KR100356705B1 - 해바라기 파네실 피로인산 신타제 유전자를 갖는 식물벡터와그의 이용방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구조상 다양한 이소프레노이드 생합성 대사산물에 대해 중요한 효소인 해바라기 파네실 피로인산 신타제를 암호화하는 분리된 cDNA의 뉴클레오티드와 펩티드 서열을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 뉴클레오티드서열을 포함하는 재조합 식물 발현벡터와 유전자전환 담배식물을 생산하기 위하여 상기 DNA 서열을 가진 재조합 식물 발현벡터를 도입하는 숙주세포에 대하여 제공한다. 비유전자전환 또는 대조군 벡터로 형질전환된 담배식물과 비교할 때 이종구조의 파네실 피로인산 신타제를 발현하는 유전자전환 식물은 잎의 클로로필 고함량 및 종자 생산에 있어서 2배의 증가를 나타낸다.

Description

해바라기 파네실 피로인산 신타제 유전자를 갖는 식물벡터와 그의 이용방법{Recombinant plant expression vector comprising isolated cDNA nucleotide sequence encoding Farnesyl Pyrophosphate Synthase (FPS) derived from seedlings of sunflower (Helianthus annus)}

본 발명은 해바라기(Helianthus annus)의 파종에서 얻은 해바라기 파네실 피로인산 신타제(sunflower farnesyl pyrophosphate synthase, SFPS)를 암호화하도록 분리된 cDNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 식물 발현벡터와, 노쇠가 지연(delay)되고 종자생산이 증가된 유전자전환 담배식물의 제조에 관한 것이다.

파네실 피로인산 신타제(FPS)는 이소펜테닐 피로인산과 디메틸알릴 피로인산으로부터 파네실 피로인산이 합성되는 반응을 촉매하는 효소이다. 파네실 피로인산(FPP) 신타제는 특히 스테로이드 합성과 카로틴합성에 있어서 스테롤, 카로테노이드 및 프레닐 퀴논과 같은 구조상 다양한 중요 대사산물들에 대한 C15 전구체를 제공하는 이소프레노이드 생합성에서 중요한 효소이다. 이소프레노이드 생합성 경로는 일련의 이소프렌 단위를 포함하는 일차 알코올의 피로인산 에스테르류를 중심으로 이루어진다. C5 분자(DMAPP 및 IPP)로 시작하여, 일련의 C10(GPP), C15(파네실 피로인산), C20(GGPP) 및 더 높은 분자량의 이소프레노이드 피로인산은 신장 사슬의 1'-4'에 이소펜테닐 피로인산이 첨가됨으로써 합성된다. 1'-4' 축합반응은 기질과 생성물의 이중결합 입체화학과 사슬 길이에 대해서 고도로 선택적인 프레닐전이효소족에 의해서 촉매된다. FPP는 특히 스테로이드 합성과 카로틴 합성에 있어서 이소프레노이드 경로의 한 과정에서 발견되며 파이토알렉신과 같은 구조상 다양한 세스퀴테르페노이드류의 전구체이다. 클로로필, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 K, 지베렐린 및 압시진산(abscisic acid)을 포함하는 수천 개의 천연식물 생산물이 이소프레노이드 경로에서 비롯된 것이라고 알려져 있다. 또한 이소펜테닐 피로인산의 고무로의 중합을 포함하는 천연고무 생합성의 마지막 단계에 FPS가 관련되어 있다고 밝혀졌다. 사람{Wilkinet al.,J. Biol. Chem. 1990 265(8): 4607-4614}, 효모{Chambonet al.,Curr. Genet. 1990 18(1): 41-46}, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(Cunilleraet al.,1996 J. Biol. Chem. 271, 7774-7780), 고무나무{Lightet al.,J. Biol. Chem. 1989 264(31): 18598-607} 및 대장균(Fujisakiet al.,J. Bacteriol. 1989 171(10): 5654-5658)을 포함하는 다른 유기체에 존재하는 FPS 유전자가 이미 보고되었다. 이소프레닐화 반응은 수많은 진핵세포 단백질을 막에 효과적으로 결합시키기 위해 필요하나 충분치 않은 유전번역후의 수식반응이다. 포유동물과 효모 세포들에서 이소프레닐화된 단백질의 기능과 적절한 세포내 타겟팅을 위하여 부가적인 수식이 필요하다고 알려졌다. 단백질 프레닐전이효소에 의한 특정 진핵 세포 단백질에 프레닐 그룹 파네실 및 제라닐제라닐의 결합은 신호 변환을 포함하는 많은 세포내 작용들이 기능하기 위하여 필요하다.

단백질 파네실 전이효소(FTase)는 파네실 피로인산(FPP)으로부터 라스(Ras)와 같은 세포내 단백질로, 그들의 카르복시 말단 근처의 시스테인 잔기에서 소수성 파네실 그룹이 이동하는 것을 촉매한다. 이 과정은 원형질막에서 이러한 단백질의 부세포내 위치화를 위하여 필요하고 항암 치료를 위하여 중요한 타겟인 FTase를 만드는 라스의 종양성 변이체들의 형질전환 활성화를 위하여 필요하다. 파네실화 반응은 막 부분과 Ras를 포함하는 여러 단백질들의 작용을 위하여 필요하다. 파네실-단백질 전이효소의 저해제들(FTIs)은 변이된 Ras를 제공하여 암을 치료하기 위하여 Ras 경로를 차단하도록 개발되었다. 따라서 단백질 프레닐화반응의 저해제들은 종양의 화학요법을 위하여 제안되었다{Vitaleet al., Endocrinology 1999 140(2): 698-704; Kohlet al., science 1993 260(5116): 1934-1937}.

해바라기(Helianthus annus)의 파네실 피로인산 신타제(FPS)에 관련된 본 발명의 목적은; (a)한 쌍의 FPS 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하여 해바라기 FPS cDNAs의 서열을 결정하고 증폭하며, (b)세균성 세포에서 FPS cDNAs를 발현하고 그 기능을 확인하기 위하여 효모 변이주에서 기능 상보 분석을 이행하며, (c)생체내 해바라기 파네실 피로인산 신타제(SFPS)의 과발현의 영향을 조사하기 위하여 유전자전환 담배 식물주를 제조하고, (d)유전자전환 식물에서 식물 생장시간에 더 많은 꽃을 생산하고 두배 이상의 종자를 생산하는 것이다.

본 발명은 구조상 다양한 이소프레노이드 생합성 대사산물에 대해 중요한 효소인 해바라기 파네실 피로인산 신타제를 암호화하는 분리된 cDNA의 뉴클레오티드와 펩티드 서열을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 식물 발현벡터와 유전자전환 담배식물을 생산하기 위하여 상기 재조합 식물 발현벡터내의 DNA 서열을 도입하는 숙주세포를 제공한다.

도 1은 쿠마시 블루로 염색된 겔 상에 대장균(Escherichia coli)에서의 해바라기 파네실 피로인산 신타제 단백질의 발현양식을 나타낸 것으로써, 각각의 레인에서 10㎍의 단백질을 로딩하고 10∼20% 그래디언트 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하여 가시화하기 위해 쿠마시 블루로 염색하였다. 레인1은 클론1; 레인2는 클론2; 레인3은 단백질 분자량 표준물질을 나타낸다. 과발현된 단백질의 밴드(분자량 31,000)를 화살표로 표시하였다.

