CN110387345A

CN110387345A - 一种基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌、构建方法及其应用

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Publication number: CN110387345A
Application number: CN201910633205.6A
Authority: CN
Inventors: 史劲松; 龚劲松; 李晓鹏; 许正宏; 李会; 张超; 丁振中
Original assignee: YANGZHOU RIXING BIO-TECH Co Ltd; Jiangnan University
Current assignee: YANGZHOU RIXING BIO-TECH Co Ltd; Jiangnan University
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2019-10-29

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9技术的氨糖合酶产生菌、构建方法及其应用，该氨糖合酶产生菌是将氨基葡萄糖乙酰化酶基因gnal和氨基葡萄糖合酶基因glms连接到载体pET‑28a上，再将重组质粒转入CRISPR‑Cas9基因编辑技术敲除E.coli BL21(DE3)基因组氨基葡萄糖代谢基因naggE和mannX得到的双基因缺失宿主菌中获得的。该重组菌应用于发酵培养，在摇瓶上可以累积氨基葡萄糖7.51g/L，乙酰氨基葡萄糖3.73g/L，总产量为11.24g/L；在5L发酵罐上可以累积氨基葡萄糖7.30g/L，乙酰氨基葡萄糖10.53g/L，总产量为17.83g/L。

Description

一种基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌、构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因敲除技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌、构建方法及其应用。

背景技术

氨基葡萄糖(GlcN)在关节炎的预防和治疗等方面有着良好的疗效，关节炎主要是由于关节损坏和关节软骨异常所引起，从而导致患者在日常的行动中不便，甚至导致骨关节的功能丧失，氨基葡萄糖在体内通过一定的机制刺激软骨细胞，有效的促进胶原蛋白的合成，逐渐修复受损的关节软骨。通过补充氨基葡萄糖可以促进糖蛋白的合成来修补受损的软骨，增加关节间的润滑，减少关节间的磨损。另外，氨基葡萄糖也可调节机体的内分泌以及吸附在肠道上减少人体对油脂的摄入，从而促进减肥，亦可成为新型细胞分化诱导药物而应用于临床。

氨基葡萄糖的生产方法有多种，目前已应用于工业生产或具有良好应用前景的方法主要包括3种。国内生产氨基葡萄糖最主要的方法是通过酸水解甲壳素来制备，但是这种方法在生产氨基葡萄糖的过程中会产生大量酸碱造成环境污染，同时对于设备也有很高的要求，而且以虾蟹壳作为原料来制备氨基葡萄糖被人食用后易产生过敏反应，这一系列问题限制了其大规模推广。生物转化法比传统方法具有明显进步，其反应条件温和，对环境友好，同时采用生物发酵法避免了上述传统生产方法的缺点，具有生产强度高，发酵周期短，无异味，污染小等优点，近年来逐步受到关注。

目前，通过发酵法生产氨基葡萄糖的菌株主要有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及丝状真菌这三大类。其中，采用大肠杆菌进行氨基葡萄糖发酵由于具备生产周期短、繁殖速度快、产量高等特点而受到广泛关注。在大肠杆菌中，利用葡萄糖的方式有两种，分别为PTS途径和非PTS途径。利用葡萄糖转化为氨基葡萄糖的途径主要为PTS途径，该途径解析如下：将葡萄糖转运到胞内，经磷酸化作用变为6-磷酸葡萄糖，在经过异构酶作用变为6-磷酸果糖，再经过氨基葡萄糖合酶的催化作用变成6-磷酸氨基葡萄糖，继而被氨基葡萄糖乙酰化酶催化后可变成6-磷酸乙酰氨基葡萄糖，6-磷酸氨基葡萄糖和6-磷酸乙酰氨基葡萄糖去磷酸化后可被运输到胞外，分泌到发酵液中。大肠杆菌不仅可以生产氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖，同样也可以利用它们，在发酵过程中，如果培养基中的葡萄糖浓度过低，发酵产生的氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖也会被菌体代谢利用，它们被菌体利用需要多个基因参与调控，其中利用氨基葡萄糖的关键基因为mannX，利用乙酰氨基葡萄糖的关键基因为mannX和naggE。总的来说，这两个基因的缺失对于发酵液中高效累积氨基葡萄糖至关重要。传统的大肠杆菌体系基因敲除多采用同源重组敲除技术。然而同源重组技术敲除B系列大肠杆菌基因的效率很低，抗性难以消除，敲除周期长，步骤繁琐。随着合成生物学技术的发展与进步，已有大量研究已经表明CRISPR/Cas9系统作为一种强有效的基因编辑工具可广泛应用于不同生物体的基因敲除。

已有研究表明，GlcN对大肠杆菌细胞生长有很强的抑制作用，因此用野生型菌株进行微生物发酵难以获得较高的GlcN累积浓度，而GlcNAc作为GlcN的N-乙酰化衍生物，对细胞稳定且无抑制作用，在温和酸性条件下易于水解生成GlcN。因此，通过过表达氨基葡萄糖乙酰化酶，使GlcN通路延伸到GlcNAc，可以减轻GlcN对细胞的抑制作用。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌，利用基因编辑技术对亲本菌株的代谢途径进行改造，缺失利用代谢产物的关键酶基因，构建重组质粒增强代谢途径中关键酶基因的表达量，最终增强工程菌的氨基葡萄糖合成产量。本发明的另一目的是提供上述氨糖合酶产生菌的构建方法，基于CRISPR-Cas9基因编辑技术在大肠杆菌基因组中对相关代谢利用氨基葡萄糖的关键基因进行基因编辑敲除，该方法具有非常精准、廉价、操作简便、易于使用、效率高的优点。本发明的再一目的是提供上述氨糖合酶产生菌的发酵应用，因细胞表型变化，能够减轻氨基葡萄糖对细胞的抑制作用，增强氨基葡萄糖的合成，提高发酵过程中氨基葡萄糖的积累效率，具有发酵时间短，生产强度高，生产成本低，对环境污染小，无过敏反应等优点，生产得到的氨基葡萄糖可以广泛用于医药、食品等领域。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌，是应用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除E.coli BL21(DE3)基因组氨基葡萄糖代谢基因naggE和mannX得到双基因缺失宿主菌E.coli BL21△mannX△naggE，并导入SEQ ID NO.1所示的氨基葡萄糖乙酰化酶基因gnal和SEQ ID NO.2所示的氨基葡萄糖合酶基因glms获得的。

敲除的maunX基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

敲除的naggE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

氨基葡萄糖乙酰化酶基因gnal和氨基葡萄糖合酶基因glms连接到载体pET-28a上，再将重组质粒导入宿主菌获得的。

基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌的构建方法，包括如下步骤：

1)将质粒pCas9转入E.coli BL21(DE3)，获得E.coli BL21(DE3)-pCas9；

2)根据靶标基因设计反向互补的引物，所述引物含靶标基因20个核苷酸序列，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒；

3)重叠延伸PCR扩增基因敲除的靶片段mannX、naggE；

4)将步骤2)获得的pTargetF质粒和步骤3)获得的靶片段mannX、naggE通过电化学转化的方法转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pCas9感受态细胞，获得敲除靶标基因的大肠杆菌；

5)质粒pTargetF和质粒pCas9的消除，获得E.coli BL21△mannX△naggE；

6)用限制性内切酶BamH I和Hind III对pET-28a进行酶切，并通过连接反应将glms基因片断、gnal基因片段、质粒pET-28a进行同源重组，得到重组质粒pET-28a/gnal/glms；

7)将质粒pET-28a/gnal/glms转化E.coli BL21△mannX△naggE，得到高效累积氨基葡萄糖的重组大肠杆菌。

基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌的摇瓶发酵应用，将氨糖合酶产生菌接种至含有Kan抗生素的摇瓶发酵培养基中，在37℃，220rpm培养发酵2-10h时，添加终浓度为0.2-1.0mM的IPTG，并调节温度为15-37℃，继续培养至24h，发酵结束取发酵液上清，测得氨基葡萄糖含量。

优选的，将氨糖合酶产生菌接种至含有Kan抗生素的摇瓶发酵培养基中，在37℃，220rpm培养发酵4h时，添加终浓度为0.6mM的IPTG，并调节温度为30℃，继续培养至24h，发酵结束取发酵液上清，测得氨基葡萄糖含量。

发酵培养基为M9液体培养基：葡萄糖40g/L，氯化铵4g/L，七水合硫酸镁0.49g/L，六水合氯化钙0.02g/L，七水合磷酸氢二钠12.8g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钠0.5g/L。

基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌在发酵罐上的发酵应用，将氨糖合酶产生菌接种至含有Kan抗生素的M9罐上培养基中发酵培养，转速为400-600rpm，发酵培养12h后，开始流加300g/L的葡萄糖，选取流加的葡萄糖的补糖速率为20-40mL/h，补料体积为500mL，通气量为1vvm-1.16vvm，使用50％氨水维持pH稳定在7.0。

Kan抗生素的浓度为50mg/L。

有益效果：本发明基于基于CRISPR-Cas9基因编辑技术在大肠杆菌基因组中对相关代谢利用氨基葡萄糖的关键基因进行基因编辑敲除得到双基因缺失宿主菌，并将氨基葡萄糖乙酰化酶基因gnal和氨基葡萄糖合酶基因glms连接到载体pET-28a上，再将重组质粒导入宿主菌获得的氨糖合酶产生菌，该重组菌株表现出高效累积氨基葡萄糖的能力。与现有技术相比，具有以下优势：

1)传统的大肠杆菌体系基因敲除多采用同源重组敲除技术。然而同源重组技术敲除B系列大肠杆菌基因的效率低，抗性难以消除，敲除周期长，步骤繁琐。CRISPR-Cas9基因编辑技术具有非常精准、廉价、操作简便、易于使用、效率高的优点。

2)将代谢工程和基因编辑技术结合，通过全局搜索中心代谢途径中利用产物氨基葡萄糖的初级代谢与合成步骤并根据细胞表型变化，敲除代谢利用氨基葡萄糖的关键酶基因，使GlcN通路延伸到GlcNAc，减轻GlcN对细胞的抑制作用，增强氨基葡萄糖的合成，提高发酵过程中氨基葡萄糖的积累效率。

3)相比传统通过酸水解甲壳素来制备氨基葡萄糖的方法，具有发酵时间短，生产强度高，生产成本低，对环境污染小，无过敏反应等优点，生产得到的氨基葡萄糖可以广泛用于医药、食品等领域。

附图说明

图1是采用CRISPR-Cas9技术敲除基因mannX验证结果图；

图2是采用CRISPR-Cas9技术敲除基因naggE验证结果图；

图3是重组表达质粒pET-28a/gnal/glms的验证结果图；

图4是双基因敲除的重组大肠杆菌SDS-PAGE电泳验证图谱图；

图5是重组大肠杆菌摇瓶发酵结果图；

图6是重组大肠杆菌不同转速条件下在5L罐上发酵情况图；

图7是重组大肠杆菌在不同补料流速下在5L罐上发酵情况图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例所使用的菌株和质粒如表1所示。

表1实施例所用菌株和质粒

实施例1：CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除基因mannX和naggE

以E.coli BL21(DE3)作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术对出发菌株进行目标基因的敲除工作。具体的操作步骤如下：

(1)将pCas9质粒加入到含有100μL的E.coli BL21(DE3)感受态的离心管中，迅速在冰浴中维持30min，然后在42℃水浴中热激90s，热激后立刻放入冰浴中冷却5min。从冰里取出离心管，向离心管中加入800μL的LB培养基，将其放在摇床上活化培养45min。将离心管取出并离心，条件为8000r/min离心5min，离心后在超净台吸掉800μL的上清液，吹吸混匀菌体并涂布于含有终浓度为100mg/L相应抗生素的LB固体平板上，在37℃生化培养箱中倒置培养12h。

(2)使用根据编码序列(SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4)设计的基因特异性引物用来获得待敲除基因的打靶片段和pTargetF质粒。使用表2中的引物进行目的基因的扩增。采用重叠延伸PCR扩增基因敲除的靶片段(mannX、naggE)，放置在负20℃冰箱中留存备用；利用设计的基因特异性引物扩增得到pTargetF线性化片段，在200μL离心管中加入20μL反应体系(其中含有1μL的线性化pTargetF片段，4μL的5×CE MultiS Buffer，2μL的ExnaseMultiS，13μL的dd H₂O)，反应体系置于37℃温浴30min，使目的基因发生同源重组，然后将同源重组产物采用步骤(1)的方法转化到E.coli JM109中，然后提取含有特异性N20的pTargetF质粒留存备用。

