JP3410055B2 - ヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子を有する植物ベクターとその製造方法 - Google Patents
ヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子を有する植物ベクターとその製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒマワリの苗（se
edlings of Helianthus annus）から得るヒマワリファ
ルネシルピロリン酸シンターゼ(sunflower farnesyl py
rophosphate synthase、ＳＦＰＳ)をコード化するよう
に分離された、ｃＤＮＡヌクレオチド配列を含む組換え
植物発現ベクターと、老化が遅延(delay)されて種子生
産が増加された遺伝子導入タバコ植物(transgenic toba
cco plants)の製造に関する。 【０００２】 【従来の技術】ファルネシルピロリン酸シンターゼ（Ｆ
ＰＳ）は、イソペンテニルピロリン酸とジメチルアリル
ピロリン酸からファルネシルピロリン酸が合成される反
応を触媒する酵素である。ファルネシルピロリン酸（Ｆ
ＰＰ）シンターゼは、特にステロイド合成とカロチン合
成において、ステロール、カロチノイド及びプレニルキ
ノンのような構造上に多様な重要代謝産物等に対するＣ
１５前駆体を提供するイソプレノイド生合成で重要な酵
素である。イソプレノイド生合成の経路は、一連のイソ
プレン単位を含む１次アルコールピロリン酸エステル類
を中心としてなる。 【０００３】Ｃ５分子（ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰ）から始
まって、一連のＣ１０（ＧＰＰ）、Ｃ１５（ファルネシ
ルピロリン酸）、Ｃ２０（ＧＧＰＰ）及び更に高い分子
量のイソプレノイドピロリン酸は、伸長鎖の１′−４′
にイソペンテニルピロリン酸が添加されて合成される。
１′−４′縮合反応は、基質と生成物の二重結合立体化
学と鎖の長さに対して高度に選択的なプレニル転移酵素
族により触媒される。ＦＰＰは特にステロイド合成とカ
ロチン合成において、イソプレノイド経路の一過程から
発生されるし、ファイトアレキシンのような構造上に多
様なセスキテルペノイド類の前駆体である。クロロフィ
ル、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ジベレリン
及びアブシシン酸(abscisic acid)を含む数千個の天然
植物生産物がイソプレノイド経路から始まったと知られ
ている。 【０００４】また、イソペンテニルピロリン酸のゴムへ
の重合を含む天然ゴム生合成の最後の段階でＦＰＳが関
連されていると明らかになった。人間{Wilkin et al.，
J.Biol,Chem,1990 265(8):4607-4614}、酵母{Chambon e
t al.,Curr.Genet.1990 18(1):41-46}、アラビドプシス
タリアナ(Arabidopsis thaliana)(Cunillera et al.,19
96 J.Biol,Chem,271,7774-7780)ゴムの木{Light et a
l.,J.Biol,Chem.1989 264(31):18598-607}及び大腸菌(F
ujisaki et al.,J.Bacteriol 1989 171(10):5654-565
8)を含む異なる生体に存在するＦＰＳ遺伝子が既に報告
された。イソプレニル化反応は、多数の真核細胞タンパ
ク質を膜に効果的に結合させるために必要であるが、十
分でない遺伝翻訳後の修飾である。 【０００５】哺乳動物と酵母細胞で、イソプレニル化さ
れたタンパク質の機能と適切な細胞内のターゲッティン
グのために付加的な修飾が必要であると知られている。
タンパク質プレニル転移酵素による特定真核細胞タンパ
ク質にプレニルグループファルネシル及びゼラニルの結
合は、シグナル伝達を含む多くの細胞内の作用等を可能
にするために必要である。 【０００６】タンパク質ファルネシル転移酵素（Ｆター
ゼ）は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）からラス
（Ｒａｓ）のような細胞内のタンパク質であり、それら
のカルボキシ末端の周りのシステイン残基で疎水性ファ
ネシルグループが移動することを触媒する。この過程
は、原形質膜でこのようなタンパク質の副細胞内の位置
化(subcellular localization)のために必要であり、抗
ガン治療のために重要なターゲットであるＦターゼを作
るラスの腫瘍性変異体等の形質転換活性化のために必要
である。 【０００７】ファルネシル化反応は、膜部分とＲａｓ部
分とを含むいくつかのタンパク質の作用のために必要で
ある。ファルネシル−タンパク質転移酵素の阻害剤等
（ＦＴＩｓ）は、変異したＲａｓを提供してガンを治療
するために、Ｒａｓ経路を遮断するように開発された。
従って、タンパク質プレニル化反応の阻害剤等は腫瘍の
化学療法のための提案がされた{Vitale et al.,Endocri
nology 1999 140(2):698-704;Kohl et al.,science 199
3 260(5116):1934-1937}。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】ヒマワリ（Helianthus
annus）のファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰ
Ｓ）に関連した本発明の目的は；（ａ）一対のＦＰＳオ
リゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒマワリＦＰＳｃ
ＤＮＡｓの配列を決定、増幅し、（ｂ）細菌性細胞から
ＦＰＳ ｃＤＮＡｓを発現させ、その機能を確認するた
めに酵母変異種で機能相補分析を行い、（ｃ）生体内の
ヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＳＦＰ
Ｓ）の過発現(overexpression)の影響を調査するため
に、遺伝子導入タバコ植物種を製造し、（ｄ）遺伝子導
入植物で植物成長時間に更に多くの花を生産し、２倍以
上の種子を生産する。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明は、構造上に多様
なイソプレノイド生合成代謝産物に対して重要な酵素で
あるヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼをコー
ド化する、分離されたｃＤＮＡのヌクレオチドとペプチ
ド配列を提供する。また本発明は、前記のヌクレオチド
配列を含む組換え植物発現ベクターと遺伝子導入タバコ
植物を生産するために、前記組換え植物発現ベクター内
のＤＮＡ配列を導入する宿主細胞を提供する。 【００１０】 【発明の実施の形態】非遺伝子導入または対照群ベクタ
ーに形質転換されたタバコ植物と比較する時、ファルネ
シルピロリン酸シンターゼを発現する遺伝子導入植物
は、乾燥環境に対する強い耐性と葉っぱのクロロフィル
高含量、種子生産において２倍に増加されることを示
す。植物と人間に存在するＦＰＳのアミノ酸配列を比較
した結果、それらは高い相同性を有し、５個の異なる領
域が存在することが示された。ＦＰＳの機能を特徴化す
る第１番目の段階で、ＦＰＳ ｃＤＮＡをクローニング
し、それが機能的なＦＰＳをコード化するということを
明らかにした。 【００１１】ファルネシルピロリン酸シンターゼをコー
ド化するヒマワリＳＦＰＳ（ＫＣＴＣ０５２０ＢＰ）に
融合させた３５Ｓプロモーターを遺伝子導入タバコ植物
(Nicotiana tabacum L.)に挿入し形態学的変化を調査し
た。かかる構成物はタバコでファルネシルピロリン酸を
過剰生産した。ＦＰＰの過剰生産はＴ0植物において、
葉っぱにおける更に多くの色素形成、側枝発芽、継続す
る成長及び葉っぱの老化遅延現象と、それによる花の２
倍以上の増加、種子生産の最小２倍の増加を含む等、形
態的及び生理的に顕著な変化をもたらした。 【００１２】ある機関で、ＦＰＰの増加された生産が、
植物で葉液の若芽分裂組織、開花及び種子セッティング
または葉っぱの老化のような発育結果に影響を与えたか
否かを調査した。増進された植物成長と収穫は、農作物
科学分野の最も重大な目標として見なされてきた。成長
と発達が異なる遺伝子とその生産物の複雑な相互作用に
より支配されるので、該目標を達成することは容易なこ
とではなかった。生合成の生産能力を増加させる１つの
方法は、組換えＤＮＡ技術を応用することである。 【００１３】本発明で説明した技術は、遺伝子導入植物
で農業的な利点を発生させると思っている。本発明はｐ
ＦＰＳの構成物を導入し、ヌクレオチド配列を転写する
植物を再産出し、植物の成長長さ、総合的な種子産出、
花の数とクロロフィル含量において顕著な変化を示す植
物を選択する方法等を含む。組換え発現カセットは、ア
グロバクテリウムを用いるかまたは有性交配により植物
組織に注入され得る。更に本発明は、増進された成長と
発達を促進する方法を提供する。本発明はタバコ植物に
関連して説明したが、該技術はまたタバコ植物以外の他
の植物における成長と発達にも使用することができる。 【００１４】［実施例］下記の実施例は、本発明の特徴
をより詳しく例示するためのもので、本発明の範囲を限
定するものではない。 （実施例１） ｃＤＮＡのクローニング ファルネシルピロリン酸シンターゼに対する遺伝子を下
記のとおり分離した。この研究で用いた全ての化学製品
は特別に言及されない限りシグマ(Sigma)社から購入し
たものである。ストラタジン(Stratagene)社のｃＤＮＡ
合成キットを用いてヒマワリλｇｔ１０ ｃＤＮＡライ
ブラリーを作るために、播種してから１０日目の葉っぱ
を用いた。 【００１５】該ライブラリーを培養してから大腸菌ＸＬ
１−ブルーＭＲＦ′変種に増幅した。３０％のグリセロ
ールで−９０℃に保管されたストラタジン社のＳＯＬ−
Ｒcompetent細胞を選択するために、ＬＢ／テトラサイ
クリン平盤培地に培養し、３７℃の培養器で一晩中培養
した。０．２％のマルトースと２ｍＭ硫酸マグネシウム
を添加した５０ｍｌの殺菌したＬＢ培地で、よく分離さ
れた単独コロニーを接種した。それから３７℃で攪拌し
ながら一晩中培養した（回転攪拌器で２５０ｒｐｍ）。 【００１６】マルトーズで育った細菌が更に能率的にλ
ファージを吸着する；マルトーズは、バクテリオファー
ジλ受容体をコード化する遺伝子(1amB)を含むマルトー
ズオペロンを誘導する。ＳＯＬ−Ｒ細胞が不安定のた
め、必要になる時まで４℃でＬＢ培地で保管した。５ｍ
ｌのＳＯＬ−Ｒ細胞をエペンドルフ(Eppendorf)チュー
ブに移し、超遠心分離器で最高の速度で８秒間回転し
た。２．５ｍｌの細胞に１０ｍＭ硫酸マグネシウムに更
に懸濁しその密度をＯＤ600で測定した。１０5ｐｆｕの
バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーを０．１ｍｌ
の希釈された細菌細胞（１０8細胞／ｍｌ）が入れてあ
るファルコン(Falcon)社のチューブに添加ししばらくの
間攪拌した。 【００１７】ファージ粒子が細菌に吸着するように、そ
のチューブを３７℃で２０分間培養した。ファージと細
菌性宿主細胞を培養する間、０．７％のアガロースをＬ
Ｂに溶かし、液体培養器の温度を４７℃に合わせた。培
養後に溶解されたアガロース８ｍｌをそれぞれのチュー
ブに添加し軽く攪拌し、ＮＺＹ下端のアガール(agar)平
板上に敷いた。細菌が均一に分布されるようにプレート
を慎ましく振とうして、最上部のアガロースが固くなる
ように１０分間放置した。それから、プレートを３７℃
の培養器にひっくり返して入れた後、７〜８時間の間培
養した。 【００１８】７時間後にプラーク（plaque）を確認し、
プレートの底全体が細菌に覆われるように更に幾時間培
養した。その底全体が細胞に覆われたプレートに８ｍｌ
のＡＭ（１０ｍＭ塩化ナトリウム／１０ｍＭ硫酸マグネ
シウム水化物／５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５／０．０１
％ゼラチン）を添加し、４℃で１時間の間振とうした。
その液体をチューブに入れて、４℃で３分間２，０００
ｒｐｍで遠心分離して沈殿物が生じた。その上澄を新し
いチューブに入れ、５０μｌのＤＮａｓｅとＲＮａｓｅ
（それぞれ１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。該試料を一晩
中４℃で放置した。同一嵩のＳＭに溶解された２Ｍ塩化
ナトリウムと２０％ＰＥＧ（分子量８，０００）を添加
して攪拌し、３時間の間氷で培養した。 【００１９】それからチューブを４℃で２０分間１２，
０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄を除去してから、沈
殿物を塩化ナトリウムとゼラチンのない５００μｌのＳ
Ｍに更に懸濁させて、ｐＨ７．５、４０μｌの０．５Ｍ
ＥＤＴＡと２５μｌの２０％ＳＤＳを添加した。該懸
濁液を軽く振とうして、ウィルスが分解されるように６
５℃で１０分間培養した。それから分解物を室温までに
冷却させて、それぞれのチューブに５００μｌのＰＣＩ
（トリス−飽和されたフェノール：クロロフォルム：イ
ソアミルアルコール＝２５：２４：１）を添加し、５分
間５，０００ｒｐｍで遠心分離した。その上澄を慎まし
く新しいチューブに移した後、同一嵩のクロロフォルム
を添加した。 【００２０】５分間５，０００ｒｐｍで遠心分離してか
らその上澄を取って、２Ｍアンモニウムアセテートと３
倍のエタノールと混合した。−２０℃で一晩中培養した
ら、それぞれのチューブからＤＮＡを分解できる制限酵
素が大略１ｍｇ程度生成された。その大きさに基づいて
核酸を分離、確認して精製するために、多様な濃度のア
ガロースゲル（０．７〜１．５％）を用いて電気泳動を
実行した。水平のミニゲール装置（ＢＲＬ）を主に使用
した。 【００２１】ゲル箱でプラスチックお盆の開放された両
端を２個のテープにより封じて作業台に設けた。エルレ
ンメイヤ(Erlenmeyer)フラスコに正確な量のアガロース
と、１ｘＴＡＥ（４０ｍＭトリス−アセテート／１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加して、メツラー秤(Met
tler scale)上に載せて重さを測定した。それからその
スラリーをアガロースの粒子が完全に溶ける時までたま
に振りあげながら、電子レンジで加熱した。 【００２２】メツラー秤(Mettler scale)でアガロース
ゲル溶液の重さを更に測って、水を添加し元の嵩に合わ
せた。適当量のＥｔＢｒ（０．５ｇ／ｍｌ）を添加し、
ゲル溶液を泳動槽に流し注ぎ、その上にくし（comb）を
差し込んだ。ゲルが固まった後、くしとテープとを除去
した。それから泳動槽に約１ｍｍのゲルになるよう、泳
動槽を覆うのに十分な量の１ｘＴＡＥで泳動槽に満たし
た。ＤＮＡ試料を６５℃で５分間加熱したゲルローディ
ング(loading)緩衝溶液（０．２５％ブルモフェノール
ブルー／０．２５キシレンシアノールＦＦ／１５％ピコ
ル）と混合し、氷で冷却してから自動ピフェットでコー
ディングした。ブロモフェノールブルーがゲルの陰極の
先端から１ｃｍ程度離れた所に到着する時まで、ゲルに
５Ｖ／ｃｍの電圧をかけあげた。それからゲルをフォト
ダイン(Fotodyne)社の紫外線照明器で照射し、ポラロイ
ド（ＡＳＡ３，０００）高感度フィルムを用いて写真を
取った。 【００２３】（実施例２） 退化した(degenerate)プライマーを用いたポリメラーゼ
鎖反応(Polymerase Chain Reaction) ＰＣＲ増幅に用いられたと報告されたＦＰＳ配列に基づ
いた正(universal)オリゴヌクレオチドプローブ(Probe)
を、成熟葉っぱのｍＲＮＡで作ったλＺＡＰｃＤＮＡラ
イブラリーを用いて開発した。ファルネシルピロリン酸
