CN107880134B

CN107880134B - 一种酶促合成山奈酚的方法

Info

Publication number: CN107880134B
Application number: CN201711126059.5A
Authority: CN
Inventors: 张新跃; 张智萍; 何妍之; 黄岳; 陈磊; 丁笠; 刘雅娴
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2017-11-15
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2037-11-15
Also published as: CN107880134A

Abstract

本发明公开了一种酶促合成山奈酚的方法，其中涉及两种融合蛋白TrxA‑His‑F3H、TrxA‑His‑FLS1的制备及酶活性检测，并设计缓冲液体系，反应缓冲液为0.1 M Tris‑HCl（pH7.2），100μL反应体系中含有0.4%抗坏血酸、10%甘油、8.2 mMα‑酮戊二酸、0.01 mM硫酸亚铁、0.5 mM柚皮素、3.3μg TrxA‑His‑F3H、1.8μg TrxA‑His‑FLS1；并通过优化反应体系pH值、反应时间和温度，在体外建立一步高效合成山奈酚的方法。CCK‑8法检测合成的山奈酚对肿瘤细胞生长的抑制作用。

Description

一种酶促合成山奈酚的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种酶促合成山奈酚的方法。

背景技术

山奈酚是一种广泛存在于水果、蔬菜和中草药中的次生代谢产物——黄酮醇类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等多种生物学功能，且安全无毒，在食品和医药领域具有良好的应用前景(张雅雯等.山奈酚生物功能研究进展.生命科学,2017；29(4):400-5)。

目前，山奈酚的常用制备方法是有机溶剂提取法，然而该方法步骤繁琐复杂、周期长、得率低、成本高，需要用到大量的有机溶剂，而且原材料的来源易受到季节的限制，因而不利于工业化生产。获得山奈酚的另外一种方法是化学合成法。该方法不仅合成步骤繁琐复杂、反应条件苛刻、反应催化剂多为有毒物品、产率低，且区域选择性差、易产生大量的副产物，因而增加了分离纯化的难度和生产成本，极大地限制了山奈酚的工业化生产。

近年来，随着对黄酮类化合物生物合成途径的逐步阐明，学者们开始尝试用生物转化法在微生物体内合成黄酮类化合物，并取得了成功。如Sailesh Malla等(Malla S,etal.Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production inescherichia coli.Biotechnology and bioengineering,2013,110:2525-2535)将拟南芥的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因和黄烷酮合酶(FLS)基因以及大豆的类黄酮-3-O-糖基转移酶(UGT78K1)基因转入大肠杆菌BL21，利用大肠杆菌的内源性葡萄糖途径合成的UDPG作为糖基供体，将柚皮素进行特异性修饰，最终了合成紫云英苷。然而，采用微生物发酵法生产黄酮类化合物仍然存在很多缺点。首先，合成途径中涉及到的关键酶以及合成过程中产生的中间产物会抑制宿主菌的生长。其次，在菌体生长前期涉及到多个基因的表达，而且基因之间的协同表达缺乏一种理性的调控方式，给宿主菌带来较大的代谢负担。最后，为了提高产量，敲除大肠杆菌体内的某些代谢途径同样会影响菌体的生长。

发明内容

本发明要解决的问题：克服目前山奈酚生产方法的局限性，提供一种酶促合成山奈酚的方法，是一种在生物酶的作用下高效合成山奈酚的新方法。

本发明所采用的技术方案如下：

1.山奈酚生物合成途经中关键酶的克隆、表达和纯化

从拟南芥中克隆黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因f3h和黄烷酮合酶(FLS)基因fls1至原核表达载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-f3h和pET-32a-fls1，按常规方法诱导表达和纯化融合蛋白。

具体包括：

一种融合蛋白TrxA-His-F3H，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：

(1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

所述的融合蛋白TrxA-His-F3H的制备方法，包括以下步骤：

(1)黄烷酮-3-羟化酶(F3H)基因f3h的克隆：f3h基因的PCR扩增，连接到载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-f3h；

(2)将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，利用镍琼脂糖凝胶纯化融合蛋白。

进一步地，步骤(1)中f3h基因的PCR扩增，设计两对引物分别为：

正向引物为

斜体碱基示酶切位点BamHI；

反向引物为

斜体碱基示酶切位点EcoRI。

一种融合蛋白TrxA-His-FLS1，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：

(1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

上述融合蛋白TrxA-His-FLS1的制备方法，包括以下步骤：

(1)黄烷酮合酶(FLS)基因fls1的克隆：fls1基因的PCR扩增，连接到载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-fls1；

进一步地，步骤(1)中fls1基因的PCR扩增，设计两对引物分别为：

正向引物为

斜体碱基示酶切位点BamHI；

反向引物为

斜体碱基示酶切位点EcoRI。

2.融合蛋白TrxA-His-F3H和TrxA-His-FLS1的酶活性检测

2.1融合蛋白TrxA-His-F3H的黄烷酮3-羟化酶活性检测：参照文献中的反应体系，用聚酰胺薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱质谱法(HPLC/MS)检测融合蛋白TrxA-His-F3H将柚皮素(NRN)转化为二氢山奈酚(DHK)的催化能力。

2.2融合蛋白TrxA-His-FLS1的黄酮醇合酶活性检测：参照文献中的反应体系，用聚酰胺TLC法和HPLC/MS法检测融合蛋白TrxA-His-FLS1将DHK转化为山奈酚(KMF)的催化能力。

3.一步法合成体系的建立

设计缓冲液体系，反应缓冲液为0.1M Tris-HCl(pH7.2)，100μL反应体系中含有0.4％抗坏血酸、10％甘油、8.2mMα-酮戊二酸、0.01mM硫酸亚铁、0.5mM柚皮素、3.3μg TrxA-His-F3H、1.8μg TrxA-His-FLS1；

并通过优化反应体系pH值、反应时间和温度，在体外建立一步高效合成山奈酚的方法，上述反应体系在恒温摇床反应40min、温度40℃、转速250rpm。

4.CCK-8法检测合成的山奈酚对肿瘤细胞生长的抑制作用。

发明效果

1、本发明开发了一种制备融合蛋白TrxA-His-F3H的方法，该方法具有设备简单、易操作、效率高、成本低、周期短等特点，制备的融合蛋白具有黄烷酮3-羟化酶活性，其纯度超过95％。

2、本发明开发了一种制备融合蛋白TrxA-His-FLS1的方法，该方法具有设备简单、易操作、效率高、成本低、周期短等特点，制备的融合蛋白具有黄烷酮合酶活性，其纯度超过95％。

3、本发明开发了一种在体外高效酶促合成山奈酚的新方法，最终产量为31.94±1.14mg/L，合成的山奈酚对肿瘤细胞MCF-7的生长具有明显的抑制作用，其IC50为63.25μM。

附图说明

图1 SDS-PAGE电泳分析纯化的融合蛋白。M，蛋白质分子量标准品；1，融合蛋白TrxA-His-F3H；2，融合蛋白TrxA-His-FLS1。

图2分析融合蛋白TrxA-His-F3H和TrxA-His-FLS1的酶活性及一步合成山奈酚的结果图。A，聚酰胺TLC法分析融合蛋白TrxA-His-F3H的黄烷酮3-羟化酶活性。1，反应产物。B，聚酰胺TLC法分析融合蛋白TrxA-His-FLS1的黄酮醇合酶活性。1，反应产物。C，聚酰胺TLC法分析从山奈酚的一步合成。1，反应产物。D，HPLC法分析融合蛋白TrxA-His-F3H和TrxA-His-FLS1的酶活性及山奈酚的一步合成。

图3 NRN、DHK和KMF的质谱分析结果图。

图4 CCK-8法测定合成的山奈酚对肿瘤细胞生长抑制的结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式进一步阐述本发明。

实施例

1.山奈酚生物合成途经中关键酶基因的克隆、诱导表达和纯化

1.1黄烷酮-3-羟化酶(F3H)基因f3h的克隆：设计PCR扩增引物，正向引物为

斜体碱基示酶切位点BamHI，反向引物为

斜体碱基示酶切位点EcoRI。从拟南芥克隆f3h基因(基因登录号为NM_001203121.1)至原核表达载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-f3h。

1.2黄烷酮合酶(FLS)基因fls1的克隆：设计PCR扩增引物，正向引物为

斜体碱基示酶切位点BamHI，反向引物为

斜体碱基示酶切位点EcoRI。从拟南芥克隆fls1基因(基因登录号为NM_120951.3)至原核表达载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-fls1。

1.3基因的诱导表达与纯化：将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，得到融合蛋白TrxA-His-F3H、TrxA-His-FLS1，利用镍琼脂糖凝胶纯化融合蛋白,10％SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度，结果如图1所示，融合蛋白的纯度均为95％以上。上述融合蛋白TrxA-His-F3H、具有如下氨基酸序列：

(1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

上述融合蛋白TrxA-His-FLS1，具有如下氨基酸序列：

(1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

2.融合蛋白的酶活性检测

2.1融合蛋白TrxA-His-F3H的酶活性检测

反应缓冲液为100mM Tris-HCl(pH7.5)，100μL反应体系中含有0.4％抗坏血酸、10％甘油、0.174mMα-酮戊二酸、0.1mM硫酸亚铁、0.5mM柚皮素和3.3μg融合蛋白TrxA-His-F3H。

将上述反应体系在恒温摇床中反应45min，温度30℃，转速250rpm。反应产物经等体积乙酸乙酯萃取2h，收集有机相，挥干后用甲醇溶解，再用聚酰胺薄层色谱法和高效液相色谱质谱法进行分析，检测数据如图2和图3所示，制备的融合蛋白TrxA-His-F3H能将柚皮素转化为二氢山奈酚，因而具有黄烷酮3-羟化酶活性。

薄层色谱检测条件：展开剂氯仿与甲醇比例为2:1，加入0.5mL甲酸防止拖尾；显色剂为1％的三氯化铝乙醇溶液。

高效液相色谱质谱联用仪的检测条件：

检测前样品处理：反应组和对照组以及标准品用优级甲醇稀释到1mL离心管中，依次用0.45μm和0.22μm滤器过滤到样品瓶中，进行高效液相分析。

仪器设备:美国安捷伦公司6460液质联用仪(Agilent 1200-6460QQQ)。

(1)色谱条件具体如下：

色谱柱：Agilent C18column(150×4.6mm,5μm,Thermo FisherScientific.Inc.,San Jose,CA,USA)。柱温：30℃。

流动相：A(蒸馏水)，B(乙腈)，梯度洗脱：0-10min,A:90％-75％,B:10％-25％；10-35min,75％-50％,B:25％-50％；35-45min,A:50％-15％,B:50％-85％；45-50min,A:15％-90％,B:85％-10％；50-60min,A:90％,B:10％。

进样量：10μL；流速：1mL/min，柱后分流流速：0.2mL/min；

检测器：光电二级阵列管检测器(DAD)；

检测波长：λ＝280nm；330nm；370nm。

(2)质谱条件具体如下：电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式，全扫描(m/z):50-2000，气体流速45arb，辅助吹气流速0arb，电子喷雾电压5.00KV，毛细管温度300.00℃，毛细管电压20.00V，管路偏移电压30.00V。

2.2融合蛋白TrxA-His-FLS1的酶活性检测

反应缓冲液为0.1M Tris-HCl(pH7.2)，100μL反应体系中含有0.4％抗坏血酸、10％甘油、8.2mMα-酮戊二酸、0.01mM硫酸亚铁、0.5mM二氢山奈酚和1.8μg融合蛋白TrxA-His-FLS1。

将上述反应体系在恒温摇床中反应3h，温度30℃，转速250rpm。反应产物经等体积乙酸乙酯萃取2h，收集有机相，挥干后用甲醇溶解，再用聚酰胺薄层色谱法和高效液相色谱质谱法进行分析，检测数据如图2和图3所示，制备的融合蛋白TrxA-His-FLS1能将二氢山奈酚转化为山奈酚，因而具有黄酮醇合酶活性。

薄层色谱检测条件：展开剂氯仿、甲醇和乙酸乙酯的比例为4:1.5:1.5，加入0.5mL甲酸防止拖尾；显色剂为1％的三氯化铝乙醇溶液。

高效液相色谱液质联用仪的检测条件：同2.1。

3.山奈酚的一步法合成

反应缓冲液为0.1M Tris-HCl(pH7.2)，100μL反应体系中含有0.4％抗坏血酸、10％甘油、8.2mMα-酮戊二酸、0.01mM硫酸亚铁、0.5mM柚皮素、3.3μg TrxA-His-F3H、1.8μgTrxA-His-FLS1。

上述反应体系在恒温摇床反应40min、温度40℃、转速250rpm。反应产物经等体积乙酸乙酯萃取2h，收集有机相，挥干后用甲醇溶解，再用聚酰胺薄层色谱法和高效液相色谱质谱法进行分析，检测数据如图2和图3所示。

薄层色谱检测条件：同2.1。

高效液相色谱液质联用仪的检测条件：同2.1。

4.CCK-8法检测合成的山奈酚对肿瘤细胞生长的抑制作用。

胰酶消化、计数处于对数生长期的MCF7乳腺癌细胞，制成4×10⁴/mL细胞悬液，接种至96孔细胞培养板，每孔加入100μL细胞悬液(4000个细胞每孔)。设置空白孔(有培养基，无细胞)和对照孔(培养基不加药，有细胞)，每组设定5个复孔。置CO₂培养箱于37℃、5％CO₂孵育过夜，每孔加入100μl待检测药物(用培养基系列稀释山奈酚浓度为0、12.5、25、50、100、200mM)，于37℃、5％CO₂孵育2天。弃去培养基，每孔加入100μl新鲜培养基及10μl CCK-8溶液，于37℃、5％CO₂继续孵育4h。测定各孔450nm的吸光值OD_450nm，参考波长为630nm。各重复孔的OD_450nm值取平均数。计算细胞活力％＝(加药细胞OD_450nm-空白OD_450nm)/(对照细胞OD_450nm-空白OD_450nm)×100％。检测数据如图4所示，体外酶促合成的山奈酚具有抑制肿瘤细胞生长的活性，其IC50为63.25μM。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种酶促合成山奈酚的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工()

<400> 1

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Ser Met Thr Arg Leu Ala Arg Asp Phe Phe Ala Leu

165 170 175

Pro Pro Glu Asp Lys Leu Arg Phe Asp Met Ser Gly Gly Lys Lys Gly

180 185 190

Gly Phe Ile Val Ser Ser His Leu Gln Gly Glu Ala Val Gln Asp Trp

195 200 205

Arg Glu Ile Val Thr Tyr Phe Ser Tyr Pro Val Arg Asn Arg Asp Tyr

210 215 220

Ser Arg Trp Pro Asp Lys Pro Glu Gly Trp Val Lys Val Thr Glu Glu

225 230 235 240

Tyr Ser Glu Arg Leu Met Ser Leu Ala Cys Lys Leu Leu Glu Val Leu

245 250 255

Ser Glu Ala Met Gly Leu Glu Lys Glu Ser Leu Thr Asn Ala Cys Val

260 265 270

Asp Met Asp Gln Lys Ile Val Val Asn Tyr Tyr Pro Lys Cys Pro Gln

275 280 285

Pro Asp Leu Thr Leu Gly Leu Lys Arg His Thr Asp Pro Gly Thr Ile

290 295 300

Thr Leu Leu Leu Gln Asp Gln Val Gly Gly Leu Gln Ala Thr Arg Asp

305 310 315 320

Asn Gly Lys Thr Trp Ile Thr Val Gln Pro Val Glu Gly Ala Phe Val

325 330 335

Val Asn Leu Gly Asp His Gly His Phe Leu Ser Asn Gly Arg Phe Lys

340 345 350

Asn Ala Asp His Gln Ala Val Val Asn Ser Asn Ser Ser Arg Leu Ser

355 360 365

Ile Ala Thr Phe Gln Asn Pro Ala Pro Asp Ala Thr Val Tyr Pro Leu

370 375 380

Lys Val Arg Glu Gly Glu Lys Ala Ile Leu Glu Glu Pro Ile Thr Phe

385 390 395 400

Ala Glu Met Tyr Lys Arg Lys Met Gly Arg Asp Leu Glu Leu Ala Arg

405 410 415

Leu Lys Lys Leu Ala Lys Glu Glu Arg Asp His Lys Glu Val Asp Lys

420 425 430

Pro Val Asp Gln Ile Phe Ala

435

<210> 2

<211> 501

<212> PRT

<213> 人工()

<400> 2

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Ser Met Glu Val Glu Arg Val Gln Asp Ile Ser Ser

165 170 175

Ser Ser Leu Leu Thr Glu Ala Ile Pro Leu Glu Phe Ile Arg Ser Glu

180 185 190

Lys Glu Gln Pro Ala Ile Thr Thr Phe Arg Gly Pro Thr Pro Ala Ile

195 200 205

Pro Val Val Asp Leu Ser Asp Pro Asp Glu Glu Ser Val Arg Arg Ala

210 215 220

Val Val Lys Ala Ser Glu Glu Trp Gly Leu Phe Gln Val Val Asn His

225 230 235 240

Gly Ile Pro Thr Glu Leu Ile Arg Arg Leu Gln Asp Val Gly Arg Lys

245 250 255

Phe Phe Glu Leu Pro Ser Ser Glu Lys Glu Ser Val Ala Lys Pro Glu

260 265 270

Asp Ser Lys Asp Ile Glu Gly Tyr Gly Thr Lys Leu Gln Lys Asp Pro

275 280 285

Glu Gly Lys Lys Ala Trp Val Asp His Leu Phe His Arg Ile Trp Pro

290 295 300

Pro Ser Cys Val Asn Tyr Arg Phe Trp Pro Lys Asn Pro Pro Glu Tyr

305 310 315 320

Arg Glu Val Asn Glu Glu Tyr Ala Val His Val Lys Lys Leu Ser Glu

325 330 335

Thr Leu Leu Gly Ile Leu Ser Asp Gly Leu Gly Leu Lys Arg Asp Ala

340 345 350

Leu Lys Glu Gly Leu Gly Gly Glu Met Ala Glu Tyr Met Met Lys Ile

355 360 365

Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Arg Pro Asp Leu Ala Leu Gly Val Pro

370 375 380

Ala His Thr Asp Leu Ser Gly Ile Thr Leu Leu Val Pro Asn Glu Val

385 390 395 400

Pro Gly Leu Gln Val Phe Lys Asp Asp His Trp Phe Asp Ala Glu Tyr

405 410 415

Ile Pro Ser Ala Val Ile Val His Ile Gly Asp Gln Ile Leu Arg Leu

420 425 430

Ser Asn Gly Arg Tyr Lys Asn Val Leu His Arg Thr Thr Val Asp Lys

435 440 445

Glu Lys Thr Arg Met Ser Trp Pro Val Phe Leu Glu Pro Pro Arg Glu

450 455 460

Lys Ile Val Gly Pro Leu Pro Glu Leu Thr Gly Asp Asp Asn Pro Pro

465 470 475 480

Lys Phe Lys Pro Phe Ala Phe Lys Asp Tyr Ser Tyr Arg Lys Leu Asn

485 490 495

Lys Leu Pro Leu Asp

500

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 3

aaggatccat gactcgtctc gctcgtga 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 4

aagaattcct aagcgaagat ttggtcga 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 5

aaggatccat ggaggtcgaa agagtcca 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 6

aagaattctc aatccagagg aagtttat 28

Claims

1.一种酶促合成山奈酚的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)反应缓冲液为0.1M Tris-HCl，pH7.2，100μL反应体系中含有0.4％抗坏血酸、10％甘油、8.2mMα-酮戊二酸、0.01mM硫酸亚铁、0.5mM柚皮素、3.3μg TrxA-His-F3H、1.8μgTrxA-His-FLS1；

(2)上述反应体系在恒温摇床反应40min、温度40℃、转速250rpm；

其中，融合蛋白TrxA-His-F3H具有如下氨基酸序列：由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

融合蛋白TrxA-His-F3H的制备方法包括以下步骤：

(1)黄烷酮3-羟化酶基因f3h的克隆：f3h基因的PCR扩增，连接到载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-f3h；

(2)将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，利用镍琼脂糖凝胶纯化融合蛋白；

融合蛋白TrxA-His-FLS1具有如下氨基酸序列：由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

融合蛋白TrxA-His-FLS1的制备方法包括以下步骤：

(1)黄烷酮合酶基因fls1的克隆：fls1基因的PCR扩增，连接到载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-fls1；

2.根据权利要求1所述的酶促合成山奈酚的方法，其特征在于，所述f3h基因的PCR扩增，设计两对引物分别为：

正向引物为5’-AAGGATCCATGACTCGTCTCGCTCGTGA-3’；

反向引物为5’-AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGGTCGA-3’。

3.根据权利要求1所述的酶促合成山奈酚的方法，其特征在于，所述fls1基因的PCR扩增，设计两对引物分别为：

正向引物为5’-AAGGATCCATGGAGGTCGAAAGAGTCCA-3’；

反向引物为5’-AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTAT-3’。