增加或产生至少一种核酸分子的表达，该核酸分子包括选自下述核酸分子的核酸分子或包括与下述核酸分子互补的序列：
a)编码如SEQ ID NO：690所示多肽，且其赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或用于增加总含氮量的核酸分子，
b)如SEQ ID NO：689所示核酸分子，且其赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或用于增加总含氮量的核酸分子，
c)由于遗传密码的简并性，可以从由(a)或(b)的核酸分子所编码的多肽序列推导出其序列，且其赋予提高的氮同化、累积和/或利用和/或用于增加总含氮量的核酸分子。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述蛋白质的活性或所述核酸分子的表达是瞬时或稳定增加或产生。
4.一种赋予SEQ ID NO：689的核酸分子在植物中表达的适合在植物中表达的核酸构建体，包括一或多种能够在植物细胞中调控所述核酸分子表达的调控元件。
5.一种包括SEQ ID NO：689的核酸分子或权利要求4的核酸构建体的适合在植物中表达的载体。
6.权利要求5的载体，其中该核酸分子与调控序列有效连接以在原核或真核宿主，或者在原核和真核宿主中表达。
7.一种稳定或瞬时转化了如权利要求5或6所述的载体或SEQ IDNO：689的核酸分子或权利要求4的核酸构建体的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞、昆虫细胞、酵母或其他真菌细胞。
8.一种产生转基因宿主细胞的方法，包括向所述宿主细胞稳定或瞬时导入如权利要求5或6所述的载体或SEQ ID NO：689的核酸分子或权利要求4的核酸构建体。
9.权利要求8的方法，其中所述宿主细胞是植物细胞。
10.一种生产多肽的方法，其中该多肽在权利要求7所述的宿主细胞或者在由权利要求8-9中任一项所述的方法所产生的转基因宿主细胞中表达。
11.根据权利要求8-9中任一项的方法，其中所述宿主细胞对抑制氮同化、累积和/或利用和/或抑制总含氮量增加的除草剂具有抗性。
12.根据权利要求1-2的方法，其特征在于提高的总产量或蛋白质产量。
13.根据权利要求1-2的方法，其特征在于在氮受限条件下植物的生长增强。
14.SEQ ID NO：689的核酸分子、权利要求4的核酸构建体、权利要求5或6的载体、权利要求7的宿主细胞或由权利要求8-9中任一项的方法所获得的转基因宿主细胞在获得提高的生物量总产量中的用途。
15.SEQ ID NO：689的核酸分子、权利要求4的核酸构建体、权利要求5或6的载体、权利要求7的宿主细胞或由权利要求8-9中任一项的方法所获得的转基因宿主细胞在获得提高的种子或蛋白质质量的产量中的用途。
16.SEQ ID NO：689的核酸分子、权利要求4的核酸构建体、权利要求5或6的载体、权利要求7的宿主细胞或由权利要求8-9中任一项的方法所获得的转基因宿主细胞在氮受限条件下获得提高的生长或产量中的用途。
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