CN114032223A

CN114032223A - 七叶苷和秦皮苷糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN114032223A
Application number: CN202111303487.7A
Authority: CN
Inventors: 陈士林; 尹青岗; 孙伟; 魏一丁
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2041-11-05
Also published as: CN114032223B

Abstract

本发明公开了七叶苷和秦皮苷糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的七叶苷和秦皮苷糖基转移酶蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有七叶苷和/或秦皮苷糖基转移酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明基于七叶树高通量测序的相关结果，用反向遗传学的方法找到并鉴定秦皮苷、七叶苷合成的最后一步关键酶UGTs，填补香豆素生物合成途径的终端空白，为进一步生物合成秦皮苷、七叶苷提供了糖基转移酶蛋白及其编码序列。

Description

七叶苷和秦皮苷糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别地涉及七叶苷及秦皮苷糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

七叶树(Aesculuschinensis)为七叶树科七叶树属植物，该属全球约30种，其中我国约11种。香豆素为七叶树中重要的小分子活性成分，具有抗炎、镇痛、抗菌和抗病毒的药理作用，能调节植物生长、用作植保素，在人体内有较高的生物利用度。目前已经在七叶树中分离出的香豆素有秦皮乙素(Esculetin)、七叶苷(Esculin)、秦皮苷(Fraxin)和秦皮素(Fraxetin)(图1)等。这4种香豆素成分现均未成药，因此对该香豆素的生物合成途径的研究将具有重要的医学意义和经济价值。药理研究发现，七叶苷具有抗肿瘤作用，为抗肿瘤药物的开发提供新的选择；秦皮苷具有抗炎，降低血尿酸，抗菌，利尿的药理作用，能预防或治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。因此，七叶苷、秦皮苷有待利用现代药学研究将其开发为有效新药，对其生物合成途径的研究将具有重要的研究意义和潜在的巨大经济价值。

香豆素的生物合成途径为苯丙素生物合成途径的分支，其初始过程中PAL酶已经鉴定，但下游途径未知，包括P450酶、联苯基合酶和糖基转移酶。未知因素导致生物合成香豆素困难重重。

糖基转移酶负责代谢终端产物的糖基化修饰，且其催化反应的底物和产物清晰，它的鉴定将为整个途径的解析起到重要指引作用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了七叶树中七叶苷和秦皮苷糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用。对七叶苷、秦皮苷糖基转移酶的鉴定，将为生物合成七叶苷、秦皮苷提供酶学基础，并为解析七叶苷、秦皮苷生物合成途径奠定基础。

本发明所提供的七叶苷和秦皮苷糖基转移酶蛋白，名称为UGT92G7，来源于七叶树(Aesculuschinensis)。

本发明所提供的七叶苷和秦皮苷糖基转移酶蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有七叶苷和/或秦皮苷糖基转移酶活性的由a)衍生的蛋白质。

所述七叶苷和/或秦皮苷糖基转移酶活性是催化秦皮素生成秦皮苷的活性和/或催化秦皮乙素生成七叶苷的活性。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。

该编码基因含有1528个核苷酸，编码509个氨基酸的蛋白。将该基因命名为UGT92G7，将其编码的蛋白命名为UGT92G7。

含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

扩增所述编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

所述蛋白在作为七叶苷和/或秦皮苷糖基转移酶中的应用也属于本发明的保护范围。

所述七叶苷和/或秦皮苷糖基转移酶为催化秦皮素生成秦皮苷和/或催化秦皮乙素生成七叶苷的酶。

所述蛋白、所述编码基因在催化秦皮素生成秦皮苷和/或催化秦皮乙素生成七叶苷中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明基于七叶树高通量测序的相关结果，用反向遗传学的方法找到并鉴定秦皮苷、七叶苷合成的最后一步关键酶UGTs，填补香豆素生物合成途径的终端空白，为进一步生物合成秦皮苷、七叶苷提供了糖基转移酶蛋白及其编码序列。

