CN114672499B

CN114672499B - 一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS及其启动子和应用

Info

Publication number: CN114672499B
Application number: CN202210024385.XA
Authority: CN
Inventors: 季孔庶; 姚圣; 陈妤; 朱沛煌; 王登宝
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2022-01-11
Filing date: 2022-01-11
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2042-01-11
Also published as: CN114672499A

Abstract

本发明公开了一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS及其启动子和应用，属于植物基因工程技术领域。马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PmGPPS的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。PmGPPS的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明发现PmGPPS能响应一些非生物胁迫和激素处理，过表达PmGPPS可正向调控MVA和MEP通路上部分基因的表达，有效提高下游物质及萜类化合物的产量。本发明有助于对马尾松PmGPPS基因功能的深入研究，并为提高马尾松萜类化合物合成的育种工作提供一种分子手段和依据。

Description

一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS及其启动子和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS及其启动子和应用。

背景技术

马尾松(Pinus massoniana Lamb.)是松科松属多年生常绿树种，是我国特有的乡土树种，其适应性强，耐干旱瘠薄，广泛分布在秦岭以南18个省，主产地区为赣、浙、闽、桂、粤、湘、川、渝、鄂、黔等地。马尾松林面积居我国林木前列。其木材纤维细长，非常适合造纸，因而马尾松是我国主要的纸浆材树种。此外，马尾松也是主要的采脂树种，中国每年松脂产量的70％以上来自马尾松(杨章旗，2015)，其松脂可提取松节油和松香，它们都是重要的化工原料，而松脂单产较低是制约马尾松松脂产业发展的重要因素，因此选育高产脂优良品种和营建高产脂人工林是提高松脂产量的有效措施。此外，松脂在抗生物逆境中也发挥着重要的作用。

香叶基焦磷酸合成酶基因(geranyl diphosphate synthase，GPPS)作为松脂中单萜组分直接前体的合成酶，是松脂生物合成MEP途径中第二阶段的关键限速酶之一。前人研究发现，在野生山苍子中瞬时表达和在烟草中过表达LcGPPS 均能提高单萜的产量，甚至在烟草中引入LcGPPS.SSU1会影响牻牛儿焦磷酸 (geranylgeranylpyrophosphate，GGPP)的表达，从而提高二萜的产量。将CiGPPS 和CiFPPS基因在烟草中过表达后发现，烟草中的萜烯类物质含量显著增加，在过表达GPPS的长春花(Catharanthus roseus)株系中也有类似的现象。这些结果表明过表达GPPS对提高萜类代谢物的产量。本发明公开马尾松GPPS序列及功能研究，有助于马尾松PmGPPS基因功能的深入研究，并为提高马尾松萜类化合物合成的定向育种工作提供一种分子手段和依据。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题在于提供一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS；本发明所要解决的第二技术问题在于提供一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的表达蛋白；本发明所要解决的第三技术问题在于提供一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因 PmGPPS的启动子；本发明所要解决的第四技术问题在于提供上述马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS、表达蛋白、启动子的应用。

激活胃癌细胞中PRDM5表达的saRNA。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述saRNA在制备抗胃癌药物中的应用。本发明所要解决的最后一技术问题在于提供一种利用前述saRNA制备的抗胃癌药物。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者为编码SEQ ID NO.2的DNA序列。

所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

在SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质，也属于本发明的保护范围。

所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的启动子，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

含有所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的重组表达载体、重组菌或转基因细胞系。

含有所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的启动子的重组表达载体、重组菌或转基因细胞系。其载体还含有与所述的启动子可操作地连接的目的基因。

所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的启动子在启动目的基因表达中的应用，所述目的基因位于所述启动子的下游。

所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS在响应植物非生物胁迫或激素胁迫中的应用。

本发明通过qRT-PCR技术对马尾松不同组织中PmGPPS基因表达量及不同胁迫下叶片中的表达量分析，将马尾松幼苗进行六种非生物胁迫和激素处理，即15％PEG₆₀₀₀渗透胁迫、机械损伤、10mM H₂O₂、100μM茉莉酸甲酯(MeJA)、500μM乙烯利(ETH)和1mM水杨酸(SA)。渗透胁迫处理方法为将植株根部浸没进15％PEG₆₀₀₀液体中，机械损伤处理方法为将每个针叶束剪去一半长度，其余处理方法为喷施液体至植株各部位。发现PmGPPS在马尾松的嫩叶中的表达较高且均能响应这些非生物胁迫和激素处理。

所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的启动子在驱动目的基因在响应植物非生物胁迫或激素胁迫中的应用。

本发明通过构建不同长度35S：ProPmGPPS：GUS表达载体，瞬时转入本式烟草叶片中，在不同胁迫处理后进行GUS染色。观察各片段在烟草叶片中的表达情况及不同激素处理下的启动子活性。通过对不同长度的启动子片段在烟草叶片中瞬时表达分析，初步表明各片段均能启动其相应的顺式作用元件。

所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS在构建转基因植物中的应用。将所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS导入植物组织或细胞，得到转基因植物，所述转基因植物为烟草、拟南芥或马尾松。

所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的启动子在构建转基因植物中的应用。将含有马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的启动子以及启动子可操作地连接的目的基因，构建重组表达载体，导入植物组织或细胞，得到转基因植物，所述转基因植物为烟草、拟南芥或马尾松。

所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS或所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的启动子在提高转基因植物GPPS酶活性中的应用或在提高转基因植物叶绿素含量中的应用或在提高转基因植物的萜类化合物产量中的应用。

本发明以模式植物拟南芥为研究对象，将克隆得到的马尾松异戊烯基转移酶基因PmGPPS利用农杆菌介导转化至拟南芥中，通过筛选与培育，最终获得 T3代纯合转基因植株。通过检测野生型拟南芥与8个转基因拟南芥株系的生理指标，发现转基因拟南芥中GPPS酶活性和叶绿素含量均高于野生型拟南芥，同时，萜类物质合成相关基因的表达量较野生型均有不同程度的上调。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明通过qRT-PCR技术对马尾松不同组织中PmGPPS基因表达量及不同胁迫下叶片中的表达量分析，发现PmGPPS在马尾松的嫩叶中的表达较高且均能响应这些非生物胁迫和激素处理；通过不同长度的启动子片段在烟草叶片中瞬时表达分析，初步表明各片段均能启动其相应的顺式作用元件。此外，发明以模式植物烟草和拟南芥为研究对象，将克隆得到的马尾松异戊烯基转移酶基因PmGPPS利用农杆菌介导转化至拟南芥中，通过筛选与培育，最终获得T3 代纯合转基因植株；通过检测野生型拟南芥与8个转基因拟南芥株系的生理指标，发现转基因拟南芥中GPPS酶活性和叶绿素含量均高于野生型拟南芥，同时，萜类物质合成相关基因的表达量较野生型均有不同程度的上调，表明本发明可通过调控萜类代谢途径中上游物质的表达，有效提高下游物质及萜类化合物的产量。本发明为提高马尾松萜类化合物合成的育种工作提供一种分子手段和依据。

附图说明

图1是马尾松总RNA的1.2％琼脂糖凝胶电泳图；

图2是PmGPPS基因完整开放阅读框克隆的PCR结果图；

图3是各组织PmGPPS基因相对表达量分析图；图中，相同字母表示差异不显著；

图4是各处理下PmGPPS基因相对表达量分析图；图中，星号表示差异的显著性：*p＜0.05，**p＜0.01；

图5是PmGPPS启动子片段PCR产物图；图中，六条片段分别对应六对引物；

图6是不同长度启动子构建GUS质粒的阳性鉴定图；图中，1： pBI121-PmGPPS-1690bp-GUS；2：pBI121-PmGPPS-1130bp-GUS；3： pBI121-PmGPPS-570bp-GUS；

图7是各片段启动子GUS染色的情况；图中，1、2、3为每个片段的三个重复；

图8是是四种外源激素处理下的GUS染色情况；图中，A： pBI121-PmGPPS-570bp-GUS；B：pBI121-PmGPPS-1130bp-GUS；C： pBI121-PmGPPS-1690bp-GUS；1、2、3为每种处理的三个重复；

图9是重组蛋白表达分析蛋白纯化分析；图A中，1，3为未诱导的对照组， 2，4为诱导后的蛋白；图B中，1-4为纯化蛋白样品；

图10是转PmGPPS基因拟南芥T1代植株DNA的PCR检测结果图；图中， 1-15表示转基因拟南芥；WT表示野生型拟南芥；

图11是叶绿素含量分析图；图中，WT表示野生型拟南芥；1-8表示转基因拟南芥。星号表示差异的显著性：**p＜0.01；

图12是GPPS酶活性分析图；图中，WT表示野生型拟南芥；1-8表示转基因拟南芥。星号表示差异的显著性：**p＜0.01；

图13是萜类物质合成相关基因的相对表达量分析图；图中，星号表示差异的显著性：*p＜0.05，**p＜0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值，检验方法为T-test检验。

实施例1马尾松PmGPPS基因开放阅读框的获得

取7年生马尾松针叶组织，利用植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取总RNA，利用逆转录试剂盒合成cDNA(Vazyme)，按照试剂盒提供的说明书操作。设计相应引物进行PCR。PCR扩增产物经过电泳检测并回收后，连入克隆载体pEASY(TransGen)并转化大肠杆菌T1菌株感受态细胞，经过抗生素筛选和菌落PCR鉴定后将阳性菌进行测序，将连接好的克隆载体命名为 pEASY-PmGPPS。获得PmGPPS基因编码蛋白质的ORF序列。利用ORFfinder 对PmGPPS的编码区进行翻译成氨基酸序列。

具体步骤如下：

(1)总RNA的提取

使用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA，提取前事先将研钵研棒用锡纸包裹后在烘箱中180℃烘烤4h左右。将样品放在液氮中研磨成粉末后，按照试剂盒说明书提取RNA，-80℃保存。马尾松叶片总RNA的1.2％琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，条带较清晰；测定总RNA的吸光度，OD₂₆₀/OD₂₈₀值为2.32，OD₂₆₀/OD₂₃₀为2.09，可用作基因克隆。

(2)cDNA的获取

使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒(Vazyme)，以提取的RNA为模板，反转录eDNA。

具体过程为：

1)在RNase-free离心管中配制如下混合液：5μg Total RNA，RNase-free ddH₂Oto 8μL。60℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。

2)上一步混合液8μL中加入2μL 5×gDNA wiper Mix，用移液枪轻轻吹打混匀。42℃2min。

(3)目的基因的克隆

根据马尾松转录组测序得到的PmGPPS基因序列，通过Primer 5.0设计中间片段特异性引物，克隆获得PmGPPS基因片段，然后进行连接载体、转化大肠杆菌、目的序列测序和序列分析，确定为目的基因。

PmGPPSORF克隆引物为：

PmGPPS-ORF-F：5′-ATGGGTTACAGTGGCATGGTAGTT-3′；

PmGPPS-ORF-R：5′-TCACTTCTGTCTTGAGGCAATGTAAT-3′。

PCR反应体系(50μL)为：2μL Forward primer(10uM/L)、2μL Reverse primer(10uM/L)、2μL Template cDNA(100ng/ul)、25μL 2×Taq PCR MASTER Mix、 19μL ddH₂O。

PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，58℃退火10s，72℃ 延伸45s，35个循环，72℃再延伸5min。

(4)连接载体与转化：在离心管中加入4μl产物，再加入1μl Blunt载体，混合后在室温反应15min。反应结束后加入50μl刚解冻的Trans1-T1感受态细胞，混匀后冰浴30min。将连接产物放于42℃金属浴中40s，之后立刻置于冰中2min。加入250μl平衡至室温的LB液体培养基(无Kan)，200rpm，37℃ 培养1h。10000rpm离心30s，弃上清液150μl，剩余培养液用移液枪吹打混合均匀后涂布在Kan抗性培养基上(培养基事先放于37℃培养箱中1h)，在37℃培养箱中过夜培养。阳性克隆检测后送至擎科生物测序。

实施例2马尾松PmGPPS在不同组织及不同胁迫处理下的表达量

本实施例随机选取三株长势一致的马尾松幼苗，采集其成熟叶、种子、幼苗、嫩叶、嫩茎5个部位进行RNA提取，反转录成cDNA后分析PmGPPS基因的相对表达量。此外，将马尾松幼苗进行六种非生物胁迫和激素处理，即15％ PEG₆₀₀₀渗透胁迫、机械损伤、10mM H₂O₂、100μM茉莉酸甲酯(MeJA)、500μM 乙烯利(ETH)和1mM水杨酸(SA)。渗透胁迫处理方法为将植株根部浸没进15％PEG₆₀₀₀液体中，机械损伤处理方法为将每个针叶束剪去一半长度，其余处理方法为喷施液体至植株各部位，每种处理选择三个长势一致的幼苗作为三个生物学重复，分别在0h、3h、6h、12h和24h采集针叶作为样本，在液氮中冷冻并保存在-80℃，将未经任何处理收集的0h样品用作对照，对所有样本进行RNA提取和cDNA合成，分析PmGPPS基因的相对表达量。实验设置三个重复，同时运用t-检验方法分析各表达量与对照组差异的显著性。

具体步骤为：

(1)cDNA的获取

RNA提取及cDNA第一链的合成方法，同实施例1(1)、(2)。反转录后eDNA稀释10倍。

(2)qRT-PCR分析

选用马尾松TUA(KM496535.1)作为内参基因。按照ChamQ^TM SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书方法分析PmGPPS基因的相对表达量，同时运用t-检验方法分析各表达量与对照组差异的显著性。

qRT-PCR引物为：

TUA-F：5′-CAAACTTGGTCCCGTATCCTC-3′；

TUA-R：5′-CACAGAAAGCTGCTCATGGTAA-3′；

qPCR-PmGPPS-F：5′-TTCGACAAGTACCTGCATTCCAA-3′；

qPCR-PmGPPS-R：5′-AAGCTCCTGTGTTCCTCCCACAA-3′；

qRT-PCR反应体系(10μL)为：0.4μL Forward primer(10μM/L)、0.4μL Reverseprimer(10μM/L)、1μL Template cDNA、5μL SYBR Green Mix、3.2μL ddH₂O。

qRT-PCR反应程序为：95℃1min；95℃15s，58℃15s，72℃45s，循环 40次。

通过qRT-PCR技术对马尾松不同组织中PmGPPS基因表达量及不同胁迫下叶片中的表达量分析，发现PmGPPS在马尾松的嫩叶中的表达较高且均能响应这些非生物胁迫和激素处理。

实施例3马尾松PmGPPS基因启动子的克隆

取7年生马尾松叶片，利用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取总DNA。设计6条前引物和1条后引物进行PCR。PCR扩增产物经过电泳检测并回收后，连入克隆载体pEASY(TransGen)并转化大肠杆菌T1菌株感受态细胞，经过抗生素筛选和菌落PCR鉴定后将阳性菌进行测序。将测序获得的6条序列进行拼接，获得完整的启动子序列。

具体步骤为：

(1)DNA的提取

使用天根新型植物基因组DNA提取试剂盒提取马尾松总DNA，提取前事先将研钵研棒用锡纸包裹后在烘箱中180℃烘烤4h左右。将样品放在液氮中研磨成粉末后，按照试剂盒说明书提取DNA，-80℃保存。测定总DNA的吸光度， OD₂₆₀/OD₂₈₀值为2.43，OD₂₆₀/OD₂₃₀为2.17，可用作启动子克隆。

(2)PmGPPS基因启动子序列的克隆

将PmGPPS基因放入火炬松基因组中进行比对，选取相似度最高的基因起始密码子上游2800bp左右序列为预测序列，通过Primer 5.0设计6对特异性引物，克隆获得6条PmGPPS启动子片段，然后进行连接载体、转化大肠杆菌(同实例1(4))、目的序列测序和拼接，确定为目的基因。

PmGPPS启动子克隆引物为：

pPmGPPS-F1：5′-ATATGATGGTTATGTCAGGCCCT-3′；

pPmGPPS-F2：5′-GTCAAGTAGAGTAAGGTGAGGGG-3′；

pPmGPPS-F3：5′-GTAGTGGAGCAACACGAGATATGA-3′；

pPmGPPS-F4：5′-CTGGAGTTCTACGAGTGTGTTGCC-3′；

pPmGPPS-F5：5′-CAATTCTGATTGATAGCGAGGGCT-3′；

pPmGPPS-F6：5′-TCATTCCTCACGTTGATATTGGAG-3′；

pPmGPPS-R1：5′-TGCTGGGACTACATAATGCATAGT-3′。

PCR反应体系(50μL)为：2μL Forward primer(10uM/L)、2μL Reverse primer(10uM/L)、2μL Template gDNA(100ng/u1)、25μL 2×Taq PCR MASTER Mix、 19μL ddH₂O。

PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃ 延伸1min，35个循环，72℃再延伸5min。

实施例4启动子在烟草中瞬时表达分析

构建不同长度35S：ProPmGPPS：GUS表达载体，瞬时转入本式烟草叶片中，在不同胁迫处理后进行GUS染色。观察各片段在烟草叶片中的表达情况及不同激素处理下的启动子活性。

具体步骤为：

(1)pBI121-GUS载体的构建

将带有GUS报告基因的pBI121作为瞬时表达的载体，设计包含Xba I和 BamH I两个酶切位点的引物，扩增带有酶切位点的各个片段，三个片段长分别为1690bp、1130bp及570bp，将其插入到pBI121-GUS载体中构建重组质粒。分别命名为pPmGPPS-1690bp-GUS、pPmGPPS-1130bp-GUS及 pPmGPPS-570bp-GUS。所用大肠杆菌菌株为Trans1-T1(TransGen)；表达载体为 pBI121(南京林业大学实验室保存)；限制性内切酶和连接酶购自诺唯赞(Vazyme)。

1)通过PCR向三个片段上下游分别添加XbaI和BamH I酶切位点，1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分离；用

Gel DNA Extraction Mini Kit进行回收并纯化酶切产物，溶于20μL的Elution Buffer中。PCR体系及反应条件同全长扩增，引物分别是：

pPmGPPS-121-F1：5′-GGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAACATCCCCC AGACAAGTCTTATCC-3′；

pPmGPPS-121-F2：5′-GGAGAGAACACGGGGGACTCTAGATCGGCACTA GCTTATAATTAGCCA-3′；

pPmGPPS-121-F3：5′-GGAGAGAACACGGGGGACTCTAGATAAAAAAT ATGTTATTTGATACAG-3′；

pPmGPPS-121-R：5′-AAGGGACTGACCACCCGGGGATCCGTTATATTCC CTATGATTAGTTCC-3′。

2)PCR产物测序正确后，在连接酶的作用下，可进行载体的构建。使用 XbaI和BamHI内切酶进行酶切反应处理pBI121表达载体。

表达载体的双酶切体系(50μ1)为：1μg pBI121-GUS质粒、1μl QuickCut Xba I、1μl QuickCut BamH I、5μl 10×QuickCut Buffer、ddH₂O up to 50μl。

表达载体的双酶切程序为：37℃30min；85℃20s。

3)检测所回收的目的片段长度，按连接体系加入各试剂(最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)；最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol))，37℃30min。

表达载体连接体系(20μl)为：100ng线性化载体、80ng目的片段、2μl Exnase II、4μl 5×CE II Buffer、ddH₂O up to 20μl。

4)连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；使用全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆。同时测序检测载体构建过程中是否发生突变或者缺失现象。

(2)启动子各片段在烟草叶片中的瞬时表达及不同激素处理下的启动子活性分析

1)将重组载体转化农杆菌GV3101感受态，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，28℃震荡培养2d；使用全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆。

2)将pBI121-GUS、pPmGPPS-1690bp-GUS、pPmGPPS-1130bp-GUS及 pPmGPPS-570bp-GUS的农杆菌菌株加入到50ml含100mg/L Rif和100mg/L Kan 的LB液体培养基中28℃，200rpm过夜摇菌，直至菌液OD₆₀₀＝0.8-1.0。

3)取适量菌液5000rpm离心10min，弃上清。

4)配制重悬液：10mM MgCl₂、10mM MES与200μmol/L乙酰丁香酮(AS) 溶于水中。用重悬液将离心的菌体重新悬浮，准备10ml去掉针头的注射器从烟草背面注射烟草，并做好标记。

5)注射后的烟草放入25℃，14h光照和10h黑暗的培养箱中培养2d。

6)取注射不同菌株的烟草各喷施100μM茉莉酸甲酯(MeJA)、100mg/L 赤霉素(GA)、1mM水杨酸(SA)及100mg/L生长素(IAA)四种外源激素，对照组用H₂O处理。

7)培养24h后，用打孔器采取注射部位的叶片用GUS染色液染色，37℃避光染色12-16h。

8)换脱色液(70％乙醇)脱色，每2-3h更换一次脱色液，直至阴性对照的叶片完全透明，用立体荧光显微镜拍照记录染色情况。

通过不同长度的启动子片段在烟草叶片中瞬时表达分析，初步表明各片段均能启动其相应的顺式作用元件。

实施例5马尾松PmGPPS基因原核表达

(1)pEASY-Blunt E2-PmGPPS载体构建

1)目的片段与载体的连接与转化

使用pEASY-Blunt E2载体作为原核表达载体，将4μl PmGPPS质粒与1μl pEASY-Blunt E2轻轻混合，室温反应5分钟，反应结束后置于冰上。转化大肠杆菌Trans1-T1，转化步骤同实例1(4)，涂布Amp抗性的LB固体培养基。阳性检测后进行测序。

其中阳性克隆检测引物为：

T7启动子引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；

T7终止子引物：5′-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。

2)重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)

取50μl冰上融化的BL21(DE3)感受态细胞，加入5μl E2-PmGPPS重组质粒并轻轻混匀，冰上静置25分钟。42℃水浴热激45s，冰浴静置2min。在离心管中加入700μl无抗LB液体培养基，放入摇床37℃，200rpm复苏60min。5000rpm 离心1min收菌，留取200μl上清吹打重悬菌液并涂布到含Amp的LB固体培养基上，37℃倒置过夜培养。阳性检测后进行测序。

(2)原核表达分析及蛋白纯化

1)IPTG诱导蛋白表达

挑取E2-PmGPPS-DE3单克隆菌株至5ml含100mg/LAmp的LB液体培养基中，放入37℃摇床200rpm摇菌12h。将菌液接种到50ml含100mg/LAmp的LB 液体培养基中，37℃，200rpm摇菌3-4h，直至OD₆₀₀＝0.8，取出10ml菌液作为对照，暂时放4℃保存。将剩余菌液分成两部分分别加入0.5mmol/L、1mmol/L IPTG诱导蛋白表达，37℃，200rpm摇菌6-8h。将所有的菌液6000rpm，8min 离心收菌，弃上清。加入10ml 1×PBS震荡重悬菌体，6000rpm，8min离心收菌，弃上清，重复两次后，加入10ml 1×PBS震荡重悬菌体，准备破碎。采用冻融法破碎：先放入液氮中速冻，随后37℃水浴融化，震荡，重复4-6次。破碎结束后， 6000rpm，8min离心收菌，取上清，4℃保存备用。

2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白

配制胶：将玻璃板装至凝胶模具中，按说明书先配10ml 10％的分离胶，立刻打入模具中，注入蒸馏水与玻璃齐平，等待30-40min，待分离胶凝固后，倒掉蒸馏水并用滤纸吸尽残留水分，再配制4ml 5％的浓缩胶，打入模具，插上梳子，静置40min左右后装进电泳槽中等待跑胶。

配制5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：在去离子水中加入0.125mol/L Tris、1.25mol/L甘氨酸、0.5％SDS，室温保存。

点完样后，设置电压为160V，电泳时长50min，随后将胶取出冲洗干净，用考马斯亮蓝超快染色液染色30-40min，再用清水脱色至看清蛋白条带为止，拍照记录。

3)蛋白纯化

准备好蛋白上清液，按照Ni-NTA亲和层析介质说明书进行蛋白纯化。将介质装入柱子中，用四倍柱体积的平衡缓冲液洗涤后，加入蛋白澄清样品，流速控制为0.5-1ml/min，随后以流速为1ml/min的洗涤缓冲液洗涤柱子以去除杂蛋白，直到流出液的A280值达到最低且稳定。最后用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液以 0.5-1ml/min的流速洗脱，分管收集洗脱液，测定A280的数值至最低且稳定时停止收集，取A280数值最高的几管洗脱液进行电泳检测，方法同实例5(2)2)。

缓冲液方法如下(均溶于蒸馏水中)：

Lysis平衡缓冲液(LE Buffer)：50mM Na₂HPO₄+0.3M NaCl；

洗涤缓冲液：50mM Na₂HPO₄+0.3M NaCl+10mM咪唑(imidazole)；

洗脱缓冲液：50mM Na₂HPO₄+0.3M NaCl+250mM咪唑(imidazole)。

实施例6 PmGPPS转基因拟南芥鉴定与筛选

构建35S：PmGPPS表达载体，转入野生型哥伦比亚拟南芥中，比较T3代转基因拟南芥和野生型拟南芥的差异，观察马尾松PmGPPS基因是否能促进萜类化合物的产生，分析马尾松PmGPPS基因的功能。

(1)pCAMBIA-PmGPPS-1302载体构建

本发明所用大肠杆菌菌株为Trans1-T1(TransGen)；表达载体为 pCAMBIA-1302(南京林业大学实验室保存)；限制性内切酶和连接酶购自诺唯赞 (Vazyme)。

具体步骤如下：

通过PCR向三个片段上下游分别添加NcoI和Spe I酶切位点，1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分离；用

Gel DNA Extraction Mini Kit进行回收并纯化酶切产物，溶于20μL的Elution Buffer中。

1302-PmGPPS-F：5′-CACGGGGGACTCTTGACCATGATGACGGTAGGAA CTAATCAT-3′；

1302-PmGPPS-R：5′-GAAAAGTTCTTCTCCTTTACTAGTCAGATCTACCATCTTCTGTCTTGAGGCAATGTA-3′。

2)PCR产物测序正确后，酶切载体、连接、转化、阳检、送测，测序正确的质粒转入农杆菌用于转化拟南芥。使用NcoI和Spe I内切酶进行酶切反应处理pCAMBIA-1302表达载体，酶切载体体系同实例4(1)2)；连接转化体系、程序同实例4(1)3)和实例1(4)。

(2)拟南芥的培养

1)拟南芥种子消毒：取适量野生型拟南芥种子放入灭菌后的EP管中，加入适量75％乙醇，振荡消毒30s后吸出；加入同等量0.1％升汞，消毒2.5min后吸出(弃于专用废液缸)；加入同等量去离子水，振荡洗涤后吸出并将种子放于新EP管中；重复水洗四次。

2)拟南芥的培养：将消毒完毕后的种子置于悬浮液中，利用移液枪均匀播入1/2MS培养基中；密封好培养基，放入4℃冰箱中春化3天；将春化后的培养基置于23℃恒温培养室培养7天；待拟南芥幼苗长出2片真叶时，将拟南芥移栽至事先准备好的基质培养土中，并放入光照培养箱中培养，光照培养箱设置参数为：23℃恒温、光强5LS，湿度75％，光照时间16h/d；待拟南芥进入盛花期前用于转化。

(3)农杆菌的转化

将重组载体转化农杆菌GV3101感受态，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，28℃震荡培养2d；使用全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆，4℃保存阳性克隆备用。待种植的健康状态的拟南芥生长至开花。将PCR检测的阳性克隆，摇菌至OD₆₀₀为0.8时，进行拟南芥花器官浸泡转化。

具体步骤如下：

将菌液5000rpm，5min离心，收集菌体，用5％蔗糖溶液悬浮；

1)在浸泡前，加入SilwetL-77，浓度为0.05％(500μL/L)，晃出泡沫；

2)将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡30sec，期间轻轻晃动；

3)将浸过的拟南芥平躺在托盘里，用保鲜膜覆盖保湿，锡箔纸密封避光24h；

4)揭开锡箔纸，正常条件下培养，当种子成熟时停止浇水；

5)收集拟南芥的种子为T1代种子，并于37℃烘干一周后保存。

(4)转PmGPPS基因的拟南芥T1代阳性植株的筛选及T3代转基因苗的获取

1)T1代转基因拟南芥PCR检测

农杆菌侵染转化过的拟南芥的种子经消毒后播入含卡那霉素(50mg/L)的 1/2MS培养基中，春化3d开始发芽后，转入光照培养室，观察植株生长变化。由于卡那霉素的影响，非转基因植株与对照组植株幼苗逐渐黄化枯萎，转基因幼苗正常生长。10d左右转基因植株与对照组植株全部黄化死亡。经卡那霉素筛选后获得15株植株，分别命名为T1-1至T1-15。试剂盒提取这15个转基因拟南芥株系的DNA后(方法同实施例3(1))，进行PCR检测，T1-1至T1-15分别获得了相应条带(目的片段长485bp)，即成功转入基因PmGPPS。

T1代转基因拟南芥PCR检测上游引物：

5′-ATGGGTTACAGTGGCATGGT-3′；

T1代转基因拟南芥PCR检测下游引物：

5′-GCACAAGCAGTTGGCATCGC-3′。

PCR体系(50μL)为：19μL ddH₂O，25μL 2×Taq PCR MASTER Mix，2μL Primer-F(10μM)，2μL Primer-R(10μM)，2μL DNA。

PCR程序为：95℃5min；95℃15s，58℃15s，72℃1min，35cycles；72 ℃5min；4℃保存。

2)T3代转基因拟南芥的获取

将上述T1代种子进行消毒处理后(方法同实例6(4)1))，播入含卡那霉素(50mg/L)的1/2MS培养基中，春化3d后，放入适宜环境中培养(培养条件同上)。然后移入基质土中，收取种子为T2代转基因拟南芥种子。将所得T2 代转基因拟南芥种子进行如上述步骤的培养，筛选T3代纯合转基因拟南芥种子及植株，移入基质土后，放于光照培养箱中培养(设置参数为：23℃恒温光照、光强5LS，湿度75％，光照时间16h/d)培养。

(5)叶绿素含量分析

随机选取1株野生型(WT)和8株T3代转基因拟南芥植株，每个株系三个重复，剪取拟南芥叶片60mg，根据植物叶绿素(Chlorophyll)酶联免疫分析试剂盒使用说明书测定GPPS叶绿素的含量。

具体步骤如下：

1)称取约新鲜植物叶片或其它绿色组织，去掉中脉，称取约0.1g，剪碎，用蒸馏水洗干净。

2)提取液的准备：取400mL无水乙醇和800mL丙酮，充分混匀待用。

3)加入1mL蒸馏水，少量试剂一(约50mg)，在黑暗或弱光条件下充分研磨，转入10mL玻璃试管。

4)用提取液冲洗研钵，将所有冲洗液转入玻璃试管，用提取液补充至10mL，玻璃试管置于黑暗条件下或者包上锡箔纸浸提3h，观察试管底部组织残渣完全变白则提取完全，若组织残渣未完全变白，继续浸提至其完全变白。

5)取浸提液200μL于微量石英比色皿/96孔板，提取液调零，测定663nm 和645nm处吸光值，分别记为A663和A645。

计算公式如下所示：

叶绿素a含量(mg/g鲜重)＝(12.7×A663-2.69×A645)×V提×D÷m ÷1000＝0.01×(12.7×A663-2.69×A645)×D÷m；

叶绿素b含量(mg/g鲜重)＝(22.9×A645-4.68×A663)×V提×D÷m ÷1000＝0.01×(22.9×A645-4.68×A663)×D÷m；

叶绿素总含量(mg/g鲜重)＝(20.21×A645+8.02×A663)×V提×D÷ m÷1000＝0.01×(20.21×A645+8.02×A663×D÷m；

V：提取液体积，10mL；D：稀释倍数；m：样本质量，g。

(6)GPPS酶活性分析

随机选取1株野生型(WT)和8株T3代转基因拟南芥植株，每个株系三个重复，剪取拟南芥叶片60mg。GPPS酶活性由上海沪鼎生物科技有限公司根据植物牻牛儿基焦磷酸合酶(GPPS)酶联免疫分析试剂盒使用说明书测定。

(7)转基因拟南芥种萜类物质合成相关基因的表达分析

PmGPPS在拟南芥中过表达后，进行qPCR分析萜类物质合成途径中其他一些基因的表达情况，如的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原酶(DXR)、4-羟基-3-甲基-2-苯基二磷酸还原酶(HDR)、八氢番茄红素合成酶(PSY)及萜类合成酶(TPS)、3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMGR)、甲戊酸激酶(MK)。将拟南芥 Actin2作为内参基因(安航，2020)，通过Primer5.0设计各基因的特异性引物，各目的片段扩增长度为150-200bp。方法、程序同实施例2(2)。

引物序列如下：

AtActin2-F：5′-GCTCTCCTTTGTTGCTGTT-3′；

AtActin2-R：5′-GAATCTCTCAGCACCAATCG-3′。

qAtDXR-F：5′-TAAAGGAAGTTAAAGTAGCGG-3′；

qAtDXR-R：5′-CTGTGTTTCAATCATGGAATG-3′。

qAtHDR-F：5′-CGTTTGTGATTACATTCTCGG-3′；

qAtHDR-R：5′-ATCTCCTCTGTTTCTCCCTTT-3′。

qAtHMGR-F：5′-ACTCAGCACGAACCCTCTCC-3′；

qAtHMGR-R：5′-AATCAAAACGAATCCACCCA-3′。

qAtMK-F：5′-CTCCTTGCTTCTTCTATTTC-3′；

qAtMK-R：5′-CACTGACGGTGTTGTCTATC-3′。

qAtPSY-F：5′-GGGTTGCTACTTCTTCTCTA-3′；

qAtPSY-R：5′-TCTTCTACTTCGGTTCCTTA-3′。

qAtTPS-F：5′-GACGAAGACGGTGAAGAGGAC-3′；

qAtTPS-R：5′-AACGAACCAACGAGGATAAGA-3′。

本申请以模式植物拟南芥为研究对象，将克隆得到的马尾松异戊烯基转移酶基因PmGPPS利用农杆菌介导转化至拟南芥中，通过筛选与培育，最终获得 T3代纯合转基因植株。通过检测野生型拟南芥与8个转基因拟南芥株系的生理指标，发现转基因拟南芥中GPPS酶活性和叶绿素含量均高于野生型拟南芥，同时，萜类物质合成相关基因的表达量较野生型均有不同程度的上调。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS及其启动子和应用

<130> 1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1164

<212> DNA

<213> 马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS(Artificial)

<400> 1

atgggttaca gtggcatggt agttagcttc agccatggcc tgtattgtac gagcatttct 60

tctccagaat atagtctgaa aggaatgtcg ttcccattaa aaaaaattca aggcgtatca 120

acttcattga gcacatcttc tggtgaacat ctgcatctcc atgggcattt gaagaaaggg 180

ttgctgtcac aaagatgtct aatatcgtca attaggtcat caaaaacaat tgcacagttg 240

gctaatcttc ctgaacaggt gaagaatgtc gttgaatttg atttcgacaa gtacctgcat 300

tccaaggcaa tggaggtgaa tgaagcattg gataaggcag tcccacaacg ttatacctca 360

aaattatatg aagccatgag gtattctctt ctagcaggag gcaaacgagt tcgtcctgtt 420

ctgtgcattg cagcatgcga gcttgtggga ggaacacagg agcttgcgat gccaactgct 480

tgtgcaattg aaatgatcca cacaatgtct ttgattcatg atgacttgcc ttgcatagac 540

aacgatgacc tacgccgagg taagcctaca agtcataagg tctttgggga agatactgct 600

attcttgcag gagatgcact tctctcactg gcctttgagc acattgcagt ctccacaagc 660

agaactgttg ggagtgatag aattttgagg ctgctatctg aattgggtag agcaacaggc 720

tctgaagggg ttatgggtgg ccaggttgtc gatattgaga gcgaaggaga tccttctatt 780

gaccttgaga ctctcgagtg gattcatatt cacaagactg cagtgctctt ggagtgctcg 840

gttgtgtgtg gggccatcat cggtggtgct tcggactatg agatcgagag agctcgaaag 900

tattcccgtt gcgtggggct tctgtttcag gttgtggatg acattctgga tgtcacaaga 960

tcatcagaag aattgggcaa gactgcagga aaggatttga ctagcgataa ggtcacttat 1020

cccaagctgc tgggtttgga gaaagcaaag gaatttgctg atgaattgtt gaacagaggt 1080

aagcaggagt tatcctgctt caacccaact aaggctgcac ctttgttggg tcttgcagat 1140

tacattgcct caagacagaa gtga 1164

<210> 2

<211> 387

<212> PRT

<213> 马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的表达蛋白(Artificial)

<400> 2

Met Gly Tyr Ser Gly Met Val Val Ser Phe Ser His Gly Leu Tyr Cys

1 5 10 15

Thr Ser Ile Ser Ser Pro Glu Tyr Ser Leu Lys Gly Met Ser Phe Pro

20 25 30

Leu Lys Lys Ile Gln Gly Val Ser Thr Ser Leu Ser Thr Ser Ser Gly

35 40 45

Glu His Leu His Leu His Gly His Leu Lys Lys Gly Leu Leu Ser Gln

50 55 60

Arg Cys Leu Ile Ser Ser Ile Arg Ser Ser Lys Thr Ile Ala Gln Leu

65 70 75 80

Ala Asn Leu Pro Glu Gln Val Lys Asn Val Val Glu Phe Asp Phe Asp

85 90 95

Lys Tyr Leu His Ser Lys Ala Met Glu Val Asn Glu Ala Leu Asp Lys

100 105 110

Ala Val Pro Gln Arg Tyr Thr Ser Lys Leu Tyr Glu Ala Met Arg Tyr

115 120 125

Ser Leu Leu Ala Gly Gly Lys Arg Val Arg Pro Val Leu Cys Ile Ala

130 135 140

Ala Cys Glu Leu Val Gly Gly Thr Gln Glu Leu Ala Met Pro Thr Ala

145 150 155 160

Cys Ala Ile Glu Met Ile His Thr Met Ser Leu Ile His Asp Asp Leu

165 170 175

Pro Cys Ile Asp Asn Asp Asp Leu Arg Arg Gly Lys Pro Thr Ser His

180 185 190

Lys Val Phe Gly Glu Asp Thr Ala Ile Leu Ala Gly Asp Ala Leu Leu

195 200 205

Ser Leu Ala Phe Glu His Ile Ala Val Ser Thr Ser Arg Thr Val Gly

210 215 220

Ser Asp Arg Ile Leu Arg Leu Leu Ser Glu Leu Gly Arg Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ser Glu Gly Val Met Gly Gly Gln Val Val Asp Ile Glu Ser Glu Gly

245 250 255

Asp Pro Ser Ile Asp Leu Glu Thr Leu Glu Trp Ile His Ile His Lys

260 265 270

Thr Ala Val Leu Leu Glu Cys Ser Val Val Cys Gly Ala Ile Ile Gly

275 280 285

Gly Ala Ser Asp Tyr Glu Ile Glu Arg Ala Arg Lys Tyr Ser Arg Cys

290 295 300

Val Gly Leu Leu Phe Gln Val Val Asp Asp Ile Leu Asp Val Thr Arg

305 310 315 320

Ser Ser Glu Glu Leu Gly Lys Thr Ala Gly Lys Asp Leu Thr Ser Asp

325 330 335

Lys Val Thr Tyr Pro Lys Leu Leu Gly Leu Glu Lys Ala Lys Glu Phe

340 345 350

Ala Asp Glu Leu Leu Asn Arg Gly Lys Gln Glu Leu Ser Cys Phe Asn

355 360 365

Pro Thr Lys Ala Ala Pro Leu Leu Gly Leu Ala Asp Tyr Ile Ala Ser

370 375 380

Arg Gln Lys

385

<210> 3

<211> 1690

<212> DNA

<213> 马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的启动子(Artificial)

<400> 3

acatccccca gacaagtctt atcccttaaa acctactaac cggtagttca agagataaaa 60

tctcctcatt tctaatatta ttttttatta atcatcgtca gcacatccct aataatttct 120

ccaatactat aacgattcca aataaatggt atctccgacg tttgtcgttt ccgacaaaca 180

ttctatcctc aacgccttta aattcatatt ccatgtaccc aagagaaact gcctcccaat 240

ttctccattt ctgagaatca tcagaggtat ggtgagattt attgtactct cccgcgatca 300

tttagttaat gtttctgtaa gcaattagtt gaagtttttt ttcaatacaa atttatttaa 360

actagtatgc atctttattg tccctactta tacaaacgac aagtcttact gcaaagagtc 420

atttgaagtt taattgtcag tagtttagtg caccttccct caattatttg ttagtagctt 480

atcgcaattt tgagaataga acagccgcta tttagattag cacagcaaca taatttgcca 540

ccgttgagcg tccatgtgta tcggcactag cttataatta gccatggaga aagatttgat 600

caatttttta ggaacatgta acaattttat ctgttatttg attattttta tgtgcttaac 660

acagattgta agatgtcaaa cccgatgtca aaggggtttt gggtagatag ggattgtttg 720

ttttgttaag ttattttttg atataaagta gtttgttcaa tttctttgga tgtaaagtca 780

tcagttccca acctctatca aaatgatggg atatcatgaa aatgtatccc acccaactga 840

aaactcaagc agattataaa ataaaaattt agagtataaa gaaattttca gtacattttt 900

attatatcct taatatagtt tatttgtcat tagtttagtg cactttcctg ccatcatttc 960

ctagcaattt attgcacctt ctctacccgt aatttattgt agcttctcac aattattttg 1020

attagcacag tagttattta cactagcaca gcagcataat ttgcctctgg tgaaaattgg 1080

tatagaataa agctatttta aaattttcgt gaaccatgtt taaaaaatat gttatttgat 1140

acaggtttaa aatttgtttc aatatattta aaaatatgtt cattttatgg atttatagaa 1200

aagattaatc taaccatatt taaagaaatt tagatatatt ctttctgcca tgtagatgta 1260

ttctttctct ctttgcttta caaactgcac tttcttctaa acaataatca accatggttt 1320

tgttttttct aatcagatgt tttgttactc gattttctct ttatattaat tttaagagca 1380

aacagttttt tcatgggttt ctttttttta aacaacatgt tttgttactc gattttttct 1440

ttgtaggaat tttaacagca aacagttttt gttttgtaac tcgtatgcat aacctttggc 1500

tccgtgctat atgttgttgg aaaaagttag ttgaggttta cttttttagc acaaacgttt 1560

ttaactcgta tgcatgtgaa agcagcattt actcttctat ggcattcaaa gttctatata 1620

tttccctgtt ctgaattttt ggtttttttg gttgcagtag acggtaggaa ctaatcatag 1680

ggaatataac 1690

Claims

1.马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示。

2.含有权利要求1所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的启动子的重组表达载体、重组菌。

3.权利要求1所述的马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的启动子在启动目的基因表达中的应用，所述目的基因位于所述启动子的下游。

4.马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS在响应植物非生物胁迫或激素胁迫中的应用，所述马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示；所述的非生物胁迫或激素胁迫为15% PEG6000渗透胁迫、机械损伤、10mMH₂O₂、100μM茉莉酸甲酯(MeJA)、500μM乙烯利(ETH)和1mM水杨酸(SA)处理。

5.马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS在提高转基因拟南芥叶绿素含量中的应用，所述马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

6.马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS在提高转基因拟南芥的萜类化合物产量相关基因表达中的应用，所述马尾松香叶基焦磷酸合成酶基因PmGPPS的核苷酸序列如SEQ IDNO .1所示；所述的萜类化合物产量相关基因为DXR、HDR、HMGR、MK、PSY、TPS。