表2实施例1中扩增目的基因所需引物序列

注：首字母m对应的是mannX基因；n对应的是naggE基因；M1F、M1R用于扩增基因上游同源臂；M2F、M2R用于扩增基因下游同源臂。

表2中设计扩增pTargetF质粒的引物关键性在于N20的选择，每个基因上面都有大量的N20可供挑选，我们通过参考NCBI中Escherichia coli str.K-12substr.MG1655基因组序列，主要挑选基因两端符合条件的N20，并用来设计引物。表2中设计扩增基因同源臂引物时一般在基因的上游选择300bp，下游选择300bp，采用重叠延伸PCR反应得到600bp左右的同源臂基因。

(3)利用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pCas9制备化转感受态，将300ng同源臂基因和100ng的pTargetF质粒和感受态在1.5mLEP管中混合均匀后立马转移到电击杯中并放置在冰上，设定电转仪参数电压为1800V，电转仪将基因同源臂和pTargetF质粒转化到E.coliBL21(DE3)/pCas9中。一系列电转操作后，使用终浓度为10mM的L-arabinose来诱导菌体内产生同源重组酶促进同源重组的发生，然后放置在参数为30℃、220rpm的摇床中振荡培养2h，之后离心弃掉一定量的上清液，将剩下的培养基和菌株吹吸混匀并涂布于含有Kan+Spc的LB固体平板上，放置在30℃培养箱中倒置培养12h。

(4)得到正确的克隆子之后，挑取单菌落于单抗(Kan)10mL/50mL LB小摇瓶中，而后可直接加入终浓度0.5mM的IPTG置于30℃过夜培养(8h左右)。过夜培养的菌液在单抗(Kan)平板上划线分离出单菌落，而后挑取单菌落于单抗(Kan)10mL/50mL LB小摇瓶中，富集培养之后在双抗平板(Kan+Spc(或者Kan+Smr))上划线(也可以接种1％到双抗Kan+Spc(或者Kan+Smr))10mL/50mLLB小摇瓶中)，双抗平板上没长的，就是pTargetF正常消除的克隆子。

(5)得到正确的pTargetF正常消除克隆子之后，挑取单菌落于无抗性10mL/50mLLB小摇瓶中，置于42℃过夜培养(8h左右)。过夜培养的菌液在无抗性的平板上划线分离出单菌落，而后挑取单菌落于无抗性10mL/50mL LB小摇瓶中或者孔板中，富集培养之后在单抗平板(Kan)上划线(也可以接种1％到单抗(Kan)10mL/50mL LB小摇瓶中)，单抗平板上没长的，就是pCas9正常消除的克隆子。

实施例2：双基因缺失大肠杆菌可利用碳源的探究

以相同接种量将两种菌分别接种于50mL的M9+葡萄糖Glc(终浓度0.5％)，M9+氨基葡萄糖GlcN(终浓度0.5％)，M9+乙酰氨基葡萄糖GlcNAc(终浓度0.5％)液体培养基中，在220rpm，37℃相同条件下同一时间下培养，定期取样，测定OD₆₀₀，绘制出两种菌在不同液体培养基中的生长情况曲线，来探究双基因缺失大肠杆菌是否可以利用氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖。

实施例3：重组表达质粒pET-28a/gnal/glms的构建

表3实施例3中扩增目的基因需用到的引物序列

表3中氨基葡萄糖合酶基因引物的设计主要是根据NCBI中Escherichia colistr.K-12 substr.MG1655基因组氨基葡萄糖合酶基因glms序列为标准，氨基葡萄糖乙酰化酶基因引物的设计主要是根据优化后的酿酒酵母来源的氨基葡萄糖乙酰化酶基因gnal序列为标准，利用SnapGene软件设计得到。

