CN115927407B - 一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用 - Google Patents
一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115927407B CN115927407B CN202211321173.4A CN202211321173A CN115927407B CN 115927407 B CN115927407 B CN 115927407B CN 202211321173 A CN202211321173 A CN 202211321173A CN 115927407 B CN115927407 B CN 115927407B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- cocsudraft
- chlorella
- algae
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 105
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 title claims abstract description 53
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 38
- 230000012010 growth Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims abstract description 70
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 35
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 21
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 18
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 claims description 16
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 16
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 11
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 11
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 9
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 claims description 8
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 claims description 8
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940082787 spirulina Drugs 0.000 claims description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 7
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 239000004519 grease Substances 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 5
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 claims description 5
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 claims description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 5
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 4
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims description 3
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 claims description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims 2
- 241000192707 Synechococcus Species 0.000 claims 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 claims 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 36
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 8
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 5
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 5
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000206744 Phaeodactylum tricornutum Species 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 4
- 125000004177 diethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 4
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 description 3
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 2
- 241000224474 Nannochloropsis Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 description 2
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 2
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241001306132 Aurantiochytrium Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000002112 Carya glabra Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 241000199914 Dinophyceae Species 0.000 description 1
- 108050003365 Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylases Proteins 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 108010030975 Polyketide Synthases Proteins 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233671 Schizochytrium Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000233675 Thraustochytrium Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241001501518 Vischeria punctata Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 108010083912 bleomycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006372 lipid accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000006014 omega-3 oil Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- -1 unsaturated fatty acid lipids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用。所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，先根据该基因序列设计引物并通过PCR扩增该基因扩增产物；然后根据该基因序列和pPha‑T1载体信息设计带有载体同源部分片段和酶切位点的引物，并通过同源重组法将该基因构建进入pPha‑T1载体获得重组质粒；再将重组质粒经电转化转入胶球藻筛选过表达该基因的阳性重组藻；最后培养过表达该基因的重组藻获得高油脂产率。本发明所述基因可显著提高该基因重组藻生长速率以及同步增强脂质产率，对培育高油脂微藻品种具有重要的理论和现实意义。
Description
技术领域
本发明属于微藻生物工程技术领域，特别涉及一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用。
背景技术
微藻因具有生长周期短、环境适应性强、光合固碳效率高、不与粮食和农用耕地竞争、可采用各种工农业废水进行规模化培育以及富含油脂等优势性能成为持续性开发功能脂质的新资源(Udayan A,et al.Mass cultivation and harvesting of microalgalbiomass:Current trends and future perspectives.Bioresource Technology,2022,344:126406)。目前已报道，微藻中富含的多种不饱和脂肪酸脂质，在增强免疫力、降血脂、促进大脑发育，防止老人大脑痴呆以及促进维生素、蛋白质、矿物质等营养物质的吸收，阻止癌细胞扩散，促进肿瘤萎缩等方面都具有较好的生物学功能，因而在食品、药品及保健品等领域应用前景较好。
近年来，国内外研究者围绕微藻脂质合成积累开展了大量研究，证实激素、高光、营养、高盐、培养模式等环境条件均可诱导藻细胞积累脂质。如Wang等采用植物激素诱导三角褐指，使得其脂质含量较无激素对照提高了2.09倍(Wang,et al.An auxin-likesupermolecule to simultaneously enhance growth and cumulativeeicosapentaenoic acid production in Phaeodactylum tricornutum.BioresourceTechnology,2022,345:126564)；Lima等以连续高频闪光诱导微拟球藻和鞭毛藻使其脂质产量较对照提高近3倍(Lima et al.Flashing light emitting diodes(LEDs)induceproteins,polyunsaturated fatty acids and pigments in three microalgae.Journalof Biotechnology,2021,325:15-24.)；Sinetova等发现在0.5mol/L高盐胁迫下点状魏氏藻中脂质比例由对照组6.4％提高至13.6％(Sinetova et al.Effect of salt stress onphysiological parameters of microalgae Vischeria punctata strain IPPAS H-242,a superproducer of eicosapentaenoic acid.Journal of Biotechnology,2021,331:63-73)；此外，三角褐指藻和裂壶藻共培养、生物反应器等模式也均能有效提高脂质产率。尽管通过环境因子调控能有效诱导脂质合成积累，整体上优化脂质产率，但其与工业化应用脂质产量相比尚存在差距，提高微藻脂质产率的有效策略也仍然必需。
实际上，通过调控微藻脂质合成积累相关的酶基因等被认为是提高微藻脂质富集产率的有效策略之一。如Xin等利用代谢工程将CrDGTT1、Δ0-ELO1和NoDGAT2K基因引入到产油微拟球藻中，使脂质含量较对照组分别提高了5.9、12.3和34.7倍(Xin etal.Biosynthesis of triacylglycerol molecules with a tailored PUFA profile inindustrial microalgae.Molecular Plant,2019,12:474-488)；Cui等通过过度表达丙二酰辅酶a酰基载体蛋白转酰酶基因使得转基因三角褐指藻脂质含量增加297％(Cui etal.Phaeodactylum tricornutum microalgae as a rich source of omega-3oil:Progress in lipid induction techniques towards industry adoption.FoodChemistry,2019,297:124937)。此外，Wang等在破囊壶菌中异源过表达EPA合成基因簇使其EPA含量提高5倍，产量达到2.7g/L细胞干重(Wang et al.Optimizing eicosapentaenoicacid production by grafting a heterologous polyketide synthase pathway in theThraustochytrid Aurantiochytrium.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2020,68:11253-11260)。SnRK2是典型的“一因多效”基因家族，它不仅可以响应逆境胁迫应答，增强植物的抗逆性，而且可参与调控植物生长发育等多个方面。目前对SnRK2的研究主要集中在脱落酸依赖的信号通路，COCSUDRAFT_64904基因就是胶球藻中脱落酸代谢通路上SnRK2基因家族中一员。相关文献表明，外源添加适宜浓度的脱落酸能有效促进微藻生长和油脂积累，此外，其转录组数据显示COCSUDRAFT_64904基因表达出现显著增加现象，然而，COCSUDRAFT_64904基因在微藻油脂合成积累过程中的作用尚未有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用，以胶球藻脱落酸代谢通路上SnRK2基因家族中的COCSUDRAFT_64904基因为目标基因，探究其在调控微藻生长和脂质合成中的功能及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种胶球藻基因，为胶球藻脱落酸代谢通路上SnRK2基因家族中的COCSUDRAFT_64904基因。
优先地，所述胶球藻基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
上述胶球藻基因在调控生长和脂质合成中的应用，先根据所述胶球藻基因序列设计引物并通过PCR扩增胶球藻基因扩增产物；然后根据胶球藻基因序列和pPha-T1载体信息设计带有载体同源部分片段和酶切位点的引物，并通过同源重组法将胶球藻基因构建进入pPha-T1载体获得重组质粒；再将重组质粒经电转化转入胶球藻筛选过表达胶球藻基因的阳性重组藻；最后培养过表达胶球藻基因的重组藻获得高油脂产率。
优先地，所述的通过PCR扩增胶球藻基因扩增产物，具体包括：1)提取胶球藻全基因组作为模板；2)根据胶球藻基因序列设计引物：上游引物序列：5’-GGCTTGTTGGTGGATTGTGAT-3’，下游引物序列：5’-CTCTAGGCGTTGGCGGTTA-3’；3)PCR扩增：通过PCR扩增得到胶球藻基因扩增产物。
优先地，所述的同源重组法构建重组质粒，具体包括：a)根据COCSUDRAFT_64904的基因序列和pPha-T1载体信息设计引物：上游引物序列：5’-GTCTGCCGTTTCGA GGCTTGTTGGTGGATTGTGAT-3’，下游引物序列：5’-ATAGCACGCTTCTG/>CTCTAGGCGTTGGCGGTTA-3’，引物两端分别包括载体的部分序列(划横线处)和酶切位点(划波浪线处)作为同源臂；b)PCR扩增：通过PCR扩增得到COCSUDRAFT_64904基因扩增产物(带有pPha-T1载体的部分序列和酶切位点)；c)重组质粒的获得：通过同源重组方法，将COCSUDRAFT_64904基因构建进入pPha-T1载体得到重组质粒。
优先地，步骤b)PCR扩增的反应体系为：体积比为1-3：25-30：1-3：1-3：15-20的DNA，2×Phanta Max Buffer，上游引物，下游引物和ddH2O，优选为：2μL DNA，27μL 2×Phanta Max Buffer，上、下游引物各2μL，17μL ddH2O；PCR扩增程序为：预变性92-98℃ 2-5min，变性92-98℃ 20-40s，退火50-60℃ 20-40s，延伸70-74℃ 0.5-2min，彻底延伸6-12min，20-40个循环，优选为：预变性95℃ 3min，变性95℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃1min，彻底延伸10min，30个循环；PCR扩增产物用0.5wt％-2wt％(优选1wt％)琼脂糖凝胶电泳纯化回收，得到COCSUDRAFT_64904基因的同源重组扩增产物。
优先地，步骤c)具体为将pPha-T1双酶切产物与COCSUDRAFT_64904同源重组产物进行同源重组反应，反应体系为：用量比为80-120ng：80-120ng：1-3μL：3-5μL：8-12μL的pPha-T1双酶切产物，COCSUDRAFT_64904PCR同源重组产物，Exnase II，5×CE II Buffer和ddH2O，36-38℃反应25-35min；优选为：100ng pPha-T1双酶切产物，100ng COCSUDRAFT_64904PCR同源重组产物，2μL Exnase II，4μL 5×CE II Buffer，10μL ddH2O，37℃反应30min；将同源产物进行大肠杆菌转化，鉴定获得含有pPha-T1-COCSUDRAFT_64904重组质粒的阳性菌。
优先地，所述的过表达胶球藻基因的阳性重组藻构建为将获得的重组质粒通过电转化方法转入胶球藻中，并通过抗生素筛选和表达量检测方式筛选得到过表达COCSUDRAFT_64904基因的阳性重组藻株。