도 2는 효모 CC25 변이주에서의 SFPS의 구조분석을 나타낸 것이다.

도 3은 유전자전환 담배식물에서의 SFPS의 발현을 나타낸 것으로써, 다른 유전자전환 담배 식물에서 전체 RNA 시료들을 정제하고³²P-랜덤 프라임된(random primed) SFPS로 시험하였다.

도 4는 두 세트의 시료; (a) 4주된 유전자전환 및 비유전자전환 담배의 전체 식물과 (b) 7개월된 유전자전환 및 4개월된 비유전자전환 담배식물의 3개월된 잎으로 수행한 식물 추출물에서 클로로필의 분광광도계 측정결과를 나타낸 것이다.

도 5a는 FPS-유전자전환 담배식물과 대조군 담배식물을 비교한 것으로써 종자를 심은 후에 잎의 신선함을 나타낸 것이고, 도 5b는 FPS-유전자전환 식물과 대조군 식물의 종자를 수집한 것이며, 도 5c는 7개월된 FPS-유전자전환 담배식물과 4개월된 대조군 담배식물을 나타낸 것으로써 토양에 옮겨 심은지 7개월된 것이다.

도 6은 노쇠현상과 관련된 시스테인 프로테아제와 리불로오스-1,5 비스인산 카르복실라아제/옥시게나아제에 대한 mRNAs의 발현패턴을 나타낸 것이다.

비유전자전환 또는 대조군 벡터로 형질전환된 담배식물과 비교할 때 파네실 피로인산 신타제를 발현하는 유전자전환 식물은 건조환경에 대한 강한 내성과 잎의 클로로필 고함량, 종자 생산에 있어서 2배로 증가됨을 나타낸다.

식물과 사람에 존재하는 FPS의 아미노산 서열을 비교한 결과 그것들은 높은 상동성을 가지며 5개의 다른 영역이 존재한다는 것이 나타났다. FPS의 기능을 특징화하는 첫 번째 단계에서 FPS cDNA를 클로닝하여 그것이 기능적 FPS를 암호화한다는 것을 밝혔다. 파네실 피로인산 신타제를 암호화하는 해바라기 SFPS(KCTC 0520BP)에 융합시킨 35S 프로모터를 유전자전환 담배 식물(Nicotiana tabacumL.)에 삽입하여 형태학적 변화를 조사하였다. 이러한 구성물은 담배에서 파네실 피로인산을 과잉생산하였다. FPP의 과잉생산은 T_o식물에 있어서, 잎에서의 더 많은 색소형성, 측지 발아, 계속되는 성장 및 잎의 노쇠 지연현상과 그에 따른 꽃의 두배 이상의 증가, 종자 생산의 최소 2배의 증가를 포함하는 등 형태적 및 생리적으로 현저한 변화를 가져왔다. 어떤 기관에서 FPP의 증가된 생산이 식물에서 엽액의 새싹 분열조직, 개화 및 종자 세팅 또는 잎 노쇠와 같은 발육 결과에 영향을 주었는지를 조사하였다.

증진된 식물 성장과 수확은 농작물 과학분야의 가장 중대한 목표로 여겨져 왔다. 성장과 발달이 다른 유전자들과 그 생산물들의 복잡한 상호작용에 의해서 지배되기 때문에 이 목표를 달성하는 것은 쉬운 일이 아니었다. 생합성의 생산능력을 증가시키는 한가지 방법은 재조합 DNA 기술을 응용하는 것이다.

본 발명에서 설명된 기술은 유전자전환 식물에서 농업적 이점을 가져다 줄 것이다. 본 발명은 pFPS의 구성물을 도입하고 뉴클레오티드 서열을 전사하는 식물을 재산출하고 식물 생장길이, 종합적인 종자 산출, 꽃의 수와 클로로필 함량에 있어서 현저한 변화를 나타내는 식물을 선택하는 방법을 포함한다. 재조합 발현 카세트는 아그로박테리움을 사용하거나 또는 유성교배에 의해서 식물 조직으로 주입될 수 있다.

더 나아가 본 발명은 증진된 성장과 발달을 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명은 담배식물에 관련하여 설명하지만, 이 기술은 또한 담배 식물 외의 다른 식물에서의 성장과 발달에도 사용할 수 있다.

[실시예]

다음의 실시예는 본 발명의 특징을 더 자세히 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 한정짓는 것은 아니다.

(실시예1)

cDNA 클로닝

파네실 피로인산 신타제에 대한 유전자를 다음과 같이 분리하였다: 이 연구에서 사용한 모든 화학 제품은 특별히 언급되지 않는 한 시그마사(Sigma)에서 구입한 것이다. 스트라타진사(Stratagene)의 cDNA 합성 키트를 사용하여 해바라기 λgt10 cDNA 라이브러리를 만들기 위하여 파종한지 10일된 잎을 사용하였다. 이 라이브러리를 배양한 다음 대장균 XL1-블루 MRF' 변종으로 증폭하였다. 30%의 글리세롤에서 -90℃로 보관된 스트라타진사의 SOL-R competent 세포를 선택하기 위해 LB/테트라사이클린 평반배지에 배양하고 37℃의 배양기에서 밤새 배양하였다. 0.2%의 말토오즈와 2mM 황산마그네슘을 첨가한 50ml의 살균된 LB배지에서 잘 분리된 단독 콜로니를 접종하였다. 그 다음 37℃에서 교반하면서 밤새 배양하였다(회전 교반기에서 250rpm). 말토오즈에서 자란 세균이 더 능률적으로 λ파지를 흡착한다; 말토오즈는 박테리오파지λ수용체를 암호화하는 유전자(lamB)를 포함하는 말토오즈 오페론을 유도한다. SOL-R 세포의 불안정성 때문에 필요할 때까지 4℃에서 LB배지에 보관하였다. 5ml의 SOL-R 세포를 에펜도프(Eppendorf) 튜브로 옮겨서 초원심분리기에서 최고 속도로 8초 동안 회전하였다. 세포를 2.5ml의 10mM 황산마그네슘에 다시 현탁하여 그들의 밀도를 OD₆₀₀에서 측정하였다. 10⁵pfu의 박테리오파지 cDNA 라이브러리를 0.1ml의 희석된 세균 세포(10⁸세포/ml)가 들어 있는 펠콘사(Falcon)의 튜브에 첨가하여 잠깐동안 교반하였다. 파지 입자들이 세균에 흡착하도록 그 튜브를 37℃에서 20분간 배양하였다. 파지와 세균성 숙주세포를 배양하는 동안 0.7%의 아가로스를 LB에 녹이고 액체 배양기의 온도를 47℃로 맞추었다. 배양 후 용해된 아가로스 8ml을 각각의 튜브에 첨가하여 가볍게 교반하고 NZY 하단 아가(agar) 평판 위에 깔았다. 세균이 고르게 분포되도록 플레이트를 조심스럽게 흔들어주고 최상부 아가로스가 굳도록 10분 동안 방치하였다. 그 다음 플레이트를 37℃ 배양기에 뒤집어 넣은 후 7∼8시간 동안 배양하였다. 7시간 후에 플러크를 확인하고 플레이트 바닥 전체가 세균으로 덮이도록 몇 시간 더 배양하였다. 바닥 전체가 세포로 덮힌 플레이트에 8ml의 AM(10mM 염화나트륨/10mM 황산마그네슘수화물/50mM 트리스, pH 7.5/0.01% 젤라틴)을 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 흔들어 주었다. 그 액체를 튜브에 넣어 4℃에서 3분 동안 2,000rpm으로 원심분리하여 침전물이 생겼다. 그 상등액을 새 튜브에 넣고 50㎕의 DNase와 RNase(각각 10mg/ml)를 첨가하였다. 이 시료를 하룻밤 4℃에서 방치하였다. 같은 부피의 SM에 용해된 2M 염화나트륨과 20% PEG(분자량 8,000)를 첨가하여 교반하고 3시간 동안 얼음에서 배양하였다. 그 다음 튜브를 4℃에서 20분 동안 12,000rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후에 침전물을 염화나트륨과 젤라틴이 없는 500㎕의 SM에 다시 현탁시키고 pH 7.5, 40㎕의 0.5M EDTA와 25㎕의 20% SDS를 첨가하였다. 그 현탁액을 가볍게 흔들어 주고 바이러스가 분해되도록 65℃에서 10분 동안 배양하였다. 그 다음 분해물을 실온까지 냉각시키고 각각의 튜브에 500㎕의 PCI(트리스-포화된 페놀:클로로포름:이소아밀알코올=25:24:1)을 첨가하여 5분 동안 5,000rpm으로 원심분리하였다. 그 상등액을 조심스럽게 새 튜브에 옮긴 후 같은 부피의 클로로포름을 첨가하였다. 5분 동안 5,000rpm으로 원심분리한 후 상등액을 취하여 2M 암모늄아세테이트와 3배의 에탄올과 혼합하였다. -20℃에서 하룻밤 배양하였더니 각각의튜브에서 DNA를 분해할 수 있는 제한효소가 대략 1mg정도 생성되었다.