(1)Primer STAR HS DNA聚合酶具有较好的保真性，因此被用于目的基因的扩增。PCR反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性0.5min，60℃退火0.75min，72℃延伸2min，72℃终延伸10min，重复34个循环。PCR反应体系为：Premix 25μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，dd H₂O 19μL，大肠杆菌基因组或gnal基因1μL。PCR反应结束后，将PCR产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段割胶回收纯化，用dd H₂O溶解。提取得到质粒pET-28a并使用QuickCut BamH I和QuickCut Hind III对质粒进行双酶切。

(2)将酶切后的表达质粒和目的基因进行琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒进行回收，将回收后得到的氨基葡萄糖合酶基因glms，氨基葡萄糖乙酰化酶基因gnal和双酶切后的表达质粒按照合适的体系(1μL双酶切后的pET-28a，4μL5×CE MultiS Buffer，2μLExnase MultiS，1μL gnal基因，1μL glms基因，11μL的dd H₂O)进行同源重组。然后放入37℃金属浴反应30min。

(3)将同源重组产物通过化学转化法转入实施例1得到的双基因敲除宿主菌中，筛选得到正确的克隆转化子，得到重组大肠杆菌。

实施例4：重组大肠杆菌的SDS-PAGE验证

将通过PCR验证、酶切验证和测序验证确认正确的阳性克隆接种至含有抗性的LB培养基中培养，作为种子液，按照2％接种量接种于相应发酵培养基中，选取250mL摇瓶进行培养，装液量总体积为50mL，37℃，220rpm培养24h，发酵2h时加入1mM IPTG进行诱导。诱导12h后取5mL发酵液，吸取一定量的发酵液，与5×样品缓冲液(40μL+10μL)按一定比例加入到1.5mL的离心管中混合。置于100℃加热5-10min，取上清进行点样。组装蛋白胶电泳系统，加入Running Buffer，用进样针点样20μL，调节电压为80V，当酚蓝刚跑出浓缩胶并压成一条线(约30min)时改变电压为180V，待溴酚蓝运行至分离胶底部时停止电泳，取出蛋白胶，置于考马斯亮蓝染色液中室温染色2h左右，取出蛋白胶放入脱色液(蒸馏水∶乙醇∶乙酸＝7∶2∶1)中，置于80rpm脱色摇床上，每20min更换一次脱色液至完全脱色。

实施例5：重组大肠杆菌的摇瓶发酵优化

产物测定方法：

(1)氨基葡萄糖测定方法

分别称量氨基葡萄糖的标样并配置成1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L的氨基葡萄糖溶液，按照Morgan-Elson方法检测并绘制得到标准曲线。

Morgan-Elson方法进行氨基葡萄糖含量测定：取样品5.0mL加入5mL离心管中，8000r/min离心5min，取0.5mL离心上清液加入乙酰丙酮试剂1.0mL，90℃水浴处理1h，冷却至室温，慢慢加入96％(v/v)乙醇10mL，加入1.0mL的DMAB试剂并混合均匀。混合后室温放置1h，在530nm处比色，根据标准曲线计算胞外氨基葡萄糖产量。每组均做3次平行。

(2)乙酰化氨基葡萄糖测定方法

分别称量氨基葡萄糖的标样并配置成2.0g/L、4.0g/L、6.0g/L、8.0g/L、10.0g/L的氨基葡萄糖溶液，按照改良后的Reissig方法^[56]检测并计算绘制标准曲线。

乙酰化氨基葡萄糖测定方法：发酵液离心取上清液2μL于1.5mL EP管中，加入43μL超纯水以及1μL四硼酸钾溶液(1.5g四硼酸钾溶解于25mL超纯水)后于96℃金属浴加热5min，结束反应。然后取10μL反应液于96浅孔板中，再向其中加入125μL的PDABA溶液(1g对二甲氨基苯甲醛溶解于100mL含1.25％盐酸的冰醋酸中)，于37℃96孔板摇床反应10min，利用酶标仪测定585nm处吸光值，根据标准曲线计算出胞外乙酰化氨基葡萄糖的产量。每组均做3次平行。