优先地，所述的过表达胶球藻基因的阳性重组藻构建，具体为将pPha-T1-COCSUDRAFT_64904质粒用Sca I进行质粒线性化处理，酶切体系为：20μL pPha-T1-COCSUDRAFT_64904，1μL Sca I，5μL 10×QuickCut Buffer，37℃酶切30min，100μL重悬胶球藻细胞与4μg线性化pPha-T1-COCSUDRAFT_64904质粒和40μg鲑精DNA，在冰上孵育至少10min后进行电穿孔，电穿孔后细胞立即转移到含有10mL Basal培养液的试管中，在黑暗条件下复苏24h，再转移到正常光强下培养24h，然后4000g离心10min收集细胞并用0.6mLBasal培养液重悬细胞，经过博来霉素筛选得到初步阳性藻；再经表达量检测方式筛选得到过表达COCSUDRAFT_64904基因的阳性重组藻。
优先地，所述的培养过表达胶球藻基因的重组藻获得高油脂产率，具体为：挑取过表达胶球藻基因的重组单克隆藻接入Basal培养基培养至对数末期，对重组藻培养液进行离心清洗得到藻泥，经冷冻干燥获得藻粉，称重藻粉获得藻生物量；同步将获得藻粉经有机溶剂抽提得油脂，基于生物量计算油脂产率；再将提取油脂皂化获得脂肪酸甲酯，以GC内标法测定脂肪酸组分和含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明通过构建的COCSUDRAFT_64904基因过表达重组藻，发现了COCSUDRAFT_64904基因的一个新功能，其能同步显著性地提高微藻生长和油脂积累，为提高微藻脂质产率提供了一种新的功能基因资源。
(2)本发明所用的COCSUDRAFT_64904基因为微藻本身自有基因，其转基因重组微藻的安全性能高。
(3)本发明COCSUDRAFT_64904基因过表达重组藻能为工业化利用胶球藻生产功能性脂质提供新的藻种，并且可有效降低脂质生产成本。
附图说明
图1为胶球藻COCSUDRAFT_64904基因PCR扩增产物电泳图(注：M为DNA Maker；1为胶球藻COCSUDRAFT_64904基因PCR扩增产物)
图2为胶球藻COCSUDRAFT_64904基因PCR同源重组扩增产物电泳图(注：PCR产物片段大小为载体同源部分+EcoR I和Hind III酶切位点+COCSUDRAFT_64904基因；M为DNAMaker；1为COCSUDRAFT_64904基因PCR同源重组扩增产物)
图3为pPha-T1-COCSUDRAFT_64904阳性菌质粒菌落PCR产物电泳图(注：M为DNAMaker；1为pPha-T1-COCSUDRAFT_64904阳性菌质粒菌落PCR产物)
图4为线性化pPha-T1-COCSUDRAFT_64904重组质粒电泳图(注：M为DNA Maker；空白为空质粒载体；1为线性化pPha-T1-COCSUDRAFT_64904重组质粒)
图5为COCSUDRAFT_64904基因转化胶球藻博来霉素抗性筛选菌落图
图6为转COCSUDRAFT_64904基因重组胶球藻中基因表达情况分析(注：野生株为未转化COCSUDRAFT_64904基因的胶球藻株；转化株为COCSUDRAFT_64904基因过表达重组胶球藻株；柱子上的星号表示统计分析上有显著差异(t检验，**p<0.01))。
图7为COCSUDRAFT_64904基因过表达重组胶球藻和野生型胶球藻生物量对比图(注：野生株为未转化COCSUDRAFT_64904基因的胶球藻株；转化株为COCSUDRAFT_64904基因过表达重组胶球藻株；柱子上的星号表示统计分析上有显著差异(t检验，**p<0.01))。
图8为COCSUDRAFT_64904基因过表达重组胶球藻和野生型胶球藻油脂含量对比图(注：野生株为未转化COCSUDRAFT_64904基因的胶球藻株；转化株为COCSUDRAFT_64904基因过表达重组胶球藻株；柱子上的星号表示统计分析上有显著差异(t检验，**p<0.01))。
图9为COCSUDRAFT_64904基因过表达重组胶球藻和野生型胶球藻脂肪酸含量对比图(野生株为未转化COCSUDRAFT_64904基因的胶球藻株；转化株为COCSUDRAFT_64904基因过表达重组胶球藻株；注：柱子上的星号表示统计分析上有显著差异(t检验，**p<0.01；*p<0.05))。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于所述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
下述实施例中，若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。
实施例
一、胶球藻COCSUDRAFT_64904基因的获取
利用转录组、生物信息学等技术手段筛选得到一个胶球藻脱落酸代谢通路上SnRK2基因家族中COCSUDRAFT_64904基因，该基因全长编码框核苷酸序列长度为1806bp，由401个氨基酸组成，其核苷酸序列如序列SEQ ID NO.1所示，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
二、胶球藻COCSUDRAFT_64904基因的克隆
1.提取对数期胶球藻(藻细胞浓度约为1×106cells/mL)全基因组DNA作为模板。
2.根据NCBI中COCSUDRAFT_64904的基因序列设计引物：
上游引物序列：5’-GGCTTGTTGGTGGATTGTGAT-3’；
下游引物序列：5’-CTCTAGGCGTTGGCGGTTA-3’。
3.PCR扩增：通过PCR扩增得到COCSUDRAFT_64904基因扩增产物，PCR扩增的反应体系为：2μL DNA，25μL 2×Phanta Max Buffer，上、下游引物各2μL，17μL ddH2O，1μL dNTPmix,1μL PhantaR Max Super-Fidelity DNA Polymerase(PCR扩增试剂盒购自南京诺维赞生物有限公司)。PCR扩增程序为：预变性95℃ 3min，变性95℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 1min，彻底延伸10min，30个循环。
