CN114561369B

CN114561369B - 用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN114561369B
Application number: CN202210252104.6A
Authority: CN
Inventors: 黎胜红; 刘燕; 陈月桂; 刘艳春
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2022-03-15
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2042-03-15
Also published as: CN116790544A; CN116790545A; CN114561369A; CN116790543A; CN116790542A

Abstract

本发明属于天然产物生物合成技术领域，具体涉及用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因和应用。本发明的PpUGT1和PpUGT2能够催化薯蓣皂苷元/偏诺皂苷元分别合成地索苷和偏诺皂苷元‑3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷，PpUGT3能够催化地索苷/偏诺皂苷元‑3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷分别合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI，PpUGT4和PpUGT5能够催化重楼皂苷V和VI分别合成薯蓣皂苷元‑3‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖‑(1‑2)‑[β‑D‑吡喃葡萄糖‑(1‑6)]‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷和trikamsterosideB。本发明的糖基转移酶为重楼皂苷提供了高效的生物合成方法。

Description

用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于天然产物生物合成技术领域，具体涉及用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因和应用。

背景技术

重楼是黑药花科(Melanthiaceae)重楼属(Paris)植物的统称，全世界共有27种，我国分布有21种，其中18种为我国特有种，并以云贵高原至四川一带分布最为集中。重楼具有重要的药用价值，在我国有着悠久的利用历史。其中滇重楼(云南重楼，P.polyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)和七叶一枝花(P.polyphylla Smithvar.chinensis(Franch.)Hara)的干燥根茎收载于《中华人民共和国药典》，具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊的功能，主治疔疮痈肿，咽喉肿痛，蛇虫咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐。现代药理学研究表明重楼具有止血、抗肿瘤、抑菌、镇痛、抗早孕等活性。

重楼皂苷是重楼的主要活性成分，其中重楼皂苷I、II和VII的总含量是《中国药典》规定用于重楼质量评价的标准。重楼皂苷具有广泛的药理活性，包括止血、缩宫、抗肿瘤、抑菌、抗心机缺血和免疫调节作用等。重楼皂苷结构复杂，化学合成难以实现，从重楼中直接分离纯化难度较大、且受重楼资源短缺限制，严重制约了该类天然产物的开发和应用。

糖基化修饰是重楼皂苷生物合成的关键步骤，其依赖于糖基转移酶催化完成，对重楼皂苷的生物活性、生物利用度、水溶性等具有重要影响。中国专利申请202110109409.7公开了薯蓣皂苷元/偏诺皂苷元-3-O-β-D-葡萄糖基转移酶PpUGT73E5及其在重楼皂苷合成中的应用，该酶属于UGT73家族，对底物薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元的Km值分别为53.69±9.37和73.43±8.16μM，表明其对底物的亲和力不高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因和应用，本发明的用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶对底物的亲和力高。

本发明提供了用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶，包括1)～6)中的糖基转移酶中的一种或几种：

1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的PpUGT1；

2)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的PpUGT2；

3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的PpUGT3；

4)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的PpUGT4；

5)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的PpUGT5；

6)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。

本发明还提供了上述方案所述糖基转移酶的编码基因，包括1)～6)中的编码基因中的一种或几种：

1)核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的PpUGT1的编码基因；

2)核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的PpUGT2的编码基因；

3)核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的PpUGT3的编码基因；

4)核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的PpUGT4的编码基因；

5)核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的PpUGT5的编码基因；

6)SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明还提供了包含上述方案所述编码基因的重组载体、表达盒或重组菌。

本发明还提供了上述方案所述的糖基转移酶或者所述的编码基因或者所述的重组载体、表达盒或重组菌在制备含有糖基转移酶的转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述方案所述的糖基转移酶或者所述的编码基因或者所述的重组载体、表达盒或重组菌在合成重楼皂苷中的应用。

优选的，所述重楼皂苷包括化学结构式分别如式I～式VI所示的地索苷、偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、重楼皂苷V、重楼皂苷VI、薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B中的一种或几种；

优选的，当所述糖基转移酶为PpUGT1和/或PpUGT2时，所述重楼皂苷为地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

优选的，当所述糖基转移酶为PpUGT3时，所述重楼皂苷为重楼皂苷V和/或重楼皂苷VI。

优选的，当所述糖基转移酶为PpUGT4和/或PpUGT5时，所述重楼皂苷为薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和/或trikamsteroside B。

优选的，所述PpUGT1和PpUGT2分别以薯蓣皂苷元为底物合成地索苷；所述PpUGT1和PpUGT2分别以偏诺皂苷元为底物合成偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；

所述PpUGT3以地索苷为底物合成重楼皂苷V；所述PpUGT3以偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物合成重楼皂苷VI；

所述PpUGT4和PpUGT5分别以重楼皂苷V为底物合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷；所述PpUGT4和PpUGT5分别以重楼皂苷VI为底物合成trikamsteroside B。

本发明提供了用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶，包括1)～6)中的糖基转移酶中的一种或几种：1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的PpUGT1；2)氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的PpUGT2；3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的PpUGT3；4)氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示的PpUGT4；5)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的PpUGT5；6)SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。本发明的糖基转移酶PpUGT1和PpUGT2分别以薯蓣皂苷元为底物合成地索苷；所述PpUGT1和PpUGT2分别以偏诺皂苷元为底物合成偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；所述PpUGT3以地索苷为底物合成重楼皂苷V；所述PpUGT3以偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物合成重楼皂苷VI；所述PpUGT4和PpUGT5分别以重楼皂苷V为底物合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷；所述PpUGT4和PpUGT5分别以重楼皂苷VI为底物合成trikamsteroside B。本发明的糖基转移酶对底物的亲和力好，PpUGT1和PpUGT2以薯蓣皂苷元为底物时的Km值分别为20.1和16.1μM；PpUGT4和PpUGT5以重楼皂苷VI为底物时的Km值分别为32.5和22.1μM。本发明的糖基转移酶为重楼皂苷提供了高效的生物合成方法，并为重楼皂苷的人工合成以及构建新的重楼皂苷衍生物奠定了基础。

附图说明

图1为合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖基转移酶PpUGT1和PpUGT2、合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI的糖基转移酶PpUGT3、合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B的糖基转移酶PpUGT4和PpUGT5编码基因的PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中M泳道为DL2000DNAMarker，泳道1、2、3、4和5为目的条带(1668，1773，1455，1398，1404bp)；

图2为实施例2中表达合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖基转移酶PpUGT1的大肠杆菌表达质粒结构示意图；

图3为实施例2中表达合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖基转移酶PpUGT2的大肠杆菌表达质粒结构示意图；

图4为实施例2中表达合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI的糖基转移酶PpUGT3的大肠杆菌表达质粒结构示意图；

图5为实施例2中表达合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B的糖基转移酶PpUGT4的大肠杆菌表达质粒结构示意图；

图6为实施例2中表达合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B的糖基转移酶PpUGT5的大肠杆菌表达质粒结构示意图；

图7为实施例4中酶促反应产物的HPLC分析图谱；其中A为PpUGT1和PpUGT2分别以薯蓣皂苷元(1)和偏诺皂苷元(2)为底物，UDP-葡萄糖为糖供体的酶活产物的HPLC分析图谱；B为PpUGT1和PpUGT2的催化反应；C为PpUGT3分别以地索苷(3)和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)为底物，UDP-鼠李糖为糖供体的酶活产物的HPLC分析图谱；D为PpUGT3的催化反应；E为PpUGT4和PpUGT5分别以重楼皂苷V(5)和重楼皂苷VI(6)为底物，UDP-葡萄糖为糖供体的酶活产物的HPLC分析图谱；F为PpUGT4和PpUGT5的催化反应；

图8为实施例5中Lineweaver–Burk plot得到的用于计算Km值的函数；A和B分别为PpUGT1和PpUGT2以薯蓣皂苷元为底物时Lineweaver–Burk plot得到的函数；C和D分别为PpUGT4和PpUGT5以重楼皂苷VI为底物时Lineweaver–Burkplot得到的函数。

具体实施方式

本发明提供了本发明提供了用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶，包括1)～6)中的糖基转移酶中的一种或几种：

1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的PpUGT1；

2)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的PpUGT2；

3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的PpUGT3；

4)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的PpUGT4；

5)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的PpUGT5；

在本发明中，PpUGT1～PpUGT5分别由555、590、484、465和467个个氨基酸组成，分子量分别预测为61.5、64.8、52.1、52.7和52.5kDa，将PpUGT1～PpUGT5分别放在NCBI中进行BLASTX分析比对，结果显示PpUGT1在氨基酸水平上与海枣(Phoenix dactylifera)的甾醇3-β-葡萄糖转移酶UGT80A2-like isoform X1(XP_038974355.1)同源性为84.44％，PpUGT2氨基酸序列与XP_038974355.1同源性为82.9％，PpUGT3氨基酸序列与海枣(Phoenixdactylifera)莨菪亭葡萄糖转移酶(XM_039127341.1)的同源性为73.05％，PpUGT4和PpUGT5在氨基酸水平上与Musa acuminata subsp.malaccensis的UDP-葡萄糖转移酶91C1-like isoform X3(XP_009408288.1)同源性分别为53.8％和54.11％，此外，通过Target P软件预测PpUGT1、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5是不含转运肽的蛋白，PpUGT2是一个含有38个氨基酸转运肽的蛋白。

本发明提供的糖基转移酶PpUGT1和PpUGT2均能高效催化薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元分别生成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；PpUGT3高效催化地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷分别合成重楼皂苷V和VI；糖基转移酶PpUGT4和PpUGT5高效催化重楼皂苷V和VI分别合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B。地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷是重楼皂苷生物合成途径的关键中间化合物；重楼皂苷V和重楼皂苷VI为重要的重楼皂苷，也是重楼皂苷I、II、III或VII和H生物合成的关键中间化合物；薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B为重楼属植物的微量成分。本发明为地索苷、偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、重楼皂苷V、重楼皂苷VI、薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B提供了高效的生物合成方法，并为重楼皂苷的人工合成以及构建新重楼皂苷衍生物奠定了基础。

1)核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的PpUGT1的编码基因；

2)核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的PpUGT2的编码基因；

3)核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的PpUGT3的编码基因；

4)核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的PpUGT4的编码基因；

5)核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的PpUGT5的编码基因；

本发明中，所述SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示编码基因的开放阅读框分别为1668、1773、1455、1398和1404bp。PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5的编码基因的发现丰富了糖基转移酶编码基因的多样性。

本发明对PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5的编码基因的cDNA序列的获取方法并没有特殊限定，采用本领域常规的cDNA获取方式即可。

本发明从黑药花科植物滇重楼(Pairs polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)出发，克隆并功能鉴定了重楼皂苷生物合成途径中5个糖基转移酶PpUGT1～PpUGT5的编码基因。

本发明对所述重组载体的基础载体并没有特殊限定，本发明实施例中所述重组载体的基础载体优选为pCold TF。

在本发明中，所述重组菌的原始菌优选为大肠杆菌、酿酒酵母或农杆菌。本发明对所述大肠杆菌、酿酒酵母或农杆菌的种类并没有特殊限定；在本发明中，所述大肠杆菌优选为菌株Rosetta(DE3)或大肠杆菌BL21(DE3)菌株。本发明对所述构建重组载体以及转化的方法并没有特殊限定，采用本领域常规的方法即可。在本发明具体实施过程中，将所述编码基因与原核表达载体连接，构建成为能够在大肠杆菌中表达的重组质粒，再将重组质粒转化至大肠杆菌中构建成为重组菌。

在本发明中，当所述重组菌为重组大肠杆菌或者重组酿酒酵母时，将重组大肠杆菌或重组酿酒酵母进行发酵培养，得到含有糖基转移酶的重组菌的发酵液。

在本发明中，所述转基因植物优选的包括转基因烟草。

在本发明中，当所述重组菌为重组农杆菌时，本发明将重组农杆菌转染本氏烟草瞬时表达，得到含有糖基转移酶的新鲜烟叶。

在本发明中，所述重楼皂苷包括化学结构式分别如式I～式VI所示的地索苷、偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、重楼皂苷V、重楼皂苷VI、薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B中的一种或几种；

在本发明中，当所述糖基转移酶为PpUGT1和/或PpUGT2时，所述重楼皂苷为地索苷和/或偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

在本发明中，当所述糖基转移酶为PpUGT3时，所述重楼皂苷为重楼皂苷V和/或重楼皂苷VI。

在本发明中，当所述糖基转移酶为PpUGT4和/或PpUGT5时，所述重楼皂苷为薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和/或trikamsteroside B。

在本发明中，所述PpUGT1和PpUGT2独立的以薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元为底物分别合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；所述PpUGT3以地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物分别合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI；所述PpUGT4和PpUGT5独立的以重楼皂苷V和重楼皂苷VI为底物分别合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B。

本发明中，所述合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖基转移酶PpUGT1和PpUGT2及其编码基因是通过催化薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，所述合成重录皂苷V和重楼皂苷VI的糖基转移酶PpUGT3及其编码基因是通过催化地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷分别合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI，所述合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B的糖基转移酶PpUGT4和PpUGT5及其编码基因是通过催化重楼皂苷V和重楼皂苷VI分别合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖基转移酶PpUGT1和PpUGT2，合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI的糖基转移酶PpUGT3，合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B的糖基转移酶PpUGT4和PpUGT5编码基因cDNA序列的获取及生物信息学分析：

根据分子克隆手册从滇重楼中获取RNA，利用SMART^TM RACE cDNAAmplificationKit试剂盒中引物5’-CDS primer和SMART IITM A oligonucleotide进行反转录合成cDNA，并以基因特异性引物进行PCR扩增，得到PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5编码基因全长cDNA序列。

经分析，PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5编码基因的开放阅读框(ORF)分别为1668bp(SEQ ID NO.6)、1773bp(SEQ ID NO.7)、1455bp(SEQ ID NO.8)、1398bp(SEQ IDNO.9)和1404bp(SEQ ID NO.10)，分别编码555个氨基酸(SEQ ID NO.1)、590个氨基酸(SEQID NO.2)、484个氨基酸(SEQ ID NO.3)、465个氨基酸(SEQ ID NO.4)和467个氨基酸(SEQID NO.5)，分子量分别预测为61.5、64.8、52.1、52.7和52.5kDa。PpUGT 3、PpUGT 4和PpUGT5包含具有44个氨基酸的plant secondary product glycosyltransferases(PSPG)盒，PpUGT1和PpUGT2的PSPG盒中插入了16个氨基酸，将PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5编码基因放在NCBI中运用BLASTX进行同源性搜索，PpUGT1和PpUGT2氨基酸序列与海枣(Phoenix dactylifera)的甾醇3-β-葡萄糖基转移酶UGT80A2-like isoform X1(XP_038974355.1)同源性分别为84.44％和82.9％，PpUGT3氨基酸序列与海枣莨菪亭葡萄糖转移酶/XM_039127341.1的同源性为73.05％，PpUGT4和PpUGT5安激素序列与Musa acuminatasubsp.malaccensis的UDP-葡萄糖基转移酶91C1-like isoform X3(XP_009408288.1)同源性分别为53.8％和54.11％，此外，通过Target P软件预测PpUGT1、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5是不含转运肽的蛋白，PpUGT2是一个含有38个氨基酸转运肽的蛋白。

实施例2

合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖基转移酶PpUGT1和PpUGT2，合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI的糖基转移酶PpUGT3，合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B的糖基转移酶PpUGT4和PpUGT5编码基因表达载体构建：

以实施例1合成的PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5基因cDNA为模板，PpUGT1F:5’-aaggtaggcatatggagctcatgcctgaagaggtgaataattct-3’(SEQ ID NO.21)和PpUGT1R:5’-tatctagactgcaggtcgactcacgaacaaccaaagcatctccgt-3’(SEQ ID NO.22)，PpUGT2F:5’-aaggtaggcatatggagctcatggcggagagcggcagtggagcag-3’(SEQ ID NO.23)和PpUGT2R:5’-tatctagactgcaggtcgactcaggagcagcccatgtacttc-3’(SEQ ID NO.24)，PpUGT3F:5’-aaggtaggcatatggagctcatgggctccgacgatcgtcaacctc-3’(SEQ ID NO.25)和PpUGT3R:5’-tatctagactgcaggtcgactcagtctttcgattcctttctggat-3’(SEQ ID NO.26)，PpUGT4F:5’-aaggtaggcatatggagctcatgggagaagacaatggaagccttc-3’(SEQ ID NO.27)和PpUGT4R:5’-tatctagactgcaggtcgacttacattttcaaaggctgaggtttc-3’(SEQ ID NO.28)，PpUGT5F:5’-aaggtaggcatatggagctcatggaagaaggcaatgaaagccttc-3’(SEQ ID NO.29)和PpUGT5R:5’-tatctagactgcaggtcgacttacagcttcagaggttgtggcgtc-3’(SEQ ID NO.30)为引物对，利用高保真酶PrimeSTAR HS DNAPolymerase进行PCR扩增，PCR体系为50μL。

PCR扩增反应体系为：

5×PrimeSTARHSBuffer	10μL
		dNTPMixture(2.5mMeach)	4μL
PrimerF	1μL
		PrimerR	1μL
TemplatecDNA	0.5μL
		PrimeSTARHSDNAPolymerase	0.5μL
去离子水	33μL

PCR扩增的反应程序为：98℃10sec，60℃15sec，72℃2min，35个循环。程序结束后进行产物回收纯化。

pCold TF载体经限制性核酸内切酶KpnI和SalI双酶切，37℃反应3h，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，并进行产物回收纯化。纯化的PCR产物与载体pColdTF连接，即将PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5编码基因cDNA克隆到N末端含有HIS标签的pColdTF表达载体上，构建重组载体pCold TF/PpUGT1、pCold TF/PpUGT2、pCold TF/PpUGT3、pCold TF/PpUGT4和pColdTF/PpUGT5，其结构示意图如图2～图6所示。将重组载体pColdTF/PpUGT1、pCold TF/PpUGT2、pCold TF/PpUGT3、pCold TF/PpUGT4和pCold TF/PpUGT5转化大肠杆菌DH5α，涂布在添加氨苄青霉素(Amp:100μg/mL)的LB固体平板进行筛选，37℃恒温培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取单克隆进行PCR及酶切验证，选出阳性克隆进行DNA测序验证。

实施例3

糖基转移酶PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5重组蛋白的诱导表达及可溶性分析：

挑取测序正确的重组菌株提取质粒pCold TF/PpUGT1、pCold TF/PpUGT2、pColdTF/PpUGT3、pCold TF/PpUGT4和pCold TF/PpUGT5，将质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，利用添加氨苄青霉素(Amp:100μg/mL)的LB固体平板进行筛选，随机挑取单克隆进行菌落PCR验证，经验证正确的单克隆接种于6ml含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。活化后的菌按照1:100比例接种至50mL LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀值约为0.5。取5mL菌液作为对照，剩余加入45μL 0.3mM IPTG，16℃诱导过夜。配制相关蛋白纯化缓冲液，低温诱导的菌液经4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入7mL缓冲液1(20mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，5mM DTT，10mM咪唑)，重悬菌体；冰上超声破碎菌体20min；留取100μL作为对照，其余样品经4℃,12000rpm离心10min，转移上清，并加入500μLNi-NTAAgarose(购自Qiagen公司)，4℃孵育1h；将含有Ni-NTAAgarose的蛋白液加入Polypropylene柱(购自Qiagen公司)，分别以6mL缓冲液1、6mL缓冲液2(20mM Tris-HClpH8.0，500mM NaCl，5mM DTT，20mM咪唑)及3mL缓冲液3(20mM Tris-HCl pH8.0，500mMNaCl，5mM DTT，250mM咪唑)进行顺序洗脱，并同时收集洗脱液，缓冲液3洗脱液即为纯化后的蛋白，加入等体积甘油，混匀，-80℃保存，以10％SDS-PAGE按照相关操作步骤进行蛋白可溶性和大小分析，结果表明PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5重组蛋白的可溶性较好，蛋白大小在95KDa～140KDa之间。

实施例4

糖基转移酶PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5的体外酶活测试及产物分析：

反应液：50mM Tris-HCl(pH 8.0)，100μΜ糖供体，底物100μΜ，300μL粗酶，去离子水补足至400μL。将反应液混匀，30℃静置反应6h，加入等体积甲醇终止反应，真空减压干燥，加入100μL甲醇溶解，12000rpm离心20min，反应液经HPLC分析检测得图7。

PpUGT1和PpUGT2的底物是薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元，糖供体是UDP-葡萄糖；PpUGT3的底物是地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，糖供体是UDP-鼠李糖；PpUGT4和PpUGT5的底物是重楼皂苷V和重楼皂苷VI，糖供体是UDP-葡萄糖。UDP-葡萄糖和UDP-鼠李糖购自广州昂飞生物科技有限公司；薯蓣皂苷元(CAS 512-04-9)购自上海源叶生物科技有限公司；地索苷(CAS 14144-06-0)和重楼皂苷V(CAS 19057-67-1)购自成都曼思特生物科技有限公司；重楼皂苷VI(CAS 55916-51-3)购自成都植标化纯生物技术有限公司；偏诺皂苷元(CAS 507-89-1)和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(CAS 37341-36-9)来自本实验室。

HPLC色谱条件1：Aglient 1260系统，Aglient SDB-C18色谱柱(4μm，4.6×250mm)，CH₃CN-H₂O流动相(0-18min：44％-86％，18-22min:86％-100％，22-32min:100％，v/v)，37℃柱温，20μL进样体积，1mL/min流速，195nm检测波长。

由图7中的A和B可以看出，与对照组相比，PpUGT1和PpUGT2以薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元为底物时，均合成了1个特异产物，将其分别与标准品地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷进行对比，特异产物峰与标准品的保留时间一致，表明该产物分别是地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；由图7中的C和D可以看出，与对照组相比，PpUGT3以地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物时，均合成了1个特异产物，将其分别与标准品重楼皂苷V和重楼皂苷VI进行对比，特异产物峰与标准品的保留时间一致，表明该产物分别是重楼皂苷V和重楼皂苷VI；由图7中的E和F可以看出，与对照组相比，PpUGT4和PpUGT5以重楼皂苷V和重楼皂苷VI为底物时，均合成了1个特异产物，将其分别与标准品薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B进行对比，特异产物峰与标准品的保留时间一致，表明该产物分别是薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B。

实施例5

糖基转移酶PpUGT1、PpUGT2、PpUGT4和PpUGT5的酶动力学参数分析：

pColdTF/PpUGT1、pColdTF/PpUGT2、pColdTF/PpUGT4和pCold TF/PpUGT5的大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)在6mL添加氨苄青霉素(Amp:100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。活化后的菌按照1:100比例接种至50mL LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀值约为0.5。加入50μL 0.3M IPTG，16℃诱导过夜。配制相关蛋白纯化缓冲液，低温诱导的菌液经4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入7mL缓冲液1(20mM Tris-HCl pH8.0，500mMNaCl，5mM DTT，10mM咪唑)，重悬菌体；冰上超声破碎菌体10min；留取100μL作为对照，其余样品经4℃,12000rpm离心10min，转移上清，并加入500μLNi-NTAAgarose(购自Qiagen公司)，4℃孵育1h；将含有Ni-NTAAgarose的蛋白液加入Polypropylene柱(购自Qiagen公司)，分别以6mLbuffer 1、6Lbuffer 2(20mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，20mM咪唑)及3mLbuffer 3(320mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，250mM咪唑)进行顺序洗脱，并同时收集洗脱液，buffer3洗脱液即为纯化后的蛋白，加入等体积甘油，混匀，-20℃保存。

PpUGT1和PpUGT2的酶动力学参数测定：

反应液：50mM Tris-HCl(pH 8.0)，100μΜUDP-葡萄糖，纯化后的蛋白100μg，薯蓣皂苷元浓度梯度0，20，40，60，80，100μM，去离子水补足至300μL。将反应液混匀，37℃静置反应45min，加入等体积甲醇终止反应，真空减压干燥，加入100μL甲醇溶解，12000rpm离心20min，所的样品用于HPLC检测。

HPLC色谱条件2：Aglient 1260系统，Aglient SDB-C18色谱柱(4μm，4.6×250mm)，CH₃CN-H₂O流动相(0-15min：55％-100％，15-27min:100％，22-32min:100％，v/v)，37℃柱温，20μL进样体积，1mL/min流速，195nm检测波长。

PpUGT4和PpUGT5的酶动力学参数测定：

反应液：50mM Tris-HCl(pH 8.0)，100μΜUDP-葡萄糖，纯化后的蛋白100μg，重楼皂苷VI浓度梯度0，20，40，60，80，100μM，去离子水补足至300μL。将反应液混匀，37℃静置反应25min，加入等体积甲醇终止反应，真空减压干燥，加入100μL甲醇溶解，12000rpm离心20min，所的样品用于HPLC分析。

HPLC色谱条件3：Aglient 1260系统，Aglient SDB-C18色谱柱(4μm，4.6×250mm)，CH₃CN-H₂O流动相(0-15min：30％-75％，15-16min:75％-95％，16-21min:95％，v/v)，37℃柱温，20μL进样体积，1mL/min流速，195nm检测波长。

以重楼皂苷VI按照HPLC色谱条件3制备标准曲线，重楼皂苷VI的浓度梯度为0，5，10，15，20，25nmol，得到峰面积与浓度的函数y＝538.12x+38.989(R²＝0.9999)，根据函数计算反应产物的含量。根据Lineweaver–Burkplot得到图8，根据图8中函数在x和y轴的截距进而计算出Km值。

由图8中的A和B计算出PpUGT1和PpUGT2以薯蓣皂苷元为底物时的Km值分别为20.1和16.1μM；由C和D计算出PpUGT4和PpUGT5以重楼皂苷VI为底物时的Km值分别为32.5和22.1μM。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 中国科学院昆明植物研究所

<120> 用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因和应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 555

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Glu Glu Val Asn Asn Ser Glu Lys Pro Glu Thr Ser Thr Ser

1 5 10 15

Ser Phe Gln Leu Glu Arg Ser Lys Thr Glu Lys Arg Arg Gln Asn Asn

20 25 30

Ile Arg Ala Asp His Ala Thr Gln Leu Phe Asp Asp Lys Ile Ser Ile

35 40 45

Lys Lys Lys Leu Lys Met Leu Asn Gln Ile Ala Thr Met Asn Asp Asp

50 55 60

Gly Thr Val Ala Val Glu Val Pro Ser Asn Val Glu Ser Ala Ser Ile

65 70 75 80

Asp Pro Gly Ser Gln Asp Val Gly Asn Glu Ala Leu Asp Asp Glu Pro

85 90 95

Ile Asp Leu Ala Asp Ile Gln Tyr Ile Pro Pro Ile Gln Ile Val Ile

100 105 110

Leu Ile Val Gly Thr Arg Gly Asp Val Gln Pro Phe Val Ser Ile Gly

115 120 125

Lys Arg Leu Gln Asp Phe Gly His Arg Val Arg Leu Ala Thr His Ala

130 135 140

Asn Phe Lys Glu Phe Val Leu Thr Ala Gly Leu Glu Phe Tyr Pro Leu

145 150 155 160

Gly Gly Asp Pro Lys Val Leu Ala Glu Phe Met Val Lys Asn Lys Gly

165 170 175

Phe Leu Pro Ser Ser Pro Ser Glu Ile Ala Ile Gln Arg Lys Gln Met

180 185 190

Lys Glu Ile Ile Phe Ser Leu Leu Pro Ala Cys Lys Asp Pro Asp Pro

195 200 205

Asp Ser Gly Ile Pro Phe Lys Ala Asp Ala Ile Ile Ala Asn Pro Pro

210 215 220

Ala Tyr Gly His Thr His Val Ala Glu Ala Leu Lys Val Pro Ile His

225 230 235 240

Ile Phe Phe Thr Met Pro Trp Thr Pro Thr Ser Glu Phe Pro His Pro

245 250 255

Leu Ser Arg Val Lys Gln Pro Ala Gly Tyr Arg Leu Ser Tyr Gln Ile

260 265 270

Val Asp Ser Leu Ile Trp Leu Gly Ile Arg Asp Met Ile Asn Asp Phe

275 280 285

Arg Lys Arg Lys Leu Lys Leu Arg Pro Val Thr Tyr Leu Ser Gly Ala

290 295 300

Gln Glu Ser Ala Ser Asp Ile Pro His Gly Tyr Ile Trp Ser Pro Asn

305 310 315 320

Leu Val Pro Lys Pro Lys Asp Trp Gly Ser Lys Val Asp Val Val Gly

325 330 335

Phe Cys Phe Leu Asp Leu Ala Ser Asn Tyr Glu Pro Pro Glu Ser Leu

340 345 350

Val Lys Trp Ile Glu Ala Gly Glu Lys Pro Ile Tyr Ile Gly Phe Gly

355 360 365

Ser Leu Pro Val Gln Glu Pro Glu Lys Met Thr Arg Ile Ile Val Glu

370 375 380

Val Leu Glu Ile Thr Gly Gln Arg Gly Ile Ile Asn Lys Gly Trp Gly

385 390 395 400

Gly Leu Gly Asn Leu Ala Glu Pro Lys Glu Phe Val Tyr Leu Leu Asp

405 410 415

Asn Val Pro His Asp Trp Leu Phe Leu Gln Cys Lys Ala Val Val His

420 425 430

His Gly Gly Ala Gly Thr Thr Ser Ala Gly Leu Lys Ala Ala Cys Pro

435 440 445

Thr Thr Ile Val Pro Phe Phe Gly Asp Gln Leu Phe Trp Gly Glu Arg

450 455 460

Val His Ala Arg Gly Val Gly Pro Pro Pro Ile Pro Ile Asp Glu Phe

465 470 475 480

Asn Leu Gln Arg Leu Val Asp Ala Ile Lys Phe Met Leu Asp Pro Lys

485 490 495

Val Lys Glu Asn Ala Val Glu Leu Ala Glu Ala Ile Glu Ser Glu Asp

500 505 510

Gly Val Thr Gly Ala Val Lys Ala Phe Phe Lys His Leu Pro Pro Lys

515 520 525

Gly Gln Glu Asp Thr Pro Gly Pro Pro Ser Thr Ala Val Asp Ser Trp

530 535 540

Phe Tyr Pro Val Arg Arg Cys Phe Gly Cys Ser

545 550 555

<210> 2

<211> 590

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Glu Ser Gly Ser Gly Ala Ala Gly Asn Asn Gly Lys Ser Pro

1 5 10 15

Ser Ala Ile Ser His Asn Asn Leu Pro Arg Ala Ile Ser Met Pro Gly

20 25 30

Arg Thr Lys Asp Thr Lys Ser Ser Glu Ala Ser Thr Ser His Pro Lys

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Leu Glu Lys Ser Lys Thr Glu Lys Gln Arg Gln Ile Asn Leu Arg Ala

50 55 60

Asp Pro Thr Ser Gln Leu Phe Asp Asp Asn Val Ser Ile Lys Lys Lys

65 70 75 80

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Pro Glu Asp Val Tyr Glu Ala Val Asp Asp Gln Val Ala Asp Ile Ala

115 120 125

Asp Pro Gln Tyr Ile Pro Pro Leu Gln Ile Val Ile Leu Ile Val Gly

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Thr Arg Gly Asp Val Gln Pro Phe Ile Pro Ile Gly Lys Arg Phe Gln

145 150 155 160

Asp Tyr Gly His Arg Val Arg Leu Ala Thr His Ala Asn Phe Lys Glu

165 170 175

Phe Val Leu Thr Ala Gly Leu Glu Phe Tyr Pro Leu Gly Gly Asp Pro

180 185 190

Lys Val Leu Ala Glu Tyr Met Val Lys Asn Lys Gly Phe Leu Pro Ser

195 200 205

Ser Pro Ser Glu Ile Pro Ile Gln Arg Lys Gln Leu Lys Glu Ile Ile

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Phe Ser Leu Leu Ser Ala Cys Lys Asp Pro Asp Leu Asp Ser Gly Ile

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Pro Phe Lys Ala Asp Ala Ile Ile Ala Asn Pro Pro Ala Tyr Gly His

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Thr His Val Ala Glu Ala Leu Lys Ile Pro Ile His Ile Ile Phe Thr

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Met Pro Trp Thr Pro Thr Ser Glu Phe Pro His Pro Leu Ser Arg Val

275 280 285

Lys Gln His Ala Gly Tyr Arg Leu Ser Tyr Gln Ile Val Asp Ser Met

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Ile Trp Leu Gly Ile Arg Asp Met Ile Asn Asp Phe Arg Lys Arg Lys

305 310 315 320

Leu Lys Leu Arg Pro Val Thr Tyr Leu Ser Gly Ser Gln Gly Ser Val

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Ser Asp Ile Pro His Ala Tyr Ile Trp Ser Pro His Leu Val Pro Lys

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Pro Lys Asp Trp Gly Pro Lys Ile Asp Val Val Gly Phe Cys Phe Leu

355 360 365

Asp Leu Ala Ser Asn Tyr Glu Pro Pro Glu Ser Leu Val Lys Trp Leu

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Gln Asp Gly Glu Lys Pro Val Tyr Ile Gly Phe Gly Ser Leu Pro Val

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Gln Gly Pro Glu Lys Met Thr Asn Ile Ile Val Glu Ala Leu Glu Ile

405 410 415

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Leu Ala Glu Pro Lys Asp Ser Val Tyr Val Leu Asp Asn Val Pro His

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Asp Trp Leu Phe Leu Gln Cys Lys Ala Val Val His His Gly Gly Ala

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Gly Thr Thr Ser Ala Gly Leu Arg Ala Ala Cys Pro Thr Ala Ile Val

465 470 475 480

Pro Phe Phe Gly Asp Gln Gln Phe Trp Gly Glu Arg Val Tyr Ala Arg

485 490 495

Gly Leu Gly Pro Ala Pro Ile Pro Val Glu Glu Phe Ser Leu Pro Lys

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Leu Val Asp Ala Met Lys Phe Leu Leu Asp Pro Lys Val Lys Glu Arg

515 520 525

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Ser Pro Pro Ser Gln Ser Pro Ser Pro Glu Glu Gln Ser Ser Cys Phe

565 570 575

Glu Pro Phe Leu Ala Pro Val Lys Lys Tyr Met Gly Cys Ser

580 585 590

<210> 3

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Ser Asp Asp Arg Gln Pro Leu Thr Ala Phe Phe Ile Pro Tyr

1 5 10 15

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Leu Pro His Leu Ala Val Thr Arg Asp Asp Glu Gln Phe Leu Val Pro

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Met Ala Cys Asn Asp Glu Ala Thr Ala Met Arg Ala Val Ala Arg Arg

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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Glu Pro Ser Ser Val Val Tyr Val Ala Phe Gly Ser Glu Ala Lys Leu

275 280 285

Ser Ser Ala Gln Ala Asn Glu Ile Ala Leu Gly Leu Asp Arg Ser Gly

290 295 300

Val Arg Phe Val Trp Val Val Arg Glu Gly Ser Thr Leu Pro Lys Gly

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Pro Gln Val Arg Phe Leu Ala His Arg Ser Val Gly Gly Phe Leu Thr

340 345 350

His Cys Gly Trp Asn Ser Ile Val Glu Gly Leu Ser Ala Gly Leu Pro

355 360 365

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Met

465

<210> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Glu Glu Gly Asn Glu Ser Leu His Val Val Val Leu Pro Trp Leu

1 5 10 15

Ala Met Gly His Ile Leu Pro Phe Phe Glu Leu Ser Arg Arg Leu Ala

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Asn Thr Val Asp Leu Thr Glu Glu Phe His Arg Gln Tyr Leu Gln Val

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Pro Ile Ser Ser Pro Lys Asp Leu Thr Asn Val Pro Asp Trp Ile Pro

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180 185 190

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Asn Glu Phe Glu Gly Ala Trp Ile Glu Leu Leu Asn Glu Leu Tyr Gln

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Lys Pro Val Ile Pro Ile Gly Leu Phe Pro Pro Pro Ala Pro Val Glu

245 250 255

Ser Lys Glu Ser Ser Gln Gln Trp Ala Thr Ala Tyr Lys Trp Leu Glu

260 265 270

Ile Gln Glu Pro Gly Ser Val Val Tyr Ala Ala Phe Gly Ser Glu Ala

275 280 285

Gln Leu Thr Ser Thr Gln Val Asn Lys Ile Ala Ile Gly Leu Asp Gln

290 295 300

Ser Gly Leu Arg Phe Val Trp Val Leu Arg Glu Gly Ser Pro Leu Pro

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Glu Gly Phe Glu Ala Arg Thr Val Gly Arg Gly Ile Val Cys Lys Gly

325 330 335

Trp Val Pro Gln Val Gln Phe Leu Thr His Pro Ser Val Gly Gly Phe

340 345 350

Leu Thr His Gly Gly Trp Asn Ser Ile Val Glu Gly Leu Thr Ile Gly

355 360 365

Leu Pro Met Val Ile Leu Pro Met Leu Phe Asp Gln Gly Leu Asn Ala

370 375 380

Arg Asn Leu Val Asp Gln Gly Ile Ala Val Glu Val Pro Arg Asp Leu

385 390 395 400

Glu Asp Gly Ser Phe Glu Gly Glu Gly Val Ser Lys Cys Leu Arg Met

405 410 415

Val Met Val Asp Glu Glu Gly Glu Arg Phe Arg Ala Lys Ala Arg Glu

420 425 430

Cys Lys Lys Val Leu Gly Asp Glu Glu Leu His Asp Arg Tyr Ile Glu

435 440 445

Gly Leu Val Lys Tyr Leu Trp Asp His Gly Lys Gln Thr Pro Gln Pro

450 455 460

Leu Lys Leu

465

<210> 6

<211> 1668

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgcctgaag aggtgaataa ttctgaaaag ccagagacat ccacaagtag ttttcaattg 60

gaaaggtcaa aaactgagaa acgaagacag aataatatac gcgctgatca tgccacacaa 120

ttatttgatg ataagatctc aattaagaag aagcttaaga tgctaaacca aatagctact 180

atgaatgacg acggaactgt agctgttgaa gttccgagta atgttgaatc tgcatcaatt 240

gaccctgggt ctcaagatgt tggtaatgaa gctcttgatg atgaaccaat agatttagct 300

gacattcagt atatacctcc tatacaaata gttattctta ttgttggtac acgtggagat 360

gttcaacctt ttgtttctat tggtaaacgt ttacaggatt tcgggcatcg tgttagacta 420

gcaactcatg caaatttcaa agaatttgta ttgactgctg gactggaatt ttacccctta 480

ggaggagacc caaaagttct ggctgaattc atggtcaaga ataaagggtt cttaccttct 540

tcaccttcag aaattgctat tcaacgaaag caaatgaagg aaatcatatt ttctttgctc 600

ccagcttgca aggacccaga tcctgattct ggtatccctt ttaaagcaga tgccattatt 660

gcgaatcccc cggcatatgg gcatacacat gtggcagagg cgctaaaggt tccgatacac 720

atattcttca caatgccatg gacaccaact agtgaatttc cacatcctct ctctcgtgtc 780

aagcagccag ctggatatag actttcttac caaattgttg actctttgat ctggcttggg 840

atacgagaca tgattaatga ttttaggaaa agaaagctga agctgcgacc tgtcacttat 900

ctgagtggtg cacaggagtc tgcttctgac atccctcatg gctatatctg gagccctaac 960

cttgtcccta agccaaaaga ttggggatct aaggttgatg tggttggatt ttgctttctt 1020

gacctcgcat cgaactatga acctccagaa tcactcgtga aatggattga agcaggagag 1080

aagcctatat atataggatt tggtagcctt cctgttcaag aaccagaaaa aatgacacga 1140

attattgttg aggtgctgga aatcactggg cagcgaggta tcattaacaa gggatggggt 1200

ggccttggga acttggctga accgaaggag tttgtatatc tattggataa tgttccccat 1260

gactggctat tcttgcagtg caaggcagtg gtacatcatg gtggtgctgg aacaacatct 1320

gcgggcctta aagctgcatg cccaactact atcgtacctt tctttggaga tcaactattt 1380

tggggtgagc gagttcatgc tagaggggtt ggcccccctc ctattcctat tgatgagttc 1440

aacctgcaaa gacttgtgga tgcaataaag ttcatgctgg atccgaaggt aaaggagaat 1500

gcagtcgagc tggcagaggc catagagtca gaggatggag tgaccggagc agtgaaagcc 1560

ttctttaaac atctccctcc caaggggcag gaggacacac cggggcctcc atcgactgcc 1620

gtggattcat ggttctatcc cgtacggaga tgctttggtt gttcgtga 1668

<210> 7

<211> 1773

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggcggaga gcggcagtgg agcagcggga aacaatggca aatcaccctc ggcaatcagt 60

cacaataatc tacctagggc tattagtatg cctggacgta caaaagatac taaaagctca 120

gaggcgtcta cgagtcaccc aaaattggag aagtcaaaaa ctgagaaaca aaggcaaatt 180

aatctacgtg ctgatccaac atctcaatta tttgatgata atgtttctat taaaaagaag 240

cttaagatga taaatcggat agctacgctg aaaaacgatg gaactgtggt tgtcgagatt 300

ccaagcagcg ttgaaccagc atcacttaat cttgggccag aggatgttta tgaagcagtt 360

gatgatcaag tggcagacat agctgaccct cagtatatac ctcctctgca aatagttatt 420

ctaattgttg gtactcgagg ggatgtgcag ccatttatac ctattggcaa gcgttttcag 480

gactatggac atcgtgtcag actagcaact catgcgaact tcaaagagtt cgtattgact 540

gctggattgg agttctaccc tttgggagga gacccaaaag ttcttgctga atacatggtc 600

aagaataaag ggttcttacc ttcatcaccg tcagagatac ctattcagcg taaacaactt 660

aaggaaatta tattttcttt gctctcagcc tgcaaggacc cagatcttga ttctggcatt 720

cctttcaaag cagatgccat aatagctaat cccccagcat atggacatac tcatgtggct 780

gaggcgctaa aaataccgat tcacattatt ttcacaatgc catggacccc aactagtgaa 840

tttccacatc ctctttctcg ggtcaagcaa catgctggat atagactttc atatcaaatt 900

gtcgactcta tgatttggct tggaattcgg gacatgatta atgatttcag gaaaaggaag 960

ctgaagttga ggcctgtcac atatcttagt ggctcccaag ggtctgtttc cgatatacct 1020

cacgcgtata tttggagccc tcatttggtc cctaaaccga aagattgggg accaaaaatt 1080

gatgtggttg ggttttgctt ccttgacctt gcatcaaact atgagcctcc agaatcactt 1140

gtgaaatggc ttcaagatgg tgaaaagcct gtttatattg gatttggaag tcttcctgtt 1200

caaggaccag aaaaaatgac gaacattatt gtcgaggcac tggaaattac cgggcagaga 1260

ggcatcatta acaagggatg gggtggccta gggactttgg cagaacccaa agattctgta 1320

tatgtactgg acaatgttcc ccatgactgg ttattcttgc agtgcaaggc agtggtgcat 1380

catgggggtg ctggaacaac ctctgctggt cttagagccg cgtgtccaac tgctatcgtg 1440

ccattctttg gtgaccagca attttgggga gaacgggtat acgctagagg tttgggtcca 1500

gctcctatac ctgttgaaga attctcacta cctaagcttg ttgatgcaat gaaattcctg 1560

ttagatccga aggtgaagga gagaacggtg gaagtggcca aggccatgga attagaggat 1620

ggggtgaatg gagcagtgaa agcgttccta aagcatctcc ctagaaagtc gtcacctcag 1680

tctccgccat ctcagtctcc atcgccagag gagcaatcta gctgcttcga gcccttcctt 1740

gcccctgtaa agaagtacat gggctgctcc tga 1773

<210> 8

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggctccg acgatcgtca acctctgacg gcgttcttca tcccctactt cgcgacgggg 60

cacatgatcc ccctcgtcga catcgcccgc cttctcgccg cccgtggcgt tgactccacc 120

gtcctcgcca cccctgccaa cgccgccctc attcaacgca ccgtcgactc cgccgcagcc 180

gccggcctcc cgattcgaac cctcacctac cccttccccg cggcggagtc cggcctcccc 240

cccggcgtcg agaacatcag ccgcctccct cccgctgacg cccaccggat cgacgacgcc 300

acctggcacg tgcggccctc gcacgagcgc ctcattcggg cccaccgacc aaacgccgtc 360

ttctccgaca tccacttccc atggaccaca gccatggcga aagaggtcgg ggcggtgagg 420

atctccttcg acgccctcgg gctgttcccc atatcggtta tgaacgtcct gttcggaaag 480

ctaccacacc tagccgtcac aagggacgac gagcagttcc tcgtaccggg gctgccgcac 540

ccgattcaca tggtccggcc cgagctgcca gattttctcc gcggcaagac gcacatcaca 600

ggtctcatgg agagcattga ggaggcggag gccggcagcc tcggggtggt cgtcaacagc 660

ttcttagaga tggagtcaga gtacgccgac tactattaca aggccaccaa ccggaagttc 720

tggtgcgtgg gccccgtctc cctcgcctac actgccggcg atgatgtggc aactcgtggc 780

agcgacaacc ctgcggccgc agctaatcgc cagcagtgct tcaactggct cgaggggaag 840

gaggctgggt cggtggtcta cgtggcattt gggagctggt ctcacttttc cgacgagcag 900

ctccgtgaaa tggcggcagg gctcgagttt tccggccacc cattcatctg ggtagtccga 960

gacgatgggg ccacgtgggt gcccgcagga ttcgaggagc agttggcagg gcgggggctg 1020

gtggtccggg ggtgggcccc gcaggtgtcg gtgctgggcc atgcagcggt gggcggcttc 1080

gtgacccact gcgggtggaa ctccgtgctg gagggcgtca cgtcctgcct cccgatggcc 1140

acgttgcccc tctccaccga gcagttcatc aacgagaagc tcgtcgtcga tgtcctcggc 1200

gtcgccgtca ggatctccga ggccccacgt ggtacagcgg atggggacgg tgccatcgtg 1260

ccggccgcgg acgtggcacg cgcagtcgac cggatcatgg cctgcaacga tgaggcgacg 1320

gccatgcgag cggtggcgcg gcggctcggg gcggcggcga gggtggcggt gaaggaaggc 1380

gggtcgtctt atgttggtct cactcgtctc atcgatgaga tccgggcggg atccagaaag 1440

gaatcgaaag actga 1455

<210> 9

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgggagaag acaatggaag ccttcatgtt gtggtgctcc catggctcgc catgggccac 60

atcctcccct tcttcgaggt ttcccggcga ctagcaagca agggtcaccg cgtctccttc 120

ctcacaaccc gcaagaacat ggaaaggctg gagccccaga tcccccacca cctctcgcac 180

ctcctaactc tagtcgagtt ctctttatcc cgcatcgaac accttccgga atccatcgag 240

aacaccgtcg acatcaccga cgatctccac gtcgagtacc tgcggatcgc cttcgactcc 300

ttcgaggtcc aactctccga attcctccgt cgtgagactc ccgattggct cctctacgac 360

tatgccgcct gctgggcacc ggacgttgcc ttggcccacg acgtcccctt tgcctacctc 420

agcttattca gcgctgcgac cctcagcttc ttcggcccgt tggacaaacc cccgagattg 480

tcccccgagg agttcaccaa agtccccgat tggatccctt ttcggaccac ggttgccttc 540

aggctcttcg agtcccagta tctgttcaag catgacctcc acccgaagct ggcatccgga 600

atgtctgaat tccttcggtt tgagaatgga ttcagaaagt gcccttttat ggtaatccga 660

ggatgtttcg aattggatgg agagtggata gagctattga gcgagttgta tggaaaaccg 720

gtcatcccca tcggtctctt cccccctccg gctccggccc tgtccgaagg aagtagtcag 780

aattgggcta ctgcttataa gtggctggag aatcaagagc caagttctgt agtttatgtt 840

gcatttggga gcgaggcgaa actatcgagc gcccaagcta acgagattgc cctcgggctc 900

gaccggtccg gagttcggtt cgtgtgggtg gtgagggaag gatcaacatt gcccaaggga 960

tttgaatccc agacagaagg tcggggggtg gtctgcaagg ggtgggtccc acaggtaagg 1020

ttcctcgccc accgatcggt cggggggttc ctcacgcatt gcgggtggaa ctcaatcgtc 1080

gagggcctct cggctgggct gccaatggtg gtattgccga tggtgtatga gcaagggctc 1140

aacgcgagga atctcgttga caaggggatc ggtgtcgagg tgccgaggga atcggaggat 1200

gggtcgttcg agggtgaggg gatcgccaag tgtttgaggt tggtgatggt ggatgaagag 1260

ggggagaaga tcagagccaa agctagggag tgtaagcaag tgctaggtga cgaggagttg 1320

catgataaat atattggaga cttcgctaag tatctctggg atcacaggag gcagaaacct 1380

cagcctttga aaatgtaa 1398

<210> 10

<211> 1404

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggaagaag gcaatgaaag ccttcatgtt gtggtgctcc catggctcgc catgggccac 60

atcctcccct tcttcgagct ctcccggcga ctagcaagca aggaccacca cgtctccttc 120

ctgacaaccc gcaagaacat cgataggctc gagcccaaga tcccccacca cctttcccac 180

ctcctaactc ttgtcgagtt cactttgccc cacatcgaaa acttgccgga atccgtcgag 240

aacactgtcg acctcaccga ggagttccac cggcagtacc tgcaggtcgc cttcgactcc 300

ttcgaggagc aattctccga tttcctcaga aaccggccat ccccgcctcc cgactgggtt 360

atttacgact acgctgccta ttgggtcccg gacatcgtcg acaggcatgg catcccctgc 420

gcctacatca gtctcttcag cgctgcggct ctcggattct tcggcccact cagtaaaccg 480

cccatatcgt ctcccaagga tttaaccaac gtcccggatt ggataccgtt cccgacgact 540

gtagctttcc ttccgttcga ggcccgggcg ctgttcaagc ccggagtcct cctcaaagcc 600

tctggaacgt cgcagtcact tcagttcgca aaggggatcg agaagtgccc gttcatgttg 660

attcggagct gcaatgagtt tgaaggggca tggatcgagc tcttgaacga gctataccag 720

aaaccggtca tcccgatagg gctcttcccc cctccggctc cggttgagtc caaagaaagt 780

agccagcaat gggctacagc ttataagtgg ctggaaattc aagagccagg ttctgtagtt 840

tacgctgcat tcggaagcga ggcgcaatta acaagcaccc aagtcaataa gattgccatc 900

gggcttgacc agtccggact tcggttcgtg tgggtgctga gggagggatc gccgctcccg 960

gaggggttcg aggcccggac cgtgggccgg gggattgtct gcaaggggtg ggtcccgcag 1020

gttcagttcc tcacccaccc gtcggttggg gggttcctga ctcatggcgg atggaactcg 1080

atagtggaag ggctcaccat cggactccca atggtgattc tgccgatgct gttcgaccaa 1140

ggcctcaacg cgaggaatct tgtggaccag gggatcgcgg tcgaggttcc acgggatctg 1200

gaggacgggt cattcgaagg agagggggtc tccaagtgtt tgaggatggt gatggtggat 1260

gaagaggggg agaggttcag agccaaagcc agggagtgta agaaggtact aggtgatgag 1320

gagttgcatg ataggtatat tgagggcttg gttaagtatc tctgggatca cgggaagcag 1380

acgccacaac ctctgaagct gtaa 1404

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgcctgaag aggtgaata 19

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcacgaacaa ccaaagcatc tccgt 25

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggcggaga gcggcagtgg ag 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcaggagcag cccatgtact tc 22

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgggctccg acgatcgtca acctc 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcagtctttc gattcctttc tggat 25

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgggagaag acaatggaag ccttcatgt 29

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttacattttc aaaggctgag gtttctgc 28

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atggaagaag gcaatgaaag ccttc 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttacagcttc agaggttgtg gcgtc 25

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aaggtaggca tatggagctc atgcctgaag aggtgaataa ttct 44

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tatctagact gcaggtcgac tcacgaacaa ccaaagcatc tccgt 45

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aaggtaggca tatggagctc atggcggaga gcggcagtgg agcag 45

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tatctagact gcaggtcgac tcaggagcag cccatgtact tc 42

<210> 25

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aaggtaggca tatggagctc atgggctccg acgatcgtca acctc 45

<210> 26

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tatctagact gcaggtcgac tcagtctttc gattcctttc tggat 45

<210> 27

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aaggtaggca tatggagctc atgggagaag acaatggaag ccttc 45

<210> 28

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tatctagact gcaggtcgac ttacattttc aaaggctgag gtttc 45

<210> 29

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aaggtaggca tatggagctc atggaagaag gcaatgaaag ccttc 45

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tatctagact gcaggtcgac ttacagcttc agaggttgtg gcgtc 45

Claims

1.用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶，为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的PpUGT1的糖基转移酶。

2.权利要求1所述糖基转移酶的编码基因，为核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的PpUGT1的编码基因。

3.包含权利要求2所述编码基因的重组载体、表达盒或重组菌。

4.权利要求1所述的糖基转移酶或者权利要求2所述的编码基因或者权利要求3所述的重组载体、表达盒或重组菌在制备含有糖基转移酶的转基因植物中的应用。

5.权利要求1所述的糖基转移酶或者权利要求2所述的编码基因或者权利要求3所述的重组载体、表达盒或重组菌在合成重楼皂苷中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重楼皂苷为化学结构式如式I、式II所示的地索苷、偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，