CN110423733B

CN110423733B - 一种穿心莲中的蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN110423733B
Application number: CN201910500200.6A
Authority: CN
Inventors: 黄璐琦; 高伟; 李媛
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2039-06-11
Also published as: CN110423733A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种穿心莲中的蛋白及其编码基因与应用。本发明提供一种名称为ApUFGT1的蛋白，所述ApUFGT1是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖基转移酶功能的由其衍生的蛋白质。本发明的ApUFGT1，经转录组测序鉴定和分离，可以对不同结构的黄酮类化合物进行糖基化，可以对黄酮类化合物的不同羟基进行糖基化。

Description

一种穿心莲中的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种穿心莲中的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

穿心莲为爵床科植物穿心莲(Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees)的干燥地上部分，具有抗炎、抗高血糖、保肝、抗癌、抗氧化、抗菌等多种药理活性，是我国最常用的传统药材之一，具有很大的应用潜力。黄酮类化合物及其苷类化合物是穿心莲主要次生代谢产物之一。以糖苷形式存在的黄酮类化合物通过调节生长素激素的稳态，在植物的生长发育中起着关键作用。近年来，人们越来越重视穿心莲中黄酮苷的抗血小板、抗增殖等药理作用，为穿心莲黄酮苷的进一步开发和临床应用提供了机遇。糖基化是发生在各种生物过程中的关键修饰步骤，特别是在次生代谢途径中，它改变底物分子的稳定性、极性、溶解性、生物活性、毒性等。近年来，糖基化的化学和酶法合成取得了很大进展。但化学糖基化反应存在副反应和中间体多、区域选择性和立体选择性差、收率低、溶剂相容性差、萃取分离复杂、保护脱保护步骤繁琐等缺点。

利用糖基转移酶对天然产物和非天然产物进行糖基化反应是合成生物学中的一个新兴领域，近年来发展迅速。新发现的具有特异底物识别的糖基转移酶将有助于阐明糖苷生物合成途径，具有重要的理论和实用价值。目前，国内外对穿心莲黄酮糖基转移酶的研究较少。因此，对具有不同结构的黄酮类化合物进行催化作用的新型穿心莲黄酮糖基转移酶具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的糖基转移酶，满足对不同结构的黄酮类化合物进行糖基化的需求。

为了解决以上技术问题，本发明提供了名称为ApUFGT1的蛋白质。

所述名称为ApUFGT1的蛋白质来源于穿心莲(Andrographispaniculata)。

本发明提供一种名称为ApUFGT1的蛋白，所述ApUFGT1是如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖基转移酶功能的由其衍生的蛋白质。

其中，序列1由485个氨基酸残基组成。

本发明还提供了一种编码所述ApUFGT1的基因。

其中，所述基因为如下(b1)或(b2)所述的DNA分子：

(b1)核苷酸序列如序列2所示的DNA序列；

(b2)将(b1)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的DNA序列。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌也应在本发明的保护范围之内。

所述ApUFGT1作为糖基转移酶的应用也应在本发明的保护范围之内。

序列2由1458个核苷酸组成，其中第1-1458为编码序列。

上述应用可为非疾病诊断和/或非疾病治疗目的应用。

所述ApUFGT1的编码基因在制备糖基转移酶中的应用也应在本发明的保护范围之内。

所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在制备糖基转移酶中的应用也应在本发明的保护范围之内。

所述ApUFGT1在参与芹菜素糖苷的生物合成或者制备芹菜素糖苷中的应用也应在本发明的保护范围之内。

所述ApUFGT1在参与汉黄芩素糖苷生物合成或者制备汉黄芩素糖苷中的应用也应在本发明的保护范围之内。

所述ApUFGT1在参与木犀草素糖苷生物合成或者制备脱水木犀草素糖苷中的应用也应在本发明的保护范围之内。

所述重组菌在制备ApUFGT1中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明公开了新的穿心莲多糖基转移酶(ApUFGT1)，经转录组测序鉴定和分离，可以对不同结构的黄酮类化合物进行糖基化，它们还表现出多个功能，可以对黄酮类化合物的不同羟基进行糖基化。这种糖基转移酶(ApUFGT1)是合成具有不同结构的小生物活性糖苷的有效酶促工具，对黄酮类化合物资源开发、药物设计和新的活性先导化合物的发现具有重要意义。

附图说明

图1亲和层析纯化重组蛋白的SDS-PAGE。M，标准蛋白质标记物(ThermoScientific)；

图2为底物为芹菜素时的结果图，其中图2A为色谱图，图2B为质谱图；

图3为底物为汉黄芩素时的结果图，其中图3A为色谱图，图3B为质谱图，其中图3A中的2和2a分别表示底物和产物。图3B表示的是产物2a的质谱图；

图4为底物为木犀草素时的结果图，其中图4A为色谱图，图4B为质谱图。

具体实施方式

大肠杆菌Transetta(DE3)：北京全式金生物技术有限公司。

pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit：北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司。

Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱：Qiagen,Wisconsin,USA。

芹菜素(CAS号：520-36-5)、汉黄芩素(CAS号：632-85-9)、木犀草素(CAS号：491-70-3)、白杨素(CAS号：480-40-0)、大豆苷元(CAS号：486-66-8)、山奈酚(CAS号：520-18-3)、柚皮素(CAS号：480-41-1)、根皮素(CAS号：60-82-2)和染料木素(CAS号：446-72-0)均购自云南西力生物技术股份有限公司。

芹菜素-7-O-葡糖苷(CAS号：578-74-5)、山奈酚-7-O-葡萄糖苷(CAS号：16290-07-6)、大豆苷(CAS号：552-66-9)、柚皮素-7-O-葡萄糖苷(CAS号：529-55-5)和染料木苷(CAS号：529-59-9)均购自成都普瑞法科技开发有限公司。

载体HIS-MBP-pET28a记载于如下文献：Probing the Single Key AminoAcidResponsible for the Novel CatalyticFunction of ent-KaureneOxidaseSupported by NADPH-CytochromeP450 Reductases inTripterygiumWilfordii；Frontiers in Plant Science，www.frontiersin.org；October2017，Volume 8，Article 1756，公众可以从中国中医科学院中药资源中心获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

实施例1

穿心莲中一种黄酮糖基转移酶蛋白ApUGT1及其编码基因的发现

采用MEJA(茉莉酸甲酯)诱导进行转录组测序，在叶转录组中发现了9个候选糖基转移酶，其表达均受到茉莉酸甲酯的诱导。进一步对九个基因进行原核表达和功能验证，发现蛋白ApUGT1为能够专属性地参与黄酮糖苷类化合物生物合成的糖基转移酶，而不能催化穿心莲中二萜类化合物的生物合成。

所述糖基转移酶蛋白ApUGT1的氨基酸如序列表的序列1所示，其对应的cDNA中的编码区如序列表的序列2所示。

实施例2

功能验证

一、构建重组质粒

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子，即ApUFGT1基因。

2、以步骤1得到的DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

F1：5’-TCCAGGGGCCCGAATTCGGAATGGAGAATAATAACAAAGTTG-3’；

R1：5’-AGTGCGGCCGCAAGCTTGTTAGCTATATTTTTGTTGTAT-3’。

3、取载体HIS-MBP-pET28a，用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收线性化的载体骨架。

4、取步骤2得到的PCR扩增产物，采用pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit并按说明书操作，将其克隆至载体HIS-MBP-pET28a，得到重组质粒。

用SEQ ID No.2所示的ApUFGT1基因替换HIS-MBP-pET28a的BamHⅠ和SalⅠ识别位点间的片段，保持HIS-MBP-pET28a其他序列不变，得到重组表达载体，将其命名为pET28a-ApUFGT1。pET28a-ApUFGT1可以表达序列表中的序列1所示的蛋白质ApUFGT1。

二、制备粗酶液

1、取步骤一中构建的重组质粒pET28a-ApUFGT1，导入大肠杆菌Transetta(DE3)中，得到重组菌。

2、将步骤1得到的重组菌接种至含0.1mg/100ml氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃、250rpm振荡培养至OD_600nm＝0.6-1.0。

3、完成步骤2后，在体系中加入IPTG并使其在体系中的浓度为1mM，16℃、180rpm振荡培养12h。

4、完成步骤3后，4℃、10000g离心20min，收集菌体，用预冷的PB缓冲液(含1mMEDTA、10％甘油、1mM PMSF，溶剂为pH7.0、50mM的PBS缓冲液)重悬，然后置冰浴中进行超声破菌(30％功率，超声5s，间隔5s，持续10min)，然后4℃、15000g离心15min，收集上清液，即为粗酶液，将该上清液命名为上清液甲。

用载体HIS-MBP-pET28a代替重组质粒进行上述步骤1-4，得到的上清液命名为上清液乙。

三、制备蛋白

1、取步骤二得到的上清液甲，采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行纯化得到ApUFGT1。具体方法如下：将上清液通过0.45μm膜过滤蛋白，上样Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱，4℃孵育2小时；样品用不同浓度的咪唑/Pb缓冲液[0.02M Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.4)和0.5MNaCl洗脱，咪唑浓度为50、100、200、300或500mM。然后浓缩蛋白质，通过Amicon Ultra-30K过滤器(美国Millipore公司)将缓冲液改为脱盐缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.4)。使用改良的Bradford蛋白质检测试剂盒(中国上海生工生物技术公司)测定蛋白浓度。纯化后的蛋白经SDS-PAGE验证经检测。结果如图1所示。

四、蛋白具有糖基转移酶功能的验证试验

分别设置如下黄酮底物：包括穿心莲中的黄酮:芹菜素、汉黄芩素、木犀草素，以及非穿心莲中的黄酮:白杨素、大豆苷元、山奈酚、柚皮素、根皮素、染料木素。反应体系组成:总体积为100μl，含有50mM的Tris-HCl(ph＝8.0)、8μg纯化蛋白(ApUFGT1)、320μM的底物和3200μM的UDP葡萄糖。反应在30℃下进行12小时，加入两倍体积的甲醇终止反应，充分摇匀混合物，12000g离心10分钟，最后用0.22μm滤膜过滤上清液，然后进行液相和质谱分析。

液质联用分析为Waters Acquity I-Class UPLC TM串联Waters Zevo G2-S Q-TOF MS(美国Waters公司)，色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)，柱温40℃。进样量1μL。流动相流速为0.4mL/min。流动相由A液和B液组成。A液为0.1％(体积百分含量)甲酸水溶液。B液为乙腈。洗脱过程：0-3min，A液占流动相的体积份数由95％线性下降至83％；3-12min，A液占流动相的体积份数由83％线性下降至65％；12-14.5min，A液占流动相的体积份数由65％线性下降至40％。离子化模式为电喷雾正离子模式；扫描范围，50-1500Da；扫描时间，0.2秒；锥电压，40V；源温度，100℃；溶解气体温度，450℃；锥形气体流量，50升/小时；去溶剂流量，900L/h；碰撞能量，20-50V。以法林(200pg/μl，10μl/min)为参照物(m/z 556.2766ESI(+)。准确质量数用leucineenkephalin作校正液。使用Masslynxtm软件(4.1版，Waters Co.，Milford，MA，USA)分析数据。

其中，底物为芹菜素时的结果图见图2。图2中，上图为色谱图，下图为质谱图。图2中，1a和1c为对应反应产物，产物1a和1c的质谱图分别对应图2上的B2和B1，1c’为对应产物标准品(即芹菜素-7-O-葡糖苷)，1为对应底物标准品。反应产物峰有两个分别为1a和1c,由图2B的质谱图可以看出其质荷比比底物质荷比多1个或2个162(一个葡萄糖和底物轻基脱去一分子水后,产物增加的分子量),表明产物1a和1c均为相应糖苷化合物。且产物标准品1c’的峰与反应产物1c的峰对应，可以判定为同一物质，即底物芹菜素与本发明的蛋白(ApUFGT1)的反应产物中含有芹菜素-7-O-葡糖苷。由此可以看出，本发明的蛋白(ApUFGT1)对于芹菜素具有糖基转移酶的功能。

其中，底物为汉黄芩素时的结果图见图3。图3中，上图图3中A为色谱图，下图图3B为质谱图。以反应产物峰有1个，即图3A上的2a,如图3B所示，产物2a的质荷比比底物质荷比多1个162(一个葡萄糖和底物轻基脱去一分子水后,产物增加的分子量),表明产物为相应糖苷化合物。由此可以看出，本发明的蛋白(ApUFGT1)对于汉黄芩素具有糖基转移酶的功能。

其中，底物为木犀草素时的结果图见图4。图4中，上图图4A为色谱图，下图图4B为质谱图。反应产物峰有5个分别为3a、3b、3c、3d和3e,产物3a、3b、3c、3d和3e的质谱图分别对应图4中的B5、B4、B3、B2和B1。从质谱图中可以看出，产物的质荷比比底物质荷比多1个或者2个162(一个葡萄糖和底物轻基脱去一分子水后,产物增加的分子量),表明产物为相应糖苷化合物。由此可以看出，本发明的蛋白(ApUFGT1)对于木犀草素具有糖基转移酶的功能。

分别以表1中化合物为底物，进行上述糖基转移酶功能的验证试验，并通过色谱结果计算计算转化率，转化率＝反应后的产物质量/(反应后的产物总质量+反应后的剩余底物质量)，结果如表1所示。其中，底物4-11的洗脱过程由“0-3min，A液占流动相的体积份数由95％线性下降至83％；3-12min，A液占流动相的体积份数由83％线性下降至65％；12-14.5min，A液占流动相的体积份数由65％线性下降至40％”更改为“0-6min，A液占流动相的体积份数由95％线性下降至75％；6-15min，A液占流动相的体积份数由75％线性下降至60％”。

表1.本发明的蛋白(ApUFGT1)以不同底物反应时的转化率

本发明的蛋白(ApUFGT1)以不同底物反应时的转化率如表1所示。由表1中的结果可以看出，本发明的蛋白(ApUFGT1)对黄酮类底物有着良好的糖苷化转化率。

序列表

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> 一种穿心莲中的蛋白及其编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 485

<212> PRT

<213> 穿心莲(Andrographis paniculata)

<400> 1

Met Glu Asn Asn Asn Lys Val Ala Ile Thr Pro Asn Val Leu Met Ile

1 5 10 15

Ala Ile Pro Tyr Gln Gly His Leu Asn Pro Phe Leu His Leu Ala Ile

20 25 30

Lys Leu Ala Ser Lys Gly Phe Ala Ile His Phe Val His Thr Leu His

35 40 45

Ala His His Val Ile Lys Ser Ser Ser Glu Asn Arg Phe Asp Gly Asp

50 55 60

Asp Val Phe Ser Gly Ala Arg Glu Ser Gly Leu Asp Ile Arg Tyr Ser

65 70 75 80

Thr Ile Ser Asp Gly Phe Pro Ile Glu Tyr Asp Arg Ser Glu Asp Val

85 90 95

Val Ser Tyr Trp Asp His Met Leu Lys Val Phe Pro Ser Leu Val Asp

100 105 110

Glu Phe Val Ala Asn Leu Ile Asn Thr Val Pro Pro Ser Pro Trp Ile

115 120 125

Ile Val Ala Asp Thr Ile Ser Ser Trp Gln Gly Leu Ile Ala Glu Lys

130 135 140

Tyr Asn Met Val Asn Val Ser Phe Trp Thr Glu Pro Ala Val Val Phe

145 150 155 160

Ala Leu Asp Tyr Tyr Val Asp Leu Leu Thr Lys Asn Gly His Phe Pro

165 170 175

Ser Ser Ser Ser Ser Gly Asp Arg Asp Cys Val Ile Asp Tyr Ile Pro

180 185 190

Gly Val Ala Pro Ile His Lys Lys Asp Leu Met Ser Asn Leu Gln Glu

195 200 205

Ser Asp Ser Thr Ser Ile Leu Asn Lys Ile Leu Leu Lys Thr Phe Glu

210 215 220

Glu Val Lys Lys Ala Asp Ile Val Leu His Asn Thr Val Glu Glu Leu

225 230 235 240

Glu Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Leu Asn Glu Leu Trp Pro Thr Tyr Ala

245 250 255

Ile Gly Pro Ile Asn Phe Ser Pro Glu Thr Thr Lys Leu Asp Ile Ser

260 265 270

Lys Ser Leu Leu Pro Glu Thr Asp Cys Thr Glu Trp Leu Asn Ser Lys

275 280 285

Pro Pro Gly Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Leu Val Gln Ile

290 295 300

Glu Gln Lys Val Ile Gln Glu Val Ala Arg Gly Leu Arg Ala Ser Lys

305 310 315 320

Leu Asn Phe Leu Trp Ala Leu Arg Arg Asp Ile Phe Glu His Glu Ile

325 330 335

Asn Val Phe Pro Ala Gly Phe Glu Asp Asp Val Lys Asp Arg Gly Leu

340 345 350

Ile Ile Thr Trp Cys Asp Gln Ile Ala Val Met Ser Asn Pro Ala Val

355 360 365

Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Ile Leu Glu Ser Met

370 375 380

Trp Phe Gly Val Pro Met Ile Cys Tyr Pro Val Leu Tyr Asp Gln Pro

385 390 395 400

Thr Asn Arg Lys Leu Val Val Asp Asp Trp Lys Ile Gly Ile Asp Leu

405 410 415

Cys Gln Asp Lys Ala Lys Val Glu Gly Glu Glu Val Ala Trp Lys Ile

420 425 430

Lys Thr Leu Met Asn Ser Glu Thr Ser Asp Gly Val Arg Asn Glu Met

435 440 445

Lys Lys Leu Thr Ser Val Ile Arg Ser Ala Trp Gly Ala Asp Gly Ser

450 455 460

Ser Thr Thr Asn Phe Asn Arg Phe Leu Asp Asp Leu Asn Asp Lys Ile

465 470 475 480

Gln Gln Lys Tyr Ser

485

<210> 2

<211> 1458

<212> DNA

<213> 穿心莲(Andrographis paniculata)

<400> 2

atggagaata ataacaaagt tgcaataacc cctaatgtcc taatgattgc aattccctac 60

caaggccatc taaacccttt tcttcattta gcaatcaagt tggcttcaaa aggctttgcc 120

atacattttg tgcacactct ccatgctcac catgtcatca aaagctcttc cgaaaatcga 180

ttcgacggcg atgacgtctt ttccggggca cgcgagtcgg gcctcgacat acgctattcc 240

acgatttccg atggcttccc catcgaatat gatagatcgg aggatgtcgt gagctattgg 300

gatcatatgt tgaaagtgtt tccttctctt gtcgacgagt ttgtcgctaa tttgatcaac 360

accgtcccgc cgtcgccgtg gattattgtg gccgatacta tctcgtcgtg gcaaggattg 420

atcgccgaga agtataacat ggtgaatgta tccttttgga ccgagccggc cgtcgtgttt 480

gccctcgatt attacgtgga tcttcttaca aagaacggac atttcccgtc ctcatcctcg 540

tcgggagatc gggattgcgt gatcgactac atccccggag tcgcgccgat acacaaaaag 600

gacttaatgt ctaatcttca agaatccgat tcgacatcga ttcttaacaa gattttgctc 660

aagacattcg aggaagttaa aaaagccgac attgtcctac acaacacggt cgaagaactc 720

gagtcgtata cactatcaac cttgaacgaa ctatggccga catacgccat aggcccgata 780

aacttctcgc cggagaccac caaactcgac atttccaaga gcctacttcc cgaaactgat 840

tgcaccgaat ggttgaactc gaaacccccc ggatcagttc tatacgtctc gttcggaagc 900

ctcgttcaga tcgaacaaaa agttattcaa gaagtggctc gcgggcttcg ggcgagcaag 960

ttaaacttcc tttgggcact aaggcgcgac attttcgaac atgagattaa tgtttttcct 1020

gccggattcg aggatgatgt aaaggatcga ggattgatca tcacgtggtg cgatcaaatc 1080

gccgtgatgt ccaatccggc ggtcggggga tttttgacgc attgtggatg gaactctata 1140

ttggaaagca tgtggtttgg ggtacctatg atatgttatc cggtccttta cgatcaaccg 1200

actaatcgga agctagtggt ggatgattgg aagatcggga tcgacctttg ccaggacaag 1260

gcaaaggtcg agggggaaga agtggcgtgg aagatcaaaa cattgatgaa tagtgaaacc 1320

tcggacggtg taagaaatga gatgaagaag ctcacaagtg taattaggag tgcttggggt 1380

gctgatggat cttccacgac gaatttcaac cggtttctag atgatttgaa tgataaaata 1440

caacaaaaat atagctaa 1458

Claims

1.一种名称为ApUFGT1的蛋白在参与黄酮糖苷的生物合成或者制备黄酮糖苷中的应用，所述黄酮糖苷为芹菜素糖苷、汉黄芩素糖苷或者木犀草素糖苷；

所述ApUFGT1是由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。