CN110616205B - 一种用于黄酮糖苷合成制备的黄酮合酶 - Google Patents

一种用于黄酮糖苷合成制备的黄酮合酶 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种黄酮合酶及其在黄酮糖苷类化合物的应用。所述黄酮合酶选自：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽；或(b)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或(c)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。该黄酮合酶可实现包括橙皮苷在内的多种黄酮类糖苷化合物的转化和制备，且具有更优的催化效率，具有优于现有的化学合成方法，能够用于黄酮类化合物细胞工厂的构建与优化。

Description

一种用于黄酮糖苷合成制备的黄酮合酶
技术领域
本发明涉及生物酶技术领域，特别涉及一种黄酮合酶，以及该黄酮合酶的应用。
背景技术
黄酮类化合物是结构多样性高的重要植物天然化合物，目前已经分离到了9000多种不同结构的黄酮类化合物，按结构可以分为黄酮(flavones)、黄烷酮(flavanones)、异黄酮(isoflavone)、黄烷醇(flavanols)、黄酮醇(flavonols)和花青素(anthocyanidines)等不同类型。黄酮类化合物除少数游离外，大多与糖结合成苷。黄酮类化合物不但对于植物的生理、生态和农业有广泛的用途，而且在癌症和心血管等疾病防治方面也显著的疗。例如，地奥司明(Diosmin)是黄酮类化合物中的一种天然成分，存在于植物、水果和蔬菜中，蓬子菜、柑橘果实果皮等多种药食同源的天然植物中含量丰富，具有改善糖脂代谢，降低血糖、降血脂、预防尿酸、增加静脉张力，保护血管、抗炎、抗氧化、减少红细胞聚集、降低血沉及抗血栓等药理功效，被广泛用于治疗静脉疾病、急性痔疮、神经病理性疼痛、减轻局部炎症、作为微循环调节剂减轻慢性非细菌性前列腺炎组织炎症反应，改善前列腺组织的病理损伤，对前列腺组织起到明显保护作用等方面(朱春华等，香叶木苷的生物合成及其抗肿瘤活性，公共卫生与预防医学，2019年)。新地奥明(Neodiosmin)是从酸橙分离出来得到的一种黄酮类糖苷化合物，也可通过新橙皮苷(Neohesperidin)获取，具有较好的掩蔽苦味与调和产品风味的作用，在食品、饮料和药品的苦味抑制方面起着积极的作用(鲁明芳，新地奥明在抑制柑橘类果汁苦味中的应用，中国食品添加剂，2007年)。由于具有良好的应用前景使得黄酮类化合物在生产开发与设计方面也越来越受到重视，因此，如何大量制备这些黄酮类化合物也受到了越来越多的关注。
黄酮类糖苷化合物的生物合成途径涉及多种酶，包括黄酮合成酶、羟基化酶、甲基化酶和一系列糖基转移酶，途径复杂，工业上难以应用。地奥司明在植物中含量低，工业上主要通过化学合成法来制备，主要有两种方法，一是橙皮苷(hesperidin)水氧化反应后水解成地奥司明，二是橙皮苷经碘取代反应后用吗啉脱碘反应生成地奥司明。近年来受资源供应制约、生产成本及环保等因素的影响，使用生物合成法生产黄酮类化合物得到越来越多的研究和发展。黄酮合酶(FNS)是存在植物中的一中双加氧酶，可以将低成本的黄烷酮化合物价值的黄酮化合物，例如将柚皮素转化为芹菜素。通过蛋白分子改造和定向进化筛选，使得黄酮合酶(FNS)可以将黄烷酮糖苷类化合物转化为黄酮糖苷类化合物，例如将橙皮苷转化为地奥司明，新橙皮苷转化为新地奥明。相比传统的化学合成法和植物提取法，具有低成本、周期短、环保和品质高等优势的细胞工厂，将具有更为广泛的应用前景。
发明内容
本技术公开的FNS I可实现包括地奥司明在内的多种黄酮糖苷类化合物的转化和制备。
本发明公开的黄酮合酶选自：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列有至少85％(较佳地至少90％；更佳地至少95％)序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。
优选地，所述(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。
本发明同时还公开了编码上述黄酮合酶的多核苷酸。优选地，该多核苷酸的序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
在本发明的另一方面，提供一种载体，含有前述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞，常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等；所述的真菌细胞包括酵母细胞。
在本发明的另一方面，提供上述黄酮合酶的制备方法，其包括步骤：
1)在适合表达的条件下，培养所述宿主细胞；
2)从培养物中分离出黄酮合酶。
针对不同的宿主细胞可以分别进行表达工艺的优化，包括不同成分的培养基和培养条件，以及优化培养基的碳源、氮源和无机盐；优化培养时的温度、转速。
制得的黄酮合酶可应用于将黄烷酮类糖苷化合物氧化脱氢转化为黄酮类糖苷化合物。具体是以α-酮戊二酸为辅因子，在pH＝5-9，温度20-45℃的条件下，将黄烷酮类糖苷化合物氧化脱氢转化为黄酮类糖苷化合物。例如，将橙皮苷转化为地奥司明。
本发明公开的黄酮合酶具有FNS I的转化效率，能够用于黄酮化合物细胞工厂的构建与优化。
附图说明
图1为黄酮合酶DcFNS和AgFNS琼脂糖凝胶电泳图；
图2为大肠杆菌BL21表达黄酮合酶DcFNS和AgFNS的Westernblot图；
图3为黄酮合酶DcFNS和AgFNS催化橙皮苷反应产物的HPLC检测图；
图4为大肠杆菌BL21表达黄酮合酶DcFNS和AgFNS催化橙皮苷效率比较图；
图5为毕赤酵母菌GS115表达黄酮合酶DcFNS和AgFNS的Western blot图；
图6为毕赤酵母菌GS115表达黄酮合酶DcFNS和AgFNS催化橙皮苷效率比较图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
通过对多种植物的基因组和转录组数据进行数据挖掘分析，从中分别获得黄酮合酶的核苷酸候选序列DcFNS(SEQ ID NO:3)和AgFNS(SEQ ID NO:4)。通过在大肠杆菌中表达该序列，制备含有该序列表达产物的粗酶液，以α-酮戊二酸为辅因子，通过体外催化和全细胞催化检测其对橙皮苷的催化活性。本发明发现DcFNS和AgFNS表达产物能够高效催化橙皮苷合成具有高附加值和多种重要生理活性的地奥司明。
实施例1.黄酮合酶DcFNS的克隆及其在大肠杆菌中表达
合成如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的两条引物，以从植物提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KOD DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃2min，共35个循环；68℃10min降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1。
在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用Axygen GelExtraction Kit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的黄酮合酶基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)的PMD18-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到PMDT载体，所构建的载体命名为PMDT-DcFNS。经测序获得DcFNS的基因序列。
DcFNS基因具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列。自SEQ ID NO:3的5’端第1-1074位核苷酸为DcFNS的开放阅读框(Open ReadingFrame,ORF)，自SEQ ID NO:3的5’端的第1-3位核苷酸为DcFNS基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:3的5’端的第1072-1074位核苷酸为DcFNS基因的终止密码子TAG。黄酮合酶DcFNS编码一个含有357个氨基酸的蛋白质DcFNS，具有SEQ ID NO:1的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为40.2kDa，等电点pI为6.23。
合成如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的两条引物，在合成的引物，两端分别加BamH I和Xho I两个酶切位点，以质粒PMDT-DcFNS为模板进行PCR。PCR扩增程序同上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后的PCR产物利用Vazyme公司的One-stepmutisclone kit连入经BamH I和Xho I双酶切的pET28a载体(Invitrogen公司)中。所获得的重组质粒命名为pET28a-DcFNS。
将重组质粒pET28a-DcFNS及空载体pET28a转化大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组大肠杆菌BL21-pET28a-DcFNS和BL21-pET28a。
分别接种BL21-pET28a-DcFNS和BL21-pET28a到LB培养基中，37℃200rpm培养至OD600约0.6-0.8，使菌液降温至4℃，加入终浓度为50μM的IPTG，18℃，200rpm诱导表达15h。4℃离心收集菌体，加入裂解buffer(50mM磷酸盐缓冲液、1mM EDTA、1mM DTT，pH 7.4)重悬菌体，超声破碎细胞，4℃12000g离心收集细胞裂解液上清，取样品进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析，结果如附图2。
实施例2.黄酮合酶DcFNS催化橙皮苷反应
以实施例1获得的BL21-pET28a-DcFNS和BL21-pET28a裂解液上清为粗酶液，配置如下反应体系(100μL)：
Figure BDA0002218720690000071
在30℃水浴下反应2h。反应结束后加入等体积的乙酸乙酯抽提，取上层乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于100μL甲醇中，结果用HPLC检测，结果如附图3和附图4，转化率为52.9％。
从图3中结果可以看出含有黄酮合酶DcFNS的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-DcFNS可以催化橙皮苷形成一种新的产物其在HPLC的保留时间与地奥司明标准品一致，而对照组含有空载体pET28a的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a催化橙皮苷则没有该产物生成。结果表明，本发明中发现的黄酮合酶DcFNS能催化黄烷酮糖苷类化合物橙皮苷的C3位脱氢反应合成地奥司明。
实施例3.黄酮合酶DcFNS全细胞催化橙皮苷反应
将实施案例1获得的BL21-pET28a-DcFNS重组子接种到LB培养基中(添加50μg/mL卡那霉素)，37℃200rpm培养至OD600达到0.6-0.8。菌液置于冰水中冷却，加入200μM IPTG，16℃110rpm诱导培养18h。4℃离心收集细胞，用50mM Tris-HCl(pH7.4)重悬。加入终浓度100mM的橙皮苷和50mMα-酮戊二酸，30℃孵育8h。加入等体积乙酸乙酯对反应液进行抽提，12 000rpm离心10min，取上层乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于100μL甲醇中，结果用HPLC检测，转化率为59.7％，较粗酶液转化率高。
实施例4.黄酮合酶AgFNS的克隆及其在大肠杆菌中表达
合成如序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的两条引物，以从植物提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KODDNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃2min，共35个循环；68℃10min降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1。
在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用Axygen GelExtraction Kit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的黄酮合酶基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)的PMD18-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到PMDT载体，所构建的载体命名为PMDT-AgFNS。经测序获得AgFNS的基因序列。
AgFNS基因具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列。自SEQ ID NO:4的5’端第1-1068位核苷酸为AgFNS的开放阅读框，自SEQ ID NO:4的5’端的第1-3位核苷酸为AgFNS基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:4的5’端的第1066-1068位核苷酸为AgFNS基因的终止密码子TGA。黄酮合酶AgFNS编码一个含有355个氨基酸的蛋白质AgFNS，具有SEQ ID NO:1的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为40.0kDa，等电点pI为5.91。
合成如序列表中SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的两条引物，在合成的引物，两端分别加BamH I和Xho I两个酶切位点，以质粒PMDT-AgFNS为模板进行PCR。PCR扩增程序同上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后的PCR产物利用Vazyme公司的One-stepmutisclone kit连入经BamH I和Xho I双酶切的pET28a载体中。所获得的重组质粒命名为pET28a-AgFNS。
将重组质粒pET28a-AgFNS转化大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组大肠杆菌BL21-pET28a-AgFNS。
分别接种BL21-pET28a-AgFNS和BL21-pET28a到LB培养基中，37℃200rpm培养至OD600约0.6-0.8，使菌液降温至4℃，加入终浓度为50μM的IPTG，18℃，200rpm诱导表达15h。4℃离心收集菌体，加入裂解buffer(50mM磷酸盐缓冲液、1mM EDTA、1mM DTT，pH 7.4)重悬菌体，超声破碎细胞，4℃12000g离心收集细胞裂解液上清，取样品进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析，结果如附图2。
实施例5.黄酮合酶AgFNS催化橙皮苷反应
以实施例1获得BL21-pET28a-AgFNS和BL21-pET28a裂解液上清为粗酶液，配置如下反应体系(100μL)：
Figure BDA0002218720690000101
在30℃水浴下反应2h。反应结束后加入等体积的乙酸乙酯抽提，取上层乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于100μL甲醇中，结果用HPLC检测，结果如附图3和附图4，转化率为38.4％。
从图3中结果可以看出含有黄酮合酶AgFNS的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-AgFNS可以催化橙皮苷形成一种新的产物其在HPLC的保留时间与地奥司明标准品一致，而对照组含有空载体pET28a的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a催化柚皮素则没有该产物生成。结果表明，本发明中发现的黄酮合酶AgFNS能催化黄烷酮糖苷类化合物橙皮苷的C3位脱氢反应合成芹菜素。
实施例6.黄酮合酶AgFNS全细胞催化橙皮苷反应
将实施案例4获得的BL21-pET28a-AgFNS重组子接种到LB培养基中(添加50μg/mL卡那霉素)，37℃200rpm培养至OD600达到0.6-0.8。菌液置于冰水中冷却，加入200μM IPTG，16℃110rpm诱导培养18h。4℃离心收集细胞，用50mM Tris-HCl(pH7.4)重悬。加入终浓度100mM的橙皮苷和50mMα-酮戊二酸，30℃孵育8h。加入等体积乙酸乙酯对反应液进行抽提，12 000rpm离心10min，取上层乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于100μL甲醇中，结果用HPLC检测，转化率为45.8％，较粗酶液转化率高。
实施例7.黄酮合酶DcFNS在毕赤酵母中表达
合成如序列表中SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的两条引物，在合成的引物，两端分别加Sal I和Not I两个酶切位点，以质粒PMDT-DcFNS为模板进行PCR。PCR扩增程序同上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后的PCR产物利用Vazyme公司的One-stepmutisclone kit连入经Sal I和Not I双酶切的pPIC9K载体中。所获得的重组质粒命名为pPIC9K-DcFNS。
将重组质粒pPIC9K-DcFNS转化大肠杆菌Top10中构建重组大肠杆菌Top10-pPIC9K-DcFNS。
从Top10-pPIC9K-DcFNS中提取重组质粒pPIC9K-DcFNS，采用Sal I线性化重组质粒pPIC9K-DcFNS和空载质粒pPIC9K后，采用电转化法将其转入毕赤酵母GS115细胞，筛选阳性克隆，分别命名为GS115-pPIC9K-DcFNS和GS115-pPIC9K。
分别接种GS115-pPIC9K-DcFNS和GS115-pPIC9K到分别用YPD液体培养基活化20h，按照1％的接种量接种于装有50mL BMGY培养基中，30℃200r/min培养OD600到2～6。室温条件下3000g离心5min，收集菌体，用5ml BMMY(pH 6.0)重悬菌体，30℃200r/min诱导表达，每24h向培养基中添加终浓度为0.5％的甲醇，维持诱导条件。诱导表达5day，4℃12 000g离心收集菌体，上清液即为粗酶液，取样品进行Western blot分析，结果如附图5。
毕赤酵母表达DcFNS产生的粗酶液催化柚皮素反应参照实施例2进行，结果如附图6。结果表明毕赤酵母表达的DcFNS酶活较大肠杆菌表达的高，产酶量更多。
实施例8.黄酮合酶AgFNS在毕赤酵母中表达
合成如序列表中SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的两条引物，在合成的引物，两端分别加Sal I和Not I两个酶切位点，以质粒PMDT-AgFNS为模板进行PCR。PCR扩增程序同上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后的PCR产物利用Vazyme公司的One-step mutisclone kit连入经Sal I和Not I双酶切的pPIC9K载体中。所获得的重组质粒命名为pPIC9K-AgFNS。
将重组质粒pPIC9K-AgFNS转化大肠杆菌Top10中构建重组大肠杆菌Top10-pPIC9K-AgFNS。
从Top10-pPIC9K-AgFNS中提取重组质粒pPIC9K-AgFNS，采用Sal I线性化pPIC9K-AgFNS后，采用电转化法将其转入毕赤酵母GS115细胞，筛选阳性克隆，分别命名为GS115-pPIC9K-AgFNS。
分别接种GS115-pPIC9K-AgFNS和GS115-pPIC9K(实施例9)到分别用YPD液体培养基活化20h，按照1％的接种量接种于装有50mL BMGY培养基中，30℃200r/min培养OD600到2～6。室温条件下3000g离心5min，收集菌体，用5ml BMMY(pH 6.0)重悬菌体，30℃200r/min诱导表达，每24h向培养基中添加终浓度为0.5％的甲醇，维持诱导条件。诱导表达5day，4℃12 000g离心收集菌体，上清液即为粗酶液，取样品进行Western blot分析，结果如附图5。
毕赤酵母表达AgFNS产生的粗酶液催化橙皮苷反应参照实施例5进行，结果如附图6。结果表明毕赤酵母表达的AgFNS酶活较大肠杆菌表达的高，产酶量更多。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山市汇腾生物技术有限公司
<120> 一种用于黄酮糖苷合成制备的黄酮合酶
<130> 2019
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 357
<212> PRT
<213> 未知来源
<400> 1
Met Ala Pro Ser Thr Ile Thr Ala Leu Ser Lys Glu Lys Thr Leu Asn
1 5 10 15
Leu Asp Phe Val Arg Asp Glu Asp Glu Arg Pro Lys Val Ala Tyr Asn
20 25 30
Gln Phe Ser Asn Glu Ile Pro Ile Ile Ser Leu Ala Gly Leu Asp Asp
35 40 45
Asp Ser Asn Gly Arg Arg Pro Glu Val Cys Arg Lys Ile Val Lys Ala
50 55 60
Cys Glu Asp Trp Gly Ile Phe Gln Val Val Asp His Gly Ile Asp Ser
65 70 75 80
Gly Leu Ile Ser Glu Met Ser Arg Leu Ser Arg Glu Phe Phe Ala Leu
85 90 95
Pro Ala Glu Glu Lys Leu Val Tyr Asp Thr Thr Gly Gly Lys Lys Gly
100 105 110
Gly Phe Thr Ile Ser Thr His Leu Gln Gly Asp Asp Val Arg Asp Trp
115 120 125
Arg Glu Phe Val Val Tyr Phe Ser Tyr Pro Val Ser Ala Arg Asp Tyr
130 135 140
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210 215 220
Thr Ile Leu Leu Gln Asp Met Val Gly Gly Leu Gln Ala Thr Arg Asp
225 230 235 240
Gly Gly Lys Thr Trp Ile Thr Val Gln Pro Val Glu Gly Ala Phe Val
245 250 255
Val Asn Leu Gly Asp His Gly His Tyr Leu Ser Asn Gly Arg Phe Arg
260 265 270
Asn Ala Asp His Gln Ala Val Val Asn Ser Thr Ser Ser Arg Leu Ser
275 280 285
Ile Ala Thr Phe Gln Asn Pro Ala Gln Asn Ala Ile Val Tyr Pro Leu
290 295 300
Lys Ile Arg Glu Gly Glu Lys Ala Ile Leu Asp Glu Ala Ile Thr Tyr
305 310 315 320
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325 330 335
Arg Lys Lys Leu Ala Lys Glu Lys Arg Leu Gln Asn Glu Lys Ala Lys
340 345 350
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355
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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<213> 未知来源
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cgtgatgagg atgaacgccc aaaagtggcg tacaaccagt tcagcaacga gatcccgatt 120
atcagcctcg ccggcctcga tgatgatagc aacggccgtc gtccggaagt gtgccgcaag 180
atcgtgaaag cgtgtgaaga ttggggcatc ttccaagttg tggatcacgg tattgacagc 240
ggtctgatca gcgagatgag tcgtctgagc cgcgaatttt tcgcgctgcc ggccgaggag 300
aaactggttt atgacaccac gggcggtaag aagggtggct tcacgatcag cacgcatctc 360
caaggcgacg atgttcgcga ttggcgcgag ttcgtggtgt acttcagcta cccggtgagc 420
gcccgcgatt atagtcgctg gccgaaaaaa ccggagggtt ggcgtagcac gaccgaggtg 480
tatagcgaga agctgatggt tctgggtgcg aaactgctcg aagtgctgag cgaggcgatg 540
ggtctggaaa aggaagccct caccgaggcg tgcgtggaga tggagcagaa agtgctcatc 600
aactactacc cgacgtgccc gcagccagat ctcacgctgg gtgttcgccg tcataccgat 660
ccgggtacca tcaccattct gctgcaagat atggtgggtg gtctgcaagc cacgcgtgat 720
ggcggcaaga cgtggatcac ggttcagcca gtggaaggcg ccttcgttgt gaatctgggt 780
gatcatggcc actatctgag caacggtcgc ttccgcaatg cggaccatca agccgttgtt 840
aatagcacca gtagccgtct gagcattgcc accttccaga atccggcgca gaacgccatc 900
gtgtacccgc tgaagatccg cgaaggcgaa aaagcgattc tggacgaagc catcacctac 960
gcggaaatgt acaagaaaaa catgaccaag catatcgaag tggcgacccg caagaagctc 1020
gccaaagaga agcgtctgca gaacgaaaag gcgaagctgg agatgaaaag ctga 1074
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atcgtggagg ccttcgagga gtggggtatc ttccaagttg tggatcacgg tatcgacacg 240
ggtctgatca gcgagatggc gcgtctgagt cgcgaatttt tcgccctccc ggccgaagaa 300
aaactggtgt acgatacgac cggcggtcgc aagggtggtt tcaccattag cacgcatctc 360
caaggcgacg acgttcgtga ttggcgcgaa ttcgcgacct atttcagcta cccaattagc 420
gcccgcgatt atagccgctg gccgaaaaag ccagaaggct ggcgcagcac gagcgaggtt 480
tacagcgaaa agctgatggt gctcggcgcc aaactgctgg aagtgctcag cgaagcgatg 540
ggtctggaaa aggaagccct cagtaaagcg tgcgtgaaca tggagcagaa ggtgctgatc 600
aactactacc cgacgtgccc agaaccagat ctgacgctgg gcgttcgccg tcatacggat 660
ccgggcacca tcaccattct gctccaagat atggttggtg gtctgcaagc cacgcgtgat 720
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Claims (1)

1.催化橙皮苷的方法，其特征在于，以宿主细胞接种到添加有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃200rpm培养至OD600达到0.6-0.8，菌液置于冰水中冷却，加入200μMIPTG，16℃110rpm诱导培养18h，4℃离心收集细胞，用pH7.4的Tris-HCl 50mM重悬，加入终浓度100mM的橙皮苷和50mMα-酮戊二酸，30℃孵育8h；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21，含有如SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4所示的多核苷酸。
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CN101514344A (zh) * 2009-02-19 2009-08-26 上海交通大学 黄酮合成酶基因及其编码的多肽

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Title
"Molecular evolution of flavonoid dioxygenases in the family Apiaceae";Gebhardt 等;《Phytochemistry》;20050630;第66卷(第11期);第1276页左栏第2段，图5 *
"苔类植物羟基肉桂酰转移酶功能鉴定和黄酮合成酶催化机制研究";王平平;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》;20181130(第11期);正文第15页第2段 *
Gebhardt 等."Molecular evolution of flavonoid dioxygenases in the family Apiaceae".《Phytochemistry》.2005,第66卷(第11期), *

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