JP5870464B2 - 長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子 - Google Patents

Description

本発明は、長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子、該遺伝子を含む発現ベクターにより形質転換された植物、および該植物を用いるトランス−１，４−ポリイソプレンの製造方法に関する。

イソプレノイド化合物の一種であるポリイソプレン（ゴム）は、イソプレン単位の重合の様式の相違からシス型とトランス型とに分類される。長鎖シス型ポリイソプレン（シス−１，４−ポリイソプレン）を産生する植物としては、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、キク科のタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）およびアキノノゲシ（Ｌａｃｔｕｃａ ｉｎｄｉｃａ）などの多くの植物が知られている。なかでも、パラゴムノキが産生するシス−１，４−ポリイソプレンは、天然ゴムとして商業的に広く利用されている（非特許文献１）。一方、長鎖トランス型ポリイソプレン（トランス−１，４−ポリイソプレン）については、天然には、トチュウ科のトチュウ（杜仲、Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）、キョウチクトウ科のペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）、アカテツ科のバラタ（Ｍｉｍｕｓｏｐｓ ｂａｌａｔａ）およびグッタペルカノキ（Ｐａｌａｑｕｉｕｍ ｇｕｔｔａ）などの少数の植物が産生することが知られているが、商業的には利用されていない（非特許文献２）。なかでも、中国原産の木本植物であるトチュウは、繊維状のトランス−１，４−ポリイソプレンを産生する。トチュウの葉、樹皮および果皮には大量のトランス−１，４−ポリイソプレンが含まれている（非特許文献２）。しかし、現在、トランス−１，４−ポリイソプレンは、化学的に合成され、ゴルフボール外皮、ギプス、スポーツプロテクターなどに使用されている。トランス−１，４−ポリイソプレンは、低融点および高弾性を示す熱可塑性エラストマーであり、絶縁体としても有用である。なお、天然ゴムという語句は、一般的には天然物由来のゴム全般を指すが、産業的にはパラゴムノキから得られるシス型ゴムのみを指す場合がある。高等植物におけるゴムの産生は珍しいものではなく、約５００の植物種でゴムの含有が確認されている（非特許文献３）。

天然のイソプレノイド化合物は、いずれも炭素数５（Ｃ５）のイソプレン単位が連続的につながったプレニル二リン酸を中間体として生合成され、このプレニル二リン酸は、いずれもプレニル二リン酸合成酵素によって生合成される（非特許文献４および５）。プレニル二リン酸合成酵素とは、プライマー基質となるプレニル二リン酸（アリル基質）に、炭素数５（Ｃ５）の化合物であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が縮合する反応を触媒し、プライマー基質よりもイソプレン単位数（鎖長）が大きいプレニル二リン酸を生成物とする酵素の総称である（特許文献１）。プレニル二リン酸合成酵素はまた、プレニル基転移酵素（プレニルトランスフェラーゼ）またはプレニル鎖延長酵素とも呼ばれる（非特許文献６）。

プレニル二リン酸合成酵素の基質であるＩＰＰは、メバロン酸経路などにより生合成される。メバロン酸経路に関与する酵素の遺伝子群の一部は、トチュウなどの種々の植物において、明らかにされている。

プレニル二リン酸合成酵素には、ＩＰＰの縮合の際に形成される二重結合が、Ｅ型（トランス型）を形成する縮合反応を触媒する酵素と、Ｚ型（シス型）を形成する縮合反応を触媒する酵素とがある。また、プレニル二リン酸合成酵素は、縮合反応により生成したプレニル二リン酸にさらにＩＰＰが縮合する反応を触媒することがある。各プレニル二リン酸合成酵素によって、このようなＩＰＰの縮合重合反応により生成可能な最大のイソプレン鎖長（ＩＰＰの重合度）が決まっている。そして、生成物のイソプレン鎖長に応じて生成物の疎水性が変化するので、酵素活性の発現様式には大きな違いがある。

具体的には、プレニル二リン酸合成酵素は、プレニル二リン酸合成酵素Ｉ（Ｅ型短鎖プレニル二リン酸合成酵素）、プレニル二リン酸合成酵素ＩＩ（Ｅ型中鎖プレニル二リン酸合成酵素）、プレニル二リン酸合成酵素ＩＩＩ（Ｅ型長鎖プレニル二リン酸合成酵素）およびプレニル二リン酸合成酵素ＩＶ（Ｚ型長鎖プレニル二リン酸合成酵素）の４つに分類される（特許文献１）。

プレニル二リン酸合成酵素Ｉ（Ｅ型短鎖プレニル二リン酸合成酵素）としては、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素（Ｃ５→Ｃ１０）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）合成酵素（Ｃ１０→Ｃ１５）およびゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）合成酵素（Ｃ１５→Ｃ２０）が挙げられる。ここで、例えば、「Ｃ５→Ｃ１０」とは、炭素数５（Ｃ５）のプライマー基質となるプレニル二リン酸から、炭素数５のＩＰＰの縮合により、炭素数１０（Ｃ１０）のプレニル二リン酸が生成する反応を触媒することを意味する。

プレニル二リン酸合成酵素ＩＩ（Ｅ型中鎖プレニル二リン酸合成酵素）としては、ヘキサプレニル二リン酸（ＨｅｘＰＰ）合成酵素（Ｃ１５→Ｃ３０）およびヘプタプレニル二リン酸（ＨｅｐＰＰ）合成酵素（Ｃ１５→Ｃ３５）が挙げられる。

プレニル二リン酸合成酵素ＩＩＩ（Ｅ型長鎖プレニル二リン酸合成酵素）としては、オクタプレニル二リン酸（ＯｃｔＰＰ）合成酵素（Ｃ１５→Ｃ４０）、ノナプレニル二リン酸（ＮｏｎＰＰ）合成酵素（Ｃ１０→Ｃ４５）およびデカプレニル二リン酸（ＤｅｃＰＰ）合成酵素（Ｃ１５→Ｃ５０）が挙げられる。

プレニル二リン酸合成酵素ＩＶ（Ｚ型長鎖プレニル二リン酸合成酵素）としては、Ｚ−ノナプレニル二リン酸合成酵素（Ｃ１５→Ｃ４５）、ウンデカプレニル二リン酸（ＵＰＰ）合成酵素（Ｃ１５→Ｃ５５）およびデヒドロドリキル二リン酸（ｄｅＤｏｌＰＰ）合成酵素（Ｃ１５→Ｃ８５〜１０５）が挙げられる。

シス型ゴム産生植物であるパラゴムノキからラバートランスフェラーゼ遺伝子（ＨＲＴ２）が単離され、ＨＲＴ２遺伝子がコードするタンパク質はゴム粒子にＩＰＰを縮合させるシス型プレニル二リン酸合成活性を有することが認められている。さらに、ＨＲＴ２遺伝子は出芽酵母のデヒドロドリキル二リン酸合成酵素の機能欠損を相補することが認められている（非特許文献７）。しかし、ＨＲＴ２遺伝子を含む発現ベクターによってパラゴムノキを形質転換し、パラゴムノキが産生するシス−１，４−ポリイソプレン（シス型ゴム）の含量を増大させたとの報告はない。

一方、トランス型ゴム産生植物であるトチュウ、ペリプロカ、バラタおよびグッタペルカノキから、トランス型ゴムの生合成に関与する長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素の遺伝子は単離同定されていない。本発明者らは、トチュウからプレニルトランスフェラーゼの遺伝子を単離しているが（塩基配列：GenBank登録番号AB041626およびアミノ酸配列：GenBank登録番号BAB16687）、シス型プレニル二リン酸合成酵素であるかトランス型プレニル二リン酸合成酵素であるか、および短鎖プレニル二リン酸合成酵素であるか長鎖プレニル二リン酸合成酵素であるかについては未だ同定していない。

ところで、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ＨＭＧＲ）は、プレニル二リン酸合成酵素の基質であるＩＰＰの生合成系における鍵酵素と考えられる。このＨＭＧＲの触媒ドメイン（ＨＭＧＲ−ＣＤ）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターによってシロイヌナズナを形質転換すると、形質転換されたシロイヌナズナは、野生型と比較して、ステロール類の総含量が約３．６倍に増大する（非特許文献８）。ここで、ステロール類は、ＩＰＰを基質として生合成されるイソプレノイド化合物の一種である。

コエンザイムＱ１０なども、トランス型イソプレノイド化合物の一種として知られている。野生型のイネは、ソラネシル二リン酸（イソプレン単位が９個重合したもの）を中間体として、コエンザイムＱ９を産生する。グルコノバクターサブオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）由来のデカプレニル二リン酸（イソプレン単位が１０個重合したもの）合成酵素をコードするＤＮＡを含む発現ベクターによってイネを形質転換すると、形質転換されたイネは、コエンザイムＱ９を産生せず、デカプレニル二リン酸を中間体とするコエンザイムＱ１０を産生する（非特許文献９）。真菌由来のデカプレニル二リン酸合成酵素をコードするＤＮＡを含む発現ベクターによって大腸菌を形質転換すると、形質転換された大腸菌は、デカプレニル二リン酸を中間体とするコエンザイムＱ１０を効率よく産生する（特許文献２および３）。

特開２００４−２４２７５号公報 国際公開第２００２／０９２８１１号 国際公開第２００２／０４０６８２号

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本発明は、植物のトランス−１，４−ポリイソプレンの含量を増大させる方法、および植物を用いるトランス−１，４−ポリイソプレンの効率的な製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、トチュウから長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子を単離同定し、この遺伝子を含む発現ベクターにより植物を形質転換することによって、植物のトランス−１，４−ポリイソプレンの含量を増大させることができ、該植物を用いることによって、トランス−１，４−ポリイソプレンを効率的に製造できることを見出して、本発明を完成した。

本発明は、長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子を提供し、該遺伝子は、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列の８８位から１１３４位までの塩基配列またはその相補配列、配列番号３に記載の塩基配列の４２位から１０８８位までの塩基配列またはその相補配列、および配列番号５に記載の塩基配列の９１位から１１４０位までの塩基配列またはその相補配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列でなるＤＮＡ；
（ｂ）該（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成するＤＮＡであって、長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列との間において１０^−８０以下のＥ−ｖａｌｕｅを有し、かつ長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質、をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入されたアミノ酸配列でなり、かつ長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質、をコードするＤＮＡ。

本発明はまた、長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素を提供し、該酵素は、以下の（Ａ）から（Ｃ）のいずれかのタンパク質からなる：
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列でなるタンパク質；
（Ｂ）該（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列との間において１０^−８０以下のＥ−ｖａｌｕｅを有し、かつ長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質；
（Ｃ）該（Ａ）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入されたアミノ酸配列でなり、かつ長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質。

本発明はさらに、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子を含む発現ベクターを提供する。

本発明はさらに、上記発現ベクターにより形質転換された植物を提供する。

１つの実施態様では、上記植物は、トチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）である。

他の実施態様では、上記植物は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）である。

本発明はさらに、植物のトランス−１，４−ポリイソプレンの含量を増大させる方法を提供し、該方法は、上記発現ベクターによって該植物を形質転換する工程を含む。

本発明はさらに、トランス−１，４−ポリイソプレンを製造する方法を提供し、該方法は、上記植物を栽培する工程、および該栽培された植物から該トランス−１，４−ポリイソプレンを回収する工程を含む。

本発明によれば、長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子を含む発現ベクターにより植物を形質転換することによって、トランス−１，４−ポリイソプレンの含量が増大した植物を提供することができる。このような植物を栽培することによって、トランス−１，４−ポリイソプレンを効率的に製造することができる。

pCold-TPL1、pCold-TPL3および pCold-TPL5の構造を示す模式図である。 ＴＰＬタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングの結果を示す電気泳動写真である。 ＴＰＬタンパク質のプレニル二リン酸合成活性を示すグラフである。 ＴＰＬ発現植物形質転換ベクターpBIsGFP-TPL1の構造を示す模式図である。 ＴＰＬ１のｍＲＮＡの量を示すグラフである。 形質転換トチュウ培養根内に産生されたゴムの分布状況を示すリアルスペクトルイメージング顕微鏡である。 野生型トチュウ培養根内に産生されたゴムの分布状況を示すリアルスペクトルイメージング顕微鏡である。 ＴＰＬ発現植物形質転換ベクターpHis-TPL1の構造を示す模式図である。 ＴＰＬ１およびＧＦＰのｍＲＮＡの量を示すグラフである。 野生型タバコ（Ａ）、ＧＦＰ形質転換タバコＧＦＰ＃１（Ｂ）およびＴＰＬ１形質転換タバコＴＰＬ１＃８（Ｃ）のＳＥＣ分析の結果を示すグラフおよび分析に供したタバコの葉の形態を示す写真である。 トチュウ（上）およびＴＰＬ１形質転換タバコ（下）の成葉抽出物の^１Ｈ−ＮＭＲ分析の結果を示すスペクトルおよびトランス１，４−ポリイソプレンの構造式である。

本発明は、長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子を提供する。本発明の長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素は、好適にはトチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）に由来する。本発明の長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素は、例えば、以下の実施例４〜６に実質的に記載されるように、分子量１０^４〜１０^５の長鎖トランス型ポリイソプレン（トランス−１，４−ポリイソプレン）合成活性を有する。本発明の長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素は、トランス型のプレニル二リン酸の合成反応を触媒する点で、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来のシス型プレニル二リン酸合成酵素とは異なる。

本発明の長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子は、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列の８８位から１１３４位までの塩基配列またはその相補配列、配列番号３に記載の塩基配列の４２位から１０８８位までの塩基配列またはその相補配列、および配列番号５に記載の塩基配列の９１位から１１４０位までの塩基配列またはその相補配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列でなるＤＮＡからなり得る。

本発明の長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子は、（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成するＤＮＡであって、長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなり得る。

本発明の長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子は、（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列との間において１０^−８０以下のＥ−ｖａｌｕｅを有し、かつ長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質、をコードするＤＮＡからなり得る。

本発明の長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子は、（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入されたアミノ酸配列でなり、かつ長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質、をコードするＤＮＡからなり得る。

本発明の遺伝子は、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１に記載の塩基配列の８８位から１１３４位までの塩基配列またはその相補配列、配列番号３に記載の塩基配列の４２位から１０８８位までの塩基配列またはその相補配列、および配列番号５に記載の塩基配列の９１位から１１４０位までの塩基配列またはその相補配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列でなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成するＤＮＡからなり得る。

上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性は、例えば、以下の実施例４〜６に実質的に記載される方法のような、当業者が通常用いる方法を用いて確認し得る。