附图说明

为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：

图1为四种香豆素分子结构式。

图2为七叶树中不同器官中香豆素含量分析结果。

图3为AcUGTs基因克隆电泳结果图(M代表Marker)。

图4为pMAL-c2X-UGT92G7载体PCR检测电泳结果图。

图5为UGT92G7重组蛋白SDS-PAGE胶图。

图6为UGT92G7重组蛋白对秦皮素催化活性鉴定UPLC图。

图7为UGT92G7重组蛋白对秦皮乙素催化活性鉴定UPLC图。

图8为UGT92G7重组蛋白对秦皮乙素催化产物MS鉴定图；注，秦皮甲素离子形式为[M+H]⁺，七叶苷离子形式为[M+H+Na]⁺。

图9为UGT92G7重组蛋白对秦皮素催化产物MS鉴定图；注，秦皮素和秦皮苷离子形式均为[M+H+Na]⁺。

具体实施方式

实施例1、克隆香豆素糖基转移酶的编码基因

一、基因克隆的方法和步骤

收集成熟期的七叶树叶、花、种子，分析其中的香豆素含量(图2)，发现花中富含秦皮乙素、七叶苷、秦皮素和秦皮苷(魏一丁,熊超,张天缘,等.基于转录组数据对七叶树中三萜皂苷合成途径的研究[J].中国中药杂志,2019(6):1135-1144.)。

因此，利用以上植物材料，借助Illumina平台进行RNAseq。七叶树中组织表达谱RNAseq数据表明，获得19个高表达的AcUGTs序列，基于转录组数据，结合AcUGTs保守结构域PSPG box，得到19个300aa-500aa的AcUGTs序列，其中1个AcUGTs在花中表达量非常高。

设计引物序列(如表1)，以花的cDNA为模板，利用KOD-Plus-Neo高保真酶克隆到AcUGTs基因片段(图3)(KOD高保真酶PCR体系总体积为50μL：5μL 10ⅩBuffer，3μL MgSO₄，5μL dNTP(2mM)，1.5μL正向引物(10μM)，1.5μL反向引物(10μM)，1μL模板，1μLKOD酶和32μL水，程序如表2)。借助pEASY-Blunt载体(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CB111-01(20rxns))，成功将AcUGTs片段连入载体上(连接体系总体积为3μL：0.5μLpEASY-Blunt载体和2.5μL cDNA模板，25℃连接反应1h)。连接体系直接转化TransT1感受态(购自北京全式金生物技术有限公司)，挑选阳性克隆测序(菌落PCR体系总体积为12.5μL：6.25μL2×Taq PCR Mix，1μL模板，0.25μL正引物，0.25μL反引物和4.75μL水，程序如表3)，与RNAseq序列比对，与RNAseq序列比对，发现，核苷酸序列与原数据相似度99％，以实际测序结果为准。

表1克隆基因所用引物序列

表2 KOD高保真酶PCR反应程序

表3菌落PCR反应程序

二、获得基因序列以及其编码的蛋白序列

测序结果表明，利用表1中的引物扩增得到的基因含有1528个核苷酸(序列表中序列1所示)，编码509个氨基酸的蛋白(序列表中序列2所示)，将该基因命名为UGT92G7，将其编码的蛋白命名为UGT92G7。

三、基因功能验证

借助原核系统对基因功能进行了验证，构建pMAL-c2X-UGT92G7载体，测序确认序列正确后，将载体成功转入表达菌株Novablue。

首先，给UGT92G7基因序列加上酶切位点接头(体系和程序跟上述基因克隆方法一致，引物信息见表4)；UGT92G7基因序列(带有酶切位点)酶切后(图4)，利用T4-DNA连接酶，将其构建到经酶切的表达载体pMAL-c2X(购自New England Biolabs.，产品目录号为E8200S)上，得到重组载体pMAL-c2X-UGT92G7(连接体系总体为7μL：3.5μL 2×LigationMix Buffer，2.75μLUGT92G7基因片段和0.75μL pMAL-c2X；4℃反应过夜)；其次，连接体系转化TransT1(购自北京全式金生物技术有限公司)后，挑选阳性克隆；提取质粒后，转化到表达菌株Novablue(购自Merck Millipore，德国达姆施塔特默克集团(Merck KGaA)的生命科学业务公司，产品目录号为69284-3)。

表4构建原核表达载体所用引物序列

注：序列中小写字母为保护碱基和酶切位点。

重组蛋白的诱导、纯化、酶活分析和产物鉴定如下：

1)重组蛋白的诱导

分别挑取pMAL-c2X-UGT92G7与pMAL-c2X单克隆菌落于2mL LB(含AMP 100mg/L)液体培养基中37℃中振荡(200rpm)过夜培养。

取1mL过夜培养的菌液加入100mL新鲜的灭菌的LB培养液(含AMP100mg/L，0.2％灭菌的葡萄糖)中，37℃摇床(180rpm)培养至600nm OD值为0.6时，取1mL菌液，收集菌体作为对照。

在100mL菌液中加入30μL IPTG(1M，异丙基-β-D-硫代半乳苷)，终浓度为0.3mM，于16℃培养16h以上。

4℃，8,000×g离心3min，收集菌沉淀。

2)重组蛋白的纯化

根据pMAL融合蛋白和美国New England BioLab Inc.提供的蛋白纯化说明手册对本实验的重组蛋白进行纯化。步骤如下：上样缓冲液(column buffer)重悬上面收集的菌液沉淀，并-20℃过夜。次日菌沉淀样品冰上融化后，利用超声破碎仪破碎细胞，释放蛋白，4℃高速10,000rpm离心30min后，取上清，待上样；利用上样缓冲液(8倍柱体积)活化蛋白纯化柱中亲和性填料(流速为1mL/min)，将上清样品稀释5倍后上样，过柱上样2遍，待样品都流过亲和柱填料后，用12倍柱体积的上样缓冲液冲洗柱中杂蛋白，最后利用6倍柱体积麦芽糖上样缓冲液(10mM麦芽糖)洗脱目标蛋白。利用Millipore进口超滤管(30kDa)浓缩蛋白并置换成酶活反应缓冲液。SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝R-250染色20min，脱色后确认重组蛋白(如图5)。

3)酶活性的测定

一般酶活反应体系为100μL，如表5。37℃，反应2h后，用等体积甲醇中止反应，12,000rpm离心10min。0.22μm微孔滤膜过滤，制液相样品待上机。

表5重组蛋白酶活反应体系

4)酶活产物分析与鉴定

利用原核表达系统，成功表达了UGT92G7的重组蛋白，进一步酶活分析来鉴定了它的功能。酶活反应的供体包括UDP-葡萄糖，受体为秦皮乙素和秦皮素。分析酶活产物UPLC图谱(图6和图7)，发现UGT92G7对秦皮乙素和秦皮素均具有活性。

UPLC条件：UPLC型号：Waters UPLC H-class；流动相：A相：0.2％乙酸水溶液；B相：乙腈；等度洗脱：0-5min，90％A，10％B；DAD检测波长：336nm和225nm；进样量：1μL；柱温：35℃；样品盘温度：25℃。

利用质谱鉴定酶活产物，发现UGT92G7对于受体为秦皮素或秦皮乙素的酶活反应产物峰有一个，其质荷比均比底物质荷比多出162(一个葡萄糖和底物羟基脱水缩合脱去一分子水后，产物增加的分子量，秦皮乙素的产物为钠加合离子,比162还多出22)，表明其产物为秦皮素和秦皮乙素的单葡萄糖苷(图8和图9)。将产物峰与标准品的保留时间和质谱数据进行比对(图6和图7)，发现它们分别为秦皮苷(秦皮素的8-O单糖苷)和七叶苷(秦皮乙素的6-O单糖苷)。综上所述，体外酶活证据显示UGT92G7编码了糖基化秦皮素和秦皮乙素的糖基转移酶。

质谱条件：

利用Agilent 6540Q-TOF UPLC/MS对样品进行分离，色谱柱为，EclipsePlusC18RRHD(1.8μm，2.1×50mm，Agilent)，流动相与UPLC相同，90％A，10％B等度洗脱5min，检测波长同上。

TOF UPLC/MS质谱条件，电喷雾离子化(Dual AJS ESI)，全离子扫描，正离子模式质谱分析。Dual AJS ESI(Seg)：Gas Temp，350℃；Drying Gas，8L/min；Nebulizer，40psig；ShealthGasTemp，350℃；Sheath Gas Flow，12L/min。Dual AJS ESI(Expt)：Vcap，3500V。MSTOF(Expt)：Fragmentor，130V；Skimmer，65V；OctopoleRFPeak 750V。母离子：钠加合离子与氢加合离子(正离子)。采集质谱范围m/z：100-1000。

5)UGT92G7的催化特性

为进一步了解UGT92G7重组蛋白的催化特性(表6)，检测了其对于秦皮素或秦皮乙素的催化活性。酶活反应体系，总体积100μL，其中包括：约5μg重组蛋白、100μM UDP-葡萄糖，分别与10μM、50μM、100μM、200μM、400μM的秦皮素或秦皮乙素反应。pH为7，37℃反应1h后，等体积甲醇终止反应后，12000rpm高速离心后，取1μL UPLC检测。实验发现，UGT92G7重组蛋白对于秦皮素和秦皮乙素的催化效率(K_cat/Km)分别为386.917s^-1·M^-1和210.653s^-1·M^-1，表明UGT92G7重组蛋白对于秦皮素具有高的催化效率；Km值表明，UGT92G7重组蛋白对于秦皮素和秦皮乙素具有近似的亲和性(分别为55.167μM和48.957μM)。

表6酶代动力学数据

本发明主要通过转录组分析，获得香豆素糖基转移酶基因序列，再通过体外原核表达重组蛋白，确认UGT92G7能催化秦皮苷和七叶苷的形成。可通过原核菌产生目标糖基转移酶，在体外催化秦皮苷、七叶苷的形成，为香豆素糖苷的合成提供新的思路。

上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> 七叶苷和秦皮苷糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用

<130> SPI20065

<160> 4

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1528

<212> DNA

<213> 七叶树（Aesculuschinensis）

<400> 1

atggcttgcagcagtgatgatgagcacatagtgatgcttcctatgatggcacatggtcat 60

ctaataccattcttgggtttagcaaggcgtatccaacaagcaactggtttcaccatcacc 120

attgccaacactcctctcaacctcaacaacctccgatccaccaccaactcctccgaattc 180

gattccaaaatccgcctagctgagctccccttctgcagcgccgaccacggcttaccaccc 240

agcaccgagaacaccgagaacttgtctttagatcggatcatcgactttttccacgcatcg 300

aaatcccttaaaaccccatttcacaatctcttgctggacatcacgcagagagaaggcaag 360

cctccgctttgtataatcacggatactttctgcggttgggctgtggatgttgcggaaagt 420

acaggtactgttaatgtgactttctctacaggcggcgcctatggcactttggcttacatg 480

tctttatggatgaatcttcctcatcgcaacccagatcgtgatgagttcaatctgcctggc 540

tttcctgatcagtgccgttttcacatcacacagcttcataggttcttaagaatggctgac 600

ggcactgattcctggtccaggttttttcagccacagatatcagagtcactgaaatcttat 660

gggatgctatgtaatacagttgaagaagttgaggcaaaagcactgaaatggctgaggaag 720

ttctctaagattcctgtttggagtgttggtcctcttcttcctccagctctgctcagcagc 780

aacgagtcacccggatcatcgaacacctacaagaaacattcaggcaaggttccaggagta 840

tctgcagagaaatgcctcgagtggcttgatttacaagataccgattcggttctgtacatt 900

tctttcggctcacaaaacaccatcagcgcatcccagatgatgggattagcaatcggtttg 960

gaagaaagcaaagtagcattcatctgggtcataaggccgcccatcggtttcgacttaaac 1020

ggcggattccgatcagaatggctgccggaacgttacgaagagagaatagctgcaacgaaa 1080

caggggttgctggtgaaaaactgggcaccccagttggacatcttgtcgcacgagtcgacg 1140

ggagcgttcctgagccactgtgggtggaattcggtgatggagagcctatcccagggggtg 1200

ccgataatcggatggccaatggcggcggagcagagctacaattcaaagatgctggtggag 1260

gagatgggtgcggccgtggagttgacaagaggagtgcaaacaagcgttgaggggaaggat 1320

gtgaagaaggtgatagaattggttatggagaagagagaggggaagggaagggaaatgaag 1380

gaaaatgcagtgaagatcggtaagcaaattagggcatcagtcatggaggaaggagaagga 1440

accggctctgcttttaaatccttggatgattttgttacctccttgatacgcagaagggaa 1500

gaacaatcacgtcctgcaaatcacttat 1528

<210> 2

<211> 509

<212> PRT

<213> 七叶树（Aesculuschinensis）

<400> 2

Met Ala Cys Ser Ser Asp Asp Glu His Ile Val Met Leu Pro Met Met

1 5 10 15

Ala His Gly His Leu Ile Pro Phe Leu Gly Leu Ala Arg Arg Ile Gln

20 25 30

Gln Ala Thr Gly Phe Thr Ile Thr Ile Ala Asn Thr Pro Leu Asn Leu

35 40 45

Asn Asn Leu Arg Ser Thr Thr Asn Ser Ser Glu Phe Asp Ser Lys Ile

50 55 60

Arg Leu Ala Glu Leu Pro Phe Cys Ser Ala Asp His Gly Leu Pro Pro

65 70 75 80

Ser Thr Glu Asn Thr Glu Asn Leu Ser Leu Asp Arg Ile Ile Asp Phe

85 90 95

Phe His Ala Ser Lys Ser Leu Lys Thr Pro Phe His Asn Leu Leu Leu

100 105 110

Asp Ile Thr Gln Arg Glu Gly Lys Pro Pro Leu Cys Ile Ile Thr Asp

115 120 125

Thr Phe Cys Gly Trp Ala Val Asp Val Ala Glu Ser Thr Gly Thr Val

130 135 140

Asn Val Thr Phe Ser Thr Gly Gly Ala Tyr Gly Thr Leu Ala Tyr Met

145 150 155 160

Ser Leu Trp Met Asn Leu Pro His Arg Asn Pro Asp Arg Asp Glu Phe

165 170 175

Asn Leu Pro Gly Phe Pro Asp Gln Cys Arg Phe His Ile Thr Gln Leu

180 185 190

His Arg Phe Leu Arg Met Ala Asp Gly Thr Asp Ser Trp Ser Arg Phe

195 200 205

Phe Gln Pro Gln Ile Ser Glu Ser Leu Lys Ser Tyr Gly Met Leu Cys

210 215 220

Asn Thr Val Glu Glu Val Glu Ala Lys Ala Leu Lys Trp Leu Arg Lys

225 230 235 240

Phe Ser Lys Ile Pro Val Trp Ser Val Gly Pro Leu Leu Pro Pro Ala

245 250 255

Leu Leu Ser Ser Asn Glu Ser Pro Gly Ser Ser Asn Thr Tyr Lys Lys

260 265 270

His Ser Gly Lys Val Pro Gly Val Ser Ala Glu Lys Cys Leu Glu Trp

275 280 285

Leu Asp Leu Gln Asp Thr Asp Ser Val Leu Tyr Ile Ser Phe Gly Ser

290 295 300

Gln Asn Thr Ile Ser Ala Ser Gln Met Met Gly Leu Ala Ile Gly Leu

305 310 315 320

Glu Glu Ser Lys Val Ala Phe Ile Trp Val Ile Arg Pro Pro Ile Gly

325 330 335

Phe Asp Leu Asn Gly Gly Phe Arg Ser Glu Trp Leu Pro Glu Arg Tyr

340 345 350

Glu Glu Arg Ile Ala Ala Thr Lys Gln Gly Leu Leu Val Lys Asn Trp

355 360 365

Ala Pro Gln Leu Asp Ile Leu Ser His Glu Ser Thr Gly Ala Phe Leu

370 375 380

Ser His Cys Gly Trp Asn Ser Val Met Glu Ser Leu Ser Gln Gly Val

385 390 395 400

Pro Ile Ile Gly Trp Pro Met Ala Ala Glu Gln Ser Tyr Asn Ser Lys

405 410 415

Met Leu Val Glu Glu Met Gly Ala Ala Val Glu Leu Thr Arg Gly Val

420 425 430

Gln Thr Ser Val Glu Gly Lys Asp Val Lys Lys Val Ile Glu Leu Val

435 440 445

Met Glu Lys Arg Glu Gly Lys Gly Arg Glu Met Lys Glu Asn Ala Val

450 455 460

Lys Ile Gly Lys Gln Ile Arg Ala Ser Val Met Glu Glu Gly Glu Gly

465 470 475 480

Thr Gly Ser Ala Phe Lys Ser Leu Asp Asp Phe Val Thr Ser Leu Ile

485 490 495

Arg Arg Arg Glu Glu Gln Ser Arg Pro Ala Asn His Leu

500 505

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT92G7F

<400> 3

atggcttgcagcagtgatg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT92G7R

<400> 4

ataagtgatttgcaggacgt 20

Claims

1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述七叶苷和/或秦皮苷糖基转移酶活性是催化秦皮素生成秦皮苷的活性和/或催化秦皮乙素生成七叶苷的活性。

3.权利要求1或2所述蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

6.扩增权利要求3或4所述编码基因全长或其任一片段的引物对，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

7.权利要求1或2所述的蛋白在作为七叶苷和/或秦皮苷糖基转移酶中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述七叶苷和/或秦皮苷糖基转移酶为催化秦皮素生成秦皮苷和/或催化秦皮乙素生成七叶苷的酶。

9.权利要求1或2所述的蛋白、权利要求3或4所述编码基因在催化秦皮素生成秦皮苷和/或催化秦皮乙素生成七叶苷中的应用。