CN117866997A - 一种光合固氮工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种光合固氮工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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CN117866997A CN202211242051.6A CN202211242051A CN117866997A CN 117866997 A CN117866997 A CN 117866997A CN 202211242051 A CN202211242051 A CN 202211242051A CN 117866997 A CN117866997 A CN 117866997A
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郑艳宁
曾艳
崔玲炜
王孟寐
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Abstract

本发明公开了一种光合固氮工程菌及其构建方法与应用。本发明公开的光合固氮工程菌，其制备方法包括：对受体菌进行包括1)与2)的改造，得到重组菌：1)使受体菌中NifA蛋白质具有活性；2)包括2A)或2B)：2A)将受体菌基因组中铁固氮酶anfH启动子替换为钼固氮酶nifH启动子；2B)将受体菌基因组中AnfA基因和铁固氮酶anfH启动子替换为钼固氮酶nifH启动子。本发明得到的光合固氮工程菌突破了铵抑制等调控限制，实现了铁固氮酶的组成型表达，大大缩短了培养铁固氮酶表达菌的生长周期，显著提高了铁固氮酶的产量，具有很好的应用前景。

Description

一种光合固氮工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域中，一种光合固氮工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
固氮酶根据其活性中心的金属辅因子分为钼固氮酶、钒固氮酶和铁固氮酶。鉴于我国农耕用地普遍缺乏有效态钼，而钒离子是有毒金属离子，表达铁固氮酶的固氮菌在农业可持续发展中具有开发为微生物菌剂等产品的潜力。除此之外，固氮酶在固氮时可以产生清洁能源氢气，铁固氮酶还能够将二氧化碳还原为生物燃料甲烷，因此铁固氮酶在能源生产等领域也发挥着重要作用。
铁固氮酶的表达由于受到诸多限制而未能实现大量生产，其中最主要的限制因素是铁固氮酶的表达受到环境中固定态氮的抑制，阻碍了固氮菌在普遍含有铵的环境中的应用。在不含铵的条件下，表达铁固氮酶的菌株生长周期长(生长至稳定期约5-7天)，细胞密度(培养菌液OD660最高达到0.7-1.0左右)和产量都非常低。并且铁固氮酶的表达同时受到钼离子或有活性的钼固氮酶的抑制。因此解除抑制或者避开调控通路，实现铁固氮酶在自生固氮菌中组成型表达，是提高菌密度、生长速度以及固氮速率的有效途径，有助于实现表达铁固氮酶的自生固氮菌的广泛应用。
沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)是一种自生光合固氮菌，作为饲料级微生物，被广泛应用在水质处理和水产养殖等行业。沼泽红假单胞菌能够表达钼、钒、铁固氮酶。但在有铵条件下不能表达铁固氮酶，无铵条件下培养，铁固氮酶产量低、不易提取。因此，提高铁固氮酶的表达量，是一种需要解决的重要问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有方法制备铁固氮酶产量低、周期长、工艺复杂等缺陷，提供了一种基因工程菌的构建方法及其应用。将本发明的基因工程菌应用于铁固氮酶复合物的制备时，所得铁固氮酶复合物显著提高，且细胞生长周期短、密度高，满足铁固氮酶复合物的大量制备需求。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种重组菌的制备方法，所述方法包括对受体菌进行包括如下1)与2)的改造，得到重组菌：
1)使所述受体菌中NifA蛋白质具有活性；
2)包括2A)或2B)：
2A)将所述受体菌基因组中铁固氮酶anfH启动子替换为钼固氮酶nifH启动子；
2B)将所述受体菌基因组中AnfA基因和所述铁固氮酶anfH启动子替换为所述钼固氮酶nifH启动子。
所述受体菌含有NifA基因、铁固氮酶anfH基因及其启动子、anfD基因、anfG基因、anfK基因和AnfA基因。
所述NifA基因为SEQ ID NO.1所示的DNA分子。所述anfH基因为SEQ ID NO.11所示的DNA分子。所述anfD基因为SEQ ID NO.5的第1-1566位所示的DNA分子。所述anfG基因为SEQ ID NO.14所示的DNA分子。所述anfK基因为SEQ ID NO.16所示的DNA分子。所述AnfA基因为SEQ ID NO.10的第1-1629位所示的DNA分子。
上述方法中，所述NifA蛋白质可如SEQ ID NO.2所示；
所述铁固氮酶anfH启动子可为SEQ ID NO.7所示的DNA分子；
所述钼固氮酶nifH启动子可为SEQ ID NO.9所示的DNA分子；
所述AnfA基因可为SEQ ID NO.10的第1-1629位所示的DNA分子。
上述方法中，步骤1)可通过a)使SEQ ID NO.2所示NifA蛋白质的第202-217位氨基酸的缺失突变，或b)使所述NifA蛋白质的第202、209、212、213位氨基酸饱和突变，或c)使所述NifA蛋白质的第202、209、212和/或213位氨基酸突变实现，或使与所述NifA蛋白质的同源蛋白质的同源位置发生a)或b)或c)的突变实现；
步骤2B)可通过将SEQ ID NO.10所示的DNA分子替换为SEQ ID NO.9所示的DNA分子实现。
上述方法还包括对所述受体菌进行3)的改造：
3)在所述受体菌基因组中AnfD基因上游或下游连接标签的编码基因，使所得重组菌能够表达AnfD与所述标签的融合蛋白。
上述方法中，所述标签可为组氨酸标签。
进一步，所述组氨酸标签可为6-8个组氨酸连接得到的标签。
上述方法中，所述受体菌(在有铵条件下固氮受到抑制，只有解除铵抑制，才能组成型表达固氮酶进行固氮)可为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。
进一步，所述受体菌可为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA755。
利用所述重组菌的制备方法得到的重组菌，或含有所述重组菌的菌剂，也属于本发明的保护范围。
所述菌剂的活性成分可为所述重组菌。
所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
所述重组菌或所述菌剂在制备铁固氮酶复合物中的应用，或在制备生产铁固氮酶复合物产品中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种制备铁固氮酶复合物的方法，所述方法包括：培养所述重组菌，得到培养液；提取所述培养液中的铁固氮酶复合物，即得到铁固氮酶复合物。
上述方法中，所述培养可在厌氧条件下进行。
所述培养在PM培养基中进行，所述PM培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述PM培养基中的浓度分别为12.5mM磷酸氢二钠，12.5mM磷酸二氢钾，1mL/L浓缩碱，0.1mM硫代硫酸钠，2mg/L对氨基苯甲酸，20mM醋酸钠，质量百分含量为0.1％的硫酸铵；所述浓缩碱由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述浓缩碱中的浓度分别为20g/L氨基三乙酸，28.9g/L无水硫酸镁，6.67g/L CaCl2·2H2O，0.198g/L FeSO4·7H2O，100mL/L Metal 44；所述Metal 44由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述Metal 44中的浓度分别为2.5g/L EDTA，10.95g/L ZnSO4·7H2O，5g/L FeSO4·7H2O，1.54g/L MnSO4·H2O，0.392g/L CuSO4·5H2O，0.25g/L Co(NO3)2·6H2O，0.177g/LNa2B4O7·10H2O。
所述培养可在25-30℃下进行。
所述提取所述培养液中的铁固氮酶复合物在厌氧条件下进行。
提取所述培养液中的铁固氮酶复合物采用含有还原剂的提取液进行。所述还原剂可为2-10mM连二亚硫酸钠。
所述提取液包括溶液A和溶液B；所述溶液A由溶剂和溶质组成，所述溶质为水，所述溶质及其在所述溶液A中的浓度分别为：50mM Tris-HCl，pH8.0；所述溶液B由溶剂和溶质组成，所述溶质为水，所述溶质及其所述溶液B中的浓度分别为：50mM Tris-HCl，500mM咪唑，pH8.0。
所述铁固氮酶复合物为铁固氮酶复合物AnfDGK，所述AnfDGK由SEQ ID NO.5所示的AnfD-His蛋白质、SEQ ID NO.13所示的AnfG蛋白质和SEQ ID NO.15所示的AnfK蛋白质组成。
本发明在对沼泽红假单胞菌的基因组进行改造，突破了铵抑制等调控限制，实现了铁固氮酶的组成型表达，获得的基因工程菌在非固氮酶培养基中培养约3天，铁固氮酶的表达量显著提高，与组成型表达钼固氮酶表达量相当，并进一步制备了铁固氮酶复合物，国内外文献未见报道。通过4L发酵培养，制备的铁固氮酶复合物可达3-4mg。本发明大大缩短了培养铁固氮酶表达菌的生长周期，显著提高了铁固氮酶复合物的产量，达到了可制备水平，使原来40L固氮酶培养基发酵7天制备约0.2mg/L铁固氮酶复合物的水平，提高到4L非固氮酶培养基发酵3天制备约0.75-1mg/L铁固氮酶复合物的水平，大大提高了菌株生产速率和铁固氮酶复合物的制备得率。满足了铁固氮酶的菌剂生产的需求。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1是基因工程菌构建示意图。
