CN102321642A - 莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5及其编码蛋白与应用，所述莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5是以JGI莱茵衣藻基因数据库公布的au.g4218_t1基因为模板进行扩增cDNA获得，其序列如SEQ ID NO：1所示的核苷酸；其编码蛋白是根据其碱基序列分析而推测编码CrDGAT2-5蛋白质序列，其序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列的蛋白质；将该基因运用于莱茵衣藻进行植物表达可以显著提高莱茵衣藻中中性脂含量和生物量。本发明以JGI莱茵衣藻基因数据库公布的au.g4218_t1基因为模板进行扩增cDNA获得莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5，运用于莱茵衣藻中可以显著提高中性脂含量和生物量，对提高微藻含油量以及品质具有重要意义。

Description

莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属微生物技术领域，涉及一种能显著提高藻类中性脂含量的基因及其编码蛋白与应用，特别涉及一种能显著提高莱茵衣藻中性脂含量的莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5及其编码蛋白与应用。

背景技术

随着石油等化石燃料不可再生资源储量日益减少，全世界各国都在寻求可持续发展的新能源。目前化石燃料的替代能源主要形式是：燃料乙醇和生物柴油。生物柴油由于具备来源广泛，成本低等优点，已经成为目前最有希望解决未来石油能源危机的可再生能源之一。

目前，制备生物柴油的原料有餐饮废弃油、动物油脂、各种油料作物和微藻。餐饮废弃油来源有限；生产动物油脂成本高、周期长；植物油脂的生产又受到生产地域、季节周期等条件的制约，且大量种植油料作物用于生产生物柴油将会占用大量耕地和水资源同时将导致粮油作物价格上涨。微藻作为原料生产生物柴油具有极大的优势：种类多，来源广泛、油脂成分可以直接生产生物柴油、吸收CO₂有利于坏境改善、利用光能转化为化学能的效率高、油脂含量高、繁殖迅速、只需荒地，不会与粮食生产争水争地、培养简单易于大规模培养，因此以微藻为原料生产生物柴油已成为不可阻挡的趋势。

用于生产生物柴油的理想的藻株要求具备生长迅速、含油量高且脂肪酸组成适宜制备生物柴油等特点。目前微藻有三种选育方式：直接从种质库中筛选、人工诱变和利用生物基因工程与生物代谢工程人工制造工程藻株。前两种方法费时费力且随机性较强，第三种方法则最简单最直接，可以快速完善理想的工程藻株来满足各种生产需求。随着分子生物学的发展，从分子水平揭示微藻油脂，主要是中性脂三酰甘油(TAG)的合成和代谢机理，改良藻种，控制微藻的代谢产物流向，已成为利用微藻制备生物柴油研究的重点。

迄今，微藻TAG的合成和代谢分子机理研究还很薄弱，只有少量莱茵衣藻油脂体的分离以及油脂体中蛋白质分离的零星报道，对微藻中TAG的形成和积累网络途径相关基因的功能了解甚微。二酰基甘油酰基转移酶(Diacylgycerol acyltransferase，DGAT)是TAG合成中的关键酶，作用是催化二酰甘油加上脂肪酸酰基形成三酰甘油。目前对高等植物的研究表明DGAT基因活性增强时可以提高9％-12％的油脂含量。DGAT有四种类型：DGAT1，DGAT2，WS/DGAT和细胞质内DGAT(Cytosolic DGAT)，在微藻中尚无DGAT基因家族的报道。对其它物种脂质合成途径和代谢过程研究表明对微藻的DGAT基因的深入研究对提高微藻含油量以及品质具有重要意义，尤其是近年来新兴的比较基因组学以及莱茵衣藻基因组测序的完成均为莱茵衣藻的TAG代谢途径相关候选基因的研究提供了可能性。

发明内容

本发明的目的是提供一种能显著提高藻类中性脂含量和生物量的莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5及其编码蛋白与应用。

本发明所提供的能提高藻类中性脂含量和生物量的莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5(Chlamydomonas reinhardtii Diacylgycerolacyltransferase2-5)是以JGI莱茵衣藻基因数据库公布的au.g4218_t1基因为模板设计特异性引物，扩增cDNA获得，其序列如SEQ ID NO：1所示的核苷酸，该基因来源于莱茵衣藻，在JGI莱茵衣藻基因数据库的名称为au.g4218_t1，位于12号染色体8831356-8833893区域，含7个外显子。对其研究发现该基因可以显著提高莱茵衣藻中中性脂含量和生物量。

上述莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5，根据其碱基序列分析而推测编码CrDGAT2-5(Diacylgycerol acyltransferase2-5)蛋白质序列，其序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列的蛋白质，蛋白ID为285889，是由320个氨基酸残基组成的蛋白质。

一种蛋白质，是将SEQ ID NO：2所示的蛋白质序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

一种DNA序列，是将莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5经PCR扩增而得到，其序列如SEQ ID NO：3所示，与SEQ ID NO：1所示的核苷酸具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及至少有15个核苷酸与由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或其互补链组成的DNA互补的DNA均属本发明的保护范围。

采用任何一种引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5转入藻类导致中性脂含量和生物量增加，在微藻中将此基因敲除(或沉默)后中性脂含量降低。如通过电转化法转化莱茵衣藻，得到纯合的CrDGAT2-5转化子(即为CrDGAT2-5过量表达的单拷贝纯合莱茵衣藻)。为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入了植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。用于转化的生物可以是细菌细胞，动物细胞和植物。

一旦获得一种转化植物，其中已将本发明的DNA导入了基因组，就可能通过无性或有性繁殖获得后代，或者从该植株及其后代通过克隆获得繁殖材料来生产植物。用本发明DNA转化的植物细胞，包含这些细胞的植物体，该植物后代和克隆后代，以及所有从该植物获得的繁殖材料都属于本发明中。

本发明的基因可以用于制备该基因的重组蛋白。

重组蛋白常如下制备：将编码本发明蛋白的DNA插入适当的表达载体，将该载体导入适当的细胞，培养转化的细胞，为使这些细胞表达所述重组蛋白和纯化所表达的蛋白。重组蛋白可表达为与便于纯化的其他蛋白融合的蛋白，如与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的蛋白。对宿主细胞没有限制，只要该细胞适于表达所述重组蛋白。

所得重组蛋白可用于制备与该蛋白结合的抗体。例如用本发明的纯化重组蛋白或一部分免疫动物(如兔)，一段时间后采血，从而制备多克隆抗体。得到的抗体可用于检测或纯化本发明的蛋白和能与本发明蛋白互作的蛋白。相应的本发明包括能结合本发明蛋白的抗体。

本发明以JGI莱茵衣藻基因数据库公布的au.g4218_t1基因序列为模板进行扩增cDNA获得莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5，运用于莱茵衣藻中可以显著提高中性脂含量和生物量，对提高微藻含油量以及品质具有重要意义。

附图说明

图1为CrDGAT2-5的RT-PCR扩增结果。M：DL2000 DNA分子量标准；1：CrDGAT2-5扩增结果；

图2为CrDGAT2-5过量表达转化子生物量的变化情况。

图3为CrDGAT2-5过量表达转化子中性脂含量的变化情况。

图4为原始藻株组、pCAMBIA1302空载体组、pCAMBIA1302-CrDGAT2-5转化组第六天时尼罗红染色后荧光观察图；

图5CrDGAT2-5干涉藻株的生物量及中性脂含量变化图。A)六组转化子生物量的变化情况。B)六组转化子中性脂含量的变化情况。

图6为Maa7/XIR空载体转化子和CrDGAT2-5干涉藻株尼罗红染色后荧光观察图。

图7CrDGAT2-5基因在莱茵衣藻CC425中的亚细胞定位。

图8CrDGAT2-5基因在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位。

图9诱导的GST-CrDGAT2-5融合重组蛋白电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。Marker均购自大连宝生物公司。下述实施例中，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例一：CrDGAT2-5的克隆

1、莱茵衣藻总RNA的提取

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻株CC425，培养于24℃光照培养箱，100μmol m^-2sec^-1白光，全光照条件下，待生长至对数生长期，取藻液50mL，10000r/min离心1min收集藻体，液氮速冻后碾磨成粉末，按照Trizol的方法提取总RNA。

2、引物设计

根据JGI Chlamydomonas database上公布的au.g4218_t1基因序列为模板，设计如下特异性引物，进行PCR扩增：

CrDGAT2-5全长扩增引物    引物序列(5’→3’)

             正向引物    ATGGCCTCTTACTTCCCCGGC

             反向引物    TCATTGCACGATGGCCAGCGG

3、cDNA的合成

按照宝生物工程(大连)有限公司提供的Takara的试剂盒，使RNA反转录成cDNA。

4、制备PCR Master混合物

5、进行PCR扩

94℃ 5min；35个循环：94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min；72℃ 10min。

取8μL进行1％琼脂糖凝胶电泳分析结果如图1，-20℃保存。

6、PCR产物的纯化和胶回收

按照上海华舜生物工程有限公司的小量胶回收试剂盒回收DNA片断，PCR产物连接到pGEM-T Vector(promega公司)，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序。

7、CrDGAT2-5基因生物信息学分析

来源于莱茵衣藻的CrDGAT2-5推测的蛋白质含有320个氨基酸，经ExPASy数据库中蛋白质软件(http://expasy.org/tools/)分析其分子量为35kD，等电点为9.27，为一种疏水蛋白质。

实施例二：过量表达CrDGAT2-5基因的转化子获得

1、植物双元表达载体的构建

设计带有NcoI和Spe I酶切位点的引物(正向：

5’-AGAACCATGGCAGGTGGAAAGTCAA  ACGG-3’；反向：

5’-CATAACTAGTCTACTCGATGGACAGCGGG-3’)，PCR扩增CrDGAT2-5基因全长。NcoI和Spe I双酶切修饰后的CrDGAT2-5产物和pCAMBIA1302的NcoI和Spe I双酶切载体大片段进行连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定阳性克隆，提取质粒进行双酶切鉴定。提取正确的重组表达质粒pCAMBIA1302-CrDGAT2-5，用于转化。

2、过量表达CrDGAT2-5莱茵衣藻转化子的获得(电转化法)

莱茵衣藻(藻株CC425，购自中国科学院水生生物研究所)，培养于24℃光照培养箱，100μmol m^-2sec^-1白光，全光照条件下，待生长至藻细胞数为2×10⁷个/mL；2000rpm离心5min，收集藻细胞；无菌去离子水洗涤沉淀并重复3次，用含60mM蔗糖的TAP液体培养基(2.42g/L Tris-base+1ml/L冰醋酸+119mg/L K₂HPO₄+61mg/LKH₂PO₄+0.4g/L NH₄Cl+0.1g/LMgSO₄·7H₂O+50mg/LCaCl₂·2H₂O+1ml/LTrace)重悬沉淀；冰浴10min；取藻液加入重组质粒，混匀后转移至电击杯中，室温静置5min；1.5kV，10μF，200Ω，6msec条件下电击，室温静置10min，加入5mL TAP液体培养基，22℃，100rpm，昏暗光线复苏8h；2000rpm，离心5min，收集藻细胞，调节藻细胞数目到1×10⁶个/mL；转移藻液至含1.5mM L-色氨酸、5μg/mLL-paromomycin的TAP固体选择培养基上，缓慢倾斜旋转，使藻液分布均匀；关闭光源，吹干，24℃光照培养箱，100μmol m^-2sec^-1白光，全光照条件下培养至形成单个藻落。

3、对照莱茵衣藻的获得

用pCMBIA1302代替pCMBIA1302-CrDGAT2-5，用电转化法转化莱茵衣藻CC425，方法同步骤2，得到转空载体的藻株。

实施例三：CrDGAT2-5过量表达藻株的生理表型观察

转pCMBIA1302空载体组、CrDGAT2-5过量表达组、原始藻株CC425，各选100个藻株，培养于24℃光照培养箱，100μmol m^-2sec^-1白光，全光照条件下，待生长至对数生长期，2000rpm，离心5min，双蒸水重悬，按10％接种量接种到不含抗生素的HSM-N液体培养基(2g/LNaAc·3H₂O+1.44g/L K₂HPO₄+0.72g/L KH₂PO₄+0.5467g/L NaCl+20mg/LMgSO₄·7H₂O+10mg/LCaCl₂·2H₂O+1ml/L Trace-N)，连续震荡培养6天。每24h测量以下生理值。

1、生物量统计

按照Harris于1989年描述的方法使用血球计数板计数，并计算出生物量。结果显示过量表达CrDGAT2-5基因的藻株比非转基因藻株CrCC425和转空载体藻株生物量明显增加了。在第6天时增长最高，相对于非转基因藻株CrCC425和转空载体藻株生物量分别提高39％和178％。，转空载体的藻株生物量略微下降了(图2)。

2、中性脂含量测定

使用尼罗红荧光法测量中性脂含量：各取200μL藻液加入标准96孔酶标板中，在多荧光功能酶标仪中，测定激发光和发散光波长分别为470nm和570nm测量荧光值，读数A1；用终浓度为0.1μg/mL尼罗红染色藻液10min，再次使用多荧光功能酶标仪测量荧光值，读数A2；根据公式：中性脂含量(mg/L)＝0.0208(A2-A1)+11.7112，计算得到数据并作图。CrDGAT2-5过量表达藻株的中性脂含量比非转基因藻株和转空载体的藻株提高了20-40％(图3)。另取藻液，经终浓度为10μg/mL尼罗红染色10min后，使用荧光显微镜在激发光为480nm，发散光为560nm-600nm下进行观察及拍照，也可见过量表达CrDGAT2-5基因中性脂含量明显升高(图4)。

实施例四：干涉表达CrDGAT2-5基因的转化子的获得

1、植物干涉表达载体的构建

设计特异性引物(正向：5’-ATGGCCTCTTACTTCCCCGGC-3’；反向：5’-TCATTGCACG ATGGCCAGCGG-3’)扩增CrDGAT2-5基因286bp片段用于干涉研究。正义片段分别在正向和反向引物引入HindIII和XbaI位点，扩增的PCR产物和RNAi中间载体T2251载体分别经HindIII/XbaI双酶切后，连接，转化，鉴定，测序确定正确的阳性克隆。反义片段在正向和反向引物中分别引入BamHI与SalI位点，经过BamHI和SalI双酶切后，与同样经BamHI/SalI双酶切修饰已连接正义片段的T2251载体连接，转化，鉴定获得CrDGAT2-5反向重复序列插入的中间载体T2251-CrDGAT2-5。EcoRI酶切Maa7/XIR载体并去磷酸化与同样经EcoRI酶切的T2251-CrDGAT2-5载体连接，转化，鉴定得到用于RNA干涉的最终载体Maa7/XIR-CrDGAT2-5。

2、干涉表达CrDGAT2-5莱茵衣藻的获得

采用电转化法转化莱茵衣藻CC425，具体步骤参见实施例二中步骤2。

3、对照莱茵衣藻的获得

用Maa7/XIR代替Maa7/XIR-CrDGAT2-5用电转化法转化莱茵衣藻CC425，方法同步骤2，得到转空载体的藻株。

实施例五：CrDGAT2-5干涉表达藻株的生理表型观察

CrDGAT2-5干涉表达组，待长出单个藻落后，接种到含1.5mM L-色氨酸、5μM5-FI的TAP固体选择培养基上，转Maa7/XIR空载体组直接接种到含1.5mM L-色氨酸、5μg/mL Paromomycin的TAP固体选择培养基上，培养于24℃光照培养箱，100μmol m^-2sec^-1白光，全光照条件下，待第三次长出单个藻落，挑取阳性转化子，接种到HSM液体培养基(2g/LNaAc·3H₂O+1.44g/L K₂HPO₄+0.72g/L KH₂PO₄+0.5g/LNH₄Cl+20mg/LMgSO₄·7H₂O+10mg/LCaCl₂·2H₂O+1ml/L Trace)中，连续震荡培养9天。每24h测量以下生理值。

生物量和中性脂含量的测定参照实例3。结果CrDGAT2-5干涉表达的藻株生物量明显降低，在第9天时下降了48％；中性脂含量同样呈下降趋势，在第9天时下降最多，降低了74％(图5)，CrDGAT2-5干涉表达组的中性脂含量下降也可以通过尼罗红染色后照相明显可见(图6)。

实施例六：CrDGAT2-5基因的亚细胞定位

取pCAMBIA1302-CrDGAT2-5过量表达的藻株和pCAMBIA1302空载体转化组及空白CC2255藻株在荧光显微镜下观察，发现CrDGAT-5在细胞质中表达强烈(图7)，将pCAMBIA1302-CrDGAT2-5质粒采用基因枪轰击洋葱表皮细胞后观察也发现CrDGAT2-5基因定位于细胞质(图8)。

实施例七：CrDGAT2-5重组蛋白的获得

1、CrDGAT2-5蛋白表达载体的构建

设计CrDGAT2-5全长扩增引物(正向：

5’-AATCGGATCCATGGCCTCTTA  CTTCCCC-3’)和(反向：

5’-ATAAGTCGACTCATTGCACGATGGCCAGCGG-3’)，分别引入BamHI和SalI酶切位点，进行PCR扩增。PCR产物和pGEX-6P-1载体均经BamHI和SalI双酶切后，回收，连接，转化大肠杆菌BL21。鉴定，挑取正确的阳性克隆。

2、GST-CrDGAT2-5融合重组蛋白的诱导

转化质粒pGEX-6P-1-CrDGAT2-5的BL21菌，在37℃摇床培养至对数生长期，加入终浓度1mM的IPTG，220rpm，37℃诱导4小时，离心菌体，进行SDS-PAGE电泳，诱导的GST-CrDGAT2-5融合重组蛋白大小为61kD(图9)，CrDGAT2-5蛋白与预期的35kD一致。

Claims (5)

1.一种莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5，其特征是来源于莱茵衣藻，其序列如SEQ ID NO：1所示的核苷酸。

2.一种权利要求1所述的基因的编码蛋白，其特征是将根据权利要求1所述序列分析而推测得到，其序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列的蛋白质，蛋白ID为285889，是由320个氨基酸残基组成的蛋白质。

3.一种权利要求2所述的编码蛋白的衍生蛋白质，其特征是将SEQ ID NO：2所示的蛋白质序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

4.一种DNA序列，其特征是将莱茵衣藻油脂代谢基因CrDGAT2-5经PCR扩增而得到，其序列如SEQ ID NO：3所示，与SEQ ID NO：1所示的核苷酸具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

5.一种植物表达载体，其特征是利用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1所示序列构建的表达载体，用于提高植物的中性脂含量和生物量。

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