菌种发酵：

(1)菌种活化和纯化：取于-20℃冰箱中保存的甘油管，接10μL甘油管中的菌液于试管液体LB培养基中37℃，220rpm过夜培养12-14h。用接种环沾取菌液划线于LB固体培养基中于37℃培养箱中倒置培养12-14h，挑取单菌落于37℃，220rpm进行液体LB培养12-14h并保菌。

(2)种子培养：取甘油管中的菌液200μL接种于50mL液体LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养12h。

(3)发酵培养：取种子液按照2％接种量接种于相应发酵培养基中，选取250mL摇瓶进行培养，装液量为50mL，添加50mg/L Kan抗生素，37℃、220rpm培养24h，定期取样测定生物量OD₆₀₀，产物氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖含量。

选取LB，TB，M9，GYT，SOB 5种发酵培养基，初糖浓度均为30g/L，筛选适合基因工程菌大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的培养基。从发酵结果来看M9无机盐发酵培养基更适合本研究中的重组大肠杆菌生产氨基葡萄糖，最终氨基葡萄糖产量3.27g/L和乙酰氨基葡萄糖产量1.82g/L，总产量为5.09g/L。对重组大肠杆菌在摇瓶水平进行了发酵条件优化，如图5所示，最终确定发酵培养4h后添加0.6mM的IPTG于30℃条件下诱导可达最佳效果。对培养基组分的优化结果显示，在葡萄糖40g/L，氯化铵4g/L，七水合硫酸镁0.49g/L，六水合氯化钙0.02g/L，七水合磷酸钠12.8g/L，磷酸二氢钠3g/L，氯化钠0.5g/L时，氨基葡萄糖产量可达到7.51g/L，乙酰氨基葡萄糖为3.73g/L，总产量为11.24g/L，相比初始产量提升1.2倍。

培养基配方：

(1)LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，pH自然；

(2)TB液体培养基(g/L)：磷酸二氢钾2.3，蛋白胨12，磷酸氢二钾12.54，甘油4，酵母粉24，pH自然；

(3)M9液体培养基(g/L)：六水合氯化钙0.02，氯化铵1，七水合磷酸氢二钠12.8，磷酸二氢钾3，七水合硫酸镁0.49，氯化钠0.5，pH自然；

(4)GYT液体培养基(g/L)：蛋白胨2.5，酵母粉1.25，甘油10，pH自然；

(5)SOB培养基(g/L)：氯化钠0.5，酵母粉5，氯化钾0.19，蛋白胨20，氯化镁0.95，pH自然；

以上5种培养基作为发酵培养基时另加入葡萄糖母液使得葡萄糖终浓度为30g/L。

实施例6：重组大肠杆菌的罐上发酵

(1)5L罐的分批发酵

如图6所示，在5L发酵罐中首先进行了分批发酵：选取转速分别为400rpm，500rpm，600rpm，探究转速对于发酵生产氨基葡萄糖和乙酰化氨基葡萄糖的影响。发酵培养基为优化后的M9培养基。5L发酵罐中装液3L，添加50mg/LKan抗生素，通气量为1vvm，接种量为2％，用75％的氨水调节pH，37℃培养4h后加入0.6mM的诱导剂于30℃发酵培养32h，每隔4h取样一次。转速为600rpm时，氨基葡萄糖产量为5.67g/L，乙酰化氨基葡萄糖产量为6.83g/L，总产量为12.50g/L。

(2)5L罐的流加葡萄糖补料发酵

在5L发酵罐中进行了流加葡萄糖的补料发酵：发酵培养基为摇瓶优化后的M9培养基，选取的补糖浓度为300g/L，探究了不同补糖速率对发酵生产氨基葡萄糖的影响。如图7所示，发酵培养12h后开始补加300g/L的葡萄糖，选取流加的葡萄糖的补糖速率分别为20mL/h，30mL/h，40mL/h，补料体积为500mL。最终装液量体积为3.5L，通气量为1vvm-1.16vvm，接种量为2％，使用50％氨水来维持pH稳定在7.0，37℃培养4h后加入0.6mM的诱导剂于30℃诱导发酵培养36h，每隔4h取一次样。根据不同流加速率补料分批发酵的结果，最终确定最佳流加速率为30mL/h。此时氨基葡萄糖产量为7.30g/L，乙酰化氨基葡萄糖产量为10.53g/L，总产量可达到17.83g/L。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 扬州日兴生物科技股份有限公司；江南大学

<120> 一种基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌、构建方法及其应用

<130> 1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 480

<212> DNA

<213> artificial

<400> 1

atgagcctgc cggatggctt ctacatccgt cgtatggaag aaggcgatct ggaacaggtt 60

accgaaaccc tgaaagttct gaccaccgtt ggcaccatca ccccggaatc cttcagcaaa 120

ctgatcaaat actggaacga agcgaccgtt tggaacgata acgaagataa gaaaatcatg 180

cagtacaacc cgatggttat cgttgataaa cgtaccgaaa ccgttgcggc gaccggcaac 240

atcatcatcg aacgtaaaat catccacgaa ctgggcctgt gcggtcacat cgaagacatc 300

gcggtgaaca gcaaatacca gggccagggc ctgggcaaac tgctgatcga ccagctggtg 360

accatcggct tcgactacgg ctgctacaaa atcatcctgg attgcgatga gaaaaacgtt 420

aaattctacg aaaaatgcgg cttcagcaac gcgggcgttg aaatgcagat ccgtaaataa 480

<210> 2

<211> 1830

<212> DNA

<213> artificial

<400> 2

atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60

ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcagaa 120

ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggcaca ggcagcggaa 180

gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240

ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300

atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360

tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420

actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480

atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540

attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600

acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc gatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660

aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720

tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780

ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840

gagctgggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900

tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960

attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020

aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080

cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140

tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200

gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260

tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320

ctgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380

gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440

ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500

ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560

gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620

ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680

cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740

ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800

aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830

<210> 3

<211> 972

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

atgaccattg ctattgttat aggcacacat ggttgggctg cagagcagtt gcttaaaacg 60

ccagaaatgc tgttaggcga gcaggaaaac gtcggctgga tcgatttcgt tccaggtgaa 120

tatgccgaaa cgctgattga aaagtacaac gctcagttgg caaaactcga caccactaaa 180

cgcgtgctgt ttctcgttga tacatgggga ggcagcccgt tcaatgctgc cagccgcatt 240

ctcgtcgaca aagagcatta tgaagtcatt gcaggcgtta acattccaat gctcgtggaa 300

tcgttaatgg cccgtgatga tgacccaagc tttgatgaac tggtggcact ggcagtagaa 360

tcaggccgtg aaggcgtgaa agcactgaaa gccaaaccgg ttgaaaaagc cgcgccagca 420

gccgctgccg cagcaccaaa agcggctcca actccggcaa aaccaatggg gccaaacgac 480

aacatggtta ttggccttgc gcgtatcgac gaccgtctga ttcacggtca ggtcgccacc 540

ggctggacca aagaaaccaa tgtctcccgt attattgttg ttagtgatga agtggctgcg 600

cataccgttc gtaagacact gctcacccag gttgcacctc cgggcgtaac agcacacgta 660

cttgatgttg ccaaaatgat tcgcgtctac aacaacccga aatatgctgg cgaacgcgta 720

ttgctgttat ttaccaaccc aacagatgta gagcgtctcg ttgaaggcgg cgtgaaaatc 780

tcctctgtta acgtcggtgg tatggcattc cgtcagggta aaacccaggt gaataacgcg 840

ctttcggttg atgaaaaaga tatcgaggcg ttcaagaaac tgaatgcgcg cggtattgag 900

gtggaagtcc gtaaggtttc caccgatccg aaactgaaaa tgatggatct gatcagcaaa 960

ttcgataagt aa 972

<210> 4

<211> 948

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 4

atgtgcgggc gcgctgggtt ccggtatctt tggtttcatc aaccgtctgc tgatcccaac 60

gggtctgcat caggtactga acaccatcgc ctggttccag attggtgaat tcaccaacgc 120

cgcgggtacg gttttccacg gtgacattaa ccgcttctat gccggtgacg gcaccgcggg 180

catgttcatg tccggcttct tcccgatcat gatgttcggt ctgccgggtg cggcgctggc 240

catgtacttc gcagcaccga aagagcgtcg tccgatggtt ggcggtatgc tgctttctgt 300

agctgttact gcgttcctga ccggtgtgac tgagccgctg gaattcctgt tcatgttcct 360

agctccgctg ctgtacctcc tgcacgcact gctgaccggt atcagcctgt ttgtggcaac 420

cctgctgggt atccacgcgg gcttctcttt ctctgcgggg gctatcgact acgcgttgat 480

ctataacctg ccggccgcca gccagaacgt ctggatgctg ctggtgatgg gcgttatctt 540

gttcgctatc tacttcgtgg tgttcagttt ggttatccgc atgttcaacc tgaaaacgcc 600

cggtcgtgaa gataaagaag acgagatcgt tactgaagaa gccaacagca acactgaaga 660

tggtctgact caactggcaa ccaactatat tgctgcggtt ggcggcactg acaacctgaa 720

tgcgattgac gcctgtatca cccgtctgcg ccttacagtg gctgactctg cccgcgttaa 780

ggatacgatg tgtaaacgtc tgggtgcttc tggggtagtg aaactgaaca aacagactat 840

acaggtgatt gttggcgcga aagcagaatc catcggcgat gcgatgaaga aagtcgttgc 900

gcgtggtccg gtagccgctg cgtcagctga agcaactccg gcaactaa 948

Claims

1.一种基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌，其特征在于，所述氨糖合酶产生菌是应用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除E.coli BL21(DE3)基因组氨基葡萄糖代谢基因naggE和mannX得到双基因缺失宿主菌E.coli BL21ΔmannXΔ naggE，并导入SEQ ID NO.1所示的氨基葡萄糖乙酰化酶基因gnal和SEQ ID NO.2所示的氨基葡萄糖合酶基因glms获得的。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌，其特征在于敲除的mannX基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌，其特征在于敲除的naggE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌，其特征在于，氨基葡萄糖乙酰化酶基因gnal和氨基葡萄糖合酶基因glms连接到载体pET-28a上，再将重组质粒导入宿主菌获得的。

5.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将质粒pCas9转入E.coli BL21(DE3)，获得E.coli BL21(DE3)-pCas9；

3)重叠延伸PCR扩增基因敲除的靶片段mannX、naggE；

5)质粒pTargetF和质粒pCas9的消除，获得E.coli BL21ΔmannXΔnaggE；

7)将质粒pET-28a/gnal/glms转化E.coli BL21ΔmannXΔnaggE，得到高效累积氨基葡萄糖的重组大肠杆菌。

6.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌的摇瓶发酵应用，其特征在于，将所述氨糖合酶产生菌接种至含有Kan抗生素的摇瓶发酵培养基中，在37℃，220rpm培养发酵2-10h时，添加终浓度为0.2-1.0mM的IPTG，并调节温度为15-37℃，继续培养至24h，发酵结束取发酵液上清，测得氨基葡萄糖含量。

7.根据权利要求6所述的基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌的摇瓶发酵应用，其特征在于，将所述氨糖合酶产生菌接种至含有Kan抗生素的摇瓶发酵培养基中，在37℃，220rpm培养发酵4h时，添加终浓度为0.6mM的IPTG，并调节温度为30℃，继续培养至24h，发酵结束取发酵液上清，测得氨基葡萄糖含量。

8.根据权利要求6所述的基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌的摇瓶发酵应用，其特征在于，所述发酵培养基为M9液体培养基：葡萄糖40g/L，氯化铵4g/L，七水合硫酸镁0.49g/L，六水合氯化钙0.02g/L，七水合磷酸氢二钠12.8g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钠0.5g/L。

9.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9技术的氨糖合酶产生菌在发酵罐上的发酵应用，其特征在于，将所述氨糖合酶产生菌接种至含有Kan抗生素的M9罐上培养基中发酵培养，转速为400-600rpm，发酵培养12h后，开始流加300g/L的葡萄糖，选取流加的葡萄糖的补糖速率为20-40mL/h，补料体积为500mL，通气量为1vvm-1.16vvm，使用50％氨水维持pH稳定在7.0。

10.根据权利要求6或权利要求9所述的发酵应用，其特征在于，所述Kan抗生素的浓度为50mg/L。