シンターゼの酵素の増幅に用いた退化したプライマーの
配列は下記のとおりである： プライマ１：5′- CAR GCH TWY TTY CTT GTD CTT GAT G
AY ATH ATG-3′ プライマ２：5′- TKM ACS ACY AWC CAA GAR CAT YTR A
AA TC-3′ 【００２４】５μＭのプライマ１と２、０．２ｍＭ ｄ
ＮＴＰｓ、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭトリ
ス、ｐＨ８．３、５０ｍＭ塩化カリウム及び２．５uタ
クポリメラーゼ(Taq polymerase)を含む５０μｌの反応
混合物に、ｃＤＮＡの集合所であるライブラリーから抽
出した全体プラスミドＤＮＡ１ｇを添加した。その試料
の蒸発を最小にするために、少量の殺菌された鉱物性油
で覆った。 【００２５】第１番目は９４℃で２分、５０℃で１．５
分、７２℃まで３分、７２℃で１．５分の条件で実行し
た。次の２番目は９４℃で１分、５０℃で１．５分、７
２℃まで３分、７２℃で１．５分に実行した。かかる前
処理後に、増幅を９４℃で１分、５５℃で１．５分、７
２℃まで１．５分、７２℃で１．５分に３２回実行し
た。ＰＣＲ生成物の中１０μｌを同量のローディング緩
衝溶液と混合し、１％アガロースゲルから分離した。 【００２６】（実施例３） 増幅された核酸断片のヌクレオチドのシークエンシング ＰＣＲ生成物のサブクローニング ブラント末端を有する断片でＰＣＲ生成物をクローニン
グすることは、その鋳型がタクポリメラーゼの末端転移
酵素活性に独立的であるので、断片の３′末端にヌクレ
オチドを付加させることにあまり効果的でなかった。ｄ
ＡＴＰに対するポリメラーゼの強い親和性のために、ほ
とんどの場合にそれはアデノシンである。 【００２７】ｐＧＥＭプラスミドＤＮＡは、一晩中エコ
(Eco)ＲＶ(ＮＥＢ)（１０μｇｐＧＥＭ ＤＮＡ/６μlエ
コＲＶ緩衝溶液／10μgＢＳＡ／２０ユニットエコＲＶ
／８１μl水）で分解した。分解されたＤＮＡを−２０
℃で３時間の間０．５Ｍの塩化ナトリウムと３倍嵩のエ
タノール（−２０℃）で遠心分離して沈殿させた。沈殿
物を１００μｌの水に更に懸濁し、ゲル状で完全な分解
物を確認した。 【００２８】それから分解されたベクターをプロメガ(P
romega)社のタクポリメラーゼ（８５μｌ分解されたベ
クター／１０μlタクポリメラーゼ緩衝溶液／２μｌ
ｄＴＴＰ(１００ｍＭ)／３μｌタクポリメラーゼ）と培
養し、そのエキソヌクレアーゼ活性により３′末端の突
出部分を除去した。少量の鉱物性の油をその上に覆っ
て、その混合物を熱循環器(thermal cycler)で７０℃で
２時間の間培養した。それから試料を２倍嵩のフェノー
ル／クロロフォルム／イソアミルアルコールと混合し、
５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後クロロフォ
ルムを抽出した。 【００２９】その上澄を慎ましく２倍嵩のエタノールと
混合し、−８０℃で２０分間培養した。５分間最高速度
で遠心分離し、その結果生成された沈殿物を１００μｌ
の０．１ｘＴＥに更に懸濁した。それからＰＣＲ生成物
をＴ−ベクター（２．５μｌの４ｘリゲーション(Ligat
ion)）緩衝溶液／２μｌのｐＧＥＭ Ｔ−ベクター／１
μｌのＰＣＲ生成物／１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ／
４．５μｌの水）と１２℃で一晩中培養した。４ｘリゲ
ーション緩衝溶液は、４００ｍＭトリス、ｐＨ７．５、
８０ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭ ＡＴＰ、４０ｍＭ塩化マ
グネシウム、４００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含んで−２０
℃で保管した。 【００３０】冷凍したＤＨ５−α適合細胞を氷の上で溶
かした。２μｌのβ−Ｍｅ、３μｌのリガーゼ及び５０
μｌのＤＨ５α細胞を含むリゲーション混合物を備え
て、３０分間氷で培養してから、４２℃で正確に６０秒
間加熱した。その試験管をすぐ氷で２分間冷却した。４
５０μｌのＬＢを添加し、攪拌器で２５０ｒｐｍで１時
間の間３７℃で培養した。混合物の１／４をＸ−ｇａｌ
／ＩＰＴＧ／Ａｍｐプレートに注いで３７℃で一晩中培
養した。最初に、５０個以上のクローンを制限エンドヌ
クレアゼ地図制作(mapping)により分析し、プライマ部
位にベクター塩基配列を用いてｃＤＮＡ両末端から塩基
配列データを分析した。 【００３１】ＤＮＡのシークエンシング 超巻き取り鋳型ＤＮＡ（３μｇ）をｐＨ８．０の１８μ
ｌのＴＥに再懸濁した。該試料に２μｌの２Ｍ水酸化ナ
トリウムを添加した後、室温で５分間培養して鋳型ＤＮ
Ａを変性させた(denature)。それからｐＨ７．５の８μ
ｌの５Ｍ ＮＨ 4ＯＡｃと１００μｌのエタノールを添
加して、氷で１５分間培養した。変性されたＤＮＡを集
めて真空下で乾燥した。乾燥されたＤＮＡを７μｌの水
に再懸濁し、１μｌのプライマ（０．５ｐモル／μｌ）
と２μｌの５ｘシクァナーゼ(Sequenase)緩衝溶液と混
合した。該混合物を６５℃で２分間培養し室温に冷却し
た。 【００３２】希釈したラベリング混合物、ＤＴＴ、α−
［32Ｐ］ｄＡＴＰ及び希釈したシクァナーゼ(sequenas
e)を添加し室温で２分間培養した。最終混合物を４塩基
（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）に分けて添加し、４２℃で２分間培
養した。それぞれの試験管に反応終了溶液を添加し、該
試料をゲル状にローディングする前、９５℃で２分間加
熱した。重要な塩基配列に対する最上の分析結果を得る
ことに必要な時間の間、該試料を３５Ｗの一定した電力
で６％アクリルアミドゲルから分離した。実行後ゲルを
１枚の３ＭＭの紙の上に載せて置いて、サラン(Saran)
ラップにかぶせた。それからゲルをバイオーラド(Bio-R
ad)社の真空乾燥機で８０℃で３０分間乾燥し、室温で
コダクＸ−Ｏｍａｔフィルムに一晩中露出させた。マッ
クベクター塩基配列分析プログラム(Mac Vector Sequen
cing Analysis Program)を用いて、その試料の配列を解
読し分析した。 【００３３】（実施例４） ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 放射能プローブの調製 プラスミドＤＮＡを５００ｍｌの３２７個のクローン培
養液から、プロメガ社のマックシ−プレップキット(Max
i-prep kit)を用いて分離した。５０μｇのプラスミド
ＤＮＡをKpn I及びSac I制限酵素で分解することにより
挿入物を分離した。プラスミドＤＮＡを３７℃で２時間
の間Sac Iで分解し、９５％エタノールで一晩中沈殿し
た。それから線形化されたＤＮＡを同一条件下でKpnIで
切断した。全てのＤＮＡ試料を１％のアガロースゲルを
通過させて、その挿入物を低溶解アガロースを用いて分
離した。ゲルから挿入物を分離してから、ゲルを紫外線
照明器で照射し、挿入物の位置を表示した。 【００３４】それから挿入物の陰極側のアガロースゲル
をナイフを用いて切断し、１％の低溶解アガロース溶液
をウィンド(window)に流し注いだ。その挿入物を低溶解
アガロース領域から電気泳動で分離した。低溶解アガロ
ースを切除し、同じ嵩の２ｘ抽出緩衝溶液（４００ｍＭ
塩化ナトリウム／２００ｍＭトリス、ｐＨ７．９／２ｍ
Ｍ ＥＴＤＡ）を添加した。混合物を１５分間６５℃ま
で加熱して、アガロース塊を溶かした。溶けたゲル片ら
を試験管に入れて、同一嵩のフェノール／クロロフォル
ム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加し
た後、クロロフォルム／イソアミルアルコールを添加し
た。 【００３５】エタノールで沈殿させた挿入ＤＮＡを真空
で乾燥し、ｐＨ８．０のＴＥに再懸濁した。分離された
挿入物をアマーシャム(Amersham)社のマルチプライムＤ
ＮＡラベリングキットを用いてラベリングした。一反応
で大略２５μｇのＤＮＡを鋳型に使用した。適当量のＤ
ＮＡに２１μｌの水を添加し（５０μｌの反応で）、該
混合物を５分間熱湯で加熱してから氷で冷却した。鋳型
ＤＮＡを変性させる間反応を始めるし（４μｌのラベル
されないｄＮＴＰｓ／５μｌの反応緩衝溶液／５μｌの
プライマ／２μｌのクレナウ(Klenow)ＤＮＡポリメラー
ゼ／５０μＣｉ［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ、３，０００ｍＣ
ｉ／ｍｌ）上下にピペッティングして徐々に混合した。 【００３６】該反応物を３７℃で３０分間培養し、１０
０μｌのＳＴＥ（１００ｍＭ塩化ナトリウム／１０ｍＭ
トリス、ｐＨ８．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）
を添加し反応を終了させた。ラベルされたＤＮＡを回転
−カラムクロマトグラフィーで分離した。該カラムは、
ベックトン−ディキンソン(Becton-Dickinson)社の１ｍ
ｌの１回用の注射器で制作した。注射器を少量の殺菌グ
ラスウール(glass wool)で塞いでＰ−１０平形のＳＴＥ
で詰めた。注射器を１５ｍｌの遠心分離器チューブに入
れて１分間１，５００ｒｐｍで遠心分離した。充填され
たビードが０．９ｍｌの嵩となるまで、ゲルをかかる方
法により充填した。 【００３７】カラムを１００μｌのＳＴＥで２回洗滌し
た。蓋のないエペンドルフチューブを遠心分離器チュー
ブの底に置いてカラムをチューブに入れた。注射器の針
の先端をエペンドルフチューブの入り口に合わせた。放
射能試料をローディングし、１分間１，５００ｒｐｍで
遠心分離し、ラベルされたプローブから遊離されたヌク
レオチドを分離した。流出物を新しいエペンドルフ試験
管に移して嵩を測定した。カラムを通過する前後の１μ
ｌの試料に対する放射能を測定することにより、ラベル
されたヌクレオチドの結合比率を計算した。ノーザンブ
ロッティング、サザンブロッティング及びｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするために、ラベルされたＤ
ＮＡをプローブに用いた。 【００３８】ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子
をクローニングするために、ヒマワリｃＤＮＡライブラ
リーを含むバクテリオファージを備えてスクリーニング
することに用いた。フィルタが２枚用意され、完全に分
離され一致しているプラークが選抜され、挿入断片を配
列決定した。それで、ファルネシルピロリン酸シンター
ゼをコード化する新しい遺伝子を決定した（配列１）。
ヒマワリで１つのＦＰＳをクローニングし、遺伝子銀行
(GenBank)に承認番号ＡＦ０００９３７（ヒマワリＦＰ
Ｓ）に登録した。ＦＡＳＴＡｎ調査は、ヌクレオチド配
列が既に報告された他のＦＰＳ族と似ているというこ
と、即ちタバコＦＰＳの８７％相同性を有するというこ
とを示す。 【００３９】全てのクローニングしたＦＰＳ酵素の調査
で保全されたアミノ酸が表れた。最初５０個のクローン
を制限エンドヌクレアーゼ地図制作(mapping)により分
析し、プライマ部位にベクター塩基配列を用いてｃＤＮ
Ａの両末端から塩基配列データを分析した。長い鎖をイ
ソプレノイド２リン酸であり、ステロール生合成でＤＭ
ＡＰＰをＦＰＰに転換する、ファルネシル化されたタン
パク質であるＦＰＳ酵素をコード化するサン−ＦＰＳ
(ｓｕｎ−ＦＰＳ）ｃＤＮＡをかかるクローンから選択
し特徴づけた。サン−ＦＰＳ１（１３４７ｂｐ）ｃＤＮ
Ａｓは、プレニル転移酵素の特徴を示す典型的なＤＤＸ
ＸＤモチーフ（Ｄ：Ａｓｐ、９３〜９７アミノ酸、２３
２〜２３６アミノ酸、配列２参考）を有する、３４６個
のアミノ酸を含む分子量３１，０００のタンパク質をコ
ード化する。 【００４０】（実施例５） 温度に敏感な酵母変異種を用いた融合タンパク質酵素活
性の分析 ヌクレオチド塩基配列分析を完成した時、タンパク質発
現に対するｐＲＳＥＴ融合タンパク質システムと酵母補
完分析に対するｐＹＥＳ２を用いて発現ベクターを構成
した。ＳＦＰＳタンパク質を過発現させ部分的に精製し
て、生成物の大きさを確認した。これは酵素機能をサッ
カロマイセスセレビジエ(Saccharomycescerevisiae)Ｆ
ＰＳ変異種補完分析により調査した。ｐＧＥＭベクター
でサブクローニングされたＳＦＰＳをコード化するＤＮ
Ａ断片を、ＰＣＲにより一対の変異されたオリゴ（7s-3
CGG GAT CCA TGG CCT CTG ATC TCA AGT C及びBIEN TCG
CGA GGC GAA TTG GGT ACC GGG)を用いて増幅した。 【００４１】ＰＣＲ生成物をｐＧＥＭベクターで更にサ
ブクローニングした。ＬＢ培地で１０個の陽性反応のク
ローンを選択培養した。挿入物をEcoR I分解により確認
した。実際に陽性のクローンを選抜し、冷凍グリセロー
ルストック(stock)を作った。５０μｌ／ｍｌのアンピ
シリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に５０μｌの冷凍ｐＲ
ＳＥＴ−ＳＦＰＳストックを接種し、攪拌器で３７℃で
一晩中培養した。それから全培養液を既に暖ためた５０
０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐに接種した。ＯＤ600値が０．６
〜０．８に達した時、Ｌａｃオペロンが活性化されるよ
うに、２ｍｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。 【００４２】該培養液を更に４時間培養し、１５分間
２，０００ｒｐｍで遠心分離した。それからその上澄を
慎ましく除去した。５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール及び０．２％ＮＰ−
４０を含む１５ｍｌの溶解(Lysis)緩衝溶液に沈殿物を
再懸濁した。細胞懸濁液をブランソン(Branson)社の超
音波器を用いて１０目盛りに対してパワー５で、それぞ
れ３０秒ずつ４回にかけて超音波処理し、３０分間１
２，０００ｒｐｍで遠心分離した。その上澄を回収しア
ミコン(Amicon)社の０．４５μｍろ過器でろ過した。タ
ンパク質抽出物をゲルに通過させることにより、ＳＦＰ
Ｓタンパク質の誘導水準を調査した。 【００４３】本発明では１０％ＰＡＧＥを用いた。ホー
エファ科学(Hoeffer Sci.)のグラディエントメーカー(G
radient maker)を用いて下部ゲルを作った。グラディエ
ントメーカーを１０目盛りに対して３にして磁性攪拌器
の上に載せて置いた。１０％ゲル混合物（２．２ｍｌ水
／２．９ｍｌ ２Ｍトリス緩衝溶液、ｐＨ８．８／２．
６ｍｌ ３０％アクリルアミド／４０μｌ １０％過硫
酸アンモニウム／４０μ２０％ＳＤＳ／７．８ｍｌゲル
溶液に対する１０μｌ ＴＥＭＥＤ）を低濃度チャンバ
ーに入れて、グラディエントメーカーで２０％ゲル溶液
（０．２ｍｌ水／２．９ｍｌ ２Ｍトリス、ｐＨ８．８
／４．６ｍｌ ３０％アクリルアミド／４０μｌ １０
％過硫酸アンモニウム／７．８ｍｌゲル溶液に対する１
０μｌＴＥＭＥＤ）と混合した。 【００４４】ファーマシア(Pharmacia)社の２個の連動
(peristaltic)ポンプで該混合物をバイオーラド(Bio-Ra
d)社のミニゲルカセットに注入した。下部ゲルを室温で
３０分間備えた。２つのサンドイッチになっているスラ
ブの間に、高さがスラブの上から２ｃｍとなるようにゲ
ル溶液を満たした。２２ゲージの針を有する、油を塗っ
た(greased)注射器により、水に飽和されたｎ−ブタノ
ール(Butanol)を板の上にかぶせた。約０．３ｍｌのブ
タノールをゲルの上部に重層した。次の板の他面が異な
るスペーサーに隣接するように繰り返した。しばらく後
でブタノール層が全体表面に均一に形成した。ゲルが重
合される時に、非常に鮮明なブタノールとゲルとの境界
面を見ることができた。 【００４５】下部ゲルを用いる前で、夜間に流し注いで
その表面をパラフィルムで覆った後、室温で貯蔵するこ
とができる。鋳型台(castingstand)を傾いてブタノール
層を流し出した。ゲル表面を２０ｍｌの蒸留水で洗い出
した。それから水に溶解された０．５Ｍトリス−塩酸、
ｐＨ８．８、０．１％ＳＤＳを含む３ｍｌのゲル蓋(ove
rlay)緩衝溶液を添加し、最小限１時間放置して置い
た。ゲル蓋溶液を２２ゲージの針を有する注射器を用い
て除去した。 【００４６】上部にゲル（１．１ｍｌの水／０．４ｍｌ
４ｘ上部トリス／０．１５ｍｌ３０％アクリルアミド
／８μｌ １０％過硫酸アンモニウム／５ｍｌの嵩に対
して３．３μｌＴＥＭＥＤ）を積んでＡＰとＴＥＭＥＤ
を添加する前、その中５ｍｌを積んだゲル表面を洗滌す
ることに用いた。ゲルカセットを数回傾けて、余分のゲ
ル溶液を流した。上部にウェル形成用のくしは、試料が
ウェルにローディングされるまでそのまま残しておい
た。上部にウェル形成用のくしをはずし、２２ゲージの
針を有する１０ｍｌの注射器を用いて、ウェルに貯まっ
ている緩衝溶液を除去した後、すぐそれぞれのウェルを
洗浄した。試料緩衝溶液に溶解されたバイオ−ラド社の
既に染色された低分子量のマーカーと、１０〜１５μｇ
のタンパク質を含有する試料を１％β−メルカプトエタ
ノールと３％ＳＤＳで調製した。 【００４７】それから該試料をローディングする前、６
５℃で１５分間加熱した。適当量の試料をＰＡＧＥロー
ディングチップが付着されたピペットマン(Pipetman)で
ローディングした。ゲルカセットに１０ｍＡの一定した
電流を供給する途中で、染色薬が分離(lower)ゲルに移
動し始まった時に電流を２０〜２５ｍＡに高めた。染色
薬が底から０．５ｃｍ離れた地点に到着する時まで進行
させた。クマシブルー(Coomasie blue)により染色され
たゲルから、ＦＰＳの予想される分子量と相応する３
１，０００Ｄａから過発現された鮮明なタンパク質バン
ドが観察された。タンパク質プロファイルは図１に示し
た。 【００４８】ＦＰＳに対する酵母相補(complementatio
n)分析 サン−ＦＰＳ１が機能性酵素をコード化するかを調査す
るために、信頼性のない変異エルグ(erg)２０−２を有
する、温度に敏感な突然変異体の変種である変異種酵母
(Saccharomyces cerevisiae)変種ＣＣ２５でｃＤＮＡを
発現させた。従って、該変異種は、複製を阻害する温度
（３６℃）では、エルゴステロルに対して栄養要求性で
ある。Bam HIとXho I部位で発現ベクターpYES２-SFPSを
構成した。ＧＡＬ１プロモーターの調節下でヒマワリＦ
ＰＳ１ ｃＤＮＡを有するｐＹＥＳ２−サン−ＦＰＳ１
に変異種酵母を形質転換した。図２の図示のとおり、酵
母変異種のエルゴステロルを栄養要求性を、３６℃でプ
ラスミドｐＹＥＳ２−サン−ＦＰＳ１で補充した。補充
された酵母でＦＰＳ ＤＮＡの存在をＰＣＲ増幅で確認
し、これはこの挿入されたタンパク質が酵母ＦＰＳの酵
素活性を代替し、次の生化学的な段階を復旧できるとい
うことを示す。 【００４９】（実施例６） ＳＦＰＳのプラスミド構成と形質転換 上述のとおり、ＦＰＰは特にステロイド合成とカロチン
合成において、構造上多様なセスキテルフェノイド類の
前駆体であり、イソプレノイド経路の多重分岐点に存在
する。ＦＰＳ ｃＤＮＡの分離と遺伝子の技術は、他の
宿主システムで過発現の影響を実行できるようにする。
生体内のＳＦＰＳ酵素活性を測定し、ステロイド合成ま
たはカロチン合成に対するＦＰＳ過発現の影響を調査す
るために、遺伝子導入タバコ植物を産出するように、ア
グロバクテリウム−ｐＣＩＰ−ＳＦＰＳ二重ベクター(b
inary vector)を構成した。これは生体内の機能性ＳＦ
ＰＳ１であるかを決定するためにも必要なものであり、
実質的な代謝作用において、ヒマワリのその自体で過発
現するものが必要であるので、ＦＰＳ酵素をコード化す
る組換えアグロバクテリウムクローンは、遺伝子導入植
物を産出するために構成された。 【００５０】Ａ．遺伝子導入されたヒマワリファルネシ
ルピロリン酸シンターゼ（ＳＦＰＳ）ダバコの産出 上述のとおり、ＦＰＰは特にステロイド合成とカロチン
合成において、構造上多様なセスキテルフェノイド類の
前駆体であり、イソプレノイド経路の多重分岐点に存在
する。生体内のＳＦＰＳ酵素活性を測定し、対象植物に
対するＦＰＳ過発現の影響を調査するために、遺伝子導
入タバコ植物を産出するように、アグロバクテリウム−
ｐＣＩＰ−ＳＦＰＳ二重ベクターを構成して、遺伝子導
入タバコ植物を産出した。 【００５１】ｐＧＥＭベクターで８５０個の塩基対の挿
入物をＢａｍＨＩとＮｒｕＩで切断し、キアゼン(Qiage
n)社のゲル精製キットを用いて、１％ＴＡＥ−アガロー
スゲルに通過させて精製した。ＢａｍＨＩとＮｒｕＩと
に分解したＰＢＩ１２１と精製した挿入ＤＮＡとを、適
当な緩衝溶液でＤＮＡリガーゼと混合し、１６℃で一晩
中培養した。中間サイズの調製後、制限酵素分解で確認
した陽性のクローン(clone #668)をアグロバクテリウム
形質転換に用いた。ＭＳ−アガー培地で育った野生のタ
バコ植物を収集し殺菌した。アグロバクテリウム変種Ｌ
ＢＡ４４０４をＬＢ（５ｇ塩／Ｌ）で、対数期末期や停
止期初期まで培養した。 【００５２】細胞塊を１０ｍＭの塩化マグネシウム、５
％蔗糖、０．００５％シルウエット(Silwet)Ｌ−７７に
ＯＤ600値が０．８となる時まで再懸濁した。殺菌した
葉っぱをアグロバクテリウム懸濁液に入れて外科用メス
で切った。アグロバクテリウム懸濁液に１５分間入れて
から、葉っぱディスク(disc)を発芽ＭＳ培地（蔗糖、ビ
タミン、ＮＡＡ、０．１ｍｇ／Ｌ及びＢＡ、１ｍｇ／
Ｌ）に移した。２５℃培養器で光のない状態で三日間培
養した後、残存しているアグロバクテリウムを高圧殺菌
した蒸留水で洗滌し、葉っぱディスクを新しいＭＳアガ
ープレート（蔗糖、ビタミン、カルベネシリン、２５０
ｍｇ／Ｌ、ガナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ、０．
１ｍｇ／Ｌ及びＢＡ、１ｍｇ／Ｌ）に移した。 【００５３】形質転換体選択のために、４週間にかけて
毎週ガナマイシンの量を増加させて全培養した。若芽が
生えた時、それらを新しいＭＳ固定培地（蔗糖、ビタミ
ン、カルベネシリン、２５０ｍｇ／Ｌ及びガナマイシン
２００ｍｇ／Ｌ）に移して２週間放置した。選択された
形質変換体を、根を張る時まで根誘導培地（１／２ＭＳ
及び蔗糖）に移して置いた。３〜４週後に生存した遺伝
子導入タバコ植物を土壌に移し植えて、２７℃温室で栽
培した。 【００５４】Ｂ．遺伝子導入タバコ植物の特徴 他の遺伝子導入タバコ植物に導入されたＳＦＰＳの発現
を確認するために、ゲノムのＤＮＡ試料を精製した。遺
伝子導入タバコ植物からゲノムのＤＮＡを分離するため
に、冷凍−解凍方法を使用した。急冷させた葉っぱを液
体窒素で冷却された擂り鉢とすりこぎで挽いて、きれい
な２５ｍｌのコレックス試験管に移した。溶解緩衝溶液
（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０／１００ｍＭ ＥＤＴＡ
／１００μｇ／ｍｌタンパク質分解酵素(Proteinase)
Ｋ）にＳＤＳを０．５％添加した。該混合物を７０℃で
１５分間培養してから、タンパク質分解酵素Ｋを最終濃
度２００ｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で一晩中
培養した。 【００５５】それから、同一嵩のトリス緩衝溶液−飽和
フェノールを添加してから、同一嵩のクロロフォルム：
イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、１時間の
間ラブクェーク(Lab Quake)で混合した。試料を最高速
度で攪拌し、５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離し
た。その上層を新しい試験管に移し、４００μｌのクロ
ロフォルム：イソアミルアルコールを添加した。軽く攪
拌してから試料を遠心分離し、その上層を新しい試験管
に入れた。ｐＨ８．０の１／１０嵩の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムと２倍嵩の純粋なエタノール（−２０℃）を添加し、
軽く振とうして混合した。それから該試験管を−２０℃
で一晩中培養した。 【００５６】４℃で５分間５，０００ｒｐｍで遠心分離
し、ＤＮＡ塊を得た。遠心分離後、上澄を真空連続抽出
パストゥールピペットで慎ましく除去した。１ｍｌの７
０％エタノール（−２０℃）を添加して洗滌し、遠心分
離して上澄を除去した。その後、余分のエタノールを蒸
発させるために、沈殿物を真空下でサバント(Savant)社
のスピードバック(speed vac)で乾燥した。ＤＮＡを５
０〜１００μｌのＴＥ、ｐＨ８．０（１０ｍＭトリス、
ｐＨ８．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し確認後その量
を決めた。サブクローニングＳＦＰＳ挿入物に対して使
用された同一なオリゴヌクレオチドを非常に厳しい条件
におけるＰＣＲ増幅に対して使用した。遺伝子導入タバ
コ植物の試料から産出したＰＣＲ生成物を７６０塩基対
と１５０塩基対の断片を産出するXba Iに分解した。そ
のような断片を有する選択された遺伝子導入タバコ植物
を更に成長させ、遺伝子タバコ植物における導入された
ＳＦＰＳの発現水準をノーザンブロットで調査した。 【００５７】ノーザンブロット 全体ＲＮＡ試料をシグマ社のトリ(Tri)試薬を用いて精
製した。最後に、その塊をＤＥＰＣ（ジエチルピロカー
ボネート）で処理された４００μｌの蒸留水に再懸濁
し、ベックマンデュ(Beckman Du)８分光光度計で１００
倍希釈液の吸光度を測定しその量を決めた。 【００５８】分解は発生されないことを確認するため
に、それぞれの分離されたＲＮＡ試料から１．５ｇのＲ
ＮＡを含む天然分析ゲル(native analytical gels)で実
行した。それから１０μｇの任意の全体ＲＮＡを含む一
部を電気泳動で分離し、ニトラン(Nytran)膜上に移し
た。蒸留水に浸したニトランにＲＮＡを移し、１５分間
２０Ｘ ＳＳＰＥにびっしょり浸した。移動緩衝溶液で
２０Ｘ ＳＳＰＥを用いて２４時間の間サザン分析に用
いたことと同様な装置で移動を遂行した。１００℃で５
分間ｐＨ８．０の０．０２Ｍトリスでその膜を反応させ
ることにより、移動されたＲＮＡｓのデグリオキシル化
反応を完成した。 【００５９】前記のとおり産出した放射能ＳＦＰＳプロ
ーブを本実験で用いた。プリハイブリダイゼーション、
ハイブリダイゼーション及びＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダ
イゼーション洗滌をＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョンに対し説明したとおり実行した。また、自動Ｘ線撮
影をサザンハイブリダイゼーションのように遂行した。
ノーザンブロット分析結果は、サン−ＦＰＳ１をコード
化するｍＲＮＡが、葉っぱと幹とに高い含量で存在する
ことを示す（図３）。 【００６０】ＦＰＳの過発現は、老齢の植物において、
老化が緩められた結果であり、クロロフィル含量、ルビ
スコ(Rubisco)の相対的な量及びシステインプロテアー
ゼを含む老化遅延に対する数個の要素を調査した。葉っ
ぱの老化は、重要な代謝産物が成長に用いられるために
回復される間、結局細胞の死滅に至る活発に調節される
発生過程であると知られている(Weaver et al,1998)。
光合成作用は、細胞がそれらの構成分及びタンパク質内
容物が除去され、核酸が数個のフォルド(fold)を除去
し、澱粉と脂質が物質代謝されることにより衰退するも
のと観察された。 【００６１】（実施例７） 遺伝子導入タバコ植物を過発現するＳＦＰＳの葉っぱに
おけるクロロフィル含量の測定 遺伝子導入及び非遺伝子導入植物の成長をモニタした
が、遺伝子導入植物のもっと暗い色素形成を除いては、
遺伝子導入及び非遺伝子導入植物の成長に大きい差異は
なかった（図４と図５）。植物抽出物でクロロフィルの
含量を２セットの試料；４週目の遺伝子導入及び非遺伝
子導入タバコの全体植物及び７ヶ月目の遺伝子導入及び
４ヶ月目の非遺伝子導入タバコ植物の３ヶ月目の葉っぱ
を用いて分光光度計で測定した。前記２つの場合に、遺
伝子導入植物は対照群に比して更に暗い色素形成が観察
された。幾日以内に２グループを精密に調査し始めた。
遺伝子導入植物で観察された特徴は、老化の長期遅延で
ある（図６と図７）。図６〜図８に示されたとおり、遺
伝子導入植物は、種子収集時間まで継続して新鮮に維持
されることを示した。新鮮さが一般植物より更に長時間
持続され、余分の葉液の芽と枝の根本から生える若芽
は、正常の優性のため、余分の花とその生産物である種
となった（図８）。 【００６２】このように長く持続される年少は、ＦＰＰ
過生産による高水準のジベレリンの結果であることもあ
る。かかる一部の形態学的な変化等が直接的にジベレリ
ンの集中された過発現の結果である反面、他の変化等は
ジベレリンが豊富な組織に植物栄養分が動員された結果
であることもある。 【００６３】（実施例８） ＳＦＰＳを過発現する遺伝子導入タバコ植物の特徴決定 老化に関連した遺伝子の発現様式 一般的に老化の調節は核によって行われる。老化は多く
の構成成分の一連の退化過程であるがタンパク質合成が
要求される。光合成タンパク質、ＣＡＢ及びルビスコを
コードするｍＲＮＡｓは、老化する間にその多くは衰退
することが知られており（He etal.,1997)、いくつかの
ｍＲＮＡｓ、システインプロテアーゼ、マレートシンタ
ーゼ及びグルタミンシンターゼは、その多くが増加の傾
向を示す(Ding et al,1993;Oh et al.,1997)。遺伝子導
入及び非遺伝子導入タバコ植物で、老齢に対する反応に
おいて、一対の老化関連遺伝子（ＳＡＧｓ）、ルビスコ
及びシステインプロテイズの発現を比較した。 【００６４】しかし、他の方法で標準と異なる個別のＳ
ＡＧｓは部分的に重複されるが、一致しない環境でそれ
らの遺伝子生成物が役割を行うことを暗示する（He et
al,1997)。ノーザンブロット分析のために、２、３、
５、８及び２３週目の遺伝子導入植物と、２、３、５、
８及び１６週目の非遺伝子導入タバコ植物を処理して、
全体ＲＮＡ試料を分離した。末端にラベルされたシステ
インプロテアーゼオリゴをプローブに用いた。ノーザン
分析結果、システインプロテアーゼのｍＲＮＡ水準が非
遺伝子導入植物で、葉っぱの老化に伴って漸次的に増加
した（図９のａ）。 【００６５】しかし、ＳＦＰＳ−遺伝子導入植物は、全
ての試料でシステインプロテアーゼの一定した水準を示
した。図９ｂのとおり、ルビスコの発現水準は、遺伝子
導入植物が２３週まで高く維持されるが、信号は非遺伝
子転換植物で弱く得られる。要約すれば、対照群植物が
記録された結果により確認された反面、ＳＦＰＳを有す
る遺伝子導入タバコ植物は、野生型と比較する時、高い
含量のクロロフィル、高い含量で長く持続されるルビス
コ及びシステインプロテアーゼの一定した水準を示す。
不確実な理由で遺伝子導入タバコ植物は、おそらく過剰
生産されるジベレリンにより、幹と葉っぱで年少が維持
され、正常優性が維持されるし、連続的に葉液の発芽、
多数の花及び多い種子を得る。 【００６６】 【発明の効果】本発明は、ヒマワリ（Helianthus annu
s）の苗から得るヒマワリファルネシルピロリン酸シン
ターゼ(sunflower farnesyl pyrophosphate synthase、
ＳＦＰＳ)をコード化するように分離された、ｃＤＮＡ
ヌクレオチド配列を含む組換え植物発現ベクターと、老
化が遅延(delay)されて、花の発達と種子生産が増加さ
れた遺伝子導入タバコ植物の製造に関する。非遺伝子転
換または対照群ベクターに形質転換されたタバコ植物と
比較する時、二重構造のファルネシルピロリン酸シンタ
ーゼを発現する遺伝子転換植物は、乾燥環境に対する強
い耐性、葉っぱのクロロフィル高含量、種子生産におい
て２倍の増加を示す。 【００６７】図１は、クマシブルーにより染色したゲル
に、大腸菌(Escherichia coli)におけるヒマワリファル
ネシルピロリン酸シンターゼタンパク質の発現様式を示
したもので、それぞれのレーンで１０μｇのタンパク質
をローディングし、１０〜２０％のグラディエントＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離して可
視化するために、クマシブルーで染色した。レーン１は
クロン１；レーン２はクロン２；レーン３はタンパク質
分子量標準物質を示す。過発現したタンパク質のバンド
（分子量３１，０００）を矢印で表示した。 【００６８】図２は、酵母ＣＣ２５変異種におけるＳＦ
ＰＳの構造分析を示す。図３は、遺伝子導入タバコ植物
におけるＳＦＰＳの発現を示したもので、他の遺伝子導
入タバコ植物で全体のＲＮＡ試料等を精製し、32Ｐ−ラ
ンダムプライム(random primed)ＳＦＰＳで試験した。
図４は、４週目の遺伝子転換及び非遺伝子転換タバコの
全体植物を以て行った植物抽出物におけるクロロフィル
の分光光度計の測定結果を示す。図５は、７ヶ月目の遺
伝子転換及び４ヶ月目の非遺伝子導入タバコ植物の３ヶ
月目の葉っぱを以て行った植物抽出物におけるクロロフ
ィルの分光光度計の測定結果を示す。 【００６９】図６は、ＦＰＳ−遺伝子導入タバコ植物と
対照群のタバコ植物とを比較したもので、種子を植えた
後の葉っぱの新鮮さを示したものである。図７は、ＦＰ
Ｓ−遺伝子転換植物と対照群植物の種子を収集したもの
である。図８は、７ヶ月目のＦＰＳ遺伝子導入タバコ植
物と４ヶ月目の対照群タバコ植物を示したもので、土壌
に移して植えてから７ヶ月目のものである。図９は、老
化現象と関連したシステインプロテアーゼとリブロース
−１，５ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ
に対するｍＲＮＡｓの発現パターンを示している。 【００７０】 【配列表】 <110> KOREA KUMHO PETROCHEMICAL CO., LTD. <120> Sunflower Farnesyl Pyrophosphate Synthase-plant vector <130> F06680A1 <160> 2 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 1347 <212> DNA <213> Helianthus annuus <220> <221> CDS <222> (17)..(1039) <400> 1 caacaacaca ccaaca atg gcc tct gat ctc aag tct aaa ttc ctc cac 49 Met Ala Ser Asp Leu Lys Ser Lys Phe Leu His 1 5 10 gtt tat caa act ctc aaa tcc gaa tta ctc aac gat cca gcc ttc gaa 97 Val Tyr Gln Thr Leu Lys Ser Glu Leu Leu Asn Asp Pro Ala Phe Glu 15 20 25 ttc cac cac gat tct cgt caa tgg atc gat aag atg ctt gac tac aac 145 Phe His His Asp Ser Arg Gln Trp Ile Asp Lys Met Leu Asp Tyr Asn 30 35 40 gta ccc gga gga aag ctg aat cgg ggc ctc tct gtt gtt gac agc tac 193 Val Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Ser Tyr 45 50 55 cag tta ctt aaa gga gca gaa ctg act gat gat gag att ttt ctt gca 241 Gln Leu Leu Lys Gly Ala Glu Leu Thr Asp Asp Glu Ile Phe Leu Ala 60 65 70 75 tct gcc ctt ggt tgg tgc att gaa tgg ctt caa gca tac ttt ctt gtg 289 Ser Ala Leu Gly Trp Cys Ile Glu Trp Leu Gln Ala Tyr Phe Leu Val 80 85 90 ctt gat gac atc atg gac ggg tct cat aca cgc aga ggt caa ccc tgt 337 Leu Asp Asp Ile Met Asp Gly Ser His Thr Arg Arg Gly Gln Pro Cys 95 100 105 tgg ttc aga tta ccc aag gtt ggt atg att gct gca aac gat gga ttg 385 Trp Phe Arg Leu Pro Lys Val Gly Met Ile Ala Ala Asn Asp Gly Leu 110 115 120 att ctt cgc aac cat gtc cca aga att ctc aaa aag cat ttt cga gga 433 Ile Leu Arg Asn His Val Pro Arg Ile Leu Lys Lys His Phe Arg Gly 125 130 135 aag ccg tat tat gtg gat cta gtt gac cta ttc aac gag gta gaa ttc 481 Lys Pro Tyr Tyr Val Asp Leu Val Asp Leu Phe Asn Glu Val Glu Phe 140 145 150 155 caa aca gcc tct gga cag atg att gat ttg atc act aca ctt gtt gga 529 Gln Thr Ala Ser Gly Gln Met Ile Asp Leu Ile Thr Thr Leu Val Gly 160 165 170 gaa aaa gat ctc tca aag tat tca ttg tct att cat cgc cgg att gtt 577 Glu Lys Asp Leu Ser Lys Tyr Ser Leu Ser Ile His Arg Arg Ile Val 175 180 185 cag tac aaa acc gct tat tac tca ttt tac ctt cct gtt gct tgt gcg 625 Gln Tyr Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala Cys Ala 190 195 200 ctc ctt atg ttc ggt gag gat ttg gac aat cat gtt gaa gtg aag aat 673 Leu Leu Met Phe Gly Glu Asp Leu Asp Asn His Val Glu Val Lys Asn 205 210 215 gta ctt gta gaa atg ggt acc tat ttt caa gtg cag gac gat tat cta 721 Val Leu Val Glu Met Gly Thr Tyr Phe Gln Val Gln Asp Asp Tyr Leu 220 225 230 235 gac tgt ttt ggt gct ccc gag gta att gga aag att gga aca gac att 769 Asp Cys Phe Gly Ala Pro Glu Val Ile Gly Lys Ile Gly Thr Asp Ile 240 245 250 gaa gac ttt agt tca tgg cta gtt gta aaa gct ttg gaa ctt gcc aat 817 Glu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Val Val Lys Ala Leu Glu Leu Ala Asn 255 260 265 gag gaa caa aag aaa gtc cta cat gaa aat tat gga aaa aaa gac ccc 865 Glu Glu Gln Lys Lys Val Leu His Glu Asn Tyr Gly Lys Lys Asp Pro 270 275 280 tct tcg gtt gca aaa gtg aag gaa cta tac aac act cta aat ctt cag 913 Ser Ser Val Ala Lys Val Lys Glu Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Leu Gln 285 290 295 ggc gta ttt gaa gat tat gag agc cac agt tac aag aag cta atc acg 961 Gly Val Phe Glu Asp Tyr Glu Ser His Ser Tyr Lys Lys Leu Ile Thr 300 305 310 315 tcc att gaa ggt cac cca agc aaa gcc gta caa gca gtg ttg aaa tcg 1009 Ser Ile Glu Gly His Pro Ser Lys Ala Val Gln Ala Val Leu Lys Ser 320 325 330 ttc ttg gga aag ata tac aag agg caa aag t aggtaattta tcctaccaaa 1060 Phe Leu Gly Lys Ile Tyr Lys Arg Gln Lys 335 340 taattttttt gtgtttttac tatgtgtaat aagatttcta cattgtttgt aacaactgtt 1120 ttgtagtttc tggattcgtc gtttttaatg ttctttattg acaatttttt tgagttattt 1180 gttggattac gagtaggtcg aaattttgta atatcaattg ggctagatgg ttagacttta 1240 acattcgtga cgctattttg taatctttcg ggttccagct tcttgctggc ccagtttcta 1300 tatcttgtta tatagaagtt tcgccgttca aaaaaaaaaa aaaaaaa 1347 <210> 2 <211> 341 <212> PRT <213> Helianthus annuus <400> 2 Met Ala Ser Asp Leu Lys Ser Lys Phe Leu His Val Tyr Gln Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ser Glu Leu Leu Asn Asp Pro Ala Phe Glu Phe His His Asp Ser 20 25 30 Arg Gln Trp Ile Asp Lys Met Leu Asp Tyr Asn Val Pro Gly Gly Lys 35 40 45 Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Ser Tyr Gln Leu Leu Lys Gly 50 55 60 Ala Glu Leu Thr Asp Asp Glu Ile Phe Leu Ala Ser Ala Leu Gly Trp 65 70 75 80 Cys Ile Glu Trp Leu Gln Ala Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp Ile Met 85 90 95 Asp Gly Ser His Thr Arg Arg Gly Gln Pro Cys Trp Phe Arg Leu Pro 100 105 110 Lys Val Gly Met Ile Ala Ala Asn Asp Gly Leu Ile Leu Arg Asn His 115 120 125 Val Pro Arg Ile Leu Lys Lys His Phe Arg Gly Lys Pro Tyr Tyr Val 130 135 140 Asp Leu Val Asp Leu Phe Asn Glu Val Glu Phe Gln Thr Ala Ser Gly 145 150 155 160 Gln Met Ile Asp Leu Ile Thr Thr Leu Val Gly Glu Lys Asp Leu Ser 165 170 175 Lys Tyr Ser Leu Ser Ile His Arg Arg Ile Val Gln Tyr Lys Thr Ala 180 185 190 Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala Cys Ala Leu Leu Met Phe Gly 195 200 205 Glu Asp Leu Asp Asn His Val Glu Val Lys Asn Val Leu Val Glu Met 210 215 220 Gly Thr Tyr Phe Gln Val Gln Asp Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Ala 225 230 235 240 Pro Glu Val Ile Gly Lys Ile Gly Thr Asp Ile Glu Asp Phe Ser Ser 245 250 255 Trp Leu Val Val Lys Ala Leu Glu Leu Ala Asn Glu Glu Gln Lys Lys 260 265 270 Val Leu His Glu Asn Tyr Gly Lys Lys Asp Pro Ser Ser Val Ala Lys 275 280 285 Val Lys Glu Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Leu Gln Gly Val Phe Glu Asp 290 295 300 Tyr Glu Ser His Ser Tyr Lys Lys Leu Ile Thr Ser Ile Glu Gly His 305 310 315 320 Pro Ser Lys Ala Val Gln Ala Val Leu Lys Ser Phe Leu Gly Lys Ile 325 330 335 Tyr Lys Arg Gln Lys 340
edlings of Helianthus annus）から得るヒマワリファ
ルネシルピロリン酸シンターゼ(sunflower farnesyl py
rophosphate synthase、ＳＦＰＳ)をコード化するよう
に分離された、ｃＤＮＡヌクレオチド配列を含む組換え
植物発現ベクターと、老化が遅延(delay)されて種子生
産が増加された遺伝子導入タバコ植物(transgenic toba
cco plants)の製造に関する。 【０００２】 【従来の技術】ファルネシルピロリン酸シンターゼ（Ｆ
ＰＳ）は、イソペンテニルピロリン酸とジメチルアリル
ピロリン酸からファルネシルピロリン酸が合成される反
応を触媒する酵素である。ファルネシルピロリン酸（Ｆ
ＰＰ）シンターゼは、特にステロイド合成とカロチン合
成において、ステロール、カロチノイド及びプレニルキ
ノンのような構造上に多様な重要代謝産物等に対するＣ
１５前駆体を提供するイソプレノイド生合成で重要な酵
素である。イソプレノイド生合成の経路は、一連のイソ
プレン単位を含む１次アルコールピロリン酸エステル類
を中心としてなる。 【０００３】Ｃ５分子（ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰ）から始
まって、一連のＣ１０（ＧＰＰ）、Ｃ１５（ファルネシ
ルピロリン酸）、Ｃ２０（ＧＧＰＰ）及び更に高い分子
量のイソプレノイドピロリン酸は、伸長鎖の１′−４′
にイソペンテニルピロリン酸が添加されて合成される。
１′−４′縮合反応は、基質と生成物の二重結合立体化
学と鎖の長さに対して高度に選択的なプレニル転移酵素
族により触媒される。ＦＰＰは特にステロイド合成とカ
ロチン合成において、イソプレノイド経路の一過程から
発生されるし、ファイトアレキシンのような構造上に多
様なセスキテルペノイド類の前駆体である。クロロフィ
ル、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ジベレリン
及びアブシシン酸(abscisic acid)を含む数千個の天然
植物生産物がイソプレノイド経路から始まったと知られ
ている。 【０００４】また、イソペンテニルピロリン酸のゴムへ
の重合を含む天然ゴム生合成の最後の段階でＦＰＳが関
連されていると明らかになった。人間{Wilkin et al.，
J.Biol,Chem,1990 265(8):4607-4614}、酵母{Chambon e
t al.,Curr.Genet.1990 18(1):41-46}、アラビドプシス
タリアナ(Arabidopsis thaliana)(Cunillera et al.,19
96 J.Biol,Chem,271,7774-7780)ゴムの木{Light et a
l.,J.Biol,Chem.1989 264(31):18598-607}及び大腸菌(F
ujisaki et al.,J.Bacteriol 1989 171(10):5654-565
8)を含む異なる生体に存在するＦＰＳ遺伝子が既に報告
された。イソプレニル化反応は、多数の真核細胞タンパ
ク質を膜に効果的に結合させるために必要であるが、十
分でない遺伝翻訳後の修飾である。 【０００５】哺乳動物と酵母細胞で、イソプレニル化さ
れたタンパク質の機能と適切な細胞内のターゲッティン
グのために付加的な修飾が必要であると知られている。
タンパク質プレニル転移酵素による特定真核細胞タンパ
ク質にプレニルグループファルネシル及びゼラニルの結
合は、シグナル伝達を含む多くの細胞内の作用等を可能
にするために必要である。 【０００６】タンパク質ファルネシル転移酵素（Ｆター
ゼ）は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）からラス
（Ｒａｓ）のような細胞内のタンパク質であり、それら
のカルボキシ末端の周りのシステイン残基で疎水性ファ
ネシルグループが移動することを触媒する。この過程
は、原形質膜でこのようなタンパク質の副細胞内の位置
化(subcellular localization)のために必要であり、抗
ガン治療のために重要なターゲットであるＦターゼを作
るラスの腫瘍性変異体等の形質転換活性化のために必要
である。 【０００７】ファルネシル化反応は、膜部分とＲａｓ部
分とを含むいくつかのタンパク質の作用のために必要で
ある。ファルネシル−タンパク質転移酵素の阻害剤等
（ＦＴＩｓ）は、変異したＲａｓを提供してガンを治療
するために、Ｒａｓ経路を遮断するように開発された。
従って、タンパク質プレニル化反応の阻害剤等は腫瘍の
化学療法のための提案がされた{Vitale et al.,Endocri
nology 1999 140(2):698-704;Kohl et al.,science 199
3 260(5116):1934-1937}。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】ヒマワリ（Helianthus
annus）のファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰ
Ｓ）に関連した本発明の目的は；（ａ）一対のＦＰＳオ
リゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒマワリＦＰＳｃ
ＤＮＡｓの配列を決定、増幅し、（ｂ）細菌性細胞から
ＦＰＳ ｃＤＮＡｓを発現させ、その機能を確認するた
めに酵母変異種で機能相補分析を行い、（ｃ）生体内の
ヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＳＦＰ
Ｓ）の過発現(overexpression)の影響を調査するため
に、遺伝子導入タバコ植物種を製造し、（ｄ）遺伝子導
入植物で植物成長時間に更に多くの花を生産し、２倍以
上の種子を生産する。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明は、構造上に多様
なイソプレノイド生合成代謝産物に対して重要な酵素で
あるヒマワリファルネシルピロリン酸シンターゼをコー
ド化する、分離されたｃＤＮＡのヌクレオチドとペプチ
ド配列を提供する。また本発明は、前記のヌクレオチド
配列を含む組換え植物発現ベクターと遺伝子導入タバコ
植物を生産するために、前記組換え植物発現ベクター内
のＤＮＡ配列を導入する宿主細胞を提供する。 【００１０】 【発明の実施の形態】非遺伝子導入または対照群ベクタ
ーに形質転換されたタバコ植物と比較する時、ファルネ
シルピロリン酸シンターゼを発現する遺伝子導入植物
は、乾燥環境に対する強い耐性と葉っぱのクロロフィル
高含量、種子生産において２倍に増加されることを示
す。植物と人間に存在するＦＰＳのアミノ酸配列を比較
した結果、それらは高い相同性を有し、５個の異なる領
域が存在することが示された。ＦＰＳの機能を特徴化す
る第１番目の段階で、ＦＰＳ ｃＤＮＡをクローニング
し、それが機能的なＦＰＳをコード化するということを
明らかにした。 【００１１】ファルネシルピロリン酸シンターゼをコー
ド化するヒマワリＳＦＰＳ（ＫＣＴＣ０５２０ＢＰ）に
融合させた３５Ｓプロモーターを遺伝子導入タバコ植物
(Nicotiana tabacum L.)に挿入し形態学的変化を調査し
た。かかる構成物はタバコでファルネシルピロリン酸を
過剰生産した。ＦＰＰの過剰生産はＴ0植物において、
葉っぱにおける更に多くの色素形成、側枝発芽、継続す
る成長及び葉っぱの老化遅延現象と、それによる花の２
倍以上の増加、種子生産の最小２倍の増加を含む等、形
態的及び生理的に顕著な変化をもたらした。 【００１２】ある機関で、ＦＰＰの増加された生産が、
植物で葉液の若芽分裂組織、開花及び種子セッティング
または葉っぱの老化のような発育結果に影響を与えたか
否かを調査した。増進された植物成長と収穫は、農作物
科学分野の最も重大な目標として見なされてきた。成長
と発達が異なる遺伝子とその生産物の複雑な相互作用に
より支配されるので、該目標を達成することは容易なこ
とではなかった。生合成の生産能力を増加させる１つの
方法は、組換えＤＮＡ技術を応用することである。 【００１３】本発明で説明した技術は、遺伝子導入植物
で農業的な利点を発生させると思っている。本発明はｐ
ＦＰＳの構成物を導入し、ヌクレオチド配列を転写する
植物を再産出し、植物の成長長さ、総合的な種子産出、
花の数とクロロフィル含量において顕著な変化を示す植
物を選択する方法等を含む。組換え発現カセットは、ア
グロバクテリウムを用いるかまたは有性交配により植物
組織に注入され得る。更に本発明は、増進された成長と
発達を促進する方法を提供する。本発明はタバコ植物に
関連して説明したが、該技術はまたタバコ植物以外の他
の植物における成長と発達にも使用することができる。 【００１４】［実施例］下記の実施例は、本発明の特徴
をより詳しく例示するためのもので、本発明の範囲を限
定するものではない。 （実施例１） ｃＤＮＡのクローニング ファルネシルピロリン酸シンターゼに対する遺伝子を下
記のとおり分離した。この研究で用いた全ての化学製品
は特別に言及されない限りシグマ(Sigma)社から購入し
たものである。ストラタジン(Stratagene)社のｃＤＮＡ
合成キットを用いてヒマワリλｇｔ１０ ｃＤＮＡライ
ブラリーを作るために、播種してから１０日目の葉っぱ
を用いた。 【００１５】該ライブラリーを培養してから大腸菌ＸＬ
１−ブルーＭＲＦ′変種に増幅した。３０％のグリセロ
ールで−９０℃に保管されたストラタジン社のＳＯＬ−
Ｒcompetent細胞を選択するために、ＬＢ／テトラサイ
クリン平盤培地に培養し、３７℃の培養器で一晩中培養
した。０．２％のマルトースと２ｍＭ硫酸マグネシウム
を添加した５０ｍｌの殺菌したＬＢ培地で、よく分離さ
れた単独コロニーを接種した。それから３７℃で攪拌し
ながら一晩中培養した（回転攪拌器で２５０ｒｐｍ）。 【００１６】マルトーズで育った細菌が更に能率的にλ
ファージを吸着する；マルトーズは、バクテリオファー
ジλ受容体をコード化する遺伝子(1amB)を含むマルトー
ズオペロンを誘導する。ＳＯＬ−Ｒ細胞が不安定のた
め、必要になる時まで４℃でＬＢ培地で保管した。５ｍ
ｌのＳＯＬ−Ｒ細胞をエペンドルフ(Eppendorf)チュー
ブに移し、超遠心分離器で最高の速度で８秒間回転し
た。２．５ｍｌの細胞に１０ｍＭ硫酸マグネシウムに更
に懸濁しその密度をＯＤ600で測定した。１０5ｐｆｕの
バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーを０．１ｍｌ
の希釈された細菌細胞（１０8細胞／ｍｌ）が入れてあ
るファルコン(Falcon)社のチューブに添加ししばらくの
間攪拌した。 【００１７】ファージ粒子が細菌に吸着するように、そ
のチューブを３７℃で２０分間培養した。ファージと細
菌性宿主細胞を培養する間、０．７％のアガロースをＬ
Ｂに溶かし、液体培養器の温度を４７℃に合わせた。培
養後に溶解されたアガロース８ｍｌをそれぞれのチュー
ブに添加し軽く攪拌し、ＮＺＹ下端のアガール(agar)平
板上に敷いた。細菌が均一に分布されるようにプレート
を慎ましく振とうして、最上部のアガロースが固くなる
ように１０分間放置した。それから、プレートを３７℃
の培養器にひっくり返して入れた後、７〜８時間の間培
養した。 【００１８】７時間後にプラーク（plaque）を確認し、
プレートの底全体が細菌に覆われるように更に幾時間培
養した。その底全体が細胞に覆われたプレートに８ｍｌ
のＡＭ（１０ｍＭ塩化ナトリウム／１０ｍＭ硫酸マグネ
シウム水化物／５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５／０．０１
％ゼラチン）を添加し、４℃で１時間の間振とうした。
その液体をチューブに入れて、４℃で３分間２，０００
ｒｐｍで遠心分離して沈殿物が生じた。その上澄を新し
いチューブに入れ、５０μｌのＤＮａｓｅとＲＮａｓｅ
（それぞれ１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。該試料を一晩
中４℃で放置した。同一嵩のＳＭに溶解された２Ｍ塩化
ナトリウムと２０％ＰＥＧ（分子量８，０００）を添加
して攪拌し、３時間の間氷で培養した。 【００１９】それからチューブを４℃で２０分間１２，
０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄を除去してから、沈
殿物を塩化ナトリウムとゼラチンのない５００μｌのＳ
Ｍに更に懸濁させて、ｐＨ７．５、４０μｌの０．５Ｍ
ＥＤＴＡと２５μｌの２０％ＳＤＳを添加した。該懸
濁液を軽く振とうして、ウィルスが分解されるように６
５℃で１０分間培養した。それから分解物を室温までに
冷却させて、それぞれのチューブに５００μｌのＰＣＩ
（トリス−飽和されたフェノール：クロロフォルム：イ
ソアミルアルコール＝２５：２４：１）を添加し、５分
間５，０００ｒｐｍで遠心分離した。その上澄を慎まし
く新しいチューブに移した後、同一嵩のクロロフォルム
を添加した。 【００２０】５分間５，０００ｒｐｍで遠心分離してか
らその上澄を取って、２Ｍアンモニウムアセテートと３
倍のエタノールと混合した。−２０℃で一晩中培養した
ら、それぞれのチューブからＤＮＡを分解できる制限酵
素が大略１ｍｇ程度生成された。その大きさに基づいて
核酸を分離、確認して精製するために、多様な濃度のア
ガロースゲル（０．７〜１．５％）を用いて電気泳動を
実行した。水平のミニゲール装置（ＢＲＬ）を主に使用
した。 【００２１】ゲル箱でプラスチックお盆の開放された両
端を２個のテープにより封じて作業台に設けた。エルレ
ンメイヤ(Erlenmeyer)フラスコに正確な量のアガロース
と、１ｘＴＡＥ（４０ｍＭトリス−アセテート／１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加して、メツラー秤(Met
tler scale)上に載せて重さを測定した。それからその
スラリーをアガロースの粒子が完全に溶ける時までたま
に振りあげながら、電子レンジで加熱した。 【００２２】メツラー秤(Mettler scale)でアガロース
ゲル溶液の重さを更に測って、水を添加し元の嵩に合わ
せた。適当量のＥｔＢｒ（０．５ｇ／ｍｌ）を添加し、
ゲル溶液を泳動槽に流し注ぎ、その上にくし（comb）を
差し込んだ。ゲルが固まった後、くしとテープとを除去
した。それから泳動槽に約１ｍｍのゲルになるよう、泳
動槽を覆うのに十分な量の１ｘＴＡＥで泳動槽に満たし
た。ＤＮＡ試料を６５℃で５分間加熱したゲルローディ
ング(loading)緩衝溶液（０．２５％ブルモフェノール
ブルー／０．２５キシレンシアノールＦＦ／１５％ピコ
ル）と混合し、氷で冷却してから自動ピフェットでコー
ディングした。ブロモフェノールブルーがゲルの陰極の
先端から１ｃｍ程度離れた所に到着する時まで、ゲルに
５Ｖ／ｃｍの電圧をかけあげた。それからゲルをフォト
ダイン(Fotodyne)社の紫外線照明器で照射し、ポラロイ
ド（ＡＳＡ３，０００）高感度フィルムを用いて写真を
取った。 【００２３】（実施例２） 退化した(degenerate)プライマーを用いたポリメラーゼ
鎖反応(Polymerase Chain Reaction) ＰＣＲ増幅に用いられたと報告されたＦＰＳ配列に基づ
いた正(universal)オリゴヌクレオチドプローブ(Probe)
を、成熟葉っぱのｍＲＮＡで作ったλＺＡＰｃＤＮＡラ
イブラリーを用いて開発した。ファルネシルピロリン酸
シンターゼの酵素の増幅に用いた退化したプライマーの
配列は下記のとおりである： プライマ１：5′- CAR GCH TWY TTY CTT GTD CTT GAT G
AY ATH ATG-3′ プライマ２：5′- TKM ACS ACY AWC CAA GAR CAT YTR A
AA TC-3′ 【００２４】５μＭのプライマ１と２、０．２ｍＭ ｄ
ＮＴＰｓ、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭトリ
ス、ｐＨ８．３、５０ｍＭ塩化カリウム及び２．５uタ
クポリメラーゼ(Taq polymerase)を含む５０μｌの反応
混合物に、ｃＤＮＡの集合所であるライブラリーから抽
出した全体プラスミドＤＮＡ１ｇを添加した。その試料
の蒸発を最小にするために、少量の殺菌された鉱物性油
で覆った。 【００２５】第１番目は９４℃で２分、５０℃で１．５
分、７２℃まで３分、７２℃で１．５分の条件で実行し
た。次の２番目は９４℃で１分、５０℃で１．５分、７
２℃まで３分、７２℃で１．５分に実行した。かかる前
処理後に、増幅を９４℃で１分、５５℃で１．５分、７
２℃まで１．５分、７２℃で１．５分に３２回実行し
た。ＰＣＲ生成物の中１０μｌを同量のローディング緩
衝溶液と混合し、１％アガロースゲルから分離した。 【００２６】（実施例３） 増幅された核酸断片のヌクレオチドのシークエンシング ＰＣＲ生成物のサブクローニング ブラント末端を有する断片でＰＣＲ生成物をクローニン
グすることは、その鋳型がタクポリメラーゼの末端転移
酵素活性に独立的であるので、断片の３′末端にヌクレ
オチドを付加させることにあまり効果的でなかった。ｄ
ＡＴＰに対するポリメラーゼの強い親和性のために、ほ
とんどの場合にそれはアデノシンである。 【００２７】ｐＧＥＭプラスミドＤＮＡは、一晩中エコ
(Eco)ＲＶ(ＮＥＢ)（１０μｇｐＧＥＭ ＤＮＡ/６μlエ
コＲＶ緩衝溶液／10μgＢＳＡ／２０ユニットエコＲＶ
／８１μl水）で分解した。分解されたＤＮＡを−２０
℃で３時間の間０．５Ｍの塩化ナトリウムと３倍嵩のエ
タノール（−２０℃）で遠心分離して沈殿させた。沈殿
