CN107190015B

CN107190015B - 玉米糖基转移酶基因ufgt2在提高植物体内黄酮含量中的应用

Info

Publication number: CN107190015B
Application number: CN201710562086.0A
Authority: CN
Inventors: 李燕洁; 侯丙凯; 李攀
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2017-07-11
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2037-07-11
Also published as: CN107190015A

Abstract

本发明公开了一种玉米糖基转移酶基因UFGT2在提高植物体内黄酮含量中的应用。其中所述玉米糖基转移酶基因UFGT2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其是通过RT‑PCR技术从玉米中克隆获得。本发明利用基因UFGT2构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。通过检测表明：获得的转基因植物中黄酮含量得到显著提高。预示本发明实施后有望能显著提升作物品质，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产和人类健康具有重大意义。

Description

玉米糖基转移酶基因UFGT2在提高植物体内黄酮含量中的应用

技术领域

本发明涉及一种糖基转移酶基因的应用，尤其涉及一种玉米糖基转移酶基因UFGT2在提高植物体内黄酮含量中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

黄酮类化合物(flavonoids,又称类黄酮)，是植物为适应环境而合成的一大类次生代谢产物，其数量列为天然酚类化合物之首。研究表明，类黄酮在植物体内可以有效清除活性氧自由基，保护植物抵御紫外线伤害。另外，对动物和人而言，类黄酮具有很好的保健价值，适量摄入黄酮类化合物除了可抗衰老之外，还可以减少癌症、肿瘤、心血管疾病、抑郁症的发病率。黄酮类化合物已被我国卫生部批准为新型抗氧化剂。在自然界中,黄酮类化合物大多以糖苷的形式存在，所以黄酮的糖基化修饰对其储存与运输有重要意义。

糖基转移酶是专门负责催化糖基化修饰反应的酶类，它将活性糖基从供体(通常是UDP-glucose)转移到受体分子上。糖基化修饰往往会改变植物分子的生物活性、水溶性、在细胞内和整体植株中的转运特性、亚细胞定位以及与受体的相互识别与结合特性，另外还能降低或消除内源和外源物质的毒性(Lim and Bowles,2004；Bowles et al.,2006；Wang and Hou,2009)。因此，糖基转移酶基因在调节植物细胞代谢平衡、维持植物正常生长发育等方面有重要意义。例如，已有报道糖基转移酶基因参与植物激素平衡调节、植物防御反应、植物次生代谢物合成以及植物信号转导等(Wang and Hou,2009)。但是有关糖基转移酶在提高植物黄酮含量方面的应用却未见报道。

玉米是世界上种植最广的农作物之一，在作为主要的粮食作物的同时，其茎杆也可被加工成饲料饲喂牲畜。如果通过基因工程技术提高玉米中黄酮的含量，将对于提高玉米的营养品质有十分重要的意义。玉米UFGT2是糖基转移酶家族1中的一个成员，目前它的基因序列已公开于核酸序列数据库中，但是经过检索，有关玉米糖基转移酶基因UFGT2在调控黄酮的代谢途径、提高玉米等植物中的黄酮含量方面的应用尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种玉米糖基转移酶基因UFGT2在提高植物体内黄酮含量中的应用。

本发明所述玉米糖基转移酶基因UFGT2在提高植物体内黄酮含量中的应用。

其中：所述玉米糖基转移酶基因UFGT2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述玉米糖基转移酶UFGT2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述植物优选是单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为粮食作物，优选是玉米、水稻或小麦，所述双子叶植物是蔬菜类植物或中药植物。

本发明所述玉米糖基转移酶基因UFGT2是利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物序列，通过RT-PCR技术从玉米中克隆得到。应用该基因构建植物过表达载体，进行转基因操作，可获得转基因植物。通过检测表明：获得的转基因植物中黄酮含量得到显著提高。

本发明的有益效果是：首次证明玉米糖基转移酶基因UFGT2能够提高植物体内的黄酮含量。实验证实，应用本发明所述玉米糖基转移酶基因UFGT2进行植物转基因操作，可以显著提高转基因植物体内的黄酮含量(见附图1、附图2、附图3和附图4)。预示本发明实施后有望能显著提升作物品质，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。

附图说明

图1.UFGT2体外糖基化黄酮化合物的酶促反应。将UFGT2cDNA克隆至PGEX原核表达载体中，转化XL1-blue大肠杆菌，纯化蛋白，进行体外酶促反应。实验结果显示，UFGT2对黄酮类化合物槲皮素、山奈酚有很高的催化活性，能够催化形成黄酮的糖苷。图中UGT89B1作为酶促反应的阳性对照，因为UGT89B1已被证明能够糖基化修饰槲皮素和山奈酚(文献：Limet al.,2004,Biotechnology and Bioengineering)。

图2.玉米ufgt2突变体中黄酮积累量降低。申请人从美国UniformMu突变体库购买了两个UFGT2敲除突变体Mu689和Mu943，分别提取WT和突变体玉米的幼苗、种子中的总黄酮，发现ufgt2突变体中两种主要的黄酮醇(槲皮素、山奈酚)含量是降低的。说明UFGT2基因与黄酮含量有关。

图3.玉米UFGT2基因在转基因拟南芥不同株系中的表达水平。WT为野生型拟南芥对照，OE1,OE2,OE3为转入玉米UFGT2的转基因拟南芥。

图4.UFGT2转基因拟南芥中黄酮积累量升高。其中WT为对照，OE1、OE2和OE3为三个过表达株系。将拟南芥培养至5日龄，收集幼苗，提取总黄酮，用HPLC检测，发现过表达UFGT2的拟南芥中黄酮含量比WT显著增高。并且发现UFGT2在OE2、OE3中表达水平比OE1的高，黄酮含量也是在OE2、OE3中比OE1更高。实验结果表明UFGT2可以提高植物中的黄酮含量。

具体实施方式

实施例1玉米糖基转移酶基因UFGT2的克隆

通过公开网站http://plants.ensembl.org/Zea_mays获得玉米UFGT2基因的cDNA序列。

根据cDNA序列设计引物，正向引物为UFGT2-F:5’-GGATCCATGGCCGAAGGGGACGGTCCA-3’，反向引物为UFGT2-R:5GTCGACTCAAAGAGAAAGTATGTGATCCACC-3’。

利用TRIzol试剂盒提取拟南芥RNA，RT-PCR方法扩增UFGT2基因的全长cDNA序列。将cDNA克隆的过程是先经过BamHI和SacⅠ酶切，之后连入相应酶切的pBluescript II SK(+)克隆载体中，记为pK-UFGT2，通过PCR扩增和BamHI和SacⅠ酶切验证，最后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。

玉米糖基转移酶基因UFGT2的序列信息与特性分析：UFGT2基因的编码区cDNA为1410bp(如SEQ ID No.1所示)，编码469个氨基酸的蛋白(如SEQ ID No.2所示)，C端具有44个氨基酸的PSPG盒，为植物次生代谢物糖基转移酶所共同具有的保守序列。

实施例2玉米糖基转移酶基因UFGT2转入拟南芥获得转基因植物

1.含有UFGT2编码区cDNA表达载体的构建

含有UFGT2编码框的克隆载体pK-UFGT2经过BamHI和SacⅠ双酶切后，获得带有粘性酶切位点末端的全长cDNA序列，将此基因片段与用BamHI和SacI双酶切后的pBI121载体部分相连，得到以CaMV 35S启动子驱动糖基转移酶基因过表达的植物表达载体，称为pBI-UFGT2。

2.农杆菌介导植物转化

农杆菌GV3101具有侵染植物和转移基因的能力，故将构建的pBI-UFGT2植物表达载体转入农杆菌，然后进行PCR验证验证。利用浸花法(一种公开的通用方法)，使含有植物表达载体的农杆菌GV3101浸染拟南芥花蕾。待其长出的角果成熟之后，收集T1代种子并在筛选培养基上进行筛选，将能够正常生长的绿色转化苗移栽至营养土中培养，分别收获其T2代种子再进行下一轮筛选，挑选出绿苗：白苗为3：1的培养皿。将此培养皿上的绿苗移栽，单株收获种子(T3代)。对每一单株的种子部分用于筛选，直到选出在筛选培养基上为全绿的株系，即为纯合转基因株系。

3.过表达转基因植株分子鉴定

对上述拟南芥转基因植株进行基因表达水平的检测。分别提取转基因植株和野生型植株的RNA，进行qRT-PCR扩增，分析过表达植株和野生型植株的基因表达差异。玉米UFGT2在拟南芥过表达植株OE1、OE2、OE3中的表达量都明显高于野生型植株(理论上野生型没有UFGT2的表达)。

利用三个转基因拟南芥株系，来进行后续的分析工作。

实施例3玉米突变体和转基因拟南芥中黄酮含量的分析测定

玉米UFGT2的突变体从美国UniformMu突变体库购买，两个突变株系的编号为Mu689和Mu943。转基因拟南芥为实施例2制备的过表达株系OE1、OE2、OE3。利用这些材料分析玉米UFGT2基因对植物体内黄酮含量的影响。

黄酮的提取方法：主要针对槲皮素和山奈酚两类黄酮醇的含量进行了测定。基本按照参考文献(Ruohe et al.,2012)进行。

(1)称取0.1g样品放入2ml的Eppendorf管中，加入钢珠后经液氮速冻，在研磨仪上研磨1min至粉末；

(2)加入1ml的甲醇充分溶解，在4℃温和旋转提取1h；

(3)4℃，12,000rpm离心10min；

(4)将上清转至新的离心管中，加入1/3体积的蒸馏水，4℃，12,000rpm离心10min，去除叶绿素和油脂；

(5)取100ul上清，加入等体积2N HCl，70℃酸解40min，反应结束后加入100ul100％甲醇以防止苷元的沉降；

(6)4℃，12,000rpm离心15min；

(7)上清直接用于高效液相色谱分析。分析条件为：色谱仪是岛津LC-20AT(Shimadzu，日本)。色谱柱为Ultimate XB-C18(150mm×4.6mm，5μm)反相柱。每个物质峰的检测波长在190-430nm之间。流动相为乙腈和水(均含有0.1％甲酸)，二元高压浓度梯度设置为10％-100％乙腈，流速为1ml/min，洗脱时间为35min，检测波长设置为270nm。

结果和结论：检测结果发现在玉米UFGT2的两个突变体中黄酮含量显著降低(附图2)。而在UFGT2的转基因拟南芥中，黄酮含量都明显提高。并且发现UFGT2的表达水平越高(OE2和OE3比OE1表达水平高)，黄酮含量也越高(OE2、OE3比OE1黄酮含量更高)。

以上这些实验结果表明玉米的UFGT2可以影响植物体内的黄酮含量，通过转移和表达UFGT2基因可以实现在它种植物中提高黄酮的含量。

　　　　　　　　　　　　　　　　　序列表

<110>山东大学

<120>玉米糖基转移酶基因UFGT2在提高植物体内黄酮含量中的应用

<141> 2017-6-29

<160>4

<210> 1

<211> 1410

<212> DNA

<213>人工序列

<221>玉米糖基转移酶基因UFGT2

<222>（1）…（1410）

<400> 1

atggccgaag gggacggtcc aactccagcc cgcggcgctc gcgtcgtgct gttcccactg 60

ccgtcccagg gccacctcag cccgatgctg cacctcgcca gcgcgctcca cgcgcggggg 120

ctcgcagtca ccgtcctcca cacggcgtac aacgcgccgg accccgcgca ccacccgggg 180

ctagccttcg tcgccgtgcc cgacgtcatc ccggaggccg tggcggcgac gacgaatggc 240

atcgcgaaga tcctcgccct gaacgccgcc atggaggcgt cggggcacgt ccgcggcgcg 300

ctcgcgtcgc tcctcgcgga ggaggcgggc ggacagcggc tggcgtgcct catcttcgac 360

tccaccctct tcgccgcgca gaaggccgcg gctggcctcg ggctgcccac gctcgtgctg 420

cacaccggca gcgccgccgg cttccgtctg ttcaggtccg acacctacaa catgctccac 480

gacaggggct atctgccagc cacagagtcc aacctacaca tgccggtaaa ggagctgccg 540

cctctgcaag tgagggacct gttcgaccca agcaagctcc ccaacaagga aatcgtgcag 600

aagatcttgg gtcgcgccac ggagagcacg acgaactcgt ccggcgcaat cctcaacacg 660

tttgaggctc tcgagtcccg cgagctcgag atgatccggg acgaacttgc cgacagaggt 720

atcccaccct tcgccgtcgg cccgcttcac aagctcaccg ccgccccctc caacgatggc 780

gccgacgaga ctagtctact cagccaggac cgcgtctgca tggagtggct agacgcacgg 840

ggccctggct ccgtgctgta cgtgagcttc ggcagtgttg ttcatgtcac cgcggacgag 900

ttggtggaga tcgcgtgggg cttggcgaac agcggcgtgc cgttcctgtt ggtggtccgg 960

cgtggccttg tggtcggagt ggacaagcag gagctcccgg acgggttcat ggcggccgtg 1020

gagggcaggg gcaaggtgat cgagtgggcg ccgcagcagg aggtgctagc tcacccggca 1080

gtcggaggct tctggactca caacggatgg aactccacgc tggagagtat ctatgagggg 1140

gtgcctatgc tgtcgaggcc catctttgga gaccagttgc caacggcaag gtacgtgtgc 1200

gacgtgtgga ggattggagt tttgctggag ggtgtgctgg agcggcggga ggtggagaag 1260

gccatcaaga agctgatgga agaagacgag ggagttggta tcaggggaag agccaaggat 1320

ttgaaggaga aagtgcggat gtgccttgag agcagtgggt cttctcaact tgccgtcgat 1380

aagttggtgg atcacatact ttctctttga 1410

<210> 2

<211> 469

<212> PRT

<213>人工序列

<221>玉米糖基转移酶UFGT2的氨基酸序列

<222>（1）…（469）

<400> 2

Met Ala Glu Gly Asp Gly Pro Thr Pro Ala Arg Gly Ala Arg Val Val Leu Phe Pro Leu

1 5 10 15 20

Pro Ser Gln Gly His Leu Ser Pro Met Leu His Leu Ala Ser Ala Leu His Ala Arg Gly

21 25 30 35 40

Leu Ala Val Thr Val Leu His Thr Ala Tyr Asn Ala Pro Asp Pro Ala His His Pro Gly

41 45 50 55 60

Leu Ala Phe Val Ala Val Pro Asp Val Ile Pro Glu Ala Val Ala Ala Thr Thr Asn Gly

61 65 70 75 80

Ile Ala Lys Ile Leu Ala Leu Asn Ala Ala Met Glu Ala Ser Gly His Val Arg Gly Ala

81 85 90 95 100

Leu Ala Ser Leu Leu Ala Glu Glu Ala Gly Gly Gln Arg Leu Ala Cys Leu Ile Phe Asp

101 105 110 115 120

Ser Thr Leu Phe Ala Ala Gln Lys Ala Ala Ala Gly Leu Gly Leu Pro Thr Leu Val Leu

121 125 130 135 140

His Thr Gly Ser Ala Ala Gly Phe Arg Leu Phe Arg Ser Asp Thr Tyr Asn Met Leu His

141 145 150 155 160

Asp Arg Gly Tyr Leu Pro Ala Thr Glu Ser Asn Leu His Met Pro Val Lys Glu Leu Pro

161 165 170 175 180

Pro Leu Gln Val Arg Asp Leu Phe Asp Pro Ser Lys Leu Pro Asn Lys Glu Ile Val Gln

181 185 190 195 200

Lys Ile Leu Gly Arg Ala Thr Glu Ser Thr Thr Asn Ser Ser Gly Ala Ile Leu Asn Thr

201 205 210 215 220

Phe Glu Ala Leu Glu Ser Arg Glu Leu Glu Met Ile Arg Asp Glu Leu Ala Asp Arg Gly

221 225 230 235 240

Ile Pro Pro Phe Ala Val Gly Pro Leu His Lys Leu Thr Ala Ala Pro Ser Asn Asp Gly

241 245 250 255 260

Ala Asp Glu Thr Ser Leu Leu Ser Gln Asp Arg Val Cys Met Glu Trp Leu Asp Ala Arg

261 265 270 275 280

Gly Pro Gly Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Val Val His Val Thr Ala Asp Glu

281 285 290 295 300

Leu Val Glu Ile Ala Trp Gly Leu Ala Asn Ser Gly Val Pro Phe Leu Leu Val Val Arg

301 305 310 315 320

Arg Gly Leu Val Val Gly Val Asp Lys Gln Glu Leu Pro Asp Gly Phe Met Ala Ala Val

321 325 330 335 340

Glu Gly Arg Gly Lys Val Ile Glu Trp Ala Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Pro Ala

341 345 350 355 360

Val Gly Gly Phe Trp Thr His Asn Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Ile Tyr Glu Gly

361 365 370 375 380

Val Pro Met Leu Ser Arg Pro Ile Phe Gly Asp Gln Leu Pro Thr Ala Arg Tyr Val Cys

381 385 390 395 400

Asp Val Trp Arg Ile Gly Val Leu Leu Glu Gly Val Leu Glu Arg Arg Glu Val Glu Lys

401 405 410 415 420

Ala Ile Lys Lys Leu Met Glu Glu Asp Glu Gly Val Gly Ile Arg Gly Arg Ala Lys Asp

421 425 430 435 440

Leu Lys Glu Lys Val Arg Met Cys Leu Glu Ser Ser Gly Ser Ser Gln Leu Ala Val Asp

441 445 450 455 460

Lys Leu Val Asp His Ile Leu Ser Leu

461 465 469

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<221> UFGT2-F

<222>（1）…（27）

<400> 3

ggatccatgg ccgaagggga cggtcca 27

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列

<221> UFGT2-R

<222>（1）…（31）

<400> 4

gtcgactcaa agagaaagta tgtgatccac c 31

Claims

1.玉米糖基转移酶基因UFGT2在提高植物体内黄酮含量中的应用；

所述玉米糖基转移酶基因UFGT2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物是粮食作物，所述双子叶植物是蔬菜类植物或中药植物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述粮食作物是玉米、水稻或小麦。