CN105368761B - 一种高效产透明质酸的重组菌的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效产透明质酸的重组菌的构建方法。该方法是将SEQ ID No.2中自N端起第1‑972位氨基酸所示的PmHasA蛋白的编码基因和SEQ ID No.4中自N端起第1‑390位氨基酸所示的PmHasB蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中得到的。通过实验证明，在普通三角瓶中，一次转化能获得2g/L的透明质酸。诱导后菌体可以反复利用，进行多次的转化，HA的总产量可达4‑5g/L。

Description

一种高效产透明质酸的重组菌的构建方法

技术领域

本发明涉及微生物的基因工程技术领域，具体涉及一种高效产透明质酸的重组菌的构建方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)是一种酸性的粘多糖，最早由美国哥伦比亚大学教授Meyer从牛眼睛玻璃体中分离得到。透明质酸是由等摩尔D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，分子量在10⁴～10⁷Da之间，是胞外基质的重要组成部分。透明质酸是线性大分子，在水溶液中形成的网状结构赋予其溶液独特的流变学特性和依数性，因此被广泛应用于医药、化妆品和食品等多个领域。

目前报道的HA的生产方法有以下3种：天然产物提取法、化学合成法和微生物发酵法。其中，天然产物提取法是从动物的组织中直接提取HA；化学合成法是通过化学合成的方法合成“玻璃酸氧氮杂环戊烯衍生物”，然后在降解酶的作用下制备出HA衍生物和酶的复合体，最后清除酶，获得HA；微生物发酵法是经过微生物进行发酵培养，从发酵液中分离纯化得到HA。目前，工业生产的HA主要通过天然产物提取法和微生物发酵法获得。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种高效产透明质酸的重组菌pBPAB/BW25113的构建方法。

上述方法中，所述的重组菌是将PmHasA蛋白的编码基因和PmHasB蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中得到的。

上述方法中，所述的PmHasA蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2中自N端起第1-972位氨基酸所示的PmHasA蛋白序列的相似性超过97％；所述的PmHasB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示的PmHasB蛋白序列的相似性超过97％。

上述方法中，所述SEQ ID No.2中自N端起第1-972位氨基酸所示的PmHasA蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示的PmHasB蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

上述方法中，所述的PmHasA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第1-972位氨基酸所示；所述的PmHasB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示。

上述所述的宿主大肠杆菌为E.coli BW25113。

上述所述的编码基因是通过如下方式导入的：将编码基因插入载体pBAD-HisB的多克隆位点得到重组载体；将重组载体导入宿主菌中。

起始载体pBAD-HisB含有pBR322的复制起始位点、氨苄抗性基因、AraC基因(L-阿拉伯糖调节基因)、araBAD启动子和rrnB转录终止子，公众可从Invitrogen公司购买获得，产品目录号：V430-01。

宿主菌E.coli BW25113，基因型：F^-，Δ(araD-araB)567，ΔlacZ4787(::rrnB-3)，λ^-，rph-1，Δ(rhaD-rhaB)568，hsdR514。E.coli BW25113在葡萄糖耗尽，阿拉伯糖存在的情况下，会启动araBAD启动子下游基因的表达。公众可从北京碧橙蓝生物科技有限责任公司获得，产品目录号为OEC5042。

上述所述的重组菌pBPAB/BW25113在制备透明质酸中的应用也是本发明的一个目的。

本发明另一个目的是提供一种制备透明质酸的方法。

上述所述的透明质酸的制备方法包括如下步骤：诱导上述所述的重组菌pBPAB/BW25113表达所述PmHasA蛋白和PmHasB蛋白，得到诱导后的重组菌；将诱导后的重组菌加入转化液中，进行生物转化，得到透明质酸。

上述方法中，所述转化液的底物为葡萄糖和N-乙酰葡萄糖胺。

本发明最后一个目的是提供一种重组菌pRXPB/BL21(DE3)。

上述所述的重组菌是将SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示的蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中得到的。

上述所述的SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示的蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述宿主大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

