CN102660566A

CN102660566A - 莱茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPC1及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN102660566A
Application number: CN2012101432361A
Authority: CN
Inventors: 邓晓东; 费小雯; 罗秋兰; 蔡佳佳
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2012-05-10
Filing date: 2012-05-10
Publication date: 2012-09-12

Abstract

本发明公开了一种莱茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPC1及其编码蛋白与应用，该基因是来源于莱茵衣藻，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID NO：1DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。该基因的编码蛋白是具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列的蛋白质，蛋白ID为80312，由484个氨基酸残基组成的蛋白质。该CrPEPC1基因可应用于显著改变莱茵衣藻的中性脂含量和生物量，还可以应用于新型高油脂含量藻株的培育。并且本发明对于微藻的油脂代谢机理研究具有重要意义。

Description

莱茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPC1及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及一种能显著抑制藻类中性脂合成的基因及其编码蛋白与应用，特别涉及一种能显著抑制莱茵衣藻中性脂含量的油脂代谢基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

进入21世纪，经济飞速发展，人类对石油等化石燃料的消耗日益增加，并且使用化石燃料带来了严重环境污染问题，世界各国都在寻找安全的可再生能源。生物能源可以间接或者直接利用植物或微生物的光合作用，将太阳能固定为化学能，是可再生能源的首选。生物柴油和燃料乙醇是目前可以作为汽油添加剂进入市场的生物能源，其中生物柴油的成分更接近汽油，并且来源广泛，成本低，是最有可能解决石油危机的可再生能源之一。

生物柴油的制备主要是通过三酰甘油(TAG)与甲醇(乙醇)通过酯交换工艺制成。近年来生物柴油的产量在不断增加，2008年全球生物柴油总量达到1110万吨，预计到2016年生物柴油总产量达到12100万吨，但是生物柴油的价格至今仍是居高不下。原料成本占据了生物柴油总生产成本的60-70％。目前生物柴油的原料有餐饮废弃油、动植物油脂和微藻。利用微藻生产生物柴油具有无可比拟的优势，已成为制备生物柴油的主要途径。

利用微藻来生产生物柴油有很多工艺步骤，其中优良藻种的选育是关键。最理想的生物柴油生产藻株要求生长迅速、含油量高且脂肪酸组成适宜制备生物柴油。目前的研究工作主要集中在藻种的分离，藻种含油量的测定，藻种脂肪酸成分的分析以及藻种的大规模培养上。与高等植物相比，微藻的TAG生物合成和积累的分子机制研究还很薄弱，关于TAG代谢网络中相关基因功能研究报告更为稀少。莱茵衣藻是模式单细胞生物，基因组测序已经完成，在缺氮条件下油脂可以积累达到胞质的60％，是研究TAG代谢基因的理想藻株。

PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)是一种细胞质酶，广泛存在于光合生物中，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HCO3-生成草酰乙酸(OAA)和无机磷酸的不可逆反应。在C4植物中PEPC主要起固定CO2作用；而在C3植物和非光合作用组织中，PEPC主要起到回补损失的碳骨架作用。莱茵衣藻中存在两种PEPC酶：PEPC1和PEPC2。前期研究表明PEPC2对微藻的中性脂合成具有负调控作用。日本学者Sugimoto等也发现大豆籽粒中PEPC活性与蛋白质含量密切相关。我国科学家陈锦清等受此启发而提出“底物竞争”假说：大豆籽粒中的油脂和蛋白质之间存在着底物竞争，其共同底物为糖酵解的产物一丙酮酸，PEPC催化和HCO3-生成草酰乙酸(OAA)进入蛋白质合成途径，而乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)则催化丙酮酸生成乙酰辅酶A进入脂肪酸合成途径，二者的相对活性决定了底物的流向，进而决定蛋白质和脂肪在大豆籽粒中的比例。

