CN117004670B - 一种磺基转移酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域和肝素生物合成领域，具体涉及一种磺基转移酶及其应用。本发明挖掘得到磺基转移酶S4来源于鸟类，属于首次报道，并实现了在大肠杆菌中的表达和纯化。经验证具有活性，可用于后续改造提高活性。因此，本发明具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域和肝素生物合成领域，具体涉及一种磺基转移酶及其应用。
背景技术
肝素(Heparin)属于一类高度硫酸化的糖胺聚糖，具有独特的生理功能。肝素作为一种抗凝血和抗血栓药物，大量应用于手术处理和抗静脉血栓形成等临床实践中。另外肝素还具有抗平滑肌增生、抗炎、抗肿瘤以及抗自由基等作用。其结构复杂，具有生物活性多样等特点，成为近年来多糖类药物研究的热点。目前市场上的肝素获得主要依赖动物组织提取，主要是猪小肠黏膜，但是随着市场需求量的增加，动物组织提取无法满足需求。化学酶法合成肝素因为安全有效，成为新的肝素来源。
肝素的合成以葡萄糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）二糖重复单元组成的线性多糖骨架，随后，六种肝素修饰酶对其进行一系列的修饰。多糖骨架在氨基葡萄糖N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶（NDST）的作用下将GlcNAc转化为N-硫磺基葡萄糖（GlcNS）。然后C5异构化酶（C5 epimerase）将GlcUA转化为艾杜糖醛酸（IdoUA），得到的多糖在2-O-硫酸基转移酶（2-OST）的作用下将2-O-硫酸基（2-O-sulfo group）引入到IdoUA/GlcUA，在6-O-硫酸基转移酶（6-OST）的作用下将6-O-硫酸基（6-O-sulfo group）引入到GlcN，在3-O-硫酸基转移酶（3-OST）的作用下将3-O-硫酸基（3-O-sulfo group）引入到GlcN，修饰后的肝素具有抗凝血活性。
磺基转移酶（sulfotransferase，ST，EC 2.8.2.-）是指催化磺基基团从PAPS上转移给各种受体分子，同时生成3'-磷酸腺苷-5'-磷酸（PAP）的一类酶。磺基转移酶存在于大多数生物组织中，可介导不同类别受体硫酸化，以实现各种生物功能，包括解毒、细胞信号转导和受体结合的调节等 。在微生物-酶法合成肝素途径中，芳基磺基转移酶IV ( Arylsulfotransferase, ASTIV, EC 2.8.2.1) 可以使用廉价的对硝基苯酚磺酸盐（PNPS）和催化量的PAP合成PAPS，这是目前肝素合成研究中常用的PAPS再生方法，该方法可以在反应体系中消除PAP对硫酸转移酶抑制的同时促进PAPS再生（图1）。目前ASTIV受体特异性和抑制机制等方面已取得一定研究进展，其表达元件数量稀少，主要来源于鼠源和人源，且表达量较低，因此挖掘新型芳基磺基转移酶，为PAPS再生系统提供新元件，对构建高效低成本的酶法合成肝素工艺具有重要意义。
例如，US20230151339A1（公开日2023年5月18日）公开一种工程化的芳基硫酸盐依赖性酶，CN114763518A（公开日2022年7月19日）公开一种发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用。但是现有技术中PAPS系统的芳基磺基转移酶来源单一、表达量较低，酶活较低，造成PAPS系统成本高，无法实现微生物-酶法合成肝素。
在微生物-酶法生产肝素中，3'-磷酸腺苷-5'磷酸硫酸（3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate，PAPS）高效合成/再生系统是该方法能否实现的关键，磺基转移酶（sulfotransferase，ST，EC 2.8.2.-）是该系统中的关键酶之一，催化磺基基团从PAPS上转移给各种受体分子，同时生成3'-磷酸腺苷-5'-磷酸（PAP）的一类酶。现有酶的表达量和活力不高，挖掘新的芳基磺基转移酶，为PAPS再生系统提供新元件，对构建高效低成本的微生物-酶法合成肝素工艺具有重要意义。
发明内容
本发明基于上述需求，从鸟类中首次挖掘得到磺基转移酶S4，并实现了在大肠杆菌中的表达和纯化，由此完成本发明。
本发明提供一种磺基转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明进而提供所述的磺基转移酶的编码核酸。
进而本发明提供所述的编码核酸的表达载体。优选地，其是原核表达载体。
进一步本发明提供含有所述的编码核酸或所述的表达载体的重组宿主细胞。具体地，其是原核细胞，更具体是大肠杆菌。
本发明因而提供一种制备所述的磺基转移酶的方法，其是培养所述的重组宿主细胞以产生所述磺基转移酶，任选还包括收集或纯化所述磺基转移酶的步骤。
本发明还提供一种制备肝素的方法，其以PNPS和PAP为底物，以所述的磺基转移酶作为催化剂进行催化反应，得到PAPS。
具体地，以200 μL反应体系计，含有3 mmol/L PNPS，3 mmol/L PAP，50 mmol/L pH=7.0的Tris-HC l，加所述的磺基转移酶400 μg，加蒸馏水至200 μL；优选地，反应的温度为35-45℃，优选为40℃。
本发明最后提供所述的磺基转移酶在制备肝素中的应用。
本发明挖掘得到磺基转移酶S4来源于鸟类，属于首次报道，并实现了在大肠杆菌中的表达和纯化。经验证具有活性，可用于后续改造提高活性提供了基础，具有潜在的应用价值。
附图说明
图1、PAPS再生系统。
图2、S4蛋白表达SDS-PAGE图。其中，1：细胞破碎上清；2：细胞破碎沉淀。
图3、S4纯化前后SDS-PAGE。其中，1：纯化前；2：纯化后。
图4、S4的液相图。
图5、S4的质谱图。
图6、PNPS标准品的液相图。
图7、PNPS标准品的质谱图。
具体实施方式
结合实施例，进一步阐述本发明。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品，相关处理为常规操作。但下述实施例仅是示例，并不构成本发明的限制。
实施例1、磺基转移酶S4的表达
利用本体blast程序分析建立磺基转移酶基因容量数据库，作为目标物种蛋白质数据库，使用HMMER命令行工具训练多序列比对结果，构建隐马尔可夫数据集，使用HMM数据集体扫描目标物种蛋白质数据库，挖掘磺基转移酶基因家族未报道与未注释的新基因，获得磺基转移酶新基因S4（氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示）。
利用隐马尔可夫模型挖掘获得磺基转移酶新基因S4，基因序列根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化（优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示），并构建到表达载体pET32a的多克隆位点BamH I和Xhol I之间，在N端添加麦芽糖结合蛋白Mbp。
过夜培养DH5α/pET32a-Mbp-S4菌株，提取质粒pET32a-Mbp-S4，化学热激法转化到E. coli BL21 TrxB（DE3）菌株中。涂布于LB固体平板（氨苄霉素和卡那霉素抗性），培养12h后挑取单克隆进行菌落PCR验证并测序。
挑取测序正确的BL21 / pET32a -Mbp-S4单菌落于2 mL TB液体培养基中，添加100 μg/mL氨苄霉素和50 μg/mL卡那霉素，37℃，220 rpm过夜培养。按照1%接种量转接到含有相同抗性的20ml TB培养基（100 mL三角瓶）培养，测定OD600=0.6~0.8时，摇床降温到16℃，加入0.4 mmol/L IPTG（终浓度），诱导培养20 h。培养结束后，取1ml发酵液于5500 rpm，4℃条件下离心10 min，收集菌体，加入500 μL磷酸盐缓冲液重悬菌体，放置在冰上，使用超声破碎仪破碎（功率300 W，工作5s，停止3s，工作10 min），低温高速离心10 min，分离并收集破碎上清液体和不溶物，对样品进行SDS-PAGE胶图分析。
实施例2、磺基转移酶S4的纯化
培养结束后，取培养液于5500 rpm，4℃离心10min收集菌体，用缓冲液CM洗菌（Tris-HCl pH 7.4 ，20 mmol/L NaCl， 200 mmol/L EDTA ，1 mmol/L DTT），并重悬至OD=20。高压匀质破碎菌体。10000 rpm，4℃离心20 min，上清过0.45μmol/L滤膜后进行纯化。
利用淀粉树脂凝胶柱纯化目的蛋白，样品加入纯化柱后4℃旋转吸附1h。收集流穿液，用100 ml缓冲液CM洗脱杂蛋白，然后用3ml含有10 mmol/L麦芽糖的CM缓冲液洗脱目的蛋白（图2）。蛋白纯化结果用SDS-PAGE进行分析（图3）。
实施例3、磺基转移酶S4的酶学性质表征
（1）酶活检测
将20μg S4加入到含有50 μmol/L的PNPS、50 μmol/L的PAP的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）中，用蒸馏水补齐至总体系为200 μL。使用酶标仪每间隔1 min测定400nm吸光值，利用标准曲线计算 PNP 浓度，以不添加酶的体系作为对照。
酶活力定义为：测定条件下，每分钟催化生成1μmol PNP所需要的酶量为1个酶活单位。
在重组蛋白S4的最适反应条件，即40℃，pH=7.0的缓冲体系下，测定S4纯酶的比酶活为3.3mU/mg，总酶活为13.2U/L是粗酶液的4.73倍。测定的酶活力大小如表1。
表1 磺基转移酶S4活性测定
（2）酶反应产物分析
酶修饰：取400 μg纯酶加入到含有3 mmol/L PAPS，3 mmol/L PNP，50 mmol/LTris-HC l（pH=7.0）的体系中，用蒸馏水补齐200 μL；在最适反应条件下，反应10 h；
终止反应：将上一步中反应体系置于100℃金属浴中10 min后冷却至室温；
检测：负电喷雾电离（ESI）模式下，使用超高效液相色谱（UPLC）系统（Nexera30A, Shimadzu, Kyoto, Japan）结合质谱（TripleTOF™5600,Applied Biosystem Sciex,usa）分析酶修饰产物。使用SeQuant ZIC-HILIC色谱柱（100 × 2.1 mm, 3.5 μm, Merck,Germany）进行LC鉴定，分别以10 mmol/L乙酸铵和100%乙腈为流动相A和B，流速设置为0.2mL/min，梯度为0-3 min，90% B；3-6 min，90-60% B；6-25min，60-50% B；25-30min，50% B；30-30.5 min，50-90% B；30.5-38 min，90% B。
测活反应体系以PNPS为磺基供体，生成PAPS，但是PAPS体外存在极不稳定，极易降解为PAP，由于芳基磺基转移酶参与该反应的催化作用是可逆的，其正向反应为催化磺基从PAPS转移到PNP上，并生成PNPS。使用UPLC– MS检测，在负电模式下，实验组在保留时间为0.688 min的液相峰（图4）m/z为215.98（图5），标准品在保留时间为0.68 min的液相峰（图6）m/z为215.98（图7），表明S4反应修饰后得到的产物为PNPS，进一步验证S4为芳基磺基转移酶。
Claims (6)
1.一种制备PAPS的方法，其特征在于，以PAP和PNPS为底物，以磺基转移酶作为催化剂进行催化反应，得到PAPS；所述磺基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以200 μL反应体系计，含有3 mmol/L PAP，3mmol/L PNPS，50 mmol/L pH=7.0的Tris-HC l，加所述的磺基转移酶400 μg，加蒸馏水至200 μL。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，催化反应的温度为35-45℃。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述的磺基转移酶通过基因工程方法获得。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的磺基转移酶是通过含有所述磺基转移酶的编码核酸的表达载体的重组宿主细胞表达获得。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组宿主细胞是大肠杆菌。
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