物を１００μｌの水に更に懸濁し、ゲル状で完全な分解
物を確認した。 【００２８】それから分解されたベクターをプロメガ(P
romega)社のタクポリメラーゼ（８５μｌ分解されたベ
クター／１０μlタクポリメラーゼ緩衝溶液／２μｌ
ｄＴＴＰ(１００ｍＭ)／３μｌタクポリメラーゼ）と培
養し、そのエキソヌクレアーゼ活性により３′末端の突
出部分を除去した。少量の鉱物性の油をその上に覆っ
て、その混合物を熱循環器(thermal cycler)で７０℃で
２時間の間培養した。それから試料を２倍嵩のフェノー
ル／クロロフォルム／イソアミルアルコールと混合し、
５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後クロロフォ
ルムを抽出した。 【００２９】その上澄を慎ましく２倍嵩のエタノールと
混合し、−８０℃で２０分間培養した。５分間最高速度
で遠心分離し、その結果生成された沈殿物を１００μｌ
の０．１ｘＴＥに更に懸濁した。それからＰＣＲ生成物
をＴ−ベクター（２．５μｌの４ｘリゲーション(Ligat
ion)）緩衝溶液／２μｌのｐＧＥＭ Ｔ−ベクター／１
μｌのＰＣＲ生成物／１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ／
４．５μｌの水）と１２℃で一晩中培養した。４ｘリゲ
ーション緩衝溶液は、４００ｍＭトリス、ｐＨ７．５、
８０ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭ ＡＴＰ、４０ｍＭ塩化マ
グネシウム、４００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含んで−２０
℃で保管した。 【００３０】冷凍したＤＨ５−α適合細胞を氷の上で溶
かした。２μｌのβ−Ｍｅ、３μｌのリガーゼ及び５０
μｌのＤＨ５α細胞を含むリゲーション混合物を備え
て、３０分間氷で培養してから、４２℃で正確に６０秒
間加熱した。その試験管をすぐ氷で２分間冷却した。４
５０μｌのＬＢを添加し、攪拌器で２５０ｒｐｍで１時
間の間３７℃で培養した。混合物の１／４をＸ−ｇａｌ
／ＩＰＴＧ／Ａｍｐプレートに注いで３７℃で一晩中培
養した。最初に、５０個以上のクローンを制限エンドヌ
クレアゼ地図制作(mapping)により分析し、プライマ部
位にベクター塩基配列を用いてｃＤＮＡ両末端から塩基
配列データを分析した。 【００３１】ＤＮＡのシークエンシング 超巻き取り鋳型ＤＮＡ（３μｇ）をｐＨ８．０の１８μ
ｌのＴＥに再懸濁した。該試料に２μｌの２Ｍ水酸化ナ
トリウムを添加した後、室温で５分間培養して鋳型ＤＮ
Ａを変性させた(denature)。それからｐＨ７．５の８μ
ｌの５Ｍ ＮＨ 4ＯＡｃと１００μｌのエタノールを添
加して、氷で１５分間培養した。変性されたＤＮＡを集
めて真空下で乾燥した。乾燥されたＤＮＡを７μｌの水
に再懸濁し、１μｌのプライマ（０．５ｐモル／μｌ）
と２μｌの５ｘシクァナーゼ(Sequenase)緩衝溶液と混
合した。該混合物を６５℃で２分間培養し室温に冷却し
た。 【００３２】希釈したラベリング混合物、ＤＴＴ、α−
［32Ｐ］ｄＡＴＰ及び希釈したシクァナーゼ(sequenas
e)を添加し室温で２分間培養した。最終混合物を４塩基
（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）に分けて添加し、４２℃で２分間培
養した。それぞれの試験管に反応終了溶液を添加し、該
試料をゲル状にローディングする前、９５℃で２分間加
熱した。重要な塩基配列に対する最上の分析結果を得る
ことに必要な時間の間、該試料を３５Ｗの一定した電力
で６％アクリルアミドゲルから分離した。実行後ゲルを
１枚の３ＭＭの紙の上に載せて置いて、サラン(Saran)
ラップにかぶせた。それからゲルをバイオーラド(Bio-R
ad)社の真空乾燥機で８０℃で３０分間乾燥し、室温で
コダクＸ−Ｏｍａｔフィルムに一晩中露出させた。マッ
クベクター塩基配列分析プログラム(Mac Vector Sequen
cing Analysis Program)を用いて、その試料の配列を解
読し分析した。 【００３３】（実施例４） ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 放射能プローブの調製 プラスミドＤＮＡを５００ｍｌの３２７個のクローン培
養液から、プロメガ社のマックシ−プレップキット(Max
i-prep kit)を用いて分離した。５０μｇのプラスミド
ＤＮＡをKpn I及びSac I制限酵素で分解することにより
挿入物を分離した。プラスミドＤＮＡを３７℃で２時間
の間Sac Iで分解し、９５％エタノールで一晩中沈殿し
た。それから線形化されたＤＮＡを同一条件下でKpnIで
切断した。全てのＤＮＡ試料を１％のアガロースゲルを
通過させて、その挿入物を低溶解アガロースを用いて分
離した。ゲルから挿入物を分離してから、ゲルを紫外線
照明器で照射し、挿入物の位置を表示した。 【００３４】それから挿入物の陰極側のアガロースゲル
をナイフを用いて切断し、１％の低溶解アガロース溶液
をウィンド(window)に流し注いだ。その挿入物を低溶解
アガロース領域から電気泳動で分離した。低溶解アガロ
ースを切除し、同じ嵩の２ｘ抽出緩衝溶液（４００ｍＭ
塩化ナトリウム／２００ｍＭトリス、ｐＨ７．９／２ｍ
Ｍ ＥＴＤＡ）を添加した。混合物を１５分間６５℃ま
で加熱して、アガロース塊を溶かした。溶けたゲル片ら
を試験管に入れて、同一嵩のフェノール／クロロフォル
ム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加し
た後、クロロフォルム／イソアミルアルコールを添加し
た。 【００３５】エタノールで沈殿させた挿入ＤＮＡを真空
で乾燥し、ｐＨ８．０のＴＥに再懸濁した。分離された
挿入物をアマーシャム(Amersham)社のマルチプライムＤ
ＮＡラベリングキットを用いてラベリングした。一反応
で大略２５μｇのＤＮＡを鋳型に使用した。適当量のＤ
ＮＡに２１μｌの水を添加し（５０μｌの反応で）、該
混合物を５分間熱湯で加熱してから氷で冷却した。鋳型
ＤＮＡを変性させる間反応を始めるし（４μｌのラベル
されないｄＮＴＰｓ／５μｌの反応緩衝溶液／５μｌの
プライマ／２μｌのクレナウ(Klenow)ＤＮＡポリメラー
ゼ／５０μＣｉ［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ、３，０００ｍＣ
ｉ／ｍｌ）上下にピペッティングして徐々に混合した。 【００３６】該反応物を３７℃で３０分間培養し、１０
０μｌのＳＴＥ（１００ｍＭ塩化ナトリウム／１０ｍＭ
トリス、ｐＨ８．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）
を添加し反応を終了させた。ラベルされたＤＮＡを回転
−カラムクロマトグラフィーで分離した。該カラムは、
ベックトン−ディキンソン(Becton-Dickinson)社の１ｍ
ｌの１回用の注射器で制作した。注射器を少量の殺菌グ
ラスウール(glass wool)で塞いでＰ−１０平形のＳＴＥ
で詰めた。注射器を１５ｍｌの遠心分離器チューブに入
れて１分間１，５００ｒｐｍで遠心分離した。充填され
たビードが０．９ｍｌの嵩となるまで、ゲルをかかる方
法により充填した。 【００３７】カラムを１００μｌのＳＴＥで２回洗滌し
た。蓋のないエペンドルフチューブを遠心分離器チュー
ブの底に置いてカラムをチューブに入れた。注射器の針
の先端をエペンドルフチューブの入り口に合わせた。放
射能試料をローディングし、１分間１，５００ｒｐｍで
遠心分離し、ラベルされたプローブから遊離されたヌク
レオチドを分離した。流出物を新しいエペンドルフ試験
管に移して嵩を測定した。カラムを通過する前後の１μ
ｌの試料に対する放射能を測定することにより、ラベル
されたヌクレオチドの結合比率を計算した。ノーザンブ
ロッティング、サザンブロッティング及びｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするために、ラベルされたＤ
ＮＡをプローブに用いた。 【００３８】ファルネシルピロリン酸シンターゼ遺伝子
をクローニングするために、ヒマワリｃＤＮＡライブラ
リーを含むバクテリオファージを備えてスクリーニング
することに用いた。フィルタが２枚用意され、完全に分
離され一致しているプラークが選抜され、挿入断片を配
列決定した。それで、ファルネシルピロリン酸シンター
ゼをコード化する新しい遺伝子を決定した（配列１）。
ヒマワリで１つのＦＰＳをクローニングし、遺伝子銀行
(GenBank)に承認番号ＡＦ０００９３７（ヒマワリＦＰ
Ｓ）に登録した。ＦＡＳＴＡｎ調査は、ヌクレオチド配
列が既に報告された他のＦＰＳ族と似ているというこ
と、即ちタバコＦＰＳの８７％相同性を有するというこ
とを示す。 【００３９】全てのクローニングしたＦＰＳ酵素の調査
で保全されたアミノ酸が表れた。最初５０個のクローン
を制限エンドヌクレアーゼ地図制作(mapping)により分
析し、プライマ部位にベクター塩基配列を用いてｃＤＮ
Ａの両末端から塩基配列データを分析した。長い鎖をイ
ソプレノイド２リン酸であり、ステロール生合成でＤＭ
ＡＰＰをＦＰＰに転換する、ファルネシル化されたタン
パク質であるＦＰＳ酵素をコード化するサン−ＦＰＳ
(ｓｕｎ−ＦＰＳ）ｃＤＮＡをかかるクローンから選択
し特徴づけた。サン−ＦＰＳ１（１３４７ｂｐ）ｃＤＮ
Ａｓは、プレニル転移酵素の特徴を示す典型的なＤＤＸ
ＸＤモチーフ（Ｄ：Ａｓｐ、９３〜９７アミノ酸、２３
２〜２３６アミノ酸、配列２参考）を有する、３４６個
のアミノ酸を含む分子量３１，０００のタンパク質をコ
ード化する。 【００４０】（実施例５） 温度に敏感な酵母変異種を用いた融合タンパク質酵素活
性の分析 ヌクレオチド塩基配列分析を完成した時、タンパク質発
現に対するｐＲＳＥＴ融合タンパク質システムと酵母補
完分析に対するｐＹＥＳ２を用いて発現ベクターを構成
した。ＳＦＰＳタンパク質を過発現させ部分的に精製し
て、生成物の大きさを確認した。これは酵素機能をサッ
カロマイセスセレビジエ(Saccharomycescerevisiae)Ｆ
ＰＳ変異種補完分析により調査した。ｐＧＥＭベクター
でサブクローニングされたＳＦＰＳをコード化するＤＮ
Ａ断片を、ＰＣＲにより一対の変異されたオリゴ（7s-3
CGG GAT CCA TGG CCT CTG ATC TCA AGT C及びBIEN TCG
CGA GGC GAA TTG GGT ACC GGG)を用いて増幅した。 【００４１】ＰＣＲ生成物をｐＧＥＭベクターで更にサ
ブクローニングした。ＬＢ培地で１０個の陽性反応のク
ローンを選択培養した。挿入物をEcoR I分解により確認
した。実際に陽性のクローンを選抜し、冷凍グリセロー
ルストック(stock)を作った。５０μｌ／ｍｌのアンピ
シリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に５０μｌの冷凍ｐＲ
ＳＥＴ−ＳＦＰＳストックを接種し、攪拌器で３７℃で
一晩中培養した。それから全培養液を既に暖ためた５０
０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐに接種した。ＯＤ600値が０．６
〜０．８に達した時、Ｌａｃオペロンが活性化されるよ
うに、２ｍｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。 【００４２】該培養液を更に４時間培養し、１５分間
２，０００ｒｐｍで遠心分離した。それからその上澄を
慎ましく除去した。５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール及び０．２％ＮＰ−
４０を含む１５ｍｌの溶解(Lysis)緩衝溶液に沈殿物を
再懸濁した。細胞懸濁液をブランソン(Branson)社の超
音波器を用いて１０目盛りに対してパワー５で、それぞ
れ３０秒ずつ４回にかけて超音波処理し、３０分間１
２，０００ｒｐｍで遠心分離した。その上澄を回収しア
ミコン(Amicon)社の０．４５μｍろ過器でろ過した。タ
ンパク質抽出物をゲルに通過させることにより、ＳＦＰ
Ｓタンパク質の誘導水準を調査した。 【００４３】本発明では１０％ＰＡＧＥを用いた。ホー
エファ科学(Hoeffer Sci.)のグラディエントメーカー(G
radient maker)を用いて下部ゲルを作った。グラディエ
ントメーカーを１０目盛りに対して３にして磁性攪拌器
の上に載せて置いた。１０％ゲル混合物（２．２ｍｌ水
／２．９ｍｌ ２Ｍトリス緩衝溶液、ｐＨ８．８／２．
６ｍｌ ３０％アクリルアミド／４０μｌ １０％過硫
酸アンモニウム／４０μ２０％ＳＤＳ／７．８ｍｌゲル
溶液に対する１０μｌ ＴＥＭＥＤ）を低濃度チャンバ
ーに入れて、グラディエントメーカーで２０％ゲル溶液
（０．２ｍｌ水／２．９ｍｌ ２Ｍトリス、ｐＨ８．８
／４．６ｍｌ ３０％アクリルアミド／４０μｌ １０
％過硫酸アンモニウム／７．８ｍｌゲル溶液に対する１
０μｌＴＥＭＥＤ）と混合した。 【００４４】ファーマシア(Pharmacia)社の２個の連動
(peristaltic)ポンプで該混合物をバイオーラド(Bio-Ra
d)社のミニゲルカセットに注入した。下部ゲルを室温で
３０分間備えた。２つのサンドイッチになっているスラ
ブの間に、高さがスラブの上から２ｃｍとなるようにゲ
ル溶液を満たした。２２ゲージの針を有する、油を塗っ
た(greased)注射器により、水に飽和されたｎ−ブタノ
ール(Butanol)を板の上にかぶせた。約０．３ｍｌのブ
タノールをゲルの上部に重層した。次の板の他面が異な
るスペーサーに隣接するように繰り返した。しばらく後
でブタノール層が全体表面に均一に形成した。ゲルが重
合される時に、非常に鮮明なブタノールとゲルとの境界
面を見ることができた。 【００４５】下部ゲルを用いる前で、夜間に流し注いで
その表面をパラフィルムで覆った後、室温で貯蔵するこ
とができる。鋳型台(castingstand)を傾いてブタノール
層を流し出した。ゲル表面を２０ｍｌの蒸留水で洗い出
した。それから水に溶解された０．５Ｍトリス−塩酸、
ｐＨ８．８、０．１％ＳＤＳを含む３ｍｌのゲル蓋(ove
rlay)緩衝溶液を添加し、最小限１時間放置して置い
た。ゲル蓋溶液を２２ゲージの針を有する注射器を用い
て除去した。 【００４６】上部にゲル（１．１ｍｌの水／０．４ｍｌ
４ｘ上部トリス／０．１５ｍｌ３０％アクリルアミド
／８μｌ １０％過硫酸アンモニウム／５ｍｌの嵩に対
して３．３μｌＴＥＭＥＤ）を積んでＡＰとＴＥＭＥＤ
を添加する前、その中５ｍｌを積んだゲル表面を洗滌す
ることに用いた。ゲルカセットを数回傾けて、余分のゲ
ル溶液を流した。上部にウェル形成用のくしは、試料が
ウェルにローディングされるまでそのまま残しておい
た。上部にウェル形成用のくしをはずし、２２ゲージの
針を有する１０ｍｌの注射器を用いて、ウェルに貯まっ
ている緩衝溶液を除去した後、すぐそれぞれのウェルを
洗浄した。試料緩衝溶液に溶解されたバイオ−ラド社の
既に染色された低分子量のマーカーと、１０〜１５μｇ
のタンパク質を含有する試料を１％β−メルカプトエタ
ノールと３％ＳＤＳで調製した。 【００４７】それから該試料をローディングする前、６
５℃で１５分間加熱した。適当量の試料をＰＡＧＥロー
ディングチップが付着されたピペットマン(Pipetman)で
ローディングした。ゲルカセットに１０ｍＡの一定した
電流を供給する途中で、染色薬が分離(lower)ゲルに移
動し始まった時に電流を２０〜２５ｍＡに高めた。染色
薬が底から０．５ｃｍ離れた地点に到着する時まで進行
させた。クマシブルー(Coomasie blue)により染色され
たゲルから、ＦＰＳの予想される分子量と相応する３
１，０００Ｄａから過発現された鮮明なタンパク質バン
ドが観察された。タンパク質プロファイルは図１に示し
た。 【００４８】ＦＰＳに対する酵母相補(complementatio
n)分析 サン−ＦＰＳ１が機能性酵素をコード化するかを調査す
るために、信頼性のない変異エルグ(erg)２０−２を有
する、温度に敏感な突然変異体の変種である変異種酵母
(Saccharomyces cerevisiae)変種ＣＣ２５でｃＤＮＡを
発現させた。従って、該変異種は、複製を阻害する温度
（３６℃）では、エルゴステロルに対して栄養要求性で
ある。Bam HIとXho I部位で発現ベクターpYES２-SFPSを
構成した。ＧＡＬ１プロモーターの調節下でヒマワリＦ
ＰＳ１ ｃＤＮＡを有するｐＹＥＳ２−サン−ＦＰＳ１
に変異種酵母を形質転換した。図２の図示のとおり、酵
母変異種のエルゴステロルを栄養要求性を、３６℃でプ
ラスミドｐＹＥＳ２−サン−ＦＰＳ１で補充した。補充
された酵母でＦＰＳ ＤＮＡの存在をＰＣＲ増幅で確認
し、これはこの挿入されたタンパク質が酵母ＦＰＳの酵
素活性を代替し、次の生化学的な段階を復旧できるとい
うことを示す。 【００４９】（実施例６） ＳＦＰＳのプラスミド構成と形質転換 上述のとおり、ＦＰＰは特にステロイド合成とカロチン
合成において、構造上多様なセスキテルフェノイド類の
前駆体であり、イソプレノイド経路の多重分岐点に存在
する。ＦＰＳ ｃＤＮＡの分離と遺伝子の技術は、他の
宿主システムで過発現の影響を実行できるようにする。
生体内のＳＦＰＳ酵素活性を測定し、ステロイド合成ま
たはカロチン合成に対するＦＰＳ過発現の影響を調査す
るために、遺伝子導入タバコ植物を産出するように、ア
グロバクテリウム−ｐＣＩＰ−ＳＦＰＳ二重ベクター(b
inary vector)を構成した。これは生体内の機能性ＳＦ
ＰＳ１であるかを決定するためにも必要なものであり、
実質的な代謝作用において、ヒマワリのその自体で過発
現するものが必要であるので、ＦＰＳ酵素をコード化す
る組換えアグロバクテリウムクローンは、遺伝子導入植
物を産出するために構成された。 【００５０】Ａ．遺伝子導入されたヒマワリファルネシ
ルピロリン酸シンターゼ（ＳＦＰＳ）ダバコの産出 上述のとおり、ＦＰＰは特にステロイド合成とカロチン
合成において、構造上多様なセスキテルフェノイド類の
前駆体であり、イソプレノイド経路の多重分岐点に存在
する。生体内のＳＦＰＳ酵素活性を測定し、対象植物に
対するＦＰＳ過発現の影響を調査するために、遺伝子導
入タバコ植物を産出するように、アグロバクテリウム−
ｐＣＩＰ−ＳＦＰＳ二重ベクターを構成して、遺伝子導
入タバコ植物を産出した。 【００５１】ｐＧＥＭベクターで８５０個の塩基対の挿
入物をＢａｍＨＩとＮｒｕＩで切断し、キアゼン(Qiage
n)社のゲル精製キットを用いて、１％ＴＡＥ−アガロー
スゲルに通過させて精製した。ＢａｍＨＩとＮｒｕＩと
に分解したＰＢＩ１２１と精製した挿入ＤＮＡとを、適
当な緩衝溶液でＤＮＡリガーゼと混合し、１６℃で一晩
中培養した。中間サイズの調製後、制限酵素分解で確認
した陽性のクローン(clone #668)をアグロバクテリウム
形質転換に用いた。ＭＳ−アガー培地で育った野生のタ
バコ植物を収集し殺菌した。アグロバクテリウム変種Ｌ
ＢＡ４４０４をＬＢ（５ｇ塩／Ｌ）で、対数期末期や停
止期初期まで培養した。 【００５２】細胞塊を１０ｍＭの塩化マグネシウム、５
％蔗糖、０．００５％シルウエット(Silwet)Ｌ−７７に
ＯＤ600値が０．８となる時まで再懸濁した。殺菌した
葉っぱをアグロバクテリウム懸濁液に入れて外科用メス
で切った。アグロバクテリウム懸濁液に１５分間入れて
から、葉っぱディスク(disc)を発芽ＭＳ培地（蔗糖、ビ
タミン、ＮＡＡ、０．１ｍｇ／Ｌ及びＢＡ、１ｍｇ／
Ｌ）に移した。２５℃培養器で光のない状態で三日間培
養した後、残存しているアグロバクテリウムを高圧殺菌
した蒸留水で洗滌し、葉っぱディスクを新しいＭＳアガ
ープレート（蔗糖、ビタミン、カルベネシリン、２５０
ｍｇ／Ｌ、ガナマイシン１００ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ、０．
１ｍｇ／Ｌ及びＢＡ、１ｍｇ／Ｌ）に移した。 【００５３】形質転換体選択のために、４週間にかけて
毎週ガナマイシンの量を増加させて全培養した。若芽が
生えた時、それらを新しいＭＳ固定培地（蔗糖、ビタミ
ン、カルベネシリン、２５０ｍｇ／Ｌ及びガナマイシン
２００ｍｇ／Ｌ）に移して２週間放置した。選択された
形質変換体を、根を張る時まで根誘導培地（１／２ＭＳ
及び蔗糖）に移して置いた。３〜４週後に生存した遺伝
子導入タバコ植物を土壌に移し植えて、２７℃温室で栽
培した。 【００５４】Ｂ．遺伝子導入タバコ植物の特徴 他の遺伝子導入タバコ植物に導入されたＳＦＰＳの発現
を確認するために、ゲノムのＤＮＡ試料を精製した。遺
伝子導入タバコ植物からゲノムのＤＮＡを分離するため
に、冷凍−解凍方法を使用した。急冷させた葉っぱを液
体窒素で冷却された擂り鉢とすりこぎで挽いて、きれい
な２５ｍｌのコレックス試験管に移した。溶解緩衝溶液
（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０／１００ｍＭ ＥＤＴＡ
／１００μｇ／ｍｌタンパク質分解酵素(Proteinase)
Ｋ）にＳＤＳを０．５％添加した。該混合物を７０℃で
１５分間培養してから、タンパク質分解酵素Ｋを最終濃
度２００ｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で一晩中
培養した。 【００５５】それから、同一嵩のトリス緩衝溶液−飽和
フェノールを添加してから、同一嵩のクロロフォルム：
イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、１時間の
間ラブクェーク(Lab Quake)で混合した。試料を最高速
度で攪拌し、５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離し
た。その上層を新しい試験管に移し、４００μｌのクロ
ロフォルム：イソアミルアルコールを添加した。軽く攪
拌してから試料を遠心分離し、その上層を新しい試験管
に入れた。ｐＨ８．０の１／１０嵩の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムと２倍嵩の純粋なエタノール（−２０℃）を添加し、
軽く振とうして混合した。それから該試験管を−２０℃
で一晩中培養した。 【００５６】４℃で５分間５，０００ｒｐｍで遠心分離
し、ＤＮＡ塊を得た。遠心分離後、上澄を真空連続抽出
パストゥールピペットで慎ましく除去した。１ｍｌの７
０％エタノール（−２０℃）を添加して洗滌し、遠心分
離して上澄を除去した。その後、余分のエタノールを蒸
発させるために、沈殿物を真空下でサバント(Savant)社
のスピードバック(speed vac)で乾燥した。ＤＮＡを５
０〜１００μｌのＴＥ、ｐＨ８．０（１０ｍＭトリス、
ｐＨ８．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し確認後その量
を決めた。サブクローニングＳＦＰＳ挿入物に対して使
用された同一なオリゴヌクレオチドを非常に厳しい条件
におけるＰＣＲ増幅に対して使用した。遺伝子導入タバ
コ植物の試料から産出したＰＣＲ生成物を７６０塩基対
と１５０塩基対の断片を産出するXba Iに分解した。そ
のような断片を有する選択された遺伝子導入タバコ植物
を更に成長させ、遺伝子タバコ植物における導入された
ＳＦＰＳの発現水準をノーザンブロットで調査した。 【００５７】ノーザンブロット 全体ＲＮＡ試料をシグマ社のトリ(Tri)試薬を用いて精
製した。最後に、その塊をＤＥＰＣ（ジエチルピロカー
ボネート）で処理された４００μｌの蒸留水に再懸濁
し、ベックマンデュ(Beckman Du)８分光光度計で１００
倍希釈液の吸光度を測定しその量を決めた。 【００５８】分解は発生されないことを確認するため
に、それぞれの分離されたＲＮＡ試料から１．５ｇのＲ
ＮＡを含む天然分析ゲル(native analytical gels)で実
行した。それから１０μｇの任意の全体ＲＮＡを含む一
部を電気泳動で分離し、ニトラン(Nytran)膜上に移し
た。蒸留水に浸したニトランにＲＮＡを移し、１５分間
２０Ｘ ＳＳＰＥにびっしょり浸した。移動緩衝溶液で
２０Ｘ ＳＳＰＥを用いて２４時間の間サザン分析に用
いたことと同様な装置で移動を遂行した。１００℃で５
分間ｐＨ８．０の０．０２Ｍトリスでその膜を反応させ
ることにより、移動されたＲＮＡｓのデグリオキシル化
反応を完成した。 【００５９】前記のとおり産出した放射能ＳＦＰＳプロ
ーブを本実験で用いた。プリハイブリダイゼーション、
ハイブリダイゼーション及びＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダ
イゼーション洗滌をＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョンに対し説明したとおり実行した。また、自動Ｘ線撮
影をサザンハイブリダイゼーションのように遂行した。
ノーザンブロット分析結果は、サン−ＦＰＳ１をコード
化するｍＲＮＡが、葉っぱと幹とに高い含量で存在する
ことを示す（図３）。 【００６０】ＦＰＳの過発現は、老齢の植物において、
老化が緩められた結果であり、クロロフィル含量、ルビ
スコ(Rubisco)の相対的な量及びシステインプロテアー
ゼを含む老化遅延に対する数個の要素を調査した。葉っ
ぱの老化は、重要な代謝産物が成長に用いられるために
回復される間、結局細胞の死滅に至る活発に調節される
発生過程であると知られている(Weaver et al,1998)。
光合成作用は、細胞がそれらの構成分及びタンパク質内
容物が除去され、核酸が数個のフォルド(fold)を除去
し、澱粉と脂質が物質代謝されることにより衰退するも
のと観察された。 【００６１】（実施例７） 遺伝子導入タバコ植物を過発現するＳＦＰＳの葉っぱに
おけるクロロフィル含量の測定 遺伝子導入及び非遺伝子導入植物の成長をモニタした
が、遺伝子導入植物のもっと暗い色素形成を除いては、
遺伝子導入及び非遺伝子導入植物の成長に大きい差異は
なかった（図４と図５）。植物抽出物でクロロフィルの
含量を２セットの試料；４週目の遺伝子導入及び非遺伝
子導入タバコの全体植物及び７ヶ月目の遺伝子導入及び
４ヶ月目の非遺伝子導入タバコ植物の３ヶ月目の葉っぱ
を用いて分光光度計で測定した。前記２つの場合に、遺
伝子導入植物は対照群に比して更に暗い色素形成が観察
された。幾日以内に２グループを精密に調査し始めた。
遺伝子導入植物で観察された特徴は、老化の長期遅延で
ある（図６と図７）。図６〜図８に示されたとおり、遺
伝子導入植物は、種子収集時間まで継続して新鮮に維持
されることを示した。新鮮さが一般植物より更に長時間
持続され、余分の葉液の芽と枝の根本から生える若芽
は、正常の優性のため、余分の花とその生産物である種
となった（図８）。 【００６２】このように長く持続される年少は、ＦＰＰ
過生産による高水準のジベレリンの結果であることもあ
る。かかる一部の形態学的な変化等が直接的にジベレリ
ンの集中された過発現の結果である反面、他の変化等は
ジベレリンが豊富な組織に植物栄養分が動員された結果
であることもある。 【００６３】（実施例８） ＳＦＰＳを過発現する遺伝子導入タバコ植物の特徴決定 老化に関連した遺伝子の発現様式 一般的に老化の調節は核によって行われる。老化は多く
の構成成分の一連の退化過程であるがタンパク質合成が
要求される。光合成タンパク質、ＣＡＢ及びルビスコを
コードするｍＲＮＡｓは、老化する間にその多くは衰退
することが知られており（He etal.,1997)、いくつかの
ｍＲＮＡｓ、システインプロテアーゼ、マレートシンタ
ーゼ及びグルタミンシンターゼは、その多くが増加の傾
向を示す(Ding et al,1993;Oh et al.,1997)。遺伝子導
入及び非遺伝子導入タバコ植物で、老齢に対する反応に
おいて、一対の老化関連遺伝子（ＳＡＧｓ）、ルビスコ
及びシステインプロテイズの発現を比較した。 【００６４】しかし、他の方法で標準と異なる個別のＳ
ＡＧｓは部分的に重複されるが、一致しない環境でそれ
らの遺伝子生成物が役割を行うことを暗示する（He et
al,1997)。ノーザンブロット分析のために、２、３、
５、８及び２３週目の遺伝子導入植物と、２、３、５、
８及び１６週目の非遺伝子導入タバコ植物を処理して、
全体ＲＮＡ試料を分離した。末端にラベルされたシステ
インプロテアーゼオリゴをプローブに用いた。ノーザン
分析結果、システインプロテアーゼのｍＲＮＡ水準が非
遺伝子導入植物で、葉っぱの老化に伴って漸次的に増加
した（図９のａ）。 【００６５】しかし、ＳＦＰＳ−遺伝子導入植物は、全
ての試料でシステインプロテアーゼの一定した水準を示
した。図９ｂのとおり、ルビスコの発現水準は、遺伝子
導入植物が２３週まで高く維持されるが、信号は非遺伝
子転換植物で弱く得られる。要約すれば、対照群植物が
記録された結果により確認された反面、ＳＦＰＳを有す
る遺伝子導入タバコ植物は、野生型と比較する時、高い
含量のクロロフィル、高い含量で長く持続されるルビス
コ及びシステインプロテアーゼの一定した水準を示す。
不確実な理由で遺伝子導入タバコ植物は、おそらく過剰
生産されるジベレリンにより、幹と葉っぱで年少が維持
され、正常優性が維持されるし、連続的に葉液の発芽、
多数の花及び多い種子を得る。 【００６６】 【発明の効果】本発明は、ヒマワリ（Helianthus annu
s）の苗から得るヒマワリファルネシルピロリン酸シン
ターゼ(sunflower farnesyl pyrophosphate synthase、
ＳＦＰＳ)をコード化するように分離された、ｃＤＮＡ
ヌクレオチド配列を含む組換え植物発現ベクターと、老
化が遅延(delay)されて、花の発達と種子生産が増加さ
れた遺伝子導入タバコ植物の製造に関する。非遺伝子転
換または対照群ベクターに形質転換されたタバコ植物と
比較する時、二重構造のファルネシルピロリン酸シンタ
ーゼを発現する遺伝子転換植物は、乾燥環境に対する強
い耐性、葉っぱのクロロフィル高含量、種子生産におい
て２倍の増加を示す。 【００６７】図１は、クマシブルーにより染色したゲル
に、大腸菌(Escherichia coli)におけるヒマワリファル
ネシルピロリン酸シンターゼタンパク質の発現様式を示
したもので、それぞれのレーンで１０μｇのタンパク質
をローディングし、１０〜２０％のグラディエントＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離して可
視化するために、クマシブルーで染色した。レーン１は
クロン１；レーン２はクロン２；レーン３はタンパク質
分子量標準物質を示す。過発現したタンパク質のバンド
（分子量３１，０００）を矢印で表示した。 【００６８】図２は、酵母ＣＣ２５変異種におけるＳＦ
ＰＳの構造分析を示す。図３は、遺伝子導入タバコ植物
におけるＳＦＰＳの発現を示したもので、他の遺伝子導
入タバコ植物で全体のＲＮＡ試料等を精製し、32Ｐ−ラ
ンダムプライム(random primed)ＳＦＰＳで試験した。
図４は、４週目の遺伝子転換及び非遺伝子転換タバコの
全体植物を以て行った植物抽出物におけるクロロフィル
の分光光度計の測定結果を示す。図５は、７ヶ月目の遺
伝子転換及び４ヶ月目の非遺伝子導入タバコ植物の３ヶ
月目の葉っぱを以て行った植物抽出物におけるクロロフ
ィルの分光光度計の測定結果を示す。 【００６９】図６は、ＦＰＳ−遺伝子導入タバコ植物と
対照群のタバコ植物とを比較したもので、種子を植えた
後の葉っぱの新鮮さを示したものである。図７は、ＦＰ
Ｓ−遺伝子転換植物と対照群植物の種子を収集したもの
である。図８は、７ヶ月目のＦＰＳ遺伝子導入タバコ植
物と４ヶ月目の対照群タバコ植物を示したもので、土壌
に移して植えてから７ヶ月目のものである。図９は、老
化現象と関連したシステインプロテアーゼとリブロース
−１，５ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ
に対するｍＲＮＡｓの発現パターンを示している。 【００７０】 【配列表】 <110> KOREA KUMHO PETROCHEMICAL CO., LTD. <120> Sunflower Farnesyl Pyrophosphate Synthase-plant vector <130> F06680A1 <160> 2 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 1347 <212> DNA <213> Helianthus annuus <220> <221> CDS <222> (17)..(1039) <400> 1 caacaacaca ccaaca atg gcc tct gat ctc aag tct aaa ttc ctc cac 49 Met Ala Ser Asp Leu Lys Ser Lys Phe Leu His 1 5 10 gtt tat caa act ctc aaa tcc gaa tta ctc aac gat cca gcc ttc gaa 97 Val Tyr Gln Thr Leu Lys Ser Glu Leu Leu Asn Asp Pro Ala Phe Glu 15 20 25 ttc cac cac gat tct cgt caa tgg atc gat aag atg ctt gac tac aac 145 Phe His His Asp Ser Arg Gln Trp Ile Asp Lys Met Leu Asp Tyr Asn 30 35 40 gta ccc gga gga aag ctg aat cgg ggc ctc tct gtt gtt gac agc tac 193 Val Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Ser Tyr 45 50 55 cag tta ctt aaa gga gca gaa ctg act gat gat gag att ttt ctt gca 241 Gln Leu Leu Lys Gly Ala Glu Leu Thr Asp Asp Glu Ile Phe Leu Ala 60 65 70 75 tct gcc ctt ggt tgg tgc att gaa tgg ctt caa gca tac ttt ctt gtg 289 Ser Ala Leu Gly Trp Cys Ile Glu Trp Leu Gln Ala Tyr Phe Leu Val 80 85 90 ctt gat gac atc atg gac ggg tct cat aca cgc aga ggt caa ccc tgt 337 Leu Asp Asp Ile Met Asp Gly Ser His Thr Arg Arg Gly Gln Pro Cys 95 100 105 tgg ttc aga tta ccc aag gtt ggt atg att gct gca aac gat gga ttg 385 Trp Phe Arg Leu Pro Lys Val Gly Met Ile Ala Ala Asn Asp Gly Leu 110 115 120 att ctt cgc aac cat gtc cca aga att ctc aaa aag cat ttt cga gga 433 Ile Leu Arg Asn His Val Pro Arg Ile Leu Lys Lys His Phe Arg Gly 125 130 135 aag ccg tat tat gtg gat cta gtt gac cta ttc aac gag gta gaa ttc 481 Lys Pro Tyr Tyr Val Asp Leu Val Asp Leu Phe Asn Glu Val Glu Phe 140 145 150 155 caa aca gcc tct gga cag atg att gat ttg atc act aca ctt gtt gga 529 Gln Thr Ala Ser Gly Gln Met Ile Asp Leu Ile Thr Thr Leu Val Gly 160 165 170 gaa aaa gat ctc tca aag tat tca ttg tct att cat cgc cgg att gtt 577 Glu Lys Asp Leu Ser Lys Tyr Ser Leu Ser Ile His Arg Arg Ile Val 175 180 185 cag tac aaa acc gct tat tac tca ttt tac ctt cct gtt gct tgt gcg 625 Gln Tyr Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala Cys Ala 190 195 200 ctc ctt atg ttc ggt gag gat ttg gac aat cat gtt gaa gtg aag aat 673 Leu Leu Met Phe Gly Glu Asp Leu Asp Asn His Val Glu Val Lys Asn 205 210 215 gta ctt gta gaa atg ggt acc tat ttt caa gtg cag gac gat tat cta 721 Val Leu Val Glu Met Gly Thr Tyr Phe Gln Val Gln Asp Asp Tyr Leu 220 225 230 235 gac tgt ttt ggt gct ccc gag gta att gga aag att gga aca gac att 769 Asp Cys Phe Gly Ala Pro Glu Val Ile Gly Lys Ile Gly Thr Asp Ile 240 245 250 gaa gac ttt agt tca tgg cta gtt gta aaa gct ttg gaa ctt gcc aat 817 Glu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Val Val Lys Ala Leu Glu Leu Ala Asn 255 260 265 gag gaa caa aag aaa gtc cta cat gaa aat tat gga aaa aaa gac ccc 865 Glu Glu Gln Lys Lys Val Leu His Glu Asn Tyr Gly Lys Lys Asp Pro 270 275 280 tct tcg gtt gca aaa gtg aag gaa cta tac aac act cta aat ctt cag 913 Ser Ser Val Ala Lys Val Lys Glu Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Leu Gln 285 290 295 ggc gta ttt gaa gat tat gag agc cac agt tac aag aag cta atc acg 961 Gly Val Phe Glu Asp Tyr Glu Ser His Ser Tyr Lys Lys Leu Ile Thr 300 305 310 315 tcc att gaa ggt cac cca agc aaa gcc gta caa gca gtg ttg aaa tcg 1009 Ser Ile Glu Gly His Pro Ser Lys Ala Val Gln Ala Val Leu Lys Ser 320 325 330 ttc ttg gga aag ata tac aag agg caa aag t aggtaattta tcctaccaaa 1060 Phe Leu Gly Lys Ile Tyr Lys Arg Gln Lys 335 340 taattttttt gtgtttttac tatgtgtaat aagatttcta cattgtttgt aacaactgtt 1120 ttgtagtttc tggattcgtc gtttttaatg ttctttattg acaatttttt tgagttattt 1180 gttggattac gagtaggtcg aaattttgta atatcaattg ggctagatgg ttagacttta 1240 acattcgtga cgctattttg taatctttcg ggttccagct tcttgctggc ccagtttcta 1300 tatcttgtta tatagaagtt tcgccgttca aaaaaaaaaa aaaaaaa 1347 <210> 2 <211> 341 <212> PRT <213> Helianthus annuus <400> 2 Met Ala Ser Asp Leu Lys Ser Lys Phe Leu His Val Tyr Gln Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ser Glu Leu Leu Asn Asp Pro Ala Phe Glu Phe His His Asp Ser 20 25 30 Arg Gln Trp Ile Asp Lys Met Leu Asp Tyr Asn Val Pro Gly Gly Lys 35 40 45 Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Ser Tyr Gln Leu Leu Lys Gly 50 55 60 Ala Glu Leu Thr Asp Asp Glu Ile Phe Leu Ala Ser Ala Leu Gly Trp 65 70 75 80 Cys Ile Glu Trp Leu Gln Ala Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp Ile Met 85 90 95 Asp Gly Ser His Thr Arg Arg Gly Gln Pro Cys Trp Phe Arg Leu Pro 100 105 110 Lys Val Gly Met Ile Ala Ala Asn Asp Gly Leu Ile Leu Arg Asn His 115 120 125 Val Pro Arg Ile Leu Lys Lys His Phe Arg Gly Lys Pro Tyr Tyr Val 130 135 140 Asp Leu Val Asp Leu Phe Asn Glu Val Glu Phe Gln Thr Ala Ser Gly 145 150 155 160 Gln Met Ile Asp Leu Ile Thr Thr Leu Val Gly Glu Lys Asp Leu Ser 165 170 175 Lys Tyr Ser Leu Ser Ile His Arg Arg Ile Val Gln Tyr Lys Thr Ala 180 185 190 Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala Cys Ala Leu Leu Met Phe Gly 195 200 205 Glu Asp Leu Asp Asn His Val Glu Val Lys Asn Val Leu Val Glu Met 210 215 220 Gly Thr Tyr Phe Gln Val Gln Asp Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Ala 225 230 235 240 Pro Glu Val Ile Gly Lys Ile Gly Thr Asp Ile Glu Asp Phe Ser Ser 245 250 255 Trp Leu Val Val Lys Ala Leu Glu Leu Ala Asn Glu Glu Gln Lys Lys 260 265 270 Val Leu His Glu Asn Tyr Gly Lys Lys Asp Pro Ser Ser Val Ala Lys 275 280 285 Val Lys Glu Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Leu Gln Gly Val Phe Glu Asp 290 295 300 Tyr Glu Ser His Ser Tyr Lys Lys Leu Ile Thr Ser Ile Glu Gly His 305 310 315 320 Pro Ser Lys Ala Val Gln Ala Val Leu Lys Ser Phe Leu Gly Lys Ile 325 330 335 Tyr Lys Arg Gln Lys 340
【図面の簡単な説明】
【図１】 大腸菌(Escherichia coli)におけるヒマワ
リファルネシルピロリン酸シンターゼタンパク質の発現
様式を示した。 【図２】 酵母ＣＣ２５変異種におけるＳＦＰＳの構
造分析を示す。 【図３】 遺伝子導入タバコ植物におけるＳＦＰＳの
発現を示したものである。 【図４】 ４週目の遺伝子転換及び非遺伝子転換タバ
コの全体植物を以て行った植物抽出物におけるクロロフ
ィルの分光光度計の測定結果を示す。 【図５】 ７ヶ月目の遺伝子転換及び４ヶ月目の非遺
伝子導入タバコ植物の３ヶ月目の葉っぱを以て行った植
物抽出物におけるクロロフィルの分光光度計の測定結果
を示す。 【図６】 ＦＰＳ−遺伝子導入タバコ植物と対照群の
タバコ植物とを比較したもので、種子を植えた後の葉っ
ぱの新鮮さを示したものである。 【図７】 ＦＰＳ−遺伝子転換植物と対照群植物の種
子を収集したものである。 【図８】 ７ヶ月目のＦＰＳ遺伝子導入タバコ植物と
４ヶ月目の対照群タバコ植物を示したもので、土壌に移
して植えてから７ヶ月目のものである。 【図９】 老化現象と関連したシステインプロテアー
ゼとリブロース−１，５ビスリン酸カルボキシラーゼ／
オキシゲナーゼに対するｍＲＮＡｓの発現パターンを示
している。
リファルネシルピロリン酸シンターゼタンパク質の発現
様式を示した。 【図２】 酵母ＣＣ２５変異種におけるＳＦＰＳの構
造分析を示す。 【図３】 遺伝子導入タバコ植物におけるＳＦＰＳの
発現を示したものである。 【図４】 ４週目の遺伝子転換及び非遺伝子転換タバ
コの全体植物を以て行った植物抽出物におけるクロロフ
ィルの分光光度計の測定結果を示す。 【図５】 ７ヶ月目の遺伝子転換及び４ヶ月目の非遺
伝子導入タバコ植物の３ヶ月目の葉っぱを以て行った植
物抽出物におけるクロロフィルの分光光度計の測定結果
を示す。 【図６】 ＦＰＳ−遺伝子導入タバコ植物と対照群の
タバコ植物とを比較したもので、種子を植えた後の葉っ
ぱの新鮮さを示したものである。 【図７】 ＦＰＳ−遺伝子転換植物と対照群植物の種
子を収集したものである。 【図８】 ７ヶ月目のＦＰＳ遺伝子導入タバコ植物と
４ヶ月目の対照群タバコ植物を示したもので、土壌に移
して植えてから７ヶ月目のものである。 【図９】 老化現象と関連したシステインプロテアー
ゼとリブロース−１，５ビスリン酸カルボキシラーゼ／
オキシゲナーゼに対するｍＲＮＡｓの発現パターンを示
している。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
9/00 5/00 Ｃ
(72)発明者 吉 賢淑
大韓民国全羅北道▲イク▼山市中央洞58
−１
(72)発明者 鄭 昌昊
大韓民国光州市西區花亭洞572現代アパ
ートメント100−1003
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 核酸構成物とプロモーターを含む組換え
植物発現ベクターをタバコ植物細胞内に導入する段階
と、その細胞を植物に成長させる段階とからなり、 前記の核酸構成物は、配列２のタンパク質をコードす
る、分離されたｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮ
Ａ断片を含み、 前記ｃＤＮＡヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片は、
ヒマワリ(Helianthusannus)の苗から分離したものであ
ることを特徴とする、タバコ植物で、葉っぱにおける老
化の遅延、無性生殖と種子生産、クロロフィル含量を増
加させる方法。
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