CN106191017B - 一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶，其核苷酸序列及应用 - Google Patents

一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶，其核苷酸序列及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106191017B
CN106191017B CN201610353097.3A CN201610353097A CN106191017B CN 106191017 B CN106191017 B CN 106191017B CN 201610353097 A CN201610353097 A CN 201610353097A CN 106191017 B CN106191017 B CN 106191017B
Authority
CN
China
Prior art keywords
uridine
diphosphate
apiose
xylose
udp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610353097.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106191017A (zh
Inventor
孔建强
尹森
程克棣
王伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Materia Medica of CAMS
Original Assignee
Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Materia Medica of CAMS filed Critical Institute of Materia Medica of CAMS
Publication of CN106191017A publication Critical patent/CN106191017A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106191017B publication Critical patent/CN106191017B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01035—UDP-glucuronate decarboxylase (4.1.1.35), i.e. UDP-D-xylose synthase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种来源于虎眼万年青的尿苷‑5’‑二磷酸芹菜糖/木糖合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；还提供了编码尿苷‑5’‑二磷酸芹菜糖/木糖合成酶基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示，以及含有该编码核苷酸序列的载体和宿主细胞。本发明还提供了尿苷‑5’‑二磷酸芹菜糖/木糖合成酶或含有尿苷‑5’‑二磷酸芹菜糖/木糖合成酶的细胞在催化底物尿苷‑5’‑二磷酸葡萄糖醛酸反应中的应用。

Description

一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成 酶，其核苷酸序列及应用
技术领域
本发明涉及一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶，其编码基因及其在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为尿苷-5’-二磷酸木糖、尿苷-5’-二磷酸芹菜糖和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应中的应用，属于基因工程领域。
背景技术
尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶(UAXS)是生物体内生成尿苷-5’-二磷酸芹菜糖(UDP-芹菜糖)、尿苷-5’-二磷酸木糖(UDP-木糖)的关键酶。UAXS能将尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-葡萄糖醛酸)脱去羧基而形成UDP-木糖，同时催化UDP-葡萄糖醛酸经过脱羧和碳骨架重排形成UDP-芹菜糖(图1)。UDP-木糖和UDP-芹菜糖是两个在糖蛋白、多糖、寡糖以及各种糖基修饰的次生代谢产物，如黄酮苷、三萜皂苷、甾体皂苷的生物合成中重要的糖基供体，它广泛存在于动物、植物、真菌、细菌中。许多糖基化的化合物与其苷元相比具有更好的水溶性，从而使化合物的成药性增加，有利于创新药物的研制，具有很重要的经济价值和社会价值。然而，参与形成木糖苷或芹菜糖苷的糖基供体UDP-木糖或UDP-芹菜糖天然来源少，合成困难，价格昂贵。而通过UXS对UDP-葡萄糖醛酸的催化，一步反应就能将UDP-葡萄糖醛酸转化为UDP-木糖和UDP-芹菜糖，从而可以为天然产物的木糖基或芹菜糖基化提供廉价而稳定的糖基供体，这可以带来很大的经济利益。因此，克隆UAXS基因并对其进行功能鉴定对于酶催化合成UDP-木糖和UDP-芹菜糖或者通过合成生物学技术规模化制备木糖苷或芹菜糖苷天然产物，减少由于化学合成以及植物提取木糖苷类天然产物等传统方法对环境和物种造成的压力，从而促进社会可持续发展具有很重要的意义。