本発明において、ストリンジェントな条件とは、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡのみが、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素をコードするＤＮＡとハイブリッド（いわゆる特異的ハイブリッド）を形成し、上記合成活性を有しないタンパク質をコードするＤＮＡは、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素をコードするＤＮＡとハイブリッド（いわゆる非特異的ハイブリッド）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリッドを形成させるために用いる反応液および洗浄液の塩濃度や、反応および洗浄の温度などを適宜選択することによって、このような条件を容易に決定することができる。具体的には、反応液として、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ７．４）を用いて、４２℃でハイブリッドを形成させ、次いで、洗浄液として、０．５×ＳＳＣを用いて、４２℃で洗浄する条件が挙げられるが、これに限定されるものではない。

本発明の遺伝子は、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列でなるタンパク質のアミノ酸配列との間において１０^−８０以下、好ましくは１０^−１００以下、より好ましくは１０^−１２０以下、さらに好ましくは１０^−１４０以下、よりさらに好ましくは１０^−１６０以下のＥ−ｖａｌｕｅを有するタンパク質をコードするＤＮＡからなり得る。

本発明において、Ｅ−ｖａｌｕｅとは、相同性の指標である期待値、すなわちデータベースにおいて全く偶然に見つかる相同な配列の数の期待値をいい、NCBIの相同性検索プログラムBLASTにおいて、デフォルトパラメーターを用いて、比較する一方の配列をクエリー配列として入力した場合に、他方の配列について表示される比較結果（Ｅｘｐｅｃｔ）の値である。Ｅ−ｖａｌｕｅが小さいほど相同性が高い。

本発明の遺伝子は、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質をコードする限り、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列において１または数個（２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入されたアミノ酸配列でなるタンパク質をコードするＤＮＡからなり得る。このようなアミノ酸配列の変異は、ＤＮＡ上の塩基の置換、付加、欠失または挿入に由来し得、天然による変異誘発または人為的な変異誘発（例えば、部位特異的変異導入法の使用）のいずれによっても生じ得る。

本発明の遺伝子は、当業者が通常用いる方法を用いて、本明細書に記載の配列情報に基づいてプローブまたはプライマーを調製し、トチュウの染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって得ることができる。もちろん、ＲＮＡを鋳型とする逆転写ＰＣＲを介しても得ることができる。本発明の遺伝子は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり得る。また本発明の遺伝子は、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ分子でもあり得る。

本発明の長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素は、（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列でなるタンパク質からなり得る。

本発明の長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素は、（Ｂ）上記（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列との間において１０^−８０以下のＥ−ｖａｌｕｅを有し、かつ長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質からなり得る。

本発明の長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素は、（Ｃ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入されたアミノ酸配列でなり、かつ長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質からなり得る。

本発明の酵素は、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列でなるタンパク質のアミノ酸配列との間において１０^−８０以下、好ましくは１０^−１００以下、より好ましくは１０^−１２０以下、さらに好ましくは１０^−１４０以下、よりさらに好ましくは１０^−１６０以下のＥ−ｖａｌｕｅを有するタンパク質からなり得る。

本発明の酵素は、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列、および配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列でなるタンパク質のアミノ酸配列において１または数個（２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入されたアミノ酸配列でなるタンパク質からなり得る。

本発明の酵素は、分類学的にはトランスフェラーゼ（ＥＣ２．５．１）に属し、長鎖プレニル二リン酸合成酵素ＩＩＩ（Ｅ型長鎖プレニル二リン酸合成酵素）に分類される。本発明の酵素は、炭素数５ｎ（ｎは整数）のプレニル二リン酸（Ｃ５ｎ）と炭素数５のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ，Ｃ５）とを基質とし、プレニル二リン酸（Ｃ５ｎ）にイソプレニル基（Ｃ５）が転移する縮合反応を触媒し、炭素数５（ｎ＋１）のプレニル二リン酸（Ｃ５（ｎ＋１））および副生物の二リン酸を生成する。この縮合反応は、プレニル二リン酸（Ｃ５ｎ）とイソプレニル基とがトランスの位置で行われることを特徴とする。縮合反応のくり返しによる縮合重合反応によって生成可能な最大のイソプレン単位数（鎖長）またはＩＰＰの重合度は、１１以上、好ましくは２０以上、より好ましくは３０以上、さらに好ましくは４０以上である。本発明の酵素は、常法に従って精製することができ、例えば、以下の実施例４に記載の方法により精製することができる。

本発明の酵素は、真核生物のＦＰＰ合成酵素とアミノ酸配列上高い相同性（Ｅ−ｖａｌｕｅ＜１０^−８０）を有する。真核生物のプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列は、２つのAspartate-Rich Motif（First Aspartate-Rich Motif：ＦＡＲＭおよびSecond Aspartate-Rich Motif：ＳＡＲＭ）を有する。本発明の酵素では、ＦＡＲＭ配列とは、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列の９９位から１０２位までのアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列の９９位から１０２位までのアミノ酸配列、または配列番号６に記載のアミノ酸配列の１００位から１０３位までのアミノ酸配列に見られるアスパラギン酸−アルパラギン酸−イソロイシン−メチオニンからなるアミノ酸配列をいう。真核生物のＦＰＰ合成酵素のアミノ酸配列においてＦＡＲＭのアミノ末端側近傍には、チロシンとフェニルアラニンとの連続したアミノ酸配列、またはフェニルアラニンとフェニルアラニンとの連続したアミノ酸配列が存在する。これらのアミノ酸配列は、プレニル二リン酸合成酵素が触媒する縮合重合反応におけるＩＰＰの重合度に関与すると考えられている。本発明の酵素では、これらのアミノ酸配列がシステインとアラニンとの連続したアミノ酸配列に置き換わっている。この置換により、本発明の酵素は長鎖プレニル二リン酸合成活性を有すると考えられる。

したがって、本発明の遺伝子は、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質をコードする限り、そのアミノ酸配列においてＦＡＲＭのアミノ末端側近傍に存在するシステインとアラニンとの連続したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、例えば、配列番号１に記載の塩基配列の３６７位から３７２位までの塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列の３２１位から３２６位までの塩基配列、または配列番号５に記載の塩基配列の３７３位から３７８位までの塩基配列を有するＤＮＡからなり得る。

また、本発明の酵素は、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有する限り、そのアミノ酸配列においてＦＡＲＭのアミノ末端側近傍に存在するシステインとアラニンとの連続したアミノ酸配列、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列の９４位から９５位までのアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列の９４位から９５位までのアミノ酸配列、または配列番号６に記載のアミノ酸配列の９５位から９６位までのアミノ酸配列を有するタンパク質からなり得る。

さらに、本発明の酵素は、アミノ酸配列のアミノ末端とＦＡＲＭとの間において、真核生物のＦＰＰ合成酵素には存在しない６アミノ酸の挿入配列を有する。この挿入配列は、予測立体構造モデルの解析から、タンパク質の表面で突起状の構造を形成することが示唆され、局在化シグナルとして機能する可能性が考えられる。

したがって、本発明の遺伝子は、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質をコードする限り、そのアミノ酸配列のアミノ末端とＦＡＲＭとの間に存在する、ＦＰＰ合成酵素には存在しない６アミノ酸の挿入配列をコードするＤＮＡ、例えば、配列番号１に記載の塩基配列の２７７位から２９４位までの塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列の２３１位から２４８位までの塩基配列、または配列番号５に記載の塩基配列の２８３位から３００位までの塩基配列を有するＤＮＡからなり得る。

