CN111909952B - 构建食烷菌敲除酰基辅酶a硫脂酶基因的方法和应用 - Google Patents
构建食烷菌敲除酰基辅酶a硫脂酶基因的方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111909952B CN111909952B CN202010770287.1A CN202010770287A CN111909952B CN 111909952 B CN111909952 B CN 111909952B CN 202010770287 A CN202010770287 A CN 202010770287A CN 111909952 B CN111909952 B CN 111909952B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plasmid
- sequence
- pha
- grna
- donor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 101710120269 Acyl-CoA thioester hydrolase YbgC Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 241000611272 Alcanivorax Species 0.000 title claims abstract description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 110
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 38
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 26
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 241000611270 Alcanivorax borkumensis Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 claims abstract description 7
- -1 acyl coenzyme A Chemical compound 0.000 claims abstract description 5
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 claims abstract description 5
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 claims description 65
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 claims description 65
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 42
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 30
- RZJRJXONCZWCBN-UHFFFAOYSA-N octadecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC RZJRJXONCZWCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 28
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 26
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 26
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 25
- 101150026728 tesB gene Proteins 0.000 claims description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229940038384 octadecane Drugs 0.000 claims description 15
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 claims description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 12
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 12
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 12
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 12
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 11
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 9
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 8
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 6
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 claims description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 6
- 229920000070 poly-3-hydroxybutyrate Polymers 0.000 claims description 6
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 108060008225 Thiolase Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 4
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 claims description 4
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000032050 esterification Effects 0.000 claims description 3
- 239000001307 helium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical group [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 4
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims 4
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 4
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims 4
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 claims 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 2
- 241000981595 Zoysia japonica Species 0.000 claims 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 abstract description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 1
- 235000001715 Lentinula edodes Nutrition 0.000 description 1
- 240000000599 Lentinula edodes Species 0.000 description 1
- 239000004164 Wax ester Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000012815 thermoplastic material Substances 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000019386 wax ester Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
- C12Y301/0202—Acyl-CoA hydrolase (3.1.2.20)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及构建食烷菌敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法和应用。敲除基因为酰基辅酶A硫脂酶，其上下游的核苷酸序列如序列表中序列所示；出发菌株食烷菌(Alcanivorax borkumensis)，保藏号为DSM11573。所述方法通过CRISPR‑Cas9双质粒基因编辑技术无痕敲除食烷菌酰基辅酶A硫脂酶基因得到重组菌，使食烷菌所产聚羟基丁酸酯分泌到细胞外；双质粒系统包括：工具质粒pCas9，addgene编号#62225，和辅助质粒pTargetF，addgene编号#62226。
Description
技术领域
本发明基因工程技术领域，特别涉及一种构建食烷菌中敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法和应用。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是唯一的一种由微生物生产、可被微生物降解的热塑性塑料材料，作为石油基塑料的替代品，可缓解日益严重的塑料污染问题。目前，PHA通过细胞内累积的方式发酵生产。PHA作为细菌的胞内储能物质，累积量无法超过细胞干重，使生产速度直接受细菌生命周期长度影响。具有持续胞外分泌PHA能力的菌株，能有效提高细菌单位时间生产PHA的效率。
食烷菌具有完整的油类代谢途径，能够合成脂肪酸、甘油三酯和蜡酯并分泌到细胞外。虽然食烷菌也能合成PHA，但是由于3-羟基脂肪酸((3-HA)和PHA的合成途径使用相同的前体，两者是竞争途径的关系，所以通常食烷菌内并没有累积PHA。
通过转座子随机突变，在食烷菌的酰基辅酶A硫脂酶(tesB)基因插入一段序列，会使食烷菌失去3-HA合成能力，从而激活PHA的合成途径，并实现PHA胞外分泌。但是，转座子突变属于有痕突变，这种突变方法在原有基因中插入大片段序列，虽然使得基因失活，但是可能对下游基因表达产生未知影响。而且，转座子突变的随机性决定这种方法一方面无法进行定点突变，另一方面耗时耗力。因此，这种方法无法用于食烷菌在基因水平上的进一步优化。
发明内容
本发明所解决的技术问题是针对现有技术中的食烷菌缺少稳定的定点基因敲除方法，而提供一种基于CRISPR-Cas9双质粒系统的基因编辑方法构建食烷菌敲除株的方法。使用该方法通过敲除酰基辅酶A硫脂酶(tesB)基因得到重组菌，使食烷菌所产PHA分泌到细胞外，使食烷菌在生命周期内累积的PHA超过细胞总重量，从而提高PHA生产效率的食烷菌酰基辅酶A硫酯酶基因敲除株利用十八烷烃或丙酮胞外制备PHA的方法。
本发明的技术解决方案是所述构建食烷菌中敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法，其特殊之处在于，所述方法通过CRISPR-Cas9双质粒基因编辑技术，无痕敲除除食烷菌酰基辅酶A硫脂酶基因，得到重组菌，使食烷菌所产聚羟基丁酸酯分泌到细胞外；所述tesB基因的核苷酸序列，其上游和下游核苷酸序列如序列表序列1、序列2和序列3所示；所述食烷菌为Alcanivorax borkumensis，保藏号为DSM11573；双质粒系统包括：工具质粒pCas9，addgene编号#62225，和辅助质粒pTargetF，addgene编号#62225。
作为优选：所述构建食烷菌中敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法，其特殊之处在于，包括如下步骤：
⑴构建重组辅助质粒：替换辅助质粒pTargetF中的向导RNA(gRNA)片段，插入供体分子(Donor)的核苷酸序列，得到重组辅助质粒pTargetF-gRNA-Donor；所述gRNA的核苷酸序列包括具有特异性的待敲除基因中的一段20bp的片段和gRNA骨架(gRNA scaffold)共同组成识别切割位点的片段，所述片段如序列表中序列4所示；所述供体核苷酸序列为基于食烷菌基因组中酰基辅酶A硫酯酶基因的上游序列和下游序列合成的序列，所述上游序列和所述下游序列如序列表中序列2和序列3所示；
⑵将所述重组辅助质粒和工具质粒导入出发菌株，实现基因敲除，得到包含质粒的敲除株；所述食烷菌为出发菌株；
⑶包含双质粒的敲除株在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下消除工具质粒，在37℃培养下消除重组辅助质粒，即得到所述敲除株。
本发明的第二技术解决方案是基于CRISPR-Cas9双质粒系统的基因编辑方法构建食烷菌敲除株的方法，其特殊之处在于，包括如下步骤：
⑴制备质粒：
(1.1)替换gRNA的特异性片段：以酰基辅酶A硫酯酶基因(tesB)序列为模板，设计特异性识别所述基因的gRNA；根据原质粒序列和特异性gRNA片段设计一对引物，利用反向聚合酶链式反应(反向PCR)，用特异性gRNA片段替换pTargetF上的原gRNA片段，所得到的线性化质粒为pTargetF-gRNA；
(1.2)合成供体分子：以tesB基因的上游序列和下游序列为模板，各设计一对引物；
上游序列的正向引物含EcoRI酶切位点，下游序列的反向引物含HindIII的酶切位点，在适宜的条件下进行重叠聚合酶链式反应(重叠PCR)反应，回收得到带有酶切位点的供体分子；供体分子序列如序列表中序列5所示；
(1.3)连接质粒骨架和同源臂：使用EcoRI、HindIII限制性内切酶在适宜条件下分别双酶切质粒pTargetF-gRNA和DNA片段Donor，回收线性化产物；回收线性化产物，在T4连接酶作用下进行连接，回收得到质粒pTargetF-gRNA-Donor；所述质粒序列如序列表中序列6所示；
⑵制备敲除株：
(2.1)质粒导入食烷菌：将质粒pTargetF-gRNA-Donor和质粒pCas分别以电转化形式转入食烷菌，在卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的ONR7a平板上筛选出双阳性克隆，得到含有pCas和pTargetF-gRNA-Donor所构成双质粒系统的食烷菌菌株；所述ONR7a培养基为德国微生物菌种保藏中心DSZM950培养基；
(2.2)消除质粒：所述双阳性克隆转接至含卡那霉素(50mg/L)和IPTG(0.5mM)的ONR7a液体培养基，30℃过夜培养，消除质粒pTargetF-gRNA-Donor；涂布培养液于含卡那霉素(50mg/L)的ONR7a平板上，筛选出单阳性克隆，得到含有单一质粒pCas的重组菌；
所述单阳性克隆转接于ONR7a培养基，37℃过夜培养，消除温敏型质粒pCas；涂布培养液于ONR7a平板，得到无质粒的重组菌；
⑶验证重组菌：以重组菌作为模板进行PCR，使用上述(1.2)中的tesB基因的上游序列的正向引物和tesB基因的下游序列的反向引物，在适宜体系和程序下进行PCR反应，回收PCR产物进行测序，测序结果与供体序列一致，证明同源重组正确，获得食烷菌tesB基因的敲除株。
本发明的第三技术解决方案是重组食烷菌酰基辅酶A硫酯酶基因敲除株利用十八烷烃胞外制备PHA的方法，其特殊之处在于，敲除株以十八烷烃为唯一碳源进行发酵；发酵培养基：添加1.5％(wt/vol)十八烷烃的MM培养基；MM培养基成分包括(g/L)：Na2HPO4_4、KH2PO4_2.65、(NH4)2SO4_0.5、MgSO4_0.2和微量元素1mL(浓度g/L：CuSO4·6H2O_0.155、nSO4·7H2O_0.153、CoCl2·6H2O_0.22、MnCl2·4H2O_0.0589、CaCl2_7.8、FeCl3·6H2O_20)；培养条件为30℃、200rpm振荡培养48-72h；取全部发酵液进行冷冻干燥，干燥菌体中加入10倍菌体量体积的氯仿，90℃提取4h，提取完毕后静置冷却，过滤去除非PHA物质，取上清液加入2.5倍氯仿体积的冷乙醇4℃混匀后静置，过滤后干燥48h，得到PHA。
本发明的第四技术解决方案是重组食烷菌酰基辅酶A硫酯酶基因敲除株利用丙酮酸胞外制备PHA的方法，其特殊之处在于，敲除株以丙酮酸为唯一碳源进行发酵；发酵培养基：添加2％(wt/vol)丙酮酸的MM培养基；MM培养基成分包括(g/L)：Na2HPO4_4、KH2PO4_2.65、(NH4)2SO4_0.5、MgSO4_0.2和微量元素1mL(浓度g/L：CuSO4·6H2O_0.155、ZnSO4·7H2O_0.153、COCl2·6H2O_0.22、MnCl2·4H2O_0.0589、CaCl2_7.8、FeCl3·6H2O_20)；培养条件为30℃、200rpm振荡培养48-72h；取全部发酵液进行冷冻干燥，干燥菌体中加入10倍菌体量体积的氯仿，90℃提取4h，提取完毕后静置冷却，过滤去除非PHA物质，取上清液加入2.5倍氯仿体积的冷乙醇4℃混匀后静置，过滤后干燥，得到PHA。
与现有技术相比，本发明的有益效果:
⑴本发明能对食烷菌中目标基因进行精确无痕敲除或敲入。
⑵本发明的基因编辑和验证的全过程不超过两周，省去耗时耗力的大规模的文库筛选。
⑶本发明所述的方法能可重复地改造野生菌株获得敲除tesB基因株，实现聚羟基脂肪酸酯胞外分泌株。
⑷本发明通过CRISPR-Cas9双质粒基因编辑技术，能够无痕敲除tesB基因，能精确控制被敲除的序列长度，不影响相邻的脂酰基转移酶基因,敲除株具有产PHA并分泌到细胞外的能力。
附图说明
图1是本发明pTargetF-gRNA-Donor质粒构造途径示意图。(a)质粒装配主要步骤。(b)pTargetF-gRNA-Donor质粒图谱。(c)酰基辅酶A硫脂酶基因和供体分子的位置。
图2是食烷菌敲除株利用十八烷烃或丙酮酸产聚羟基脂肪酸酯的效率与出发菌株的对比图。
图3A是聚羟基丁酸酯标准物质的GC-MS的峰图。
图3B是食烷菌敲除株以十八烷烃为碳源生长的冻干细胞的氯仿提取物的GC-MS峰图。
图3C是食烷菌敲除株以丙酮酸为碳源生长的冻干细胞的氯仿提取物的GC-MS峰图。
具体实施方式
本发明下面将结合实施例作进一步详述：
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均构自常规生化试剂商店。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
·关键物质来源
本发明使用的出发菌株食烷菌为Alcanivorax borkumensis DSM11573；
本发明使用的质粒pTargtF和pCas来自Addgene。
·术语
本文所使用的术语PHB代表聚3-羟基丁酸酯；
本文所用的术语tesB代表酰基辅酶A硫脂酶基因；
本文所用术语gRNA代表可识特异性别待敲除基因向导RNA；
本文所用术语Donor代表插入待敲除基因上游和下游核苷酸序列合成的供体分子；
本文所用的术语pTargetF-gRNA-Donor代表替代gTargetF质粒中的向导RNA的特异性片段，并插入供体分子的质粒；
本文所用的重组菌和敲除株代表敲除tesB基因后的食烷菌；
本文所用的术语ONR7a是食烷菌专用培养基，其配方来自德国微生物菌种保藏中心，编号为DSMZ950(https://www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ_ Medium950.pd f)。
实施例1、制备重组食烷菌
1、制备质粒：
a)替换gRNA：食烷菌基因组上tesB基因核苷酸序列为模板，所述核苷酸序列如序列表的序列1，设计特异性gRNA的核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列表的序列4；基于质粒pTargetF的启动子J23119(SpeI)promoter和序列4设计正向引物Pl-F(GAGACCGAGAGAGGGTCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA)和反向引物Pl-R(ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGC)，合成磷酸化的引物，进行反向PCR。
反向PCR步骤如下：
1)以原始质粒为模板1μL，添加正向引物Pl-F和反向引物Pl-R，各1μL，高保真酶25μL(PrimeSTAR Max DNA Polymearse，TAKARA)，以去RNA水补充至体积50μL，于94℃下预变性6min，以94℃下45s、53℃下45s、72℃下90s为一个循环扩增，共31个循环，最后72℃下延伸10min；
2)琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，胶回收试剂盒(AG21005，艾科瑞生物)对目标片段进行回收，回收得到的线性化片段在T4连接酶的作用下进行自连，得到环化片段pTargetF-gRNA；
b)合成供体分子
以食烷菌出发菌株基因组上tesB基因阅读框的上下游序列为模板，并保证下游序列不影响下游的基因完整性，基因与供体序列的相对位置如图1所示，核苷酸序列如序列表序列2和序列3所示，设计上游序列的正向引物PL-F(ccgccgGAATTCcaagtcaaaacgcagtccaatg)和反向PL-R(tgagtggcaccagttccgatttcatgcggtgctttatttaccattcc)，设计下游序列的正向引物PR-F(gcaggaatggtaaataaagcaccgcatgaaatcggaactggtgccac)和反向引物PL-R(acccccAAGCTTacgccggtaacagaaacctaaca)；其中大写字母分别表示EcoRI和HindIII酶切位点；Donor片段由上游序列、下游序列、EcoRI酶切位点、HindIII酶切位点以及保护碱基组成；利用所述的两对引物在适宜的体积和条件下利用Overlap-PCR合成供体分子。
Overlap-PCR步骤如下：
1)以食烷菌出发菌株基因组为模板(1μL)，加入引物PL-F(1μL)和PL-R(1μL)，2xTaq酶(25μL，AG11107，艾科瑞生物)，去RNA水补充体积至50μL，于94℃下预变性6min，以94℃下45s、53℃下45s、72℃下90s为一个循环扩增，共31个循环，最后72℃下延伸10min；同样以食烷菌出发菌株基因组为模板，加入引物PR-F和PR-R，于所述上游序列的和核苷酸分子片段PCR扩增的体系和程序下进行PCR反应，得到下游序列的核苷酸分子片段；
2)琼脂糖凝胶电泳(AG21005，艾科瑞生物)纯化回收上游和下游核苷酸分子片段；
3)上游片段和和下游片段各1μL作为共同模板，高保真酶25μL(PrimeSTAR MaxDNA Polymearse，TAKARA)，以去RNA水补充至体积49μL，于98℃下预变性2min，以98℃下30s、60℃下40s、72℃下60s为一个循环连接，共5个循环，最后72℃下5min发生互补，得到融合序列片段；
4)在所述融合序列片段体系中加入0.5μL的PL-F为正向引物，0.5μL的PR-R为反向引物，于98℃下预变性2min，以98℃下30s、55℃下30s、72℃下120s为一个循环扩增，共12个循环，最后72℃下延伸5min，得到供体分子；
c)连接质粒骨架和同源臂：
使用1μL的EcoRI、1μL的HindIII限制性内切酶、2μL的10x缓冲溶液、去RNA水16μL，质粒pTargetF-gRNA或供体分子1μL，在37℃孵育30min，回收线性化产物以3:1的摩尔比混合供体分子与质粒，体系中DNA含量约为50-100ng，10xT4连接酶缓冲溶液2μL，T4连接酶2μL，去RNA水补足体积至20μL，与16℃孵育过夜连接得到pTargetF-gRNA-Donor；
2、制备敲除株：
a)质粒导入食烷菌：将质粒pTargetF-gRNA-Donor和质粒pCas分别以电击的方式转化形式转入食烷菌出发菌株，在卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的ONR7a平板上筛选出双阳性克隆，得到含有pCas和pTargetF-gRNA-Donor所构成双质粒系统的食烷菌；
电转化步骤如下：
1)在ONR7a培养基中培养至培养液在600nm波长下的吸光度达到0.4；
2)细胞在灭菌后的超纯水中洗3次，重悬液置于冰上；
3)在0.1cm的电击杯中加入20μL细菌重悬液，和1-8μL质粒溶液(DNA含量50-100ng)；
4)使用电穿孔仪(1652100，Bio-Rad)，电击条件为12kV，电击后加入ONR7a培养液，30℃培养。
b)消除质粒:所述筛选得到的双阳性克隆转接至含卡那霉素(50mg/L)和IPTG(0.5mM)的ONR7a液体培养基，30℃过夜培养，消除质粒pTargetF-gRNA-Donor；涂布培养液于含卡那霉素(50mg/L)的ONR7a平板上，筛选出单阳性克隆，得到含有单一质粒pCas的重组菌；
所述单阳性克隆转接于ONR7a培养基，37℃过夜培养，消除温敏型质粒pCas；涂布培养液于ONR7a平板，得到无质粒的重组菌；
c)验证重组菌:以重组菌基因组为模板，PL-F为正向引物，PR-R为反向引物，适宜体系和程序下进行PCR反应，回收产物进行测序结果与供体分子序列一致，即重组菌基因组上不含tesB基因。
实施例2、重组食烷菌利用十八烷烃胞外产PHA
1、制备种子液：取敲除株接种至ONR7a培养基平板，30℃培养3天，获得活化菌种；平板上挑选单菌落接种于装有10mL液体ONR7a培养基的50mL锥形瓶内，30℃摇床培养3天，获得一级种子液；10％的接种量转接一级种子液到含10mL液体ONR7a培养基的50mL锥形瓶内，30℃摇床培养24h，获得二级种子液；
2、以十八烷烃为唯一碳源进行发酵:取2.5mL步骤1得到的种子液，接种于47.5mL发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48h或72h；发酵培养基：添加1.5％(wt/vol)十八烷烃的MM培养基；MM培养基成分包括(g/L)：Na2HPO4_4、KH2PO4_2.65、(NH4)2SO4_0.5、MgSO4_0.2和微量元素1mL(浓度g/L：CuSO4·6H2O_0.155、ZnSO4·7H2O_0.153、CoCl2·6H2O_0.22、MnCl2·4H2O_0.0589、CaCl2_7.8、FeCl3·6H2O_20)；
3、胞外PHA提取：发酵后，取全部发酵液进行冷冻干燥(将装有液相体系的离心管先置于-80℃预冷1h，再放入真空冷冻干燥仪中12h，得到全发酵液的冷冻干燥产物，并称重；室温条件下，加入10倍体积的氯仿洗脱，90℃提取4h，静置冷却，过滤去除非PHA物质，加入2.5倍氯仿体积的冷乙醇4℃搅拌，沉淀过滤60℃干燥24h，得到PHA干燥产物，称重计算每升培养基胞外PHA的产量，单位mg/L；
4、制备PHA酯化样品：取上述PHA干燥产物加入氯仿1mL，加入1mL的酯化液(含15％浓硫酸的甲醇溶液)混匀，加盖密闭，100℃油浴150min进行酸性条件下的甲酯化反应；冰浴冷却5min，加入1mL去离子水，充分混匀30s，静置1min，取下层有机相150μL进行气相色谱分析；
5、GC分析PHA的种类:取20-25mg的聚3-羟基丁酸酯(PHB)作为标准样品；气相色谱(GC)分析参数：使用DB-WAX型号柱(AgilentTechnologies，G6501-CTC)分析被测物质；流动相为氦气，平衡溶剂为氯仿试剂；进样口、检测器温度分别为250℃、275℃；起始色谱柱温度80℃维持2min，然后以10℃/min的速率升至245℃维持1min；进样量1μL，分流比1:8，进样速率0.7mL/min；通过比较待测样品和标准样品在相同保留时间确定PHA的种类。
实施例3、重组食烷菌利用丙酮酸胞外产PHA
1、制备种子液：同实施例2(1)；
2、以丙酮酸为唯一碳源进行发酵：取2.5mL步骤1得到的种子液，接种于47.5mL发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48-72h；发酵培养基：含2％(wt/vol)丙酮酸的MM培养基，MM培养基见实施例1(2)；
3、胞外PHA提取：同实施例2(3)；
4、制备PHA酯化样品：同实施例2(4)；
5、GC分析PHA的种类:同实施例2(5)。
从图2能看出食烷菌的敲除株胞外累积PHA的速度比出发菌株快，且食烷菌敲除株利用十八烷烃累积PHA的能力大于丙酮酸。此外，从图3能确定食烷菌敲除株产PHA的种类为聚羟基丁酸酯。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明权利要求的涵盖范围。
北京大学深圳研究院
构建食烷菌敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法和应用
DNA
786
Alcanivorax borkumensis DSM11573
atgacattcgatgagattctagccacgattgatggccagggtaacgccacgtttccagaagggtgggggcagggccggaccttatttggtggcctggtgggggcggtgctgtttgaacatttagaaaaaaccgtggctcgcgggaggtttctacgtagtttttctctctcttttgtcgcccctgcggtgccgggtccggtggcactagacgagactgtgtttcgggaaggcaaatccgttatgcaggccatggtctccgcccgtcaaggagggcaggtggtggcggttatgttggccagctttggggccagtcgccaatccagtgtagtggtagaagggccatcggccccagtgatgaaatctccagagcagagtatttcggtaccgtttatcaaaggattgacgccggattttttttcccattttaatatccattacgcagaaggcatgccgccgttcagtggcagttctgagcccgattacggtggttacatggggtttactgtgccgccggaaaccatgagcaccgcagcgctgattgcattggtggatacctgggcgccttcagttttacctctgctcaaagggccagcacccgccagttccttgacctggaccatggagctcttggatgaccctagtgtccactcgccggagactttatggcaatatcgggtaaacacggaccaatgcagtgatggctatggtcaaagtcaggcggtggtttgggatgctgcgggtaaggctgtggcgttgagtcgacaaacctttacggtatttgcatga
2
DNA
370
Alcanivorax borkumensis DSM11573
caagtcaaaacgcagtccaatgcccaaggcgctaagcacggcttcagagtctacggtcgttgatgatggaatttctgaaaagccaaaataaaagacgacacgtagtacaaccatcaacgagaaaaagagggcggtgatggccagcagatactgcagacgtcgggatttcaaccaggtcatgtcattgtctccatactggcgaaactaaaaaaggggcgcctatgctaccggcaaggaggaacaagcgcatgggaaaacacattttttggctgttttatgtgcattgttgctggttatggcgccgttaatcctctttgagccggcataatgacttttactggcttcgcaggaatggtaaataaagcaccgc
3
DNA
489
Alcanivorax borkumensis DSM11573
atgaaatcggaactggtgccactcacggcgcggactttaggtaagcaagtgcctcgtcgtgggcactggctgttggcggcgctagggcggctgattttgactgttatggggtggcgtattgttggtgatttgcccgatacgcctcgggcagttttggcggtggcgccacacacgtcgaacatagacggggtcattggtatcagtgctattcagtctttgcgcttggatgtgcgcttcatgggtaagcacacgttgtttaaaggtcgtcttgggcggttcatgtactggctgggcggcatccctgtgaatcgagaaagtgccagggatgtggtggaccagacgacgtcggtgatgggggaaacaccattttggcttgggctaacgccggaggggacgcgtaaaggcgccaagcgttggaaaaccgggttttaccgtattgctgagcaaatgcaggtgccgattgtcgtgttaggtttctgttaccggcgt
4
人工序列
96
gcggtgctcatggtttccgggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc
5
人工序列
883
ccgccggaattccaagtcaaaacgcagtccaatgcccaaggcgctaagcacggcttcagagtctacggtcgttgatgatggaatttctgaaaagccaaaataaaagacgacacgtagtacaaccatcaacgagaaaaagagggcggtgatggccagcagatactgcagacgtcgggatttcaaccaggtcatgtcattgtctccatactggcgaaactaaaaaaggggcgcctatgctaccggcaaggaggaacaagcgcatgggaaaacacattttttggctgttttatgtgcattgttgctggttatggcgccgttaatcctctttgagccggcataatgacttttactggcttcgcaggaatggtaaataaagcaccgcatgaaatcggaactggtgccactcacggcgcggactttaggtaagcaagtgcctcgtcgtgggcactggctgttggcggcgctagggcggctgattttgactgttatggggtggcgtattgttggtgatttgcccgatacgcctcgggcagttttggcggtggcgccacacacgtcgaacatagacggggtcattggtatcagtgctattcagtctttgcgcttggatgtgcgcttcatgggtaagcacacgttgtttaaaggtcgtcttgggcggttcatgtactggctgggcggcatccctgtgaatcgagaaagtgccagggatgtggtggaccagacgacgtcggtgatgggggaaacaccattttggcttgggctaacgccggaggggacgcgtaaaggcgccaagcgttggaaaaccgggttttaccgtattgctgagcaaatgcaggtgccgattgtcgtgttaggtttctgttaccggcgtaagcttgggggt
6
人工序列
2963
catgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatgctggatccttgacagctagctcagtcctaggtataatactagtgcggtgctcatggtttccgggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgaattccaagtcaaaacgcagtccaatgcccaaggcgctaagcacggcttcagagtctacggtcgttgatgatggaatttctgaaaagccaaaataaaagacgacacgtagtacaaccatcaacgagaaaaagagggcggtgatggccagcagatactgcagacgtcgggatttcaaccaggtcatgtcattgtctccatactggcgaaactaaaaaaggggcgcctatgctaccggcaaggaggaacaagcgcatgggaaaacacattttttggctgttttatgtgcattgttgctggttatggcgccgttaatcctctttgagccggcataatgacttttactggcttcgcaggaatggtaaataaagcaccgcatgaaatcggaactggtgccactcacggcgcggactttaggtaagcaagtgcctcgtcgtgggcactggctgttggcggcgctagggcggctgattttgactgttatggggtggcgtattgttggtgatttgcccgatacgcctcgggcagttttggcggtggcgccacacacgtcgaacatagacggggtcattggtatcagtgctattcagtctttgcgcttggatgtgcgcttcatgggtaagcacacgttgtttaaaggtcgtcttgggcggttcatgtactggctgggcggcatccctgtgaatcgagaaagtgccagggatgtggtggaccagacgacgtcggtgatgggggaaacaccattttggcttgggctaacgccggaggggacgcgtaaaggcgccaagcgttggaaaaccgggttttaccgtattgctgagcaaatgcaggtgccgattgtcgtgttaggtttctgttaccggcgtaagctttgcttagatctattaccctgttatccctactcgagttcatgtgcagctccataagcaaaaggggatgataagtttatcaccaccgactatttgcaacagtgccgttgatcgtgctatgatcgactgatgtcatcagcggtggagtgcaatgtcatgagggaagcggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtcatcgagcgccatctcgaaccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggatggcggcctgaagccacacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgatgaaacaacgcggcgagctttgatcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagagagcgagattctccgcgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgttatccagctaagcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgcaggtatcttcgagccagccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaagagaacatagcgttgccttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcctgaacaggatctatttgaggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgggctggcgatgagcgaaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggcaaaatcgcgccgaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcagatcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggcaaataagatgccgctcgccagtcgattggctgagctcataagttcctattccgaagttccgcgaacgcgtaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctca
Claims (9)
1.一种构建食烷菌中敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法，其特征在于，所述方法通过CRISPR-Cas9双质粒基因编辑技术无痕敲除食烷菌酰基辅酶A硫脂酶基因tesB得到重组菌，使食烷菌所产聚羟基丁酸酯分泌到细胞外；所述食烷菌为Alcanivorax borkumensis，保藏号为DSM11573；双质粒系统包括：工具质粒pCas9，addgene编号#62225，和辅助质粒pTargetF，addgene编号#62226；所述构建食烷菌中敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法，包括如下步骤：
⑴构建重组辅助质粒：替换辅助质粒pTargetF中的向导RNAgRNA片段，插入供体分子Donor的核苷酸序列，得到重组辅助质粒pTargetF-gRNA-Donor；所述gRNA的核苷酸序列包括具有特异性的待敲除基因中的一段20bp的片段和gRNA骨架gRNA scaffold共同组成识别切割位点的片段，所述片段如序列表中序列4所示；所述供体核苷酸序列为基于食烷菌基因组中酰基辅酶A硫酯酶基因tesB的上游序列和下游序列合成的序列，所述上游序列和所述下游序列如序列表中序列2和序列3所示；
⑵将所述重组辅助质粒和工具质粒导入出发菌株，实现基因敲除，得到包含质粒的敲除株；所述食烷菌为出发菌株；
⑶包含双质粒的敲除株在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下消除工具质粒，在37℃培养下消除重组辅助质粒，即得到所述敲除株。
2.一种根据权利要求1所述构建食烷菌中敲除酰基辅酶A硫脂酶基因方法而基于CRISPR-Cas9双质粒系统的基因编辑方法构建食烷菌敲除株的方法，其特征在于，包括如下步骤：
⑴制备质粒：
(1.1)替换gRNA的特异性片段：以酰基辅酶A硫酯酶基因tesB序列为模板，设计特异性识别所述基因的gRNA；根据原质粒序列和特异性gRNA片段设计一对引物，利用反向聚合酶链式反应，即反向PCR，用特异性gRNA片段替换pTargetF上的原gRNA片段，所得到的线性化质粒为pTargetF-gRNA；
(1.2)合成供体分子：以酰基辅酶A硫酯酶基因tesB的上游序列和下游序列为模板，各设计一对引物；
上游序列的正向引物含EcoRI酶切位点，下游序列的反向引物含HindIII的酶切位点，进行重叠聚合酶链式反应，即重叠PCR反应，回收得到带有酶切位点的供体分子，供体分子序列如序列表中序列5所示；
(1.3)连接质粒骨架和同源臂：使用EcoRI、HindIII限制性内切酶分别双酶切质粒pTargetF-gRNA和DNA片段Donor，回收线性化产物；回收线性化产物，在T4连接酶作用下进行连接，回收得到质粒pTargetF-gRNA-Donor；所述质粒序列如序列表中序列6所示；
⑵制备敲除株：
(2.1)质粒导入食烷菌：将质粒pTargetF-gRNA-Donor和质粒pCas9分别以电转化形式转入食烷菌，在卡那霉素50mg/L和壮观霉素50mg/L的食烷菌专用培养基ONR7a平板上筛选出双阳性克隆，得到含有pCas9和pTargetF-gRNA-Donor所构成双质粒系统的食烷菌菌株；所述食烷菌专用培养基ONR7a为德国微生物菌种保藏中心DSZM950培养基；
(2.2)消除质粒：所述双阳性克隆转接至含卡那霉素50mg/L和IPTG0.5mM的ONR7a液体培养基，30℃过夜培养，消除质粒pTargetF-gRNA-Donor；涂布培养液于含卡那霉素50mg/L的食烷菌专用培养基ONR7a平板上，筛选出单阳性克隆，得到含有单一质粒pCas9的重组菌；
所述单阳性克隆转接于食烷菌专用培养基ONR7a，37℃过夜培养，消除温敏型质粒pCas9；涂布培养液于食烷菌专用培养基ONR7a平板，得到无质粒的重组菌；
⑶验证重组菌：以重组菌作为模板进行聚合酶链式反应PCR，使用上述(1.2)中的酰基辅酶A硫酯酶基因tesB的上游序列的正向引物和酰基辅酶A硫酯酶基因tesB的下游序列的反向引物，在适宜体系和程序下进行聚合酶链式反应PCR，回收聚合酶链式反应PCR产物进行测序，测序结果与供体序列一致，证明同源重组正确，获得食烷菌酰基辅酶A硫酯酶基因tesB的敲除株。
3.一种根据权利要求1所述方法构建的酰基辅酶A硫酯酶基因食烷菌敲除株利用十八烷烃胞外制备PHA的方法，所述敲除株以十八烷烃为唯一碳源进行发酵；发酵培养基：添加1.5%wt/vol十八烷烃的MM培养基；其特征在于， MM培养基成分包括：Na2HPO4_4g/L、KH2PO4_2.65g/L、(NH4)2SO4_0.5g/L、MgSO4_0.2g/L和微量元素1mL，所述微量元素组成为：CuSO4·6H2O_0.155 g/L、ZnSO4·7H2O_0.153 g/L、CoCI2·6H2O_0.22 g/L、MnCI2·4H2O_0.0589 g/L、CaCI2_7.8 g/L、FeCI3·6H2O_20 g/L；培养条件为30℃、200rpm振荡培养48-72h；取全部发酵液进行冷冻干燥，干燥菌体中加入10倍菌体量体积的氯仿，90℃提取4h，提取完毕后静置冷却，过滤去除非聚羟基脂肪酸酯PHA物质，取上清液加入2.5倍氯仿体积的冷乙醇4℃混匀后静置，过滤后干燥48h，得到聚羟基脂肪酸酯PHA。
4.一种根据权利要求1所述方法构建的酰基辅酶A硫酯酶基因食烷菌敲除株利用丙酮酸胞外制备PHA的方法，所述敲除株以丙酮酸为唯一碳源进行发酵；发酵培养基：添加2%wt/vol丙酮酸的MM培养基；其特征在于， MM培养基成分包括：Na2HPO4_4g/L、KH2PO4_2.65g/L、(NH4)2SO4_0.5g/L、MgSO4_0.2g/L和微量元素1mL，所述微量元素组成为：：CuSO4·6H2O_0.155 g/L、ZnSO4·7H2O_0.153 g/L、CoCI2·6H2O_0.22 g/L、MnCI2·4H2O_0.0589 g/L、CaCI2_7.8 g/L、FeCI3·6H2O_20 g/L；培养条件为30℃、200rpm振荡培养48-72h；取全部发酵液进行冷冻干燥，干燥菌体中加入10倍菌体量体积的氯仿，90℃提取4h，提取完毕后静置冷却，过滤去除非PHA物质，取上清液加入2.5倍氯仿体积的冷乙醇4℃混匀后静置，过滤后干燥，得到聚羟基脂肪酸酯PHA。
5.一种制备重组食烷菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
⑴制备质粒：
a)替换gRNA：食烷菌为Alcanivorax borkumensis，保藏号为DSM11573，以所述食烷菌基因组上tesB基因核苷酸序列为模板，所述核苷酸序列如序列表的序列1，设计特异性gRNA的核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列表的序列4；辅助质粒pTargetF，addgene编号#62226，基于所述质粒pTargetF的启动子J23119SpeI promoter和序列4设计正向引物Pl-FGAGACCGAGAGAGGGTCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA和反向引物Pl-RACTAGTATTATACCTAGGACTGAGC，合成磷酸化的引物，进行反向PCR;
b)合成供体分子：以食烷菌出发菌株基因组上tesB基因阅读框的上下游序列为模板，并保证下游序列不影响下游的基因完整性，基因与供体序列的相对位置如图1所示，核苷酸序列如序列表序列2和序列3所示，设计上游序列的正向引物PL-F和反向引物PL-R，设计下游序列的正向引物PR-F和反向引物PR-R；所述引物的序列如下所示：PL-F：ccgccgGAATTCcaagtcaaaacgcagtccaatg、PL-R：tgagtggcaccagttccgatttcatgcggtgctttatttaccattcc、PR-F：gcaggaatggtaaataaagcaccgcatgaaatcggaactggtgccac、PR-R：acccccAAGCTTacgccggtaacagaaacctaaca，其中大写字母分别表示EcoRI和HindIII酶切位点；Donor片段由上游序列、下游序列、EcoRI酶切位点、HindIII酶切位点以及保护碱基组成；利用所述的两对引物在适宜的体积和条件下利用Overlap-PCR合成供体分子；
c)连接质粒骨架和同源臂：
使用1μL的EcoRI、1μL的HindIII限制性内切酶、2μL的10x缓冲溶液、去RNA水16μL，质粒pTargetF-gRNA或供体分子1μL，在37°C孵育30min，回收线性化产物以3:1的摩尔比混合供体分子与质粒，体系中DNA含量为50-100ng，10xT4连接酶缓冲溶液2μL，T4连接酶2μL，去RNA水补足体积至20μL，于16°C孵育过夜连接得到pTargetF-gRNA-Donor；
⑵制备敲除株：
a)质粒导入食烷菌：将质粒pTargetF-gRNA-Donor和质粒pCas9分别以电击的方式转化形式转入食烷菌出发菌株，在卡那霉素50mg/L和壮观霉素50mg/L的ONR7a平板上筛选出双阳性克隆，得到含有pCas9和pTargetF-gRNA-Donor所构成双质粒系统的食烷菌，所述质粒pCas9为工具质粒pCas9，addgene编号#62225；
电转化步骤如下：
1)在ONR7a培养基中培养至培养液在600nm波长下的吸光度达到0.4；
2)细胞在灭菌后的超纯水中洗3次，重悬液置于冰上；
3)在0.1cm的电击杯中加入20μL细菌重悬液，和1-8μL质粒溶液，质粒溶液中DNA含量为50-100ng；
4)使用电穿孔仪1652100，Bio-Rad，电击条件为12kV，电击后加入ONR7a培养液，30°C培养；
b)消除质粒:所述筛选得到的双阳性克隆转接至含卡那霉素50mg/L和IPTG0.5mM的ONR7a液体培养基，30℃过夜培养，消除质粒pTargetF-gRNA-Donor；涂布培养液于含卡那霉素50mg/L的ONR7a平板上，筛选出单阳性克隆，得到含有单一质粒pCas9的重组菌；
所述单阳性克隆转接于ONR7a培养基，37℃过夜培养，消除温敏型质粒pCas9；涂布培养液于ONR7a平板，得到无质粒的重组菌；
c)验证重组菌:以重组菌基因组为模板，PL-F为正向引物，PR-R为反向引物，适宜体系和程序下进行PCR反应，回收产物进行测序结果与供体分子序列一致，即重组菌基因组上不含tesB基因。
6.根据权利要求5所述制备重组食烷菌的方法，其特征在于，步骤⑴所述反向PCR进一步包括以下步骤：
1)以原始质粒为模板1μL，添加正向引物Pl-F和反向引物Pl-R，各1μL，高保真酶25μLPrimeSTAR Max DNA Polymearse，TAKARA，以去RNA水补充至体积50μL，于94°C下预变性6min，以94°C下45s、53°C下45s、72°C下90s为一个循环扩增，共31个循环，最后72°C下延伸10min；
2)琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，胶回收试剂盒 AG21005，艾科瑞生物，对目标片段进行回收，回收得到的线性化片段在T4连接酶的作用下进行自连，得到环化片段pTargetF-gRNA。
7.根据权利要求5所述制备重组食烷菌的方法，其特征在于，步骤⑴所述Overlap-PCR合成供体分子进一步包括以下步骤：
1)以食烷菌出发菌株基因组为模板1μL，加入引物PL-F1μL和PL-R1μL，2xTaq酶25μL，AG11107，艾科瑞生物，去RNA水补充体积至50μL，于94°C下预变性6min，以94°C下45s、53°C下45s、72°C下90s为一个循环扩增，共31个循环，最后72°C下延伸10min；同样以食烷菌出发菌株基因组为模板，加入引物PR-F和PR-R，于所述上游序列的和核苷酸分子片段PCR扩增的体系和程序下进行PCR反应，得到下游序列的核苷酸分子片段；
2)琼脂糖凝胶电泳AG21005，艾科瑞生物，纯化回收上游和下游核苷酸分子片段；
3)上游片段和和下游片段各1μL作为共同模板，高保真酶25μL PrimeSTAR Max DNAPolymearse，TAKARA，以去RNA水补充至体积49μL，于98°C下预变性2min，以98°C下30s、60°C下40s、72°C下60s为一个循环连接，共5个循环，最后72°C下5min发生互补，得到融合序列片段；
4)在所述融合序列片段体系中加入0.5μL的PL-F为正向引物，0.5μL的PR-R为反向引物，于98°C下预变性2min，以98°C下30s、55°C下30s、72°C下120s为一个循环扩增，共12个循环，最后72°C下延伸5min，得到供体分子。
8.一种根据权利要求5所述方法制备的重组食烷菌利用十八烷烃胞外生产PHA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
⑴制备种子液：取敲除株接种至ONR7a培养基平板，30℃培养3天，获得活化菌种；平板上挑选单菌落接种于装有10mL液体ONR7a培养基的50mL锥形瓶内，30℃摇床培养3天，获得一级种子液；10%的接种量转接一级种子液到含10mL液体ONR7a培养基的50mL锥形瓶内，30℃摇床培养24h，获得二级种子液；
⑵以十八烷烃为唯一碳源进行发酵:取2.5mL步骤⑴得到的种子液，接种于47.5mL发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48h或72h；发酵培养基：添加1.5%wt/vol十八烷烃的MM培养基；MM培养基成分包括：Na2HPO4_4g/L、KH2PO4_2.65g/L、(NH4)2SO4_0.5g/L、MgSO4_0.2g/L和微量元素1mL，所述微量元素组成为：CuSO4·6H2O_0.155 g/L、ZnSO4·7H2O_0.153 g/L、CoCI2·6H2O_0.22 g/L、MnCI2·4H2O_0.0589 g/L、CaCI2_7.8 g/L、FeCI3·6H2O_20 g/L；
⑶胞外PHA提取：发酵后，取全部发酵液进行冷冻干燥，将装有液相体系的离心管先置于-80℃预冷1h，再放入真空冷冻干燥仪中12h，得到全发酵液的冷冻干燥产物，并称重；室温条件下，加入10倍体积的氯仿洗脱，90°C提取4h，静置冷却，过滤去除非PHA物质，加入2.5倍氯仿体积的冷乙醇4°C搅拌，沉淀过滤60°C干燥24h，得到PHA干燥产物，称重计算每升培养基胞外PHA的产量，单位mg/L；
⑷制备PHA酯化样品：取上述PHA干燥产物加入氯仿1mL，加入1mL的酯化液含15%浓硫酸的甲醇溶液混匀，加盖密闭，100℃油浴150min进行酸性条件下的甲酯化反应；冰浴冷却5min，加入1mL去离子水，充分混匀30s，静置1min，取下层有机相150μL进行气相色谱分析；
⑸GC分析PHA的种类:取20-25mg的聚3-羟基丁酸酯PHB作为标准样品；气相色谱GC分析参数：使用DB-WAX型号柱AgilentTechnologies，G6501-CTC分析被测物质；流动相为氦气，平衡溶剂为氯仿试剂；进样口、检测器温度分别为250℃、275℃；起始色谱柱温度80℃维持2min，然后以10℃/min的速率升至245℃维持1min；进样量1μL，分流比1:8，进样速率0.7mL/min；通过比较待测样品和标准样品在相同保留时间确定PHA的种类。
9.一种根据权利要求5所述方法制备的重组食烷菌利用丙酮酸胞外生产PHA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
⑴制备种子液：取敲除株接种至ONR7a培养基平板，30℃培养3天，获得活化菌种；平板上挑选单菌落接种于装有10mL液体ONR7a培养基的50mL锥形瓶内，30℃摇床培养3天，获得一级种子液；10%的接种量转接一级种子液到含10mL液体ONR7a培养基的50mL锥形瓶内，30℃摇床培养24h，获得二级种子液；
⑵以丙酮酸为唯一碳源进行发酵:取2.5mL步骤⑴得到的种子液，接种于47.5mL发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48h或72h；发酵培养基：含2%wt/vol丙酮酸的MM培养基；MM培养基成分包括：Na2HPO4_4g/L、KH2PO4_2.65g/L、(NH4)2SO4_0.5 g/L、MgSO4_0.2 g/L和微量元素1mL，所述微量元素组成为：CuSO4·6H2O_0.155 g/L、ZnSO4·7H2O_0.153 g/L、CoCI2·6H2O_0.22 g/L、MnCI2·4H2O_0.0589 g/L、CaCI2_7.8 g/L、FeCI3·6H2O_20 g/L；
⑶胞外PHA提取：发酵后，取全部发酵液进行冷冻干燥，将装有液相体系的离心管先置于-80℃预冷1h，再放入真空冷冻干燥仪中12h，得到全发酵液的冷冻干燥产物，并称重；室温条件下，加入10倍体积的氯仿洗脱，90°C提取4h，静置冷却，过滤去除非PHA物质，加入2.5倍氯仿体积的冷乙醇4°C搅拌，沉淀过滤60°C干燥24h，得到PHA干燥产物，称重计算每升培养基胞外PHA的产量，单位mg/L；
⑷制备PHA酯化样品：取上述PHA干燥产物加入氯仿1mL，加入1mL的酯化液含15%浓硫酸的甲醇溶液混匀，加盖密闭，100℃油浴150min进行酸性条件下的甲酯化反应；冰浴冷却5min，加入1mL去离子水，充分混匀30s，静置1min，取下层有机相150μL进行气相色谱分析；
⑸GC分析PHA的种类:取20-25mg的聚3-羟基丁酸酯PHB作为标准样品；气相色谱GC分析参数：使用DB-WAX型号柱AgilentTechnologies，G6501-CTC分析被测物质；流动相为氦气，平衡溶剂为氯仿试剂；进样口、检测器温度分别为250℃、275℃；起始色谱柱温度80℃维持2min，然后以10℃/min的速率升至245℃维持1min；进样量1μL，分流比1:8，进样速率0.7mL/min；通过比较待测样品和标准样品在相同保留时间确定PHA的种类。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010770287.1A CN111909952B (zh) | 2020-08-04 | 2020-08-04 | 构建食烷菌敲除酰基辅酶a硫脂酶基因的方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010770287.1A CN111909952B (zh) | 2020-08-04 | 2020-08-04 | 构建食烷菌敲除酰基辅酶a硫脂酶基因的方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111909952A CN111909952A (zh) | 2020-11-10 |
| CN111909952B true CN111909952B (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=73286488
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010770287.1A Active CN111909952B (zh) | 2020-08-04 | 2020-08-04 | 构建食烷菌敲除酰基辅酶a硫脂酶基因的方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111909952B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101297030A (zh) * | 2005-08-09 | 2008-10-29 | 亥姆霍茨感染研究中心 | 利用基因工程微生物生产的细胞外的多羟基链烷酸酯 |
| CN102952774A (zh) * | 2012-10-30 | 2013-03-06 | 清华大学 | 一种工程菌及其在生产中长链3-羟基脂肪酸中的应用 |
| CN104520433A (zh) * | 2012-04-11 | 2015-04-15 | 赫姆霍尔兹传染病研究中心有限责任公司 | 产生pha的基因工程微生物 |
| CN110387345A (zh) * | 2019-07-12 | 2019-10-29 | 扬州日兴生物科技股份有限公司 | 一种基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌、构建方法及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006204255A (ja) * | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Canon Inc | アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子破壊ポリヒドロキシアルカノエート生産菌、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法 |
-
2020
- 2020-08-04 CN CN202010770287.1A patent/CN111909952B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101297030A (zh) * | 2005-08-09 | 2008-10-29 | 亥姆霍茨感染研究中心 | 利用基因工程微生物生产的细胞外的多羟基链烷酸酯 |
| CN104520433A (zh) * | 2012-04-11 | 2015-04-15 | 赫姆霍尔兹传染病研究中心有限责任公司 | 产生pha的基因工程微生物 |
| CN102952774A (zh) * | 2012-10-30 | 2013-03-06 | 清华大学 | 一种工程菌及其在生产中长链3-羟基脂肪酸中的应用 |
| CN110387345A (zh) * | 2019-07-12 | 2019-10-29 | 扬州日兴生物科技股份有限公司 | 一种基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌、构建方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111909952A (zh) | 2020-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5892507B2 (ja) | ３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の産生方法。 | |
| EP3778866B1 (en) | Recombinant yeast strain for producing nervonic acids and application thereof | |
| US10889841B2 (en) | Oleaginous yeast variant, method for obtaining thereof and use thereof for lipid production | |
| CN111549073A (zh) | 基因sng1缺失在提高酿酒酵母香草醛抗性中的应用 | |
| CN114621968A (zh) | 四氢嘧啶生物合成基因簇、突变体及制备四氢嘧啶的方法 | |
| CN106995794B (zh) | 一种提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株及其构建方法与用途 | |
| CN107257851A (zh) | 正面影响天然或工程化的真核细胞的生理学的细菌伴侣蛋白的组合 | |
| CN111909952B (zh) | 构建食烷菌敲除酰基辅酶a硫脂酶基因的方法和应用 | |
| CN115975823B (zh) | 敲除磷脂酶d基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用 | |
| CN116814572A (zh) | 一种羰基还原酶及其突变体及其在制备手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯中的应用 | |
| CN113493758B (zh) | 一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用 | |
| CN103194419A (zh) | 微生物及其用途 | |
| CN115927407B (zh) | 一种胶球藻基因及其在调控生长和脂质合成中的应用 | |
| JP6979484B2 (ja) | ２，３−ブタンジオール生産用の組換え微生物および２，３−ブタンジオールの生産方法 | |
| CN117683791B (zh) | Opr33基因、蛋白及其在甘油三酯合成中的用途 | |
| CN113913448B (zh) | 一种提高甲基营养菌吡咯喹啉醌产量的方法及应用 | |
| CN113667686B (zh) | 一种高效利用葡萄糖合成肌醇的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用 | |
| CN114015634B (zh) | 高产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 | |
| CN112391401B (zh) | 一种提高解脂耶氏酵母油脂产量的方法 | |
| CN116676355B (zh) | 一种催化合成山莨菪碱的方法 | |
| CN111334445B (zh) | 长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用 | |
| CN117624378A (zh) | 一种融合蛋白、表达载体、构建方法及应用 | |
| CN114907999A (zh) | 一种内质网调节因子在促进酵母合成油脂中的应用 | |
| CN117866997A (zh) | 一种光合固氮工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN116376732A (zh) | 一株高产甘油三酯和甘油二酯的酿酒酵母工程菌株、构建方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |