CN117604005A

CN117604005A - 一种类黄酮多羟基位点糖基转移酶及其应用

Info

Publication number: CN117604005A
Application number: CN202311262103.0A
Authority: CN
Inventors: 易善勇; 王威; 李国四; 徐涛; 韩邦兴; 姜雪萍; 陆海波
Original assignee: West Anhui University
Current assignee: West Anhui University
Priority date: 2023-09-27
Filing date: 2023-09-27
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2043-09-27

Abstract

本发明公开了霍山石斛DhUGT7基因编码的糖基转移酶在生物合成类黄酮‑3,7,4′‑三‑O‑葡萄糖苷中的应用，属于生物技术领域。DhUGT7基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示序列完全互补配对，或为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。在体外利用DhUGT7蛋白进行酶催化的生物合成法得到类黄酮‑3,7,4′‑三‑O‑葡萄糖苷，为合成类黄酮‑3,7,4′‑三‑O‑糖苷提供新的方法。

Description

一种类黄酮多羟基位点糖基转移酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的是涉及一种类黄酮多羟基位点的糖基化方法。

背景技术

类黄酮是一类广泛存在于自然界中的活性天然化合物，根据其基本骨架中的C₃环结构差异，类黄酮被分为黄酮、黄酮醇、黄烷酮、异黄酮等多种类型。现代药理学结果表明类黄酮具有抗氧化、抗炎、抗病毒等诸多药理活性，是寻找新药开发先导化合物的来源宝库。但天然存在的类黄酮化合物往往具有水溶性差、稳定性低、选择性较差等缺点，极大限制了适应性新药的寻找和开发。糖基化是次生代谢产物结构修饰的重要形式，是导致类黄酮化合物结构多样性的主要因素之一，在临床上，多数黄酮苷相较于苷元具有更小的毒副作用及更高的稳定性和生物利用度。因此对一些黄酮进行糖基化修饰将有助于其在临床上开拓更好的应用方向。

近年来，糖基化修饰的化学和生物合成法研究取得了较大进展；但化学糖基化反应存在副产物和中间体多、区域选择性和立体选择性较差、收率低、保护脱保护步骤繁琐、污染大等缺点，此外，低原子效能和部分催化剂的昂贵价格也使得化学合成法在大规模生产糖苷中存在很多短板。相比而言，利用酶催化的生物合成法不仅具有立体和区域选择性，而且操作步骤相对简单，对环境污染也更小，符合绿色化学理念，因此，利用工具酶催化合成产物的生物合成逐步成为该领域的研究焦点。类黄酮-3,7,4′-二-O-葡萄糖基转移酶，是一种以尿苷二磷酸(Uridine diphosphate，UDP)活化的糖分子作为糖基供体的糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase，UGT)，它能专一性的催化类黄酮A环的3位和7位，以及B环的4′位羟基发生糖苷化。在已发现的黄酮糖基转移酶中，以催化3、7位羟基的糖基化居多，然而，能同时糖基化3、7和4′位的酶罕见报道。

发明内容

本发明主要针对上述技术问题，提供一种催化生成类黄酮-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷的糖基转移酶基因，以及生物合成类黄酮-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷的方法，以解决现存化学合成类黄酮-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷系列化合物的不足。

具体地，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供一种糖基转移酶基因，其序列为编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。

在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶基因序列为编码包含如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。

在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶基因序列为编码包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。

在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶基因序列为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。

在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO.1所示序列完全互补配对的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供一种糖基转移酶，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO.4所示序列。

在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.3所示序列。

在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列为包含如SEQ ID NO.2的序列。

在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示序列。

另一方面，本发明提供一种糖基转移酶基因在合成类黄酮-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷系列糖苷类化合物中的应用，所述糖基转移酶基因的核酸序列为编码包含如SEQ IDNO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。

另一方面，本发明提供一种糖基转移酶在合成类黄酮-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷系列糖苷类化合物中的应用，所述糖基转移酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.4所示序列。

在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.2所示序列。

在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列为如SEQ ID NO.3所示序列。

另一方面，本发明提供一种合成类黄酮-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷系列糖苷类化合物方法，所述方法包含如下步骤：

1)获得包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的糖基转移酶；

2)利用步骤1)中的糖基转移酶在酶活反应体系中催化合成类黄酮-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷系列糖苷类化合物。

在一个优选的实施例中，通过原核表达获得上述糖基转移酶。

在一个优选的实施例中，通过化学合成获得上述糖基转移酶。

在一个优选的实施例中，酶活反应体系中含有上述糖基转移酶、UDP-Glc以及类黄酮化合物。

在一个优选实施例中，酶活反应体系中还含有二价阳离子。

在一个优选实施例中，酶活反应体系的反应温度为4-60℃。

在一个优选实施例中，酶活反应体系的PH为8.0-10.0。

在一个优选实施例中，酶活反应体系具体为10μg纯化糖基转移酶、5mM Mg²⁺、14mMβ-巯基乙醇、5mM UDP-Glc、0.5mM类黄酮化合物，用50mM，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液补充至200μL，于37℃反应至少3h。

在一个优选实施例中，酶活反应体系为上述反应体系的各组分含量的等比例扩大或缩小，PH＝9.0，于37℃反应至少2h。

在一个优选实施例中，前述类黄酮化合物为山奈酚、槲皮素中的任一个。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)本发明相较于现有技术，本发明是利用酶催化的生物合成法得到类黄酮-3,7,4′-三

-O-葡萄糖苷，较化学合成法具有步骤更简单、污染更小、产物更单一等优点。

2)本发明中的糖基转移酶在较短的时间内(3h内)对底物类黄酮的转化率高达95％以上。

3)本发明中的该糖基转移酶适合反应温度范围较宽。

4)本发明中的该糖基转移酶无金属离子依赖性，但多种二价阳离子可提高其催化活性。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明的方法及其有益效果进行详细说明。

图1为类黄酮-3,7,4′-二-O-葡萄糖基转移酶的催化流程图，其中化合物1、2分别为山奈酚、槲皮素；

图2为以霍山石斛茎cDNA为模板扩增目的基因片段的电泳结果图，其中M为DNAMarker(2k bp)，1为目的基因片段；

图3为Nde I和BamH I双酶切重组质粒的电泳验证图，其中M为DNA Marker(5kbp)，1为pET-28a(+)-DhUGT7重组质粒双酶切产物片段；

图4为pET-28a(+)-DhUGT7融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图(Marker大小为10-150kDa)，其中1为为纯化后的蛋白；

图5为pET-28a(+)-DhUGT7融合蛋白对底物山奈酚的催化结果图，其中A为反应终产物的质谱检测图；B为反应结果的液相检测图；C为反应终产物的LC-MS检测图；

图6为pET-28a(+)-DhUGT7融合蛋白的酶促动力学参数结果图，其中A为反应温度、B为反应pH、C为二价金属离子、D为反应时间、E为酶对以山奈酚为催化底物时的米氏常数。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本申请所使用的所有技术和科技术语具有本申请所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。

实施例1

目标糖基转移酶基因的克隆

1、提取霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)茎段RNA，按照反转录试剂盒(R333，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)操作说明将其反转录成cDNA，利用PCR技术克隆目的基因，具体引物信息为：

上游引物：5'ATGGGAGAAGCTTCCCCTCTC 3'

下游引物：5'TTACGTGGCAACGGCGCA 3'

PCR反应体系为：2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(P515，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)25μL，上下游引物各2μL，模板50-100ng，dd H2O补至50μL。PCR扩增程序为：①95℃反应3min；②95℃反应15s、60℃反应45s、72℃反应60s，共循环35次；③72℃延伸5min。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物大小，电泳图见图1(M：DL 2000marker；Lane 1：DhUGT7基因)

2、将扩增产物与T载体相连(C601，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，并转化至大肠杆菌DH5α中，挑选单菌落于LB培养基中培养并进行菌液PCR验证，菌液PCR反应体系为：12.5μL Green Taq Mix(P131，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，上下游引物各1μL，2μL模板(菌液)，以dd H₂O补至25μL。将菌液PCR结果正确的样本送去测序。

测序所得核苷酸序列如SEQ ID NO.1，与基因组序列相似度为99％，以实际基因克隆所得的测序结果为准。该基因序列含有1419个核苷酸，编码472个氨基酸(SEQ ID NO.2所示)。

测序所得核苷酸序列与基因组序列相似度为99％，以实际基因克隆所得的测序结果为准。如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，该基因序列含有1473个核苷酸，编码490个氨基酸。

SEQ ID NO.1

ATGGGAGAAGCTTCCCCTCTCCTCCACTTTCTCTTTGTCTCCTTCCCCGGCCAAGGCCACCTCAACCCTCTCCTCCGCTTAGCCAAACGCGTCGCTTCCAAGGGCCCACTCGTCACCTTCTCCACCACCCTCGATCTAGGCAACCGCATCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGAAAGCGATTCGGACTTAATCCCAGTCGGCCGCGGCCTTCTCCGGTTTGAGTTTTTTGACGACGGGACAGACCCGACAGACCCGCATCGCGACGACCTCGACATCCTCATGGCCCGACTGGAATCCAACGGCCCGCCCGCACTAACCAATCTCATCAACCGCCAAACCGACGCGGGTCGACCAGTCTCCTGCCTCATCAACAACCCGTTTCTTCCATGGGCTCTCAACGTCGCCGAAGATCTCGGAATCCCCAGCGCCGTTTTATGGGTTCAGTCCTGCGCAGTATTCTCTACTTACTATCATTTTCACCACAAGCTCGCCGATTTCCCAACCGAAGATAACCCGGACCGGACGGTGAATCTCCCGGGCCTCCCACCCATGCGGCCCGAAGACCTGCCCACATTCCTTCTCCCTTCCAACCCTTACAAACCTCTAACAAACGTGATCCTCGCCCAGTTCAAGAACATTTTAAAGGCCCGATGGGTTTTTGCTAATTCATTCGAGGAACTGGAGAGAGATGCTTTTGATGCTATTGCAGGTAGATTGCAAATACCCGTCATACCAGTGGGCCCACTTGTCGAAGCCGGTGAGCCGCAGGAGAAGATTAAGGCCGATATGTGGAAGCCGGAGGATCGCTGTATTGAATGGCTTGATAAACAGGAGAAGCGATCTGTTGTCTACGTCTCGGCGGGGAGTATAGTAATGTTAAATTCCTCCGAGATGCAAGAGCTTGCTTTTGGACTTCGGAACTCCGGCCGGCCTTTCCTTTGGGTGGTTAGGGAGAACCTCCGAGAACTGCTTCCGAAGGGTTTCAAGGAAGAGATAGAAGCAGAAGGCAAAAGCATTCTCGTGGAGTGGAGCCCACAAGAGAAAGTCCTGGCCCAAAAATCCCTAGCTTGCTTCGTCACTCACTGCGGCTGGAACTCTACCCTAGAACTCATCGCCGCCGGCGTCCCTGCCATTGCCTTCCCCCAGTGGGGAGACCAAGTCCCCGACGCCAAGTTCCTCTGCGATGTCCACGGAATCGGCGTCCGCATTCCCACTCCAGCAGCACGTGCCGAGATCGTGCGATGCCTCACCGCCGCCACCGAAGGACCAGACGCCGAGGCGATGCTGAAGCGCGCTAAGAAGTGGAAAGAGATAGCTCGAGCCGCCGTCACCACCGGTGGATCATCAGACCGTAACATTGAAAGGTTTGTTGATGATGTGAGAAAATGGGTGGCGAACGGAGGCGGCGGGGTGGTCGATCCAGTCGCCGGAGTTTGTCGGGTGATTCAGGGGTCTTGCGCCGTTGCCACGTAA

SEQ ID NO.2

MGEASPLLHFLFVSFPGQGHLNPLLRLAKRVASKGPLVTFSTTLDLGNRISAAAAAAESDSDLIPVGRGLLRFEFFDDGTDPTDPHRDDLDILMARLESNGPPALTNLINRQTDAGRPVSCLINNPFLPWALNVAEDLGIPSAVLWVQSCAVFSTYYHFHHKLADFPTEDNPDRTVNLPGLPPMRPEDLPTFLLPSNPYKPLTNVILAQFKNILKARWVFANSFEELERDAFDAIAGRLQIPVIPVGPLVEAGEPQEKIKADMWKPEDRCIEWLDKQEKRSVVYVSAGSIVMLNSSEMQELAFGLRNSGRPFLWVVRENLRELLPKGFKEEIEAEGKSILVEWSPQEKVLAQKSLACFVTHCGWNSTLELIAAGVPAIAFPQWGDQVPDAKFLCDVHGIGVRIPTPAARAEIVRCLTAATEGPDAEAMLKRAKKWKEIARAAVTTGGSSDRNIERFVDDVRKWVANGGGGVVDPVAGVCRVIQGSCAVAT

实施例2

保守结构域预测

将实施例1中的SEQ ID NO.2提交到InterProScan预测其保守结构域(选择CDD和pFAM数据库)，结果显示该序列含有CDD数据库的GT1_Gtf-like结构域，以及Pfam数据库的UDPGT结构域。

GT1_Gtf-like结构域为如SEQ ID NO.3所示的序列，UDPGT结构域为如SEQ IDNO.4所示的序列。上述2个序列均是糖基转移酶保守结构域，可能为SEQ ID NO.2发挥特殊催化作用相关。

SEQ ID NO.3：

LHFLFVSFPGQGHLNPLLRLAKRVASKGPLVTFSTTLDLGNRISAAAAAAESDSDLIPVGRGLLRFEFFDDGTDPTDPHRDDLDILMARLESNGPPALTNLINRQTDAGRPVSCLINNPFLPWALNVAEDLGIPSAVLWVQSCAVFSTYYHFHHKLADFPTEDNPDRTVNLPGLPPMRPEDLPTFLLPSNPYKPLTNVILAQFKNILKARWVFANSFEELERDAFDAIAGRLQIPVIPVGPLVEAGEPQEKIKADMWKPEDRCIEWLDKQEKRSVVYVSAGSIVMLNSSEMQELAFGLRNSGRPFLWVVRENLRELLPKGFKEEIEAEGKSILVEWSPQEKVLAQKSLACFVTHCGWNSTLELIAAGVPAIAFPQWGDQVPDAKFLCDVHGIGVRIPTPAARAEIVRCLTAATEGPDAEAMLKRAKKWKEIARAA

SEQ ID NO.4：

DKQEKRSVVYVSAGSIVMLNSSEMQELAFGLRNSGRPFLWVVRENLRELLPKGFKEEIEAEGKSILVEWSPQEKVLAQKSLACFVTHCGWNSTLELIAAGVPAIAFPQWGDQVPDAKFLC

实施例3

pET-28a(+)-DhUGT7重组质粒的构建及融合蛋白的诱导表达

1、从-80℃冰箱中取出甘油保存的pET-28a(+)菌液，在1000mL锥形瓶中加入500mLLB培养基、500μL KaN⁺(50mg/mL)和1mL的甘油菌，并置于振荡箱中37℃、200rpm培养16h。将从菌液中提取的pET-28a(+)质粒用BamH I(1010S，宝日医生物技术(北京)有限公司)和NdeI(1161A，宝日医生物技术(北京)有限公司)限制性内切酶进行双酶切。反应体系为50μL反应液中含有不高于1μg的质粒，两种限制性内切酶各1μL，10×K缓冲液5μL，用dd H₂O补充至固定体积，在37℃下反应3h以上，并通过1％琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒(DC301，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)纯化回收线性化载体。2、以测序正确的pClone007 Blunt-DhUGT7质粒为模板，扩增出含同源臂的目的基因片段，扩增引物序列为：上游引物：5'gtgccgcgcggcagccatatgATGGGAGAAGCTTCCCCTCTC 3'，下游引物：5'acggagctcgaattcggatccTTACGTGGCAACGGCGCA 3'。

3、用胶回收试剂盒回收产物，并通过同源重组酶(C112，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将目的基因连接至线性化载体中，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，具体方法为：吸取9μL连接产物缓慢打入100μL感受态细胞中央，轻弹管壁，并通过手腕的轻浮摆动将菌液甩至管底，随后放置于碎冰上静置30min。将离心管42℃水浴45s，在此过程中应避免晃动。在管中加入500μL LB培养基，于37℃，200rpm条件振摇1h，最后涂至固体LB培养基表面。待长出克隆子后进行菌液PCR检测，将结果正确的菌液送至生物公司测序。

4、如图3所示，所得的重组质粒经Nde I和BamH I限制性内切酶酶切后，得到了两段条带，其中在5k附近为pET-28a(+)线性化载体片段，1-2k间的条带为目的基因片段，表明载体pET-28a(+)中成功插入了一段基因。

3、将得到的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，并挑选阳性克隆子至LB培养基中培养，当OD₆₀₀＝0.6～0.8(以无菌LB培养基为对照)时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM，16℃过夜诱导表达目的蛋白。

4、收集诱导表达后的菌体，悬浮于pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液中，并超声破碎，所得上清即为粗酶液。根据融合蛋白上的His-Tag标签，采用镍亲和层析柱纯化目的蛋白，利用不同浓度的咪唑溶液洗脱目的蛋白，最后以10％的SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的分子量及纯度。如图4所示，纯化后的蛋白酶液在电泳图中条带单一，大小与理论蛋白加上重组标签的分子量相符，表明该蛋白在上清液中成功表达，且纯化出的蛋白可用于后续实验。为提高纯化蛋白的浓度，用30kDa超滤管离心浓缩目的蛋白，并用BCA蛋白定量试剂盒(E 112，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)检测蛋白浓度。浓度为1.6μg/mL。

实施例3

体外酶活检测

1、酶活反应体系：在1.5ml离心管中加入10μg纯化蛋白、5mM Mg²⁺、14mMβ-巯基乙醇、5mM UDP-Glc、0.5mM类黄酮化合物(山奈酚、槲皮素)，用50mM，pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液补充至200μL，于30℃水浴锅中反应1h，待反应结束后，用三倍量的乙酸乙酯萃取三遍，合并萃取液于旋转蒸发仪上45℃旋干，后用甲醇超声溶解，14000rpm离心5min，取上清液进LC-MS检测。

2、HPLC条件

HPLC型号：Waters ACQUITY Arc

流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：乙腈。

洗脱梯度：0-5min：5％-20％B；5-8min：20％-22％B；8-17min：22-25％B；17-23min：25-35％B；23-25min：35-50％B；25-32min：50-95％B；32-37min：95％B；37-38min：95-5％B；38-42min：5％B。

检测波长：336nm。

3、LC-MS条件：

色谱柱型号：Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈ column(2.1×100mm,1.7μm)

流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：乙腈。

洗脱梯度：0-0.5min：5％B；0.5-1.5min：5-10％B；1.5-4min：10-25％B；4-7min：25-35％B；7-9.5min：35-65％B；9.5-10.5min：65-85％B；10.5-11.5min：85-95％B；11.5-12.5min：95％B；12.5-13.5min：95-5％B；13.5-15min：5％B。

质谱条件：电喷雾离子源；采集模式为AutoMS²；负离子模式；毛细管电压3500V；鞘气温度350℃，流速11L/min；干燥气温度325℃，流速8L/min；质荷比扫描范围为100-1700m/z；碰撞电压175V；碰撞能量15-50eV。

5、检测结果：

通过比对产物标准品的保留时间和相对分子质量，发现重组酶pET-28a(+)-DhUGT7对类黄酮底物的催化终产物质荷比较底物多出486(产物增加的分子量为三个葡萄糖和脱去三分子水后的差值)，证明该产物为类黄酮三葡萄糖苷。由于山奈酚、槲皮素具有相同的骨架结构，仅是2个侧链的-H和-OH不同组合，一般糖基转移酶催化其中一种，则可以催化另1种化合物。这里以山奈酚为例，同时根据产物标准品的保留时间，发现其产物为山奈酚-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷，催化反应的检测结果见图5。

实施例4

重组蛋白pET-28a(+)-DhUGT7酶促动力学参数检测

为进一步了解重组蛋白的酶学性质，我们从pH、温度、金属离子、反应时间等方面对酶的催化条件进行了探究。其中以山奈酚为反应底物，UDP-Glc为糖供体，β-巯基乙醇为抗氧化剂。

1、温度：在总体积为200μL的Tris-HCl(50mM，pH＝8.0)反应体系中加入了14mMβ-巯基乙醇，5mM UDP-Glc，10μg蛋白，0.5mM底物，在4、20、30、37、40、42、50、60、70℃下反应1h，对反应的最适温度进行考察。

2、pH：在总体积为200μL、50mM的不同缓冲液(pH＝5.0-6.0的柠檬酸-柠檬酸钠、pH＝6.0-8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、pH＝7.0-9.0的Tris-HCl、pH＝9.0-10.0的碳酸钠-碳酸氢钠)体系中包含了14mMβ-巯基乙醇，5mM UDP-Glc，10μg蛋白，0.5mM底物，在不同类型缓冲液中37℃反应1h，对反应的最适pH进行考察。

3、金属离子：在总体积为200μL的Tris-HCl(50mM，pH＝9.0)反应体系中加入了14mMβ-巯基乙醇，5mM UDP-Glc，10μg纯化蛋白，0.5mM底物，5mM的二价金属离子，于37℃下反应1h。观察不同的二价金属离子及EDTA·2Na对催化效率的影响。

4、反应时间：在总体积为200μL的Tris-HCl(50mM，pH＝9.0)反应体系中加入了14mMβ-巯基乙醇，5mM UDP-Glc，10μg蛋白，0.5mM底物，5mM的Mg²⁺,于37℃下反应5、10、20、30、60、120、240、480、720min，检测不同的反应时间内，酶催化效率的变化规律。

5、米氏常数K_m：酶活反应体系总体积为200μL，其中包括：5μg蛋白与5mM的UDP-Glc，底物浓度为50-300μM(分别为50、100、150、200、250、300、350、400μM)，用pH＝9.0、50mM的Tris-HCl补充至200μL，在37℃下反应10min，然反应结束后立即用等体积预冷的甲醇终止反应，14000rpm高速离心5min后，取20μL进HPLC检测，液相条件如上。米氏常数是通过米氏方程与双倒数作图法法(Lineweaver-Burk plot)计算获得。

6、检测结果：

重组蛋白pET-28a(+)-DhUGT7催化山奈酚的最佳反应温度为37℃；重组蛋白的最佳反应pH为9.0，且在Tris-HCl中的反应速率较碳酸钠-碳酸氢钠中高得多；重组蛋白对金属离子没有依赖性，但Mg²⁺可提高其催化效率；重组蛋白的催化效率在3h内，催化速率与反应时间呈正相关，且在3h内，底物的转化率可达95％以上，因此选取3h为该催化反应的最佳反应时间。最终通过计算，得出上述重组蛋白对山奈酚K_m值为36.59μM。上述酶促动力学相关结果见图6A-E。。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种糖基转移酶基因，其序列为编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。

2.一种糖基转移酶，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO.4所示序列。

3.一种糖基转移酶基因在合成类黄酮-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷系列糖苷类化合物中的应用，所述糖基转移酶基因的序列为编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。

4.一种糖基转移酶在合成类黄酮-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷系列糖苷类化合物中的应用，所述糖基转移酶序列包含如SEQ ID NO.4所示序列。

5.一种合成类黄酮-3,7,4′-三-O-系列糖苷类化合物方法，所述方法包含如下步骤：

1)获得包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的糖基转移酶；

2)利用上述糖基转移酶在酶活反应体系中催化合成类黄酮-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷系列糖苷类化合物。

6.如权利要求5所述的一种合成类黄酮-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷系列糖苷类化合物方法，其特征在于，步骤1)中通过原核表达获得糖基转移酶或通过化学合成获得糖基转移酶。

7.如权利要求5所述的一种合成类黄酮-3,7,4′-三-O-葡萄糖苷系列糖苷类化合物方法，其特征在于，步骤2)中酶活反应体系中含有上述糖基转移酶、UDP-Glc以及类黄酮化合物。

8.如权利要求5所述的一种合成类黄酮-3,7,4′-三-O-糖苷系列糖苷类化合物方法，其特征在于，步骤2)中酶活反应体系中还含有二价阳离子。

9.如权利要求5所述的一种合成类黄酮-3,7,4′-三-O-糖苷系列糖苷类化合物方法，其特征在于，步骤2)中酶活反应体系的反应温度为4-60℃。

10.如权利要求5所述的一种合成类黄酮-3,7,4′-三-O-糖苷系列糖苷类化合物方法，其特征在于，步骤2)中酶活反应体系的PH为8.0-10.0。