上述所述的编码基因是通过如下方式导入的：将编码基因插入载体6HisT-pRSET的多克隆位点得到重组载体；将重组载体导入宿主菌中。

起始载体6HisT-pRSET含有pBR322的复制起始位点、氨苄抗性基因、T7启动子和T7转录终止子。此载体的构建方法见文献：“TAO,Y.,Guermah,M.,Martinez,E.,T.,Hasegawa,S.,Takada,R.,Yamamoto,T.,Horikoshi,M.and Roeder,R.G.(1997)Specific Interactions and Potential Functions of HumanTAFII100.Journal of Biological Chemistry270:23984-23987.”，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

宿主菌E.coli BL21(DE3)，基因型：F^-，ompT，hsdSB(rB^-mB^-)，gal dcm(DE3)，缺失了lon和ompT蛋白酶，含有T7RNA聚合酶基因，在lacUV5启动子控制之下，当有IPTG(乳糖)诱导时，T7RNA聚合酶基因表达，可以启动T7启动子下游基因的表达。公众可从北京全世金生物技术有限公司购买获得，产品目录号：CD601。

上述所述的重组菌pRXPB/BL21(DE3)在制备酶活性提高的UDP-葡萄糖脱氢酶中的应用也是本发明的一个目的。

上述所述的UDP-葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4中自N端起第1-390位所示。

本发明第一次对在大肠杆菌BL21中表达的多杀巴氏杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶进行了酶学性质的初步研究。首次使用多杀巴氏杆菌的透明质酸合成酶基因PmhasA和UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB在大肠杆菌BW25113中共表达合成透明质酸。

本发明一方面提供了高效产透明质酸大肠杆菌工程菌pBPAB/BW25113；另一方面提供了多杀性巴氏杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶高效表达菌株pRXPB/BL21(DE3)，并对UDP-葡萄糖脱氢酶的酶学性质进行了初步研究。

本发明与现有的HA发酵技术相比存在以下优点：

(1)本发明所构建的工程菌pBPAB/BW25113在普通三角瓶中进行一次生物转化能获得1-2g/L的透明质酸，比毛自朝等人构建的大肠杆菌工程菌在普通三角瓶中的HA产量(0.5-0.6g/L)高了3倍。

(2)HA生物的转化过程可以分为2个阶段，将蛋白诱导过程和生物转化过程分开，可以减少代谢产物对细胞生长的抑制，实现工程菌的高密度培养，为下游的生物转化节约成本。1、蛋白表达过程：pBPAB采用的是诱导型启动子，可以调控透明质酸合成酶基因PmhasA和UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB的表达，从而降低其代谢产物对菌体生长的影响，可以在发酵罐中实现工程菌的高密度培养；2、生物转化过程，简化了转化液的组分，降低了生产成本，诱导表达后的pBPAB/BW25113菌株能进行多次生物转化，总产量可达到4-5g/L，提高了菌株的利用率和HA的总产量。

本发明提供了一种高效产透明质酸的重组菌的构建方法。该方法是将SEQ IDNo.2中自N端起第1-972位氨基酸所示的PmHasA蛋白的编码基因和SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示的PmHasB蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中得到的。本发明通过实验证明，在普通三角瓶中，一次转化能获得2g/L的透明质酸。诱导后菌体可以反复利用，进行多次的转化，HA的总产量可达4-5g/L。

附图说明

图1为表达载体pRXPB的载体图。

图2为表达载体pRXPB在大肠杆菌BL21(DE3)中表达纯化的SDS-PAGE图。M：蛋白标准品；1：未诱导的pRXPB/BL21(DE3)；2：乳糖诱导的pRXPB/BL21(DE3)；3：纯化后的PmHasB蛋白。

图3为多杀性巴氏杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶PmHasB的酶学性质。A：PmHasB的最适反应pH；B：PmHasB的pH稳定性；C：PmHasB的最适反应温度；D：PmHasB的热稳定性。

图4为共表达载体pBPAB的载体图。

图5为共表达载体pBPAB在大肠杆菌BW25113中表达的SDS-PAGE图。1：未诱导的pBPAB/BW25113；2：阿拉伯糖诱导的pBPAB/BW25113；M：蛋白标准品(从上往下分别是：200，150，120，100，85，70，60，50，40，30，25kDa)。