4.将COCSUDRAFT_64904基因的PCR扩增产物用1wt％琼脂糖凝胶电泳验证其核苷酸片段大小。由图1可知，在1800bp片段大小位置出现条带，说明COCSUDRAFT_64904基因产物PCR扩增成功，可用于下一步实验。
三、COCSUDRAFT_64904基因过表达重组藻的获得
1.根据COCSUDRAFT_64904的基因序列和pPha-T1载体信息设计引物：
上游引物序列：5’-GTCTGCCGTTTCGA CGGCTTGTTGGTGGATTGTGAT-3’，下游引物序列：5’-ATAGCACGCTTCTG/>CTCTAGGCGTTGGCGGTTA-3’，引物两端分别包括载体的部分序列(划线处)和酶切位点(划波浪线处)作为同源臂。
2.PCR扩增：通过PCR扩增得到COCSUDRAFT_64904同源重组产物，PCR扩增的反应体系为：2μL基因组DNA，25μL 2×Phanta Max Buffer(PCR扩增试剂盒：PhantaR Max Super-Fidelity DNA Polymerase购自南京诺维赞生物有限公司)，上、下游引物各2μL，17μLddH2O；PCR扩增程序为：变性98℃ 10s，退火55℃ 15s，延伸，72℃ 1min，30个循环；PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳验证其核苷酸片段大小。由图2可知，在1900bp片段大小位置出现条带，说明胶球藻COCSUDRAFT_64904基因同源重组产物(带pPha-T1载体部分序列和酶切位点)PCR扩增成功。将PCR扩增产物采用PCR产物回收试剂盒(购自生工生物工程上海股份有限公司)按照操作说明纯化回收用于下一步实验。
3.载体构建：将pPha-T1用EcoR I和Hind III进行双酶切，酶切体系为：25μLpPha-T1，1μL Quick Cut EcoR I，1μL Quick Cut Hind III，10μL 10×QuickCut Buffer(南京诺维赞生物有限公司)，13μL ddH2O，37℃酶切30min，酶切产物用用柱式DNA胶回收试剂盒(购自生工生物工程上海股份有限公司)按照操作说明进行清洗回收。将pPha-T1双酶切产物与COCSUDRAFT_64904同源重组产物进行同源重组反应，反应体系为：2μL pPha-T1双酶切产物，2μL COCSUDRAFT_64904PCR同源重组产物，2μL Exnase II，4μL 5×CEIIBuffer，10μL ddH2O，37℃反应30min。将同源产物进行大肠杆菌转化，通过氨苄抗生素鉴定获得含有pPha-T1-COCSUDRAFT_64904阳性菌质粒。pPha-T1-COCSUDRAFT_64904阳性菌质粒菌落PCR验证，PCR产物用1wt％琼脂糖凝胶电泳验证其核苷酸片段大小。由图3pPha-T1-COCSUDRAFT_64904质粒阳性菌菌落PCR产物电泳图可知，在1900bp片段大小位置出现条带，说明pPha-T1-COCSUDRAFT_64904重组质粒构建成功，可用于下一步实验。然后进一步将菌液送至生工生物工程上海股份有限公司进行测序，测得其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.胶球藻转化：提取pPha-T1-COCSUDRAFT_64904重组质粒，并用Sca I进行质粒线性化处理，酶切体系为：26μL pPha-T1-COCSUDRAFT_64904，1μL Quick Cut Sca I，10μL 10×QuickCut Buffer，13μL ddH2O,37℃酶切30min，酶切产物用胶回收试剂盒进行清洗回收，回收产物用1wt％琼脂糖凝胶电泳验证其线性化重组质粒核苷酸片段大小。由图4线性化pPha-T1-COCSUDRAFT_64904重组质粒电泳图结果可知，在7000bp片段大小位置出现条带，符合pPha-T1-COCSUDRAFT_64904重组质粒片段大小，可用于下一步实验。
胶球藻生长至对数期密度为4×106-5×106cell/mL，在4℃下8000g离心10min收集总共2×108个细胞，用无菌冷冻超纯水重悬藻细胞3次，最后重悬到100μL超纯水中使藻的最终密度为2×109cell/mL，放在冰上待用。将100μL重悬藻细胞与4μg线性化pPha-T1-COCSUDRAFT_64904重组质粒和40μg(10μg/μL)鲑精DNA(95℃以上水浴煮沸1min变性)在冰上孵育至少10min，然后转移放入2mm电穿孔比色皿中，使用Bio-rad电穿孔仪进行电穿孔。将电穿孔系统调整为指数衰减，2750V场强，25μF电容和400欧姆并联电阻。电穿孔后细胞立即转移到含有10mL Basal培养液的15mL试管中，在黑暗环境下复苏24h，再转移到正常光强条件下培养24h，然后4000g离心10min收集细胞并用0.5mL Basal培养液重悬该细胞，平均涂布于含100μg/mL的博来霉素的固体培养基上，10～20天后出现单藻落。由图5可知，COCSUDRAFT_64904基因电转化胶球藻株后，以博来霉素筛选转化藻株结果可见，转化效果良好，培养板中单菌落清晰可见，可进行下一步处理。
5.COCSUDRAFT_64904过表达阳性胶球藻鉴定
转基因藻细胞在含有80μg/mL博来霉素的选择性液体Basal培养基中正常摇动培养(120r/min)作为预培养物以达到对数期。取50mL对数期藻液在4℃以4000×g离心5min并弃上清液，得到的沉淀物在液氮中快速冷冻并研磨成粉末，使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)/Total RNA Kit I/miRNA Isolation Kit提取总RNA。使用RT Reagent Kit(Perfect Real Time)(TakaraBio,Otsu,Japan)逆转录了500ng的RNA成cDNA。将cDNA样品用TE缓冲液稀释至80ng/μL并储存于-20℃。使用2x SYBRGreen I PCR Master Mix(Applied Biosystems,CA,USA)在LightCycler 96Real-TimePCR系统(Roche，Basel，Switzerland)上进行qRT-PCR。使用的上游引物和下游引物(F:5’-GGCTGGTTGCTTCGGTTGT-3’；R:5’-TTCCATTGCCATCTGTCCC-3’)，热循环条件如下：95℃变性2min，40cycles of 95℃for 5s，60℃ for 30s；and 95℃ for 5s，65℃ for 5s，95℃ for5s。每个qRT-PCR样品有三个重复，54775 60S基因用于内参，基因表达分析采用2ΔΔCt方法分析。由图6所示基因表达情况可知，转入pPha-T1-COCSUDRAFT_64904载体的转基因胶球藻株基因表达要显著高于野生型胶球藻株，说明COCSUDRAFT_64904基因过表达成功，其为COCSUDRAFT_64904过表达阳性胶球藻株。
四、培养COCSUDRAFT_64904基因过表达重组胶球藻株
挑取COCSUDRAFT_64904基因过表达胶球藻单藻落接入液体Basal培养基中，将接种液体培养瓶放入转速160rpm的摇床中，设置温度为28±1℃，光照强度50μmol/m2/s，光照周期12h光照:12h黑暗培养144h即得接种种子液。取上述种子液以10％接种比例(体积比)接入含有100mL Basal培养基的培养瓶中，在温度28±1℃、光照强度50μmol/m2/s、光照周期12h光照:12h黑暗、转速160rpm的恒温培养箱内培养至对数末期。收集培养至对数末期的藻液，8000g离心10min，弃上清液，以蒸馏水洗涤藻泥2-3次后放入-80℃超低温冰箱内冷冻10h，再放入冷冻干燥机冻干48h获得藻粉。称量冻干藻粉重量得生物量(g/L)，以下式计算生物量产率。
PBiomass(g/L/d)＝(x1-x0)/(t1-t0) (1)
式中，PBiomass—生物量产率(g/L/d)；x1、x0分别为培养时间t1和t0测定的生物量浓度(g/L)。
准确称取0.02g(W1)上述冻干藻粉，加入3mL水/氯仿/甲醇(v/v/v＝0.5:2:1)震荡20min充分混匀，8000rpm离心10min，收集氯仿层，萃取重复3-5次，收集氯仿层至已称重(W2)50mL离心管中，以0.5mL 1mol/L氯化钾和1mL超纯水清洗萃取管，合并所有清洗液与氯仿层，真空干燥至恒重(W3)，以式(2)和(3)计算总脂含量和产率。
CLipid(％)＝(W3-W2)/W1 (2)
PLipid(g/L/d)＝PBiomass×CLipid(％) (3)
式中，PLipid—总脂产率(g/L/d)；W1—共培养藻粉重量(g)；W2—离心管重量(g)；W3—离心管和油脂总重量；Clipid—总脂含量(％)。
准确称取20mg上述冻干藻粉加入烧瓶中，并依次加入100mg焦性没食子酸、沸石、2mL 95％乙醇混匀，再加入盐酸溶液10mL混匀。将烧瓶放入70℃～80℃水浴中水解40min(注：每隔10min振荡一次，使黏附在烧瓶壁上的颗粒物混入溶液中)，水解完成后，待烧瓶冷却至室温再加入10mL 95％乙醇混匀。将烧瓶中水解液转移至分液漏斗中，用50mL乙醚-石油醚混合液冲洗烧瓶和塞子，冲洗液合并入分液漏斗中加盖振摇5min，静置10min。将乙醚-石油醚层提取液收集到250mL烧瓶中。以上步骤重复提取水解液3次，最后用乙醚-石油醚混合液冲洗分液漏斗，合并收集到已恒重的烧瓶中，将烧瓶置水浴蒸干，再放入100℃烘箱中干燥2h。干燥完成后，加入2mL 2％NaOH-CH3OH溶液，85℃水浴30min，再加入3mL 14wt％BF3-CH3OH溶液，于85℃水浴30min。水浴完成后冷却至室温，在离心管中加入1mL正己烷，震荡萃取2min，静置1h，待分层后取上层清液100μL，用正己烷定容到1mL，采用0.45μm滤膜过滤，以Agilent 7890A气相色谱仪进行脂肪酸组成和含量的测定，HP-88(色谱柱(100m×0.25mm×0.20μm)；升温程序:100℃保持13min，以10℃/min的速率升温至180℃，保持6min，再以1℃/min的速率升温至192℃，保持9min，再以3℃/min的速率升温至230℃，保持10min；进样口温度:240℃；载气：氮气，流速:1.3mL/min；分流进样，分流:0.8；FID检测器温度:280℃。按照国家标准GB 5009.168-2016给出的计算方法，依据保留时间以及对应峰面积并以式(4)计算各脂肪酸的含量：
W＝(C*V*N)/m*k*10-4 (4)
式中，W—样品各脂肪酸的含量，单位为毫克每千克(g/100g)；C—样品测定液中脂肪酸甲酯的浓度，单位mg/L；V—容体积，单位mL；k-各脂肪酸甲酯转化为脂肪酸的换算系数；N-稀释倍数；10-4—单位换算系数；m—样品质量，单位为克(g)。
以野生型胶球藻生物量产率、总脂产率和脂肪酸含量作为对照，主要步骤为：取野生型胶球藻种子液以10％接种比例(体积比)接入含有100mL Basal培养基的培养瓶中，在温度28±1℃、光照强度50μmol/m2/s、光照周期12h光照:12h黑暗、转速160rpm的恒温培养箱内培养至对数末期。收集培养至对数末期的藻液，8000g离心10min，弃上清液，以蒸馏水洗涤藻泥2-3次后放入-80℃超低温冰箱内冷冻10h，再放入冷冻干燥机冻干48h获得藻粉。称量藻粉重量得生物量(g/L)，以上式(1)计算生物量产率。
准确称取0.02g(W1)冻干胶球藻藻粉，加入3mL水/氯仿/甲醇(v/v/v＝0.5:2:1)震荡20min充分混匀，8000rpm离心10min，收集氯仿层，萃取重复3-5次，收集氯仿层至已称重(W2)50mL离心管中，以0.5mL 1mol/L氯化钾和1mL超纯水清洗萃取管，合并所有清洗液与氯仿层，真空干燥至恒重(W3)，以上式(2)和(3)计算总脂含量和产率。
准确称取20mg上述冻干藻粉加入烧瓶中，并依次加入100mg焦性没食子酸、沸石、2mL 95％乙醇混匀，再加入盐酸溶液10mL混匀。将烧瓶放入70℃～80℃水浴中水解40min(注：每隔10min振荡一次，使黏附在烧瓶壁上的颗粒物混入溶液中)，水解完成后，待烧瓶冷却至室温再加入10mL 95％乙醇混匀。将烧瓶中水解液转移至分液漏斗中，用50mL乙醚-石油醚混合液冲洗烧瓶和塞子，冲洗液合并入分液漏斗中加盖振摇5min，静置10min。将乙醚-石油醚层提取液收集到250mL烧瓶中。以上步骤重复提取水解液3次，最后用乙醚-石油醚混合液冲洗分液漏斗，合并收集到已恒重的烧瓶中，将烧瓶置水浴蒸干，再放入100℃烘箱中干燥2h。干燥完成后，加入2mL 2wt％NaOH-CH3OH溶液，85℃水浴30min，再加入3mL 14wt％BF3-CH3OH溶液，于85℃水浴30min。水浴完成后冷却至室温，在离心管中加入1mL正己烷，震荡萃取2min，静置1h，待分层后取上层清液100μL，用正己烷定容到1mL，采用0.45μm滤膜过滤，以Agilent 7890A气相色谱仪进行脂肪酸组成和含量的测定，HP-88(色谱柱(100m×0.25mm×0.20μm)；升温程序:100℃保持13min，以10℃/min的速率升温至180℃，保持6min，再以1℃/min的速率升温至192℃，保持9min，再以3℃/min的速率升温至230℃，保持10min；进样口温度:240℃；载气：氮气，流速:1.3mL/min；分流进样，分流:0.8；FID检测器温度:280℃。按照国家标准GB 5009.168-2016给出的计算方法，依据保留时间以及对应峰面积并以上式(4)计算各脂肪酸的含量。
由图7所示结果可知，COCSUDRAFT_64904基因过表达重组胶球藻株生长明显优于野生型胶球藻株，其对数生长末期生物量和生物量产率分别增加至1.40倍和1.40倍，油脂合成积累效率也显著高于野生型胶球藻株，总脂含量和总脂产率提高至1.77倍和2.54倍(图8所示)，这说明过表达COCSUDRAFT_64904基因能够显著促进胶球藻生长和脂质积累。此外，COCSUDRAFT_64904基因过表达还调控了优势脂肪酸的比例，其中特别显著地上调了C8:1油酸、C18:2亚油酸和C18:3亚麻酸含量，使其提高至1.54倍、1.68倍和2.04倍(图9所示)。
Claims (8)
1.一种胶球藻基因在调控生长和脂质合成中的应用，其特征在于，先根据所述胶球藻基因序列设计引物并通过PCR扩增胶球藻基因扩增产物；然后根据胶球藻基因序列和pPha-T1载体信息设计带有载体同源部分片段和酶切位点的引物，并通过同源重组法将胶球藻基因构建进入pPha-T1载体获得重组质粒；再将重组质粒经电转化转入胶球藻筛选过表达胶球藻基因的阳性重组藻；最后培养过表达胶球藻基因的重组藻获得高油脂产率；
所述胶球藻基因为胶球藻脱落酸代谢通路上SnRK2基因家族中的COCSUDRAFT_64904基因；
所述胶球藻基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的通过PCR扩增胶球藻基因扩增产物，具体包括：1)提取胶球藻全基因组作为模板；2)根据胶球藻基因序列设计引物：上游引物序列：5’-GGCTTGTTGGTGGATTGTGAT-3’，下游引物序列：5’-CTCTAGGCGTTGGCGGTT A-3’；3)PCR扩增：通过PCR扩增得到胶球藻基因扩增产物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，同源重组法构建重组质粒，具体包括：a)根据COCSUDRAFT_64904的基因序列和pPha-T1载体信息设计引物：上游引物序列：5’-GTCTGC CGTTTCGAGAATTCGGCTTGTTGGTGGATTGTGAT-3’，下游引物序列：5’-ATAGCACGCTTCTGAAGCTTCTCTAGGCGTTGGCGGTTA-3’，引物两端分别包括载体的部分序列即划横线处和酶切位点即划波浪线处作为同源臂；b)PCR扩增：通过PCR扩增得到COCSUDRAFT_64904基因扩增产物，扩增产物带有pPha-T1载体的部分序列和酶切位点；c)重组质粒的获得：通过同源重组方法，将COCSUDRAFT_64904基因构建进入pPha-T1载体得到重组质粒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤b)PCR扩增的反应体系为：体积比为1-3：25-30：1-3：1-3：15-20的DNA，2×Phanta Max Buffer，上游引物，下游引物和ddH2O；PCR扩增程序为：预变性92-98℃2-5min，变性92-98℃20-40s，退火50-60℃20-40s，延伸70-74℃0.5-2min，彻底延伸6-12min，20-40个循环；PCR扩增产物用0.5wt％-2wt％琼脂糖凝胶电泳纯化回收，得到COCSUDRAFT_64904基因的同源重组扩增产物。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤c)具体为将pPha-T1双酶切产物与COCSUDRAFT_64904同源重组产物进行同源重组反应，反应体系为：用量比为80-120ng：80-120ng：1-3μL：3-5μL：8-12μL的pPha-T1双酶切产物，COCSUDRAFT_64904PCR同源重组产物，Exnase II，5×CE II Buffer和ddH2O，36-38℃反应25-35min；将同源产物进行大肠杆菌转化，鉴定获得含有pPha-T1-COCSUDRAFT_64904重组质粒的阳性菌。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的过表达胶球藻基因的阳性重组藻构建为将获得的重组质粒通过电转化方法转入胶球藻中，并通过抗生素筛选和表达量检测方式筛选得到过表达COCSUDRAFT_64904基因的阳性重组藻株。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的过表达胶球藻基因的阳性重组藻构建，具体为将pPha-T1-COCSUDRAFT_64904质粒用Sca I进行质粒线性化处理，酶切体系为：20μLpPha-T1-COCSUDRAFT_64904，1μL Sca I，5μL 10×QuickCut Buffer，37℃酶切30min，100μL重悬胶球藻细胞与4μg线性化pPha-T1-COCSUDRAFT_64904质粒和40μg鲑精DNA，在冰上孵育至少10min后进行电穿孔，电穿孔后细胞立即转移到含有10mLBasal培养液的试管中，在黑暗条件下复苏24h，再转移到正常光强下培养24h，然后4000g离心10min收集细胞并用0.6mL Basal培养液重悬细胞，经过博来霉素筛选得到初步阳性藻；再经表达量检测方式筛选得到过表达COCSUDRAFT_64904基因的阳性重组藻。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的培养过表达胶球藻基因的重组藻获得高油脂产率，具体为：挑取过表达胶球藻基因的重组单克隆藻接入Basal培养基培养至对数末期，对重组藻培养液进行离心清洗得到藻泥，经冷冻干燥获得藻粉，称重藻粉获得藻生物量；同步将获得藻粉经有机溶剂抽提得油脂，基于生物量计算油脂产率；再将提取油脂皂化获得脂肪酸甲酯，以GC内标法测定脂肪酸组分和含量。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211321173.4A CN115927407B (zh) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | 一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211321173.4A CN115927407B (zh) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | 一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115927407A CN115927407A (zh) | 2023-04-07 |
| CN115927407B true CN115927407B (zh) | 2024-06-25 |
Family
ID=86553077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211321173.4A Active CN115927407B (zh) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | 一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115927407B (zh) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004113379A1 (en) * | 2003-06-20 | 2004-12-29 | Ares Trading S.A. | Interferon gamma-like protein |
| CN109390036B (zh) * | 2018-10-31 | 2021-08-24 | 湘潭大学 | 一种挖掘甄选微藻油脂合成代谢标志物的方法 |
| CN115197947B (zh) * | 2022-05-26 | 2023-05-12 | 宁波大学 | 一种三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因及其编码蛋白和应用 |
-
2022
- 2022-10-26 CN CN202211321173.4A patent/CN115927407B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《GenBank》.2015,1-2. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115927407A (zh) | 2023-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3778866B1 (en) | Recombinant yeast strain for producing nervonic acids and application thereof | |
| CN112695047B (zh) | 一种三角褐指藻中表达外源丙酮酸磷酸双激酶的突变株用于生产岩藻黄质的方法 | |
| CN103014053B (zh) | 集胞藻高效双同源重组载体及其构建方法与应用 | |
| CN115927407B (zh) | 一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用 | |
| CN103087998B (zh) | 冬虫夏草合成十六烷基-辅酶a的酶、基因及其应用 | |
| CN114990153B (zh) | 水稻脂质转移蛋白在提高稻米脂肪酸含量和降低稻米垩白度中的应用 | |
| CN114525215B (zh) | 产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用 | |
| CN115820712A (zh) | 一种利用酿酒酵母工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法 | |
| JP4221476B2 (ja) | イコサペンタエン酸生合成遺伝子群をクローニングしたプラスミド及びイコサペンタエン酸を産生するラン藻 | |
| CN108330114B (zh) | 一种利用epa的甘油二酯酰基转移酶及其应用 | |
| CN114958636A (zh) | 一株高产石榴酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用 | |
| TWI589692B (zh) | 微藻及其用途 | |
| JP2023549946A (ja) | 酵母によるネルボン酸および油脂の合成における脂肪酸伸長酵素遺伝子およびエステラーゼ遺伝子の使用 | |
| CN110551702B (zh) | 重组塔宾曲霉单宁酶及其表达和应用 | |
| CN103589737B (zh) | 一种微藻三酰甘油合成调控基因及其应用 | |
| CN113512100A (zh) | LipR蛋白及其编码基因在调控DHA和油脂合成中的应用 | |
| CN117660499A (zh) | 胶球藻脂肪酸硫酯酶基因及其在提高亚油酸合成中的应用 | |
| CN102978177B (zh) | 冬虫夏草合成代谢二十碳五烯酸的△-5-脱氢酶、基因及应用 | |
| CN111909952B (zh) | 构建食烷菌敲除酰基辅酶a硫脂酶基因的方法和应用 | |
| CN116606868B (zh) | 一种乙酰CoA合成酶基因RkACS2及其应用 | |
| CN114606150B (zh) | 一种产γ-亚麻酸的基因工程菌株、其构建方法及其应用 | |
| CN117186197A (zh) | 小球藻转录因子bZIP及其应用 | |
| CN103074311B (zh) | 冬虫夏草中国被毛孢合成乙酸的酶、基因及其应用 | |
| CN111206023A (zh) | 一种高效提高微藻甘油三酯含量的代谢工程方法 | |
| CN103013946B (zh) | 一种冬虫夏草十六烷辅酶a水解酶、基因及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |