CN107356577A - 一种通用型磺基转移酶活性分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通用型磺基转移酶活性分析方法，该方法将3’‑磷酸腺苷‑5’‑磷酰硫酸(PAPS)、磺基转移酶及磺基转移酶特异性底物混合发生磺酸化反应，生成3’‑磷酸腺苷‑5’‑磷酸盐，IMPAD1酶能特异性水解3’‑磷酸腺苷‑5’‑磷酸盐释放磷酸根(Pi)，经由与Pi具有高结合能力的金属离子(Mn+)和特定荧光探针(FP)组成的混合体系对Pi进行荧光定量检测，即可实现磺基转移酶活性的定量分析。该体系中，Mn+与FP的结合将导致体系荧光被有效猝灭，而反应过程产生的Pi将有效掩蔽Mn+从而使FP的荧光信号恢复。因此，通过监测体系中荧光信号的变化情况，即可实现磺基转移酶活性的荧光增强式传感。该方法普遍适用于所有以PAPS为磺酸基团供体的磺基转移酶活性的检测。

Description

一种通用型磺基转移酶活性分析方法
技术领域
本发明属于生物活性分子/蛋白酶检测技术领域，具体涉及一种通过对磺酸化反应过程副产物3’-磷酸腺苷-5’-磷酸盐水解产生的磷酸根进行定量检测，从而实现磺基转移酶活性分析的荧光分析方法。
背景技术
细胞内蛋白等生物分子的磺酸化修饰过程是一种影响蛋白及各类小分子生物活性的极其重要的修饰机制。生物体内磺酸化过程的发生是在磺基转移酶催化作用下，磺酸基供体3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸上的磺酸基团被转移到底物分子上使底物磺酸化，该过程伴随着3’-磷酸腺苷-5’-磷酸盐副产物的产生。根据其细胞定位以及对直接底物的选择性，磺基转移酶可以分为3个主要的家族：细胞溶质磺基转移酶、碳水化合物磺基转移酶和酪氨酸蛋白磺基转移酶(TPST)。细胞溶质磺基转移酶，主要参与修饰类固醇和神经递质类分子，在药物解毒中发挥重要作用。碳水化合物磺基转移酶主要催化糖脂类、糖蛋白、蛋白聚糖等具有调节细胞交流功能的生物分子的磺酸化修饰，而多糖的磺酸化影响激素的药物动力学、生长因子和细胞因子活性以及病毒、细菌的入侵。TPST催化的蛋白质酪氨酸磺酸化更是在许多重要的生理过程中发挥着关键的调控作用。
鉴于磺基转移酶催化的磺酸化反应在细胞内多种重要生命过程中均发挥着至关重要的调控作用，其活性异常与多种疾病的发生密切相关，磺基转移酶也因而被视为对特定疾病进行药物干预的理想靶标。因此，快速、准确、灵敏地检测磺基转移酶的活性对于其生物功能研究、疾病诊断及靶向药物开发等方面均具有非常重要的意义。虽然磺酸化修饰的普遍性和重要价值逐渐得到人们的重视，在某些方面其重要性不亚于生物分子的磷酸化修饰调控，但对该领域的研究目前并不够深入。迄今为止调控蛋白磷酸化过程的蛋白激酶活性检测技术已经相当成熟，而在调控磺酸化过程的磺基转移酶活性检测方法方面的研究却相对匮乏。因此，建立快速灵敏，操作简单，通用性好的磺基转移酶活性分析方法，是相关研究领域的基础和关键。
目前，磺基转移酶活性分析主要依赖于放射性同位素标记技术，将磺酸基供体3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸进行35S标记，然后将HPLC及凝胶电泳等分离手段与放射性显影相结合进行磺基转移酶活性分析。但此方法有许多缺点：操作繁琐、耗时、存在放射性污染等，最重要的是通用性较差，如凝胶电泳适合TPST等以蛋白或多肽为专属底物的磺基转移酶活性分析，但不太适于多糖、小分子等底物磺酸化产物的分离检测。除放射性标记外，目前也有一些报道采用比色法和荧光法测定磺基转移酶活性，但这些方法仅限于底物在磺酸化前后吸收光谱或荧光性质有显著改变。且这些方法中，磺酸化反应过程中副产物3’-磷酸腺苷-5’-磷酸盐的逐渐累积增加会对磺基转移酶活性产生明显抑制作用，对磺基转移酶活性检测的准确度造成不可避免的影响。
因此，考虑到磺基转移酶分析对简单操作、实用性及通用性等方面的需求，理想的磺基转移酶活性检测方法应摆脱对放射性标记技术的依赖，且满足操作简单、适用范围广等特点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简单、通用性强、无需昂贵仪器即可灵敏分析磺基转移酶活性的非放射性荧光分析方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、将已知活性的磺基转移酶与3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸、磺基转移酶特异性底物混合进行磺酸化反应。
2、将步骤1中磺酸酸化反应后的溶液与IMPAD1酶混合，进行水解释放磷酸根的反应。
3、向步骤2中释放磷酸根后的溶液中加入能与磷酸根结合的金属离子，充分混合均匀，然后加入能被金属离子猝灭的荧光探针，检测体系的荧光强度，绘制荧光强度随磺基转移酶活性变化的标准曲线。
4、按照上述步骤1、2和3检测待测磺基转移酶样品对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测样品中磺基转移酶活性的定量分析。
上述步骤2中，所述的金属离子优选三价稀土离子、二价过渡金属离子或三价过渡金属离子，具体如La3+、Ce3+、Mn2+、Ga3+、Fe3+等。
上述的荧光探针为荧光素类、罗丹明类、香豆素类及其衍生物中的任意一种或无机荧光量子点，具体如：羧基四甲基罗丹明、3,3’-双(甲胺二乙酸)荧光素、四氯-6-羧基荧光素、CdS半导体量子点、CdSe半导体量子点、碳量子点等。
本发明的有益效果如下：
1、与传统磺基转移酶检测方法相比，本发明方法不再聚焦于对酶专属底物磺酸化前后性质的变化，而是基于底物磺酸化反应后磺酸基供体会生成3’-磷酸腺苷-5’-磷酸盐进而可水解产生磷酸根这一原理，利用金属离子/荧光探针荧光猝灭体系对磷酸根的选择性荧光响应，实现磺基转移酶活性检测，该方法具有非常好的普遍适用性，适用于各类针对不同专属底物的磺基转移酶活性的检测。
2、本发明方法中，3’-磷酸腺苷-5’-磷酸盐产生之后不会积累，会随着IMPAD1酶的加入水解成腺嘌呤核糖核苷酸和磷酸根，从而可以有效避免3’-磷酸腺苷-5’-磷酸盐累积对磺基转移酶活性的抑制作用，提高检测结果的准确性。
3、本发明建立的磺基转移酶活性分析方法操作简单，磺酸化反应可与3’-磷酸腺苷-5’-磷酸盐的水解反应一步完成，再与金属离子/荧光探针荧光猝灭体系混合后直接利用普通的荧光仪检测体系的荧光信号即可，无需大型仪器，克服了传统放射性标记的放射性危害、需专业人员操作、耗时长、试剂存放时间短、易受外界干扰等不足，在普通的化学及生物实验室均可实施。此外荧光信号可以用酶标仪及多孔板阅读器等进行检测，在磺基转移酶潜在抑制剂药物的筛选方面可实现高通量检测。
附图说明
图1是实施例1中反应体系荧光信号随磺基转移酶SULT1A3活性变化的荧光光谱图。
图2是实施例1中反应体系在510nm处的荧光强度随磺基转移酶SULT1A3活性变化的标准曲线图。
图3是实施例2中反应体系荧光信号随磺基转移酶SULT1A1活性变化的荧光光谱图。
图4是实施例2中反应体系在510nm处的荧光强度随磺基转移酶SULT1A1活性变化的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
以磺基转移酶SULT1A3活性检测为例，具体检测方法如下：
1、2μL 100μmol/L 3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸水溶液、2μL 1mmol/L多巴胺水溶液和磺基转移酶SULT1A3溶液(将酶活性为150pmol/min/μg的磺基转移酶SULT1A3用10mmol/LpH值为7.5的Tris-HCl缓冲溶液稀释)分散到10mmol/L pH值为7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，总体积为10μL，使混合体系中磺基转移酶SULT1A3的浓度分别为0、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5、0.65、0.8ng/μL，在恒温摇床上37℃温育20分钟，进行磺酸化反应。
2、向步骤1磺酸化反应后的溶液中加入2μL 20ng/μL IMPAD1酶和10mmol/L pH值为7.5的Tris-HCL缓冲溶液(含2mmol/L MgCl2)中，终体积为20μL，在37℃温育20分钟，进行3’-磷酸腺苷-5’-磷酸盐的水解反应，释放出磷酸根。
3、向步骤2释放磷酸根后的溶液中加入5μL20μmol/LCeCl3水溶液，并用10mmol/LpH值为7.5的Tris-HCl缓冲溶液稀释到总体积为195μL，在室温下孵育10分钟后，向反应体系中加入5μL20μmol/L3,3’-双(甲胺二乙酸)荧光素溶液，总体积为200μL。采用荧光分光光度计(激发波长480nm，最大发射波长510nm，入射狭缝1.0nm，出射狭缝1.0nm)扫描体系荧光光谱并测量反应体系最大发射波长的荧光强度。反应体系的荧光信号随磺基转移酶酶SULT1A3活性变化的光谱图见图1，并绘制510nm处荧光强度随磺基转移酶SULT1A3活性变化的标准曲线(见图2)。由图1和图2可知，510nm处荧光强度与磺基转移酶SULT1A3的活性在0～0.8ng/μL范围内呈现良好的线性关系，其相应的标准曲线方程为Y＝46.3×104X+10.9×104，式中Y代表体系510nm峰值处的荧光强度，X代表磺基转移酶酶SULT1A3的活性，相关系数r值为0.9940。由此可知，体系的荧光强度与磺基转移酶SULT1A3活性的线性关系良好。
4、按照上述步骤1、2和3检测待测样品中磺基转移酶SULT1A3对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测样品中磺基转移酶SULT1A3活性的定量分析。
实施例2
以磺基转移酶SULT1A1活性检测为例，具体检测方法如下：
1、2μL 100μmol/L 3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸水溶液、2μL 1mmol/L SULT1A1的特异性底物2-萘酚和磺基转移酶SULT1A1溶液(将酶活性为30pmol/min/μg的磺基转移酶SULT1A1用10mmol/LpH值为7.5的Tris-HCl缓冲溶液稀释)分散到10mmol/LpH值为7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，总体积为10μL，使混合体系中磺基转移酶SULT1A3的浓度分别为0、0.2、0.4、1、2ng/μL，在恒温摇床上37℃温育20分钟，进行磺酸化反应。
2、向步骤1磺酸化反应后的溶液中加入2μL 20ng/μL IMPAD1酶和10mmol/L pH值为7.5的Tris-HCL缓冲溶液(含2mmol/L MgCl2)中，终体积为20μL，在37℃温育20分钟，进行3’-磷酸腺苷-5’-磷酸盐的水解反应，释放出磷酸根。
3、向步骤2释放磷酸根后的溶液中加入5μL20μmol/LCeCl3水溶液，并用10mmol/LpH值为7.5的Tris-HCl缓冲溶液稀释到总体积为195μL，在室温下孵育10分钟后，向反应体系中加入5μL20μmol/L3,3’-双(甲胺二乙酸)荧光素溶液，总体积为200μL。采用荧光分光光度计(激发波长480nm，最大发射波长510nm，入射狭缝1.0nm，出射狭缝1.0nm)扫描体系荧光光谱并测量反应体系最大发射波长的荧光强度。反应体系的荧光信号随磺基转移酶酶SULT1A1活性变化的光谱图见图3，并绘制510nm处荧光强度随磺基转移酶SULT1A1活性变化的标准曲线(见图4)。由图3和图4可知，510nm处荧光强度与磺基转移酶SULT1A1的活性在0～2ng/μL区间范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y＝16.2×104X+8.27×104，式中Y代表体系510nm峰值处的荧光强度，X代表磺基转移酶SULT1A1活性，相关系数r值为0.9947。由此可知，体系的荧光强度与磺基转移酶SULT1A1活性的线性关系良好。
4、按照上述步骤1、2和3检测待测样品中磺基转移酶SULT1A1对应的荧光强度，根据上述建立的标准曲线即可实现待测样品中磺基转移酶SULT1A1活性的定量分析。
需要指出，不同种类的磺基转移酶其特异性底物不同，因此针对特定的靶标磺基转移酶，本发明方法只需选取与之对应的特异性底物，其余步骤均完全按照上述相似的检测过程即可实现特定磺基转移酶的活性分析。

Claims (5)

1.一种通用型磺基转移酶活性分析方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)将已知活性的磺基转移酶与3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸、磺基转移酶特异性底物混合进行磺酸化反应；
(2)将步骤(1)中磺酸化反应后的溶液与IMPAD1酶混合，进行水解释放磷酸根的反应；
(3)向步骤(2)中释放磷酸根后的溶液中加入能与磷酸根结合的金属离子，充分混合均匀，然后加入能被金属离子猝灭的荧光探针，检测体系的荧光强度，绘制荧光强度随磺基转移酶活性变化的标准曲线；
(4)按照上述步骤(1)、(2)和(3)检测待测磺基转移酶样品对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测样品中磺基转移酶活性的定量分析。
2.根据权利要求1所述的通用型磺基转移酶活性分析方法，其特征在于：所述的金属离子为三价稀土离子、二价过渡金属离子或三价过渡金属离子。
3.根据权利要求1所述的通用型磺基转移酶活性分析方法，其特征在于：所述的金属离子为La3+、Ce3+、Mn2+、Ga3+、Fe3+中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的通用型磺基转移酶活性分析方法，其特征在于：所述的荧光探针为荧光素类、罗丹明类、香豆素类及其衍生物中的任意一种或无机荧光量子点。
5.根据权利要求1所述的通用型磺基转移酶活性分析方法，其特征在于：所述的荧光探针为羧基四甲基罗丹明、3,3’-双(甲胺二乙酸)荧光素、四氯-6-羧基荧光素、CdS半导体量子点、CdSe半导体量子点、碳量子点中的任意一种。
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