また、本発明の酵素は、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有する限り、そのアミノ酸配列のアミノ末端とＦＡＲＭとの間に存在する、ＦＰＰ合成酵素には存在しない６アミノ酸の挿入配列、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列の６４位から６９位までのアミノ酸配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列の６４位から６９位までのアミノ酸配列、または配列番号６に記載のアミノ酸配列の６５位から７０位までのアミノ酸配列を有するタンパク質からなり得る。

本発明の発現ベクターは、上記長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子を含む。本発明の発現ベクターは、当業者が通常用いる方法を用いて、構築することができる。基礎とするベクターとしては、形質転換する宿主に応じて、種々のものが利用できる。例えば、大腸菌では、pUC19、pMAL-p2、pCold I、pGEX、pET、pMalc2、pTrc99Aなど、酵母では、pYES、pYC、pYI、pYL、pYEUra3TMなど、植物ではpIG121-Hm、pBI12、pBI221、pBIN19、pCAMBIA2301、pCC22、pGA482、pPCV001、pCGN1547、pJJ1881、pPZP111、pGreen0029、pBI101、pBI121、pYLTAC7などが挙げられる。ベクターには、目的とする遺伝子のほかに、遺伝子を発現するためのプロモーター、ターミネーターなどの遺伝子発現の調節に関与するＤＮＡ、および形質転換体を選択するための選択マーカーが適宜含まれる。プロモーターとしては、形質転換する宿主に応じて、種々のものが利用できる。例えば、大腸菌では、T7プロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、trpプロモーター、cspAプロモーターなど、酵母では、PMA1プロモーター、ADH1プロモーター、GAL1プロモーター、PGKプロモーター、PHO5プロモーター、GAPDHプロモーターなど、植物では、CaMV35Sプロモーター、NOSプロモーター、CABプロモーター、UBIプロモーターなどが挙げられる。

本発明において、形質転換する宿主としては、大腸菌、酵母などの微生物、または植物などが挙げられる。好ましくは植物、より好ましくはトチュウ科のトチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）およびキョウチクトウ科のペリプロカ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）である。形質転換方法としては、形質転換する宿主に応じて、種々のものが利用できる。例えば、大腸菌では、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法など、酵母では、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法など、植物ではアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。形質転換体は、ベクターに含まれる選択マーカーを利用することにより、形質転換されなかった野生型から選択、分離できる。選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子などが一般的に利用することができ、形質転換する宿主に応じても、種々のものが利用できる。例えば、大腸菌では、アンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性など、酵母では、オーレオバシジンＡ耐性などのほか、種々のアミノ酸などの栄養要求性など、植物ではカナマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性などの遺伝子が挙げられる。

本発明の長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子は、トランス−１，４−ポリイソプレンの含量が増大した形質転換植物（例えば、トチュウ、ペリプロカ、タバコなど、好ましくはトチュウ）を作製するために、それぞれの植物を形質転換するために好適に用いられ得る。

本発明の形質転換植物（好ましくは形質転換トチュウ）は、当業者が通常用いる方法を用いて栽培することができる。形質転換トチュウの成木の葉、樹皮、果皮などから、当業者が通常用いる方法を用いて、トランス−１，４−ポリイソプレンを回収、精製することができる。

以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

（実施例１：ＴＰＬ１−ｃＤＮＡ（配列番号１）の単離）
（トチュウのトータルＲＮＡの調製１）
トチュウ植物体試料として、愛媛県生名村に生育するトチュウ標準木より５月下旬に採取した若い当年枝に付いた葉を使用した。トチュウ植物体試料（当年枝に付いた葉）を、液体窒素で冷却しつつ乳鉢・乳棒で破砕し、試料の１０倍量(w/v)の２×ＣＴＡＢ溶液（２％(w/v)ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）、１％(w/v)β−メルカプトエタノール、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９．５］、１．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。これを６５℃にて１０分間インキュベートし、次いでクロロホルム／イソアミルアルコールで処理（洗浄）した（２回くり返す）。回収した水層に１／４量(w/v)の１０Ｍ ＬｉＣｌを加えて混合し、−２０℃にて２時間静置し、ＲＮＡの選択的沈殿を行った。これを遠心分離し、沈殿を適量のトリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液に溶解後、遠心分離し、上清を回収して、多糖類を排除した。回収した上清をフェノール処理、フェノール／クロロホルム処理、およびクロロホルム／イソアミルアルコール処理し、再度ＬｉＣｌによるＲＮＡの選択的沈殿を行った。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥し、次いでジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水に溶解して、トータルＲＮＡを得た。

（トチュウ由来のｃＤＮＡの調製）
上記のトチュウ葉由来トータルＲＮＡを鋳型として、AMV Reverse Transcriptase XL（タカラバイオ株式会社製）を用いて、逆転写反応を行い、トチュウ由来のｃＤＮＡを得た。逆転写反応のプライマーには、Oligo dT Adaptor Primer（タカラバイオ株式会社製）を用いた。

（縮重ＰＣＲによるＴＰＬ１−ｃＤＮＡの部分配列の決定）
上記のトチュウ由来のｃＤＮＡを鋳型として、TaKaRa Ex Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて、１回目のＰＣＲを行った。次いで、１回目のＰＣＲ産物を鋳型として、TaKaRa Ex Taqを用いて、２回目のＰＣＲを行った。いずれのＰＣＲでも、プライマーには縮重プライマーを用い、その塩基配列は以下の通りである。いずれのＰＣＲでも、９４℃にて５分のサイクルを１サイクル、９４℃にて１分、５４℃にて１分および７４℃にて２分のサイクルを３０サイクル、ならびに７４℃にて７分のサイクルを１サイクル行った。２回目のＰＣＲにより得られた増幅断片をpUC18ベクターにクローニングし、複数のプラスミドクローンについて塩基配列を決定した結果、いくつかのクローンは配列番号１の塩基配列の部分配列を有していた。

１回目のＰＣＲ用プライマーセット
センスプライマー：CIYTIGGITGGTGYRTNGARTGG（配列番号７）
アンチセンスプライマー：GTYCANGTYCTRCTIATIIAICTIAC（配列番号８）
２回目のＰＣＲ用プライマーセット
センスプライマー：GGTGIRTIGARTGGYTNCARGC（配列番号９）
アンチセンスプライマー：CCCNTRNATRAAIGTICAIGTIC（配列番号１０）

（トチュウのトータルＲＮＡの調製２）
トチュウ植物体試料として、愛媛県生名村に生育するトチュウ標準木より５月下旬に採取した若い当年枝の師部（樹皮）および木部を使用した以外は、トチュウのトータルＲＮＡの調製１と同様に調製した。得られたトータルＲＮＡを吸光度測定により定量し、そして電気泳動によって確認した。師部約４ｇから２ｍｇおよび木部約４ｇから０．８４ｍｇのトータルＲＮＡが得られた（２６０ｎｍと２８０ｎｍとにおける吸収の比は、それぞれ１．９９１および１．９５６であった）。

（トチュウのｃＤＮＡライブラリの調製）
上記のトチュウ師部および木部由来トータルＲＮＡ試料から、Oligotex-dT30<Super>（タカラバイオ株式会社製）を用いて、ｍＲＮＡを精製した。次いで、ｍＲＮＡから、Lambda ZAP II XR Library Construction Kit（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、ｃＤＮＡライブラリを調製した。

（ｃＤＮＡライブラリスクリーニング用プローブの調製）
上記の縮重ＰＣＲで得られた、配列番号１の塩基配列の部分配列を含むプラスミドクローンを鋳型として、TaKaRa Ex Taqを用いて、ＰＣＲを行った。使用したプライマーの塩基配列は、以下の通りである。ＰＣＲでは、９４℃にて５分のサイクルを１サイクル、９４℃にて１分、５０℃にて１分および７２℃にて１分のサイクルを３０サイクル、ならびに７２℃にて７分のサイクルを１サイクル行った。ＰＣＲ反応産物を、AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、アルカリフォスファターゼで標識し、スクリーニング用プローブとした。

ＰＣＲ用プライマーセット
センスプライマー：GTGCTCTTGTTCTTGATGATA（配列番号１１）
アンチセンスプライマー：CAAGAAGTATGTCCTTCATGT（配列番号１２）

（トチュウｃＤＮＡライブラリのスクリーニング）
上記のトチュウｃＤＮＡライブラリから、常法に従い、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ^＋メンブラン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）上にファージプラークリフティングを行った。次いで、このメンブランを、上記のスクリーニング用プローブおよびAlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Starを用いて、ハイブリダイゼーション、洗浄およびシグナル検出に供した。ハイブリダイゼーションは５５℃にて１６時間、１次洗浄は５５℃にて１０分間を２回、そして２次洗浄は室温にて５分間を２回行った。スクリーニングの結果、２３個の陽性ファージプラークが得られた。次いで、これらのファージクローンを、Lambda ZAP II XR Library Construction Kitを用いて、in vivo excisionにより、プラスミドクローンへ変換した。２３個のプラスミドクローンについて塩基配列を決定した結果、１０個のクローンが配列番号１の塩基配列と同一の塩基配列またはそのスプライシングバリアントと考えられる塩基配列を有していた。

（実施例２：ＴＰＬ３−ｃＤＮＡ（配列番号３）の単離）
実施例１と同様にしてＴＰＬ３−ｃＤＮＡを単離した。得られた完全長のｃＤＮＡ（ＴＰＬ３−ｃＤＮＡ）は、配列番号３の塩基配列を有する。配列番号３に記載の塩基配列の３７位から１０８９位までの塩基配列は、ＴＰＬ１のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１：GenBank登録番号AB041626）と７６％の相同性を有する。配列番号３に記載の塩基配列の４２位から１０８８位の塩基配列は、オープンリーディングフレームであった。このｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号４に示す通りである。配列番号４に記載の全アミノ酸配列（１位から３４８位）は、ＴＰＬ１のアミノ酸配列（配列番号２：GenBank登録番号BAB16687）との間において１０^−１６９のＥ−ｖａｌｕｅ（７７％の相同性）を有する。

（実施例３：ＴＰＬ５−ｃＤＮＡ（配列番号５）の単離）
（トチュウのｃＤＮＡライブラリの調製）
実施例１と同様に調製したトチュウ師部および木部由来トータルＲＮＡ試料から、日立計測器サービス株式会社にてＧ−キャッピング法によりｃＤＮＡライブラリを調製した。師部由来のｃＤＮＡライブラリは、ライブラリサイズが３．８×１０^５、インサート率が、８８％（２４試料／アガロースゲル電気泳動）、完全長率は８６％（インサートのあるクローンに対して）であった。木部由来のｃＤＮＡライブラリは、ライブラリサイズが２．２×１０^５、インサート率が７９％（２４試料／アガロースゲル電気泳動）、完全長率が６３％（インサートのあるクローンに対して）であった。

（トチュウにおけるＥＳＴ解析）
上記のトチュウ師部および木部由来ｃＤＮＡライブラリの各々約２００００クローンについて、北里大学北里生命科学研究所ゲノム情報学研究室にて塩基配列の解析を行った。配列解析により得られた配列情報から、インサートを保持しないクローンおよび配列が読めていないクローンを除去し、精度の高い配列情報を得た。師部および木部のライブラリについて、それぞれ１６５６７、１６１１３の精度の高いＥＳＴ配列が得られた（合計３２６８０）。次いで、得られた配列について、グループ分け（clustering）および注釈付け（annotation）を行った。「グループ分け」はＥＳＴ配列の中で同一の配列、類似した配列をグループ分けする。グループ分けのために、ＮＴＴソフトウェアのVISUALBIO clusteringを使用した。「注釈付け」は、既知遺伝子との比較によりＥＳＴ配列の注釈付けを行う。注釈付けには、NCBI BLASTを使用した相同性検索を用いた。検索の際に使用したデータベースは nr（All non-redundant GenBank CDS translations + PDB + SwissProt + PIR (Peptide Sequence Database)）である。

（ＴＰＬ５−ｃＤＮＡの単離）
上記のグループ分けおよび注釈付けで得られた情報により、ＴＰＬ１（配列番号１）と極めて高い相同性を示すＴＰＬ５（配列番号５）の５’末端側の配列を見出した。ＴＰＬ５（配列番号５）の３’末端側の配列は、３’−ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE）により決定した。３’−ＲＡＣＥには、3’-Full RACE Core Set（タカラバイオ株式会社製）を使用した。まず、実施例１で得たトータルＲＮＡを鋳型として、3’-Full RACE Core Setに付属のOligo dT-3 sites Adaptor Primerをプライマーとして用いて逆転写反応を行った。次いで、逆転写反応産物を鋳型として１回目のＰＣＲを行い、さらに、１回目のＰＣＲ産物を鋳型として２回目のＰＣＲを行った。使用したプライマーの塩基配列は、以下の通りである。１回目および２回目のＰＣＲでは、いずれも９４℃にて６０秒、５４℃にて６０秒および７４℃にて２分のサイクルを３０サイクル行った。２回目のＰＣＲにより得られた増幅断片をpT7Blueベクター（タカラバイオ株式会社製）にＴＡクローニングし、塩基配列を決定した。

１回目のＰＣＲ用プライマーセット
センスプライマー：ACAGTGGCTGGGCAGATGATAG（配列番号１３）
アンチセンスプライマー：3’-Full RACE Core Setに付属の3 sites Adaptor Primer
２回目のＰＣＲ用プライマーセット
センスプライマー：TTACCACACTTCTCGGAGAGGC（配列番号１４）
アンチセンスプライマー：CGCTTGCATCCATTCGATACACC（配列番号１５）

得られた完全長のｃＤＮＡ（ＴＰＬ５−ｃＤＮＡ）は、配列番号５の塩基配列を有する。配列番号５に記載の塩基配列の１１３位から１１３２位までの塩基配列は、ＴＰＬ１のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１：GenBank登録番号AB041626）と７６％の相同性を有する。配列番号５に記載の塩基配列の９１位から１１４０位までの塩基配列は、オープンリーディングフレームであった。このｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号６に示す通りである。配列番号６に記載の全アミノ酸配列（１位から３４９位）は、ＴＰＬ１のアミノ酸配列（配列番号２：GenBank登録番号BAB16687）との間において１０^−１６６のＥ−ｖａｌｕｅ（７９％の相同性）を有する。

（実施例４：ＴＰＬタンパク質の調製および解析）
（ＴＰＬ発現ベクターの構築）
上記のトチュウ標準木の葉から、RNeasy Plant Mini Kit（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、トータルＲＮＡを調製した。トータルＲＮＡ抽出用緩衝液には、キットに添付のバッファーＲＬＣを用いた。次いで、トータルＲＮＡを鋳型として、High Fidelity RNA PCR Kit（タカラバイオ株式会社製）を用いて、ＴＰＬ１、ＴＰＬ３およびＴＰＬ５のｃＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。使用したプライマーの塩基配列は、以下の通りである。ＰＣＲでは、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒および７２℃にて２分のサイクルを３５サイクル行った。

ＴＰＬ１−ｃＤＮＡ増幅用プライマーセット
センスプライマー：ACGCTGTCCTTGCACTTG（配列番号１６）
アンチセンスプライマー：GGAGAACCAAATATGCAATAAAGCCTG（配列番号１７）
ＴＰＬ３−ｃＤＮＡ増幅用プライマーセット
センスプライマー：GGCCTTTCGTTCTCTCTCTCTCTCTT（配列番号１８）
アンチセンスプライマー：ACGACTACATTTATTCAGGTTCGAAGTC（配列番号１９）
ＴＰＬ５−ｃＤＮＡ増幅用プライマーセット
センスプライマー：GATCAACACATCCTTGAGCGTTACC（配列番号２０）
アンチセンスプライマー：GTTAGTCGTTGCAATTTATTTGTTCCCTC（配列番号２１）

上記のＰＣＲにより得られた各増幅断片を、プラスミドpBluescript II KS-（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のマルチクローニングサイトの制限酵素ＥｃｏＲＶ部位に挿入し、プラスミドクローンを構築した。ＴＰＬ１、ＴＰＬ３およびＴＰＬ５のｃＤＮＡが挿入されたプラスミドクローンを、それぞれpBluescript-TPL1、pBluescript-TPL3およびpBluescript-TPL5とした。各クローンについて塩基配列決定を行い、ＰＣＲの増幅による突然変異がないことを確認した。

上記の各プラスミドクローンを鋳型として、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて、ＴＰＬ１、ＴＰＬ３およびＴＰＬ５のタンパク質コード配列断片をＰＣＲでそれぞれ増幅した。使用したプライマーの塩基配列は、以下の通りである。センスプライマーは、５’末端に制限酵素ＮｄｅＩ認識配列を有し、アンチセンスプライマーは、５’末端に制限酵素ＸｈｏＩ認識配列を有する。ＰＣＲでは、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒および７２℃にて２分のサイクルを３５サイクル行った。

ＴＰＬ１ タンパク質コード配列増幅用プライマーセット
センスプライマー：GAGAGAGCATATGGCGGAACTGAAGAAAGAATTTC（配列番号２２）
アンチセンスプライマー：CCGCTCGAGCTACTTGAGCCTCCTGTGAATCTTAG（配列番号２３）
ＴＰＬ３ タンパク質コード配列増幅用プライマーセット
センスプライマー：GAGAGAGCATATGACCGAGCTGAAGAGCAAATTTG（配列番号２４）
アンチセンスプライマー：CCGCTCGAGCTACTTGAGCCTCTTGTGTATCTTAGC（配列番号２５）
ＴＰＬ５ タンパク質コード配列増幅用プライマーセット
センスプライマー：GAGAGAGCATATGGCGGAAACGACCCAA（配列番号２６）
アンチセンスプライマー：CCGCTCGAGTCAATAATGCCTCCGATAGATCTTTGC（配列番号２７）

上記のＰＣＲにより得られた各増幅断片を、コールドショック発現ベクターpCold I（タカラバイオ株式会社製）のマルチクローニングサイトの制限酵素ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位間に挿入し、ＴＰＬ発現ベクターをそれぞれ構築した。pCold Iは、マルチクローニングサイトに挿入された遺伝子が発現するタンパク質とヒスチジン６量体タグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）とが融合タンパク質として産生できるような構造を有する。ＴＰＬ１、ＴＰＬ３およびＴＰＬ５のタンパク質コード配列断片が挿入されたＴＰＬ発現ベクターを、それぞれpCold-TPL1、pCold-TPL3およびpCold-TPL5とした（図１）。各ベクターについて塩基配列決定を行い、ＰＣＲ増幅による突然変異がないことを確認した。

（大腸菌の形質転換）
ＴＰＬタンパク質を可溶性タンパク質として大腸菌細胞内で発現させるために、まず、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテント細胞を、シャペロンプラスミドpG-Tf2（タカラバイオ株式会社製）で形質転換した。次いで、得られた形質転換大腸菌からさらにコンピテント細胞を調製し、このコンピテント細胞を、ＴＰＬ発現ベクターpCold-TPL1、pCold-TPL3またはpCold-TPL5で形質転換した。このようにして、ＴＰＬ発現ベクターとシャペロンプラスミドとを共発現する形質転換大腸菌を得た。

（ＴＰＬタンパク質の調製）
上記の共発現形質転換大腸菌を、形質転換体選択薬剤であるアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）、ならびにシャペロン発現誘導薬剤であるテトラサイクリン（１ｎｇ／ｍＬ）を含む５０ｍＬのＬＢ培地を用いて、３７℃で振蘯培養し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．５程度になるまで続けた（発現誘導前）。次いで、培養液を１５℃で３０分間冷却し、これにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（終濃度０．５ｍＭ）を添加した。次いで、振蘯培養を１５℃で２４時間さらに続けた（発現誘導後）。

上記の発現誘導後の培養液１０ｍＬから遠心分離によって大腸菌を回収し、１ｍＬの細胞破砕用緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、２％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、ｐＨ８．０）に懸濁した。懸濁液を氷上で１０分間静置した後、懸濁液中の大腸菌を、超音波破砕機ＳＯＮＩＦＩＥＲ４５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて氷上で破砕し、次いで、破砕液を４℃下の１００００×ｇにて３０分間の遠心分離によって上清と沈殿とに分離した。上清からＮｉ−ＮＴＡ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて非変性条件下でヒスチジン６量体タグとの融合タンパク質として産生されたＴＰＬタンパク質を精製した。カラムの洗浄には、洗浄用緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ イミダゾール、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ８．０）を用い、ＴＰＬタンパク質の溶出には、溶出用緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ８．０）を用いた。

（ＴＰＬタンパク質の解析）
上記ＴＰＬタンパク質の調製過程の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、ゲル用緩衝液、電気泳動用緩衝液および試料用緩衝液として、２％のＳＤＳおよび６％のβ−メルカプトエタノールを含む０．０５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ ６．８］を用い、分離ゲルのアクリルアミドの濃度は１０％とした。上記の発現誘導前の培養液および発現誘導後の培養液、ならびに上記のＴＰＬタンパク質の溶出画分をそれぞれ試料用緩衝液中で１００℃にて５分間加熱した後、それぞれ１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ウェスタンブロッティングでは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルからＨｙｂｏｎｄ−Ｐ ＰＶＤＦメンブラン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）上に転写を行い、このメンブランに、１次抗体として１，０００倍希釈のHis・Tag Monoclonal Antibody（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を反応させ、次いで、２次抗体として５，０００倍希釈のAnti-Mouse IgG (H+L) AP Conjugate（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を反応させた。ProtoBlot II AP System with Stabilized Substrate（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、メンブラン上のシグナルを検出した。この結果を図２に示す。図２は、上記ＴＰＬタンパク質が精製されていることを示す。

次に、上記精製したＴＰＬタンパク質のプレニル二リン酸合成活性を測定した。５％のＴＰＬタンパク質溶出画分（試料）、１０μＭまたは４μＭのアリル基質、および１００μＭの放射性^３２Ｐ標識ＩＰＰ［３７ＧＢｑ／ｍｏｌ］を緩衝液（１００ｍＭ Ｋ−ＭＯＰＳ［ｐＨ ８．０］、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００）中に含む２００μＬの酵素反応液を調製し、３０℃にて１６時間静置した。次いで、酵素反応液に２００μＬのＮａＣｌ飽和水および１ｍＬのＮａＣｌ飽和水飽和ブタノールを加え、１分間激しくボルテックスすることにより酵素反応を停止させた。これを室温にて３分間遠心分離に供し、水層とブタノール層とに分離した。次いで、２００μＬのブタノール層を３ｍＬの液体シンチレーションカクテルＣｌｅａｒ−ｓｏｌ Ｉ（ナカライテスク株式会社製）と混合し、液体シンチレーションカウンターＴｒｉ−Ｃａｒｂ ２１００（Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用いて、混合液の放射活性（ｄｐｍ）を測定した。ＩＰＰはブタノールに対して不溶性であるが、ＩＰＰとアリル基質との反応産物はブタノールに対して可溶性とあるため、ブタノール層の放射活性はプレニル二リン酸合成酵素によるＩＰＰ縮合重合反応活性を示している。この結果を図３に示す。図３は、各試料について、試料を加えた酵素反応液の放射活性から試料を加えていない酵素反応液の放射活性（バックグランド）を差し引いた値を３回の実験で得、この平均値（棒グラフ）および標準偏差値（エラーバー）を示している。図３より明らかなように、ＴＰＬ１、ＴＰＬ３およびＴＰＬ５は、いずれもＦＰＰあるいはＧＧＰＰをアリル基質としたときにＩＰＰ重合反応を触媒することを示した。しかし、ＤＭＡＰＰ（ジメチルアリルピロリン酸）をアリル基質としたときにはＩＰＰ重合反応を触媒しなかった。

（実施例５：トチュウ培養根の形質転換）
（ＴＰＬ発現植物形質転換ベクターの構築）
上記のＴＰＬ発現ベクターpCold-TPL1の制限酵素ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片を、植物形質転換ベクターpBIsGFP（株式会社豊田中央研究所生物部光川典宏氏より分与）のマルチクローニングサイトの制限酵素ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ部位間に挿入し、ＴＰＬ発現植物形質転換ベクターpBIsGFP-TPL1を構築した（図４）。pBIsGFPには、カナマイシン耐性遺伝子および改変型ＧＦＰ遺伝子が含まれている。

（トチュウ培養根の形質転換）
中国四川省成都に生育するトチュウ雌株より採取した種子を発芽培地（１／２ＭＳ培地、２０ｇ／Ｌ スクロース）に無菌播種した。播種後１０〜２０日経過した幼植物体から幼根を２〜３ｃｍに切り出し、増殖培地（１／２ＭＳ液体培地、１μＭ ＮＡＡ）中で往復振蘯（１２０回／分）培養を行った。このトチュウ培養根は、４週間毎に継代培養することにより、長期にわたって増殖させることができ、実験材料に供した。増殖した新根を、１．５ｃｍ程に切断して、アグロバクテリウム法により、pBIsGFP-TPL1で形質転換した。アグロバクテリウム法には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株を用いた。アグロバクテリウム菌の感染を促進させるために、感染の前に、培養根を超音波で２０分間処理した。アグロバクテリウム菌を感染させた培養根をカルス誘導寒天培地（ＭＳ培地、１μＭ ２−ｉＰ、１μＭ ＮＡＡ）に移してカルスを誘導した後、形質転換トチュウカルスを選択した。形質転換カルスは、ＧＦＰシグナルを利用して選択した。次いで、選択した形質転換カルスを根誘導培地（ＭＳ培地、１μＭ ＮＡＡ）に移し、カルスから根を分化・増殖させた。得られた形質転換トチュウ培養根のうち、２０系統を維持し、解析に用いた。

（形質転換トチュウ培養根の解析１）
形質転換トチュウ培養根２０系統について、ＴＰＬ１のｍＲＮＡの量をリアルタイムＰＣＲにより定量した（図５）。形質転換トチュウ培養根から、RNeasy Plant Mini Kit（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡを抽出した。まず、RNase-Free DNase I（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、混入ＤＮＡの除去を行った。次いで、ＲＮＡ試料の濃度を測定した。同時に、６種類の濃度の検量線用試料（ＲＮＡ濃度：４００、１００、２５、６．２５、１．５６および０．３９ｎｇ／μＬ）を調製した。形質転換トチュウ培養根から抽出したＲＮＡ試料および検量線用試料から、High Capacity Reverse Transcription Kit（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型として、ABI Prism 7300 Sequence Detection System（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法により、リアルタイムＰＣＲを行った。使用したプライマーの塩基配列は、以下の通りである。リアルタイムＰＣＲでは、５０℃にて２分および９５℃にて１０分のサイクルを１サイクル、ならびに９５℃にて１５秒および６０℃にて１分のサイクルを４０サイクル行った。次いで、９５℃にて１５秒、６０℃にて１分、９５℃にて１５秒および６０℃にて１５秒の反応を行い、解離状況を観察した。

ＴＰＬ１定量用プライマーセット
センスプライマー：AAGGAGCTCAACTCACTGAGAGC（配列番号２８）
アンチセンスプライマー：AATGCACCAACCCAACACAG（配列番号２９）
検量線用プライマーセット（内部参照遺伝子ＥＦ１αの検出）
センスプライマー：CCGAGCGTGAACGTGGTAT（配列番号３０）
アンチプライマー：TAGTACTTGGTGGTTTCGAATTTCC（配列番号３１）

（形質転換トチュウ培養根の解析２）
ＴＰＬ１のｍＲＮＡの量が最も多い形質転換トチュウ培養根ＴＰＬ１−９−７（図６）と野生型トチュウ培養根（図７）とについて、培養根内に産生されたゴムの分布状況を、リアルスペクトルイメージング顕微鏡（ＳＣＬＳＭ）を用いて評価した。ＳＣＬＳＭとして株式会社ニコン製DIGITAL ECLIPSE C1siを用いて、培養根の蛍光分離画像を取得した。蛍光分離は、参照スペクトルを用いて、株式会社ニコン製EZ-C1 3.40のソフトウェアにより行った。参照スペクトルは、次のように取得した。生薬用のトチュウ樹皮から取り出してＮｉｌｅ ｒｅｄで染色した繊維状トランスポリイソプレン、ならびにＮｉｌｅ ｒｅｄ（粒子状脂溶性物質の染色）およびFluorescent Brightener 28（細胞壁の染色）で染色したトチュウ当年枝の樹皮の横断面切片について、DIGITAL ECLIPSE C1siを用いて蛍光スペクトル画像を取得し、EZ-C1 3.40により指定した１０箇所のRegion of interest（ＲＯＩ）の蛍光スペクトルを測定し、その平均値を参照スペクトルとした。Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ由来の蛍光スペクトルの取得では、固体レーザ（４８８ｎｍ、２０ｍＷ）を用い、４１８〜５７８ｎｍの範囲のスペクトルを取得し、Fluorescent Brightener 28由来の蛍光スペクトルの取得では、ＢＤレーザ（４０８ｎｍ、１７ｍＷ）を用い、４９８〜６５８ｎｍの波長範囲のスペクトルを取得した。取得した参照スペクトルの蛍光最大波長は、５４５ｎｍ（Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ由来、トランスポリイソプレン）、５７５ｎｍ（Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ由来、粒子状脂溶性物質）および４５０ｎｍ（Fluorescent Brightener 28由来、細胞壁）であった。培養根の蛍光分離画像の取得では、固体およびＢＤレーザを用い、４２３〜７２３ｎｍの範囲のスペクトルを取得した。

この結果、形質転換トチュウ培養根ＴＰＬ１−９−７は、野生型トチュウ培養根に対して１．４倍のゴムの鎖長変化を示した。また、野生型トチュウ培養根では、ゴムが顆粒状に蓄積しているのに対して、形質転換トチュウ培養根ＴＰＬ１−９−７では、ゴムが繊維状に変化していた。したがって、ＴＰＬ１は、トチュウにおいてゴムの鎖長制御に関与することが判明した。

（実施例６：タバコの形質転換）
（ＴＰＬ発現植物形質転換ベクターの構築）
実施例４に記載のpBluescript-TPL1に由来するＴＰＬ１タンパク質コード配列断片、ならびにpBI221（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に由来するCaMV35Sプロモーター断片およびNOSターミネーター断片から構成されるＴＰＬ１発現カセットを構築し、これを、植物形質転換ベクターpCAMBIA2301（ＣＡＭＢＩＡ社製）のマルチクローニングサイトに挿入し、ＴＰＬ発現植物形質転換ベクターpHis-TPL1を構築した（図８）。pCAMBIA2301には、カナマイシン耐性遺伝子およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子が含まれている。

（タバコの形質転換）
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ Ｘａｎｔｈｉ）の葉（リーフディスク）を、アグロバクテリウム法により、pHis-TPL1で形質転換した。コントロールとしてpBIsGFPで形質転換した。アグロバクテリウム法には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株を用いた。

（形質転換タバコの解析）
pHis-TPL1で形質転換して得られた形質転換タバコ（ＴＰＬ１形質転換タバコ）およびpBIsGFPで形質転換して得られた形質転換タバコ（ＧＦＰ形質転換タバコ）について、それぞれＴＰＬ１およびＧＦＰ（コントロール）のｍＲＮＡの量をリアルタイムＰＣＲにより検定した（図９）。実験の方法および条件は、実施例５と同様である。次いで、ｍＲＮＡの量が多いＴＰＬ１形質転換タバコＴＰＬ１＃８、ＧＦＰ形質転換タバコＧＦＰ＃１および野生型タバコから、花芽が形成される前の成葉を採取して、エタノールによるソックスレー抽出を行い、次いで、トルエンによるソックスレー抽出を行った。トルエン抽出物をポリイソプレンとした。抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を行った。Ｈｉｔａｃｈｉ７０００シリーズの液体クロマトグラフィー装置（株式会社日立製作所製）を用いた。カラムには、PLgel Mini Mixed B（１０μｍ、２５０×内径４．６ｍｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，Ｓｈｏｐｓｈｉｒｅ，英国）を用い、溶出液にはＴＨＦを用いた。４０℃のカラム温度で、０．２ｍＬ／分の流速で分析を行ない、紫外線吸収（２１０ｎｍ）を検出した。ＳＥＣ分析のための検量線用試料としてＰｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製の７種のシス−1，4−ポリイソプレン（Ｍｎ＝１１９９４００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１０；Ｍｎ＝１３８０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０５；Ｍｎ＝３００００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０４；Ｍｎ＝１２０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０４；Ｍｎ＝６０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０４；Ｍｎ＝２５６０、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０８；Ｍｎ＝１１５０、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１１）を用いた。Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製ＳＩＣ−４８０IIおよび解析ソフトを用いて、データの取り込みならびに検量線の作成および分子量分布の算出を行った。

この結果、ＴＰＬ１形質転換タバコＴＰＬ１＃８では、分子量１０^４〜１０^５の高分子成分が認められた（図１０Ｃ）。ＴＰＬ１のｍＲＮＡの量が多いＴＰＬ１形質転換タバコＴＰＬ１＃１、＃３、＃６および＃７でも、同様に分子量１０^４〜１０^５の高分子成分が認められた。これに対して、ＧＦＰ形質転換タバコＧＦＰ＃１および野生型タバコでは、高分子成分は認められなかった（図１０ＡおよびＢ）。ＧＦＰのｍＲＮＡの量が多いＧＦＰ形質転換タバコＧＦＰ＃２および＃６〜＃８でも、同様に高分子成分は認められなかった。次いで、上記ＴＰＬ１形質転換タバコＴＰＬ１＃８の成葉抽出物から、ＳＥＣ分析による分子量１０^４〜１０^５の高分子画分を分取し、Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ−ＩＮＯＶＡ ６００ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｖａｒｉａｎ社製）を用いた^１Ｈ−ＮＭＲ分析による構造解析を行った。この結果、上記分子量１０^４〜１０^５の高分子画分には、トチュウのゴムと同様のトランス−１，４−ポリイソプレンの存在が確認された（図１１）。したがって、ＴＰＬ１は、トランス−１，４−ポリイソプレン合成酵素の１つであり、長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素であることが判明した。

本発明によれば、長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子を含む発現ベクターにより植物を形質転換することによって、トランス−１，４−ポリイソプレンの含量が増大した植物を得ることができる。本発明によれば、植物のトランス−１，４−ポリイソプレンの含量を増大させることができ、そしてこのような植物を用いてトランス−１，４−ポリイソプレンを効率的に製造することができる。特に、トランス−１，４−ポリイソプレンの含量が高い形質転換トチュウの果皮からは容易にトランス−１，４−ポリイソプレンを抽出できるため、トランス−１，４−ポリイソプレンを工業原料として容易に提供できる。

Claims (8)

1. 長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子であって、
   配列番号５に記載の塩基配列の９１位から１１４０位までの塩基配列またはその相補配列でなるＤＮＡ；あるいは
   配列番号６に記載のアミノ酸配列または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入されたアミノ酸配列でなり、かつ長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
   のいずれかのＤＮＡからなる、遺伝子。
2. 長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素であって、
   配列番号６に記載のアミノ酸配列でなるタンパク質；あるいは
   該配列番号６に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入されたアミノ酸配列でなり、かつ長鎖トランス型プレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質
   のいずれかのタンパク質からなる、酵素。
3. 請求項１に記載の長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子を含む発現ベクター。
4. 請求項３に記載の発現ベクターにより形質転換された植物。
5. 前記植物が、トチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）である、請求項４に記載の植物。
6. 前記植物が、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）である、請求項４に記載の植物。
7. 植物のトランス−１，４−ポリイソプレンの含量を増大させる方法であって、
   請求項３に記載の発現ベクターによって該植物を形質転換する工程
   を含む、方法。
8. トランス−１，４−ポリイソプレンを製造する方法であって、
   請求項４から６のいずれかの項に記載の植物を栽培する工程、および
   該栽培された植物から該トランス−１，４−ポリイソプレンを回収する工程
   を含む、方法。

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