크기를 기초로 하여 핵산을 분리, 확인하고 정제하기 위하여 다양한 농도의 아가로스겔(0.7∼1.5%)을 사용하여 전기영동을 실행하였다. 수평의 미니 겔 장치(BRL)를 주로 사용하였다. 겔 상자에서 플라스틱 쟁반의 개봉된 양끝을 두 개의 테이프로 봉하고 작업대에 설치하였다. 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에 정확한 양의 아가로스와 1x TAE(40mM 트리스-아세테이트/1mM EDTA, pH 8.0)를 첨가하여 메틀러 저울(Mettler scale)위에 놓고 무게를 측정하였다. 그 다음 그 슬러리를 아가로스의 입자들이 완전히 녹을 때까지 가끔씩 흔들어주면서 전자 레인지에서 가열하였다. 메틀러 저울로 아가로스겔용액의 무게를 다시 재고 물을 첨가하여 원래의 부피로 맞추었다. 적당량의 EtBr(0.5g/ml)을 첨가하고 겔을 플라스틱 쟁반에 바람직한 콤브(comb)로 쏟아 부었다. 겔이 굳은 후에 콤브와 테이프를 제거하였다. 그 다음 쟁반에 약 1mm의 두께로 겔을 덮을 정도로 충분하게 1x TAE을 채웠다. DNA 시료를 65℃에서 5분 동안 가열한 겔 로딩(loading) 완충용액(0.25% 브로모페놀 블루/0.25% 크실렌 시아놀 FF/15% 피콜)과 혼합하고 얼음에서 냉각한 후 자동 피펫으로 로딩하였다. 브로모페놀 블루가 겔의 음극 끝에서 1cm 떨어진 곳에 도착할 때까지 겔에 5V/cm의 전압을 걸어주었다. 그 다음 겔을 포토다인사 (Fotodyne)의 자외선조명기로 조사하고 폴라로이드(ASA 3,000) 고감도 필름을 사용하여 사진을 찍었다.

(실시예 2)

퇴화한(degenerate) 프라이머를 사용한 폴리메라아제 사슬 반응(Polymerase ChainReaction)

PCR 증폭에 사용되었다고 보고된 FPS 서열에 기초한 정(universal) 올리고뉴클레오티드 탐침(probe)을 성숙한 잎의 mRNA로 만든 λZAP cDNA 라이브러리를 사용하여 개발하였다. 파네실 피로인산 신타제의 효소의 증폭에 사용한 퇴화한 프라이머의 서열은 다음과 같다:

프라이머 1: 5'- CAR GCH TWY TTY CTT GTD CTT GAT GAY ATH ATG -3'

프라이머 2: 5'- TKM ACS ACY AWC CAA GAR CAT YTR AAA TC - 3'.

5μM의 프라이머 1과 2, 0.2mM dNTPs, 1.5mM 염화마그네슘, 10mM 트리스, pH 8.3, 50mM 염화칼륨 및 2.5u 태그 폴리메라아제(Taq polymerase)를 포함하는 50㎕의 반응혼합물에 cDNA의 집합소인 라이브러리로부터 추출한 전체 플라스미드 DNA 1g을 첨가하였다. 그 시료의 증발을 최소로 하기 위하여 소량의 살균된 광물성 기름으로 덮었다. 첫 번째는 94℃에서 2분, 50℃에서 1.5분, 72℃까지 3분, 72℃에서 1.5분의 조건으로 실행하였다. 다음 두 번째는 94℃에서 1분, 50℃에서 1.5분, 72℃까지 3분, 72℃에서 1.5분으로 실행하였다. 이러한 전처리 후에, 증폭을 94℃에서 1분, 55℃에서 1.5분, 72℃까지 1.5분, 72℃에서 1.5분으로 32회 실행하였다. PCR 생성물 중 10㎕를 같은 양의 로딩 완충용액과 혼합하고 1% 아가로스겔에서 분리하였다.

(실시예 3)

증폭된 핵산 단편의 뉴클레오티드 염기서열

PCR 생성물의 서브클로닝

블런트 말단을 갖는 단편으로 PCR 생성물을 클로닝하는 것은 그 주형이 태그 폴리메라아제의 말단 전이효소 활성에 독립적이기 때문에 단편의 3'말단에 뉴클레오티드를 부가시키는데 매우 효과적이지 못하였다. dATP에 대한 폴리메라아제의 강한 친화성 때문에 대부분의 경우에 그것은 아데노신이다.

pGEM 플라스미드 DNA는 하룻밤 동안 에코(Eco) RV(NEB)로(10㎍ pGEM DNA/6㎕ 에코 RV 완충용액/10㎍ BSA/20유니트 에코 RV/81㎕ 물) 분해하였다. 분해된 DNA를 -20℃에서 3시간 동안 0.5M의 염화나트륨과 3배 부피의 에탄올(-20℃)에서 원심분리하여 침전시켰다. 침전물을 100㎕의 물에 다시 현탁하고 겔 상에서 완전한 분해물을 확인하였다. 그 다음 분해된 벡터를 프로메가사(Promega)의 태그 폴리메라아제(85㎕ 분해된 벡터/10㎕ 태그 폴리메라아제 완충용액/2㎕ dTTP(100 mM)/3㎕ 태그 폴리메라아제)와 배양하여 그 엑소뉴클레아제 활성으로 3'말단의 돌출부분을 제거하였다. 소량의 광물성 기름을 위에 덮고 그 혼합물을 열순환기(thermal cycler)에서 70℃로 2시간 동안 배양하였다. 그 다음 시료를 2배 부피의 페놀/클로로포름/이소아밀알코올과 혼합하고 5분간 14,000rpm으로 원심분리한 후에 클로로포름 추출을 실행하였다. 그 상등액을 조심스럽게 2배 부피의 에탄올과 혼합하고 -80℃에서 20분 동안 배양하였다. 5분 동안 최고속도로 원심분리하여 그 결과 생성된 침전물을 100㎕의 0.1x TE에 다시 현탁하였다. 그 다음 PCR 생성물을 T-벡터(2.5㎕의 4x 리게이션(Ligation) 완충용액/2㎕의 pGEM T-벡터/1㎕의 PCR 생성물/1㎕의 T4 DNA 리가아제/4.5㎕의 물)과 12℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 4x 리게이션 완충용액은 400mM 트리스, pH 7.5, 80mM DTT, 20mM ATP, 40mM 염화마그네슘, 400㎍/ml BSA를 포함하며 -20에서 보관하였다. 냉동한 DH5-α 적합 세포를 얼음위에서 녹였다. 2㎕의 β-Me, 3㎕의 리가아제 및 50㎕의 DH5α세포를 포함하는 리게이션 혼합물을 준비하고 30분 동안 얼음에서 배양한 후 42℃에서 정확하게 60초동인 가열하였다. 그 시험관을 즉시 얼음에서 2분간 냉각하였다. 450㎕의 LB를 첨가하여 교반기에서 250rpm으로 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 혼합물의 1/4을 X-gal/IPTG/Amp 플레이트에 부어 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

처음에 50개 이상의 클론을 제한 엔도뉴클레아제 지도제작(mapping)에 의해서 분석하고, 프라이머 부위로 벡터 염기서열을 사용하여 cDNA의 양말단으로부터 염기서열 데이터를 분석하였다.

DNA 염기서열

초감김 주형 DNA(3㎍)를 pH 8.0인 18㎕의 TE에 재현탁하였다. 이 시료에 2㎕의 2M 수산화나트륨을 첨가한 후 실온에서 5분간 배양하여 주형 DNA를 변성시켰다. 그리고 나서 pH 7.5인 8㎕의 5M NH₄OAc과 100㎕의 에탄올을 첨가하여 얼음에서 15분간 배양하였다. 변성된 DNA를 모아서 진공하에서 건조하였다. 건조된 DNA를 7㎕의 물에 재현탁하고 1㎕의 프라이머(0.5pmol/㎕)와 2㎕의 5x 시쿼나아제(Sequenase)완충용액과 혼합하였다. 그 혼합물을 65℃에서 2분간 배양하고 실온으로 냉각하였다. 희석한 라벨링 혼합물, DTT, α-[³²P]dATP 및 희석한 시쿼나아제(sequenase)를 첨가하여 실온에서 2분간 배양하였다. 최종 혼합물을 4 염기(A,C,G,T)에 나누어 첨가하고 42℃에서 2분간 배양하였다. 각각의 시험관에반응종료 용액을 첨가하고 그 시료를 겔상에 로딩하기 전에 95℃에서 2분 동안 가열하였다. 중요한 염기서열에 대한 최상의 분석결과를 얻는데 필요한 시간 동안 그 시료를 35W의 일정한 전력으로 6% 아크릴아미드 겔에서 분리하였다. 실행 후 겔을 한 장의 3MM 종이 위에 올려놓고 사란(Saran)랩으로 씌웠다. 그리고 나서 겔을 바이오-라드사(Bio-Rad)의 진공 건조기로 80℃에서 30분 동안 건조하고 실온에서 코닥 X-Omat 필름에 밤새 노출시켰다. 맥벡터 염기서열 분석 프로그램 (MacVector Sequencing Analysis Program)을 사용하여 그 시료의 서열을 해독하고 분석하였다.

(실시예 4)

cDNA 라이브러리의 스크리닝

방사능 탐침의 조제

플라스미드 DNA를 500ml의 327개 클론 배양액에서 프로메가사의 맥시-프레프 키트(Maxi-prep kit)를 이용하여 분리하였다. 50㎍의 플라스미드 DNA를 Kpn I 및 Sac I 제한효소로 분해함으로써 삽입물을 분리하였다. 플라스미드 DNA를 37℃에서 2시간 동안 Sac I로 분해하고 95% 에탄올로 밤새 침전하였다. 그리고 나서 선형화된 DNA를 같은 조건하에서 Kpn I로 절단하였다. 모든 DNA 시료를 1% 아가로스 겔을 통과시키고 그 삽입물을 저용해 아가로스를 사용하여 분리하였다. 겔에서 삽입물을 분리한 후에 겔을 자외선 조명기로 조사하고 삽입물의 위치를 표시하였다. 그 다음 삽입물의 음극 쪽의 아가로스 겔을 칼을 사용하여 절단하고 1%의 저용해 아가로스 용액을 윈도우(window)에 쏟아 부었다. 그 삽입물을 저용해 아가로스 영역에서 전기영동으로 분리하였다. 저용해 아가로스를 절제하고 같은 부피의 2x 추출 완충용액(400mM 염화나트륨/200mM 트리스, pH 7.9/2mM EDTA)을 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 65℃까지 가열하여 아가로스 덩어리를 녹였다. 녹은 겔 조각들을 시험관에 넣고 같은 부피의 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25:24:1)을 첨가한 후 클로로포름/이소아밀알코올을 첨가하였다. 에탄올로 침전시킨 삽입 DNA를 진공에서 건조하고 pH 8.0인 TE에 재현탁하였다. 분리된 삽입물을 아머샴사(Amersham)의 멀티프라임 DNA 라벨링 키트를 사용하여 라벨링하였다. 한 반응에서 대략 25㎍의 DNA를 주형으로 사용하였다. 적당량의 DNA에 21㎕의 물을 첨가하고(50㎕의 반응에서) 그 혼합물을 5분 동안 끓는 물에서 가열한 후 얼음으로 냉각하였다. 주형 DNA를 변성시키는 동안 반응을 시작하고(4㎕의 라벨되지 않은 dNTPs/5㎕의 반응 완충용액/5㎕의 프라이머/2㎕의 클레나우(Klenow) DNA 폴리메라아제/50μCi [α-³²P]dCTP, 3,000 mCi/ml) 위아래로 피펫팅하여 서서히 혼합하였다. 그 반응물을 37℃에서 30분 동안 배양하고 100㎕의 STE(100mM 염화나트륨/10mM 트리스, pH 8.0/1mM EDTA, pH 8.0)를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 라벨된 DNA를 회전-칼럼 크로마토그래피로 분리하였다. 그 칼럼은 벡턴-딕킨슨사(Becton-Dickinson)의 1ml 1회용 주사기로 만들었다. 주사기를 소량의 살균한 글라스 울(glass wool)로 막고 P-10 평형의 STE로 채웠다. 주사기를 15ml의 원심분리기 튜브에 넣어 1분 동안 1,500 rpm으로 원심분리하였다. 충전된 비드가 0.9ml의 부피가 될 때까지 겔을 이러한 방법으로 충전하였다. 칼럼을 100㎕의 STE로 두 번 세척하였다. 마개가 없는 에펜돌프 튜브를 원심분리기 튜브의 바닥에 놓고 칼럼을 튜브에 넣었다. 주사기의 바늘 끝을 에펜돌프 튜브의 입구에 맞추었다. 방사능 시료를 로딩하고 1분 동안 1,500rpm으로 원심분리하여 라벨된 탐침으로부터 유리된 뉴클레오티드를 분리하였다. 유출물을 새 에펜돌프 시험관에 옮겨서 부피를 측정하였다. 칼럼을 통과하기 전과 후의 1㎕의 시료에 대한 방사능을 측정함으로써 라벨된 뉴클레오티드의 결합비율을 계산하였다. 노던 블랏팅, 서던 블랏팅 및 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 라벨된 DNA를 탐침으로 사용하였다.

