JP3795377B2 - ヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子を有する植物ベクターとその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒマワリの苗（seedlings of Helianthus annus）から得るヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ(sunflower farnesyl pyrophosphate synthase、ＳＦＰＳ)をコード化するように分離された、ｃＤＮＡヌクレオチド配列を含む組換え植物発現ベクターと、老化が遅延(delay)されて種子生産が増加された遺伝子導入タバコ植物(transgenic tobacco plants)の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＳ）は、イソペンテニルピロリン酸とジメチルアリルピロリン酸からファルネシルピロリン酸が合成される反応を触媒する酵素である。ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）シンターゼは、特にステロイド合成とカロチン合成において、ステロール、カロチノイド及びプレニルキノンのような構造上に多様な重要代謝産物等に対するＣ１５前駆体を提供するイソプレノイド生合成で重要な酵素である。イソプレノイド生合成の経路は、一連のイソプレン単位を含む１次アルコールピロリン酸エステル類を中心としてなる。
【０００３】
Ｃ５分子（ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰ）から始まって、一連のＣ１０（ＧＰＰ）、Ｃ１５（ファルネシルピロリン酸）、Ｃ２０（ＧＧＰＰ）及び更に高い分子量のイソプレノイドピロリン酸は、伸長鎖の１′−４′にイソペンテニルピロリン酸が添加されて合成される。１′−４′縮合反応は、基質と生成物の二重結合立体化学と鎖の長さに対して高度に選択的なプレニル転移酵素族により触媒される。ＦＰＰは特にステロイド合成とカロチン合成において、イソプレノイド経路の一過程から発生されるし、ファイトアレキシンのような構造上に多様なセスキテルペノイド類の前駆体である。クロロフィル、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ジベレリン及びアブシシン酸(abscisic acid)を含む数千個の天然植物生産物がイソプレノイド経路から始まったと知られている。
【０００４】
また、イソペンテニルピロリン酸のゴムへの重合を含む天然ゴム生合成の最後の段階でＦＰＳが関連されていると明らかになった。人間{Wilkin et al.，J.Biol,Chem,1990 265(8):4607-4614}、酵母{Chambon et al.,Curr.Genet.1990 18(1):41-46}、アラビドプシスタリアナ(Arabidopsis thaliana)(Cunillera et al.,1996 J.Biol,Chem,271,7774-7780)ゴムの木{Light et al.,J.Biol,Chem.1989 264(31):18598-607}及び大腸菌(Fujisaki et al.,J.Bacteriol 1989 171(10):5654-5658)を含む異なる生体に存在するＦＰＳ遺伝子が既に報告された。イソプレニル化反応は、多数の真核細胞タンパク質を膜に効果的に結合させるために必要であるが、十分でない遺伝翻訳後の修飾である。
【０００５】
哺乳動物と酵母細胞で、イソプレニル化されたタンパク質の機能と適切な細胞内のターゲッティングのために付加的な修飾が必要であると知られている。タンパク質プレニル転移酵素による特定真核細胞タンパク質にプレニルグループファルネシル及びゼラニルの結合は、シグナル伝達を含む多くの細胞内の作用等を可能にするために必要である。
【０００６】
タンパク質ファルネシル転移酵素（Ｆターゼ）は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）からラス（Ｒａｓ）のような細胞内のタンパク質であり、それらのカルボキシ末端の周りのシステイン残基で疎水性ファネシルグループが移動することを触媒する。この過程は、原形質膜でこのようなタンパク質の副細胞内の位置化(subcellular localization)のために必要であり、抗ガン治療のために重要なターゲットであるＦターゼを作るラスの腫瘍性変異体等の形質転換活性化のために必要である。
【０００７】
ファルネシル化反応は、膜部分とＲａｓ部分とを含むいくつかのタンパク質の作用のために必要である。ファルネシル−タンパク質転移酵素の阻害剤等（ＦＴＩｓ）は、変異したＲａｓを提供してガンを治療するために、Ｒａｓ経路を遮断するように開発された。従って、タンパク質プレニル化反応の阻害剤等は腫瘍の化学療法のための提案がされた{Vitale et al.,Endocrinology 1999 140(2):698-704;Kohl et al.,science 1993 260(5116):1934-1937}。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ヒマワリ（Helianthus annus）のファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＳ）に関連した本発明の目的は；（ａ）一対のＦＰＳオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒマワリＦＰＳｃＤＮＡｓの配列を決定、増幅し、（ｂ）細菌性細胞からＦＰＳ ｃＤＮＡｓを発現させ、その機能を確認するために酵母変異種で機能相補分析を行い、（ｃ）生体内のヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＳＦＰＳ）の過発現(overexpression)の影響を調査するために、遺伝子導入タバコ植物種を製造し、（ｄ）遺伝子導入植物で植物成長時間に更に多くの花を生産し、２倍以上の種子を生産する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、構造上に多様なイソプレノイド生合成代謝産物に対して重要な酵素であるヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼをコードする、分離されたｃＤＮＡのヌクレオチドとペプチド配列を提供する。また本発明は、前記のヌクレオチド配列を含む組換え植物発現ベクターと遺伝子導入タバコ植物を生産するために、前記組換え植物発現ベクター内のＤＮＡ配列を導入する宿主細胞を提供する。
【００１０】
本発明は、核酸構成物とプロモーターを含む組換え植物発現ベクターをタバコ植物細胞内に導入する段階と、その細胞を植物に成長させる段階からなり、前記の核酸構成物は、配列２のタンパク質をコードする、分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を含むことを特徴とする、タバコ植物の葉っぱにおけるクロロフィル含量を増加させ、老化を遅延させ、無性生殖を増加させ、かつ、種子生産量を増加させる方法を提供する。
【００１１】
前記ｃＤＮＡヌクレオチド配列は、ヒマワリ(Helianthus annus)の苗から分離したものであってもよい。
前記組換え植物の発現ベクターは、ｐＣＩＰ−ｓｆｐｓ（ＫＣＴＣ ０５２０ＢＰ）であってもよい。
【００１２】
前記遺伝子導入タバコ植物は、前記増加させる方法により、タバコ植物の葉っぱにおけるクロロフィル含量が増加され、老化が遅延され、無性生殖が増加され、かつ、種子生産量が増加されてなるものであってもよい。
【００１３】
前記遺伝子導入タバコ植物は、配列１の分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を含む核酸構成物を含み、前記のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片はヒマワリ(Helianthus annus)の苗から分離されたものであってもよく、合成されたものであってもよい。
前記のヌクレオチド配列は配列１であってもよい。
【００１４】
前記のＤＮＡ配列は、実質上（アグロバクテリウムチュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはバキュロウィルス(baculovirus)）変種、ＫＣＴＣ ０５２０ＢＰに含まれた配列によりコードされるものが望ましい。
【００１５】
前記のプロモーターは、細菌のプロモーター、植物プロモーター及びウィルスプロモーターからなるグループから選択されたものであってもよい。
前記ベクターは、宿主に転移され複製可能な請求項１のＤＮＡ断片を含むハイブリッドベクターであってもよい。
【００１６】
前記ベクターは、宿主に転移され複製可能な、配列２のタンパク質をコードする、分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を含むハイブリッドベクターであってもよい。
【００１７】
本発明の宿主細胞は、植物由来のＤＮＡ断片を発現することができ、前記ハイブリッドベクターを含む形質転換されたものであってもよい。
本発明の宿主細胞は、植物由来のＤＮＡ断片を発現することができ、配列２のタンパク質をコードする、分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を含む形質転換されたものであってもよい。
【００１８】
本発明は、配列２のタンパク質をコードする、分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を提供する段階と、宿主細胞に前記のＤＮＡ断片を転移して、形質転換された宿主細胞を生産する段階と、前記ＳＦＰＳ遺伝子を用いて、ファルネシルピロリン酸シンターゼの生産に適合した培地で、前記の形質転換された宿主を試験管内で培養する段階とからなる試験管内のファルネシルピロリン酸シンターゼの製造方法を提供する。
【００１９】
本発明は、配列２のタンパク質をコードする、分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を提供する段階と、形質転換された宿主細胞に前記のＤＮＡ断片を転移して、形質転換された宿主細胞を生産する段階と、植物で花と種子の生産に適合した環境で、前記の形質転換された宿主を培養する段階とからなる生体内のファルネシルピロリン酸シンターゼの製造方法を提供する。
【００２０】
本発明の宿主細胞は、植物、細菌、酵母及び真菌類からなるグループから選択され形質転換されたものであってもよい。
本発明の宿主細胞は、植物細胞であってもよい。前記植物は、タバコ種、グラス草科(grass)種及び多年生植物種からなるグループから選択され、形質転換されたものであってもよい。
【００２１】
【発明の実施の形態】
非遺伝子導入または対照群ベクターに形質転換されたタバコ植物と比較する時、ファルネシルピロリン酸シンターゼを発現する遺伝子導入植物は、乾燥環境に対する強い耐性と葉っぱのクロロフィル高含量、種子生産において２倍に増加されることを示す。
植物と人間に存在するＦＰＳのアミノ酸配列を比較した結果、それらは高い相同性を有し、５個の異なる領域が存在することが示された。ＦＰＳの機能を特徴化する第１番目の段階で、ＦＰＳ ｃＤＮＡをクローニングし、それが機能的なＦＰＳをコード化するということを明らかにした。
【００２２】
ファルネシルピロリン酸シンターゼをコード化するヒマワリＳＦＰＳ（ＫＣＴＣ０５２０ＢＰ）に融合させた３５Ｓプロモーターを遺伝子導入タバコ植物(Nicotiana tabacum L.)に挿入し形態学的変化を調査した。かかる構成物はタバコでファルネシルピロリン酸を過剰生産した。ＦＰＰの過剰生産はＴ0植物において、葉っぱにおける更に多くの色素形成、側枝発芽、継続する成長及び葉っぱの老化遅延現象と、それによる花の２倍以上の増加、種子生産の最小２倍の増加を含む等、形態的及び生理的に顕著な変化をもたらした。
【００２３】
ある機関で、ＦＰＰの増加された生産が、植物で葉液の若芽分裂組織、開花及び種子セッティングまたは葉っぱの老化のような発育結果に影響を与えたか否かを調査した。増進された植物成長と収穫は、農作物科学分野の最も重大な目標として見なされてきた。成長と発達が異なる遺伝子とその生産物の複雑な相互作用により支配されるので、該目標を達成することは容易なことではなかった。生合成の生産能力を増加させる１つの方法は、組換えＤＮＡ技術を応用することである。
【００２４】
本発明で説明した技術は、遺伝子導入植物で農業的な利点を発生させると思っている。本発明はｐＦＰＳの構成物を導入し、ヌクレオチド配列を転写する植物を再産出し、植物の成長長さ、総合的な種子産出、花の数とクロロフィル含量において顕著な変化を示す植物を選択する方法等を含む。組換え発現カセットは、アグロバクテリウムを用いるかまたは有性交配により植物組織に注入され得る。更に本発明は、増進された成長と発達を促進する方法を提供する。本発明はタバコ植物に関連して説明したが、該技術はまたタバコ植物以外の他の植物における成長と発達にも使用することができる。
【００２５】
［実施例］
下記の実施例は、本発明の特徴をより詳しく例示するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
ｃＤＮＡのクローニング
ファルネシルピロリン酸シンターゼに対する遺伝子を下記のとおり分離した。この研究で用いた全ての化学製品は特別に言及されない限りシグマ(Sigma)社から購入したものである。ストラタジン(Stratagene)社のｃＤＮＡ合成キットを用いてヒマワリλｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリーを作るために、播種してから１０日目の葉っぱを用いた。
【００２６】
該ライブラリーを培養してから大腸菌ＸＬ１−ブルーＭＲＦ′変種に増幅した。３０％のグリセロールで−９０℃に保管されたストラタジン社のＳＯＬ−Ｒ competent細胞を選択するために、ＬＢ／テトラサイクリン平盤培地に培養し、３７℃の培養器で一晩中培養した。０．２％のマルトースと２ｍＭ硫酸マグネシウムを添加した５０ｍｌの殺菌したＬＢ培地で、よく分離された単独コロニーを接種した。それから３７℃で攪拌しながら一晩中培養した（回転攪拌器で２５０ｒｐｍ）。
【００２７】
マルトーズで育った細菌が更に能率的にλファージを吸着する；マルトーズは、バクテリオファージλ受容体をコード化する遺伝子(1amB)を含むマルトーズオペロンを誘導する。ＳＯＬ−Ｒ細胞が不安定のため、必要になる時まで４℃でＬＢ培地で保管した。５ｍｌのＳＯＬ−Ｒ細胞をエペンドルフ(Eppendorf)チューブに移し、超遠心分離器で最高の速度で８秒間回転した。２．５ｍｌの細胞に１０ｍＭ硫酸マグネシウムに更に懸濁しその密度をＯＤ600で測定した。１０5ｐｆｕのバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーを０．１ｍｌの希釈された細菌細胞（１０8細胞／ｍｌ）が入れてあるファルコン(Falcon)社のチューブに添加ししばらくの間攪拌した。
【００２８】
ファージ粒子が細菌に吸着するように、そのチューブを３７℃で２０分間培養した。ファージと細菌性宿主細胞を培養する間、０．７％のアガロースをＬＢに溶かし、液体培養器の温度を４７℃に合わせた。培養後に溶解されたアガロース８ｍｌをそれぞれのチューブに添加し軽く攪拌し、ＮＺＹ下端のアガール(agar)平板上に敷いた。細菌が均一に分布されるようにプレートを慎ましく振とうして、最上部のアガロースが固くなるように１０分間放置した。それから、プレートを３７℃の培養器にひっくり返して入れた後、７〜８時間の間培養した。
【００２９】
７時間後にプラーク（plaque）を確認し、プレートの底全体が細菌に覆われるように更に幾時間培養した。その底全体が細胞に覆われたプレートに８ｍｌのＡＭ（１０ｍＭ塩化ナトリウム／１０ｍＭ硫酸マグネシウム水化物／５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５／０．０１％ゼラチン）を添加し、４℃で１時間の間振とうした。その液体をチューブに入れて、４℃で３分間２，０００ｒｐｍで遠心分離して沈殿物が生じた。その上澄を新しいチューブに入れ、５０μｌのＤＮａｓｅとＲＮａｓｅ（それぞれ１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。該試料を一晩中４℃で放置した。同一嵩のＳＭに溶解された２Ｍ塩化ナトリウムと２０％ＰＥＧ（分子量８，０００）を添加して攪拌し、３時間の間氷で培養した。
【００３０】
それからチューブを４℃で２０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄を除去してから、沈殿物を塩化ナトリウムとゼラチンのない５００μｌのＳＭに更に懸濁させて、ｐＨ７．５、４０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡと２５μｌの２０％ＳＤＳを添加した。該懸濁液を軽く振とうして、ウィルスが分解されるように６５℃で１０分間培養した。
それから分解物を室温までに冷却させて、それぞれのチューブに５００μｌのＰＣＩ（トリス−飽和されたフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を添加し、５分間５，０００ｒｐｍで遠心分離した。その上澄を慎ましく新しいチューブに移した後、同一嵩のクロロフォルムを添加した。
【００３１】
５分間５，０００ｒｐｍで遠心分離してからその上澄を取って、２Ｍアンモニウムアセテートと３倍のエタノールと混合した。−２０℃で一晩中培養したら、それぞれのチューブからＤＮＡを分解できる制限酵素が大略１ｍｇ程度生成された。
その大きさに基づいて核酸を分離、確認して精製するために、多様な濃度のアガロースゲル（０．７〜１．５％）を用いて電気泳動を実行した。水平のミニゲール装置（ＢＲＬ）を主に使用した。
【００３２】
ゲル箱でプラスチックお盆の開放された両端を２個のテープにより封じて作業台に設けた。エルレンメイヤ(Erlenmeyer)フラスコに正確な量のアガロースと、１ｘＴＡＥ（４０ｍＭトリス−アセテート／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加して、メツラー秤(Mettler scale)上に載せて重さを測定した。それからそのスラリーをアガロースの粒子が完全に溶ける時までたまに振りあげながら、電子レンジで加熱した。
【００３３】
メツラー秤(Mettler scale)でアガロースゲル溶液の重さを更に測って、水を添加し元の嵩に合わせた。適当量のＥｔＢｒ（０．５ｇ／ｍｌ）を添加し、ゲル溶液を泳動槽に流し注ぎ、その上にくし（comb）を差し込んだ。ゲルが固まった後、くしとテープとを除去した。それから泳動槽に約１ｍｍのゲルになるよう、泳動槽を覆うのに十分な量の１ｘＴＡＥで泳動槽に満たした。ＤＮＡ試料を６５℃で５分間加熱したゲルローディング(loading)緩衝溶液（０．２５％ブルモフェノールブルー／０．２５キシレンシアノールＦＦ／１５％ピコル）と混合し、氷で冷却してから自動ピフェットでコーディングした。ブロモフェノールブルーがゲルの陰極の先端から１ｃｍ程度離れた所に到着する時まで、ゲルに５Ｖ／ｃｍの電圧をかけあげた。それからゲルをフォトダイン(Fotodyne)社の紫外線照明器で照射し、ポラロイド（ＡＳＡ３，０００）高感度フィルムを用いて写真を取った。
【００３４】
（実施例２）
退化した(degenerate)プライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応(Polymerase Chain Reaction)
ＰＣＲ増幅に用いられたと報告されたＦＰＳ配列に基づいた正(universal)オリゴヌクレオチドプローブ(Probe)を、成熟葉っぱのｍＲＮＡで作ったλＺＡＰｃＤＮＡライブラリーを用いて開発した。ファルネシルピロリン酸シンターゼの酵素の増幅に用いた退化したプライマーの配列は下記のとおりである：
プライマ１：5′- CAR GCH TWY TTY CTT GTD CTT GAT GAY ATH ATG-3′
プライマ２：5′- TKM ACS ACY AWC CAA GAR CAT YTR AAA TC-3′
【００３５】
５μＭのプライマ１と２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．３、５０ｍＭ塩化カリウム及び２．５uタクポリメラーゼ(Taq polymerase)を含む５０μｌの反応混合物に、ｃＤＮＡの集合所であるライブラリーから抽出した全体プラスミドＤＮＡ１ｇを添加した。その試料の蒸発を最小にするために、少量の殺菌された鉱物性油で覆った。
【００３６】
第１番目は９４℃で２分、５０℃で１．５分、７２℃まで３分、７２℃で１．５分の条件で実行した。次の２番目は９４℃で１分、５０℃で１．５分、７２℃まで３分、７２℃で１．５分に実行した。かかる前処理後に、増幅を９４℃で１分、５５℃で１．５分、７２℃まで１．５分、７２℃で１．５分に３２回実行した。ＰＣＲ生成物の中１０μｌを同量のローディング緩衝溶液と混合し、１％アガロースゲルから分離した。
【００３７】
（実施例３）
増幅された核酸断片のヌクレオチドのシークエンシング
ＰＣＲ生成物のサブクローニング
ブラント末端を有する断片でＰＣＲ生成物をクローニングすることは、その鋳型がタクポリメラーゼの末端転移酵素活性に独立的であるので、断片の３′末端にヌクレオチドを付加させることにあまり効果的でなかった。ｄＡＴＰに対するポリメラーゼの強い親和性のために、ほとんどの場合にそれはアデノシンである。
【００３８】
ｐＧＥＭプラスミドＤＮＡは、一晩中エコ(Eco)ＲＶ(ＮＥＢ)（１０μｇｐＧＥＭ ＤＮＡ/６μlエコＲＶ緩衝溶液／10μgＢＳＡ／２０ユニットエコＲＶ／８１μl水）で分解した。分解されたＤＮＡを−２０℃で３時間の間０．５Ｍの塩化ナトリウムと３倍嵩のエタノール（−２０℃）で遠心分離して沈殿させた。沈殿物を１００μｌの水に更に懸濁し、ゲル状で完全な分解物を確認した。
【００３９】
それから分解されたベクターをプロメガ(Promega)社のタクポリメラーゼ（８５μｌ分解されたベクター／１０μlタクポリメラーゼ緩衝溶液／２μｌ ｄＴＴＰ(１００ｍＭ)／３μｌタクポリメラーゼ）と培養し、そのエキソヌクレアーゼ活性により３′末端の突出部分を除去した。少量の鉱物性の油をその上に覆って、その混合物を熱循環器(thermal cycler)で７０℃で２時間の間培養した。それから試料を２倍嵩のフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコールと混合し、５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後クロロフォルムを抽出した。
【００４０】
その上澄を慎ましく２倍嵩のエタノールと混合し、−８０℃で２０分間培養した。５分間最高速度で遠心分離し、その結果生成された沈殿物を１００μｌの０．１ｘＴＥに更に懸濁した。それからＰＣＲ生成物をＴ−ベクター（２．５μｌの４ｘリゲーション(Ligation)）緩衝溶液／２μｌのｐＧＥＭ Ｔ−ベクター／１μｌのＰＣＲ生成物／１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ／４．５μｌの水）と１２℃で一晩中培養した。４ｘリゲーション緩衝溶液は、４００ｍＭトリス、ｐＨ７．５、８０ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭ ＡＴＰ、４０ｍＭ塩化マグネシウム、４００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含んで−２０℃で保管した。
【００４１】
冷凍したＤＨ５−α適合細胞を氷の上で溶かした。２μｌのβ−Ｍｅ、３μｌのリガーゼ及び５０μｌのＤＨ５α細胞を含むリゲーション混合物を備えて、３０分間氷で培養してから、４２℃で正確に６０秒間加熱した。その試験管をすぐ氷で２分間冷却した。４５０μｌのＬＢを添加し、攪拌器で２５０ｒｐｍで１時間の間３７℃で培養した。混合物の１／４をＸ−ｇａｌ／ＩＰＴＧ／Ａｍｐプレートに注いで３７℃で一晩中培養した。
最初に、５０個以上のクローンを制限エンドヌクレアゼ地図制作(mapping)により分析し、プライマ部位にベクター塩基配列を用いてｃＤＮＡ両末端から塩基配列データを分析した。
【００４２】
ＤＮＡのシークエンシング
超巻き取り鋳型ＤＮＡ（３μｇ）をｐＨ８．０の１８μｌのＴＥに再懸濁した。該試料に２μｌの２Ｍ水酸化ナトリウムを添加した後、室温で５分間培養して鋳型ＤＮＡを変性させた(denature)。それからｐＨ７．５の８μｌの５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃと１００μｌのエタノールを添加して、氷で１５分間培養した。変性されたＤＮＡを集めて真空下で乾燥した。乾燥されたＤＮＡを７μｌの水に再懸濁し、１μｌのプライマ（０．５ｐモル／μｌ）と２μｌの５ｘシクァナーゼ(Sequenase)緩衝溶液と混合した。該混合物を６５℃で２分間培養し室温に冷却した。
【００４３】
希釈したラベリング混合物、ＤＴＴ、α−［32Ｐ］ｄＡＴＰ及び希釈したシクァナーゼ(sequenase)を添加し室温で２分間培養した。最終混合物を４塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）に分けて添加し、４２℃で２分間培養した。それぞれの試験管に反応終了溶液を添加し、該試料をゲル状にローディングする前、９５℃で２分間加熱した。重要な塩基配列に対する最上の分析結果を得ることに必要な時間の間、該試料を３５Ｗの一定した電力で６％アクリルアミドゲルから分離した。実行後ゲルを１枚の３ＭＭの紙の上に載せて置いて、サラン(Saran)ラップにかぶせた。それからゲルをバイオーラド(Bio-Rad)社の真空乾燥機で８０℃で３０分間乾燥し、室温でコダクＸ−Ｏｍａｔフィルムに一晩中露出させた。マックベクター塩基配列分析プログラム(Mac Vector Sequencing Analysis Program)を用いて、その試料の配列を解読し分析した。
【００４４】
（実施例４）
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
放射能プローブの調製
プラスミドＤＮＡを５００ｍｌの３２７個のクローン培養液から、プロメガ社のマックシ−プレップキット(Maxi-prep kit)を用いて分離した。５０μｇのプラスミドＤＮＡをKpn I及びSac I制限酵素で分解することにより挿入物を分離した。プラスミドＤＮＡを３７℃で２時間の間Sac Iで分解し、９５％エタノールで一晩中沈殿した。それから線形化されたＤＮＡを同一条件下でKpnIで切断した。全てのＤＮＡ試料を１％のアガロースゲルを通過させて、その挿入物を低溶解アガロースを用いて分離した。ゲルから挿入物を分離してから、ゲルを紫外線照明器で照射し、挿入物の位置を表示した。
【００４５】
それから挿入物の陰極側のアガロースゲルをナイフを用いて切断し、１％の低溶解アガロース溶液をウィンド(window)に流し注いだ。その挿入物を低溶解アガロース領域から電気泳動で分離した。低溶解アガロースを切除し、同じ嵩の２ｘ抽出緩衝溶液（４００ｍＭ塩化ナトリウム／２００ｍＭトリス、ｐＨ７．９／２ｍＭ ＥＴＤＡ）を添加した。混合物を１５分間６５℃まで加熱して、アガロース塊を溶かした。溶けたゲル片らを試験管に入れて、同一嵩のフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加した後、クロロフォルム／イソアミルアルコールを添加した。