图6为三角瓶中生物转化过程中HA积累的过程和葡萄糖变化趋势图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为国产分析纯试剂。

限制性内切酶购于New England Biolabs(NEB)公司；PCR产物纯化试剂盒购于Omega Bio-Tek公司，货号：D6492-01；T4DNA连接酶购于Takara公司，货号：2011A。

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)，保藏于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号：CVCC408。公众可从中国兽医微生物菌种保藏管理中心购买获得。

实施例1、多杀性巴氏杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶高效表达载体pRXPB的构建及表达

一、UDP-葡萄糖脱氢酶高效表达载体pRXPB及重组菌的构建

1、引物的设计：根据多杀巴氏杆菌菌株的基因组序列，设计UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB上下游引物。引物序列如下：PmhasB-F：5’-CGGGATCCAAGGAGATATACATATGAAGAAAATTACAATTGCTGGGG-3’，序列包含起始密码子ATG、RNA聚合酶结合位点(RBS位点)、BamHⅠ位点和NdeⅠ位点(序列表中序列7)；PmhasB-R：5’-CGAGCTCTTAAGCATCACCGCCAAAAATATCTC-3’，序列包含SacⅠ位点和终止密码子TAA(序列表中序列8)。

2、目的基因的扩增：以多杀性巴氏杆菌CVCC408的基因组DNA为模版，采用上述引物PCR扩增PmhasB。扩增条件：95℃预变性2min；每个循环95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后延伸5min。

3、表达载体pRXPB的构建：PmhasB的扩增产物和表达载体6HisT-pRSET经NdeⅠ和SacⅠ双酶切后，使用PCR产物纯化试剂盒回收DNA片段。采用T4DNA连接酶将上述2个片段连接，16℃过夜，转化到大肠杆菌DH5α中，并涂布于氨苄平板(100μg/mL)。挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，挑选阳性克隆提质粒，送上海生工进行测序鉴定。鉴定正确的命名为pRXPB(重组载体见图1所示)。测序表明：插入表达载体6HisT-pRSET的外源基因的序列如SEQ IDNo.3所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第1-390位氨基酸所示。

4、pRXPB/BL21(DE3)的菌液的获得：从大肠杆菌BL21(DE3)平板上挑选单克隆接种到5ml的LB培养基中，在37℃、200rpm的条件下，培养至OD₆₀₀值为0.3-0.4之间，冰上放置10min，然后4000rpm离心10min，弃上清，菌体用预冷的氯化钙溶液(0.1mol/L CaCl₂)洗涤，4000rpm离心10min，菌体悬浮于200μl的氯化钙溶液中，获得感受态细胞。将测序鉴定正确的质粒pRXPB加入到上述感受态细胞中，冰浴30min，于42℃热休克90s，加入500μl的LB培养基，在37℃，200rpm条件下培养1h，取50μl涂布在氨苄平板上，37℃培养过夜。挑选单克隆，接种到5ml的LB培养基中，培养过夜，所得为pRXPB/BL21(DE3)的菌液。

5、菌种的保藏：500μl的pRXPB/BL21(DE3)菌液与30g/mL的无菌甘油等体积混匀，保存在-70℃冰箱。

二、蛋白的表达和酶活测定

(一)UDP-葡萄糖脱氢酶PmHasB的表达

1、pRXPB/BL21(DE3)的表达：1mL过夜培养的pRXPB/BL21(DE3)菌液接种到100mL(含100mg/L的氨苄青霉素钠)的ZYM自诱导培养基，在37℃，230rpm条件下培养16h，测定OD₆₀₀的值，用SDS-PAGE蛋白电泳检测PmHasB的表达情况(见图2)。菌液4500rpm离心收集菌体。

ZYM自诱导培养基成分：10g/L蛋白胨(购于OXOID公司，货号：LP0042)、5g/L酵母提取物(购于OXOID公司，货号：LP0021)、5g/L甘油、0.5g/L葡萄糖、25mmol/L磷酸氢二钠、50mmol/L氯化铵、25mmol/L磷酸二氢钾、5mmol/L硫酸钠、2mmol/L的硫酸镁、50mmol/L氯化亚铁、0.02mmol/L氯化钙、0.01mmol/L氯化镁、0.01mmol/L硫酸锌、0.002mmol/L氯化钴、0.002mmol/L氯化铜、0.002mmol/L氯化镍、0.002mmol/L钼酸钠、0.002mmol/L亚硒酸钠、0.002mmol/L硼酸和0.06mmol/L盐酸。ZYM自诱导培养基中需要加入终浓度为20g/L的乳糖作为诱导物。

2、UDP-葡萄糖脱氢酶PmHasB的纯化：将上述菌体重悬到50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，经超声波破碎后，在4℃、10000r/min的条件下离心30min，收集上清。上清经0.22μm的滤膜过滤后通过AKTA FPLC，用1mL HisTrap TM HP柱(购于GE公司，货号：17-5247-01)纯化。1mL/min流速上样，含40mM咪唑的Tris-HCl(pH8.0)洗脱杂蛋白，含250mM咪唑的Tris-HCl(pH8.0)洗脱目的蛋白。将目的蛋白于50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，4℃透析过夜。SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度(见图2)。

(二)UDP-葡萄糖脱氢酶PmHasB的酶活测定及酶学性质研究

1、UDP-葡萄糖脱氢酶PmHasB的酶活测定：UDP-葡萄糖脱氢酶的测活体系：100mMTris-HCl(或者Gly-NaOH缓冲液)、5mM DTT(购于Amresco公司，货号：0281)、10mM MgCl₂、2mM UDP-glucose(购于Sigma公司，货号：U4625)和1.5mM NAD(购于Amresco公司，货号：0455)以及一定量的纯化后的酶液，在340nm处测光吸收OD值变化量。

酶活定义：在一定的温度和pH条件下，以每分钟催化1μmol NAD的还原所需酶量定义为1个酶活力单位(μmol/min)。根据朗波尔定律ΔΑ＝εCL(ΔΑ为酶促反应初期1min吸光度的增加值；ε为NADH在340nm的摩尔吸光系数，本实验ε取NADH微摩尔消光系数为6.22×10^-3μM^-1cm^-1；比色杯为1cm)和酶活定义，获得酶比活力的计算公式：酶比活力(IU/mg)＝1×ΔΑ×V_总/(c×ε×V_酶)，其中V_总和V_酶分别表示测活体系的总体积和酶液的体积，c为蛋白浓度。采用Bradford法(试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：SK3041)测蛋白含量，牛血清蛋白BSA为标准蛋白。室温下，测定在pH为10、温度为25℃的条件下，PmHasB粗酶液的比活力是0.50IU/mg。

2、UDP-葡萄糖脱氢酶PmHasB酶学性质的研究

2.1、pH对PmHasB的影响以及PmHasB的pH稳定性

(1)pH对PmHasB酶活力的影响：在室温下分别于pH7.0～11.0缓冲体系中测定PmHasB的酶活力(图3-A)。

(2)PmHasB的pH稳定性：PmHasB分别在pH3.0～11.0缓冲体系中，室温下放置3h，然后测定不同缓冲体系中剩余酶活力(图3-B)。

结果表明，室温下PmHasB反应的最适pH是pH＝10的Gly-NaOH缓冲液；在pH6-10条件下放置3h后，PmHasB的剩余酶活力维持在70％以上(其中pH3.0～6.0为0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH6.0～9.0为0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液；pH9.0～11.0为0.1mol/L的Gly-NaOH缓冲液)。

