CN115197947B - 一种三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

一种三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因及其编码蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因及其编码蛋白和应用，特点是该基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，该基因过表达重组藻构建方法包括根据PtHSF1的基因序列和pPha‑T1‑GFP载体信息设计引物的步骤；通过PCR扩增得到PtHSF1同源重组产物后通过同源重组方法，将PtHSF1基因构建进pPha‑T1‑GFP载体中得到重组质粒的步骤；最后将重组质粒通过电转化的方法转化进三角褐指藻中，并通过抗生素筛选和表达量检测方式筛选得到阳性过表达PtHSF1的重组藻的步骤；优点是可显著提高三角褐指藻中油脂和岩藻黄素含量。

Description

一种三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因及其编码蛋白和应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，尤其是涉及一种三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因及其编码蛋白和应用。
背景技术
硅藻在全球生态系统和全球碳循环中发挥着重要作用，占全球海洋总碳固定量的40%，占地球初级生产力的20%。此外，硅藻还富含有价值的活性物质，如可用于生产生物柴油的脂质和具有医学价值的岩藻黄质。
在某些情况下，硅藻可以以脂质（主要是三酰基甘油）的形式储存碳和能量，在正常培养条件下，脂质可占硅藻干重的20%。三酰基甘油可以通过两种不同的途径在硅藻中合成，要么涉及酰基辅酶a依赖的从头合成（也称为Kennedy途径的一部分），要么涉及通过降解主要存在的细胞器膜的酰基辅酶a独立途径。Kennedy途径需要三个顺序的酰化，其中甘油-2-磷酸酰基转移酶(GPAT）催化甘油-3-磷酸(G3P）和酰基辅酶a转化为溶血磷脂酸(LPA)，LPAT然后将LPA转化为磷脂酰磷酸(PA），最后磷脂酸磷酸酶(PAP）和二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)将PA衍生的二酰基甘油(DAG）转移到三酰基甘油。
岩藻黄质是一种具有抗炎、减肥、抗肿瘤等活性的光合色素。岩藻黄质的合成始于甘油醛3-磷酸(G3P)，通过1-脱氧-d-木黄糖5-磷酸合酶(DXS)、植物烯合酶(PSY)、植物烯去饱和酶(PDS)、ζ-胡萝卜素去饱和酶(ZDS)和类胡萝卜素异构酶(CRTISO)产生番茄红素。番茄红素在番茄红素β-环化酶(LCYB)的催化下转化为β-胡萝卜素，在β-胡萝卜素羟化酶(BCH)或其他同工酶的作用下最终转化为β-隐黄质和玉米黄质。在玉米黄质环氧化酶(ZEP)的催化下，玉米黄质转化为蒽黄质，然后转化为紫黄质。在紫外黄嘌呤脱氧酶(VDE)的存在下，这些转化在强光下是可逆的。最后，紫黄质通过一系列未知的酶促反应生成岩藻黄质。
热休克转录因子是一类普遍存在于高等植物中的转录因子，可以对各种胁迫产生响应。热休克转录因子也可能在微藻的胁迫反应中发挥重要作用。例如，氮和磷缺乏胁迫导致三角褐藻中许多热休克转录因子的表达。转录组分析显示，在该物种的不同生长阶段，热休克转录因子是表达差异最大的转录因子。事实上，热休克转录因子占三角褐藻所有转录因子的34.18%。然而，尽管这些迹象表明热休克转录因子在微藻中发挥着重要作用，但热休克转录因子在微藻中的具体功能尚未有研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可显著提高三角褐指藻中油脂和岩藻黄素含量的三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因及其编码蛋白和应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2、一种三角褐指藻热激转录因子PtHSF1编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3、上述三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因的克隆方法，包括如下步骤：
（1）提取三角褐指藻总RNA并反转录成cDNA作为模板；
（2）根据PtHSF1的基因序列设计引物：
上游引物序列：5’-ATGCATTATAGCAGCGATGG-3’，
下游引物序列：5’-CTAGAGAAAGCGGAAAACATC-3’;
（3）PCR扩增：通过PCR扩增得到PtHSF1基因扩增产物。
4、上述三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因过表达重组藻构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）根据PtHSF1的基因序列和pPha-T1-GFP载体信息设计引物：上游引物序列：5’-CGGGGATCCTCTAGAGTCGACATGCATTATAGCAGCGATGG-3’，下游引物序列：5’-GCCCTTGCTCACCAT GTCGACGAGAAAGCGGAAAACATCAC-3’，引物两端分别包括载体的序列作为同源臂（划线处）；
（2）PCR扩增：通过PCR扩增得到PtHSF1同源重组产物；
（3）重组质粒的获得：通过同源重组方法，将PtHSF1基因构建进pPha-T1-GFP载体中得到重组质粒；
（4）过表达PtHSF1重组藻的获得：将重组质粒通过电转化的方法转化进三角褐指藻中，并通过抗生素筛选和表达量检测方式筛选得到阳性过表达PtHSF1的重组藻。
优选的，步骤（2）PCR扩增的反应体系为：0.5μL PtHSF1-T载体，10μL 2×PrimeSTAR Max Premix，上、下游引物各0.5μL，8 .5μL ddH2O；PCR 扩增程序为：变性98℃10s，退火55℃ 15s，延伸，72℃ 1min，30个循环；PCR扩增产物用1wt%琼脂糖凝胶电泳纯化回收，得到PtHSF1同源重组产物。
优选的，步骤（3）具体为将pPha-T1-GFP单酶切产物与PtHSF1同源重组产物进行同源重组反应，反应体系为：2μL pPha-T1-GFP单酶切产物，2μL PtHSF1同源重组产物，2μLExnase II，4μL 5×CE II Buffer，10μL ddH2O，37℃反应30min，将同源产物进行大肠杆菌转化，鉴定获得含有pPha-T1-GFP-PtHSF1质粒。
优选的，步骤（4）具体将pPha-T1-GFP-PtHSF1质粒用ScaI进行质粒线性化处理，酶切体系为：26μL pPha-T1-GFP-PtHSF1，1μL ScaI，3μL 10×FastDigest buffer（ThermoScientific），37℃酶切3小时，酶切产物用胶回收试剂盒进行清洗回收；将密度为2×109cell/ml的100µl重悬三角褐指藻细胞与4µg线性化pPha-T1-GFP-PtHSF1质粒和40µg鲑精DNA，在冰上孵育至少10min后进行电穿孔，电穿孔后细胞立即转移到含有10ml f/2培养液的试管中，在低光强下孵育24h，再转移到正常光强下培养24h，然后3000g离心10min收集细胞并用0.6ml f/2培养液重悬细胞，经过博来霉素筛选得到初步阳性藻；再经表达量检测方式筛选得到阳性过表达PtHSF1的重组藻。
5、上述三角褐指藻热激转录因子PtHSF1在提高三角褐指藻中油脂和/或岩藻黄素合成方面的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于
1、首次证实了过表达三角褐指藻中热激转录因子PtHSF1能够促进油脂和岩藻黄素的含量提高；
2、过表达PtHSF1能够为工业化利用三角褐指藻产油脂和岩藻黄素提供新的藻种。
附图说明
图1为过表达 PtHSF1重组藻阳性藻鉴定分析，注：a：线性化pPha-T1-GFP-PtHSF1载体结构图： PtHSF1与 GDP的表达受 fcpA启动子驱使，博来霉素抗性基因 sh ble的表达受 fcpB启动子驱使，载体在大肠杆菌中的筛选抗生素为氨苄青霉素（Amp），载体线性化所用的酶为ScaI；b：PtHSF1过表达重组藻中PtHSF1基因表达情况分析：柱子上字母不同表示统计分析上有显著差异（ t检验， p<0.05），WT表示野生型三角褐指藻，GFP表示转入pPha-T1-GFP载体的转基因三角褐指藻，5#，6#和13#表示不同转入pPha-T1-GFP-PtHSF1载体的转基因三角褐指藻株系；c：PtHSF1过表达重组藻GFP表达分析，注：bar=20μm；
图2为过表达PtHSF1重组藻中岩藻黄素含量分析，注：柱子上字母不同表示统计分析上有显著差异（ t检验， p<0.05），WT表示野生型三角褐指藻，5#，6#和13#表示不同转入pPha-T1-GFP-PtHSF1载体的转基因三角褐指藻株系；
图3为过表达PtHSF1重组藻中岩藻黄素合成相关基因表达，注：DXS：1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase; PSY1：phytoene synthase 1；CRTISO5: carotenoidisomerase 5; ZEP1: zeaxamthin eposidase 1；柱子上字母不同表示统计分析上有显著差异（ t检验， p<0.05），WT表示野生型三角褐指藻，5#，6#和13#表示不同转入pPha-T1-GFP-PtHSF1载体的转基因三角褐指藻株系；
图4为过表达PtHSF1重组藻中油脂含量分析，注：A：PtHSF1过表达重组藻尼罗红定量检测中性脂分析：柱子上字母不同表示统计分析上有显著差异（ t检验， p<0.05），WT表示野生型三角褐指藻，5#，6#和13#表示不同转入pPha-T1-GFP-PtHSF1载体的转基因三角褐指藻株系；B：PtHSF1过表达重组藻尼罗红定性检测中性脂分析：WT表示野生型三角褐指藻，5#，6#和13#表示不同转入pPha-T1-GFP-PtHSF1载体的转基因三角褐指藻株系； bar= 20μm；
图5为过表达PtHSF1重组藻中油脂合成相关基因表达，注：PtHSF1过表达重组藻中中性脂合成相关基因表达分析: GPAT3：glycerol-3-phosphate acyltransferases 3；LPAT2: lysophosphatidic acid acyltransferase 2; PAP: phosphatidatephosphatase; DGAT2D：diacylglycerol acyltransferase 2D；柱子上字母不同表示统计分析上有显著差异（ t检验， p<0.05），WT表示野生型三角褐指藻，5#，6#和13#表示不同转入pPha-T1-GFP-PtHSF1载体的转基因三角褐指藻株系。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因克隆与序列分析
1、提取对数期三角褐指藻（藻浓度为1×106 cells/ml）总RNA并反转录成cDNA作为模板。
2、根据Genebank中PtHSF1的基因序列设计引物：
上游引物序列：5’-ATGCATTATAGCAGCGATGG-3’；
下游引物序列：5’-CTAGAGAAAGCGGAAAACATC-3’。
3、PCR扩增：通过PCR扩增得到PtHSF1基因扩增产物，PCR扩增的反应体系为：0.5μLcDNA，10μL 2×PrimeSTAR Max Premix（PCR扩增试剂盒：2×PrimeSTAR Max Premix购自宝成生物公司），上、下游引物各0.5μL，8.5μL ddH2O；PCR 扩增程序为：变性98℃ 10s，退火55℃ 15s，延伸，72℃ 1min，30个循环；
4、将PCR扩增产物用1wt% 琼脂糖凝胶电泳纯化回收后与pMD19-T载体连接，经PCR进一步验证后测序，获得PtHSF1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示：ATGCATTATAGCAGCGATGGACATCCAAAGACGAACTTTATTGACGATGTTGAGCAGGGAGTGCAAACGGATTCGGTCGTCAGCATTGCAAAATCAGATTGCTGTTCTTCAATTCGAAGCAAGAAAAAATATTGTATGGACGGTAGTATTGATGCTGCACCAAATACGGTTTCGTCCCTGTTCCGTACGTCAACTGCTCGCATAACTCTGGCATCCACAGGTGAATTAAGCTGTATGGGAGATAGCGAAATGTTCCAAACAATCAGCTCCGGTCAAGTCGCCAAACCGCTGCATAATAGATTCGGTCGCGCTTTTGTGTCACATGAGTACGAGGACAACTACCGCGAAGCCATCAATCATCGAAACGATGAGTCTTCAACCCACGGTACGCCGAAGAAAATTTATTTTCGTGGTGGAACAGCCATGCATTTTCCTGAACGTCTCTTTGAGATGTTGCAGCAGGTCGAAGAGCTCGGAATCTCCCATATTGTCTCTTGGCAGCCTCATGGACGCTCTTTCCTTGTACATCGTCCTCGAGAATTTGTATCGCAAGTTATGCCAAAATTTTATCGGCAGACTAGATTCACGTCCTTTCAGCGCCAACTCAATCTATACGGTTTTACTCGTTTGAGCACAGGGCGAGACTGCGGTAGTTACTACAACGCAAACTTCCTCAGGGGTTGTCCTCTACTTTGCCGTCGTATTGTCCGTCGACGCATCAAGGGCAATGGTGTCAAGCCAGTCCCTTCGCCAACCACAGAACCTGACTTTTACAACATGGAATGGTGCGAGGACTCCGGTCCACGGCCAACCTTTCACGAGAAGCCATCTTTCGGAATCTGTGGTGGTACTGCTCCTCAAACCTCGTGCTTCCAACAAATTTTAAATTCAAGCGCTGCTTCTTACGATCCTTGGAACATAACAAGCCCATATCATGAGCAGCCAGGGTACACCACGCAGGTAGCCTCGCCTGAAATCGCAATGAGCCACCTTCAGATTCCTGAAAGTCTTCTTTATTCGCAGCAGATGGCTCAATGCTGTCGACGCAGCAATCTCCCTACAGCCTCTAGCTCTAGCATCTACCCTTGGACTTTAGGCAGGTCTACCACCACCGAAAATGGTTCGAACGAGGATATGGTAGAAGGATTACGCCAATACCTTCCGGACCATTTTGTGGAAAATGACCAAGCGTTGATACTCCTTAGTAGCATTTGTGATACAGAGGAAGATTCATTGTATGCCCCAGTTGATGGTGATGTTTTCCGCTTTCTCTAG。
三角褐指藻热激转录因子PtHSF1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示：MHYSSDGHPKTNFIDDVEQGVQTDSVVSIAKSDCCSSIRSKKKYCMDGSIDAAPNTVSSLFRTSTARITLASTGELSCMGDSEMFQTISSGQVAKPLHNRFGRAFVSHEYEDNYREAINHRNDESSTHGTPKKIYFRGGTAMHFPERLFEMLQQVEELGISHIVSWQPHGRSFLVHRPREFVSQVMPKFYRQTRFTSFQRQLNLYGFTRLSTGRDCGSYYNANFLRGCPLLCRRIVRRRIKGNGVKPVPSPTTEPDFYNMEWCEDSGPRPTFHEKPSFGICGGTAPQTSCFQQILNSSAASYDPWNITSPYHEQPGYTTQVASPEIAMSHLQIPESLLYSQQMAQCCRRSNLPTASSSSIYPWTLGRSTTTENGSNEDMVEGLRQYLPDHFVENDQALILLSSICDTEEDSLYAPVDGDVFRFL。
 具体实施例二
PtHSF1过表达重组藻获得
1、根据PtHSF1的基因序列和pPha-T1-GFP载体信息设计引物：上游引物序列：5’-CGGGGATCCTCTAGAGTCGACATGCATTATAGCAGCGATGG-3’，下游引物序列：5’-GCCCTTGCTCACCAT GTCGACGAGAAAGCGGAAAACATCAC-3’，引物两端分别包括载体的序列作为同源臂（划线处）。
2、PCR扩增：通过PCR扩增得到PtHSF1同源重组产物，PCR扩增的反应体系为：0.5μLPtHSF1-T载体，10μL 2×PrimeSTAR Max Premix（PCR扩增试剂盒：2×PrimeSTAR MaxPremix购自宝成生物公司），上、下游引物各0.5μL，8 .5μL ddH2O；PCR 扩增程序为：变性98℃ 10s，退火55℃ 15s，延伸，72℃ 1min，30个循环；PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收，得到PtHSF1同源重组产物。
3、载体构建：将载体pPha-T1-GFP用SalI进行单酶切，酶切体系为：26μL pPha-T1-GFP，1μL SalI，3μL 10×FastDigest buffer（Thermo Scientific），37℃酶切3小时，酶切产物用胶回收试剂盒进行清洗回收。
将pPha-T1-GFP单酶切产物与PtHSF1同源重组产物进行同源重组反应，反应体系为：2μL pPha-T1-GFP单酶切产物，2μL PtHSF1同源重组产物，2μL Exnase II，4μL 5×CEII Buffer，10μL ddH2O，37℃反应30min，将同源产物进行大肠杆菌转化，鉴定获得含有pPha-T1-GFP-PtHSF1质粒。
4、三角褐指藻转化：提取pPha-T1-GFP-PtHSF1质粒，并用ScaI进行质粒线性化处理（图1a），酶切体系为：26μL pPha-T1-GFP-PtHSF1，1μL ScaI，3μL 10×FastDigestbuffer（Thermo Scientific），37℃酶切3小时，酶切产物用胶回收试剂盒进行清洗回收。
三角褐指藻生长到对数期密度为4×106-5×106 cell/ml，在4℃下3000g离心10min收集总共2×108个细胞，用1ml 375mM的山梨醇（无菌冷冻）重悬藻细胞3次，最后重悬到100µl 375mM的山梨醇中使藻的最终密度为2×109cell/ml，放在冰上待用。将100µl重悬藻细胞与4µg的线性化pPha-T1-GFP-PtHSF1质粒和40µg鲑精DNA（95℃以上的水浴煮沸1min变性），在冰上孵育至少10min，然后转移放入2mm电穿孔比色皿中，使用bio-rad的电穿孔仪进行电穿孔。将电穿孔系统调整为指数衰减，0.5kv场强，25μF电容和400欧姆并联电阻。电穿孔后细胞立即转移到含有10ml f/2培养液的15ml 试管中，在低光强（30μmol.m-2.s-1）下孵育24h，再转移到正常光强下培养24h，然后3000g离心10min收集细胞并用0.6ml f/2培养液重悬该细胞，平均涂布于3个含有75µg/ml的博来霉素的固体培养基上，15-25d后出现藻落，这些单藻落可认为是经过博来霉素筛选得到的初步阳性藻，可进行下一步处理。
4、PtHSF1过表达阳性藻鉴定
转基因藻细胞在含有50µg/mL 博来霉素的选择性液体f/2培养基中正常摇动培养（150r/min）作为预培养物以达到对数期。取50ml对数期藻液在4℃以4000×g离心5min并弃去上清液，得到的沉淀物在液氮中快速冷冻。在液氮中研磨成冷冻粉末，并使用RNeasyPlant Mini Kit（QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA）/Total RNA Kit I/miRNA IsolationKit提取总RNA。使用PrimeScript® RT Reagent Kit (Perfect Real Time) (Takara Bio,Otsu, Japan)逆转录了500ng的RNA成cDNA。将cDNA样品用TE缓冲液稀释至80ng/µL并储存于-20℃。使用2x SYBR Green I PCR Master Mix（Applied Biosystems，CA，USA）在LightCycler 96 Real-Time PCR 系统（Roche，Basel，Switzerland）上进行qRT-PCR。使用的正向引物和反向引物在（表1）中，热循环条件如下：95℃变性2min，40 cycles of 95℃for 5 s，60℃ for 30 s；and 95℃ for 5s，65℃ for 5s，95℃ for 5s。每个qRT-PCR样品有三个重复，actin基因用于内参，基因表达分析采用2-ΔΔCt的方法分析。图1b结果显示，PtHSF1过表达重组藻中，转基因株系5#，6#和13#中PtHSF1的表达量较对照WT和GFP要显著升高。
表1 本专利中所用到的定量PCR引物
注：Actin作为内参基因。
进一步验证PtHSF1转基因藻株中PtHSF1蛋白表达情况，使用了LSM880激光扫描共聚焦显微镜对PtHSF1蛋白进行定位检测。LSM880配备了Plan-Apochromat 63 ×/1.4 OilDIC M27物镜，用于可视化。使用65mW的氩激光（激发最大值）在488nm可以激发三角褐指藻中GFP和叶绿体（chl）的自发荧光，并且分别在500-553nm和695-760nm的荧光发射。核酸通过DAPI染色以指示细胞核的位置，使用346nm的激发波长和430-600nm的发射波长可视化细胞核中的DNA。细胞核与GFP定位进行比较，观察对照与实验组定位覆盖情况。最后，使用ZEN3.2软件进行图像处理。
由图1c结果可以看到转基因株系5#，6#和13#中的绿色荧光定位于细胞核中，而而对照GFP中的绿色荧光遍布于整个细胞，因此，PtHSF1转基因藻株5#，6#和13#构建成功。
具体实施例三
PtHSF1过表达藻中岩藻黄素含量
根据Kwon等人的方法并加以修改。收集10mL在对数初期的转基因粗液体并用血球计数板记下每株转基因藻的密度，4℃下4000×g离心10min，弃去上清液。加入10mL乙醇充分混匀，并在24-30℃通过超声（新芝牌超声仪）1h提取岩藻黄素。过滤上清液（0.22µm）用于HPLC分析。全程在黑暗条件下进行。由G1312A二元泵、G1367B自动进样器、G1315D PDA检测器和G1316A柱温箱组成的Agilent 1200 HPLC系统（Agilent Technologies，美国）用于岩藻黄质定量。流动相，即甲醇和水，以0.7 mL min-1的流速洗脱在35℃。YMC类胡萝卜素柱（250 mm长×4.6 mm内径；5μm 粒径；Waters，美国）用于在以下梯度程序下进行分离：甲醇从90%增加到100%持续20分钟，保持在100%接下来的5分钟，降低到90% 5分钟，然后保持在90% 5分钟。注入样品溶液(10 μL)，并在445nm处记录色谱图。基于浓度范围为0.5–50μgmL-1的校准曲线对岩藻黄质进行定量。图2结果显示，PtHSF1过表达藻株5#，6#和13#中岩藻黄素含量显著高于对照组。
设计岩藻黄素合成相关基因的定量PCR引物（引物见表1），进行定量PCR检测基因表达，图3为过表达PtHSF1重组藻中岩藻黄素合成相关基因表达结果，由图可知PtHSF1过表达藻株5#，6#和13#中岩藻黄素合成相关基因DXS（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphatesynthase），PSY1（phytoene synthase 1），CRTISO5 (carotenoid isomerase 5), ZEP1(zeaxamthin eposidase 1)的表达也显著高于对照组，柱子上字母不同表示统计分析上有显著差异（ t检验， p<0.05）。这些结果表明PtHSF1过表达能够提高三角褐指藻中岩藻黄素的含量。
 具体实施例四
PtHSF1过表达藻中中性脂含量
转基因三角褐指藻生长至对数期5×106 cell/mL，常温3000g离心10min，弃去上清液，用新鲜的f/2重悬藻细胞使其浓度不变。将重悬的藻细胞与20％DMSO在室温下孵育20min。然后将30µL尼罗红（丙酮中0.1mg/mL）按照1：100比例加入3mL预处理藻细胞中，快速倒置混合并在黑暗中孵育20min，将染色的藻细胞转移到96孔板中，用酶标仪检测荧光强度，每个样品三个平行，使用的波长为530nm的激发波长和580nm的发射波长。相对荧光强度提供了样品之间的中性脂质含量的定量比较。图4a结果显示，PtHSF1过表达重组藻中中性脂含量较对照要显著升高。
油脂含量定性检测使用LSM880激光扫描共聚焦显微镜，LSM880配备了Plan-Apochromat 63 ×/1.4 Oil DIC M27物镜。对于脂滴的观察，采用与中性脂质一样的染色方法，并将样品稀释100倍，激发波长为488nm，发射波长为505-550nm用于可视化。图4b结果显示，PtHSF1过表达重组藻中油滴大小较对照要显著增多。这进一步说明PtHSF1过表达增加中性脂的含量。
设计中性脂合成相关基因的定量PCR引物（引物见表1），进行定量PCR检测基因表达，图5基因表达结果显示，PtHSF1过表达藻株中中性脂合成相关基因GPAT3（glycerol-3-phosphate acyltransferases 3）；LPAT2（lysophosphatidic acid acyltransferase 2）；PAP（ phosphatidate phosphatase）；DGAT2D（diacylglycerol acyltransferase 2D）的表达也显著高于对照组。这些结果表明PtHSF1过表达能够提高三角褐指藻中中性脂的含量。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 一种三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因及其编码蛋白和应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1275
<212> DNA
<213>三角褐指藻热激转录因子PtHSF1基因（ATGCATTATAGCAGCGATGGACATCCAAAGACGAACTTTATTGACGATGTTGAGCAGGGAGTGCAAACGGATTCGGTCGTCAGCATTGCAAAATCAGATTGCTGTTCTTCAATTCGAAGCAAGAAAAAATATTGTATGGACGGTAGTATTGATGCTGCACCAAATACGGTTTCGTCCCTGTTCCGTACGTCAACTGCTCGCATAACTCTGGCATCCACAGGTGAATTAAGCTGTATGGGAGATAGCGAAATGTTCCAAACAATCAGCTCCGGTCAAGTCGCCAAACCGCTGCATAATAGATTCGGTCGCGCTTTTGTGTCACATGAGTACGAGGACAACTACCGCGAAGCCATCAATCATCGAAACGATGAGTCTTCAACCCACGGTACGCCGAAGAAAATTTATTTTCGTGGTGGAACAGCCATGCATTTTCCTGAACGTCTCTTTGAGATGTTGCAGCAGGTCGAAGAGCTCGGAATCTCCCATATTGTCTCTTGGCAGCCTCATGGACGCTCTTTCCTTGTACATCGTCCTCGAGAATTTGTATCGCAAGTTATGCCAAAATTTTATCGGCAGACTAGATTCACGTCCTTTCAGCGCCAACTCAATCTATACGGTTTTACTCGTTTGAGCACAGGGCGAGACTGCGGTAGTTACTACAACGCAAACTTCCTCAGGGGTTGTCCTCTACTTTGCCGTCGTATTGTCCGTCGACGCATCAAGGGCAATGGTGTCAAGCCAGTCCCTTCGCCAACCACAGAACCTGACTTTTACAACATGGAATGGTGCGAGGACTCCGGTCCACGGCCAACCTTTCACGAGAAGCCATCTTTCGGAATCTGTGGTGGTACTGCTCCTCAAACCTCGTGCTTCCAACAAATTTTAAATTCAAGCGCTGCTTCTTACGATCCTTGGAACATAACAAGCCCATATCATGAGCAGCCAGGGTACACCACGCAGGTAGCCTCGCCTGAAATCGCAATGAGCCACCTTCAGATTCCTGAAAGTCTTCTTTATTCGCAGCAGATGGCTCAATGCTGTCGACGCAGCAATCTCCCTACAGCCTCTAGCTCTAGCATCTACCCTTGGACTTTAGGCAGGTCTACCACCACCGAAAATGGTTCGAACGAGGATATGGTAGAAGGATTACGCCAATACCTTCCGGACCATTTTGTGGAAAATGACCAAGCGTTGATACTCCTTAGTAGCATTTGTGATACAGAGGAAGATTCATTGTATGCCCCAGTTGATGGTGATGTTTTCCGCTTTCTCTAG）
<400> 1
<210> 2
<211> 424
<212> RNA
<213>三角褐指藻热激转录因子PtHSF1编码的蛋白质（MHYSSDGHPKTNFIDDVEQGVQTDSVVSIAKSDCCSSIRSKKKYCMDGSIDAAPNTVSSLFRTSTARITLASTGELSCMGDSEMFQTISSGQVAKPLHNRFGRAFVSHEYEDNYREAINHRNDESSTHGTPKKIYFRGGTAMHFPERLFEMLQQVEELGISHIVSWQPHGRSFLVHRPREFVSQVMPKFYRQTRFTSFQRQLNLYGFTRLSTGRDCGSYYNANFLRGCPLLCRRIVRRRIKGNGVKPVPSPTTEPDFYNMEWCEDSGPRPTFHEKPSFGICGGTAPQTSCFQQILNSSAASYDPWNITSPYHEQPGYTTQVASPEIAMSHLQIPESLLYSQQMAQCCRRSNLPTASSSSIYPWTLGRSTTTENGSNEDMVEGLRQYLPDHFVENDQALILLSSICDTEEDSLYAPVDGDVFRFL）
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> PtHSF1的基因上游扩增引物（5’-ATGCATTATAGCAGCGATGG-3’）
<400> 3
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> PtHSF1的基因下游扩增引物（5’-CTAGAGAAAGCGGAAAACATC-3’）
<400>4
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> PtHSF1的基因序列和pPha-T1-GFP载体的上游引物（5’-CGGGGATCCTCTAGAGTCGACATGCATTATAGCAGCGATGG-3’）
<400> 5
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> PtHSF1的基因序列和pPha-T1-GFP载体的下游引物（5’-GCCCTTGCTCACCATGTCGACGAGAAAGCGGAAAACATCAC-3’）
<400> 6
<210>7
<211> 21
<212> DNA
<213> Actin基因定量PCR的正向扩增引物（AGGCAAAGCGTGGTGTTCTTA）
<400> 7
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Actin基因定量PCR的反向扩增引物（TCTGGGGAGCCTCAGTCAATA）
<400> 8
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> DXS基因定量PCR的正向扩增引物（GCCTTTAATGACGGTCCTACTG）
<400> 9
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> DXS基因定量PCR的反向扩增引物（AATTTCGTCACCCTCGAAAGTA）
<400> 10
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> PSY1基因定量PCR的正向扩增引物（GTCTATGTTTGGTGTCGACGAA）
<400> 11
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> PSY1基因定量PCR的正向扩增引物（AAGCACAGGTCAAAGACATCCT）
<400> 12
<210> 13
<211>22
<212> DNA
<213> ZEP1基因定量PCR的正向扩增引物（GGTACGCTTCGATACCCTACAG）
<400> 13
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> ZEP1基因定量PCR的反向扩增引物（GTAATTGGCAATACGGGACTTG）
<400> 17
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> CRTISO5基因定量PCR的正向扩增引物（GAGGATCGGCTCATACATTCTC）
<400> 15
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> CRTISO5基因定量PCR的反向扩增引物（GCATCTCTTCTTCCAGGACATC）
<400> 16
<210> 17
<211>22
<212> DNA
<213> GPAT3基因定量PCR的正向扩增引物（AATCGTTTCGACACCAGACTTT）
<400> 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> GPAT3基因定量PCR的反向扩增引物（GCTTCTCCGAGATATTCATTGG）
<400> 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> LPAT2基因定量PCR的正向扩增引物（CTTCCACCTTCTATTGAG）
<400> 19
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> LPAT2基因定量PCR的反向扩增引物（TTGATTCGGATGTGTATT）
<400> 20
<210> 21
<211>21
<212> DNA
<213> PAP基因定量PCR的正向扩增引物（CCATCTTGTTCGGATTATTCG）
<400> 21
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> PAP基因定量PCR的反向扩增引物（CGTTGTGTTGGATCGTTG）
<400> 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> DGAT2D基因定量PCR的正向扩增引物（CCACTGTGCTGGGGAAGATA）
<400> 23
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> DGAT2D基因定量PCR的反向扩增引物（GCAGATGAGCCTTGTCAACC）
<400> 24
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> PtHSF1-RT基因定量PCR的正向扩增引物（CTTTAGGCAGGTCTACCACCAC）
<400>2 5
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> PtHSF1-RT基因定量PCR的反向扩增引物（AGGAGTATCAACGCTTGGTCAT）
<400>26

Claims (1)

1.一种三角褐指藻热激转录因子PtHSF1在提高三角褐指藻中中性脂和/或岩藻黄素合成方面的应用，其特征在于：该因子核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
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