发明内容

本发明的目的是提供一种能抑制微藻中三酰甘油含量的基因及其编码蛋白与应用。尤其是来自莱茵衣藻的基因。

本发明所提供的能提高藻类三酰甘油含量的基因名称为CrPEPC1 (Chlamydomonas reinhardti i Phosphoenolpyruvate carboxylase isoform 1)，该基因在JGI莱茵衣藻基因数据库的名称为estExt_GenewiseW_1.C_280036，位于16号染色体3，641，705-3，648，177区域，含12个外显子。蛋白ID 80312，编码一个名为PEPC1(Phosphoenolpyruvate carboxylase isoform 1)的蛋白，是根据JGI莱茵衣藻基因数据库上公布的CrPEPC1基因为模板设计特异性引物，扩增cDNA获得全长序列，根据该碱基序列分析而推测编码CrPEPC1蛋白的序列。对其研究发现该基因可以显著降低莱茵衣藻中中性脂含量和生物量。本发明所述CrPEPC1基因，来源于莱茵衣藻，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

能降低微藻中性脂含量的基因CrPEPC1的编码蛋白CrPEPC1，是具有序列表中SEQ ID NO：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

序列表中序列2氨基酸残基是由484个氨基酸残基组成的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及至少有15个核苷酸与由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或其互补链组成的DNA互补的DNA均属本发明的保护范围。该CrPEPC1基因应用于显著改变莱茵衣藻的中性脂含量和生物量及应用于新型高油脂含量藻株的培育。

采用任何一种引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的CrPEPC1基因转入藻类导致中性脂含量减少，在微藻中将此基因敲除(或沉默)后中性脂含量升高。如通过电转化法转化莱茵衣藻，得到纯合的CrPEPC1转化子(即为CrPEPC1过量表达的单拷贝纯合莱茵衣藻)。为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入了植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。用于转化的生物可以是细菌细胞，动物细胞和植物。

一旦获得一种转化植物，其中已将本发明的DNA导入了基因组，就可能通过无性或有性繁殖获得后代，或者从该植株及其后代通过克隆获得繁殖材料来生产植物。用本发明DNA转化的植物细胞，包含这些细胞的植物体，该植物后代和克隆后代，以及所有从该植物获得的繁殖材料都属于本发明中。

本发明的基因可以用于制备该基因的重组蛋白。

重组蛋白常如下制备：将编码本发明蛋白的DNA插入适当的表达载体，将该载体导入适当的细胞，培养转化的细胞，为使这些细胞表达所述重组蛋白和纯化所表达的蛋白。重组蛋白可表达为与便于纯化的其他蛋白融合的蛋白，如与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的蛋白。对宿主细胞没有限制，只要该细胞适于表达所述重组蛋白。

所得重组蛋白可用于制备与该蛋白结合的抗体。例如用本发明的纯化重组蛋白或一部分免疫动物(如兔)，一段时间后采血，从而制备多克隆抗体。得到的抗体可用于检测或纯化本发明的蛋白和能与本发明蛋白互作的蛋白。相应的本发明包括能结合本发明蛋白的抗体。

附图说明

图1为CrPEPC1的RT-PCR扩增结果M：DL2000DNA分子量标准；3：CrPEPC1扩增结果；

图2为CrPEPC1过量表达转化子生物量的变化情况；

图3为CrPEPC1过量表达转化子中性脂含量的变化情况；

图4为pAMBIA1302空载体组、pCAMBIA1302-CrPEPC1转化组第六天时尼罗红染色后荧光观察图；

图5为pAMBIA1302空载体组、pCAMBIA1302-CrPEPC1转化组RNA表达分析图；

图6为pAMBIA1302空载体组、pCAMBI A1302-CrPEPC1转化组酶活性分析图；

图7为干涉藻株的生物量含量变化图；

图8为干涉藻株的油脂含量变化图；

图9为Maa7/XIR空载体转化子和CrPEPC1干涉藻株尼罗红染色后荧光观察图；

图10为Maa7/XIR空载体转化子和CrPEPC1干涉藻株酶活性分析图；

图11为CrPEPC1基因在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位；

图12为CrPEPC1基因在莱茵衣藻CC425中的亚细胞定位；

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。Marker均购自大连宝生物公司。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1CrPEPC1的克隆

1)莱茵衣藻总RNA的提取

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻株CC425，培养于24℃光照培养箱，100μmol m^-2sec^-1白光，全光照条件下，待生长至对数生长期，取藻液50mL，10000r/min离1min收集藻体，液氮速冻后碾磨成粉末，按照Trizol的方法提取总RNA；

2)引物设计

根据DOE JGI Chlamydomonas database上公布的CrPEPC1基因为模板，设计如下特异性引物，进行PCR扩增：

CrPEPC1全长扩增引物引物序列(5’→3’)

正向引物GATGGACGCGGTGACCAC

反向引物CCGCCGCCACCGCCGCCG

3)cDNA的合成

按照宝生物工程(大连)有限公司提供的Takara的试剂盒，使RNA反转录成cDNA。

4)制备PCR Master混合物

5)进行PCR扩增：

94℃5min；35个循环：94℃1min，55℃1min，72℃1min；72℃10min。

取8μL进行1％琼脂糖凝胶电泳分析结果如图1，-20℃保存。

6)PCR产物的纯化和胶回收

按照上海华舜生物工程有限公司的小量胶回收试剂盒回收DNA片断，PCR产物连接到pGEM-T Vector(promega公司)，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序。

7)CrPEPC1基因生物信息学分析

来源于莱茵衣藻的CrPEPC1推测的蛋白质含有484个氨基酸，经ExPASy数据库中蛋白质软件(http://expasy.org/tools/)分析其分子量为51.8kD，等电点为5.81。

实施例2过量表达CrPEPC1基因的转化子获得

1)植物双元表达载体的构建

设计带有Bgl II和Spe I酶切位点的引物(正向：5’-TAGTAGATCTGATGGACGCGGTGACCAC-3’；反向：5’-AAATACTAGTCCGCCGCCACCGCCG CCG-3’)，PCR扩增CrPEPC1基因全长。Bfl II和Spe I双酶切修饰后的CrPEPC1产物和pCAMBIA1302的BglII和Spe I双酶切载体大片段进行连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定阳性克隆，提取质粒进行双酶切鉴定。提取正确的重组表达质粒pCAMBIA1302-CrPEPC1，用于转化。

2)过量表达CrPEPC1莱茵衣藻转化子的获得(电转化法)

莱茵衣藻(藻株CC425，购自中国科学院水生生物研究所)，培养于24℃光照培养箱，100μmol m^-2sec^-1白光，全光照条件下，待生长至藻细胞数为2×10⁷个/mL；2000rpm离心5min，收集藻细胞；无菌去离子水洗涤沉淀并重复3次，用含60mM蔗糖的TAP液体培养基(2.42g/L Tris-base+1ml/L冰醋酸+119mg/L K₂HPO₄+61mg/LKH₂PO₄+0.4g/L NH₄C l+0.1g/LMgSO₄ 7H₂O+50mg/LCaCl₂ 2H₂O+1ml/LTrace)重悬沉淀；冰浴10min；取藻液加入重组质粒，混匀后转移至电击杯中，室温静置5min；1.5kV，10μF，200Ω，6msec条件下电击，室温静置10min，加入5mL TAP液体培养基，22℃，100rpm，昏暗光线复苏8h；2000rpm，离心5min，收集藻细胞，调节藻细胞数目到1×10⁶个/mL；转移藻液至含1.5mM L-色氨酸、5μg/mL L-paromomycin的TAP固体选择培养基上，缓慢倾斜旋转，使藻液分布均匀；关闭光源，吹干，24℃光照培养箱，100μmol m^-2sec^-1白光，全光照条件下培养至形成单个藻落。

实时荧光定量PCR确定CrPEPC1基因的过量表达：RNA提取参照实例一，实时荧光定量PCR参照TaKaRa公司的

Premix Ex Taq

试剂操作说明进行。结果见图5。

3)对照莱茵衣藻的获得

用pCMBIA1302代替pCMBIA1302-CrPEPC1，用电转化法转化莱茵衣藻(藻株CC425，购自中国科学院水生研究所)，方法同步骤2，得到转空载体的藻株。

实施例3CrPEPC1过量表达藻株的生理表型观察

转pCMBIA1302空载体组、CrPEPC1过量表达组、原始藻株CC425，各选100个藻株，培养于24℃光照培养箱，100μmol m^-2sec^-1白光，全光照条件下，待生长至对数生长期，2000rpm，离心5min，双蒸水重悬，按10％接种量接种到不含抗生素的HSM-N液体培养基(2g/LNaAc 3H₂O+1.44g/L K₂HPO₄+0.72g/L KH₂PO₄+0.5467g/L NaCl+20mg/LMgSO₄ 7H₂O+10mg/LCaCl₂ 2H₂O+1ml/L Trace-N)，连续震荡培养6天。每24h测量以下生理值。

1)生物量统计

按照Harris于1989年描述的方法使用血球计数板计数，并计算出生物量。结果显示过量表达CrPEPC1基因的藻株比非转基因藻株CrCC425和转空载体藻株生物量有所增加。在第6天时增加最多，相对于转空载体藻株生物量增加了70.99％(图2)。

2)中性脂含量测定

使用酸水解法测定中性脂含量：藻液低温冷冻干燥成藻粉，各取0.1g藻粉，加入无菌蒸馏水，混匀后加入10ml盐酸，80℃水浴25min，加入10ml 95％乙醇，混匀。冷却后加入10ml乙醚，加盖振摇1min，之后开盖放出气体。4000rpm离心3min，取上清液移至恒重的锥形瓶中，重复洗涤离心管中的残渣，然后将上清液转移至原先的锥形瓶中。将锥形瓶置于水浴上蒸干，再转移至100℃烘箱中干燥2h，取出冷却后称重(图3)。另取藻液，经终浓度为10μg/mL尼罗红染色10min后，使用荧光显微镜在激发光为480nm，发散光为560nm-600nm下进行观察及拍照，也可见过量表达CrPEPC1基因中性脂含量明显下降(图4)。

实施例4干涉表达CrPEPC1基因的转化子的获得

1)植物干涉表达载体的构建

设计特异性引物(正向：5’-GTGACTGTGCAGGGCGAGAT-3’；反向：5’-TGCTGAGTCCAGGCGAAGAT-3’)扩增CrPEPC1基因486bp片段用于干涉研究。正义片段分别在正向和反向引物引入HindIII和XbaI位点，扩增的PCR产物和RNAi中间载体T2251载体分别经HindIII/XbaI双酶切后，连接，转化，鉴定，测序确定正确的阳性克隆。反义片段在正向和反向引物中分别引入BamHI与SalI位点，经过BamHI和SalI双酶切后，与同样经BamHI/SalI双酶切修饰已连接正义片段的T2251载体连接，转化，鉴定获得CrPEPC1反向重复序列插入的中间载体T2251-CrPEPC1。EcoRI酶切Maa7/XIR载体并去磷酸化与同样经EcoRI酶切的T2251-CrPEPC1载体连接，转化，鉴定得到用于RNA干涉的最终载体Maa7/XIR-CrPEPC1。

2)干涉表达CrPEPC1莱茵衣藻的获得

采用电转化法转化莱茵衣藻(藻株CC425，购自中国科学院水生研究所)，具体步骤参见实例2中步骤2。

3)对照莱茵衣藻的获得

用Maa7/XIR代替Maa7/XIR-CrPEPC1用电转化法转化莱茵衣藻(藻株CC425，购自中国科学院水生研究所)，方法同步骤2，得到转空载体的藻株。

实施例5CrPEPC1干涉表达藻株的生理表型观察

CrPEPC1干涉表达组，待长出单个藻落后，接种到含1.5mM L-色氨酸、5μM 5-FI的TAP固体选择培养基上，转Maa7/XIR空载体组直接接种到含1.5mM L-色氨酸、5μg/mL paromomycin的TAP固体选择培养基上，培养于24℃光照培养箱，100μmol m^-2sec^-1白光，全光照条件下，待第三次长出单个藻落，挑取阳性转化子，接种到HSM液体培养基(2g/LNaAc 3H₂O+1.44g/L K₂HPO₄+0.72g/L KH₂PO₄+0.5g/L NH₄Cl+20mg/LMgSO₄ 7H₂O+10mg/LCaCl₂ 2H₂O+1ml/L Trace)中，连续震荡培养9天。每24h测量以下生理值。

生物量和中性脂含量的测定参照实例3。结果CrPEPC1干涉表达的藻株生物量略有下降但是改变不是很明显(图7)；中性脂含量呈升高趋势，在第6天时升高最多，升高了37.52％(图8)，CrPEPC1干涉表达组的中性脂含量上升也可以通过尼罗红染色后照相明显可见(图9)。其mRNA表达水平参照实例二，CrPEPC1基因的RNA表达明显被抑制。

实例6CrPEPC1重组蛋白的获得

1)CrPEPC1蛋白表达载体的构建

设计CrPEPC1全长扩增引物(正向：5’-AATCGGATCCATGGCCTCTTA CTTCCCC-3’)和(反向：5’-ATAAGTCGACTCATTGCACGATGGCCAGCGG-3’)，分别引入BamHI和SalI酶切位点，进行PCR扩增。PCR产物和pGEX-6P-1载体均经BamHI和SalI双酶切后，回收，连接，转化大肠杆菌BL21。鉴定，挑取正确的阳性克隆。

2)GST-CrPEPC1融合重组蛋白的诱导

转化质粒pGEX-6P-1-CrPEPC1的BL21菌，在37℃摇床培养至对数生长期，加入终浓度1mM的IPTG，220rpm，37℃诱导4小时，离心菌体，进行SDS-PAGE电泳，诱导的GST-CrPEPC1融合重组蛋白大小为84kD，CrPEPC1蛋白与预期的52kD一致。

实例7CrPEPC1基因的亚细胞定位

取pCAMBIA1302-CrPEPC1过量表达的藻株和pCAMBIA1302空载体转化组及空白CC425藻株在荧光显微镜下观察，发现CrPEPC1在细胞质中表达强烈(图12)，将pCAMBIA1302-CrPEPC1质粒采用基因枪轰击洋葱表皮细胞后观察也发现CrPEPC1基因定位于细胞质(图11)。

实例8转基因藻细胞PEPC1酶活测定

取对数生长期的转基因藻株10ml转入50ml离心管，3000rpm离心5min，取上清收集细胞，并以pH 7.9的磷酸缓冲溶液洗涤2次。将藻细胞置于冰上，加入3ml PBS进行超声波破碎，破碎持续10s，每次间隔5s，共进行四次，破碎完毕后，4℃离心5min，收集上清液定容至6ml，在大量透析液(即提取缓冲液)中4℃透析过夜，即得PEPC酶液。

酶活性测定参考Hirai的方法，略有改动：1ml反应体系(40mmol/LTris-HCL缓冲液(pH8.5)、2mmol/LMgCl2、10mmol/L KHCO3、2mmol/LPEP、0.5mmol/L GSH、0.15mmol/LNADH、过量苹果酸脱氢酶和适量酶液)，加入反应底物后立即用普析紫外分光光度计测定吸光值，15s为单位扫描3分钟，记录吸光度变化，重复3次；以每分钟吸光度变化0.01为一个酶单位，酶活性以单位/藻粉/分钟表示。

过量表达的pCAMBIA-PEPC1藻株与转空载体组相比，酶活明显增高，增高了145.52％-193.79％(图6)；干涉表达的Maa7-PEPC1藻株与转空载体组相比酶活下降了34.29％-53.18％(图10)。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims

1.一种莱茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPC1，其特征在于该基因是来源于莱茵衣藻，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白质序列的多核苷酸；

2.一种权利要求1所述的基因的编码蛋白，其特征在于是具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列的蛋白质，蛋白ID为80312，由484个氨基酸残基组成的蛋白质。

3.一种权利要求2所述的编码蛋白的衍生蛋白质，其特征是将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQID NO：2衍生的蛋白质。

4.根据权利要求1所述的莱茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPC1，其特征在于该CrPEPC1基因应用于显著改变莱茵衣藻的中性脂含量和生物量及应用于新型高油脂含量藻株的培育。