2.2、温度对PmHasB的影响以及PmHasB的热稳定性

(1)温度对PmHasB酶活力的影响：在pH＝10的Gly-NaOH缓冲液中，分别于16、25、30、37、45和55℃下测定PmHasB的酶活力(图3-C)。

(2)PmHasB的热稳定性：将PmHasB在25℃、30℃、37℃、45℃和55℃下放置9h，分别取1、3、5、7和9h的酶液测定剩余酶活力(图3-D)。

结果表明，在室温下，pH＝10的Gly-NaOH缓冲液中，PmHasB粗酶液的比活力是0.50IU/mg；在37℃下，pH＝10的Gly-NaOH缓冲液中，纯化后的PmHasB的比活力最高，达到了9.02IU/mg；在37℃以下放置9h，PmHasB剩余酶活力维持在70％以上。

综上所述，PmHasB粗酶液和纯酶液的比活力分别达到了0.50IU/mg和9.02IU/mg，pH在6-10范围内，37℃以下时稳定性较好。由于HasB是透明质酸合成中的关键酶，所以HasB的酶活力和稳定性对重组菌株合成透明质酸有着重要的意义。

实施例2、含多杀性巴氏杆菌的透明质酸合成酶基因PmhasA和UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB的共表达载体pBPAB的构建、表达和PmHasB的比活力的测定

一、含多杀巴氏杆菌的透明质酸合成酶基因PmhasA和UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB的共表达载体pBPAB的构建

1、引物的设计：设计透明质酸合成酶基因PmhasA上下游引物，PmhasA引物序列如下：PmhasA-F：5’-CATGCCATGGGCATGAATACATTATCACAAGCAAT-3’，序列包含NcoⅠ位点和起始密码子ATG(序列表中序列5)；PmhasA-R：5’-CGGGATCCTTATAGAGTTATACTATTAATAATGAACTTG-3’，序列包含BamHⅠ位点和终止密码子TAA(序列表中序列6)；设计UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB上下游引物，PmhasB引物序列如下：PmhasB-F：5’-CGGGATCCAAGGAGATATACATATGAAGAAAATTACAATTGCTGGGG-3’(序列表中序列7)，含BamHⅠ位点，RNA聚合酶结合位点(RBS位点)，NdeⅠ位点和起始密码子ATG；PmhasB-R：5’-CGAGCTCTTAAGCATCACCGCCAAAAATATCTC-3’(序列表中序列8)，含SacⅠ位点和终止密码子TAA。

2、目的基因的扩增：以多杀巴氏杆菌CVCC408的基因组DNA为模版，PCR扩增PmhasA和PmhasB基因。各自的PCR反应条件如下：PmhasA：95℃预变性2min，然后每个循环95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环，最后延伸5min；PmhasB：95℃预变性2min，然后每个循环95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸5min。

3、含PmhasA和PmhasB基因的共表达载体pBPAB的构建：用NcoⅠ和BamHⅠ对透明质酸合成酶基因PmhasA的扩增产物进行双酶切，用BamHⅠ和SacⅠ对UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB的扩增产物进行双酶切，用NcoⅠ和SacⅠ对载体pBAD-HisB进行双酶切。使用PCR产物纯化试剂盒回收DNA片段。采用T4连接酶将上述3个片段连接，16℃过夜。转化到大肠杆菌DH5α中，涂布于氨苄平板(100μg/mL)。挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定(上游引物为PmhasA-F和下游引物为PmhasB-R)，挑选阳性克隆(PCR片段在4000-5000bp)提质粒，送上海生工进行测序鉴定。重组载体记作pBPAB，其结构如图4所示。

测序表明，插入载体pBAD-HisB的PmhasA基因的序列如SEQ ID No.1所示，插入载体pBAD-HisB的PmhasB的序列如SEQ ID No.3所示，表达的PmHasA蛋白的氨基酸序列如SEQID No.2中第1-972位氨基酸所示，表达的PmHasB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4中第1-390位氨基酸所示。

二、重组菌的构建

pBPAB/BW25113的菌液的获得：从大肠杆菌BW25113平板上挑选单克隆接种到5ml的LB培养基中，在37℃，200rpm的条件下培养至OD₆₀₀为0.3-0.4之间，冰上放置10min，然后4000rpm离心10min，弃上清，菌体用预冷的氯化钙溶液(0.1mol/L CaCl₂)洗涤，4000rpm离心10min，菌体悬浮于200μl的氯化钙溶液中。将测序鉴定正确的质粒pBPAB加入到上述感受态细胞中，冰浴30min，于42℃热休克90s，加入500μl的LB培养基，在37℃，200rpm条件下培养1h，取50μl涂布在氨苄平板上，37℃培养过夜。挑选单克隆，接种到5ml的LB培养基中，培养过夜，所得为pBPAB/BW25113的菌液。

菌种保藏：500μl的上述菌液与30g/mL的无菌甘油等体积混匀，保存在-70℃冰箱。

三、诱导PmhasA和PmhasB蛋白表达

透明质酸合成酶基因PmhasA和UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB在大肠杆菌BW25113中的表达：取1mL pBPAB/BW25113的菌液接种到100mL(含100mg/L的氨苄青霉素钠)的ZYM自诱导培养基(培养基中加入终浓度2g/L的阿拉伯糖)，在37℃，230rpm条件下培养10-13h，测定OD₆₀₀的值，用SDS-PAGE蛋白电泳检测PmhasA和PmhasB的表达情况(图5)。所得菌液用4500rpm离心收集菌体，用于透明质酸的生物转化。

ZYM自诱导培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L甘油、0.5g/L葡萄糖、25mmol/L磷酸氢二钠、50mmol/L氯化铵、25mmol/L磷酸二氢钾、5mmol/L硫酸钠、2mmol/L的硫酸镁、50mmol/L氯化亚铁、0.02mmol/L氯化钙、0.01mmol/L氯化镁、0.01mmol/L硫酸锌、0.002mmol/L氯化钴、0.002mmol/L氯化铜、0.002mmol/L氯化镍、0.002mmol/L钼酸钠、0.002mmol/L亚硒酸钠、0.002mmol/L硼酸和0.06mmol/L盐酸。ZYM自诱导培养基中需要加入终浓度2g/L阿拉伯糖为诱导物。

四、PmHasB的比活力的测定

取少量菌体破碎，测定破碎上清的中的PmHasB的比活力，PmHasB活力和蛋白浓度的测定方法以及酶活定义见实施例1。结果表明：在25℃下，pH＝10时，上清中PmHasB的比活力为0.15IU/mg，而不含pBPAB质粒的BW25113几乎检测不到UDP-葡萄糖脱氢酶的酶活。

五、透明质酸的生物转化及含量测定

(一)透明质酸的生物转化

1、转化液的制备：MgSO₄、MnCl₂、(NH₄)₂SO₄、甘油、葡萄糖和N-乙酰葡萄糖胺用50mMK₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液溶解，使MgSO₄的浓度为4mM，MnCl₂的浓度为2mM，(NH₄)₂SO₄的浓度为0.5％(质量百分含量)，使甘油的浓度为2％(质量百分含量)，葡萄糖的浓度为5％(质量百分含量)，使N-乙酰葡萄糖胺的浓度为75mM，pH值＝7.0。

2、一次转化：将诱导后的pBPAB/BW25113菌体加入到25mL转化液使其OD₆₀₀值达到20，然后置于250mL的三角瓶中，在32.5℃，230rpm的条件下转化12h。转化液用4500rpm离心分别收集上清和菌体，其中上清为HA溶液，菌体用于多次转化。

3、多次转化：转化后的菌体可重复一次转化的步骤，进行多次转化，可连续进行2-3次转化。

4、透明质酸的提取：

(1)取上述HA溶液2mL，加入终浓度0.05％的十二烷基磺酸钠(SDS)(购于Amresco公司，货号：M107)，混匀，室温下放置10min。

(2)在4℃，9500rpm条件下离心10min，收集上清。上清中加入200μL的20％十六烷基溴化乙胺(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide，CTAB)(购于Amresco公司，货号：0833)和4mL无水乙醇，混匀，室温放置10min。

(3)在4℃，9500rpm条件下离心10min，收集沉淀，用2mL NaCl溶液(1M)悬浮沉淀，42℃溶解HA约2h。

(4)在4℃，9500rpm条件下离心，收集上清，加入5mL的无水乙醇，混匀，放置5min，9500rpm离心，收集沉淀。沉淀用70％的乙醇洗涤，9500rpm离心10min，收集沉淀。室温下放置10-20min，使乙醇挥发。

(5)沉淀重溶于0.1M NaCl溶液中用于HA含量的测定。

(二)透明质酸的含量的测定

1、常规的分析方法参考Ferrante等人的CTAB浊度法(Ferrante ND.Turbidimetric measurement of acid mucopolysaccharides and hyaluronidaseactivity.J Biol Chem,1956,220:303-306.)。具体步骤如下：取150μL不同浓度的HA样品和350μL的NaAc缓冲液(0.2M NaAc，0.15M NaCl，pH6.0)混匀，37℃放置15-20min。加入1mL的CTAB溶液(2.5g/L CTAB，2％NaOH，用0.22μm滤膜过滤)，室温放置5min。取200μL置于96空孔板上，在酶标仪测定OD₄₀₀的吸光值。使用Sigma公司的透明质酸标准品(Hyaluronic acidsodium salt from Streptococcus equi，货号53747-1G)绘制的HA浓度标准曲线。

2、透明质酸定量检测试剂盒测定HA的含量(化学发光法，购于北京北方生物技术研究所)。试剂盒采用竞争免疫分析法分析样品中HA的含量。首先将HA包被于固相载体表面，在微孔板各孔分别加入待测样品和酶结合物(透明质酸结合蛋白)后，经过一定时间的振荡反应后即形成固相抗原-酶结合物的复合物。充分洗涤后加入化学放光底物液，其发光强度与HA浓度成反比。测定每孔发光值。以Log(X)-Logit(Y)方法进行线性拟合，计算样品中HA的含量。分析结果见表1所示，表1中数据为3次测量的平均值±标准误差。

表1透明质酸

采用CTAB法对HA生物转化过程中HA积累的过程进行分析(图6所示)，同时对转化液中葡萄糖的含量进行了检测(图6所示)。HA生物转化条件如下：菌体密度：OD₆₀₀＝20；250mL三角瓶；25mL的转化液；转速：230rpm；培养温度：32.5℃；培养时间24h；转化过程中每隔3小时用氨水将pH调至7.0。HA产量在转化开始后16h达到最大值，产量为2.28g/L，此时葡萄糖的利用率只有50％。

(三)菌体密度对HA产量的影响

考虑到转化液中，菌体密度对HA产量的影响，分别采用不同菌体密度对HA进行生物转化。转化条件如下：菌体密度：OD₆₀₀＝10，20，30；250mL三角瓶；25mL的转化液；转速：230rpm；培养温度：32.5℃；培养时间12h；转化过程中每隔3小时用氨水将pH调至7.0。转化结果见表2所示：

表2菌体密度对HA产量的影响

结果表明，HA的产量随着菌体密度的增加而增大，这意味着在诱导蛋白表达的过程中实现菌体的高密度发酵将有助于后面生物转化过程中HA产量的提高。

Claims (8)

1.一种重组菌，是将PmHasA蛋白的编码基因和PmHasB蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中得到的；

所述的PmHasA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第1-972位氨基酸所示；所述的PmHasB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述SEQ ID No.2中自N端起第1-972位氨基酸所示的PmHasA蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示的PmHasB蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述宿主大肠杆菌为E.coliBW25113。

4.权利要求1-3任一所述的重组菌在制备透明质酸中的应用。

5.一种制备透明质酸的方法，包括如下步骤：诱导权利要求1-3任一所述重组菌表达所述PmHasA蛋白和PmHasB蛋白，得到诱导后的重组菌；将诱导后的重组菌加入转化液中，进行生物转化，得到透明质酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述转化液中的底物为葡萄糖和N-乙酰葡萄糖胺。

7.一种重组菌，是将SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示的PmHasB蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中得到的；所述SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示的PmHasB蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述宿主大肠杆菌为E.coliBL21（DE3）。

8.权利要求7所述的重组菌在制备酶活性提高的UDP-葡萄糖脱氢酶中的应用；UDP-葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4中自N端起第1-390位所示。