파네실 피로인산 신타제 유전자를 클로닝하기 위하여, 해바라기 cDNA 라이브러리를 포함하는 박테리오파지를 준비하여 스크리닝하는데 사용하였다. 이중의 여과장치를 준비하여 잘 분리된 부합되는 플러크를 선정하고 삽입물의 염기를 결정하였다. 그리하여 파네실 피로인산 신타제를 암호화하는 새로운 유전자를 결정하였다(서열번호 1). 해바라기에서 하나의 FPS를 클로닝하고 유전자은행(GenBank)에 승인번호 AF000937(해바라기 FPS)로 등록하였다. FASTAn 조사는 뉴클레오티드 서열이 이미 보고된 다른 FPS족과 비슷하다는 것, 즉 담배 FPS의 87% 상동성을 갖는다는 것을 보여준다.

모든 클로닝한 FPS 효소들의 조사로 보전된 아미노산이 나타났다. 처음에 50개의 클론을 제한 엔도뉴클레아제 지도제작(mapping)에 의해서 분석하고 프라이머 부위로 벡터 염기서열을 사용하여 cDNA의 양말단으로부터 염기서열 데이터를 분석하였다. 긴 사슬의 이소프레노이드 이인산이고 스테롤 생합성에서 DMAPP를 FPP로 전환하는, 파네실화된 단백질인 FPS 효소를 암호화하는 선-FPS(sun-FPS) cDNA를이러한 클론들로부터 선택하고 특징지웠다. 선-FPS1 (1347bp) cDNAs는 프레닐전이효소의 특징을 나타내는 전형적인 DDXXD 모티프(D:Asp, 93~97아미노산, 232~236아미노산, 서열번호 2 참고)를 가지는, 346개의 아미노산을 포함하는 분자량 31,000의 단백질을 암호화한다.

(실시예 5)

온도에 민감한 효모 변이주를 이용한 융합 단백질 효소활성의 분석

뉴클레오티드 염기서열 분석을 완성했을 때, 단백질 발현에 대한 pRSET 융합 단백질 시스템과 효모 보완 분석에 대한 pYES2를 이용하여 발현벡터를 구성하였다. SFPS 단백질을 과발현시키고 부분적으로 정제하여 생성물의 크기를 확인하였다. 그것의 효소 기능을 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) FPS 변이주 보완 분석에 의하여 조사하였다. pGEM 벡터에서 서브클로닝된 SFPS를 암호화하는 DNA 단편을 PCR에 의해 한 쌍의 수식된 올리고(7s-3 CGG GAT CCA TGG CCT CTG ATC TCA AGT C 및 BIEN TCG CGA GGC GAA TTG GGT ACC GGG)를 사용하여 증폭하였다. PCR 생성물을 pGEM 벡터로 다시 서브클로닝하였다. LB 배지에서 10개의 양성반응의 클론을 선택하고 배양하였다. 삽입물을 Eco RⅠ분해로 확인하였다. 실제로 양성의 클론을 선발하고 냉동 글리세롤 스톡(stock)을 만들었다. 50㎕/ml의 암피실린을 포함하는 50ml의 LB배지에 50㎕의 냉동 pRSET-SFPS 스톡을 접종하여 교반기에서 37℃로 하룻밤 배양하였다. 그리고 나서 전배양액을 미리 데운 500ml의 LB/Amp에 접종하였다. OD₆₀₀값이 0.6∼0.8에 도달했을 때, Lac 오페론이 활성화되도록2ml의 100mM IPTG를 첨가하였다. 그 배양액을 4시간 더 배양하고 15분 동안 2,000rpm으로 원심분리하였다. 그리고 나서 그 상등액을 조심스럽게 제거하였다. 50mM 트리스, pH 8.0, 5mM EDTA, 10% 글리세롤 및 0.2% NP-40을 포함하는 15ml의 용해(Lysis)완충용액에 침전물을 재현탁하였다. 세포 현탁액을 브랜슨사(Branson)의 초음파기를 사용하여 10눈금에 대해 파워5로 각각 30초씩 4회 초음파로 처리하고 30분 동안 12,000rpm으로 원심분리하였다. 그 상등액을 회수하여 아미콘사 (Amicon)의 0.45㎛ 여과기로 여과하였다. 단백질 추출물을 겔에 통과시킴으로써 SFPS 단백질의 유도수준을 조사하였다.

본 발명에서는 10% PAGE를 사용하였다. 호에퍼과학(Hoeffer Sci.)의 그래디언트 메이커(gradient maker)를 사용하여 하부 겔을 만들었다. 그래디언트 메이커를 10눈금에 대해 3으로 하여 자성 교반기 위에 놓았다. 10% 겔혼합물(2.2ml 물/2.9ml 2M 트리스 완충용액, pH 8.8/2.6ml 30% 아크릴아미드/40㎕ 10% 과황산암모늄/40㎕ 20% SDS/7.8ml 겔 용액에 대한 10㎕ TEMED)을 저농도 챔버에 넣고 그래디언트 메이커에서 20% 겔 용액(0.2ml 물/2.9ml 2M 트리스, pH 8.8/4.6ml 30% 아크릴아미드/40㎕ 10% 과황산암모늄/7.8ml 겔 용액에 대한 10㎕ TEMED)과 혼합하였다. 파머시아사(Pharmacia)의 두 개의 연동(peristaltic) 펌프로 그 혼합물을 바이오-라드사(Bio-Rad)의 미니겔 카세트에 주입하였다. 하부 겔을 실온에서 30분 동안 준비하였다. 두 샌드위치 모양의 판 안에 표면으로부터 높이가 2cm가 되도록 겔 용액을 채웠다. 22개의 게이지바늘을 가진 기름을 바른(greased) 주사기로 물에 포화된 n-버튼(Button)을 판 위에 씌웠다. 천천히 약 0.3ml정도를 겉에 씌웠다.다음 판의 다른 면이 다른 스페이서에 인접하도록 반복하였다. 잠시 후에 부탄올 층을 전체의 표면에 고르게 세팅하였다. 겔이 중합될 때 매우 뚜렷한 부탄올과 겔의 경계면을 볼 수 있었다. 하부 겔을 사용하기 전에 야간에 쏟아 붓고 그 표면을 파라필름으로 덮은 후에 실온에서 저장할 수 있다. 주형대(casting stand)를 기울여서 부탄올 층을 쏟아냈다. 겔의 표면을 20ml의 증류수로 씻어냈다. 그리고 나서 물에 용해된 0.5 M 트리스-염산, pH 8.8, 0.1% SDS를 포함하는 3ml의 겔 덮개(overlay) 완충용액을 첨가하고 최소한 1시간을 방치해두었다. 겔 덮개 용액을 22개의 게이지바늘을 가진 주사기를 사용하여 제거하였다. 상부에 겔(1.1ml의 물/0.4ml 4x 상부 트리스/0.15ml 30% 아크릴아미드/8㎕ 10% 과황산암모늄/5 ml의 부피에 대해 3.3㎕ TEMED)을 쌓고 AP와 TEMED를 첨가하기 전에 그 중 5ml을 쌓인 겔의 표면을 세척하는데 사용하였다. 겔 용액을 몇 시간 기울여서 겔 카세트로부터 쏟아내었다. 상부에 양호하게 형성된 콤브는 시료가 로딩되도록 준비될 때까지 그대로 남겨두었다. 22개의 게이지바늘을 가진 10ml의 주사기를 사용하여 저장기(reservoir)완충용액으로 상부에 양호하게 형성된 콤브를 제거한 후 각각의 웰을 즉시 세척하였다. 시료 완충용액에 용해된 바이오-라드사의 미리 염색된 저분자량의 메이커와 10∼15㎍의 단백질을 함유하는 시료를 1%-메르캅토에탄올과 3% SDS로 적정하였다. 그리고 나서 그 시료를 로딩하기 전에 65℃로 15분 동안 가열하였다. 적당량의 시료를 PAGE 로딩 팁이 부착된 피펫맨(Pipetman)으로 로딩하였다. 겔 카세트에 10mA의 일정한 전류를 공급하다가 염색약이 분석(lower)겔로 이동하기 시작했을 때 전류를 20-25mA로 높였다. 염색약이 바닥에서 0.5cm 떨어진지점에 도착할 때까지 진행시켰다. 쿠마시 블루(Coomasie blue)로 염색된 겔에서 FPS의 예상되는 분자량과 상응하는 31,000Da에서 과발현된 뚜렷한 단백질 밴드가 관찰되었다. 단백질 프로파일은 도 1에 나타나 있다.

FPS에 대한 효모 상보(complementation) 분석

선-FPS1이 기능성 효소를 암호화하는지를 조사하기 위하여, 신뢰성이 없는 변이 에르그(erg)20-2를 가지는 온도에 민감한 돌연변이체의 변종인 변이주 효모(Saccharomyces cerevisiae) 변종 CC25에서 cDNA를 발현하였다. 따라서 이 변이주는 복제를 저해하는 온도(36℃)에서는 에르고스테롤에 대해 영양 요구성이다. Bam HI 과 Xho I 부위에서 발현벡터 pYES2-SFPS를 구성하였다.GAL1프로모터의 조절하에서 해바라기 FPS1 cDNA를 가지는 pYES2-선-FPS1으로 변이주 효모를 형질전환하였다. 도 2에 나타난 것과 같이, 효모 변이주의 에르고스테롤 영양 요구성을 36℃에서 플라스미드 pYES2-선-FPS1로 보충하였다. 보충된 효모에서 FPS DNA의 존재를 PCR 증폭으로 확인하였고 이는 이 삽입된 단백질이 효모 FPS의 효소활성을 대체하고 다음의 생화학적 단계를 복구할 수 있다는 것을 나타낸다.

(실시예 6)

SFPS의 플라스미드 구성과 형질전환

전술한 바와 같이, FPP는 특히 스테로이드 합성과 카로틴 합성에 있어서 구조상 다양한 세스퀴테르페노이드류의 전구체이고 이소프레노이드 경로의 다중분기점에 존재한다.

FPS cDNA의 분리와 유전자의 기술은 다른 숙주시스템에서 과발현의 영향을실행할 수 있게 한다. 생체내 SFPS 효소활성을 측정하고 스테로이드 합성 또는 카로틴 합성에 대한 FPS 과발현의 영향을 조사하기 위하여, 유전자 전환 담배 식물을 산출하도록 아그로박테리움-pCIP-SFPS 이중 벡터를 구성하였다. 이것은 생체내 기능성 SFPS1인지를 결정하기 위해서도 필요한 것이고 실질적인 대사작용에 있어서 해바라기 그 자체에서 과발현하는 것이 필요하므로 FPS 효소를 암호화하는 재조합 아그로박테리움 클론은 유전자전환 식물을 산출하기 위하여 구성되었다.

A. 유전자전환된 해바라기 파네실 피로인산 신타제(SFPS) 담배의 산출

전술한 바와 같이, FPP는 특히 스테로이드 합성과 카로틴 합성에 있어서 구조상 다양한 세스퀴테르페노이드류의 전구체이고 이소프레노이드 경로의 다중분기점에 존재한다. 생체내 SFPS 효소활성을 측정하고 대상 식물에 대한 FPS 과발현의 영향을 조사하기 위하여, 유전자 전환 담배 식물을 산출하도록 아그로박테리움-pCIP-SFPS 이중 벡터를 구성하고 유전자전환 담배식물을 산출하였다. pGEM 벡터에서 850개 염기쌍의 삽입물을 Bam HI과 Nru I으로 절단하고 키아젠사(Qiagen)의 겔 정제 키트를 사용하여 1% TAE-아가로스 겔에 통과시켜서 정제하였다. Bam HI과 Nru I로 분해한 PBI121과 정제한 삽입 DNA를 적당한 완충용액에서 DNA 리가아제와 혼합하여 16℃에서 밤새 배양하였다. 중간크기의 조제 후 제한효소 분해로 확인한 양성의 클론(clone #668)을 아그로박테리움 형질전환에 사용하였다. MS-아가 배지에서 자란 야생의 담배식물을 수집하고 살균하였다. 아그로박테리움 변종 LBA4404을 LB(5g 염/L)에서 대수기 말기나 정지기 초기까지 배양하였다. 세포덩어리를10mM의 염화마그네슘, 5% 자당, 0.005% 실웨트(Silwet) L-77 에 OD₆₀₀값이 0.8이 될 때까지 재현탁하였다. 살균한 잎을 아그로박테리움 현탁액에 넣어 외과용 메스로 잘랐다. 아그로박테리움 현탁액에 15분 동안 넣어둔 후에 잎 디스크(disc)를 발아 MS 배지(자당, 비타민, NAA, 0.1mg/L 및 BA, 1mg/L)로 옮겼다. 25℃ 배양기에서 빛이 없는 상태로 3일 동안 배양한 후에 잔존해 있는 아그로박테리움을 고압살균한 증류수로 세척하고 잎 디스크를 새로운 MS 아가 플레이트(자당, 비타민, 카르베네실린, 250mg/L, 가나마이신 100 mg/L, NAA, 0.1mg/L 및 BA, 1 mg/L)에 옮겼다. 형질전환체 선택을 위하여 4주 동안 매주 가나마이신의 양을 증가시켜 전배양하였다. 새싹이 나왔을 때, 그것들을 새로운 MS 고정 배지(자당, 비타민, 카르베네실린, 250mg/L 및 가나마이신 200mg/L)에 옮겨서 2주 동안 방치하였다. 선택된 형질변환체를 뿌리가 나올 때까지 뿌리 유도 배지(1/2 MS 및 자당)에 옮겨 두었다. 3∼4주 후에 생존한 유전자전환 담배식물을 토양으로 옮겨 심어 27℃ 온실에서 재배하였다.

B. 유전자전환 담배식물의 특징

다른 유전자전환 담배 식물에 도입된 SFPS의 발현을 확인하기 위하여, 게놈의 DNA 시료를 정제하였다. 유전자전환 담배 식물에서 게놈의 DNA를 분리하기 위하여, 냉동-해동 방법을 사용하였다. 급냉시킨 잎들을 액체 질소로 냉각된 막자사발과 막자로 갈아서 깨끗한 25ml의 코렉스 시험관으로 옮겼다. 용해 완충용액(20mM 트리스, pH 8.0/100mM EDTA/100㎍/ml 단백질분해효소(Proteinase)K)에 SDS를 0.5% 첨가하였다. 이 혼합물을 70℃에서 15분 동안 배양한 다음 단백질분해효소 K를 최종농도 200g/ml이 되게 첨가하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양한 후, 같은 부피의 트리스 완충용액-포화된 페놀을 첨가한 후 같은 부피의 클로로포름:이소아밀알코올(24:1)을 첨가하여 1시간 동안 랩 퀘이크(Lab Quake)에서 혼합하였다. 시료를 최고 속도로 교반하고 5분 동안 14,000rpm으로 원심분리하였다. 그 상층을 새로운 시험관에 옮기고 400㎕의 클로로포름:이소아밀알코올을 첨가하였다. 가볍게 교반한 후에, 시료를 원심분리하고 그 상층을 새 시험관에 담았다. pH 8.0인 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨과 두배 부피의 순수한 에탄올(-20℃)을 첨가하여 가볍게 흔들어서 혼합하였다. 그리고 나서 그 시험관을 -20℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 4℃에서 5분 동안 5,000rpm으로 원심분리하여 DNA 덩어리를 얻었다. 원심분리한 후에, 상등액을 진공 연속 추출 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 제거하였다. 1ml의 70% 에탄올(-20℃)을 첨가하여 세척하고 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 그 다음 과다의 에탄올을 증발시키기 위하여 침전물을 진공하에서 사반트사(Savant)의 스피드 백(speed vac)으로 건조하였다. DNA를 50∼100㎕의 TE, pH 8.0(10mM 트리스, pH 8.0/1mM EDTA)에 현탁하여 확인하고 양을 정하였다. 서브클로닝 SFPS 삽입물에 대해 사용된 동일한 올리고뉴클레오티드를 매우 엄격한 조건에서의 PCR 증폭에 대해 사용하였다. 유전자전환 담배식물의 시료로부터 산출한 PCR 생성물을 760 염기쌍과 150 염기쌍의 단편을 산출할 Xba I으로 분해하였다. 그러한 단편을 가지는 선택된 유전자전환 담배식물을 더 성장시키고, 유전자 담배식물에서의 도입된 SFPS의 발현수준을 노던 블랏으로 조사하였다.

노던 블랏

전체 RNA 시료를 시그마사의 트리(Tri) 시약을 사용하여 정제하였다. 마지막으로, 그 덩어리를 DEPC(디에틸피로카보네이트)로 처리된 400㎕의 증류수에 재현탁하고 벡크만 두(Beckman Du) 8 분광광도계로 100배 희석액의 흡광도를 측정하여 양을 정하였다.

분해가 일어나지 않는다는 것을 확인하기 위하여 각각의 분리된 RNA 시료로부터 1.5g의 RNA를 포함하는 천연의 분석 겔을 실행하였다. 그 다음 10㎍의 임의의 전체 RNA를 포함하는 일부를 전기영동으로 분리하고 니트란(Nytran)막 위에 옮겼다. 증류수에 적신 니트란에 RNA를 옮기고 15분 동안 20X SSPE에 흠뻑 적셨다. 이동 완충용액으로써 20X SSPE를 사용하여 24시간 동안 서던 분석에 사용했던 것과 같은 장치에서 이동을 수행하였다. 100℃에서 5분 동안 pH 8.0인 0.02M 트리스에서 그 막을 반응시킴으로써 이동된 RNAs의 데글리옥실화 반응을 완성하였다. 상기에서와 같이 산출한 방사능 SFPS 탐침을 이 실험에서 사용하였다. 프리하이브리디제이션, 하이브리디제이션 및 RNA:DNA 하이브리디제이션 세척을 DNA:DNA 하이브리디제이션에 대해 설명한 바와 같이 실행하였다. 또한 자동X선촬영을 서던 하이브리디제이션과 같이 수행하였다. 노던블랏분석 결과는 선-FPS1을 암호화하는 mRNA가 잎과 줄기에 높은 함량으로 존재한다는 것을 나타낸다(도 3). FPS의 과발현은 노령의 식물들에 있어서 노쇠가 늦춰진 결과이며 클로로필 함량, 루비스코(Rubisco)의 상대적인 양 및 시스테인 프로테아제를 포함하는 노쇠지연에 대한 몇 가지 요소를 조사하였다. 잎 노쇠는 중요한 대사산물이 성장에 사용되기위하여 회복되는 동안 결국 세포 사멸에 이르는 활발하고 조절되는 발생 과정이라고 알려져 있다(Weaveret al, 1998). 광합성 작용은 세포가 그들의 구성분 및 단백질 내용물이 제거되고, 핵산이 수개의 폴드(fold)를 없애고, 전분과 지질이 물질대사 됨에 따라 쇠퇴하는 것으로 관찰되었다.

(실시예 7)

유전자전환 담배식물을 과발현하는 SFPS의 잎에서의 클로로필 함량의 측정

유전자전환 및 비유전자전환 식물의 성장을 모니터하였는데 유전자전환 식물의 더 어두운 색소형성을 제외하고는 유전자전환 및 비유전자전환 식물의 성장에 큰 차이는 없었다(도 4a와 4b). 식물 추출물에서 클로로필의 함량을 두 세트의 시료; 4주된 유전자전환 및 비유전자전환 담배의 전체 식물 및 7개월된 유전자전환 및 4개월된 비유전자전환 담배 식물의 3개월된 잎들을 사용하여 분광광도계로 측정하였다. 두 경우에 유전자전환 식물은 대조군에 비교하여 더 어두운 색소형성이 관찰되었다. 며칠 이내에 두 그룹을 세밀히 조사하기 시작하였다. 유전자전환 식물에서 관찰되는 특징은 노쇠의 장기지연이다(도 5a와 5b). 도 5에 나타난 것처럼 유전자전환 식물은 종자 수집 시간까지 계속 신선하게 유지됨을 나타냈다. 신선함이 일반 식물보다 더 길게 지속되었고, 여분의 엽액의 싹과 가지의 밑동에서 나오는 새싹은 정상의 우성 때문에 여분의 꽃과 그 생산물인 씨앗이 되었다(도 5c). 이렇게 길게 지속되는 연소는 FPP 과생산에 의한 고수준의 지베렐린의 결과일 수 있다. 이러한 일부의 형태학적 변화들이 직접적으로 지베렐린의 집중된 과발현의 결과인 반면에, 다른 변화들은 지베렐린이 풍부한 조직에 식물영양분이 동원된 결과일 수 있다.

(실시예 8)

SFPS를 과발현하는 유전자전환 담배 식물의 특징결정

노쇠와 관련된 유전자의 발현양식

일반적으로 노쇠의 조절은 핵에서 이루어진다. 노쇠는 많은 구성성분의 일련의 퇴화과정이지만 단백질합성이 요구된다. 광합성 단백질, CAB 및 루비스코를 암호화하는 mRNAs는 노쇠하는 동안 많이 쇠퇴하는 것으로 알려져 있고(Heet al.,1997) 몇몇 mRNAs, 시스테인 프로테아제, 말레이트 신타제 및 글루타민 신타제는 많이 증가하는 것으로 나타났다(Dinget al.,1993; Ohet al.,1997). 유전자전환 및 비유전자전환 담배식물에서 노령에 대한 반응에 있어서 한 쌍의 노쇠관련 유전자(SAGs), 루비스코 및 시스테인 프로테이즈의 발현을 비교하였다. 그러나 다른 방법에서 표준과 다른 개별의 SAGs는 부분적으로 중복되나 일치하지 않는 환경에서 그들의 유전자 생성물이 역할을 한다는 것을 암시한다(Heet al.,1997). 노던블랏분석을 위하여, 2, 3, 5, 8 및 23 주된 유전자전환 식물과 2, 3, 5, 8 및 16주된 비유전자전환 담배식물을 처리하여 전체 RNA 시료를 분리하였다. 말단에 라벨된 시스테인 프로테아제 올리고를 탐침으로 사용하였다. 노던분석 결과 시스테인 프로테아제의 mRNA 수준이 비유전자전환 식물에서 잎의 노쇠동안 점차적으로 증가하였다(도 6a). 그러나 SFPS-유전자전환 식물은 모든 시료에서 시스테인 프로테아제의 일정한 수준을 나타냈다. 도 6b에서와 같이, 루비스코의 발현수준은 유전자전환 식물이 23주까지 높게 유지되나 신호는 비유전자전환 식물에서 약하게 얻어진다. 요약하면, 대조군 식물이 기록된 결과로 확인된 반면에 SFPS를 가지는 유전자전환 담배식물은 야생형과 비교할 때 높은 함량의 클로로필, 높은 함량으로 길게 지속되는 루비스코 및 시스테인 프로테아제의 일정한 수준을 나타낸다. 불확실한 이유로 유전자전환 담배식물은 아마도 과잉생산되는 지베렐린에 의해 줄기와 잎에서 연소가 유지되고, 정상우성이 유지되고 연속적으로 엽액의 발아, 다수의 꽃 및 많은 종자를 얻는다.

본 발명은 해바라기(Helianthus annus)의 파종에서 얻은 해바라기 파네실 피로인산 신타제(sunflower farnesyl pyrophosphate synthase, SFPS)를 암호화하는 분리된 cDNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 식물 발현벡터와 노쇠가 지연되고 꽃의 발달과 종자생산이 증가된 유전자전환 담배식물의 제조에 관한 것이다. 비유전자전환 또는 대조군 벡터로 형질전환된 담배식물과 비교할 때 이종구조의 파네실 피로인산 신타제를 발현하는 유전자전환 식물은 건조환경에 대한 강한 내성, 잎의 클로로필 고함량, 종자 생산에 있어서 2배의 증가를 나타낸다.

Claims (17)

1. 핵산구성물과 적당한 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 담배식물세포내에 도입하는 단계와, 그 세포를 식물로 성장시키는 단계로 이루어지며, 상기의 핵산구성물은 서열번호 1의 단백질을 암호화하는 분리된 cDNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 대조식물에 관련된 담배 식물에서 잎에서의 노쇠의 지연, 무성생식과 종자생산, 클로로필 함량을 증가시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 cDNA 뉴클레오티드 서열은 해바라기(Helianthus annus)의 파종으로부터 분리한 것임을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 식물 발현 벡터는 pCIP-sfps(KCTC 0520BP)인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 담배식물은 cDNA 뉴클레오티드 서열에 의해 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 핵산구성물은 서열번호 2의 단백질을 암호화하는 분리된 cDNA 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 담배식물은 cDNA 뉴클레오티드 서열에 의해 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 삭제
7. 제 1항에 있어서, 상기 DNA 서열은 실질상 (아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 바큘로바이러스(baculovirus) 등) 변종, KCTC No. 0520BP에 포함된 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
8. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 세균의 프로모터, 식물 프로모터 및 바이러스 프로모터로 이루어진 그룹에서 선택된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
9. 제 8항에 있어서, 상기 프로모터는 세균 프로모터, 식물 프로모터 및 바이러스 프로모터인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
10. 형질전환된 숙주로 전이되어 복제 가능한 청구항 1의 DNA단편을 포함하는 하이브리드 벡터.
11. 삭제
12. 삭제
13. 청구항 1의 DNA 단편을 제공하는 단계와 숙주세포에 상기 DNA 단편을 전이하여 형질전환된 숙주세포를 생산하는 단계와 상기 SFPS 유전자를 사용하여 파네실 피로인산 신타제의 생산에 적합한 배지에서 상기 형질전환된 숙주를 시험관내 배양하는 단계로 이루어진 시험관내 파네실 피로인산 신타제의 제조방법.
14. 청구항 1의 DNA 단편을 제공하는 단계와 형질전환된 숙주세포에 상기 DNA 단편을 전이하여 형질전환된 숙주세포를 생산하는 단계와 식물에서 꽃과 종자의 생산에 적합한 환경에서 상기 형질전환된 숙주를 배양하는 단계로 이루어진 생체내 파네실 피로인산 신타제의 제조방법.
15. 제 13항에 있어서, 상기 숙주는 식물, 세균, 효모 및 진균류로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 파네실 피로인산 신타제의 제조방법.
16. 제 14항에 있어서, 상기 숙주는 식물인 것을 특징으로 하는 파네실 피로인산 신타제의 제조방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 식물은 담배종, 포아풀과(grass)종 및 다년생 식물종으로 이루어진 그룹에서 선택된 것을 특징으로 하는 파네실 피로인산 신타제의 제조방법.