JP2011507513A - 藻類由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、「藻類由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質」について2007年12月21日に出願された米国仮特許出願第60/008,752号の出願日の利益を主張する。
本開示は、概してバイオテクノロジー、とりわけ植物特性の遺伝子操作に有用な遺伝子に関する。特定の実施形態において、本開示は、単離および/または精製したポリペプチド、およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2(DGAT2)をコードする核酸、ならびにそれらの使用方法に関する。
油料種子作物は重要な農産物である。植物の種子油は、人の食物に必須の多価不飽和脂肪酸の主要な供給源であり、かつ化学工業にとっての再生可能な原料である。発達中の種子の色素体中にある脂肪酸合成酵素複合体という酵素は、細胞質のアシルCoAプールに導かれる脂肪酸の生合成に関与して、トリアシルグリセロール蓄積を維持する。トリアシルグリセロール(TAG)の生合成は、一次基質としてのグリセロール−3−リン酸および脂肪酸アシルCoAとともに小胞体に位置する。植物の貯蔵脂質の生体集合には、3つのアシル基転移酵素、すなわちグリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT、EC2.3.1.15)、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAT、EC2.3.1.51)、およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT、EC2.3.1.20)がある。これら3つのアシルトランスフェラーゼは、ケネディ経路として一般的に知られる生化学過程である、TAGの形成へのDGATによるsn−1,2−ジアシルグリセロール(DAG)のアシル化という最終工程でグリセロール骨格の段階的なアシル化を触媒する。TAGを生成するためのDGATが介在するグリセロール骨格のアシル化は、植物の脂質蓄積における律速段階と提唱されている。従って、DGATは植物脂質生合成の遺伝子改変における標的である。
本発明者らは、T.シュードナナ(T.pseudonana)のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2(DGAT)と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドの属を本明細書において開示する。これらのポリペプチドを用いて、植物における多価不飽和脂肪酸の量を変えることができる。また、タラシオシラ・シュードナナ(Thalassiosira pseudonana)のDGAT2のジアシルグリセロールトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むポリペプチド、およびDGAT2のジアシルグリセロールトランスフェラーゼ触媒ドメインと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドも開示する。さらに、T.シュードナナのDGAT2と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、およびT.シュードナナのDGAT2のジアシルグリセロールトランスフェラーゼドメインと少なくとも90%の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを記載する。
本明細書において、T.シュードナナの単離および精製した2型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT2)を開示する。他の生物および他の生物由来の細胞の中で超長鎖多価不飽和脂肪酸(VLCPUFA)の合成を改変するこのポリペプチドの驚くべき能力を用いて、所望の脂肪酸組成を有する遺伝子導入植物および植物の種子を産生するために、植物および植物の種子を形質転換する。この開示には、T.シュードナナDGAT2のものと少なくとも90%の配列同一性のアミノ酸配列を有するDGAT2活性を示すポリペプチドが含まれる。特定の実施形態において、これらのポリペプチド配列は、例えば配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、または配列番号13を含む。また、T.シュードナナDGAT2のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ触媒ドメインと少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを開示する。特定の実施形態において、これらのポリペプチド配列は、例えば配列番号15、配列番号:17、または配列番号:19を含む。図2にはT.シュードナナDGAT2のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ触媒ドメインが表されており、それはT.シュードナナDGAT2の完全な開示されているポリペプチド配列におけるアミノ酸残基236〜365からなる。
CaMV カリフラワーモザイクウイルス
cDNA 相補的DNA
CERV カーネーションエッチドリングウイルス
CrDGAT2 クラミドモナス・ラインハーディ2型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
DAG sn−1,2−ジアシルグリセロール
DGAT ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
DGAT2 2型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
DHA ドコサヘキサエン酸
DNA デオキシリボ核酸
EPA エイコサペンタエン酸
GPAT グリセロール3リン酸アシルトランスフェラーゼ
LPAT リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ
OlDGAT2 オストレオコッカス・ルシマリヌス2型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
OtDGAT2 オストレオコッカス・タウリ2型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PtDGAT2 ファエオダクチルム・トリコルヌツ2型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
RNA リボ核酸
RNAi RNA干渉
RT−PCR 逆転写PCR
T35S CaMV35Sターミネーター
TAG トリアシルグリセロール
TLC 薄層クロマトグラフィー
Tmas マンノピン合成ターミネーター
Tnos ノパリン合成ターミネーター
TpDGAT2 T.シュードナナ2型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
TrbcS リブロース2リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット終結領域
VLCPUFA 超長鎖多価不飽和脂肪酸
本開示の種々の実施形態の概説を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提供する。
A.概説
アブラギリおよびトウゴマ由来のDGAT2に関する最近の研究は、独特な脂肪酸を含む植物において、DGAT2は独特な脂肪酸を種子貯蔵油に導くのに重要な役割を担っている可能性があることを示唆している。脂肪種子における植物脂質生合成の遺伝子改変において、DGAT2は潜在的標的になり得ると同時に、最近特徴づけされた前記酵素は、共役脂肪酸であるエレオステアリン酸(アブラギリDGAT2)およびリシノール酸(トウゴマDGAT2)の利用にそれぞれ貢献している。どちらの酵素(アブラギリDGAT2またはトウゴマDGAT2)も、商業的に所望される長鎖オメガ−3多価不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸(EPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)のトリアシルグリセロール(TAG)内への取り込みに関与していない。
NCBIタンパク質データベース等のタンパク質データベースをBLAST等の検索エンジンを用いて検索することによって、全長T.シュードナナDGAT2に相同であるタンパク質を発見することができる。それらは合理的設計によって同定されてもよい。合理的設計の方法は、所望のポリペプチド配列の長さの範囲内で保存的アミノ酸置換を同定すること、および当該コードされるタンパク質においてそれらの置換を引き起こすことを含む。
開示されている実施形態は、天然環境で採取されたゲノム、すなわち、T.シュードナナ、クラミドモナス・ラインハーディ、オストレオコッカス・ルシマリヌス、オストレオコッカス・タウリ、またはファエオダクチルム・トリコルヌツムの天然ゲノムのヌクレオチド配列を含まないと理解すべきである。一部の実施形態は、例えばイオン交換クロマトグラフィー、分子サイズに基づいた排除による、またはアフィニティーによる、または種々の溶媒中の溶解度に基づいた分画法等の分離方法から始めることによって、あるいは増幅、クローニング、およびそれにより当該配列がベクターによって運搬されることが可能となるサブクローニング等の遺伝子操作の方法から始めることによって、単離、精製または部分的に精製することが可能である配列に関する。
DNAの調製、プラスミドの増殖、および単離には、標準的方法および手順を用いた(Sambrook,et al.,1989)。配列決定は、Taq DyeDeoxy(商標)ターミネーターサイクルシークエンシングキット(Applied Biosystems社)を用いて、Applied Biosystems社のモデル373A DNAシークエンシングシステムで行った。当該ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、BLASTプログラムを用いることによって、データバングで入手可能な配列と比較した(Altschul,et al.,1990)。当該技術分野において公知であるように、NCBIのヌクレオチドおよびタンパク質データベースにおける他の脂肪酸ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子とのホモロジーに基づいて、DGAT2クローンを同定した。
DGAT2遺伝子をpYES2.1(Invitrogen社)内に挿入した。当該構築物をシークエンシングによって確認し、出芽酵母サッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)の株H1246MAT−αを形質転換するために、pYES2.1/TpDGAT2を用いた。この変異株は4重の変異体である(DGAT−,PDAT−,ASAT−,ASAT2−)。プラスミドDNAを推定される形質転換体から単離し、pYES2.1/TpDGAT2の存在をサザン解析によって確認した。ベクターのみ(pYES2.1)を含むH1246MAT−α形質転換体をコントロールとして用いた。シロイヌナズナDGAT1で形質転換したH1246MAT−αはポジティブコントロールとして働いた。
Ausubel,et al.(1995)によって記載されているように、酸洗浄したガラスビーズを用いて細胞溶解物を調製した。Bradford(1976)アッセイを用いて酵母溶解物中のタンパク質を測定し、各溶解物中のタンパク質量を標準化し、アリコート(タンパク質250μg)をDGAT2活性についてアッセイした。
S.セレヴィシエ株H1246MAT−αを、シロイヌナズナ/pYES2.1またはT.シュードナナ/pYES2.1で形質転換した。形質転換体を3日間28℃にて培養し、ガラクトースによって誘導した。前記形質転換体を、処理なし(コントロール)、50uM DHAまたは150uM DHAで処理した。AtDGAT1/pYES2.1を含む3つの形質転換体およびTpDGAT2/pYES2.1を含む3つの形質転換体についての脂肪酸プロファイルを、従来のガスクロマトグラフィー分析に基づく表1に示した。
全長DGAT2 cDNAをPCR増幅のための鋳型として用いる。フラグメントを制限エンドヌクレアーゼ消化によって切断し、ベクターの相当する部位にライゲーションする。構築物の完全性を、シークエンシングによって確認する。
配列の各末端に新しい制限部位を提供するために、プライマーとともに、全長DGAT2 cDNAをPCR増幅のための鋳型として用いた。PCRプロファイルは以下のとおりである:94℃1分;94℃30秒,55℃30秒,72℃1分を30サイクル;および72℃5分。その後、PCR産物をPCR2.1ベクター(Invitrogen社)にライゲーションする。フラグメントを切断し、ベクターの相当する部位にライゲーションする。構築物の完全性を、シークエンシングによって確認する。
エレクトロコンピテント・アグロバクテリウム細胞GV3101(pMP90)株を以下のとおりに調製する。アグロバクテリウム培養物を2YT中で24〜48時間増殖させ、600nmにおける吸光度が0.5〜0.7に到達した時点で、細胞を氷上で冷やし、遠心分離(GSAローターで5,000×g,10分,4℃)によって沈殿させる。沈殿物を1、0.5、および0.02容量の冷却した10%滅菌グリセロール中で洗浄し、0.01容量の冷却した10%グリセロールに再懸濁する。その後、当該エレクトロコンピテント細胞を液体N2中で冷凍し、−70℃で保存する。メーカーの使用説明書に従って、20〜50ngの形質転換DNAを用いたエレクトロポレーションによって、前記アグロバクテリウム細胞を形質転換し、選択培地(50μg/mLカナマイシンを含むLB)上にプレーティングし、28℃にて一晩インキュベーションする。形質転換された単一細胞を、50μg/mLカナマイシンおよび25μg/mLゲンタマイシンを含む5mL LB中で一晩増殖させる(28℃,225r.p.m)。DNAの抽出および精製を行う。植物の形質転換前に、構築物の忠実度をDNAシークエンシングによって再チェックする。
シロイヌナズナの種子を16時間・明/8時間・暗の管理の中、蛍光照明(120μE・m−2S−1)の下で22℃にて栽培する。4〜6個の植物を、湿らせたTERRA−LITE REDI−EARTH(W.R.Grace&Co.Canada社,エイジャックス,オンタリオ州,カナダ)中で10cm2植木鉢で育てる。植木鉢中の土壌混合物が接種培地中に落下するのを防ぐために、土壌をプラットホームのように積み上げて種子を頂上に植え付け、植木鉢全体をナイロン製のウィンドウスクリーンで覆い、ゴム製のバンドで固定する。最初の花が開花し始めた時点で、アグロバクテリウム懸濁液中で植物を減圧浸潤する。
形質転換は基本的に、Moloney,et al.,1989,Plant Cell Reports 8:238−242によって記載されているように実施する。
各構築物に対して、種子を大量に収穫する。種子を20%漂白剤および0.01%Triton X−100を含む溶液中に種子を20分間浸すことによって表面滅菌し、その後滅菌水で3回洗浄する。滅菌した種子を、滅菌した0.1%Phytagar(500〜1,000個の種子につき約1mLのPhytagar)中に室温にて再懸濁し、および150×15mmのカナマイシン選択プレート上に2,000〜4,000個の種子を含む容量を塗布することによってプレーティングする。プレートを照明をつけずに寒い中で2日間インキュベーションし、7〜10日間制御された環境の中で(16時間・明/8時間・暗の管理の中、蛍光照明(120μE・m−2S−1)の下で22℃にて)栽培する。選択培地は、1/2MSG培地、0.8%Phytagar、3%スクロース、50μg/mLカナマイシン、および50μg/mLチメンチンを含む。ペトリプレートおよび蓋を、Micropore(商標)外科用テープ(3M カナダ,ロンドン,ON,カナダ)で密封する。7〜10日後、緑葉を有し、かつ培地中で根をしっかりと定着させている薬剤耐性植物を形質転換体として同定し、葉3〜5枚の段階で、選択された形質転換体を非常に湿らせた土壌混合物で満たした湿地の中に移植する。形質転換体を成熟させ、成熟した種子(Katavic,et al.(1994)で定義されているT2世代)を個々の植物から収穫し、さらに分析する。
Claims (19)
- 配列番号:15と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む単離または精製したポリペプチド。
- 配列番号:1と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1に記載の単離または精製したポリペプチド。
- ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項1に記載の単離または精製したポリペプチド。
- 請求項1に記載の単離または精製したポリペプチドをコードする、単離または精製した核酸配列。
- ベクター内に存在する、請求項4に記載の核酸配列。
- 請求項4に記載の核酸配列を含む遺伝子導入植物。
- 前記核酸配列を欠いている植物における量と比較して、種子中の多価不飽和脂肪酸の量が変化している、請求項4に記載の核酸配列を含む遺伝子導入植物。
- 前記植物中の脂肪酸が約70%以上の多価不飽和脂肪酸である、請求項4に記載の核酸配列を含む遺伝子導入植物。
- 請求項4に記載の核酸配列で形質転換した酵母細胞。
- 配列番号:1、15、25、27、28、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、および61からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を植物内に導入する段階を含む、植物における超長鎖多価不飽和脂肪酸の量を変化させる方法。
- アグロバクテリウム(Agrobacterium)を介した形質転換によって前記植物内に核酸構築物を導入する、請求項10に記載の方法。
- Brusicaピルビン酸脱水素酵素キナーゼ活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記植物内に導入する段階をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- グリセロール−3−リン酸脱水素酵素活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記植物が、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ボリジ種(Borago spp.)、カノーラ(Canola)、リキヌス種(Ricinus spp.)、テオブロマ種(Theobroma spp.)、トウモロコシ種(Zea spp.)、ゴシッピウム種(Gossypium spp.)、ハマナ種(Crambe spp.)、クフェア種(Cuphea spp.)、アマ種(Linum spp.)、レスクェレラ種(Lesquerella spp.)、リムナンテス種(Limnanthes spp.)、リノーラ(Linola)、ノウゼンハレン種(Tropaeolum spp.)、マツヨイグサ種(Oenothera spp.)、オリーブ種(Olea spp.)、アブラヤシ種(Elaeis spp.)、ラッカセイ種(Arachis spp.)、ナタネ(rapeseed)、ベニバナ種(Carthamus spp.)、ダイズ種(Glycine spp.)、ソヤ種(SoJa spp.)、ヒマワリ種(Helianthus spp.)、タバコ種(Nicotiana spp.)、ベルノニア種(Vernonia spp.)、コムギ種(Triticum spp.)、オオムギ種(Hordeum spp.)、オリザ種(Oryza spp.)、カラスムギ種(Avena spp.)、モロコシ種(Sorghum spp.)、ライムギ種(Secale spp.)、アブラナ(Brassicaceae)、およびイネ科(Gramineae)植物ファミリーの他のメンバーからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 請求項10に記載の方法によって産生した植物。
- 請求項10に記載の方法によって産生した前記植物から収穫した種子。
- 請求項10に記載の方法によって産生した前記植物から抽出した油。
- 前記核酸構築物を含む植物から種子を収穫する段階、および前記収穫した種子から油を抽出する段階をさらに含む、請求項10に記載の方法。
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