迄今为止，仅在少数几种植物如十字花科植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和梧桐科植物可可(Theobromacacao)中发现了UDP-芹菜糖/木糖合成酶基因。而尚没有从天门冬科植物虎眼万年青(Ornithogalum caudatum)中分离得到该蛋白的报道。本发明通过对虎眼万年青进行转录组测序，获得了虎眼万年青UDP-木糖合成酶OsaUAXS1序列信息。通过提取虎眼万年青RNA，利用RT-PCR，从虎眼万年青无菌鳞茎中克隆得到OsaUAXS1基因，并对其进行了功能鉴定，这是首次从虎眼万年青植物中克隆得到这个cDNA基因。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶、编码该酶的核苷酸序列、含有该核苷酸序列的表达载体、含有该核苷酸序列或表达载体的宿主细胞，以及其在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应中的应用。
为解决本发明的技术问题，采用如下技术方案：
本发明技术方案的第一方面提供了一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶，其特征在于：
a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经替换，缺失或添加1-40个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
以上所述的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶，其特征在于，在尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶上可进行常规修饰；或者在尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶上还连接有用于检测或纯化的标签。
其中，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰；所述的标签包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、Profinity eXact。
本发明技术方案的第二方面提供了一种编码第一方面所述尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明技术方案的第三方面提供了一种含有第二方面所述核酸分子的表达载体。
本发明技术方案的第四方面提供了一种含有第三方面所述表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞优选大肠杆菌，酿酒酵母，毕赤酵母，链霉菌和植物细胞，更优选的宿主细胞选自大肠杆菌。
本发明技术方案的第五方面提供了第一方面所述的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶或第二方面所述核酸分子或第三方面所述表达载体或第四方面所述宿主细胞在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，为尿苷-5’-二磷酸木糖，尿苷-5’-二磷酸芹菜糖和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应中的应用。其中尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶的底物为尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，产物为尿苷-5’-二磷酸木糖，尿苷-5’-二磷酸芹菜糖和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
有益技术效果：
克隆UAXS1基因并对其进行功能鉴定对于酶催化合成UDP-木糖和UDP-芹菜糖或者通过合成生物学技术规模化制备木糖苷或芹菜糖苷天然产物，减少由于化学合成以及植物提取木糖苷类天然产物等传统方法对环境和物种造成的压力，从而促进社会可持续发展具有很重要的意义。
附图说明
图1：尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶(UAXS)所参与的催化反应。
图2：OsaUAXS1基因的PCR分析结果，其中M是DNA分子量标准；1是OsaUAXS1基因PCR结果。
图3：重组质粒pETDuet-OsaUAXS1示意图。
图4：OsaUAXS1重组蛋白SDS-PAGE分析银染结果，其中M为蛋白分子标准；1为OsaUAXS1；2为空载体对照。
图5：OsaUAXS1重组蛋白免疫印迹结果，其中CK为对照；1为OsaUAXS1。
图6：咪唑洗脱纯化后OsaUAXS1蛋白SDS-PAGE分析银染结果，其中1为目的蛋白；M为蛋白分子标准。
图7：OsaUAXS1重组酶催化UDP-葡萄糖醛酸HPLC-UV检测结果，其中A为实验组；B为对照组(灭活的酶)；C为不加NAD+的实验组；D为不加NAD+的对照组。
图8：OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸产物3紫外图谱。
图9：OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸产物2的1H NMR图。
图10：OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸产物1的1H NMR图。
图11：温度对OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸活性的影响。
图12：pH对OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸活性的影响。
图13：OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸酶活曲线图。
图14：OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸Lineweaver-Burk双倒数图。
具体实施方式
本发明通过如下实施例进行进一步的说明，这些实施例仅用于说明性的，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
实施例1 虎眼万年青转录组测序及序列分析
提取虎眼万年青无菌鳞茎总RNA后，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNApolymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly(A)并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM 2000进行测序。
测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，即raw data或rawreads。对raw reads进行数据过滤，去掉带接头的，重复的，测序质量很低的reads，得到clean reads。使用短reads组装软件Trinity将具有一定长度overlap的clean reads连成更长的片段，即Contig。然后，将clean reads比对回Contig，通过paired-end reads能确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，Trinity将这些Contig连在一起，得到两端不能再延长的序列，这些序列称之为Unigene。通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(E value<0.00001)，并通过blastn将Unigene比对到核酸数据库nt(E value<0.00001)，得到跟给定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。
通过功能注释，从虎眼万年青转录组序列中发现一个长为1895bp的，具有UDP-芹菜糖/木糖合成酶基因保守序列的Unigene，即Unigene26451(SEQ ID NO.2)。
实施例2 OsaUAXS1基因克隆
取100mg虎眼万年青无菌鳞茎于液氮中速冻，研钵研成细粉状，Trizol提取法，提取虎眼万年青无菌鳞茎总RNA。使用RT-PCR Kit(ReverTra-Plus-，TOYOBO公司)将虎眼万年青无菌鳞茎总RNA反转录成cDNA。反转录体系和程序如下：在20μL体系中加入总RNA 1μg，RNase Free H2O 4μL，Oligo(dT)20 1μL，65℃保温5min后，立刻置于冰上冷却，然后在上述管中再依次加入5×RT buffer 4μL，RNase Inhibitor(10U/μL)1μL，dNTP Mixture(10mM)和ReverTra Ace 1μL，30℃保温10min，42℃温育60min，85℃变性5min，冰上5min，完成cDNA的合成。cDNA置于-20℃备用。
以虎眼万年青无菌鳞茎cDNA为模板，设计两对OsaUAXS1特异引物，通过巢式PCR的方法扩增OsaUAXS1基因。
第一轮PCR，50μL体系中含10×PCR buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO4 3μL，10μM的引物F26451-1(5’-TAAAGGTACGATAATTACATATATG-3’，SEQ ID NO.4)和R26451-1(5’-TGAACACAATTCACAATAATAATAAT-3’，SEQ ID NO.5)各1.5μL，KOD-Plus-Neo 1μL，cDNA 2μL，ddH2O补足。PCR程序：94℃预变性5min；98℃变性30s，53℃复性45s，每一个循环递减1℃，68℃延伸120s，共15循环；98℃变性30s，38℃复性45s，68℃延伸120s，共15循环；68℃延伸7min，4℃保温。第二轮PCR，50μL体系中含10×PCR buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mMMgSO4 3μL，10μM的引物F26451-2(5’-AGTGGCTTCTATAATTACGTG-3’，SEQ ID NO.6)和R26451-2(5’-CATGTAATCGAGTCATTACATC-3’，SEQ ID NO.7)各1.5μL，KOD-Plus-Neo 1μL，第一轮PCR产物2μL，ddH2O补足。PCR程序：94℃预变性5min；98℃变性30s，45℃复性45s，68℃延伸120s，共30个循环；68℃延伸7min，4℃保温。0.8％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，结果表明，扩增得到了一条长约为1.2kb的条带(图2)。
PCR产物与pEASYTM-T1Simple(Transgen公司)载体连接，转化到Trans1-T1(Transgen公司)菌株，在含有100μg/mL羧苄青霉素的LB平板上培养，挑取单克隆进行菌落PCR，筛选阳性克隆送样测序。结果表明，扩增得到的PCR产物与转录组测序结果完全一样，长为1182bp(即SEQ ID NO.3)，含有该基因的载体命名为pEASY-OsaUAXS1。
实施例3OsaUXS1表达载体的构建
根据In-Fusion(Clontech公司)同源重组的原理，以测序正确的质粒pEASY-OsaUXS1为模板，FETduetUAXS1(5’-gccaggatccgaattcgatgtcgtcgagagtggatct-3’，SEQ IDNO.8)和RETduetUAXS1(5’-atgcggccgcaagcttctagccagatgcaataggct-3’，SEQ ID NO.9)为引物，通过如下程序和体系进行PCR，50μL体系中含10×PCR buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO4 3μL，10μM的引物FETduetUAXS1和RETduetUAXS1各1.5μL，KOD-Plus-Neo 1μL，质粒1μL，ddH2O补足。PCR程序：94℃预变性5min；98℃变性30s，63℃复性45s，68℃延伸120s，共30个循环；68℃延伸7min，4℃保温。扩增得到长为1.2kb的OsaUXS1基因。将该基因通过In-Fusion的方法连接到EcoRⅠ和HindⅢ双酶切处理的pET-Duet1中，重组产物转化到Trans1-T1菌株，在含有50μg/mL的氨苄青霉素LB平板上培养，挑取单克隆进行菌落PCR，筛选阳性克隆进行测序。结果表明载体构建正确，命名为pETDuet-OsaUAXS1(图3)。
实施例4 重组OsaUAXS1蛋白的诱导表达和检测
将构建好的质粒pETDuet-OsaUAXS1用热激法转化表达宿主菌Transetta(DE3)，转化产物涂布于含氨苄青霉素(50μg/mL)及氯霉素(35μg/mL)的LB固体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠溶于1L蒸馏水中，加入15g琼脂粉，而后调节pH为7.0)上，37℃倒置培养过夜，直至长出单克隆。挑取单克隆转接于20mL含氨苄青霉素(50μg/mL)及氯霉素(35μg/mL)的LB液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠溶于1L蒸馏水中，而后调节pH为7.0)，37℃，200rpm培养至OD600为1.0左右，按1:50比例转接入50mL含氨苄青霉素(50μg/mL)及氯霉素(35μg/mL)的LB培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠溶于1L蒸馏水中，而后调节pH为7.0)，至OD600为0.6时，加入IPTG(终浓度为0.5mM)，在25℃，160rpm条件下，诱导培养12小时。取1mL菌液，12000rpm，离心2min收集菌体。加入1mL预冷裂解缓冲液(25mM，pH为8.0的磷酸钠缓冲液)，重悬菌体，菌体采用超声破碎法破碎(超声5s，停10s，总共超声破碎6min)。破碎液通过12000rpm，离心20min，吸取上清。取10μL上清进行SDS-PAGE分析。结果如图4所示，从图中可以看出，和对照相比，实验菌的诱导产物中出现了一条长约为38kDa的特异性条带。与OsaUAXS1的理论大小一致，表明OsaUAXS1在大肠杆菌中成功表达。
为进一步确证OsaUAXS1基因的表达，进行了免疫印迹分析。离心收集E.coli[pETDuet-OsaUAXS1]的菌体，用超声破碎液进行SDS-PAGE电泳，采用Western blot进行检测。所用一抗为抗His-Tag的小鼠单克隆抗体，二抗为山羊抗小鼠IgG(1：5000)。结果表明，与对照相比，E.coli[pETDuet-OsaUAXS1]经免疫印迹后，在相应的位置上出现了一条相应的杂交带(图5)。因此，确认重组的OsaUAXS1蛋白具有特异的免疫活性，表明OsaUAXS1基因在E.coli中得到了表达。
实施例5 重组OsaUAXS1蛋白的纯化和定量
E.coli[pETDuet-OsaUAXS1]在25℃，160rpm条件下，经0.5mM IPTG诱导培养12小时后，12000rpm，离心2min收集菌体，大量菌体采用细胞破碎仪(800MPa)破碎，12000rpm，离心2min，收集破碎液上清，上清经0.22μM滤膜过滤后，通过镍胶亲和层析进行纯化。用涮洗缓冲液(pH 8.0，25mM磷酸钠，300mM氯化钠，20mM咪唑)冲洗杂蛋白，直到A280小于0.010。紧接着用40mL洗脱缓冲液(pH 8.0，含25mM磷酸钠，300mM氯化钠，100mM咪唑)将结合在镍胶上的重组OsaUAXS1洗脱下来，收集洗脱等分，进行SDS-PAGE分析。结果如图6所示，从结果可以看出，OsaUAXS1纯化效果较好，几乎看不到杂带。
采用2L含25mM磷酸钠(pH 8.0)缓冲液透析纯化的重组OsaUAXS1蛋白，换液4次，而后将透析液加入甘油10mL，蛋白保存于-20℃环境中。
使用Bio-rad protein assay试剂盒对纯化的OsaUAXS1蛋白进行定量，按其说明书有部分修改。首先按1:4的比例将染料和ddH2O稀释混匀，而后通过0.22μM滤膜过滤备用。标准BSA蛋白及待测蛋白按一定梯度稀释，涡旋混匀，而后蛋白按如下体系(100μL:dryreagent dilution buffer；10μL:protein)同染料作用，室温中至少震荡孵育5min。酶标仪测量各蛋白的A595值，对不同BSA标准蛋白浓度及对应的A595值线性回归分析，获得标准BSA蛋白的浓度方程，根据得到的方程测得催化UDP-葡萄糖醛酸实验中所用的OsaUAXS1蛋白浓度为1.21mg/mL。
实施例6 OsaUAXS1蛋白功能鉴定
本实验以UDP-葡萄糖醛酸为底物，并加入辅酶NAD+，探讨OsaUAXS1对该底物的脱羧基作用，结果表明，OsaUAXS1能催化UDP-葡萄糖醛酸形成UDP-木糖并能检测到UDP-芹菜糖的分解产物UMP。
OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸形成的产物鉴定
以纯化的OsaUAXS1蛋白作为催化剂，建立100μL反应体系(500mM磷酸缓冲液20μL，加入5μL浓度为10mM的底物UDP-葡萄糖醛酸，5μL NAD+，20μL纯化的蛋白，50μL灭菌水)。50℃反应30min后，用200μL氯仿终止反应。利用0.22μM尼龙膜过滤反应液，进样20μL进行HPLC分析。色谱柱为Shodex公司的WA-pak阴离子交换柱。HPLC条件表1所示，其中A相为H2O；B相为700mM的醋酸铵-醋酸缓冲液，pH为5.2。检测波长为261nm。
表1
时间 A相％ B相％ 流速ml/min
0 98 2 1
20 50 50 1
32 0 100 1
33 98 2 1
40 98 2 1
HPLC结果(图7)表明，OsaUAXS1能催化UDP-葡萄糖醛酸，实验组底物峰消耗较多，同时在出现了3个新的产物峰，产物1和产物2的最大吸收波长为261，为尿嘧啶的特征吸收峰。产物3的紫外图谱(图8)显示，其在259nm和338nm处均有吸收与NADH的紫外图谱相同，所以判断该化合物为NADH。收集产物1和2，为鉴定新产物的结构，通过液相制备样品，样品冷干后用氘代水溶解，用1H NMR(600M)进行结构解析。归属各氢信号，结果如下：
产物1(图10)：
Rib：H1’5.91(1H,d) H2’4.35(1H,t) H3’4.18(1H,m) H4’4.28(1H,t) H5a’3.94(1H,m) H5b’3.89(1H,m)
Uridine：H5 5.93(1H,d) H6 8.05(1H,d)
产物2(图9)：
Xylosyl：H1”5.44(1H,dd) H2”3.40(1H,dt) H3”3.59(1H,t) H4”3.53(1H,dt)H5a”/H5b”3.64(2H,m)
Rib：H1’5.88(1H,d) H2’4.27(2H,m) H4’4.18(1H,m) H5a’(1H,m) H5b’(1H,m)
Uridine：H5 5.87(1H,d) H6 7.85(1H,d)
综合以上分析，可以确证OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸所形成的产物1为UMP，产物2为UDP-木糖，产物3为NAD+，其中UMP为UDP-芹菜糖分解所得，从而表明，OsaUAXS1具有UDP-芹菜糖/木糖合成酶的功能。
同时实验结果还表明，OsaUAXS1没有在外加NAD+的情况下丧失活性。
实施例7 OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸酶学性质测定
OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸最适温度确定
取1.5mLEP管，加入500mM磷酸缓冲液(pH8.8)20μL，20μL纯化的酶，50μL灭菌水，5μLNAD+，置于不同温度下孵育10min后，快速加入5μL浓度为10mM的UDP-葡萄糖醛酸。反应30min后加入200μL氯仿终止反应，利用0.22μM尼龙膜过滤反应液，进样20μL进行HPLC分析。色谱柱为Shodex公司的WA-pak阴离子交换柱。HPLC条件表1所示，其中A相为H2O；B相为700mM的醋酸铵-醋酸缓冲液，pH为5.2。检测波长为261nm。以产物峰UMP，UDP-木糖面积和最大者为100％，其余取对应的相对值。
结果表明(图11)，OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸的最适温度为50℃，在40—60℃范围内均能达到大于50％的活性，温度过低或过高均不利于反应进行，4℃活性为最高值的20％，在70℃下酶几乎失活。
OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸最适pH值确定
配置pH4-6的100mM的醋酸钠-醋酸缓冲液，pH6-9的10mM的磷酸盐缓冲液，pH7.5-9.2的100mM的Tris-HCl缓冲液。取50μL不同pH的缓冲液，20μL浓度为1.21mg/mL的纯化后的OsaUAXS1蛋白，5μLNAD+，20μL灭菌水，30℃孵育10min，加入5μL浓度为10mM的UDP-葡萄糖醛酸。30℃反应30min后，加入200μL氯仿终止反应，12000rpm离心5min，吸取水相用0.22μM尼龙膜过滤，取滤液20μL用HPLC分析，HPLC条件如表1，检测波长261nm，各自进样量相同。通过比较HPLC检测产物峰面积并比较不同pH下催化效率，以产物峰UMP、UDP-木糖面积和最大者为100％，其余取相对值。
通过HPLC分析结果(图12)表明，催化UDP-葡萄糖醛酸的最适pH为9.0，随着pH升高或降低，其活性下降。
OsaUAXS1催化UDP-葡萄糖醛酸动力学参数测定
利用反应缓冲液配置(pH5.0，50mM磷酸盐)不同浓度UDP-木糖标准品，并HPLC检测，检测波长261nm，得到峰面积。通过线性回归得出峰面积同UDP-木糖浓度的关系，得到一拟合方程Y＝111.9X+1.428(0.1≤X≤1)，X为UDP-木糖浓度(mM)，Y为峰面积变化值。建立100μL反应体系，pH为9.0，50mM磷酸盐缓冲液，OsaUAXS1终浓度为121μg/mL，改变底物UDP-葡萄糖醛酸浓度，在最适温度50℃下反应20min，立即用氯仿终止各个反应，利用HPLC分析UDP-木糖的生成量，利用峰面积求得UDP-木糖的浓度，进而求出反应初速度(μM/s)。根据实验结果做酶活曲线(图13)。使用GraphPad Prism 5中相关程序自动计算出Km和Vmax(图14)。
OsaUAXS1酶学性质数据如表2
表2
Figure BDA0000999274730000081
Figure IDA0000999274780000011
Figure IDA0000999274780000021
Figure IDA0000999274780000031

Claims (8)

1.一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶，其特征在于，其氨基酸序列为：
SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶的核酸分子。
3.根据权利要求2的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
4.一种含有权利要求2-3任一所述核苷酸分子的表达载体。
5.一种含有权利要求2所述核酸分子或权利要求4所述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌，酿酒酵母，毕赤酵母或链霉菌。
6.权利要求1所述的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶或权利要求2-3任一所述的核酸分子或权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸反应中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶的底物为尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
8.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸后，形成的产物为尿苷-5’-二磷酸木糖，尿苷-5’-二磷酸芹菜糖和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
CN201610353097.3A 2015-05-25 2016-05-25 一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶，其核苷酸序列及应用 Active CN106191017B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510271735 2015-05-25
CN2015102717352 2015-05-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106191017A CN106191017A (zh) 2016-12-07
CN106191017B true CN106191017B (zh) 2021-12-07

Family

ID=57453122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610353097.3A Active CN106191017B (zh) 2015-05-25 2016-05-25 一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶，其核苷酸序列及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106191017B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1820743A (zh) * 2005-01-05 2006-08-23 胡幼圃 尿苷二磷酸－葡萄糖醛酸基转化酵素2b(ugt2b)的抑制剂及促进剂
CN101698839A (zh) * 2008-12-26 2010-04-28 北京大学 尿苷二磷酸木糖异构酶及其编码基因与应用
WO2012125027A1 (en) * 2011-03-14 2012-09-20 Dsm Ip Assets B.V. Yeast strains that ferment uronic acids
EP2546336A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-16 DSM IP Assets B.V. Yeast strains that consume uronic acids and produce fermentation products such as ethanol
CN103952473A (zh) * 2014-03-27 2014-07-30 华南农业大学 一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测
WO2014201462A1 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 The Regents Of The University Of California Automated carbohydrate synthesis

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1820743A (zh) * 2005-01-05 2006-08-23 胡幼圃 尿苷二磷酸－葡萄糖醛酸基转化酵素2b(ugt2b)的抑制剂及促进剂
CN101698839A (zh) * 2008-12-26 2010-04-28 北京大学 尿苷二磷酸木糖异构酶及其编码基因与应用
WO2012125027A1 (en) * 2011-03-14 2012-09-20 Dsm Ip Assets B.V. Yeast strains that ferment uronic acids
EP2546336A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-16 DSM IP Assets B.V. Yeast strains that consume uronic acids and produce fermentation products such as ethanol
WO2014201462A1 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 The Regents Of The University Of California Automated carbohydrate synthesis
CN103952473A (zh) * 2014-03-27 2014-07-30 华南农业大学 一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测

Also Published As

Publication number Publication date
CN106191017A (zh) 2016-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2010205133B2 (en) Enzyme preparation containing thermostable dna polymerase, method for producing same, and method for detecting subject organism to be detected
CN110643587B (zh) 一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法
CN111534493B (zh) 一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体、基因及应用
CN113652385B (zh) 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用
CN110938579A (zh) 酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用
JP2024504439A (ja) エステラーゼ変異体及びその用途
CN112553135B (zh) 一种腺苷工程菌及其构建方法与应用
CN112410356B (zh) 来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因rs及其应用
CN117604005A (zh) 一种类黄酮多羟基位点糖基转移酶及其应用
CN106191017B (zh) 一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸芹菜糖/木糖合成酶，其核苷酸序列及应用
CN109402080B (zh) 蛋白质ugt142及其编码基因与应用
CN107164354B (zh) 一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸木糖差向异构酶，其核苷酸序列及应用
CN106191018B (zh) 一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其核苷酸序列及应用
WO2023076952A1 (en) Enzymes with hepn domains
CN105969751B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶基因及其应用
CN106191020B (zh) 一种来源于虎眼万年青的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其核苷酸序列及应用
CN106191019B (zh) 一种截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其核苷酸序列及应用
CN107164355B (zh) 一种来源于虎眼万年青的尿苷-5’-二磷酸半乳糖差向异构酶，其核苷酸序列及应用
JP3833584B2 (ja) Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
CN110157720B (zh) 倍半萜环化酶基因peniA及其在酵母中异源表达合成silphinene的方法
CN117343919B (zh) 一种类黄酮双羟基位点糖基转移酶及其应用
CN105602916B (zh) 一种dbat突变酶r363h及其应用
CN111763696B (zh) 蛋白质PfuPGM作为葡萄糖磷酸变位酶在生产肌醇中的应用
CN114107246B (zh) 尿苷-胞苷激酶突变体及其在生产胞苷酸方面的应用
CN117004670B (zh) 一种磺基转移酶及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant