CN111440734B

CN111440734B - 生产黄芩素类化合物的基因工程酵母菌、其构建方法及应用

Info

Publication number: CN111440734B
Application number: CN202010263807.XA
Authority: CN
Inventors: 蔡孟浩; 钱芷兰; 陈鑫洁; 赵清
Original assignee: SHANGHAI CHENSHAN BOTANICAL GARDEN; East China University of Science and Technology
Current assignee: SHANGHAI CHENSHAN BOTANICAL GARDEN; East China University of Science and Technology
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2020-04-07
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2040-04-07
Also published as: CN113621530A; CN111440734A

Abstract

本发明涉及生产黄芩素类化合物的基因工程酵母菌、其构建方法及应用。通过基因重组技术在酵母工程菌中引入了一系列外源基因，获得可生产黄芩素、黄芩苷或汉黄芩素的酵母工程菌。所述酵母工程菌具有代谢背景低、异源表达能力强、无需另外添加前体，可全细胞合成终产物以及终产物易分离等特征，为工业化生产黄酮类药物提供了新思路。

Description

生产黄芩素类化合物的基因工程酵母菌、其构建方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及生产黄芩素类化合物的基因工程酵母菌、其构建方法及应用。

背景技术

黄酮类化合物广泛存在于高等植物及蕨类植物中，属于植物的次生代谢产物，是很多传统中草药植物的重要的活性成分。黄酮类化合物由于其结构的特殊性及多样性因而具有多种多样的生物学功能：治疗心脑血管系统疾病，降血脂、降胆固醇、抑制血栓和扩张冠状动脉的作用；提高甲状腺对雌激素的敏感性，使甲状腺C细胞分泌降钙素的作用加强，最终抑制骨再吸收而治疗骨质疏松症；清除代谢过程中过量的自由基，保护肝细胞免受自由基亲电子化合物和毒物的损害；抑制自由基的生成、降低脂质过氧化和刺激抗氧化酶的作用等。

黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)是唇形科黄芩属多年生草本植物，中国人以黄芩根部入药已有两千多年的历史，其中药理活性最为显著的主要是根部特有的黄芩素类黄酮分子。此类根部特异性黄酮在结构上有别于其他黄酮，主要表现为B环上4’-OH的缺失。除了较为传统的抗炎、抗病毒、抗氧化作用等，在癌症、帕金森症、阿兹海默症等严重病症的治疗中黄芩素类黄酮分子也能起到积极作用。如黄芩素可通过下调抗凋亡的Mcl-1蛋白来诱导胰腺癌细胞凋亡以达到抗癌效果，同时还能抑制α-核蛋白的纤维形成以对抗帕金森症；黄芩苷能保护神经元细胞免受淀粉样β蛋白诱导的氧化应激以辅助预防阿兹海默症，有选择性地通过调节信号分子以阻滞人肺癌细胞的增殖；汉黄芩素可调控恶性肿瘤与正常淋巴细胞的氧化还原状态以达到区别肿瘤细胞的效果等。目前，多种上市药物中含有黄芩素、黄芩苷成分，如黄芩素铝胶囊、黄芩苷胶囊、熊胆黄芩滴眼液等。

黄酮类化合物最常见的制备方法为直接通过物理或化学手段从植物中提取。植物提取法较为直接且操作简单，但对植物原材料及有机试剂的大量消耗会使该法不仅深受气候及地域因素限制，同时对人体和环境也造成损害。化学合成法涉及的反应剧烈，存在安全隐患，应用前景有限。目前生物法从头合成黄芩素等黄芩根部特异性黄酮的案例较少，且明显受到异源表达植物酶活较低的限制，黄酮产量低，提升空间有限，无法实现进一步的产业化应用。

原核生物大肠杆菌已被应用于异源合成一些化合物，但是本发明人针对黄芩素类化合物的研究中发现，植物酶与大肠杆菌的适配性较低，大肠杆菌中一些植物酶的表达不理想，难以运用黄芩这一物种来源的一些合成酶类在大肠杆菌中进行黄芩素类化合物的生产。一些反应所需的酶在大肠杆菌中表达时常无活性或低活性，需要大量的表达优化设计如增加融合标签促进正确折叠等，但即便如此，也常常效果欠佳。例如，黄芩素类化合物生产中会引入细胞色素P450家族的酶，其在大肠杆菌难以表达或者必需经复杂改造才可能发挥部分活性。利用大肠杆菌工程菌株合成黄芩素的过程中，需人工添加L-苯丙氨酸前体才能合成，且合成效率低。此外，大肠杆菌的内毒素潜在地会导致药物纯化工艺的难度和要求更高。

现有技术中，酵母细胞表达化合物方面，尽管也有一些探索，但是本领域此前尚未成功运用酵母细胞来合成黄芩素类化合物，尤其是毕赤酵母细胞。这可能在于表达此类化合物需要引入较多基因，部分基因编码的蛋白本身的催化活性不高，需要高表达才能满足合成能力需求，而外源基因剂量过高导致酵母细胞的一系列生理问题。例如，外源基因过多而存在不稳定问题；蛋白折叠胁迫对于生理造成不利影响；蛋白质过量表达会消耗宿主细胞的碳源和能源，会给宿主带来一定的代谢负担。，尽管毕赤酵母已经被应用于较多种外源基因的表达，但是运用其进行多种外源基因的稳定共表达、并且实现高效生产在本领域中仍然存在瓶颈。

因此，本领域亟待进一步地研究和开发黄芩素等黄芩根部特异性黄酮的新型底盘宿主和生产工艺，以期获得高效表达，且能够在工艺方面简化操作、降低成本。

发明内容

本发明的目的在于提供生产黄芩素类化合物的基因工程酵母菌、其构建方法及应用。本发明的技术方案是目前唯一全细胞可由基础碳源从头合成黄芩苷的技术方案。

在本发明的第一方面，提供一种生产黄芩素的方法，所述方法包括：(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有外源的下组基因的表达盒：PAL，4CL，CHS-2，CHI，FNSII-2，CPR1，F6H；和(2)培养(1)的酵母工程菌，从而生产黄芩素。

在本发明的第二方面，提供一种生产黄芩苷的方法，所述方法包括：(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有外源的下组基因的表达盒：PAL，4CL，CHS-2，CHI，FNSII-2，CPR1，F6H，UBGT的表达盒；和(2)培养(1)的酵母工程菌，从而生产黄芩苷。

在本发明的另一方面，提供一种生产汉黄芩素的方法，所述方法包括：(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有外源的下组基因的表达盒：F8H，PFOMT5；和(2)培养(1)的酵母工程菌，并加入白杨素作为前体，生产汉黄芩素。

在另一优选例中，所述4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、F6H、UBGT、F8H、PFOMT5来自于黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi，Sb)。

在另一优选例中，所述PAL来自于圆红酵母(Rhodotorula toruloides；Rt)。

在另一优选例中，所述CPR1来自于拟南芥(Arabidopsis thaliana；At)。

在另一优选例中，所述的酵母工程菌为毕赤酵母；较佳地，在所述酵母工程菌中转化PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1、F6H时，制备PAL+4CL的基因片段、CHS-2+CHI+FNSII-2的基因片段、F6H+CPR1的基因片段，引入酵母工程菌。

在另一优选例中，在将UBGT引入酵母工程菌时，设置UBGT+ENO1的基因片段；所述ENO1为一段基因片段，有助于为UBGT提供整合位点。较佳地，所述ENO1可由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32序列的引物扩增获得。

在另一优选例中，该毕赤酵母中KU70基因功能被下调或缺失。

在另一优选例中，生产黄芩素或黄芩苷时，步骤(2)中利用酵母培养基进行培养，较佳地培养期间补加碳源。

在另一优选例中，生产黄芩素或黄芩苷时，所述碳源为葡萄糖；更佳地每隔12～36小时添加1次葡萄糖，添加至终浓度1～4％(v/v)。

在另一优选例中，生产黄芩素或黄芩苷时，不添加前体L-苯丙氨酸和/或丙二酰辅酶A。

在另一优选例中，生产黄芩素或黄芩苷时，步骤(2)的培养时间为100～200小时。

在另一优选例中，生产汉黄芩素时，步骤(2)中利用酵母培养基进行培养，较佳地培养期间补加碳源。

在另一优选例中，生产汉黄芩素时，所述碳源为葡萄糖；更佳地每隔12～36小时添加1次葡萄糖，添加至终浓度1～4％(v/v)。

在另一优选例中，生产汉黄芩素时，起始培养时在酵母培养基中添加白杨素，其发酵液中的终浓度为50～800μM；较佳地100～500μM；更佳地150～300μM(如200μM、250μM等)。

在另一优选例中，生产汉黄芩素时，步骤(2)的培养时间为55～95小时。

在另一优选例中，生产汉黄芩素时，每隔18～30小时(更佳地22～26小时)添加1次葡萄糖，添加至终浓度1.5～3％(v/v)。

在另一优选例中，所述酵母培养基为YPD培养基。

在另一优选例中，培养温度30±2℃，更佳地30±1℃。

在另一优选例中，培养时的转速200±50r/min，更佳地200±20r/min。

在另一优选例中，生产黄芩素或黄芩苷时，步骤(2)的培养时间为120～180小时，更佳地130～160小时，如140、144、150、155小时。

在另一优选例中，生产汉黄芩素时，步骤(2)的培养时间为60～90小时，更佳地65～80小时，如70、72、75、80小时。

在另一优选例中，所述的PAL基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:1序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的4CL基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:2序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的CHS-2基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:3序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的CHI基因具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:4序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的FNSII-2基因具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:5序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的F6H基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:6序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的CPR1基因具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:7序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的UBGT基因具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:8序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的F8H基因具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:9序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的PFOMT5基因具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:10序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母是GS115。

在本发明的另一方面，提供用于生产黄芩素的酵母工程菌，所述酵母工程菌中包含外源的下组基因的表达盒：PAL，4CL，CHS-2，CHI，FNSII-2，CPR1，F6H。

在本发明的另一方面，提供用于生产黄芩苷的酵母工程菌，所述酵母工程菌中包含外源的下组基因的表达盒：PAL，4CL，CHS-2，CHI，FNSII-2，CPR1，F6H。可选地还包括UBGT的表达盒。

在本发明的另一方面，提供用于生产汉黄芩素的酵母工程菌，所述酵母工程菌中包含外源的下组基因的表达盒：F8H、PFOMT5。

在另一优选例中，所述酵母工程菌为毕赤酵母。

在另一优选例中，所述4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、F6H、UBGT来自于黄芩。

在另一优选例中，所述F8H、PFOMT5来自于黄芩。

在另一优选例中，所述PAL来自于圆红酵母。

在另一优选例中，所述CPR1来自于拟南芥。

在本发明的另一方面，提供基因组合的用途，所述的基因组合包括下组基因：PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1和F6H，以及可选地还包括UBGT、F8H和/或PFOMT5，该基因组合用于转化入酵母工程菌中，制备黄芩素类化合物。

在另一优选例中，所述的基因组合被置于一个或多个表达构建体中。例如，PAL+4CL的基因片段、CHS-2+CHI+FNSII-2的基因片段、F6H+CPR1的基因片段被置于分别的构建体中。

在另一优选例中，所述基因组合为PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1和F6H，所述黄芩素类化合物为黄芩素。

在另一优选例中，所述基因组合为PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1、F6H和UBGT，所述黄芩素类化合物为黄芩苷。

在另一优选例中，所述基因组合为F8H和PFOMT5，所述黄芩素类化合物为汉黄芩素。

在另一优选例中，所述4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、F6H、UBGT、F8H和/或PFOMT5来自于黄芩，所述PAL来自于圆红酵母，和/或所述CPR1来自于拟南芥。

在本发明的另一方面，提供用于生产黄芩素的试剂盒，其中包括：PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、F6H和CPR1基因或含有所述基因的表达构建体(包括表达质粒)或酵母细胞；或其中包括：PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、F6H、CPR1和UBGT基因或含有所述基因的表达构建体(包括表达质粒)或酵母细胞；或其中包括：F8H和PFOMT5基因或含有所述基因的表达构建体(包括表达质粒)或酵母细胞；较佳地，所述4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、F6H、UBGT、F8H和/或PFOMT5来自于黄芩，所述PAL来自于圆红酵母，和/或所述CPR1来自于拟南芥。

在本发明的另一方面，提供一种用于生产黄芩素的重组表达载体或表达构建物，所述的重组表达载体中包含以下基因的表达盒：RtPAL，Sb4CL，SbCHS-2，SbCHI，SbFNSII-2，SbF6H，AtCPR1。

在本发明的另一方面，提供一种用于生产黄芩苷的重组表达载体或表达构建物，所述的重组表达载体中包含以下基因的表达盒：RtPAL，Sb4CL，SbCHS-2，SbCHI，SbFNSII-2，SbF6H，AtCPR1，SbUBGT；

在本发明的另一方面，提供一种用于生产汉黄芩素的重组表达载体或表达构建物，所述的重组表达载体中包含以下基因的表达盒：F8H和PFOMT5。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、黄芩素、黄芩苷及汉黄芩素的合成途径。

图2、生产黄芩素、黄芩苷及汉黄芩素菌株的摇瓶发酵图。

A、生产黄芩素的重组菌株的摇瓶发酵过程，记载了随着发酵时间变化的细胞生物量，黄芩素产量。

B、生产黄芩苷的重组菌株的摇瓶发酵过程，记载了随着发酵时间变化的细胞生物量，黄芩苷产量。

C、生产汉黄芩素的重组菌株的摇瓶发酵过程，记载了随着发酵时间变化的细胞生物量，汉黄芩素产量。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，通过基因重组技术在酵母工程菌株(优选地为毕赤酵母)中引入了一系列外源基因，获得可生产黄芩素、黄芩苷及汉黄芩素的酵母工程菌。所述酵母工程菌具有代谢背景低、异源表达能力强、无需另外添加前体，可全细胞合成终产物以及终产物易分离等特征，为工业化生产黄酮类药物提供了新思路。

本发明提供了一种生产黄芩素类化合物的基因工程酵母菌。通过在酵母工程菌中异源表达以下酶：苯丙氨酸解氨酶(Pal)，对香豆酰辅酶A连接酶(4CL)，查尔酮合酶(CHS-2)，查尔酮异构酶(CHI)，黄酮合酶(FNSII-2)，黄酮6-羟化酶(F6H)，细胞色素P450还原酶(CPR1)，实现了在酵母细胞中从头合成黄芩素。进一步地，在该菌株基础上整合黄芩素7-O-葡萄糖基转移酶(UBGT)，可以实现在酵母细胞中从头合成黄芩苷。由黄芩素合成途径中的中间产物白杨素为底物。本发明也实现了通过异源表达黄酮8-羟化酶(F8H)，黄芩黄酮苯丙素和类黄酮O-甲基转移酶(PFOMT5)，在酵母细胞中由白杨素合成汉黄芩素。本发明中构建的合成途径如图1。

本发明首次实现微生物利用基础碳源从头合成黄芩素及黄芩苷，首次实现微生物利用白杨素合成汉黄芩素。本发明中构建的重组酵母工程菌，其与植物酶具有良好的适配性，其相比于原核生物大肠杆菌在异源表达植物来源的黄酮合成酶时有独特的优势，无需针对酶结构进行改造即获得良好表达并发挥催化活性，更具有开发应用潜力。

术语

如本文所用，所述的“表达盒”或“基因表达盒”是指包含有表达目的多肽所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“表达构建物”或“表达构建体”是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，其可以包含一个或多个基因表达盒。所述的“构建物”通常被包含在表达载体中。

如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或者来自不同来源的蛋白(或核酸)与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，所述的“黄芩素类化合物”包括黄芩素、黄芩苷或汉黄芩素。所述的“黄芩素类化合物”也可以是在本发明披露的化合物基础上的变化形式，例如，化合物的母核结构保持不变，但在个别(如1-3个，1-2个)位置上发生基团(如含有1-4个碳原子(较佳地1-2个碳原子)的脂族烃类基团)的取代。

基因及其表达系统

本发明中，通过在酵母工程菌中转化入七基因组合(PAL，4CL，CHS-2，CHI，FNSII-2，CPR1，F6H)或八基因组合(PAL，4CL，CHS-2，CHI，FNSII-2，CPR1，F6H，UBGT)来实现黄芩素或黄芩苷在酵母工程菌中的高效生产。在本发明的优选实施方式中，所述的七基因组合包括如下基因：RtPAL，Sb4CL，SbCHS-2，SbCHI，SbFNSII-2，SbF6H，AtCPR1；所述的八基因组合包括如下基因：RtPAL，Sb4CL，SbCHS-2，SbCHI，SbFNSII-2，SbF6H，AtCPR1，SbUBGT。上述的基因中除RtPAL与AtCPR1外均来自黄芩这一物种的基因，本发明人在酵母细胞中成功地实现了这些基因的共同表达，以及高活性地进行化合物生产。

本发明中，通过在酵母工程菌中转化入两基因组合(F8H，PFOMT5)来实现汉黄芩素在酵母工程菌中的高效生产。所述的两基因组合包括如下基因：SbF8H，SbPFOMT5。

本发明所述的基因可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动植物或微生物。此外，所述的基因也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来获得所述的基因，或者通过人工合成的方法来获得所述的基因。

上述的基因的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1～10所示的列相同，也可以是它们的简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有同功能的蛋白质，但与选自SEQ ID NO:1～10所示的序列有差别的核酸序列。本发明包括上述基因的天然序列，也包括进行密码子优化后的序列。本发明中，目前采用天然的基因序列进行了重组表达，可以预期的是，利用一些本领域公知的密码子优化方法进行优化、并建立优化的酵母工程菌，还可以进一步地提高产量。这些在本发明的方案基础上的进一步优化技术，也应被涵盖在本发明的技术方案中。

所述的基因可以包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及所述的基因的变异体，其编码的多肽与其相应的野生型多肽在氨基酸序列上不同，是野生型多肽的片段、类似物或衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与相应的野生型多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的各基因优选获自圆红酵母、黄芩及拟南芥。本发明也可包括获自其它微生物的与圆红酵母、黄芩及拟南芥中相应的基因高度同源(如具有70％以上，如80％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的各基因的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，扩增而得有关序列。当序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，各基因的序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

各基因的序列可以分别插入到重组表达载体中，多个重组表达载体共转宿主细胞；多个基因的表达盒也可以以串联的方式插入到同一重组表达载体中，转入宿主细胞。所述的重组表达载体还可包含与所述基因的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。应理解，在本领域人员了解了本发明的技术内容后，可以方便地构建重组表达载体。获得的重组表达载体也包含在本发明中。

表达调控序列或表达盒中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启动子，诱导型的启动子可实现更可控的蛋白表达以及化合物生产，有利于工业化应用。

作为本发明的优选方式，提供了一种表达载体(表达构建物)其包括以下基因的表达盒：RtPAL，Sb4CL，SbCHS-2，SbCHI，SbFNSII-2，SbF6H，AtCPR1；还提供了另一种表达载体(表达构建物)，其包括以下基因的表达盒：SbUBGT；以及另一种表达载体(表达构建物)，其包括以下基因的表达盒：SbF8H，SbPFOMT5。

表达载体(表达构建物)的建立可以采用本领域技术人员熟悉的技术。在得知了所需选择的基因之后，本领域技术人员可以进行表达构建物的建立。基因序列可以被插入到不同的表达构建物(如表达载体)中，也可以被插入到同一表达构建物中，只要在转入到细胞后其编码的多肽能够被有效地表达和发挥活性即可。作为本发明的优选方式，所述的表达载体是pGAP Zα。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本发明中，所述的宿主细胞优选的是酵母工程菌，更优选的是毕赤酵母，如毕赤酵母GS115。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转化方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，培养中所用的培养基可以是本领域熟知的酵母培养基。在适于酵母细胞生长的条件下进行培养。

本发明也提供了用于生物合成黄芩素类化合物的试剂盒，其中包括：PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、F6H和CPR1基因或含有所述基因的表达构建体(包括表达质粒)或酵母细胞；或包括：PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、F6H、CPR1和UBGT基因或含有所述基因的表达构建体(包括表达质粒)或酵母细胞；或包括：F8H和PFOMT5基因或含有所述基因的表达构建体(包括表达质粒)或酵母细胞。更佳地，所述试剂盒中还包括说明进行生物合成的方法的使用说明书。

本发明通过基因重组技术获得的重组毕赤酵母菌株具有代谢背景低、异源表达能力强、无需另外添加前体，可全细胞合成终产物以及终产物易分离等特征，将在很大程度上解决传统生物、化学方法合成存在的问题，为工业化生产黄酮类药物提供新思路。尤其特别的是，本发明中实现了多种来自黄芩的基因在酵母工程菌中的成功表达，这更接近于黄芩素在植物体内的天然加工模式，确保了黄芩素类化合物的高效生产。

合成黄芩素、黄芩苷及汉黄芩素的方法

黄芩素的结构式如下式(I)所示，黄芩苷的结构式如下式(II)所示，汉黄芩素的结构式如下式(III)所示。

本发明公开一种利用微生物异源合成生产黄芩素、黄芩苷及汉黄芩素的方法。所述方法包括：将七种基因(优选的为RtPAL，Sb4CL，SbCHS-2，SbCHI，SbFNSII-2，SbF6H，AtCPR1)转化酵母工程菌，从而生产黄芩素；或者，将八种基因(优选的为RtPAL，Sb4CL，SbCHS-2，SbCHI，SbFNSII-2，SbF6H，AtCPR1，SbUBGT)转化酵母工程菌，从而生产黄芩苷；或者，将两种基因(优选的为SbF8H，SbPFOMT5)转化酵母工程菌，从而生产汉黄芩素。

本发明还提供了生产黄芩素或黄芩苷的重组酵母工程菌的发酵培养方法。本发明的生产黄芩素或黄芩苷的酵母工程菌可以应用酵母培养基进行培养，较佳地培养期间补加碳源；较佳地所述碳源为葡萄糖；较佳地每隔12～36小时添加1次葡萄糖；更佳地添加至终浓度1～4％(v/v)。尤其值得注意的是，本发明的重组酵母工程菌在进行生产时，酶活性理想且调动了酵母细胞的内源机制，因此，本发明的技术方案可以在不添加前体L-苯丙氨酸和/或丙二酰辅酶A的基础上进行黄芩素类化合物的生产；这一方面有利于大规模生产，另一方面也简化了工艺(例如在培养基的配制上更为简单明了，后期产物的分离纯化更为方便)、降低了成本。在本发明的优选方式中，本发明人根据所述生产黄芩素或黄芩苷的重组酵母工程菌的生产特点，优化了培养时间为100～200小时，较佳地120～180小时，更佳地130～160小时。

在本发明的具体实施方式中，提供了一种较为优选的生产黄芩素或黄芩苷的方法，包括：于30℃、转速200r/min的液体YPD培养中，将重组菌培养至对数期，收集菌体使用无菌水洗涤两次后转移至YPD培养基，于30℃、转速200r/min培养144h。发酵过程中每24h向液体培养基中添加2％的葡萄糖。

本发明还提供了生产汉黄芩素的重组酵母工程菌的发酵培养方法。本发明的生产汉黄芩素的酵母工程菌可以应用酵母培养基进行培养，较佳地培养期间补加碳源；较佳地所述碳源为葡萄糖；较佳地每隔12～36小时添加1次葡萄糖；更佳地添加至终浓度1～4％(v/v)。在本发明的优选方式中，本发明人根据所述生产汉黄芩素的重组酵母工程菌的生产特点，优化了培养时间为55～95小时，较佳地60～90小时，更佳地65～80小时。

在本发明的具体实施方式中，提供了一种较为优选的生产汉黄芩素的方法，包括：于30℃、转速200r/min的液体YPD培养中，将重组菌培养至对数期，收集菌体使用无菌水洗涤两次后转移至YPD培养基并添加200μM的白杨素作为前体，于30℃、转速200r/min培养72h。发酵过程中每24h向液体培养基中添加2％的葡萄糖。

在获得了发酵产物后，从发酵产物中提取黄芩素、黄芩苷或汉黄芩素可以采用本发明已知的技术。可以采用高效液相色谱来对产物进行分析鉴定，以确定获得了所需的化合物。

本发明的主要有点在于：

本发明运用重组毕赤酵母异源生产黄芩素，不仅解决了植物提取法消耗大量植物原材料、受季节地域因素限制以及提取效率低等问题；也避免了化学合成法中副产物多、目标产物活性低、环境污染大等不利因素；相比利用大肠杆菌作为底盘宿主更是解决了植物酶异源表达活性低的问题，更加适合黄芩素等黄酮类化合物的高效合成，为工业生产黄芩素等黄酮类化合物开辟了新途径。因此，本发明的重组毕赤酵母菌株具备工业化生产黄芩素的潜力。

本发明实现了利用重组酵母菌进行全细胞从头生物合成黄芩素及黄芩苷的技术突破，且无需另外添加氨基酸前体，基础碳源即可满足生产需求，为生产黄芩素及其他黄酮类化合物提供了新途径。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

培养基

YPD液体培养基：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L；

YPD固体培养基：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L，琼脂20.0g/L；

YND固体培养基：葡萄糖20.0g/L，无氨基酵母氮源(YNB)6.7g/L，琼脂20.0g/L；

实施例1、表达质粒的构建

1、P_GAP表达各基因质粒的构建

基因RtPAL，AtCPR1与SbUBGT由苏州金唯智生物科技有限公司全合成并直接构建于载体质粒pGAP Zα(Invitrogen)上，质粒名称：pGAP_RtPal、pGAP_AtCPR1pGAP_SbUBGT。其他基因(Sb4CL，SbCHS-2，SbCHI，SbFNSII-2，SbF6H，SbF8H，SbPFOMT5)的原始质粒均来自中科院上海辰山植物科学研究中心。设计特异性引物，以各基因的原始质粒为模板，以表1中相应引物，通过PCR扩增得到黄芩来源的相关基因(Sb4CL，SbCHS-2，SbCHI，SbFNSII-2，SbF6H，SbF8H，SbPFOMT5)；使用AsuII和KpnI双酶切质粒pGAP Zα，采用无缝组装试剂盒将各基因分别整合入质粒pGAP Zα中P_GAP下游，测序正确后即可得到具有P_GAP表达各基因的质粒，质粒名称：pGAP_Sb4CL，pGAP_SbCHS-2，pGAP_SbCHI，pGAP_SbFNSII-2，pGAP_SbF6H，pGAP_SbF8H，pGAP_SbPFOMT5。

其中，RtPAL的基因序列如SEQ ID NO:1所示；

Sb4CL的基因序列如SEQ ID NO:2所示；

SbCHS-2的基因序列如SEQ ID NO:3所示；

SbCHI的基因序列如SEQ ID NO:4所示；

SbFNSII-2的基因序列如SEQ ID NO:5所示；

SbF6H的基因序列如SEQ ID NO:6所示。

AtCPR1的基因序列如SEQ ID NO:7所示。

SbUBGT的基因序列如SEQ ID NO:8所示；

SbF8H的基因序列如SEQ ID NO:9所示；

SbPFOMT5的基因序列如SEQ ID NO:10所示。

PCR扩增所用的引物如表1所示。

表1

2、基因组合质粒的构建

使用BamH I酶切前面“1”中构建的质粒pGAP_RtPal、pGAP_SbFNSII-2、pGAP_SbF6H及pGAP_SbF8H，分别回收得到线性化的质粒。

以前面“1”中构建的质粒pGAP_Sb4CL、pGAP_SbCHI、pGAP_AtCPR1及pGAP_SbPFOMT5为模板，以表1中BamH I为引物，通过PCR扩增回收得到包括启动子和终止子的Sb4CL、SbCHI、AtCPR1及SbPFOMT5基因的完整表达盒。通过无缝组装试剂盒可将线性化的质粒及基因的表达盒相连，得到质粒pGAP_RtPal+Sb4CL、pGAP_SbCHI+SbFNSII-2、pGAP_SbF6H+AtCPR1、pGAP_SbF8H+SbPFOMT5。

使用BtgZ I酶切质粒pGAP_SbCHI+SbFNSII-2，回收得到线性化的质粒。以前面“1”中构建的质粒pGAP_SbCHS-2为模板，以表1中BtgZ I为引物，通过PCR扩增回收得到包括启动子和终止子的SbCHS-2基因的完整表达盒。通过无缝组装试剂盒可将线性化的质粒及基因的表达盒相连，得到质粒pGAP_SbCHS-2+SbCHI+SbFNSII-2。

3、含同源臂的基因组合质粒的构建

使用ApaI和XhoI双酶切质粒pDAg2、pDTg1及pDFg1(参见Liu Q,Shi X,Song L,etal.CRISPR–Cas9 mediated genomic multiloci integration in Pichia pastoris[J].Microbial Cell Factories,2019,18:144)，回收得到线性化的质粒。以前面“2”中构建的质粒pGAP_RtPal+Sb4CL、pGAP_SbCHS-2+SbCHI+SbFNSII-2、pGAP_SbF6H+AtCPR1、pGAP_SbF8H+SbPFOMT5为模板，以表1中ApaI～SpeI为引物，通过PCR扩增得到含有多个基因表达盒的片段，通过无缝组装试剂盒可将线性化的质粒及基因的表达盒片段相连，得到质粒pDAg2_RtPal+Sb4CL、pDTg1_SbCHS-2+SbCHI+SbFNSII-2、pDFg1_SbF6H+AtCPR1、pDAg2_SbF8H+SbPFOMT5。

4、含ENO1整合位点的质粒的构建

使用Nsi I酶切前面“1”中构建的质粒pGAP_SbUBGT，回收得到线性化的质粒。以毕赤酵母GS115基因组为模板，以表1中相应引物扩增ENO1片段，通过无缝组装试剂盒可将线性化的质粒及ENO1片段相连，得到质粒pGAP_SbUBGT+ENO1。

实施例2、目标重组酵母菌的制备

1、重组菌株的PCR验证

各DNA片段及对应的gRNA质粒电转化毕赤酵母GS115-Δku70(参见201910403132.1)，复苏后，涂布于YND固体培养基上，培养5天后挑取新鲜的菌落在YPD液体培养基中培养，利用酵母基因组提取试剂盒提取各转化子的基因组，经克隆PCR反应鉴定黄芩素合成的各基因整合入毕赤酵母基因组的情况。

克隆PCR反应条件：

(1)初始变性95℃5min；

(2)变性95℃30s，退火50℃30s，延伸72℃1min/kb，循环反应30次；

(3)最后延伸72℃7min。

2、包含7种外源基因的重组菌的获得

设计特异性引物，以质粒pDAg2_RtPal+Sb4CL、pDTg1_SbCHS-2+SbCHI+SbFNSII-2和pDFg1_SbF6H+AtCPR1为模板，以表2中相应引物，通过PCR扩增获得含有同源臂的各基因片段，与环形质粒3.5k-PFg1-PAg2+pTg1(参见Liu Q,Shi X,Song L,et al.CRISPR–Cas9mediated genomic multiloci integration in Pichia pastoris[J].Microbial CellFactories,2019,18:144)同时电转化入毕赤酵母感受态，使用YND固体培养筛选重组子，获得转化入7种外源基因(RtPAL，Sb4CL，SbCHS-2，SbCHI，SbFNSII-2，SbF6H，AtCPR1)的毕赤酵母基因工程菌。该菌株划线于YPD固体培养基，再次进行重组菌株的PCR验证，以确保环形质粒丢失。

表2

3、包含8种外源基因的重组菌的获得

将前述2获得的包含7种外源基因的重组酵母菌制备成感受态，线性化后的质粒pGAP_SbUBGT+ENO1经电转化入该感受态，使用具有博来霉素抗性的固体YPD培养基筛选重组子，获得转入8种外源基因(RtPAL，Sb4CL，SbCHS-2，SbCHI，SbFNSII-2，SbF6H，AtCPR1，SbUBGT)的毕赤酵母基因工程菌。

4、包含2种外源基因的重组菌的获得

设计特异性引物，以质粒pDAg2_SbF8H+SbPFOMT5为模板，以表2中相应引物，通过PCR扩增获得含有同源臂的各基因片段，与环形质粒3.5k-PAg2(参见Liu Q,Shi X,Song L,et al.CRISPR–Cas9 mediated genomic multiloci integration in Pichia pastoris[J].Microbial Cell Factories,2019,18:144)同时电转化入毕赤酵母感受态，使用YND固体培养筛选重组子，获得转化入2种外源基因(SbF8H，SbPFOMT5)的毕赤酵母基因工程菌。该菌株划线于YPD固体培养基，再次进行重组菌株的PCR验证，以确保环形质粒丢失。

实施例3、重组工程菌250ml锥形瓶发酵工艺

生产黄芩素的菌株：其中含有7种外源基因：RtPAL、Sb4CL、SbCHS-2、SbCHI、SbFNSII-2、SbF6H、AtCPR1。

生产黄芩苷的菌株：其中含有8种外源基因：RtPAL、Sb4CL、SbCHS-2、SbCHI、SbFNSII-2、SbF6H、AtCPR1、SbUBGT。

生产汉黄芩素的菌株：其中含有2种外源基因：SbF8H、SbPFOMT5。

于30℃、转速200r/min的液体YPD培养基中，将重组菌培养至对数期，收集菌体使用无菌水洗涤两次后转移至装有50mL YPD液体培养基的250mL锥形瓶中(生产黄芩素或黄芩苷的菌株无需另外添加前体，生产汉黄芩素的菌株还另外添加200μM白杨素)，于30℃、转速200r/min培养(生产黄芩素或黄芩苷的菌株培养144小时，生产汉黄芩素的菌株培养72小时)。发酵过程中每24h向液体培养基中添加2％(v/v)的葡萄糖。

实施例4、重组菌株发酵产物的提取鉴定

经前述验证后的重组菌株，经YPD液体培养基培养至对数期，取50OD(注：OD值为酵母菌浓单位，1OD约为5x10⁷个酵母细胞。OD值由紫外分光光度计于600nm波长测得)菌体，利用无菌水洗两次后转入50mL YPD液体培养基中。生产黄芩素或黄芩苷的菌株无需另外添加前体，生产汉黄芩素的菌株还需另外添加200μM白杨素。培养温度为30℃、转速为200r/min进行发酵培养；生产黄芩素或黄芩苷的菌株培养144小时，生产汉黄芩素的菌株培养72小时；其中每24h添加2％的葡萄糖。经发酵培养后的发酵液，取10mL使用等体积乙酸乙酯萃取样品三次。收集上层乙酸乙酯有机相，蒸馏后再溶于1mL甲醇用于高效液相色谱(HPLC)分析。

高效液相色谱法分析，由反向高效液相色谱Agilent 1100完成，色谱柱使用C18柱，柱温30℃，紫外检测波长为275nm，洗脱条件如表3。

表3、目标产物HPLC流动相条件

实施例5、发酵期间的细胞生物量和产物产量

根据实施例3的250ml锥形瓶发酵培养方法进行发酵。发酵期间间隔24h取样，测定细胞生物量和黄芩素、黄芩苷或汉黄芩素产物量。

生产黄芩素的菌株的发酵和生产情况见图2A，随着发酵时间的增加，生产黄芩素的菌株的细胞生物量逐渐增加，同时黄芩素的产量也逐渐增加，在约发酵144小时的时候达到最高值，产量约35mg/L。这是目前全细胞从头合成黄芩素的最高产量，且发酵时无需另外添加苯丙氨酸作为前体，只需基础碳源葡萄糖即可满足生产要求。

生产黄芩苷的菌株的发酵和生产情况见图2B，随着发酵时间的增加，生产黄芩苷的菌株的细胞生物量逐渐增加，同时黄芩苷的产量也逐渐增加，在约发酵144小时的时候达到最高值，产量约13mg/L。这是目前全细胞从头合成黄芩苷的最高产量，且发酵时无需另外添加苯丙氨酸作为前体，只需基础碳源葡萄糖即可满足生产要求。

生产汉黄芩素的菌株的发酵和生产情况见图2C，随着发酵时间的增加，生产汉黄芩素的菌株细胞生物量逐渐增加，同时汉黄芩素的产量也逐渐增加，在约发酵72小时的时候达到最高值，产量约0.55mg/L。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利的范围中。

序列表

<110> 华东理工大学;上海辰山植物园

<120> 生产黄芩素类化合物的基因工程酵母菌、其构建方法及应用

<130> 201993

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2082

<212> DNA

<213> 圆红酵母(Rhodotorula toruloides)

<400> 1

atggctccaa ggcctactag tcagagtcaa gctagaactt gtccaaccac ccaagtcacc 60

caagttgaca ttgtcgaaaa aatgttggcc gccccaaccg actctacctt ggagttggac 120

ggatacagtc ttaatcttgg tgatgttgtc agtgccgcca gaaagggtag accagttagg 180

gtcaaggact ctgacgagat cagatctaaa atcgataaat ctgttgagtt tttgagatct 240

cagttgtcta tgagtgtcta cggagttacc actggtttcg gaggttctgc cgataccaga 300

accgaagacg ccatctctct tcagaaggcc ttgcttgagc accagctttg cggagttttg 360

ccttcttctt tcgattcttt tagattgggt aggggacttg agaactcttt gccattggag 420

gtcgttagag gagctatgac cattagagtt aactctttga ctagaggaca ttctgccgtt 480

aggttggtcg tcttggaggc ccttaccaat tttttgaatc acggtatcac cccaatcgtc 540

cctcttaggg gaaccatcag tgcctctggt gacttgtctc cattgtctta tatcgctgcc 600

gccatcagtg gtcacccaga tagtaaggtc cacgtcgtcc acgagggtaa ggaaaagatc 660

ttgtatgcta gggaggccat ggcccttttc aacttggaac cagttgtctt gggacctaag 720

gagggacttg gattggttaa cggaactgct gtttctgcct ctatggctac ccttgctctt 780

cacgatgccc acatgttgtc tcttttgagt caatctttga ccgctatgac cgtcgaggct 840

atggttggtc atgccggatc tttccaccca tttcttcacg acgttaccag acctcaccca 900

actcaaatcg aagtcgctgg aaatattaga aagcttcttg agggtagtag attcgccgtc 960

catcacgagg aggaagtcaa agtcaaggat gacgagggaa tcttgaggca agatagatat 1020

ccacttagga ctagtccaca atggcttggt ccacttgtca gtgatcttat ccacgctcac 1080

gccgtcttga ccattgaggc tggacagtct accaccgata accctcttat tgacgtcgaa 1140

aataagactt ctcatcacgg tggaaacttc caagctgctg ccgttgctaa caccatggaa 1200

aagactagat tgggtttggc tcagatcggt aagcttaact tcacccaatt gaccgagatg 1260

cttaatgccg gaatgaatag aggacttcca tcttgcttgg ccgccgagga cccttctctt 1320

tcttaccatt gcaagggtct tgatattgct gctgccgctt acacctctga gcttggtcac 1380

ttggctaacc cagttaccac ccatgttcaa ccagctgaga tggctaacca agctgtcaac 1440

agtttggcct tgatcagtgc tagaaggacc accgaatcta acgatgtctt gagtcttttg 1500

ttggccactc acttgtactg cgtcttgcaa gctatcgact tgagggccat cgagtttgag 1560

tttaaaaaac aattcggtcc agctatcgtc agtttgatcg accagcactt cggatctgcc 1620

atgaccggat ctaacttgag ggatgagctt gtcgagaagg ttaacaagac cttggccaag 1680

aggttggagc agactaactc ttacgacctt gtcccaagat ggcacgatgc cttcagtttt 1740

gctgctggaa ccgtcgtcga agttcttagt tctacctctc tttctcttgc cgccgtcaat 1800

gcttggaaag tcgccgctgc tgagagtgcc attagtttga ctaggcaagt tagagagacc 1860

ttctggagtg ccgccagtac ttcttctcca gctttgtctt accttagtcc tagaacccag 1920

atcttgtacg ctttcgttag agaggagctt ggagttaaag ccagaagggg tgacgtcttt 1980

cttggtaagc aagaagtcac catcggttct aatgtttcta aaatctatga agctatcaaa 2040

tctggtagaa ttaataatgt ccttttgaag atgcttgctt ga 2082

<210> 2

<211> 1650

<212> DNA

<213> 黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)

<400> 2

atggagactg tagaaaacca cggtgacgtc attttccggt cgaagctccc cgacatatac 60

atccccaagc acctcccatt gcactcttac tgcttcgaaa acatctccga gcacaggacg 120

aagccatgtc tcatcaacgg cgccaccaat gaggtgcaca cctacgagga agtggagctc 180

atctccagga aggtggcggc ggggctgagc cacctcggcc tccaccacgg agacactatc 240

atgatcctcc tccccaactc gccggaattc gtcttcgcct tcctgggcgc ttcctacatc 300

ggcgccgtct ccaccatggc caatcccttt ttcacccccg ccgaggtcat caagcaggcc 360

aaggcctcca acgccaagct catcatcacg caggcatgct acgtcaagaa agtctgggat 420

tacgccgtcg agaacggcgt cagggttatg tgcgtcgact ctccgccgcc ggaggccgcc 480

ggtgagtgcc tggagttctc ccagctgacc tccgccgacg agggcgacat gccggaggtg 540

gagatcaact ccgaggacgt ggtggcgctg ccgtactcct ccggcacgac ggggctgccg 600

aagggcgtga tgctcacgca caaagggctc gtcaccagcg tcgctcagca agttgacggt 660

gagaacccca atctgtacat tcacagcgac gacgtcatac tctgcgtttt gcccttgttt 720

cacatttact ccttaaactc cgttctgctc tgcgggttac gggtcggggc cgccattctg 780

atcatgcaga aattcgacat tgttcccttt ttggagctga ttcagagata caaagttacc 840

attgggccct tcgtgccgcc cattgttttg gcaattgtga agagccccgt ggtgggcaat 900

tacgaccttt catctatacg gacggtgatg tccggcgcgg cgccgctcgg gaaggagctg 960

gaggaggctg tcagaattaa gtttccgaat gccaaacttg gccagggata tggaatgaca 1020

gaagcagggc cagtgctagc gatgtgtttg gcattcgcaa aagaagggtt cgagataaaa 1080

tcaggtgcat gcgggaccgt cgtaagaaac gctgagatga aaatcgtcga catagaaact 1140

gctgcctcac ttggacgcaa tcaacccggc gagatttgca tcagaggaga tcagatcatg 1200

aaaggctatt tgaatgatcc ggaatcaaca gcaaggacaa tagataaaga agggtggcta 1260

cacacaggtg acatagggtt cattgatgat gatgatgagc tctttattgt tgatcgtctc 1320

aaggaaataa tcaagtacaa agggttccaa gttgctccgg ccgaaatcga ggccctcctc 1380

ctcaatcacc cctccatttc cgatgccgcc gtggtctcaa tgaaagatga agaagcagga 1440

gaagttcctg ttgcctttgt tgtgaaatca aatgggtcca ccataactga ggatgatatc 1500

aagcaattta tatccaaaca ggtgattttc tacaagagaa tacatcgtgt atttttcatt 1560

gatgccattc caaagaatcc atcaggcaaa atattgagaa aggatttgag ggcaatatta 1620

cccacaaaag cagctactct ttcaaattga 1650

<210> 3

<211> 1173

<212> DNA

<213> 黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)

<400> 3

atggtgacag ttgaagaatt ccaccgggca acacgggcag agggccccgc caccgtcttg 60

gccatcggca cggccaaccc cccaaactgc gttgagcagt ctacttatgc tgattactac 120

tttcgcattt gtaaaagtga acacttgact gatcttaaaa agaagtttag ccgcatgtgc 180

gaaaagtctg gcatcaagaa acgttacatg catttaacgg aggagtttct gaaggagaac 240

gacaacttca cggcgtacga ggctccgtca ctggatgccc ggcaggacat agtggtggtg 300

gagatcccga agctggggaa ggaggctgcc cagaaggcga tcaaggaatg ggggcagccc 360

aagtccaaga tcacccacgt catcttctgc actaccagcg gcgtcgacat gcccggcgca 420

gactaccaga tcaccaagct cctcggcctc cgcccctccg tcaagcgctt catgatgtac 480

cagcagggct gcttcgccgg cggcacggtg ctccgcatgg ccaaggacct ggctgagaac 540

aacgccggag ctagggttct tgtcgtctgc tccgagatca ccgccatcac tttccggggg 600

cccagcgaca cccacctcga cagcctggtc ggccaggccc tgttcggcga cggcgccggg 660

gcggtcatcg ttggatccga ccccatcgtg ggggtggagc ggccgctctt ccagctggtc 720

tcggcggcgc agacgattct ccctgacagt gagggcgcca ttgacggcca cgtccgcgag 780

gtcgggctga ccttccacct cctcaaggac gtccccgggc tgatctccaa gaacatcgag 840

aagagcctca aggaggcctt cgcgccgctg ggcatctccg actggaactc cctcttctgg 900

atcgtgcacc ccggaggtcc cgccattctc gaccaggtgg aggagaagct cgggctcaag 960

cccgagatca tggtcccaac caggcacgtg cttagcgaat acgggaacat gtccagcgcc 1020

tgcgttctct tcgtgatgga tgagatgagg aaggcctccg ccaaggacgg ctgcaccacc 1080

accggagaag ggaaggactg gggggttctt ttcggcttcg gcccgggcct caccgttgag 1140

actgtagttc tgcatagtgt gcctctcaat tga 1173

<210> 4

<211> 648

<212> DNA

<213> 黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)

<400> 4

atgtctgctt cgccatccgt caccaaagtc ctagtcgaat ccatcgagtt ctcgccggcc 60

gcaaagccgc cgggatcctc caacacctta ttcctcggcg gcgccggggt gagaggaatg 120

gagatccagg ggaacttcgt gaagttcacg gcgatcggtg tttacttgga agacagcgcc 180

gttccgtctc tcgccgttaa ctggaagggc aagaccgccg aggagttgac ggagtcagac 240

gactttttca gggaaatcgt gtctggtcct ttcgagaaat tcaccaaggt gacgatgatt 300

ctgccattga cggggaagca atactcggag aaagttgcag agaactgcgt tgcgtactgg 360

aaagccgtag ggaaatacac ggatgctgaa tcggaagcaa tcgacaagtt tctccaagtg 420

ttcaaggacg aaacgttcgc gcctggagct tccatcctct tcacccaatc gccggccggc 480

tccttgacga ttagcttctc gaaagacgga tcgattccag agcaagggaa ggcagtaata 540

gagaacaaac agctgtcgga ggcagtgctg gagtcgatca tcggaaagca tggtgtgtcg 600

ccgtcggcga agcagagttt ggcggcaaga ctatcggagt tgttttaa 648

<210> 5

<211> 1509

<212> DNA

<213> 黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)

<400> 5

atggacttag tagaagtcac actctacgcc gccctcttcc tcctctccgc cgccttcctc 60

ctcctaatct tcgccggaga ccgctcctcc ccaccgggcc cgttccctct tccgatcatc 120

gggcacctcc acctcctcgg cccgaaactc caccaaagct tccacgggct gtcccaacgg 180

cacggcccgc tgatgcaaat ccggctgggc tccatcaact gcgtggtggc gtcgacgccg 240

gagctggcta aagagttcct caaaaccaac gagctggtgt tctcctcgcg caaacactcg 300

accgccattg atatcgtcac ctacaattcc tccttcgcct tctccccata cgggccctac 360

tggaagtaca tcaagaagct ctgcacctac gagctgctcg gagcgagaaa cctccaccat 420

ttccagccca tcaggacctt cgaggtccac acttttctcc ggcttctcat ggagaagagc 480

gaatccgggg agagctttaa tgtcaccgag gagctcatta agctcaccag caacgtcatg 540

tccaatatga tgctcggcac caggtgctcc gccacagacg gcgaggcgga ggcggctagg 600

acggtgatcc gggaggtgac ggagatcttc ggggagttcg atgctgctga tatcatctgg 660

ttctgtaaga acttcgattt gcagggaata aggaagaggt cggaggatat tcagagaagg 720

tatgatgctt tgctggaaaa gattatcacc gacagagaga agctccggcg gagccaccgc 780

ggcggcgagg ccaaggattt tcttgatatc tttctggata taatggacag tggcaactct 840

gaggtgaaat tcagcagaga acatctcaaa gctttgattt tggatttctt caccgctggt 900

acagacacaa cggcgatcag cacagagtgg gcaatagcag aactgatgaa caacccaaag 960

gtactaaaga aagcacaaga agagatccag aaagtggtgg gatcttgtag attgatggat 1020

gaatcagacg cccctaatct cccatacctt gaggccatca tcaaggagac cttcaggctc 1080

caccctccga tcccgatgct tgcccggaaa tccgtctccg attgcgtcat cgacggctac 1140

aacatcccgg cgagcactct cctcttcgtc aacatttggt ccattggtcg gaaccccgag 1200

tgttgggaca gccccttctc cttccggccc gaacgcttct tcgagaagga caacgcttcg 1260

atcgatatca aggggcagca cttccagctg ctgccttttg gaacgggcag gaggggctgc 1320

ccgggaatgc ttttggccat acaggagctg ctacttatca taggcactat gattcagtgc 1380

tttgattggg aattgcctga gggttcgggc cctgtcgaca tgaccgaacg ggccgggttg 1440

actgctccac gggctgaaga tttgatttgt cgggtctcct gccgggttga cccgaaaatt 1500

gttttctag 1509

<210> 6

<211> 1554

<212> DNA

<213> 黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)

<400> 6

atggagttga gctctgtcat ctatggcgcc atcgccttgc tctctctttt ctactgttac 60

ctacacttct ccaagccaaa aaagagttcc ctgaacgcgc cgccggaggc tggcggcgcg 120

cgcttcatca ccggccacct ccacctgatg gacggccgct ccgcctccga caaacttcct 180

cacataaacc tgggtttgct tgcagaccag cacggcccaa tcttcacgat caggctgggc 240

gtgcaccgag ccgtggtggt gagcagctgg gagctagcca aggagatctt caccacccac 300

gacacggcgg tcatggctcg gccccggctc atagccgacg actacctgag ctacgacgga 360

gcctcgcttg ggttctcacc ctacggacca tactggcgcg aaatccgcaa gctggtcacc 420

accgagctgc tctcggctcg ccggatcgag ctgcagcgag ccacgcgtgt gcgtgagatc 480

acgcagttca ccggcgagct ctacaagctg tgggaggaga agaaagacgg gtctgggagg 540

gttttggtgg acatgaagca gtggctgggg aacttgagcc tcaatctggt gtcgaggatg 600

gtggtgggca agaggttcta cggcggcgac gactcggaga cgaccaagag gtggcggggc 660

gtcatgaggg agttcttcca gctcatcgga cagttcatcc ccggcgacgg gcttccgttt 720

ctccggtggc tcgacttggg tgggttcgag aagaggacga gggacactgc ctatgagctg 780

gataagatca tcgcaatgtg gctggcggag tatcggaaaa gggaatattc cggcgacgac 840

aaggagcagt gcttcatggc cctcatgctc tcactcgtgc aagctaatcc cactctgcaa 900

ctccactacg atgctgatac catcatcaaa gctacttgcc aggttttgat atcggcggca 960

agtgacacga cgacggtgat cctaatctgg gtaatttccc tcctactaaa caatgctgat 1020

gtcctaaaaa aggttcaaga agaactggac gaacaagtgg ggagagaaag acgagtggaa 1080

gaatcggaca taagcaattt accctacctc caagcggtgg tgaaggagac aatgaggcta 1140

taccctccgg cccccttcgc cggagtacga gccttcagcg aagactgcac cgtgggaggc 1200

taccacatcc agaaaggcac gtttttgata gtcaatctgt ggaagctgca tcgagaccct 1260

cgtgtgtggt ccgatgatgc cttggagttc aaaccacaac ggttttttga caaaaaggtg 1320

gaggttaagg gtcaggactt cgagttgatg ccatttggtg gtggtcgaag aatgtgtccc 1380

ggctcgaacc tgggcatgca catggtgcac tttgtgctgg ctaacatatt gcaggccttt 1440

gacataacca ctgggtccac tgtggatatg accgagagtg ttgggttgac caacatgaaa 1500

gccacaccac ttgatgctat tctcactcca aggttgtcac ctactctata ttaa 1554

<210> 7

<211> 2079

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 7

atgacctctg ccttgtacgc ctctgatctt tttaagcaat tgaagtctat catgggaact 60

gactctctta gtgacgatgt cgtccttgtc atcgccacta cctctcttgc tcttgttgcc 120

ggtttcgtcg tcttgctttg gaaaaagacc actgccgaca gatctggaga acttaagcct 180

ttgatgatcc ctaagtcttt gatggccaag gatgaggatg acgaccttga ccttggttct 240

ggaaagacta gagtttctat cttcttcgga actcaaactg gaactgctga aggattcgcc 300

aaggcccttt ctgaagagat caaggctaga tacgagaagg ctgccgtcaa ggtcatcgac 360

cttgacgatt acgccgctga tgatgaccag tatgaagaga agcttaagaa ggagactctt 420

gccttttttt gcgtcgctac ctacggtgac ggtgaaccaa ccgacaacgc tgctagattt 480

tctaagtggt ttaccgagga aaatgaaaga gacatcaaac ttcagcagtt ggcctacgga 540

gtctttgcct tgggtaatag acagtacgag cattttaaca agattggtat tgtccttgat 600

gaagaacttt gtaagaaagg tgccaagagg cttattgagg ttggattggg tgacgacgac 660

cagagtatcg aagacgactt taacgcttgg aaggagtctc tttggtctga gcttgacaag 720

cttcttaagg acgaggacga caagtctgtc gccaccccat ataccgctgt cattccagaa 780

tatagagtcg tcacccacga tccaaggttc actactcaga aatctatgga atctaatgtt 840

gctaatggaa acaccaccat tgacatccac catccatgca gagtcgatgt cgccgtccaa 900

aaagagttgc acacccatga gagtgataga tcttgcattc acttggagtt cgacatctct 960

aggaccggta tcacctatga gaccggtgat cacgtcggag tttacgccga gaaccacgtc 1020

gaaatcgtcg aggaagccgg aaagttgttg ggacatagtc ttgatttggt tttttctatt 1080

cacgctgata aggaagacgg atctccattg gagagtgctg tccctccacc tttccccgga 1140

ccatgtacct tgggaaccgg tcttgccaga tacgccgacc ttttgaaccc accaaggaag 1200

tctgctttgg tcgctttggc tgcttacgct accgagccaa gtgaagccga gaagcttaaa 1260

cacttgacca gtccagatgg taaggacgaa tactctcagt ggattgtcgc ctctcagagg 1320

agtttgcttg aagtcatggc cgcctttcct agtgctaagc ctcctcttgg tgtctttttc 1380

gccgctatcg ccccaagatt gcagccaagg tactatagta tcagttcttg ccaagattgg 1440

gccccatcta gggttcatgt caccagtgcc cttgtctatg gaccaactcc aactggtagg 1500

attcacaagg gtgtctgcag tacttggatg aagaacgctg ttccagccga aaagtctcac 1560

gagtgttctg gtgcccctat cttcatcaga gctagtaatt ttaaattgcc ttctaaccca 1620

tctaccccta tcgtcatggt tggtcccgga actggtcttg ccccttttag aggttttttg 1680

caagaaagga tggcccttaa agaggacggt gaggagcttg gttcttctct tcttttcttt 1740

ggttgcagaa atagacaaat ggattttatt tatgaagatg aattgaacaa cttcgtcgac 1800

caaggagtca tctctgagct tattatggct ttctctaggg agggagccca gaaagaatac 1860

gttcagcata agatgatgga gaaagccgcc caagtctggg atcttatcaa agaggaggga 1920

tacttgtatg tctgtggaga cgctaaggga atggctaggg acgtccatag aacccttcac 1980

actatcgtcc aagaacaaga gggagttagt agttctgagg ccgaagccat cgtcaagaag 2040

ttgcaaaccg agggtaggta tcttagggac gtttggtga 2079

<210> 8

<211> 1431

<212> DNA

<213> 黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)

<400> 8

atgggtcagc ttcacattgt ccttgtccct atgatcgccc acggtcacat gatccctatg 60

ttggacatgg ctaaactttt tagttctagg ggtgttaaga ccaccatcat cgctactcca 120

gccttcgctg aaccaattag aaaagctagg gagagtggtc acgacatcgg attgaccacc 180

accaagttcc cacctaaggg atctagtctt ccagataata ttagaagttt ggaccaagtt 240

accgacgact tgttgcctca cttctttaga gctcttgagt tgttgcaaga accagtcgag 300

gagattatgg aggacttgaa gccagattgc ttggtcagtg acatgttcct tccatggacc 360

accgacagtg ccgctaagtt cggtatccca agattgcttt tccacggaac cagtcttttc 420

gctaggtgct ttgccgagca gatgagtatc cagaagcctt ataagaatgt cagttctgac 480

tctgagccat tcgtccttag aggtttgcca cacgaggtct ctttcgtcag aacccagatt 540

ccagactacg aattgcaaga gggaggagac gacgccttct ctaagatggc caaacagatg 600

agggacgccg acaagaagag ttatggtgac gttatcaact cttttgaaga attggagtct 660

gaatacgctg actataataa aaatgtcttc ggaaagaaag cttggcacat cggtcctctt 720

aagttgttca acaatagagc tgagcagaag tcttctcaga ggggtaagga gagtgccatc 780

gatgaccacg agtgccttgc ttggcttaac tctaagaagc caaattctgt cgtttacatg 840

tgcttcggaa gtatggccac cttcactcca gctcaacttc acgagaccgc tgtcggactt 900

gagagtagtg gtcaagattt catctgggtc gtcagaaacg gtggtgagaa tgaggactgg 960

ttgccacaag gattcgagga gagaatcaaa ggtaagggac ttatgattag gggttgggct 1020

ccacaagtta tgatcttgga ccacccaagt accggtgctt tcgtcaccca ctgcggatgg 1080

aactctacct tggagggtat ctgcgccgga cttccaatgg tcacttggcc agtctttgct 1140

gagcagttct ataatgagaa gcttgtcacc gaagtcctta agaccggagt ctctgtcggt 1200

aacaagaagt ggcaaagggt cggagaagga gtcggaagtg aagccgttaa ggaggccgtt 1260

gagagagtca tggttggaga tggagccgcc gaaatgagaa gtagggcctt gtactacaag 1320

gaaatggcta gaaaagccgt cgaggaggga ggaagttctt acaataacct taacgctttg 1380

atcgaagagt tgagtgccta cgtccctcct atgaaacaag gattgaattg a 1431

<210> 9

<211> 1581

<212> DNA

<213> 黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)

<400> 9

atgctatatg acaacagcca atacttagcc atggaattca gttctgccat ttatggagcc 60

attgccttct ttcttttctt atactattgc ctgctctata caacatcttc caagccaaat 120

accagagctt acaaagcacc gccggaggct ggcggggcgc gcctcttttc cggccatctc 180

catctcatgg ctggtggcac caccggtgaa cttccccaca tcaacttggc taacttagca 240

gataaacacg gcccagtttt cacaatccgg ctgggcgtaa agcgagcctt ggtggtgagc 300

agttgggaat cagccaaaga actgttcact acctgtgacg tggcggtgtc gtcccgtcca 360

cgtatgaagg cggcgaagct cttaggctat gatttcgcca tgtttgggtt cgccccatac 420

ggtgcatact ggcgtgagct gcgaaaactg atctcagttg agcttctctc aactcgtaga 480

atggagttgc agaaagaggt tcgagattca gaaactaggg agtccattaa agagctttat 540

aagctttggg aagagagaag tgagggttcg gacagtgtgt tggtggacat gaagcagtgg 600

tttggggact tgaacttgaa tgttgtcctg agaatggtgg cggggaagag atggatcggc 660

ccggagacgg ggcggtggag ggaggtgctg agggatttct tctacttggc ggggatgttt 720

gttccggccg atgcctttcc gtttcttggg tggttggatt taggcggaca tgagaagaga 780

atgaggcaaa ctgctaaaga attggacgga attgttggag gatgggtggc ggagcatcgg 840

gaaaaggaat attccggcga agataagcca aaggatttcg tcgatgttat gttgtctgtt 900

gtacaaggtt caagtcttcg agctgactat gatgctgata ccatcatcaa agcaacatgc 960

gaggctttga ttgtgggtgg aagtgacact acaacagtga tgctaatatg gacactttct 1020

ttcctattga ataatcggca tgttctgaga aaggctcaag aagagctgga caagcatgta 1080

ggaagggaaa gacgtgtaaa ccaatcagac atcaacaact tagtctatct tcaggcaata 1140

gttaaagaga ctttgagatt ataccctgct ggccccattg gtgggatacg agagttcacc 1200

caagattgcc aagtcggagg ctaccacgtt cctaaaggca cgtggctgat cgtgaacttg 1260

tggaagttgc atcgagatcc caaggtttgg tcagaagatt gtttggaatt taggccagaa 1320

cgatttctaa ataaaaacat agatgtcagg ggtcaagatt tcgagttgat cccatttggt 1380

ggtggtcgga ggatttgccc cggggctaat tttgggctgc atatgctgca tttggtgttg 1440

gctaacttgc tgcaagcttt cgagctcacc actgtgtccg atcaagtgat tgatatgacg 1500

gagagtgctg gaatgacaaa tatgaaagcc acaccactta atgttcttgt tgccccaagg 1560

ttgtctccca ctctttactg a 1581

<210> 10

<211> 705

<212> DNA

<213> 黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)

<400> 10

atgatcgaga agtacaaccg caccattctc cagagcgaca ctctcctcaa gtacattttg 60

gaaacgagtg cctttcccag agaacatgaa cagcttaagg agctgagaga agctactgtt 120

gaaaagtaca aagcttggag tttgatgaat gtgcctgctg atgaggggca gtttatttcg 180

atgcttttga aaataatgaa tgcaaagaag acaattgaaa ttggggtttt cactggatac 240

tcacttctct ctacagctct tgctcttcct catgatggca aaataatagc aattgatcca 300

gacaaagaag catatgagac tggtctgccc agcattcaga aggccaacat ggctcacaaa 360

attcacttct tcgattctcc tgccacacaa atcttggatg atctcatcgc caagggagaa 420

gaaggcacgt tcgattttgc atttgtggat gcagacaaag aaaactacat gaattatcac 480

gagcaattat tgaaactggt taagattggg ggagtgatcg ggtacgacaa caccctatgg 540

ttcggtacgg tggcatcgcc tgagacggag gagatgttgg agtttgtgaa gagtagtcga 600

gcccatatgg tggagttgaa ctcttttctt gcaaccgatt ctcgtatcga gttagcccat 660

ctttctatcg gagatggact tgctttgtgc aagcgtctca aatga 705

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

tcaattgaac aactatttcg atggagactg tagaaaacca 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

gccgccgcgg ctcgaggtac atttgaaaga gtagctgctt 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

tcaattgaac aactatttcg atggtgacag ttgaagaatt 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

gccgccgcgg ctcgaggtac attgagaggc acactatgca 40

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

tcaattgaac aactatttcg atgtctgctt cgccatccg 39

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

gccgccgcgg ctcgaggtac aaacaactcc gatagtcttg 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

tcaattgaac aactatttcg atggacttag tagaagtcac 40

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

gccgccgcgg ctcgaggtac gaaaacaatt ttcgggtcaa 40

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 19

tcaattgaac aactatttcg atggagttga gctctgtcat 40

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 20

gccgccgcgg ctcgaggtac atatagagta ggtgacaacc 40

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 21

tcaattgaac aactatttcg atgctatatg acaacagcca 40

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 22

gccgccgcgg ctcgaggtac gtaaagagtg ggagacaacc 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 23

tcaattgaac aactatttcg atgatcgaga agtacaaccg 40

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 24

gccgccgcgg ctcgaggtac tttgagacgc ttgcacaaag 40

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 25

gaccttcgtt tgtgcggatc agatcttttt tgtagaaatg tc 42

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 26

gctatggtgt gtgggggatc tctcacttaa tcttctgtac 40

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 27

ttactcttcc agattttctc agatcttttt tgtagaaatg 40

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 28

gcgatgcgcg gagtccgaga tctcacttaa tcttctgtac 40

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 29

ggcagtaatt gatatactag attttggtca tgcatgagat 40

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 30

gacctaccct acgacgggcc ttgaagctat ggtgtgtggg 40

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 31

taagggattt tggtcatgca aaagagtgag aggaaagtac 40

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 32

aaaagatctg atctcatgca caaaagcctg ctagatgtgc 40

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 33

ggggtgagcc tcaaggtata tag 23

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 34

gggatagcca tcgtttcgaa t 21

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 35

ctatgaccat gattacgaat tcgagct 27

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 36

tgcctgcagg tcgactctag 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 37

catgattacg aattcgagct 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 38

gtcgactcta gacggactca 20

Claims

1.一种生产黄芩素或黄芩苷的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1) 提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化外源基因组合的表达盒，所述外源基因组合为PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1和F6H，用于生产黄芩素；或，所述外源基因组合为PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1、F6H和UBGT，用于生产黄芩苷；所述PAL基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 1，所述4CL基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 2，所述CHS-2基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 3，所述CHI基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 4，所述FNSII-2基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 5，所述CPR1基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 7，所述F6H基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 6；所述UBGT基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 8；所述酵母工程菌为毕赤酵母(Pichia pastoris)；和

(2) 培养(1)的酵母工程菌，从而生产黄芩素或黄芩苷。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该毕赤酵母中 KU70基因功能被下调或缺失。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述酵母工程菌中转化PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1、F6H时，制备PAL+4CL的基因片段、CHS-2+CHI+FNSII-2的基因片段、F6H+CPR1的基因片段，引入酵母工程菌。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中利用酵母培养基进行培养，培养期间补加碳源。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，每隔12～36小时添加1次葡萄糖，添加至终浓度1～4%(v/v)。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，不添加前体L-苯丙氨酸和/或丙二酰辅酶A。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)的培养时间为100～200小时。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)的培养时间为55～95小时。

10.用于生产黄芩素或黄芩苷的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌中转化外源基因组合的表达盒，所述外源基因组合为PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1和F6H，用于生产黄芩素；或，所述外源基因组合为PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1、F6H和UBGT，用于生产黄芩苷；所述PAL基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 1，所述4CL基因核苷酸序列如SEQ IDNO: 2，所述CHS-2基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 3，所述CHI基因核苷酸序列如SEQ ID NO:4，所述FNSII-2基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 5，所述CPR1基因核苷酸序列如SEQ ID NO:7，所述F6H基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 6；所述UBGT基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 8；所述酵母工程菌为毕赤酵母。

11.基因组合的用途，所述的基因组合为下组基因的组合：PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1和F6H，该基因组合用于转化入酵母工程菌中，制备黄芩素；或所述的基因组合为下组基因的组合：PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1、F6H和UBGT，该基因组合用于转化入酵母工程菌中，制备黄芩苷；所述PAL基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 1，所述4CL基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 2，所述CHS-2基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 3，所述CHI基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 4，所述FNSII-2基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 5，所述CPR1基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 7，所述F6H基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 6；所述UBGT基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 8；所述酵母工程菌为毕赤酵母。

12.用于生产黄芩素的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中装入表达构建体和毕赤酵母，该表达构建体中含有外源基因组合的表达盒；或

该试剂盒中装入酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化外源基因组合的表达盒，所述酵母工程菌为毕赤酵母；

其中，所述外源基因组合为PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1和F6H；所述PAL基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 1，所述4CL基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 2，所述CHS-2基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 3，所述CHI基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 4，所述FNSII-2基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 5，所述CPR1基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 7，所述F6H基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 6。

13.用于生产黄芩苷的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中装入表达构建体和毕赤酵母，该表达构建体中含有外源基因组合的表达盒；或

其中，所述外源基因组合为PAL、4CL、CHS-2、CHI、FNSII-2、CPR1、F6H和UBGT；所述PAL基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 1，所述4CL基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 2，所述CHS-2基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 3，所述CHI基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 4，所述FNSII-2基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 5，所述CPR1基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 7，所述F6H基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 6，所述UBGT基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 8。