CN117965486A - 霍山石斛udp-鼠李糖合成酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了霍山石斛DhuRHM基因编码的UDP‑鼠李糖合成酶在生物合成UDP‑鼠李糖中的应用，属于生物技术领域。DhuRHM基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示序列完全互补配对，或为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。在体外利用DhuRHM蛋白进行酶催化的生物合成法得到UDP‑鼠李糖，为合成UDP‑鼠李糖提供新的方法。

Description

霍山石斛UDP-鼠李糖合成酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的是涉及霍山石斛UDP-鼠李糖合成酶及其应用。

背景技术

糖苷类化合物，指在糖基转移酶的作用下，苷元上引入糖基供体得到的糖基化产物。糖苷的最终结构形成主要有四个影响因素，分别是苷元、糖基化修饰种类、糖基化数目及糖基化位置。四种影响因素交叉组合、随机排列使糖苷类化合物有着丰富的结构多样性。黄酮鼠李糖苷便是众多糖苷类化合物中的一类，指黄酮苷元通过鼠李糖基化得到有特殊活性及选择性的糖苷，研究表明许多黄酮鼠李糖苷有着显著的药理活性，如：槲皮素-7-鼠李糖苷通过改善胆道排泄和抑制炎症反应进行保肝作用；杨梅素-3-鼠李糖苷通过阻断标志物透明质酸酶从而抑制激素依赖性乳腺癌细胞的增殖；山奈酚-3-鼠李糖苷通过抑制谷氨酸释放对神经起着重要的保护作用。作为鼠李糖苷的糖供体，核苷酸鼠李糖合成较为困难，主要有化学合成法和酶合成法，化学合成法反应条件苛刻，涉及有机试剂，产率较低且易产生对环境及人体有害的副产物，并非是合成核苷酸鼠李糖的最佳选择，相比下，酶合成法更为合适。核苷酸鼠李糖在自然界主要以两种活化形式存在，其生物合成也不同。细菌中，核苷酸鼠李糖的活化形式为脱氧胸腺二磷酸鼠李糖(dTDP-Rha)，是由dTDP-葡萄糖为底物，NAD+及DANPH为辅助因子，在d TDP-葡萄糖-4,6-脱水酶(rml B)、d TDP-4K6DG-3,5-差向异构酶(rml C)和d TDP-4KR-4-酮-还原酶(rml D)三个酶的作用下得到；植物中，核苷酸鼠李糖的活化形式为尿苷二磷酸鼠李糖(UDP-Rha)，是由UDP-葡萄糖为底物，NAD+及DANPH为辅助因子，在RHM酶作用下直接得到。在植物RHM酶未被挖掘之前，核苷酸鼠李糖常通过细菌中的合成途径得到，所需的三种酶对应三个基因，相比于植物RHM酶，更为繁琐及耗费。综上所述，借助植物RHM酶来合成核苷酸鼠李糖是目前最好的选择。

黄酮类是霍山石斛最主要的成分之一，多以糖苷形式存在，霍山石斛中有68种黄酮苷类，包括4种黄酮氧苷和64种黄酮碳苷，其中23个化合物带有鼠李糖供体。这暗示黄酮鼠李糖苷可能参与霍山石斛抗逆境胁迫。黄酮合成途径关键基因的调控与黄酮类成分含量和多样性密切相关，研究这些基因对霍山石斛黄酮类成分的挖掘和累积具有重要的意义。核苷酸鼠李糖作为鼠李糖苷的糖供体，RHM基因是其合成的关键酶，目前霍山石斛RHM基因还未见相关报道。

发明内容

本发明主要针对上述技术问题，提供一种催化生成UDP-鼠李糖的UDP-鼠李糖合成酶基因，以及生物合成UDP-鼠李糖的方法，以解决现存化学合成UDP-鼠李糖的不足。

具体地，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供一种UDP-鼠李糖合成酶，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO.2所示序列。

另一方面，本发明提供一种UDP-鼠李糖合成酶基因，其序列为编码包含如SEQ IDNO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，

或基于互补配的原则，本发明提供的UDP-鼠李糖合成酶基因可以为编码包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。