图2是重组质粒构建示意图。
图3是基因工程菌CGA3019、CGA3020和CGA3021鉴定核酸电泳图。CGA3019所用引物为Pa-Pn-Genome-F(AGCAGGACAAGCTGGCGTTC)和Pa-Pn-Genome-R(TTCACGACCATCGCTTCGAG)，CGA3020所用引物为Pa-Pn-Genome-F(AGCAGGACAAGCTGGCGTTC)和Pa-Pn-Genome-R(TTCACGACCATCGCTTCGAG)，CGA3021所用引物为genome-danfA-up(CTCGCCAAGCACAACGGAAC)和和Pa-Pn-Genome-R(TTCACGACCATCGCTTCGAG)。
图4是基因工程菌的表型鉴定结果。A是基因工程菌产氢示意图；B是基因工程菌产甲烷示意图。
图5是基因工程菌的铁固氮酶酶活表征示意图。
图6是基因工程菌表达铁固氮酶的western blot验证示意图。
图7是基因工程菌制备纯化的铁固氮酶复合物SDS-PAGE示意图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA755菌株，为仅表达铁固氮酶菌株，其已敲除了nifH基因，该菌株记载在“Oda,Y.et al.Functional genomic analysisof three nitrogenase isozymes in the photosynthetic bacteriumRhodopseudomonas palustris[J].JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Nov.2005,p.7784–7794”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009菌株，为野生型菌株，记载在“Oda,Y.et al.Functional genomic analysis of three nitrogenase isozymes inthe photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris[J].JOURNAL OFBACTERIOLOGY,Nov.2005,p.7784–7794”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA676菌株，为仅表达钼固氮酶组成型表达菌株，记载在“Mckinlay J B,Harwood C S.Carbon dioxide fixation as acentral redox cofactor recycling mechanism in bacteria[J].Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,2010,107(26):11669-11675.”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA676 his::nifD菌株，为仅表达带his标签的钼固氮酶组成型表达菌株，记载在“Fixen KR,Zheng Y,Harris DF,Shaw S,Yang ZY,Dean DR,Seefeldt LC,Harwood CS.Light-driven carbon dioxide reductionto methane by nitrogenase in a photosynthetic bacterium.Proc Natl Acad Sci US A.2016Sep 6；113(36):10163-7.”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1菌株，用于接合转移，记载在“Simon R,Priefer U,Pühler A.1983.A broad host mobilization system for in vivo geneticengineering:Transposon mutagenesis in Gram-negative bacteria[J].Bio/Technolgy1:784–791.”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
载体pJQ200SK，为适用于革兰氏阴性菌的自杀质粒，记载在“JürgenQuandt,F.Hynes M.1993.Versatile Suicide Vectors Which Allow Direct Selection forGene Replacement in Gram-Negative Bacteria.Gene 127:15-21.”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
沼泽红假单胞菌的培养条件：25mL厌氧试管中装入10mL培养基，上层充满氮气，光照密度≥30μmol photons m–2s–1，30℃培养。
固氮培养基(NFM)：溶剂为水，溶质及其浓度分别为12.5mM磷酸氢二钠(Na2HPO4)，12.5mM磷酸二氢钾(KH2PO4)，1mL/L浓缩碱，0.1mM硫代硫酸钠(Na2S2O3)，2mg/L对氨基苯甲酸(PABA)，20mM醋酸钠。
非固氮培养基(PM)：在固氮培养基中加入硫酸铵得到的硫酸铵的质量百分含量为0.1％的培养基。
含钼非固氮培养基(PM+Mo)：在非固氮培养基中加入终浓度为10μM的钼酸钠(Na2MoO4)。
非固氮固体培养基：在非固氮培养基中加入1.5-2％的琼脂粉，并将其中的20mM醋酸钠替换为10mM丁二酸钠得到的固体培养基。
PM抗性培养基：在非固氮固体培养基中加入庆大霉素得到的庆大霉素浓度为100μg/mL的固体培养基。
PM蔗糖培养基：在非固氮固体培养基中加入蔗糖得到的蔗糖质量百分含量为10％的固体培养基。
PM抗性加蔗糖培养基：在非固氮固体培养基中加入蔗糖和庆大霉素得到的蔗糖质量百分含量为10％、庆大霉素浓度为100μg/mL的固体培养基。
CA固体培养基：在固氮培养基的基础上去除醋酸钠替换为10mM丁二酸钠，另加终浓度为0.2％的酵母粉，0.5％酸解酪蛋白，1.5-2％琼脂粉，固氮培养基与另加部分分别单独121℃灭菌后低温混合，倒平板。
LB培养基：溶剂为水，溶质及其浓度分别为0.5g/100mL酵母粉，1g/100mL胰蛋白胨，1g/100mLNaCl。121℃灭菌。根据需要加入20μg/mL庆大霉素。
LB固体培养基：在LB培养基中加入终浓度为1.5-2％的琼脂粉。121℃灭菌。
浓缩碱：溶剂为水，溶质及其浓度分别为20g/L氨基三乙酸(NTA)，28.9g/L无水硫酸镁(MgSO4)，6.67g/L CaCl2·2H2O，0.198g/L FeSO4·7H2O，100mL/L Metal 44。将NTA分别溶解在600mL水中并用KOH(14.6g KOH)中和，加入其他组分，并按给出的顺序溶解。在制成1L的最终体积之前调节pH值至6.8。当用KOH将pH值从酸性调节到6.8时会形成沉淀(需要大约100mL的1M KOH)，但最终会在搅拌下重新溶解。当pH值接近6.8时，溶液的颜色由深黄色变为稻草绿色。过滤除菌，保存在铝箔包裹的玻璃瓶中。4℃保存至少一年。
Metal 44：溶剂为水，溶质及其浓度分别为2.5g/L EDTA，10.95g/L ZnSO4·7H2O，5g/L FeSO4·7H2O，1.54g/L MnSO4·H2O，0.392g/L CuSO4·5H2O，0.25g/L Co(NO3)2·6H2O，0.177g/L Na2B4O7·10H2O。将EDTA添加到800mL蒸馏水中并搅拌，并用10M NaOH调节pH值约5.0，使EDTA溶解。按给定的顺序添加其他金属化合物(在前一种完全溶解之前不要添加组分)，然后补足体积1L(最终pH值约为2.4，呈澄清的柠檬绿色溶液)。过滤除菌，保存在铝箔包裹的玻璃瓶中。4℃可无限期保存。
溶液A：50mM Tris-HCl，pH8.0。过滤除菌。
溶液B：50mM Tris-HCl，500mM咪唑，pH8.0。过滤除菌。
固氮菌表型和固氮酶活性的气相分析方法为：
气相色谱条件：使用氢火焰离子化检测器(FID，flame ionization detector)和Porapak N柱(matrix 80/100,6.0ft(1.8m)×1/8in.×2.1mm)检测甲烷、乙炔、乙烯和乙烷，进样器、检测器和柱温箱的温度分别为120℃，60℃，150℃，氩气为载体，流速为25mL/min。使用热导检测器(TCD，Thermal Conductivity Detector)和Molecular Sieve 5A色谱柱(matrix 60/80,6.0ft(1.8m)×1/8in.×2.1mm)检测氢气。进样器、检测器和柱温箱的温度分别为85℃，60℃，120℃，氩气为载体，流速为25mL/min。进样量为100μL。
实施例1、基因工程菌的构建
(1)钼固氮酶转录活化子突变体NifA*的构建
以沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA755菌株为出发菌株，将其钼固氮酶转录活化子NifA(基因序列如序列SEQ ID NO.1)突变为NifA*(基因序列如序列SEQ ID NO.3)(图1)。具体步骤如下：
分别以沼泽红假单胞菌CGA755菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ-nifA*-up-F与pJQ-nifA*-up-R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为含NifA突变位点及其上游序列的1007bp的上游同源臂，利用pJQ-nifA*-down-F与pJQ-nifA*-down-R(引物序列如表1)进行PCR扩增，所得PCR产物为含NifA突变位点及其下游序列的1041bp的下游同源臂；以所得的沼泽红假单胞菌CGA755基因组NifA编码序列突变位点的上下游各约1000bp作为同源臂，以同源重组的方法构建在质粒pJQ200SK的PstI酶切位点上，将得到的序列正确的同时含有NifA*基因及上游同源臂和下游同源臂的重组质粒记为pJQ-NifA*；将pJQ-NifA*转入大肠杆菌S17-1中，然后将所得携带1种重组质粒的重组菌株接合转化沼泽红假单胞菌CGA755菌株。依次通过CA固体培养基、PM抗性培养基、PM蔗糖培养基、PM抗性加蔗糖培养基筛选，最后在PM抗性加蔗糖培养基上不长，在PM蔗糖培养基上长的即为可能正确的单克隆。通过PCR鉴定和测序，序列正确的菌落即为构建成功的菌，挑取对应菌落接种于PM培养基中，30℃、光照静置培养，获得NifA*突变菌，记为CGA755-NifA*，保存甘油管于-80℃，长期贮存。
CGA755-NifA*为将沼泽红假单胞菌CGA755菌株基因组DNA中的NifA基因替换为NifA*基因、并保持基因组中其他序列不变得到的菌株。
NifA基因的序列为SEQ ID NO.1，NifA基因编码SEQ ID NO.2所示的NifA蛋白；NifA*基因的序列为SEQ ID NO.3，NifA*基因编码SEQ ID NO.4所示的NifA蛋白。与NifA基因相比，NifA*基因缺少SEQ ID NO.1的第604-651位，与NifA蛋白相比，NifA*蛋白缺少SEQ IDNO.2的第202-217位。
表1
引物名称 序列(5′-3′)
pJQ-nifA*-up-F cgataagcttgatatcgaattcctgcagGCGGCCAGCTATGTCACCGGCGAAG
pJQ-nifA*-up-R CGCGCTCCAGCCGCTCGCGGTCGCGGG
pJQ-nifA*-down-F GCGGCTGGAGCGCGAGCGTAAGCGGGTCAAGGTCG
pJQ-nifA*-down-R gtggatcccccgggctgcagCACCCACCCGGCTCGCTCCA
(2)铁固氮酶编码基因中插入组氨酸标签
对上述步骤(1)得到的CGA755-NifA*基因组进行改造，在AnfD基因编码序列下游添加8His的编码序列，即得到AnfD-His基因，具体步骤如下：
分别以CGA755-NifA*菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ-His-up-F与pJQ-His-up-R(引物序列如表2)进行PCR扩增，所得PCR产物为AnfD编码基因终止密码子前1063bp的上游同源臂，利用pJQ-His-down-F与pJQ-His-down-R(引物序列如表2)进行PCR扩增，所得PCR产物为包含AnfD终止密码子3bp其后1062bp的下游同源臂；以所得的上下游各约1000bp作为同源臂，分别以同源重组的方法构建在质粒pJQ200SK的BamHI酶切位点上，将得到的序列正确的含有AnfD-His基因及上游同源臂和下游同源臂的重组质粒记为pJQ-His；将pJQ-His转入大肠杆菌S17-1中，然后将所得携带1种重组质粒的重组菌株接合转化CGA755-NifA*菌株。经同上筛选步骤，经过PCR鉴定，获得片段大小正确的菌落，即为带组氨酸标签的铁固氮酶突变菌株(CGA755-NifA*-His菌株)，记为CGA3018菌株。
CGA3018菌株为将CGA755-NifA*菌株基因组DNA中的AnfD基因替换为AnfD-His基因、并保持基因组中其他序列不变得到的菌株。
AnfD基因的序列为SEQ ID NO.5的第1-1566位，AnfD基因编码SEQ ID NO.6的第1-522位所示的AnfD蛋白；AnfD-His基因的序列为SEQ ID NO.5，AnfD-His基因编码SEQ IDNO.6所示的AnfD-His蛋白。
表2
引物名称 序列(5′-3′)
pJQ-His-up-F tcctgcagcccgggggatccACATCGCCTGGATCAACGAC
pJQ-His-up-R TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGGCCGCTTCGGCTTTG
pJQ-His-down-F GAGCACCACCACCACCACCACCACCACTGAGACGAGAGCCCCATGACC
pJQ-His-down-R gcggccgctctagaactagtCCGGATTGACCCAGCCTGTG
(3)铁固氮酶结构基因启动子PanfH改造为不同调控序列
对上述步骤(2)得到的CGA3018菌株的基因组做进一步改造，将铁固氮酶结构基因启动子PanfH改造为不同的表达调控序列，包括：
1、将基因组中铁固氮酶启动子PanfH(如序列SEQ ID NO.7)上AnfA结合保守序列(如序列SEQ ID NO.7的第116-128位)替换为NifA结合保守序列(如序列SEQ ID NO.8的第116-131位)，即将基因组中SEQ ID NO.7所示的铁固氮酶启动子PanfH替换为调控序列SEQID NO.8；
2、将基因组中铁固氮酶启动子PanfH(如序列SEQ ID NO.7)替换为钼固氮酶启动子PnifH(如序列SEQ ID NO.9)；
3、将基因组中铁固氮酶转化活化子AnfA和PanfH(如序列SEQ ID NO.10)替换为PnifH(如序列SEQ ID NO.9)。
步骤1、2、3分别得到CGA3019、CGA3020和CGA3021菌株(图1)。各菌株的具体制备.步骤如下：
CGA3019：分别以CGA3018菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ-PanfH*-up-F与pJQ-PanfH*-up-R(引物序列如表3)进行PCR扩增，所得PCR产物为NifA结合模序及基因组铁固氮酶启动子PanfH上AnfA结合模序的前1046bp的上游同源臂，利用pJQ-PanfH*-down-F与pJQ-PanfH*-down-R(引物序列如表3)进行PCR扩增，所得PCR产物为NifA结合模序及基因组铁固氮酶启动子PanfH上AnfA结合模序的后1057bp的下游同源臂；以所得的上下游各约1000bp作为同源臂，以同源重组的方法构建在质粒pJQ200SK的BamHI酶切位点上，将得到的序列正确的含有NifA结合模序及上游同源臂和下游同源臂的重组质粒记为pJQ-PanfH*(质粒构建示意图见图2)；将pJQ-PanfH*转入大肠杆菌S17-1中，然后将所得携带1种重组质粒的重组菌株接合转化CGA3018菌株。经同上筛选方法，经过PCR鉴定，获得片段大小正确的菌落(图3)，即基因工程菌CGA3019菌株。
CGA3019菌株为将CGA3018菌株基因组DNA中铁固氮酶启动子PanfH上的AnfH结合保守序列(SEQ ID NO.7的第116-128位)替换为钼固氮酶启动子PnifH上的NifA结合保守序列(SEQ ID NO.8的第116-131位)(也即将基因组中SEQ ID NO.7所示的铁固氮酶启动子PanfH替换为调控序列SEQ ID NO.8)，并保持基因组中其他序列不变得到的菌株。
CGA3020：分别以CGA3018菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ-Pa-up-F与pJQ-Pa-up-R(引物序列如表3)进行PCR扩增，所得PCR产物为PanfH的前923bp的上游同源臂，利用pJQ-PaPn-F与pJQ-PaPn-R(引物序列如表3)进行PCR扩增，所得PCR产物为钼固氮酶启动子PnifH序列，利用pJQ-Pa-down-F与pJQ-Pa-down-R(引物序列如表3)进行PCR扩增，所得PCR产物为PanfH的后640bp的下游同源臂；将所得的上下游同源臂以及PnifH序列，以同源重组的方法构建在质粒pJQ200SK的BamHI酶切位点上，将得到的序列正确的含有上游同源臂、PnifH和下游同源臂的重组质粒记为pJQ-PnifH-Pa；将pJQ-PnifH-Pa转入大肠杆菌S17-1中，然后将所得携带1种重组质粒的重组菌株接合转化CGA3018菌株。经同上筛选方法，经过PCR鉴定，获得片段大小正确的菌落(图3)，即基因工程菌CGA3020菌株。
CGA3020菌株为将CGA3018菌株基因组DNA中启动子PanfH序列(SEQ ID NO.7)替换为启动子PnifH序列(SEQ ID NO.9)的突变菌株，并保持基因组中其他序列不变得到的菌株。
CGA3021：分别以CGA3020菌株的基因组DNA为模板，利用pJQ-APa-up-F与pJQ-APa-up-R(引物序列如表3)进行PCR扩增，所得PCR产物为AnfA的前1054bp的上游同源臂，利用pJQ-APn-F与pJQ-APa-down-R(引物序列如表3)进行PCR扩增，所得PCR产物为PanfH的后1217bp的下游同源臂；以所得的上下游各约1000bp作为同源臂，以同源重组的方法构建在质粒pJQ200SK的BamHI酶切位点上，将得到的序列正确的含有上游同源臂和下游同源臂的重组质粒记为pJQ-PnifH-APa；将pJQ-PnifH-APa转入大肠杆菌S17-1中，然后将所得携带1种重组质粒的重组菌株接合转化CGA3020菌株。经同上筛选步骤，经过PCR鉴定，获得片段大小正确的菌落(图3)，即基因工程菌CGA3021菌株。
CGA3021菌株为将CGA3020菌株基因组DNA中AnfA的编码基因敲除，并保持基因组中其他序列不变得到的菌株。
表3
实施例2、基因工程菌的表型鉴定
在非固氮培养条件下，以出发菌株CGA755为对照，分别检测基因工程菌CGA3018、CGA3019、CGA3020和CGA3021的表型，所用培养基为PM非固氮培养基，培养3天达到平台期后，继续培养2天。已知固氮酶在固定N2的同时可以产生H2，铁固氮酶还能产生CH4，因此可以通过气相色谱检测方法对菌株的表型进行鉴定。
当厌氧培养的菌液生长达到稳定期后，对其上层气体进行气相色谱检测，分别分析产生的H2和CH4的物质的量。然后，分别吸取1mL菌液，12000rpm，1min，离心收集菌体，用溶液A重悬，通过Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。计算每株菌单位蛋白浓度下的产气量。每个实验重复3次。
通过以上实验发现，菌株CGA3020和CGA3021在非固氮条件下产生了氢气(图4中A)和甲烷(图4中B)，解除了铵抑制。其中，基因工程菌CGA3020产气量更高。
实施例3、基因工程菌表达的铁固氮酶酶活检测
固氮酶的活性可以通过乙炔还原法进行定量检测，其中钼固氮酶可以还原乙炔为乙烯，铁固氮酶可以将乙炔还原为乙烯和乙烷，根据气相色谱检测，对不同固氮酶进行定性表征。
以PM培养基培养的野生型菌株沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009和PM+Mo培养的NifA*突变菌株沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA676(钼固氮酶组成型表达，所表达钼固氮酶不带有His标签)为对照，对PM培养基培养的基因工程菌CGA3020和CGA3021的固氮酶酶活进行检测，当菌株培养至OD660nm达到0.4-0.5时，将菌液转移至含有0.5％乙炔的氮气厌氧管中，30℃静置8小时后，检测催化产物。然后，分别吸取1mL菌液，12000rpm，1min，离心收集菌体，用100mM NaOH重悬，煮沸15min后，12000rpm离心1min，上清通过Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。计算每株菌单位蛋白浓度下的产气量。每个实验重复3次。
通过气相色谱检测发现，基因工程菌CGA3020和CGA3021在非固氮条件下可将乙炔还原为乙烯和乙烷(图5)，钼固氮酶仅能将乙炔还原为乙烯。说明基因工程菌表达了有活性的铁固氮酶。
实施例4、基因工程菌的铁固氮酶表达量分析
基因工程菌的铁固氮酶表达量通过Western blot实验检测。以PM+Mo培养基培养的NifA*突变菌株CGA676 his::nifD为阳性对照，对PM培养基培养的基因工程菌(CGA3020与CGA3021)的铁固氮酶的产量进行相对定量分析。收集4mL培养菌体，用溶液A洗涤一次，并重悬，通过Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，以每孔15μg蛋白上样量进行SDS-PAGE电泳，然后通过western blot进行电转膜实验，比较组成型表达铁固氮酶和钼固氮酶的量。通过显色定量分析，确定组成型表达铁固氮酶的量与组成型表达钼固氮酶相当(图6)。
所用抗体为：一抗为His-tag抗体(小鼠单抗)(碧云天，货号AH367)，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(碧云天，货号A0216)。
实施例5、铁固氮酶复合物的制备
将基因工程菌CGA3020在装有10ml PM培养基的25ml厌氧管中光照培养，30℃静置2-3天，使其达到生长稳定期，接种于100ml PM培养基的120ml厌氧瓶中培养至稳定期，然后将100ml种子液接种于4L PM培养基的5L厌氧瓶中，光照，30℃静置发酵2-3天，培养至稳定期得到发酵液。8000rpm，5min，离心收集菌体，并用100mL溶液A重悬，然后进行铁固氮酶复合物的制备，以下步骤均在厌氧条件下进行，所有溶液均经过厌氧抽换气处理，并在纯化前加入2mM连二亚硫酸钠粉末(每升缓冲液加入0.348g连二亚硫酸钠粉末)。
将100mL重悬菌液样品通过高压均质仪破碎，破碎条件为1500bar，4℃，破碎5次并收集。10000rpm，4℃，1h，离心收集上清和破碎菌体。上清由0.22μm滤器过滤。通过仪器AKTApure进行制备，厌氧制备条件如下：
①将样品进行组氨酸亲和层析纯化，采用的层析柱为His trapTM HP，上样缓冲液为溶液A，以溶液B/溶液A比例0-100％梯度洗脱，收集样品通过超滤离心浓缩体积至2ml以内。
②上一步浓缩样品进一步通过凝胶过滤层析柱SuperdexTM 200Increase 10/300GL进行纯化，溶液A进行上样和组分分离，流速0.5mL/min，9-10mL出峰。制备的铁固氮酶复合物通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。
通过两步层析，制备得到铁固氮酶复合物AnfDGK，其由AnfD-His、AnfG和AnfK组成。AnfD-His的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.6，AnfD-His的编码DNA序列如序列SEQ IDNO.5；AnfG的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.13，AnfG的编码DNA序列如序列SEQ ID NO.14，AnfK的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.15，AnfK的编码DNA序列如序列SEQ ID NO.16(图7)，总蛋白量约3-4mg，平均每升发酵液的铁固氮酶复合物产量为0.75-1.00mg/L。本发明成功获得AnfDGK复合物。基因工程菌CGA3020能够表达铁固氮酶复合物AnfDGK与AnfH，AnfH的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.11，AnfH的编码DNA序列如序列SEQ ID NO.12。
本发明通过基因工程技术手段得到一种表达铁固氮酶的高效耐铵基因工程菌，为将来工业化生产应用提供了良好的基础。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种重组菌的制备方法，包括：对受体菌进行包括如下1)与2)的改造，得到重组菌：
1)使所述受体菌中NifA蛋白质具有活性；
2)包括2A)或2B)：
2A)将所述受体菌基因组中铁固氮酶anfH启动子替换为钼固氮酶nifH启动子；
2B)将所述受体菌基因组中AnfA基因和所述铁固氮酶anfH启动子替换为所述钼固氮酶nifH启动子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述NifA蛋白质如SEQ ID NO.2所示；
和/或，所述铁固氮酶anfH启动子为SEQ ID NO.7所示的DNA分子；
和/或，所述钼固氮酶nifH启动子为SEQ ID NO.9所示的DNA分子；
和/或，所述AnfA基因为SEQ ID NO.10的第1-1629位所示的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)通过a)使SEQ ID NO.2所示NifA蛋白质的第202-217位氨基酸的缺失突变，或b)使所述NifA蛋白质的第202、209、212、213位氨基酸饱和突变，或c)使所述NifA蛋白质的第202、209、212和/或213位氨基酸突变实现，或使与所述NifA蛋白质的同源蛋白质的同源位置发生a)或b)或c)的突变实现；
步骤2B)通过将SEQ ID NO.10所示的DNA分子替换为SEQ ID NO.9所示的DNA分子实现。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对所述受体菌进行3)的改造：
3)在所述受体菌基因组中AnfD基因上游或下游连接标签的编码基因，使所得重组菌能够表达AnfD与所述标签的融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述标签为组氨酸标签；
进一步，所述组氨酸标签为6-8个组氨酸连接得到的标签。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述受体菌为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；
进一步，所述受体菌为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA755。
7.利用权利要求1-6中任一所述的方法得到的重组菌，或含有所述重组菌的菌剂。
8.权利要求7所述重组菌或菌剂在制备铁固氮酶中的应用，或在制备生产铁固氮酶产品中的应用。
9.一种制备铁固氮酶复合物的方法，包括：培养权利要求7所述重组菌，得到培养液；提取所述培养液中的铁固氮酶复合物，即得到铁固氮酶复合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述培养在厌氧条件下进行；
和/或，所述培养在PM培养基中进行，所述PM培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述PM培养基中的浓度分别为12.5mM磷酸氢二钠，12.5mM磷酸二氢钾，1mL/L浓缩碱，0.1mM硫代硫酸钠，2mg/L对氨基苯甲酸，20mM醋酸钠，质量百分含量为0.1％的硫酸铵；所述浓缩碱由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述浓缩碱中的浓度分别为20g/L氨基三乙酸，28.9g/L无水硫酸镁，6.67g/L CaCl2·2H2O，0.198g/LFeSO4·7H2O，100mL/L Metal 44；所述Metal 44由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述Metal 44中的浓度分别为2.5g/L EDTA，10.95g/L ZnSO4·7H2O，5g/LFeSO4·7H2O，1.54g/L MnSO4·H2O，0.392g/L CuSO4·5H2O，0.25g/L Co(NO3)2·6H2O，0.177g/L Na2B4O7·10H2O；
和/或，所述培养在25-30℃下进行；
和/或，提取所述培养液中的铁固氮酶复合物采用含有还原剂的提取液进行；
进一步，所述还原剂为2-10mM连二亚硫酸钠。
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