【００４６】
エタノールで沈殿させた挿入ＤＮＡを真空で乾燥し、ｐＨ８．０のＴＥに再懸濁した。分離された挿入物をアマーシャム(Amersham)社のマルチプライムＤＮＡラベリングキットを用いてラベリングした。一反応で大略２５μｇのＤＮＡを鋳型に使用した。適当量のＤＮＡに２１μｌの水を添加し（５０μｌの反応で）、該混合物を５分間熱湯で加熱してから氷で冷却した。鋳型ＤＮＡを変性させる間反応を始めるし（４μｌのラベルされないｄＮＴＰｓ／５μｌの反応緩衝溶液／５μｌのプライマ／２μｌのクレナウ(Klenow)ＤＮＡポリメラーゼ／５０μＣｉ［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ、３，０００ｍＣｉ／ｍｌ）上下にピペッティングして徐々に混合した。
【００４７】
該反応物を３７℃で３０分間培養し、１００μｌのＳＴＥ（１００ｍＭ塩化ナトリウム／１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加し反応を終了させた。ラベルされたＤＮＡを回転−カラムクロマトグラフィーで分離した。該カラムは、ベックトン−ディキンソン(Becton-Dickinson)社の１ｍｌの１回用の注射器で制作した。注射器を少量の殺菌グラスウール(glass wool)で塞いでＰ−１０平形のＳＴＥで詰めた。注射器を１５ｍｌの遠心分離器チューブに入れて１分間１，５００ｒｐｍで遠心分離した。充填されたビードが０．９ｍｌの嵩となるまで、ゲルをかかる方法により充填した。
【００４８】
カラムを１００μｌのＳＴＥで２回洗滌した。蓋のないエペンドルフチューブを遠心分離器チューブの底に置いてカラムをチューブに入れた。注射器の針の先端をエペンドルフチューブの入り口に合わせた。放射能試料をローディングし、１分間１，５００ｒｐｍで遠心分離し、ラベルされたプローブから遊離されたヌクレオチドを分離した。流出物を新しいエペンドルフ試験管に移して嵩を測定した。カラムを通過する前後の１μｌの試料に対する放射能を測定することにより、ラベルされたヌクレオチドの結合比率を計算した。ノーザンブロッティング、サザンブロッティング及びｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、ラベルされたＤＮＡをプローブに用いた。
【００４９】
ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子をクローニングするために、ヒマワリｃＤＮＡライブラリーを含むバクテリオファージを備えてスクリーニングすることに用いた。フィルタが２枚用意され、完全に分離され一致しているプラークが選抜され、挿入断片を配列決定した。それで、ファルネシルピロリン酸シンターゼをコード化する新しい遺伝子を決定した（配列１）。ヒマワリで１つのＦＰＳをクローニングし、遺伝子銀行(GenBank)に承認番号ＡＦ０００９３７（ヒマワリＦＰＳ）に登録した。ＦＡＳＴＡｎ調査は、ヌクレオチド配列が既に報告された他のＦＰＳ族と似ているということ、即ちタバコＦＰＳの８７％相同性を有するということを示す。
【００５０】
全てのクローニングしたＦＰＳ酵素の調査で保全されたアミノ酸が表れた。最初５０個のクローンを制限エンドヌクレアーゼ地図制作(mapping)により分析し、プライマ部位にベクター塩基配列を用いてｃＤＮＡの両末端から塩基配列データを分析した。長い鎖をイソプレノイド２リン酸であり、ステロール生合成でＤＭＡＰＰをＦＰＰに転換する、ファルネシル化されたタンパク質であるＦＰＳ酵素をコード化するサン−ＦＰＳ(ｓｕｎ−ＦＰＳ）ｃＤＮＡをかかるクローンから選択し特徴づけた。サン−ＦＰＳ１（１３４７ｂｐ）ｃＤＮＡｓは、プレニル転移酵素の特徴を示す典型的なＤＤＸＸＤモチーフ（Ｄ：Ａｓｐ、９３〜９７アミノ酸、２３２〜２３６アミノ酸、配列２参考）を有する、３４６個のアミノ酸を含む分子量３１，０００のタンパク質をコード化する。
【００５１】
（実施例５）
温度に敏感な酵母変異種を用いた融合タンパク質酵素活性の分析
ヌクレオチド塩基配列分析を完成した時、タンパク質発現に対するｐＲＳＥＴ融合タンパク質システムと酵母補完分析に対するｐＹＥＳ２を用いて発現ベクターを構成した。ＳＦＰＳタンパク質を過発現させ部分的に精製して、生成物の大きさを確認した。これは酵素機能をサッカロマイセスセレビジエ(Saccharomycescerevisiae)ＦＰＳ変異種補完分析により調査した。ｐＧＥＭベクターでサブクローニングされたＳＦＰＳをコード化するＤＮＡ断片を、ＰＣＲにより一対の変異されたオリゴ（7s-3 CGG GAT CCA TGG CCT CTG ATC TCA AGT C及びBIEN TCG CGA GGC GAA TTG GGT ACC GGG)を用いて増幅した。
【００５２】
ＰＣＲ生成物をｐＧＥＭベクターで更にサブクローニングした。ＬＢ培地で１０個の陽性反応のクローンを選択培養した。挿入物をEcoR I分解により確認した。実際に陽性のクローンを選抜し、冷凍グリセロールストック(stock)を作った。５０μｌ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に５０μｌの冷凍ｐＲＳＥＴ−ＳＦＰＳストックを接種し、攪拌器で３７℃で一晩中培養した。それから全培養液を既に暖ためた５００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐに接種した。ＯＤ600値が０．６〜０．８に達した時、Ｌａｃオペロンが活性化されるように、２ｍｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。
【００５３】
該培養液を更に４時間培養し、１５分間２，０００ｒｐｍで遠心分離した。それからその上澄を慎ましく除去した。５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール及び０．２％ＮＰ−４０を含む１５ｍｌの溶解(Lysis)緩衝溶液に沈殿物を再懸濁した。細胞懸濁液をブランソン(Branson)社の超音波器を用いて１０目盛りに対してパワー５で、それぞれ３０秒ずつ４回にかけて超音波処理し、３０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。その上澄を回収しアミコン(Amicon)社の０．４５μｍろ過器でろ過した。タンパク質抽出物をゲルに通過させることにより、ＳＦＰＳタンパク質の誘導水準を調査した。
【００５４】
本発明では１０％ＰＡＧＥを用いた。ホーエファ科学(Hoeffer Sci.)のグラディエントメーカー(Gradient maker)を用いて下部ゲルを作った。グラディエントメーカーを１０目盛りに対して３にして磁性攪拌器の上に載せて置いた。１０％ゲル混合物（２．２ｍｌ水／２．９ｍｌ ２Ｍトリス緩衝溶液、ｐＨ８．８／２．６ｍｌ ３０％アクリルアミド／４０μｌ １０％過硫酸アンモニウム／４０μ２０％ＳＤＳ／７．８ｍｌゲル溶液に対する１０μｌ ＴＥＭＥＤ）を低濃度チャンバーに入れて、グラディエントメーカーで２０％ゲル溶液（０．２ｍｌ水／２．９ｍｌ ２Ｍトリス、ｐＨ８．８／４．６ｍｌ ３０％アクリルアミド／４０μｌ １０％過硫酸アンモニウム／７．８ｍｌゲル溶液に対する１０μｌ ＴＥＭＥＤ）と混合した。
【００５５】
ファーマシア(Pharmacia)社の２個の連動(peristaltic)ポンプで該混合物をバイオーラド(Bio-Rad)社のミニゲルカセットに注入した。下部ゲルを室温で３０分間備えた。２つのサンドイッチになっているスラブの間に、高さがスラブの上から２ｃｍとなるようにゲル溶液を満たした。２２ゲージの針を有する、油を塗った(greased)注射器により、水に飽和されたｎ−ブタノール(Butanol)を板の上にかぶせた。約０．３ｍｌのブタノールをゲルの上部に重層した。次の板の他面が異なるスペーサーに隣接するように繰り返した。しばらく後でブタノール層が全体表面に均一に形成した。ゲルが重合される時に、非常に鮮明なブタノールとゲルとの境界面を見ることができた。
【００５６】
下部ゲルを用いる前で、夜間に流し注いでその表面をパラフィルムで覆った後、室温で貯蔵することができる。鋳型台(castingstand)を傾いてブタノール層を流し出した。ゲル表面を２０ｍｌの蒸留水で洗い出した。それから水に溶解された０．５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ８．８、０．１％ＳＤＳを含む３ｍｌのゲル蓋(overlay)緩衝溶液を添加し、最小限１時間放置して置いた。ゲル蓋溶液を２２ゲージの針を有する注射器を用いて除去した。
【００５７】
上部にゲル（１．１ｍｌの水／０．４ｍｌ ４ｘ上部トリス／０．１５ｍｌ ３０％アクリルアミド／８μｌ １０％過硫酸アンモニウム／５ｍｌの嵩に対して３．３μｌＴＥＭＥＤ）を積んでＡＰとＴＥＭＥＤを添加する前、その中５ｍｌを積んだゲル表面を洗滌することに用いた。ゲルカセットを数回傾けて、余分のゲル溶液を流した。上部にウェル形成用のくしは、試料がウェルにローディングされるまでそのまま残しておいた。上部にウェル形成用のくしをはずし、２２ゲージの針を有する１０ｍｌの注射器を用いて、ウェルに貯まっている緩衝溶液を除去した後、すぐそれぞれのウェルを洗浄した。試料緩衝溶液に溶解されたバイオ−ラド社の既に染色された低分子量のマーカーと、１０〜１５μｇのタンパク質を含有する試料を１％β−メルカプトエタノールと３％ＳＤＳで調製した。
【００５８】
それから該試料をローディングする前、６５℃で１５分間加熱した。適当量の試料をＰＡＧＥローディングチップが付着されたピペットマン(Pipetman)でローディングした。ゲルカセットに１０ｍＡの一定した電流を供給する途中で、染色薬が分離(lower)ゲルに移動し始まった時に電流を２０〜２５ｍＡに高めた。染色薬が底から０．５ｃｍ離れた地点に到着する時まで進行させた。クマシブルー(Coomasie blue)により染色されたゲルから、ＦＰＳの予想される分子量と相応する３１，０００Ｄａから過発現された鮮明なタンパク質バンドが観察された。タンパク質プロファイルは図１に示した。
【００５９】
ＦＰＳに対する酵母相補(complementation)分析
サン−ＦＰＳ１が機能性酵素をコード化するかを調査するために、信頼性のない変異エルグ(erg)２０−２を有する、温度に敏感な突然変異体の変種である変異種酵母(Saccharomyces cerevisiae)変種ＣＣ２５でｃＤＮＡを発現させた。従って、該変異種は、複製を阻害する温度（３６℃）では、エルゴステロルに対して栄養要求性である。Bam HIとXho I部位で発現ベクターpYES２-SFPSを構成した。ＧＡＬ１プロモーターの調節下でヒマワリＦＰＳ１ ｃＤＮＡを有するｐＹＥＳ２−サン−ＦＰＳ１に変異種酵母を形質転換した。図２の図示のとおり、酵母変異種のエルゴステロルを栄養要求性を、３６℃でプラスミドｐＹＥＳ２−サン−ＦＰＳ１で補充した。補充された酵母でＦＰＳ ＤＮＡの存在をＰＣＲ増幅で確認し、これはこの挿入されたタンパク質が酵母ＦＰＳの酵素活性を代替し、次の生化学的な段階を復旧できるということを示す。
【００６０】
（実施例６）
ＳＦＰＳのプラスミド構成と形質転換
上述のとおり、ＦＰＰは特にステロイド合成とカロチン合成において、構造上多様なセスキテルフェノイド類の前駆体であり、イソプレノイド経路の多重分岐点に存在する。
ＦＰＳ ｃＤＮＡの分離と遺伝子の技術は、他の宿主システムで過発現の影響を実行できるようにする。生体内のＳＦＰＳ酵素活性を測定し、ステロイド合成またはカロチン合成に対するＦＰＳ過発現の影響を調査するために、遺伝子導入タバコ植物を産出するように、アグロバクテリウム−ｐＣＩＰ−ＳＦＰＳ二重ベクター(binary vector)を構成した。これは生体内の機能性ＳＦＰＳ１であるかを決定するためにも必要なものであり、実質的な代謝作用において、ヒマワリのその自体で過発現するものが必要であるので、ＦＰＳ酵素をコード化する組換えアグロバクテリウムクローンは、遺伝子導入植物を産出するために構成された。
【００６１】
Ａ．遺伝子導入されたヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＳＦＰＳ）ダバコの産出
上述のとおり、ＦＰＰは特にステロイド合成とカロチン合成において、構造上多様なセスキテルフェノイド類の前駆体であり、イソプレノイド経路の多重分岐点に存在する。生体内のＳＦＰＳ酵素活性を測定し、対象植物に対するＦＰＳ過発現の影響を調査するために、遺伝子導入タバコ植物を産出するように、アグロバクテリウム−ｐＣＩＰ−ＳＦＰＳ二重ベクターを構成して、遺伝子導入タバコ植物を産出した。
【００６２】
ｐＧＥＭベクターで８５０個の塩基対の挿入物をＢａｍＨＩとＮｒｕＩで切断し、キアゼン(Qiagen)社のゲル精製キットを用いて、１％ＴＡＥ−アガロースゲルに通過させて精製した。ＢａｍＨＩとＮｒｕＩとに分解したＰＢＩ１２１と精製した挿入ＤＮＡとを、適当な緩衝溶液でＤＮＡリガーゼと混合し、１６℃で一晩中培養した。中間サイズの調製後、制限酵素分解で確認した陽性のクローン(clone #668)をアグロバクテリウム形質転換に用いた。ＭＳ−アガー培地で育った野生のタバコ植物を収集し殺菌した。アグロバクテリウム変種ＬＢＡ４４０４をＬＢ（５ｇ塩／Ｌ）で、対数期末期や停止期初期まで培養した。
【００６３】
細胞塊を１０ｍＭの塩化マグネシウム、５％蔗糖、０．００５％シルウエット(Silwet)Ｌ−７７にＯＤ600値が０．８となる時まで再懸濁した。殺菌した葉っぱをアグロバクテリウム懸濁液に入れて外科用メスで切った。アグロバクテリウム懸濁液に１５分間入れてから、葉っぱディスク(disc)を発芽ＭＳ培地（蔗糖、ビタミン、ＮＡＡ、０．１ｍｇ／Ｌ及びＢＡ、１ｍｇ／Ｌ）に移した。２５℃培養器で光のない状態で三日間培養した後、残存しているアグロバクテリウムを高圧殺菌した蒸留水で洗滌し、葉っぱディスクを新しいＭＳアガープレート（蔗糖、ビタミン、カルベネシリン、２５０ｍｇ／Ｌ、ガナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ、０．１ｍｇ／Ｌ及びＢＡ、１ｍｇ／Ｌ）に移した。
【００６４】
形質転換体選択のために、４週間にかけて毎週ガナマイシンの量を増加させて全培養した。若芽が生えた時、それらを新しいＭＳ固定培地（蔗糖、ビタミン、カルベネシリン、２５０ｍｇ／Ｌ及びガナマイシン２００ｍｇ／Ｌ）に移して２週間放置した。選択された形質変換体を、根を張る時まで根誘導培地（１／２ＭＳ及び蔗糖）に移して置いた。３〜４週後に生存した遺伝子導入タバコ植物を土壌に移し植えて、２７℃温室で栽培した。
【００６５】
Ｂ．遺伝子導入タバコ植物の特徴
他の遺伝子導入タバコ植物に導入されたＳＦＰＳの発現を確認するために、ゲノムのＤＮＡ試料を精製した。遺伝子導入タバコ植物からゲノムのＤＮＡを分離するために、冷凍−解凍方法を使用した。急冷させた葉っぱを液体窒素で冷却された擂り鉢とすりこぎで挽いて、きれいな２５ｍｌのコレックス試験管に移した。溶解緩衝溶液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０／１００ｍＭ ＥＤＴＡ／１００μｇ／ｍｌタンパク質分解酵素(Proteinase)Ｋ）にＳＤＳを０．５％添加した。該混合物を７０℃で１５分間培養してから、タンパク質分解酵素Ｋを最終濃度２００ｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で一晩中培養した。
【００６６】
それから、同一嵩のトリス緩衝溶液−飽和フェノールを添加してから、同一嵩のクロロフォルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、１時間の間ラブクェーク(Lab Quake)で混合した。試料を最高速度で攪拌し、５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。その上層を新しい試験管に移し、４００μｌのクロロフォルム：イソアミルアルコールを添加した。軽く攪拌してから試料を遠心分離し、その上層を新しい試験管に入れた。ｐＨ８．０の１／１０嵩の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍嵩の純粋なエタノール（−２０℃）を添加し、軽く振とうして混合した。それから該試験管を−２０℃で一晩中培養した。
【００６７】
４℃で５分間５，０００ｒｐｍで遠心分離し、ＤＮＡ塊を得た。遠心分離後、上澄を真空連続抽出パストゥールピペットで慎ましく除去した。１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃）を添加して洗滌し、遠心分離して上澄を除去した。その後、余分のエタノールを蒸発させるために、沈殿物を真空下でサバント(Savant)社のスピードバック(speed vac)で乾燥した。ＤＮＡを５０〜１００μｌのＴＥ、ｐＨ８．０（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し確認後その量を決めた。サブクローニングＳＦＰＳ挿入物に対して使用された同一なオリゴヌクレオチドを非常に厳しい条件におけるＰＣＲ増幅に対して使用した。遺伝子導入タバコ植物の試料から産出したＰＣＲ生成物を７６０塩基対と１５０塩基対の断片を産出するXba Iに分解した。そのような断片を有する選択された遺伝子導入タバコ植物を更に成長させ、遺伝子タバコ植物における導入されたＳＦＰＳの発現水準をノーザンブロットで調査した。
【００６８】
ノーザンブロット
全体ＲＮＡ試料をシグマ社のトリ(Tri)試薬を用いて精製した。最後に、その塊をＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）で処理された４００μｌの蒸留水に再懸濁し、ベックマンデュ(Beckman Du)８分光光度計で１００倍希釈液の吸光度を測定しその量を決めた。
【００６９】
分解は発生されないことを確認するために、それぞれの分離されたＲＮＡ試料から１．５ｇのＲＮＡを含む天然分析ゲル(native analytical gels)で実行した。それから１０μｇの任意の全体ＲＮＡを含む一部を電気泳動で分離し、ニトラン(Nytran)膜上に移した。蒸留水に浸したニトランにＲＮＡを移し、１５分間２０Ｘ ＳＳＰＥにびっしょり浸した。移動緩衝溶液で２０Ｘ ＳＳＰＥを用いて２４時間の間サザン分析に用いたことと同様な装置で移動を遂行した。１００℃で５分間ｐＨ８．０の０．０２Ｍトリスでその膜を反応させることにより、移動されたＲＮＡｓのデグリオキシル化反応を完成した。
【００７０】
前記のとおり産出した放射能ＳＦＰＳプローブを本実験で用いた。プリハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及びＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション洗滌をＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに対し説明したとおり実行した。また、自動Ｘ線撮影をサザンハイブリダイゼーションのように遂行した。ノーザンブロット分析結果は、サン−ＦＰＳ１をコード化するｍＲＮＡが、葉っぱと幹とに高い含量で存在することを示す（図３）。
【００７１】
ＦＰＳの過発現は、老齢の植物において、老化が緩められた結果であり、クロロフィル含量、ルビスコ(Rubisco)の相対的な量及びシステインプロテアーゼを含む老化遅延に対する数個の要素を調査した。葉っぱの老化は、重要な代謝産物が成長に用いられるために回復される間、結局細胞の死滅に至る活発に調節される発生過程であると知られている(Weaver et al,1998)。光合成作用は、細胞がそれらの構成分及びタンパク質内容物が除去され、核酸が数個のフォルド(fold)を除去し、澱粉と脂質が物質代謝されることにより衰退するものと観察された。
【００７２】
（実施例７）
遺伝子導入タバコ植物を過発現するＳＦＰＳの葉っぱにおけるクロロフィル含量の測定
遺伝子導入及び非遺伝子導入植物の成長をモニタしたが、遺伝子導入植物のもっと暗い色素形成を除いては、遺伝子導入及び非遺伝子導入植物の成長に大きい差異はなかった（図４と図５）。植物抽出物でクロロフィルの含量を２セットの試料；４週目の遺伝子導入及び非遺伝子導入タバコの全体植物及び７ヶ月目の遺伝子導入及び４ヶ月目の非遺伝子導入タバコ植物の３ヶ月目の葉っぱを用いて分光光度計で測定した。前記２つの場合に、遺伝子導入植物は対照群に比して更に暗い色素形成が観察された。幾日以内に２グループを精密に調査し始めた。遺伝子導入植物で観察された特徴は、老化の長期遅延である（図６と図７）。図６〜図８に示されたとおり、遺伝子導入植物は、種子収集時間まで継続して新鮮に維持されることを示した。新鮮さが一般植物より更に長時間持続され、余分の葉液の芽と枝の根本から生える若芽は、正常の優性のため、余分の花とその生産物である種となった（図８）。
【００７３】
このように長く持続される年少は、ＦＰＰ過生産による高水準のジベレリンの結果であることもある。かかる一部の形態学的な変化等が直接的にジベレリンの集中された過発現の結果である反面、他の変化等はジベレリンが豊富な組織に植物栄養分が動員された結果であることもある。
【００７４】
（実施例８）
ＳＦＰＳを過発現する遺伝子導入タバコ植物の特徴決定
老化に関連した遺伝子の発現様式
一般的に老化の調節は核によって行われる。老化は多くの構成成分の一連の退化過程であるがタンパク質合成が要求される。光合成タンパク質、ＣＡＢ及びルビスコをコードするｍＲＮＡｓは、老化する間にその多くは衰退することが知られており（He etal.,1997)、いくつかのｍＲＮＡｓ、システインプロテアーゼ、マレートシンターゼ及びグルタミンシンターゼは、その多くが増加の傾向を示す(Ding et al,1993;Oh et al.,1997)。遺伝子導入及び非遺伝子導入タバコ植物で、老齢に対する反応において、一対の老化関連遺伝子（ＳＡＧｓ）、ルビスコ及びシステインプロテイズの発現を比較した。
【００７５】
しかし、他の方法で標準と異なる個別のＳＡＧｓは部分的に重複されるが、一致しない環境でそれらの遺伝子生成物が役割を行うことを暗示する（He et al,1997)。ノーザンブロット分析のために、２、３、５、８及び２３週目の遺伝子導入植物と、２、３、５、８及び１６週目の非遺伝子導入タバコ植物を処理して、全体ＲＮＡ試料を分離した。末端にラベルされたシステインプロテアーゼオリゴをプローブに用いた。ノーザン分析結果、システインプロテアーゼのｍＲＮＡ水準が非遺伝子導入植物で、葉っぱの老化に伴って漸次的に増加した（図９のａ）。
【００７６】
しかし、ＳＦＰＳ−遺伝子導入植物は、全ての試料でシステインプロテアーゼの一定した水準を示した。図９ｂのとおり、ルビスコの発現水準は、遺伝子導入植物が２３週まで高く維持されるが、信号は非遺伝子転換植物で弱く得られる。要約すれば、対照群植物が記録された結果により確認された反面、ＳＦＰＳを有する遺伝子導入タバコ植物は、野生型と比較する時、高い含量のクロロフィル、高い含量で長く持続されるルビスコ及びシステインプロテアーゼの一定した水準を示す。不確実な理由で遺伝子導入タバコ植物は、おそらく過剰生産されるジベレリンにより、幹と葉っぱで年少が維持され、正常優性が維持されるし、連続的に葉液の発芽、多数の花及び多い種子を得る。
【００７７】
【発明の効果】
本発明は、ヒマワリ（Helianthus annus）の苗から得るヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ(sunflower farnesyl pyrophosphate synthase、ＳＦＰＳ)をコード化するように分離された、ｃＤＮＡヌクレオチド配列を含む組換え植物発現ベクターと、老化が遅延(delay)されて、花の発達と種子生産が増加された遺伝子導入タバコ植物の製造に関する。非遺伝子転換または対照群ベクターに形質転換されたタバコ植物と比較する時、二重構造のファルネシルピロリン酸シンターゼを発現する遺伝子転換植物は、乾燥環境に対する強い耐性、葉っぱのクロロフィル高含量、種子生産において２倍の増加を示す。
【００７８】
図１は、クマシブルーにより染色したゲルに、大腸菌(Escherichia coli)におけるヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼタンパク質の発現様式を示したもので、それぞれのレーンで１０μｇのタンパク質をローディングし、１０〜２０％のグラディエントＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離して可視化するために、クマシブルーで染色した。レーン１はクロン１；レーン２はクロン２；レーン３はタンパク質分子量標準物質を示す。過発現したタンパク質のバンド（分子量３１，０００）を矢印で表示した。
【００７９】
図２は、酵母ＣＣ２５変異種におけるＳＦＰＳの構造分析を示す。
図３は、遺伝子導入タバコ植物におけるＳＦＰＳの発現を示したもので、他の遺伝子導入タバコ植物で全体のＲＮＡ試料等を精製し、32Ｐ−ランダムプライム(random primed)ＳＦＰＳで試験した。
図４は、４週目の遺伝子転換及び非遺伝子転換タバコの全体植物を以て行った植物抽出物におけるクロロフィルの分光光度計の測定結果を示す。
図５は、７ヶ月目の遺伝子転換及び４ヶ月目の非遺伝子導入タバコ植物の３ヶ月目の葉っぱを以て行った植物抽出物におけるクロロフィルの分光光度計の測定結果を示す。
【００８０】
図６は、ＦＰＳ−遺伝子導入タバコ植物と対照群のタバコ植物とを比較したもので、種子を植えた後の葉っぱの新鮮さを示したものである。
図７は、ＦＰＳ−遺伝子転換植物と対照群植物の種子を収集したものである。図８は、７ヶ月目のＦＰＳ遺伝子導入タバコ植物と４ヶ月目の対照群タバコ植物を示したもので、土壌に移して植えてから７ヶ月目のものである。
図９は、老化現象と関連したシステインプロテアーゼとリブロース−１，５ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼに対するｍＲＮＡｓの発現パターンを示している。
【００８１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 大腸菌(Escherichia coli)におけるヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼタンパク質の発現様式を示した。
【図２】 酵母ＣＣ２５変異種におけるＳＦＰＳの構造分析を示す。
【図３】 遺伝子導入タバコ植物におけるＳＦＰＳの発現を示したものである。
【図４】 ４週目の遺伝子転換及び非遺伝子転換タバコの全体植物を以て行った植物抽出物におけるクロロフィルの分光光度計の測定結果を示す。
【図５】 ７ヶ月目の遺伝子転換及び４ヶ月目の非遺伝子導入タバコ植物の３ヶ月目の葉っぱを以て行った植物抽出物におけるクロロフィルの分光光度計の測定結果を示す。
【図６】 ＦＰＳ−遺伝子導入タバコ植物と対照群のタバコ植物とを比較したもので、種子を植えた後の葉っぱの新鮮さを示したものである。
【図７】 ＦＰＳ−遺伝子転換植物と対照群植物の種子を収集したものである。
【図８】 ７ヶ月目のＦＰＳ遺伝子導入タバコ植物と４ヶ月目の対照群タバコ植物を示したもので、土壌に移して植えてから７ヶ月目のものである。
【図９】 老化現象と関連したシステインプロテアーゼとリブロース−１，５ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼに対するｍＲＮＡｓの発現パターンを示している。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒマワリの苗（seedlings of Helianthus annus）から得るヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ(sunflower farnesyl pyrophosphate synthase、ＳＦＰＳ)をコード化するように分離された、ｃＤＮＡヌクレオチド配列を含む組換え植物発現ベクターと、老化が遅延(delay)されて種子生産が増加された遺伝子導入タバコ植物(transgenic tobacco plants)の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＳ）は、イソペンテニルピロリン酸とジメチルアリルピロリン酸からファルネシルピロリン酸が合成される反応を触媒する酵素である。ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）シンターゼは、特にステロイド合成とカロチン合成において、ステロール、カロチノイド及びプレニルキノンのような構造上に多様な重要代謝産物等に対するＣ１５前駆体を提供するイソプレノイド生合成で重要な酵素である。イソプレノイド生合成の経路は、一連のイソプレン単位を含む１次アルコールピロリン酸エステル類を中心としてなる。
【０００３】
Ｃ５分子（ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰ）から始まって、一連のＣ１０（ＧＰＰ）、Ｃ１５（ファルネシルピロリン酸）、Ｃ２０（ＧＧＰＰ）及び更に高い分子量のイソプレノイドピロリン酸は、伸長鎖の１′−４′にイソペンテニルピロリン酸が添加されて合成される。１′−４′縮合反応は、基質と生成物の二重結合立体化学と鎖の長さに対して高度に選択的なプレニル転移酵素族により触媒される。ＦＰＰは特にステロイド合成とカロチン合成において、イソプレノイド経路の一過程から発生されるし、ファイトアレキシンのような構造上に多様なセスキテルペノイド類の前駆体である。クロロフィル、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ジベレリン及びアブシシン酸(abscisic acid)を含む数千個の天然植物生産物がイソプレノイド経路から始まったと知られている。
【０００４】
また、イソペンテニルピロリン酸のゴムへの重合を含む天然ゴム生合成の最後の段階でＦＰＳが関連されていると明らかになった。人間{Wilkin et al.，J.Biol,Chem,1990 265(8):4607-4614}、酵母{Chambon et al.,Curr.Genet.1990 18(1):41-46}、アラビドプシスタリアナ(Arabidopsis thaliana)(Cunillera et al.,1996 J.Biol,Chem,271,7774-7780)ゴムの木{Light et al.,J.Biol,Chem.1989 264(31):18598-607}及び大腸菌(Fujisaki et al.,J.Bacteriol 1989 171(10):5654-5658)を含む異なる生体に存在するＦＰＳ遺伝子が既に報告された。イソプレニル化反応は、多数の真核細胞タンパク質を膜に効果的に結合させるために必要であるが、十分でない遺伝翻訳後の修飾である。
【０００５】
哺乳動物と酵母細胞で、イソプレニル化されたタンパク質の機能と適切な細胞内のターゲッティングのために付加的な修飾が必要であると知られている。タンパク質プレニル転移酵素による特定真核細胞タンパク質にプレニルグループファルネシル及びゼラニルの結合は、シグナル伝達を含む多くの細胞内の作用等を可能にするために必要である。
【０００６】
タンパク質ファルネシル転移酵素（Ｆターゼ）は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）からラス（Ｒａｓ）のような細胞内のタンパク質であり、それらのカルボキシ末端の周りのシステイン残基で疎水性ファネシルグループが移動することを触媒する。この過程は、原形質膜でこのようなタンパク質の副細胞内の位置化(subcellular localization)のために必要であり、抗ガン治療のために重要なターゲットであるＦターゼを作るラスの腫瘍性変異体等の形質転換活性化のために必要である。
【０００７】
ファルネシル化反応は、膜部分とＲａｓ部分とを含むいくつかのタンパク質の作用のために必要である。ファルネシル−タンパク質転移酵素の阻害剤等（ＦＴＩｓ）は、変異したＲａｓを提供してガンを治療するために、Ｒａｓ経路を遮断するように開発された。従って、タンパク質プレニル化反応の阻害剤等は腫瘍の化学療法のための提案がされた{Vitale et al.,Endocrinology 1999 140(2):698-704;Kohl et al.,science 1993 260(5116):1934-1937}。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ヒマワリ（Helianthus annus）のファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＳ）に関連した本発明の目的は；（ａ）一対のＦＰＳオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒマワリＦＰＳｃＤＮＡｓの配列を決定、増幅し、（ｂ）細菌性細胞からＦＰＳ ｃＤＮＡｓを発現させ、その機能を確認するために酵母変異種で機能相補分析を行い、（ｃ）生体内のヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＳＦＰＳ）の過発現(overexpression)の影響を調査するために、遺伝子導入タバコ植物種を製造し、（ｄ）遺伝子導入植物で植物成長時間に更に多くの花を生産し、２倍以上の種子を生産する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、構造上に多様なイソプレノイド生合成代謝産物に対して重要な酵素であるヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼをコードする、分離されたｃＤＮＡのヌクレオチドとペプチド配列を提供する。また本発明は、前記のヌクレオチド配列を含む組換え植物発現ベクターと遺伝子導入タバコ植物を生産するために、前記組換え植物発現ベクター内のＤＮＡ配列を導入する宿主細胞を提供する。
【００１０】
本発明は、核酸構成物とプロモーターを含む組換え植物発現ベクターをタバコ植物細胞内に導入する段階と、その細胞を植物に成長させる段階からなり、前記の核酸構成物は、配列２のタンパク質をコードする、分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を含むことを特徴とする、タバコ植物の葉っぱにおけるクロロフィル含量を増加させ、老化を遅延させ、無性生殖を増加させ、かつ、種子生産量を増加させる方法を提供する。
【００１１】
前記ｃＤＮＡヌクレオチド配列は、ヒマワリ(Helianthus annus)の苗から分離したものであってもよい。
前記組換え植物の発現ベクターは、ｐＣＩＰ−ｓｆｐｓ（ＫＣＴＣ ０５２０ＢＰ）であってもよい。
【００１２】
前記遺伝子導入タバコ植物は、前記増加させる方法により、タバコ植物の葉っぱにおけるクロロフィル含量が増加され、老化が遅延され、無性生殖が増加され、かつ、種子生産量が増加されてなるものであってもよい。
【００１３】
前記遺伝子導入タバコ植物は、配列１の分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を含む核酸構成物を含み、前記のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片はヒマワリ(Helianthus annus)の苗から分離されたものであってもよく、合成されたものであってもよい。
前記のヌクレオチド配列は配列１であってもよい。
【００１４】
前記のＤＮＡ配列は、実質上（アグロバクテリウムチュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはバキュロウィルス(baculovirus)）変種、ＫＣＴＣ ０５２０ＢＰに含まれた配列によりコードされるものが望ましい。
【００１５】
前記のプロモーターは、細菌のプロモーター、植物プロモーター及びウィルスプロモーターからなるグループから選択されたものであってもよい。
前記ベクターは、宿主に転移され複製可能な請求項１のＤＮＡ断片を含むハイブリッドベクターであってもよい。
【００１６】
前記ベクターは、宿主に転移され複製可能な、配列２のタンパク質をコードする、分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を含むハイブリッドベクターであってもよい。
【００１７】
本発明の宿主細胞は、植物由来のＤＮＡ断片を発現することができ、前記ハイブリッドベクターを含む形質転換されたものであってもよい。
本発明の宿主細胞は、植物由来のＤＮＡ断片を発現することができ、配列２のタンパク質をコードする、分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を含む形質転換されたものであってもよい。
【００１８】
本発明は、配列２のタンパク質をコードする、分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を提供する段階と、宿主細胞に前記のＤＮＡ断片を転移して、形質転換された宿主細胞を生産する段階と、前記ＳＦＰＳ遺伝子を用いて、ファルネシルピロリン酸シンターゼの生産に適合した培地で、前記の形質転換された宿主を試験管内で培養する段階とからなる試験管内のファルネシルピロリン酸シンターゼの製造方法を提供する。
【００１９】
本発明は、配列２のタンパク質をコードする、分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片を提供する段階と、形質転換された宿主細胞に前記のＤＮＡ断片を転移して、形質転換された宿主細胞を生産する段階と、植物で花と種子の生産に適合した環境で、前記の形質転換された宿主を培養する段階とからなる生体内のファルネシルピロリン酸シンターゼの製造方法を提供する。
【００２０】
本発明の宿主細胞は、植物、細菌、酵母及び真菌類からなるグループから選択され形質転換されたものであってもよい。
本発明の宿主細胞は、植物細胞であってもよい。前記植物は、タバコ種、グラス草科(grass)種及び多年生植物種からなるグループから選択され、形質転換されたものであってもよい。
【００２１】
【発明の実施の形態】
非遺伝子導入または対照群ベクターに形質転換されたタバコ植物と比較する時、ファルネシルピロリン酸シンターゼを発現する遺伝子導入植物は、乾燥環境に対する強い耐性と葉っぱのクロロフィル高含量、種子生産において２倍に増加されることを示す。
植物と人間に存在するＦＰＳのアミノ酸配列を比較した結果、それらは高い相同性を有し、５個の異なる領域が存在することが示された。ＦＰＳの機能を特徴化する第１番目の段階で、ＦＰＳ ｃＤＮＡをクローニングし、それが機能的なＦＰＳをコード化するということを明らかにした。
【００２２】
ファルネシルピロリン酸シンターゼをコード化するヒマワリＳＦＰＳ（ＫＣＴＣ０５２０ＢＰ）に融合させた３５Ｓプロモーターを遺伝子導入タバコ植物(Nicotiana tabacum L.)に挿入し形態学的変化を調査した。かかる構成物はタバコでファルネシルピロリン酸を過剰生産した。ＦＰＰの過剰生産はＴ0植物において、葉っぱにおける更に多くの色素形成、側枝発芽、継続する成長及び葉っぱの老化遅延現象と、それによる花の２倍以上の増加、種子生産の最小２倍の増加を含む等、形態的及び生理的に顕著な変化をもたらした。
【００２３】
ある機関で、ＦＰＰの増加された生産が、植物で葉液の若芽分裂組織、開花及び種子セッティングまたは葉っぱの老化のような発育結果に影響を与えたか否かを調査した。増進された植物成長と収穫は、農作物科学分野の最も重大な目標として見なされてきた。成長と発達が異なる遺伝子とその生産物の複雑な相互作用により支配されるので、該目標を達成することは容易なことではなかった。生合成の生産能力を増加させる１つの方法は、組換えＤＮＡ技術を応用することである。
【００２４】
本発明で説明した技術は、遺伝子導入植物で農業的な利点を発生させると思っている。本発明はｐＦＰＳの構成物を導入し、ヌクレオチド配列を転写する植物を再産出し、植物の成長長さ、総合的な種子産出、花の数とクロロフィル含量において顕著な変化を示す植物を選択する方法等を含む。組換え発現カセットは、アグロバクテリウムを用いるかまたは有性交配により植物組織に注入され得る。更に本発明は、増進された成長と発達を促進する方法を提供する。本発明はタバコ植物に関連して説明したが、該技術はまたタバコ植物以外の他の植物における成長と発達にも使用することができる。
【００２５】
［実施例］
下記の実施例は、本発明の特徴をより詳しく例示するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
ｃＤＮＡのクローニング
ファルネシルピロリン酸シンターゼに対する遺伝子を下記のとおり分離した。この研究で用いた全ての化学製品は特別に言及されない限りシグマ(Sigma)社から購入したものである。ストラタジン(Stratagene)社のｃＤＮＡ合成キットを用いてヒマワリλｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリーを作るために、播種してから１０日目の葉っぱを用いた。
【００２６】
該ライブラリーを培養してから大腸菌ＸＬ１−ブルーＭＲＦ′変種に増幅した。３０％のグリセロールで−９０℃に保管されたストラタジン社のＳＯＬ−Ｒ competent細胞を選択するために、ＬＢ／テトラサイクリン平盤培地に培養し、３７℃の培養器で一晩中培養した。０．２％のマルトースと２ｍＭ硫酸マグネシウムを添加した５０ｍｌの殺菌したＬＢ培地で、よく分離された単独コロニーを接種した。それから３７℃で攪拌しながら一晩中培養した（回転攪拌器で２５０ｒｐｍ）。
【００２７】
マルトーズで育った細菌が更に能率的にλファージを吸着する；マルトーズは、バクテリオファージλ受容体をコード化する遺伝子(1amB)を含むマルトーズオペロンを誘導する。ＳＯＬ−Ｒ細胞が不安定のため、必要になる時まで４℃でＬＢ培地で保管した。５ｍｌのＳＯＬ−Ｒ細胞をエペンドルフ(Eppendorf)チューブに移し、超遠心分離器で最高の速度で８秒間回転した。２．５ｍｌの細胞に１０ｍＭ硫酸マグネシウムに更に懸濁しその密度をＯＤ600で測定した。１０5ｐｆｕのバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーを０．１ｍｌの希釈された細菌細胞（１０8細胞／ｍｌ）が入れてあるファルコン(Falcon)社のチューブに添加ししばらくの間攪拌した。
【００２８】
ファージ粒子が細菌に吸着するように、そのチューブを３７℃で２０分間培養した。ファージと細菌性宿主細胞を培養する間、０．７％のアガロースをＬＢに溶かし、液体培養器の温度を４７℃に合わせた。培養後に溶解されたアガロース８ｍｌをそれぞれのチューブに添加し軽く攪拌し、ＮＺＹ下端のアガール(agar)平板上に敷いた。細菌が均一に分布されるようにプレートを慎ましく振とうして、最上部のアガロースが固くなるように１０分間放置した。それから、プレートを３７℃の培養器にひっくり返して入れた後、７〜８時間の間培養した。
【００２９】
７時間後にプラーク（plaque）を確認し、プレートの底全体が細菌に覆われるように更に幾時間培養した。その底全体が細胞に覆われたプレートに８ｍｌのＡＭ（１０ｍＭ塩化ナトリウム／１０ｍＭ硫酸マグネシウム水化物／５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５／０．０１％ゼラチン）を添加し、４℃で１時間の間振とうした。その液体をチューブに入れて、４℃で３分間２，０００ｒｐｍで遠心分離して沈殿物が生じた。その上澄を新しいチューブに入れ、５０μｌのＤＮａｓｅとＲＮａｓｅ（それぞれ１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。該試料を一晩中４℃で放置した。同一嵩のＳＭに溶解された２Ｍ塩化ナトリウムと２０％ＰＥＧ（分子量８，０００）を添加して攪拌し、３時間の間氷で培養した。
【００３０】
それからチューブを４℃で２０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄を除去してから、沈殿物を塩化ナトリウムとゼラチンのない５００μｌのＳＭに更に懸濁させて、ｐＨ７．５、４０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡと２５μｌの２０％ＳＤＳを添加した。該懸濁液を軽く振とうして、ウィルスが分解されるように６５℃で１０分間培養した。
それから分解物を室温までに冷却させて、それぞれのチューブに５００μｌのＰＣＩ（トリス−飽和されたフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を添加し、５分間５，０００ｒｐｍで遠心分離した。その上澄を慎ましく新しいチューブに移した後、同一嵩のクロロフォルムを添加した。
【００３１】
５分間５，０００ｒｐｍで遠心分離してからその上澄を取って、２Ｍアンモニウムアセテートと３倍のエタノールと混合した。−２０℃で一晩中培養したら、それぞれのチューブからＤＮＡを分解できる制限酵素が大略１ｍｇ程度生成された。
その大きさに基づいて核酸を分離、確認して精製するために、多様な濃度のアガロースゲル（０．７〜１．５％）を用いて電気泳動を実行した。水平のミニゲール装置（ＢＲＬ）を主に使用した。
【００３２】
ゲル箱でプラスチックお盆の開放された両端を２個のテープにより封じて作業台に設けた。エルレンメイヤ(Erlenmeyer)フラスコに正確な量のアガロースと、１ｘＴＡＥ（４０ｍＭトリス−アセテート／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加して、メツラー秤(Mettler scale)上に載せて重さを測定した。それからそのスラリーをアガロースの粒子が完全に溶ける時までたまに振りあげながら、電子レンジで加熱した。
【００３３】
メツラー秤(Mettler scale)でアガロースゲル溶液の重さを更に測って、水を添加し元の嵩に合わせた。適当量のＥｔＢｒ（０．５ｇ／ｍｌ）を添加し、ゲル溶液を泳動槽に流し注ぎ、その上にくし（comb）を差し込んだ。ゲルが固まった後、くしとテープとを除去した。それから泳動槽に約１ｍｍのゲルになるよう、泳動槽を覆うのに十分な量の１ｘＴＡＥで泳動槽に満たした。ＤＮＡ試料を６５℃で５分間加熱したゲルローディング(loading)緩衝溶液（０．２５％ブルモフェノールブルー／０．２５キシレンシアノールＦＦ／１５％ピコル）と混合し、氷で冷却してから自動ピフェットでコーディングした。ブロモフェノールブルーがゲルの陰極の先端から１ｃｍ程度離れた所に到着する時まで、ゲルに５Ｖ／ｃｍの電圧をかけあげた。それからゲルをフォトダイン(Fotodyne)社の紫外線照明器で照射し、ポラロイド（ＡＳＡ３，０００）高感度フィルムを用いて写真を取った。
【００３４】
（実施例２）
退化した(degenerate)プライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応(Polymerase Chain Reaction)
ＰＣＲ増幅に用いられたと報告されたＦＰＳ配列に基づいた正(universal)オリゴヌクレオチドプローブ(Probe)を、成熟葉っぱのｍＲＮＡで作ったλＺＡＰｃＤＮＡライブラリーを用いて開発した。ファルネシルピロリン酸シンターゼの酵素の増幅に用いた退化したプライマーの配列は下記のとおりである：
プライマ１：5′- CAR GCH TWY TTY CTT GTD CTT GAT GAY ATH ATG-3′
プライマ２：5′- TKM ACS ACY AWC CAA GAR CAT YTR AAA TC-3′
【００３５】
５μＭのプライマ１と２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．３、５０ｍＭ塩化カリウム及び２．５uタクポリメラーゼ(Taq polymerase)を含む５０μｌの反応混合物に、ｃＤＮＡの集合所であるライブラリーから抽出した全体プラスミドＤＮＡ１ｇを添加した。その試料の蒸発を最小にするために、少量の殺菌された鉱物性油で覆った。
【００３６】
第１番目は９４℃で２分、５０℃で１．５分、７２℃まで３分、７２℃で１．５分の条件で実行した。次の２番目は９４℃で１分、５０℃で１．５分、７２℃まで３分、７２℃で１．５分に実行した。かかる前処理後に、増幅を９４℃で１分、５５℃で１．５分、７２℃まで１．５分、７２℃で１．５分に３２回実行した。ＰＣＲ生成物の中１０μｌを同量のローディング緩衝溶液と混合し、１％アガロースゲルから分離した。
【００３７】
（実施例３）
増幅された核酸断片のヌクレオチドのシークエンシング
ＰＣＲ生成物のサブクローニング
ブラント末端を有する断片でＰＣＲ生成物をクローニングすることは、その鋳型がタクポリメラーゼの末端転移酵素活性に独立的であるので、断片の３′末端にヌクレオチドを付加させることにあまり効果的でなかった。ｄＡＴＰに対するポリメラーゼの強い親和性のために、ほとんどの場合にそれはアデノシンである。
【００３８】
ｐＧＥＭプラスミドＤＮＡは、一晩中エコ(Eco)ＲＶ(ＮＥＢ)（１０μｇｐＧＥＭ ＤＮＡ/６μlエコＲＶ緩衝溶液／10μgＢＳＡ／２０ユニットエコＲＶ／８１μl水）で分解した。分解されたＤＮＡを−２０℃で３時間の間０．５Ｍの塩化ナトリウムと３倍嵩のエタノール（−２０℃）で遠心分離して沈殿させた。沈殿物を１００μｌの水に更に懸濁し、ゲル状で完全な分解物を確認した。
【００３９】
それから分解されたベクターをプロメガ(Promega)社のタクポリメラーゼ（８５μｌ分解されたベクター／１０μlタクポリメラーゼ緩衝溶液／２μｌ ｄＴＴＰ(１００ｍＭ)／３μｌタクポリメラーゼ）と培養し、そのエキソヌクレアーゼ活性により３′末端の突出部分を除去した。少量の鉱物性の油をその上に覆って、その混合物を熱循環器(thermal cycler)で７０℃で２時間の間培養した。それから試料を２倍嵩のフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコールと混合し、５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後クロロフォルムを抽出した。
【００４０】
その上澄を慎ましく２倍嵩のエタノールと混合し、−８０℃で２０分間培養した。５分間最高速度で遠心分離し、その結果生成された沈殿物を１００μｌの０．１ｘＴＥに更に懸濁した。それからＰＣＲ生成物をＴ−ベクター（２．５μｌの４ｘリゲーション(Ligation)）緩衝溶液／２μｌのｐＧＥＭ Ｔ−ベクター／１μｌのＰＣＲ生成物／１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ／４．５μｌの水）と１２℃で一晩中培養した。４ｘリゲーション緩衝溶液は、４００ｍＭトリス、ｐＨ７．５、８０ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭ ＡＴＰ、４０ｍＭ塩化マグネシウム、４００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含んで−２０℃で保管した。
【００４１】
冷凍したＤＨ５−α適合細胞を氷の上で溶かした。２μｌのβ−Ｍｅ、３μｌのリガーゼ及び５０μｌのＤＨ５α細胞を含むリゲーション混合物を備えて、３０分間氷で培養してから、４２℃で正確に６０秒間加熱した。その試験管をすぐ氷で２分間冷却した。４５０μｌのＬＢを添加し、攪拌器で２５０ｒｐｍで１時間の間３７℃で培養した。混合物の１／４をＸ−ｇａｌ／ＩＰＴＧ／Ａｍｐプレートに注いで３７℃で一晩中培養した。
最初に、５０個以上のクローンを制限エンドヌクレアゼ地図制作(mapping)により分析し、プライマ部位にベクター塩基配列を用いてｃＤＮＡ両末端から塩基配列データを分析した。
【００４２】
ＤＮＡのシークエンシング
超巻き取り鋳型ＤＮＡ（３μｇ）をｐＨ８．０の１８μｌのＴＥに再懸濁した。該試料に２μｌの２Ｍ水酸化ナトリウムを添加した後、室温で５分間培養して鋳型ＤＮＡを変性させた(denature)。それからｐＨ７．５の８μｌの５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃと１００μｌのエタノールを添加して、氷で１５分間培養した。変性されたＤＮＡを集めて真空下で乾燥した。乾燥されたＤＮＡを７μｌの水に再懸濁し、１μｌのプライマ（０．５ｐモル／μｌ）と２μｌの５ｘシクァナーゼ(Sequenase)緩衝溶液と混合した。該混合物を６５℃で２分間培養し室温に冷却した。
【００４３】
希釈したラベリング混合物、ＤＴＴ、α−［32Ｐ］ｄＡＴＰ及び希釈したシクァナーゼ(sequenase)を添加し室温で２分間培養した。最終混合物を４塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）に分けて添加し、４２℃で２分間培養した。それぞれの試験管に反応終了溶液を添加し、該試料をゲル状にローディングする前、９５℃で２分間加熱した。重要な塩基配列に対する最上の分析結果を得ることに必要な時間の間、該試料を３５Ｗの一定した電力で６％アクリルアミドゲルから分離した。実行後ゲルを１枚の３ＭＭの紙の上に載せて置いて、サラン(Saran)ラップにかぶせた。それからゲルをバイオーラド(Bio-Rad)社の真空乾燥機で８０℃で３０分間乾燥し、室温でコダクＸ−Ｏｍａｔフィルムに一晩中露出させた。マックベクター塩基配列分析プログラム(Mac Vector Sequencing Analysis Program)を用いて、その試料の配列を解読し分析した。
【００４４】
（実施例４）
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
放射能プローブの調製
プラスミドＤＮＡを５００ｍｌの３２７個のクローン培養液から、プロメガ社のマックシ−プレップキット(Maxi-prep kit)を用いて分離した。５０μｇのプラスミドＤＮＡをKpn I及びSac I制限酵素で分解することにより挿入物を分離した。プラスミドＤＮＡを３７℃で２時間の間Sac Iで分解し、９５％エタノールで一晩中沈殿した。それから線形化されたＤＮＡを同一条件下でKpnIで切断した。全てのＤＮＡ試料を１％のアガロースゲルを通過させて、その挿入物を低溶解アガロースを用いて分離した。ゲルから挿入物を分離してから、ゲルを紫外線照明器で照射し、挿入物の位置を表示した。
【００４５】
それから挿入物の陰極側のアガロースゲルをナイフを用いて切断し、１％の低溶解アガロース溶液をウィンド(window)に流し注いだ。その挿入物を低溶解アガロース領域から電気泳動で分離した。低溶解アガロースを切除し、同じ嵩の２ｘ抽出緩衝溶液（４００ｍＭ塩化ナトリウム／２００ｍＭトリス、ｐＨ７．９／２ｍＭ ＥＴＤＡ）を添加した。混合物を１５分間６５℃まで加熱して、アガロース塊を溶かした。溶けたゲル片らを試験管に入れて、同一嵩のフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加した後、クロロフォルム／イソアミルアルコールを添加した。
【００４６】
エタノールで沈殿させた挿入ＤＮＡを真空で乾燥し、ｐＨ８．０のＴＥに再懸濁した。分離された挿入物をアマーシャム(Amersham)社のマルチプライムＤＮＡラベリングキットを用いてラベリングした。一反応で大略２５μｇのＤＮＡを鋳型に使用した。適当量のＤＮＡに２１μｌの水を添加し（５０μｌの反応で）、該混合物を５分間熱湯で加熱してから氷で冷却した。鋳型ＤＮＡを変性させる間反応を始めるし（４μｌのラベルされないｄＮＴＰｓ／５μｌの反応緩衝溶液／５μｌのプライマ／２μｌのクレナウ(Klenow)ＤＮＡポリメラーゼ／５０μＣｉ［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ、３，０００ｍＣｉ／ｍｌ）上下にピペッティングして徐々に混合した。
【００４７】
該反応物を３７℃で３０分間培養し、１００μｌのＳＴＥ（１００ｍＭ塩化ナトリウム／１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加し反応を終了させた。ラベルされたＤＮＡを回転−カラムクロマトグラフィーで分離した。該カラムは、ベックトン−ディキンソン(Becton-Dickinson)社の１ｍｌの１回用の注射器で制作した。注射器を少量の殺菌グラスウール(glass wool)で塞いでＰ−１０平形のＳＴＥで詰めた。注射器を１５ｍｌの遠心分離器チューブに入れて１分間１，５００ｒｐｍで遠心分離した。充填されたビードが０．９ｍｌの嵩となるまで、ゲルをかかる方法により充填した。
【００４８】
カラムを１００μｌのＳＴＥで２回洗滌した。蓋のないエペンドルフチューブを遠心分離器チューブの底に置いてカラムをチューブに入れた。注射器の針の先端をエペンドルフチューブの入り口に合わせた。放射能試料をローディングし、１分間１，５００ｒｐｍで遠心分離し、ラベルされたプローブから遊離されたヌクレオチドを分離した。流出物を新しいエペンドルフ試験管に移して嵩を測定した。カラムを通過する前後の１μｌの試料に対する放射能を測定することにより、ラベルされたヌクレオチドの結合比率を計算した。ノーザンブロッティング、サザンブロッティング及びｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、ラベルされたＤＮＡをプローブに用いた。
【００４９】
ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子をクローニングするために、ヒマワリｃＤＮＡライブラリーを含むバクテリオファージを備えてスクリーニングすることに用いた。フィルタが２枚用意され、完全に分離され一致しているプラークが選抜され、挿入断片を配列決定した。それで、ファルネシルピロリン酸シンターゼをコード化する新しい遺伝子を決定した（配列１）。ヒマワリで１つのＦＰＳをクローニングし、遺伝子銀行(GenBank)に承認番号ＡＦ０００９３７（ヒマワリＦＰＳ）に登録した。ＦＡＳＴＡｎ調査は、ヌクレオチド配列が既に報告された他のＦＰＳ族と似ているということ、即ちタバコＦＰＳの８７％相同性を有するということを示す。
【００５０】
全てのクローニングしたＦＰＳ酵素の調査で保全されたアミノ酸が表れた。最初５０個のクローンを制限エンドヌクレアーゼ地図制作(mapping)により分析し、プライマ部位にベクター塩基配列を用いてｃＤＮＡの両末端から塩基配列データを分析した。長い鎖をイソプレノイド２リン酸であり、ステロール生合成でＤＭＡＰＰをＦＰＰに転換する、ファルネシル化されたタンパク質であるＦＰＳ酵素をコード化するサン−ＦＰＳ(ｓｕｎ−ＦＰＳ）ｃＤＮＡをかかるクローンから選択し特徴づけた。サン−ＦＰＳ１（１３４７ｂｐ）ｃＤＮＡｓは、プレニル転移酵素の特徴を示す典型的なＤＤＸＸＤモチーフ（Ｄ：Ａｓｐ、９３〜９７アミノ酸、２３２〜２３６アミノ酸、配列２参考）を有する、３４６個のアミノ酸を含む分子量３１，０００のタンパク質をコード化する。
【００５１】
（実施例５）
温度に敏感な酵母変異種を用いた融合タンパク質酵素活性の分析
ヌクレオチド塩基配列分析を完成した時、タンパク質発現に対するｐＲＳＥＴ融合タンパク質システムと酵母補完分析に対するｐＹＥＳ２を用いて発現ベクターを構成した。ＳＦＰＳタンパク質を過発現させ部分的に精製して、生成物の大きさを確認した。これは酵素機能をサッカロマイセスセレビジエ(Saccharomycescerevisiae)ＦＰＳ変異種補完分析により調査した。ｐＧＥＭベクターでサブクローニングされたＳＦＰＳをコード化するＤＮＡ断片を、ＰＣＲにより一対の変異されたオリゴ（7s-3 CGG GAT CCA TGG CCT CTG ATC TCA AGT C及びBIEN TCG CGA GGC GAA TTG GGT ACC GGG)を用いて増幅した。
【００５２】
ＰＣＲ生成物をｐＧＥＭベクターで更にサブクローニングした。ＬＢ培地で１０個の陽性反応のクローンを選択培養した。挿入物をEcoR I分解により確認した。実際に陽性のクローンを選抜し、冷凍グリセロールストック(stock)を作った。５０μｌ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に５０μｌの冷凍ｐＲＳＥＴ−ＳＦＰＳストックを接種し、攪拌器で３７℃で一晩中培養した。それから全培養液を既に暖ためた５００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐに接種した。ＯＤ600値が０．６〜０．８に達した時、Ｌａｃオペロンが活性化されるように、２ｍｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。
【００５３】
該培養液を更に４時間培養し、１５分間２，０００ｒｐｍで遠心分離した。それからその上澄を慎ましく除去した。５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール及び０．２％ＮＰ−４０を含む１５ｍｌの溶解(Lysis)緩衝溶液に沈殿物を再懸濁した。細胞懸濁液をブランソン(Branson)社の超音波器を用いて１０目盛りに対してパワー５で、それぞれ３０秒ずつ４回にかけて超音波処理し、３０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。その上澄を回収しアミコン(Amicon)社の０．４５μｍろ過器でろ過した。タンパク質抽出物をゲルに通過させることにより、ＳＦＰＳタンパク質の誘導水準を調査した。
【００５４】
本発明では１０％ＰＡＧＥを用いた。ホーエファ科学(Hoeffer Sci.)のグラディエントメーカー(Gradient maker)を用いて下部ゲルを作った。グラディエントメーカーを１０目盛りに対して３にして磁性攪拌器の上に載せて置いた。１０％ゲル混合物（２．２ｍｌ水／２．９ｍｌ ２Ｍトリス緩衝溶液、ｐＨ８．８／２．６ｍｌ ３０％アクリルアミド／４０μｌ １０％過硫酸アンモニウム／４０μ２０％ＳＤＳ／７．８ｍｌゲル溶液に対する１０μｌ ＴＥＭＥＤ）を低濃度チャンバーに入れて、グラディエントメーカーで２０％ゲル溶液（０．２ｍｌ水／２．９ｍｌ ２Ｍトリス、ｐＨ８．８／４．６ｍｌ ３０％アクリルアミド／４０μｌ １０％過硫酸アンモニウム／７．８ｍｌゲル溶液に対する１０μｌ ＴＥＭＥＤ）と混合した。
【００５５】
ファーマシア(Pharmacia)社の２個の連動(peristaltic)ポンプで該混合物をバイオーラド(Bio-Rad)社のミニゲルカセットに注入した。下部ゲルを室温で３０分間備えた。２つのサンドイッチになっているスラブの間に、高さがスラブの上から２ｃｍとなるようにゲル溶液を満たした。２２ゲージの針を有する、油を塗った(greased)注射器により、水に飽和されたｎ−ブタノール(Butanol)を板の上にかぶせた。約０．３ｍｌのブタノールをゲルの上部に重層した。次の板の他面が異なるスペーサーに隣接するように繰り返した。しばらく後でブタノール層が全体表面に均一に形成した。ゲルが重合される時に、非常に鮮明なブタノールとゲルとの境界面を見ることができた。
【００５６】
下部ゲルを用いる前で、夜間に流し注いでその表面をパラフィルムで覆った後、室温で貯蔵することができる。鋳型台(castingstand)を傾いてブタノール層を流し出した。ゲル表面を２０ｍｌの蒸留水で洗い出した。それから水に溶解された０．５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ８．８、０．１％ＳＤＳを含む３ｍｌのゲル蓋(overlay)緩衝溶液を添加し、最小限１時間放置して置いた。ゲル蓋溶液を２２ゲージの針を有する注射器を用いて除去した。
【００５７】
上部にゲル（１．１ｍｌの水／０．４ｍｌ ４ｘ上部トリス／０．１５ｍｌ ３０％アクリルアミド／８μｌ １０％過硫酸アンモニウム／５ｍｌの嵩に対して３．３μｌＴＥＭＥＤ）を積んでＡＰとＴＥＭＥＤを添加する前、その中５ｍｌを積んだゲル表面を洗滌することに用いた。ゲルカセットを数回傾けて、余分のゲル溶液を流した。上部にウェル形成用のくしは、試料がウェルにローディングされるまでそのまま残しておいた。上部にウェル形成用のくしをはずし、２２ゲージの針を有する１０ｍｌの注射器を用いて、ウェルに貯まっている緩衝溶液を除去した後、すぐそれぞれのウェルを洗浄した。試料緩衝溶液に溶解されたバイオ−ラド社の既に染色された低分子量のマーカーと、１０〜１５μｇのタンパク質を含有する試料を１％β−メルカプトエタノールと３％ＳＤＳで調製した。
【００５８】
それから該試料をローディングする前、６５℃で１５分間加熱した。適当量の試料をＰＡＧＥローディングチップが付着されたピペットマン(Pipetman)でローディングした。ゲルカセットに１０ｍＡの一定した電流を供給する途中で、染色薬が分離(lower)ゲルに移動し始まった時に電流を２０〜２５ｍＡに高めた。染色薬が底から０．５ｃｍ離れた地点に到着する時まで進行させた。クマシブルー(Coomasie blue)により染色されたゲルから、ＦＰＳの予想される分子量と相応する３１，０００Ｄａから過発現された鮮明なタンパク質バンドが観察された。タンパク質プロファイルは図１に示した。
【００５９】
ＦＰＳに対する酵母相補(complementation)分析
サン−ＦＰＳ１が機能性酵素をコード化するかを調査するために、信頼性のない変異エルグ(erg)２０−２を有する、温度に敏感な突然変異体の変種である変異種酵母(Saccharomyces cerevisiae)変種ＣＣ２５でｃＤＮＡを発現させた。従って、該変異種は、複製を阻害する温度（３６℃）では、エルゴステロルに対して栄養要求性である。Bam HIとXho I部位で発現ベクターpYES２-SFPSを構成した。ＧＡＬ１プロモーターの調節下でヒマワリＦＰＳ１ ｃＤＮＡを有するｐＹＥＳ２−サン−ＦＰＳ１に変異種酵母を形質転換した。図２の図示のとおり、酵母変異種のエルゴステロルを栄養要求性を、３６℃でプラスミドｐＹＥＳ２−サン−ＦＰＳ１で補充した。補充された酵母でＦＰＳ ＤＮＡの存在をＰＣＲ増幅で確認し、これはこの挿入されたタンパク質が酵母ＦＰＳの酵素活性を代替し、次の生化学的な段階を復旧できるということを示す。
【００６０】
（実施例６）
ＳＦＰＳのプラスミド構成と形質転換
上述のとおり、ＦＰＰは特にステロイド合成とカロチン合成において、構造上多様なセスキテルフェノイド類の前駆体であり、イソプレノイド経路の多重分岐点に存在する。
ＦＰＳ ｃＤＮＡの分離と遺伝子の技術は、他の宿主システムで過発現の影響を実行できるようにする。生体内のＳＦＰＳ酵素活性を測定し、ステロイド合成またはカロチン合成に対するＦＰＳ過発現の影響を調査するために、遺伝子導入タバコ植物を産出するように、アグロバクテリウム−ｐＣＩＰ−ＳＦＰＳ二重ベクター(binary vector)を構成した。これは生体内の機能性ＳＦＰＳ１であるかを決定するためにも必要なものであり、実質的な代謝作用において、ヒマワリのその自体で過発現するものが必要であるので、ＦＰＳ酵素をコード化する組換えアグロバクテリウムクローンは、遺伝子導入植物を産出するために構成された。
【００６１】
Ａ．遺伝子導入されたヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＳＦＰＳ）ダバコの産出
上述のとおり、ＦＰＰは特にステロイド合成とカロチン合成において、構造上多様なセスキテルフェノイド類の前駆体であり、イソプレノイド経路の多重分岐点に存在する。生体内のＳＦＰＳ酵素活性を測定し、対象植物に対するＦＰＳ過発現の影響を調査するために、遺伝子導入タバコ植物を産出するように、アグロバクテリウム−ｐＣＩＰ−ＳＦＰＳ二重ベクターを構成して、遺伝子導入タバコ植物を産出した。
【００６２】
ｐＧＥＭベクターで８５０個の塩基対の挿入物をＢａｍＨＩとＮｒｕＩで切断し、キアゼン(Qiagen)社のゲル精製キットを用いて、１％ＴＡＥ−アガロースゲルに通過させて精製した。ＢａｍＨＩとＮｒｕＩとに分解したＰＢＩ１２１と精製した挿入ＤＮＡとを、適当な緩衝溶液でＤＮＡリガーゼと混合し、１６℃で一晩中培養した。中間サイズの調製後、制限酵素分解で確認した陽性のクローン(clone #668)をアグロバクテリウム形質転換に用いた。ＭＳ−アガー培地で育った野生のタバコ植物を収集し殺菌した。アグロバクテリウム変種ＬＢＡ４４０４をＬＢ（５ｇ塩／Ｌ）で、対数期末期や停止期初期まで培養した。
【００６３】
細胞塊を１０ｍＭの塩化マグネシウム、５％蔗糖、０．００５％シルウエット(Silwet)Ｌ−７７にＯＤ600値が０．８となる時まで再懸濁した。殺菌した葉っぱをアグロバクテリウム懸濁液に入れて外科用メスで切った。アグロバクテリウム懸濁液に１５分間入れてから、葉っぱディスク(disc)を発芽ＭＳ培地（蔗糖、ビタミン、ＮＡＡ、０．１ｍｇ／Ｌ及びＢＡ、１ｍｇ／Ｌ）に移した。２５℃培養器で光のない状態で三日間培養した後、残存しているアグロバクテリウムを高圧殺菌した蒸留水で洗滌し、葉っぱディスクを新しいＭＳアガープレート（蔗糖、ビタミン、カルベネシリン、２５０ｍｇ／Ｌ、ガナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ、０．１ｍｇ／Ｌ及びＢＡ、１ｍｇ／Ｌ）に移した。
【００６４】
形質転換体選択のために、４週間にかけて毎週ガナマイシンの量を増加させて全培養した。若芽が生えた時、それらを新しいＭＳ固定培地（蔗糖、ビタミン、カルベネシリン、２５０ｍｇ／Ｌ及びガナマイシン２００ｍｇ／Ｌ）に移して２週間放置した。選択された形質変換体を、根を張る時まで根誘導培地（１／２ＭＳ及び蔗糖）に移して置いた。３〜４週後に生存した遺伝子導入タバコ植物を土壌に移し植えて、２７℃温室で栽培した。
【００６５】
Ｂ．遺伝子導入タバコ植物の特徴
他の遺伝子導入タバコ植物に導入されたＳＦＰＳの発現を確認するために、ゲノムのＤＮＡ試料を精製した。遺伝子導入タバコ植物からゲノムのＤＮＡを分離するために、冷凍−解凍方法を使用した。急冷させた葉っぱを液体窒素で冷却された擂り鉢とすりこぎで挽いて、きれいな２５ｍｌのコレックス試験管に移した。溶解緩衝溶液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０／１００ｍＭ ＥＤＴＡ／１００μｇ／ｍｌタンパク質分解酵素(Proteinase)Ｋ）にＳＤＳを０．５％添加した。該混合物を７０℃で１５分間培養してから、タンパク質分解酵素Ｋを最終濃度２００ｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で一晩中培養した。
【００６６】
それから、同一嵩のトリス緩衝溶液−飽和フェノールを添加してから、同一嵩のクロロフォルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、１時間の間ラブクェーク(Lab Quake)で混合した。試料を最高速度で攪拌し、５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。その上層を新しい試験管に移し、４００μｌのクロロフォルム：イソアミルアルコールを添加した。軽く攪拌してから試料を遠心分離し、その上層を新しい試験管に入れた。ｐＨ８．０の１／１０嵩の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍嵩の純粋なエタノール（−２０℃）を添加し、軽く振とうして混合した。それから該試験管を−２０℃で一晩中培養した。
【００６７】
４℃で５分間５，０００ｒｐｍで遠心分離し、ＤＮＡ塊を得た。遠心分離後、上澄を真空連続抽出パストゥールピペットで慎ましく除去した。１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃）を添加して洗滌し、遠心分離して上澄を除去した。その後、余分のエタノールを蒸発させるために、沈殿物を真空下でサバント(Savant)社のスピードバック(speed vac)で乾燥した。ＤＮＡを５０〜１００μｌのＴＥ、ｐＨ８．０（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し確認後その量を決めた。サブクローニングＳＦＰＳ挿入物に対して使用された同一なオリゴヌクレオチドを非常に厳しい条件におけるＰＣＲ増幅に対して使用した。遺伝子導入タバコ植物の試料から産出したＰＣＲ生成物を７６０塩基対と１５０塩基対の断片を産出するXba Iに分解した。そのような断片を有する選択された遺伝子導入タバコ植物を更に成長させ、遺伝子タバコ植物における導入されたＳＦＰＳの発現水準をノーザンブロットで調査した。
【００６８】
ノーザンブロット
全体ＲＮＡ試料をシグマ社のトリ(Tri)試薬を用いて精製した。最後に、その塊をＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）で処理された４００μｌの蒸留水に再懸濁し、ベックマンデュ(Beckman Du)８分光光度計で１００倍希釈液の吸光度を測定しその量を決めた。
【００６９】
分解は発生されないことを確認するために、それぞれの分離されたＲＮＡ試料から１．５ｇのＲＮＡを含む天然分析ゲル(native analytical gels)で実行した。それから１０μｇの任意の全体ＲＮＡを含む一部を電気泳動で分離し、ニトラン(Nytran)膜上に移した。蒸留水に浸したニトランにＲＮＡを移し、１５分間２０Ｘ ＳＳＰＥにびっしょり浸した。移動緩衝溶液で２０Ｘ ＳＳＰＥを用いて２４時間の間サザン分析に用いたことと同様な装置で移動を遂行した。１００℃で５分間ｐＨ８．０の０．０２Ｍトリスでその膜を反応させることにより、移動されたＲＮＡｓのデグリオキシル化反応を完成した。
【００７０】
前記のとおり産出した放射能ＳＦＰＳプローブを本実験で用いた。プリハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及びＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション洗滌をＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに対し説明したとおり実行した。また、自動Ｘ線撮影をサザンハイブリダイゼーションのように遂行した。ノーザンブロット分析結果は、サン−ＦＰＳ１をコード化するｍＲＮＡが、葉っぱと幹とに高い含量で存在することを示す（図３）。
【００７１】
ＦＰＳの過発現は、老齢の植物において、老化が緩められた結果であり、クロロフィル含量、ルビスコ(Rubisco)の相対的な量及びシステインプロテアーゼを含む老化遅延に対する数個の要素を調査した。葉っぱの老化は、重要な代謝産物が成長に用いられるために回復される間、結局細胞の死滅に至る活発に調節される発生過程であると知られている(Weaver et al,1998)。光合成作用は、細胞がそれらの構成分及びタンパク質内容物が除去され、核酸が数個のフォルド(fold)を除去し、澱粉と脂質が物質代謝されることにより衰退するものと観察された。
【００７２】
（実施例７）
遺伝子導入タバコ植物を過発現するＳＦＰＳの葉っぱにおけるクロロフィル含量の測定
遺伝子導入及び非遺伝子導入植物の成長をモニタしたが、遺伝子導入植物のもっと暗い色素形成を除いては、遺伝子導入及び非遺伝子導入植物の成長に大きい差異はなかった（図４と図５）。植物抽出物でクロロフィルの含量を２セットの試料；４週目の遺伝子導入及び非遺伝子導入タバコの全体植物及び７ヶ月目の遺伝子導入及び４ヶ月目の非遺伝子導入タバコ植物の３ヶ月目の葉っぱを用いて分光光度計で測定した。前記２つの場合に、遺伝子導入植物は対照群に比して更に暗い色素形成が観察された。幾日以内に２グループを精密に調査し始めた。遺伝子導入植物で観察された特徴は、老化の長期遅延である（図６と図７）。図６〜図８に示されたとおり、遺伝子導入植物は、種子収集時間まで継続して新鮮に維持されることを示した。新鮮さが一般植物より更に長時間持続され、余分の葉液の芽と枝の根本から生える若芽は、正常の優性のため、余分の花とその生産物である種となった（図８）。
【００７３】
このように長く持続される年少は、ＦＰＰ過生産による高水準のジベレリンの結果であることもある。かかる一部の形態学的な変化等が直接的にジベレリンの集中された過発現の結果である反面、他の変化等はジベレリンが豊富な組織に植物栄養分が動員された結果であることもある。
【００７４】
（実施例８）
ＳＦＰＳを過発現する遺伝子導入タバコ植物の特徴決定
老化に関連した遺伝子の発現様式
一般的に老化の調節は核によって行われる。老化は多くの構成成分の一連の退化過程であるがタンパク質合成が要求される。光合成タンパク質、ＣＡＢ及びルビスコをコードするｍＲＮＡｓは、老化する間にその多くは衰退することが知られており（He etal.,1997)、いくつかのｍＲＮＡｓ、システインプロテアーゼ、マレートシンターゼ及びグルタミンシンターゼは、その多くが増加の傾向を示す(Ding et al,1993;Oh et al.,1997)。遺伝子導入及び非遺伝子導入タバコ植物で、老齢に対する反応において、一対の老化関連遺伝子（ＳＡＧｓ）、ルビスコ及びシステインプロテイズの発現を比較した。
【００７５】
しかし、他の方法で標準と異なる個別のＳＡＧｓは部分的に重複されるが、一致しない環境でそれらの遺伝子生成物が役割を行うことを暗示する（He et al,1997)。ノーザンブロット分析のために、２、３、５、８及び２３週目の遺伝子導入植物と、２、３、５、８及び１６週目の非遺伝子導入タバコ植物を処理して、全体ＲＮＡ試料を分離した。末端にラベルされたシステインプロテアーゼオリゴをプローブに用いた。ノーザン分析結果、システインプロテアーゼのｍＲＮＡ水準が非遺伝子導入植物で、葉っぱの老化に伴って漸次的に増加した（図９のａ）。
【００７６】
しかし、ＳＦＰＳ−遺伝子導入植物は、全ての試料でシステインプロテアーゼの一定した水準を示した。図９ｂのとおり、ルビスコの発現水準は、遺伝子導入植物が２３週まで高く維持されるが、信号は非遺伝子転換植物で弱く得られる。要約すれば、対照群植物が記録された結果により確認された反面、ＳＦＰＳを有する遺伝子導入タバコ植物は、野生型と比較する時、高い含量のクロロフィル、高い含量で長く持続されるルビスコ及びシステインプロテアーゼの一定した水準を示す。不確実な理由で遺伝子導入タバコ植物は、おそらく過剰生産されるジベレリンにより、幹と葉っぱで年少が維持され、正常優性が維持されるし、連続的に葉液の発芽、多数の花及び多い種子を得る。
【００７７】
【発明の効果】
本発明は、ヒマワリ（Helianthus annus）の苗から得るヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ(sunflower farnesyl pyrophosphate synthase、ＳＦＰＳ)をコード化するように分離された、ｃＤＮＡヌクレオチド配列を含む組換え植物発現ベクターと、老化が遅延(delay)されて、花の発達と種子生産が増加された遺伝子導入タバコ植物の製造に関する。非遺伝子転換または対照群ベクターに形質転換されたタバコ植物と比較する時、二重構造のファルネシルピロリン酸シンターゼを発現する遺伝子転換植物は、乾燥環境に対する強い耐性、葉っぱのクロロフィル高含量、種子生産において２倍の増加を示す。
【００７８】
図１は、クマシブルーにより染色したゲルに、大腸菌(Escherichia coli)におけるヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼタンパク質の発現様式を示したもので、それぞれのレーンで１０μｇのタンパク質をローディングし、１０〜２０％のグラディエントＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離して可視化するために、クマシブルーで染色した。レーン１はクロン１；レーン２はクロン２；レーン３はタンパク質分子量標準物質を示す。過発現したタンパク質のバンド（分子量３１，０００）を矢印で表示した。
【００７９】
図２は、酵母ＣＣ２５変異種におけるＳＦＰＳの構造分析を示す。
図３は、遺伝子導入タバコ植物におけるＳＦＰＳの発現を示したもので、他の遺伝子導入タバコ植物で全体のＲＮＡ試料等を精製し、32Ｐ−ランダムプライム(random primed)ＳＦＰＳで試験した。
図４は、４週目の遺伝子転換及び非遺伝子転換タバコの全体植物を以て行った植物抽出物におけるクロロフィルの分光光度計の測定結果を示す。
図５は、７ヶ月目の遺伝子転換及び４ヶ月目の非遺伝子導入タバコ植物の３ヶ月目の葉っぱを以て行った植物抽出物におけるクロロフィルの分光光度計の測定結果を示す。
【００８０】
図６は、ＦＰＳ−遺伝子導入タバコ植物と対照群のタバコ植物とを比較したもので、種子を植えた後の葉っぱの新鮮さを示したものである。
図７は、ＦＰＳ−遺伝子転換植物と対照群植物の種子を収集したものである。図８は、７ヶ月目のＦＰＳ遺伝子導入タバコ植物と４ヶ月目の対照群タバコ植物を示したもので、土壌に移して植えてから７ヶ月目のものである。
図９は、老化現象と関連したシステインプロテアーゼとリブロース−１，５ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼに対するｍＲＮＡｓの発現パターンを示している。
【００８１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 大腸菌(Escherichia coli)におけるヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼタンパク質の発現様式を示した。
【図２】 酵母ＣＣ２５変異種におけるＳＦＰＳの構造分析を示す。
【図３】 遺伝子導入タバコ植物におけるＳＦＰＳの発現を示したものである。
【図４】 ４週目の遺伝子転換及び非遺伝子転換タバコの全体植物を以て行った植物抽出物におけるクロロフィルの分光光度計の測定結果を示す。
【図５】 ７ヶ月目の遺伝子転換及び４ヶ月目の非遺伝子導入タバコ植物の３ヶ月目の葉っぱを以て行った植物抽出物におけるクロロフィルの分光光度計の測定結果を示す。
【図６】 ＦＰＳ−遺伝子導入タバコ植物と対照群のタバコ植物とを比較したもので、種子を植えた後の葉っぱの新鮮さを示したものである。
【図７】 ＦＰＳ−遺伝子転換植物と対照群植物の種子を収集したものである。
【図８】 ７ヶ月目のＦＰＳ遺伝子導入タバコ植物と４ヶ月目の対照群タバコ植物を示したもので、土壌に移して植えてから７ヶ月目のものである。
【図９】 老化現象と関連したシステインプロテアーゼとリブロース−１，５ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼに対するｍＲＮＡｓの発現パターンを示している。
Claims (2)
- 配列番号２のヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡ断片とプロモーターを含む植物発現ベクターであるｐＣＩＰ−ｓｆｐｓ（ＫＣＴＣ ０５２０ＢＰ）をタバコ植物細胞内に導入する段階と、その細胞を植物に成長させる段階とからなることを特徴とする、タバコ植物の葉っぱにおけるクロロフィル含量を増加させ、老化を遅延させ、無性生殖を増加させ、かつ、種子生産量を増加させる方法。
- 請求項１に記載の方法により、タバコ植物の葉っぱにおけるクロロフィル含量が増加され、老化が遅延され、無性生殖が増加され、かつ、種子生産量が増加されてなる遺伝子導入タバコ植物。
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