在一个优选的实施例中，上述UDP-鼠李糖合成酶基因的核苷酸序列包含如SEQ IDNO:1所示，或与SEQ ID NO.1所示序列完全互补配对的核苷酸序列。

本领域技术人员公知的，基因序列还可以包含内含子、启动子以及各种调控元件，因此述UDP-鼠李糖合成酶基因的核苷酸序列同样可以包含内含子、启动子以及各种调控元件。

另一方面，本发明提供一种UDP-鼠李糖合成酶基因在合成UDP-鼠李糖中的应用，所述UDP-鼠李糖合成酶基因的核酸序列为编码包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。

在一个优选的实施例中，上述UDP-鼠李糖合成酶基因序列为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列完全互补配对的序列。

在一个优选的实施例中，上述UDP-鼠李糖合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO.1所示序列完全互补配对的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供前述鼠李糖合成酶在合成UDP-鼠李糖中的应用。

另一方面，本发明提供一种合成UDP-鼠李糖方法，所述方法包含如下步骤：

1)获得前述UDP-鼠李糖合成酶；

2)利用步骤1)中的UDP-鼠李糖合成酶在酶活反应体系中催化合成UDP-鼠李糖。

在一个优选的实施例中，通过原核表达获得上述UDP-鼠李糖合成酶。

在一个优选的实施例中，通过化学合成获得上述UDP-鼠李糖合成酶。

在一个优选的实施例中，酶活反应体系中含有上述UDP-鼠李糖合成酶、UDP-Glc以及缓冲液。

另一方面，本发明提供一种合成鼠李糖苷的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：

1)获得包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的UDP-鼠李糖合成酶；

2)利用上述UDP-鼠李糖合成酶在酶活反应体系中催化合成UDP-鼠李糖。

3)将步骤2)中的UDP-鼠李糖作为鼠李糖苷的糖供体合成鼠李糖苷。

在一个优选的实施例中，通过原核表达获得上述UDP-鼠李糖合成酶。

在一个优选的实施例中，通过化学合成获得上述UDP-鼠李糖合成酶。

在一个优选的实施例中，酶活反应体系中含有上述UDP-鼠李糖合成酶、UDP-Glc以及缓冲液。

在一个优选的实施例中，酶活反应体系中还含有糖基转移酶和苷元。

在一个优选的实施例中，前述糖基转移酶和苷元为任何已知的可对苷元进行鼠李糖基化的糖基转移酶和与该糖基转移酶对应的苷元。

在一个优选实施例中，前述苷元为黄酮苷元。

在一个优选实施例中，前述苷元为山奈酚、槲皮素、杨梅素中的任一个。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)本发明提供了新的UDP-鼠李糖合成酶。

2)本发明相较于现有技术，是利用酶催化的生物合成法得到UDP-鼠李糖，同时合成鼠李糖苷，较化学合成法具有步骤更简单、污染更小、产物更单一等优点。

3)本发明中的UDP-鼠李糖合成酶生成的底物可直接作为糖基供体，用于合成鼠李糖苷。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明的方法及其有益效果进行详细说明。

图1为以霍山石斛cDNA为模板扩增目的基因片段的电泳结果图，其中M为DNAMarker(2k bp)，1为目的基因片段。

图2为pET-28a(+)-DhuRHM融合蛋白以及AtUGT78D1蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图(Marker大小为10-150kDa)，其中:Maker 1:空载2:DhuRHM粗酶3:DhuRHM纯酶4:AtUGT78D1粗酶。

图3为DhuRHM的催化反应检测结果以及催化活性示意图，其中A.空载体和重组蛋白与槲皮素反应的液相检测；B.重组蛋白与槲皮素反应产物的质谱检测；C.DhuRHM的催化活性示意图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本申请所使用的所有技术和科技术语具有本申请所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。

实施例1

目标UDP-鼠李糖合成酶基因的克隆

1、总RNA提取试剂盒从霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)中提取总RNA，并用带有gDNA wiper的反转录试剂盒生成单链cDNA，以此为模板进行聚合酶链式反应(PCR)扩增DhuRHM基因全长片段，具体引物信息见表1：

表1引物序列Table 1Primers sequence

PCR反应体系为：cDNA 1μL,10μmol·L-1上下游引物各1μL，高保真酶2×PhantaMax Master Mix 12.5μL，ddH2O补足至25μL。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s,72℃延伸1.15min，30个循环后；72℃延伸5min；4℃保存。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。电泳图见图1(M：DL 2000marker；Lane 1：DhuRHM基因)，在2 000bp出现1条清晰条带，与预期基因大小基本一致。

2、利用同源重组酶将PCR产物与Nde I及BamH I双酶切后的pET-28a线性载体连接得到重组质粒，转化到DH 5α化学感受态细胞，抗性筛选后测序。

测序所得核苷酸序列和编码氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，该基因序列含有1473个核苷酸，编码490个氨基酸。

SEQ ID NO.1

ATGAGTTCTTATACACCTAAAAACATCCTCATCACTGGCGCTGCTGGTTTTATTGCATCCCATGTTTGTAACCGCCTTATCCGTAACTACCCTGAGTATAAGATTGTGGTTCTTGATAAGCTTGATTATTGCTCCAATTTGAAAAATCTCCTCCCATCCCGGTCTTCTCCAAATTTTAAGTTTGTTAAAGGTGACATTGCCAGTGCTGACCTTGTCAACTTCCTCCTGATCACTGAGTCAATAGATACCATCATGCACTTTGCTGCACAAACTCATGTGGACAATTCCTTTGGGAATTCTTTTGAGTTTACCAAAAACAACATCTATGGCACTCATGTCCTACTTGAGGCCTGCAAAGTGGCCGGCAATGTAAGAAGGTTCATTCATGTTAGCACTGATGAAGTTTATGGAGAGACTGATGCAGAAGCTGTGGTTGGAAACCATGAAGCATCTCAGCTGCTTCCCACTAATCCTTACTCTGCTACCAAAGCTGGGGCCGAGATGCTTGTTATGGCTTATGGAAGCTCCTATGGCTTACCTGTCATAACCACAAGGGGGAATAATGTTTATGGACCCGGTCAGTTCCCAGAGAAGCTTATTGCCAAATTCATTCTCTTGGCCATGGCTGGAAAGCCCCTGCCAATTCATGGCGATGGATCCAATGTTAGAAGCTATCTTTATTGTGAAGATGTTGCGGAAGCGTTTGAGGTCATTCTTCACAAAGGTGAAGTTGGTCACATCTACAATATAGGAACCACGAAAGAGAGAAGGGTGATTGATGTAGCGAAGGACATATGTAAACTTTTCTCTTTGGATGCTGATGCAGTGATTAAATTTGTAGAAAACAGACCATTTAATGATCAAAGGTACTTTTTAGATGACCAGAAGCTAAAGAAATTAGGGTGGTCAGAGCGCACTACTTGGGAGGAAGGACTAAGGAAGACAATGGAGTGGTACACAAGCAATCCTGATTGGTGGGGTGATGTCTCTGGAGCCTTGCTGCCCCATCCAAGAATGCTAATGATGCCCGGTATTGAAAAGCAGTTTGAGGGACCAGCAGATGGTAACAACATGGTTTTTCAGCTAATAAGCCCTGCAAATCAGACCAAAGCGGTGTTACCAGATTTAAAGATCACTAATGGTTCTTCAGAGAAGTATTTGAAATTTTTGATATATGGTAGAACTGGTTGGATTGGTGGTTTGCTTGGAGATATATGCCAAAAGCAAGGAATACCATTTGAGTATGGCCAGGGTCGTCTTGAAAACCGATCTCAACTTCTATTGGATATTCAAACCGTGAGGCCGACCCATGTGTTCAATGCTGCTGGTGTGACTGGTAGACCTAATGTTGATTGGTGCGAATCTCACAAACCGGCGACGATTCGGACAAATGTGGTTGGCACTTTGAATTTGGCAGATGTCTGCATGGAAAATGGGTTACTTATGATGAATTATGCTACGGGTTGCATATTTGAATACAACACTGATCACCCTGAAGGGTCAGGCATTGGCTTCAAGGAGGAGGATAACCCAAATTTCACTGGATCATTCTACTCAAAGACTAAGGCAATGGTTGAAGAGCTCTTAAAAGAGTATGATAATGTGTGCACTCTTAGAGTCAGAATGCCAATATCTTCTGACCTTAGTAATCCTCGGAACTTCATCACAAAGATATCAAGATATAACAAGGTTGTAAACATTCCAAATAGCATGACAATTTTGGATGAACTTTTGCCCATTTCGGTTGAGATGGCAAAAAGAAATTGCAAGGGAATATGGAACTTCACAAATCCAGGTGTTGTCAGTCATAATGAGATACTAGAGATGTATAAGAAGTACATTGACCCTGAGTTTTCGTGGGCCAACTTTACATTGGAAGAACAGGCTAAAGTCATAATAGCACCAAGAAGCAACAATGAGATGGATGCTTCAAAATTGAAGAATGAATTTCCAGAATTGCTACCCATCAAAGAGTCGCTGATTAAGTTTGTTTTTGAGCCCAACAGAAAGATGTAA

SEQ ID NO.2

MSSYTPKNILITGAAGFIASHVCNRLIRNYPEYKIVVLDKLDYCSNLKNLLPSRSSPNFKFVKGDIASADLVNFLLITESIDTIMHFAAQTHVDNSFGNSFEFTKNNIYGTHVLLEACKVAGNVRRFIHVSTDEVYGETDAEAVVGNHEASQLLPTNPYSATKAGAEMLVMAYGSSYGLPVITTRGNNVYGPGQFPEKLIAKFILLAMAGKPLPIHGDGSNVRSYLYCEDVAEAFEVILHKGEVGHIYNIGTTKERRVIDVAKDICKLFSLDADAVIKFVENRPFNDQRYFLDDQKLKKLGWSERTTWEEGLRKTMEWYTSNPDWWGDVSGALLPHPRMLMMPGIEKQFEGPADGNNMVFQLISPANQTKAVLPDLKITNGSSEKYLKFLIYGRTGWIGGLLGDICQKQGIPFEYGQGRLENRSQLLLDIQTVRPTHVFNAAGVTGRPNVDWCESHKPATIRTNVVGTLNLADVCMENGLLMMNYATGCIFEYNTDHPEGSGIGFKEEDNPNFTGSFYSKTKAMVEELLKEYDNVCTLRVRMPISSDLSNPRNFITKISRYNKVVNIPNSMTILDELLPISVEMAKRNCKGIWNFTNPGVVSHNEILEMYKKYIDPEFSWANFTLEEQAKVIIAPRSNNEMDASKLKNEFPELLPIKESLIKFVFEPNRKM

实施例2 DhuRHM蛋白诱导表达及纯化

将构建好的pET-28a-DhuRHM转化到BL21(DE3)化学感受态细胞中，携带有重组质粒的大肠杆菌在37℃下震荡培养至A600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，于16℃、200rpm/min的条件下诱导18h，离心收集菌体。用缓冲液(50mMTirs-HCl，pH＝7.5)洗菌后重悬，冰上超声破碎后低温离心(4℃，14000rpm，4min)，上清液即为DhuRHM蛋白粗酶。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳检测蛋白表达情况，Ni-NTA亲和色谱柱纯化蛋白。

结果显示(图2)，与pET-28a空载相比，pET-28a-DhuRHM纯酶和pET-28a-AtUGT78D1粗酶在75kDa和52kDa附近出现单一、清晰的条带，与预测的蛋白大小基本一致，为诱导表达的DhuRHM重组蛋白和At UGT78D1重组蛋白。pET-28a-DhuRHM粗酶在75kDa有条带，但并无无显著富集，猜测是由于未纯化前溶液中含有其他性质相似的杂蛋白，使得目的条带与其它条带相比并不显著，而纯化除去了大部分杂蛋白，使其出现单一、清晰的条带。

实施例3 AtUGT78D1载体构建及蛋白表达

NCBI网站下载AtUGT78D1基因序列，根据实施例1的方法进行pET-28a-AtUGT78D1的载体构建(引物见表1)；根据实施例2的操作进行AtUGT78D1重组蛋白的诱导表达。

结果显示(图2)，与pET-28a空载相比，pET-28a-DhuRHM纯酶和pET-28a-AtUGT78D1粗酶在75kDa和52kDa附近出现单一、清晰的条带，与预测的蛋白大小基本一致，为诱导表达的DhuRHM重组蛋白和At UGT78D1重组蛋白。

实施例4体外酶活检测

1、酶活反应体系：加入终浓度为0.5mmol/L UDP-Glc、0.1mmol/L槲皮素、0.5mmol/LNADPH、0.5mmol/L NAD+，AtUGT78D1粗酶液与DhuRHM粗酶液1:1的比例补足至400μL。以pET-28a空载替代DhuRHM作为阴性对照。配制终浓度都为0.1mol/m L的槲皮素、槲皮素3-O-葡萄糖苷、槲皮素3-O-鼠李糖苷的混合溶液作为阳性对照。体系在30℃水浴反应过夜，加入等体积甲醇终止反应，低温离心(4℃，14000×g，20min)，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，采用高效液相(Waters)分析，将DhuRHM的反应液冷冻干燥后乙腈复溶，经0.22μm微孔滤膜过滤后采用液相色谱-飞行时间质谱联用仪(6545Q-TOF LC/MS)分析。

2、HPLC条件

色谱柱XC18柱(4.6×250mm，粒径5μm)，流动相0.1％(V/V)甲酸水(A相)和乙腈(B相)，流速0.8mL·min-1，柱温30℃，进样量20μL，检测波长为366nm。梯度洗脱体系为5％～20％B(0～5min)、20％～22％B(5～8min)、22％～25％B(8～17min)、25％～35％B(17～23min)、35％～50％B(23～25min)、50％～95％B(25～32min)、95％B(32～37min)、95％～5％B(37～38min)、5％B(38～42min)。

3、LC-MS条件：

检测模式为负离子模式，毛细管电压3500V，鞘气温度280℃，鞘气流速为11L·min-1，气体温度320℃，干燥气体流速10L·min-1，喷嘴电压155V，流动相与HPLC一致，流速0.250mL·min-1。

4、检测结果：

HPLC检测结果显示(图3A),标准对照的出峰时间为：槲皮素-3-O-葡萄糖苷(S1)12.7min；槲皮素-3-O-鼠李糖苷(S2)15.1min；槲皮素(S3)25.2min。与对照组相比，重组表达载体与空载都在12.7min出现色谱峰，这暗示两组反应液中都有槲皮素-3-O-葡萄糖苷生成；两组反应都在25.2min处未发现明显峰，说明槲皮素基本全被AtUGT78D1酶催化为糖苷。重组表达载体与空载相比，在15.1min处出现色谱峰，空载却未见色谱峰，表明重组载体反应液中生成了UDP-Rha，才能在AtUGT78D1酶作用下生成槲皮素3-O-鼠李糖苷。为保证反应产物真实性，借助6545Q-TOF LC/MS进一步检测(图3B)，结果得到两个反应产物在负离子模式下的质荷比m/z分别为463.088、447.093，加1后与槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷标准品的分子量一致，验证了DhuRHM酶可以体外催化UDP-Glc生成UDP-Rha(反应示意图如图3C所示)。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种UDP-鼠李糖合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种UDP-鼠李糖合成酶基因，其序列为编码包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。

3.权利要求1所述UDP-鼠李糖合成酶在合成UDP-鼠李糖中的应用。

4.权利要求2所述UDP-鼠李糖合成酶基因在合成UDP-鼠李糖中的应用。

5.一种合成UDP-鼠李糖的方法，所述方法包含如下步骤：

1)获得如权利要求1所述的UDP-鼠李糖合成酶；

2)利用步骤1)中的UDP-鼠李糖合成酶在酶活反应体系中催化合成UDP-鼠李糖。

6.如权利要求5所述的一种合成UDP-鼠李糖方法，其特征在于，步骤1)中通过原核表达获得UDP-鼠李糖合成酶或通过化学合成获得UDP-鼠李糖合成酶。

7.如权利要求5所述的一种合成UDP-鼠李糖方法，其特征在于，步骤2)中酶活反应体系中含有如权利要求1所述的UDP-鼠李糖合成酶和UDP-Glc。

8.如权利要求5所述的一种合成UDP-鼠李糖方法，其特征在于，步骤2)中酶活反应体系中还含有缓冲液。

9.一种合成鼠李糖苷的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：

1)获得如权利要求1所述的UDP-鼠李糖合成酶；

2)利用步骤1)中UDP-鼠李糖合成酶在酶活反应体系中催化合成鼠李糖苷。

10.如权利要求9所述的一种合成鼠李糖苷的方法，其特征在于，步骤2)中酶活反应体系中含如权利要求1所述的UDP-鼠李糖合成酶、UDP-Glc、苷元以及可对苷元进行鼠李糖基化的糖基转移酶。