CN110982830B

CN110982830B - 糖基转移酶基因RyUGT3A及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN110982830B
Application number: CN201911240552.9A
Authority: CN
Inventors: 谭宁华; 易善勇; 邝彤东
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2039-12-06
Also published as: CN110982830A

Abstract

本发明公开了一种新的蒽醌类和黄酮类化合物糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了此酶在生物合成相关糖基转移酶基因的功能；在体外该重组蛋白可以高效地将含有β‑OH蒽醌类化合物和7‑OH或3‑OH黄酮类化合物转化成对应的糖苷。本发明还提供了含有RyUGT3A基因的重组质粒，可以通过生物工程方法大量合成蒽醌类糖苷和黄酮类糖苷，同时本发明也提供了一种能大量合成蒽醌类糖苷和黄酮类糖苷的途径，进一步开展蒽醌糖苷和黄酮糖苷生物合成调控研究奠定基础。

Description

糖基转移酶基因RyUGT3A及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及一种糖基转移酶基因RyUGT3A及其编码蛋白，以及在生物转化合成特异性蒽醌苷和黄酮苷中的应用。

背景技术

糖基转移酶(glycosyltransferases，GTs；EC 2.4.x.y)家族是一个多成员的基因家族，其中尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases，UGTs)家族是植物体内最大的糖基转移酶家族。其中的GT1家族，是一个由C末端含有44个氨基酸组成的保守序列，且该保守序列被认为是糖基化过程中与UDP-糖的结合的区域，被称为PSPG-box，因此将GT1单独归类为一个尿苷二磷酸糖基依赖的转移酶超家族，其成员主要以UDP-葡萄糖，UDP-半乳糖，UDP-鼠李糖，UDP-阿拉伯糖和UDP-葡糖醛酸为糖基供体。

糖基化反应是植物次生代谢物质合成途径中的常见且重要的下游修饰反应，将受体分子催化连接上糖基，进而影响受体分子在细胞和机体内的生物活性、水溶性、转运性及稳定性等。药用植物中有很多重要活性成分都是糖基化的产物，比如大黄的活性成分大黄素苷，红景天活性成分红景天苷，天麻活性成分天麻素等。鉴于糖基转移酶对植物中重要天然活性产物的糖基化及生理活动过程中重要作用及其在生物合成技术中的越来越突显的应用价值，近几年已引起了学者们的广泛关注。

目前，可以通过三种方式获得糖苷类化合物：直接从植物中提取、利用化学合成以及酶催化合成。三种方式相比较来说，直接从植物中提取的工艺相对复杂，且植物中的糖苷类化合物种类多且含量较低，使得整个提取工艺的成本较高。糖类分子上多个可以反应的羟基，使得化学合成法在获得糖基化合物过程中必须加入复杂的基团保护剂以及糖苷合成后的去保护，才能在立体构象和区域位置上特异性合成糖苷键，如此频繁的步骤大大限制了其工业化合成糖苷的实用性，而且一般化学合成中所使用的试剂和生产过程中出现的副产物大多无法实现再利用，容易对环境造成污染。相比而言，酶法糖基化具有立体选择性和区域选择性，步骤简单，环境污染也更小，且符合绿色化学的理念，因此越来越多的人开始关注利用工具酶来催化合成糖苷类化合物。

为了找寻到功能新颖且具有一定应用价值的糖基转移酶，本发明前期基于紫参(Rubia yunnanensis Diels)的化学成分分析(具有含量较高的糖苷类化合物)，然后结合紫参的de novo转录组数据，通过生物信息学的分析，挖掘到了一组具有将蒽醌类和黄酮类化合物特异性糖基化的糖基转移酶，其中一个命名为 RyUGT3A，通过生物分子技术进行原核表达，鉴定出其功能对蒽醌类和黄酮类化合物具有较高的转化效率(95％以上)，并且对加糖位点有特异的选择性(主要针对蒽醌类的β-OH和黄酮类的7-OH或3-OH进行糖基化)，而且所合成的糖苷类化合物极为稳定，这些皆有益于提高该酶商业化用途。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种糖基转移酶基因RyUGT3A，及其编码蛋白，以及上述基因和蛋白在生物转化合成特异性蒽醌苷和黄酮苷中的应用。

技术方案：本发明公开了一种糖基转移酶基因RyUGT3A，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。该基因是以紫参根cDNA为模板基因克隆获得，可依赖尿苷二磷酸葡萄糖的蒽醌类和黄酮类糖基转移酶。

本发明还公开了上述糖基转移酶基因RyUGT3A编码的蛋白，其氨基酸序列如 SEQID NO.2所示。

本发明还公开了一种含有上述糖基转移酶基因RyUGT3A的重组质粒。

进一步的，所述重组质粒通过将糖基转移酶基因RyUGT3A连接到pET-28a(+) 载体的多克隆位点中构建获得，命名为pET-28a(+)-RyUGT3A。

上述糖基转移酶基因RyUGT3A或所述编码蛋白在蒽醌糖苷和黄酮糖苷的生物合成中的应用也在本发明的保护范围内。

具体的，所述糖基转移酶基因RyUGT3A或所述编码蛋白将含β-OH蒽醌类化合物和7-OH或3-OH黄酮类化合物转化成对应糖苷。

上述重组质粒在蒽醌糖苷和黄酮糖苷的生物合成中的应用也在本发明保护范围内。

进一步的，通过在大肠杆菌中的表达pET-28a(+)-RyUGT3A，得到RyUGT3A 重组蛋白，将含β-OH蒽醌类化合物和7-OH或3-OH黄酮类化合物转化成对应的糖苷。

有益效果：本发明提供了一种新的蒽醌类和黄酮类化合物糖基转移酶基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了此酶在生物合成相关糖基转移酶基因的功能；在体外该重组蛋白可以高效地将含有β-OH蒽醌类化合物和7-OH或3-OH黄酮类化合物转化成对应的糖苷。本发明还提供了含有RyUGT3A基因的重组质粒，可以通过生物工程方法大量合成蒽醌类糖苷和黄酮类糖苷，同时本发明也提供了一种能大量合成蒽醌类糖苷和黄酮类糖苷的途径，进一步开展蒽醌糖苷和黄酮糖苷生物合成调控研究奠定基础。

附图说明

图1为紫参根RNA电泳图；

图2为以紫参cDNA为模板扩增糖基转移酶相关基因片段的电泳结果图；

图3为转大肠杆菌DH5α菌液PCR电泳结果图；

图4为Nde I和Xho I双酶切重组质粒电泳验证图；

图5为转大肠杆菌BL21(DE3)菌液PCR电泳结果图；

图6为糖基转移酶pET-28a(+)-RyUGT3A融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE凝胶电泳图(纯化前和纯化后)；

图7-1-A为标准品6-羟基茜草素及其糖基化产物1和2的UV色谱图；

图7-1-B为6-羟基茜草素糖基化产物1和2的质谱图；

图7-2-A为标准品大黄素及其糖基化产物的UV色谱图；

图7-2-B为大黄素的糖基化产物的质谱图；

图7-3-A为标准品2-羟基蒽醌及其糖基化产物的UV色谱图；

图7-3-B为2-羟基蒽醌的糖基化产物的质谱图；

图7-4-A为标准品2-氨基-3-羟基蒽醌及其糖基化产物的UV色谱图；

图7-4-B为2-氨基-3-羟基蒽醌糖基化产物的质谱图；

图7-5-A为标准品山奈酚及其糖基化产物的UV色谱图；

图7-5-B山奈酚的糖基化产物1和2的质谱图；

图7-6-A标准品黄芩素及其糖基化产物1和2的UV色谱图；

图7-6-B黄芩素糖基化产物1和2的质谱图；

图7-7-A标准品芹菜素及其糖基化产物1和2的UV色谱图；

图7-7-B芹菜素和其糖基化产物1和2的质谱图；

图8重组酶pET-28a(+)-RyUGT3A动力学参数的检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

本发明利用重组DNA技术将紫参糖基转移酶基因RyUGT3A与原核表达载体 pET-28a(+)(购自北京擎科新业生物技术有限公司)相连接，构建了融合基因表达质粒表达载体pET-28a(+)-RyUGT3A，转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自北京擎科新业生物技术有限公司)中，诱导表达并纯化获得重组蛋白 pET-28a(+)-RyUGT3A，酶功能活性验证表明pET-28a(+)-RyUGT3A可以高效转化蒽醌类和黄酮类化合物为糖苷产物，选取4个蒽醌类和3个黄酮类(所有化合物均购自上海源叶生物科技有限公司)化合物进行酶促放大反应，制备出的糖苷产物经HPLC-MS和NRM方法进行鉴定，发现重组蛋白pET-28a(+)-RyUGT3A可以非常高效地将含有β-OH蒽醌类化合物和7-OH或3-OH黄酮类化合物转化成对应的糖苷，表明重组蛋白pET-28a(+)-RyUGT3A可用于特异性地生物制备蒽醌苷和黄酮苷。

实施例1：克隆糖基转移酶RyUGT3A的编码基因

1、采集人工气候室种植的野生型紫参根茎，无菌水洗涤干净后置于液氮中，利用RN53 EASY spin Plus(北京艾德莱生物科技有限公司)提取紫参根茎的RNA，利用Nanodrop2000检测提取RNA的浓度和纯度后，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，电泳图见图1(M：DL2000 Marker；1：紫参根总RNA)。按照宝生物公司 (大连宝生物工程有限公司)的反转录酶操作说明将其反转录成cDNA后作为PCR模板，用RyUGT3A基因的特异性引物进行PCR扩增。具体引物信息为：

上游引物：5'ATGGGCCGGAAGCAGCTGCA 3'

下游引物：5'TCAATTATTTGAATGGTATGCACTC 3'

PCR反应体系为：PrimeSTAR Max DNA Polymerase(R045A，大连宝生物工程有限公司)25μL，上下游引物各2μL，模板50-100ng，dd水补至50μL。PCR扩增程序为：98℃反应10s，60℃反应5s，72℃反应30s，循环35次；反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测其大小，电泳图见图2(M：DL2000 Marker；1：基因RyUGT3A扩增结果)。

2、将扩增产物连接到T载体，转化至大肠杆菌DH5α，挑选菌落进行PCR 验证，从而获得阳性菌落进行测序，PCR验证图见图3(M：DL2000 Marker；1-4：随机挑选的四个单克隆菌)，菌落PCR反应体系为：12.5μL 2x Ftaq PCR MasterMix (ZT201，北京庄盟国际生物基因科技有限公司)，上下游引物各2μL，模板为挑选的菌落，dd水补至25μL。扩增程序为：94℃预变性反应3min，然后94℃反应15s、60℃反应15s和72℃反应30s，共循环30次，最后72℃延伸5min。

实施例2：RyUGT3A基因序列及编码蛋白分析

测序结果返还之后比对发现核苷酸序列与RNAseq序列相似度为99％，以实际测序结果为准。序列如SEQ ID NO.1所示含有1458个核苷酸，编码485个氨基酸的蛋白，如SEQ IDNO.2所示，将该基因命名为RyUGT3A。

SEQ ID NO.1糖基转移酶基因RyUGT3A核苷酸序列(RyUGT3A：1458bp)

SEQ ID NO.2糖基转移酶RyUGT3A氨基酸序列(485AA)

实施例3：RyUGT3A基因的原核表达

1、设计带有表达载体pET-28a(+)的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列为：

上游引物：5'GGAATTCCATATGGGCCGGAAGCAGCTGCA 3'

下游引物：5'CCCTCGAGTCAATTATTTGAATGGTATGCACTC 3'

2、以测序正确返还载体为模板，用上述特异引物进行扩增，PCR反应体系为：PrimeSTAR Max DNA Polymerase(R045A，大连宝生物工程有限公司)25μL，上下游引物各2μL，模板50-100ng，dd水补至50μL。PCR扩增程序为：98℃反应10s，60℃反应5s，72℃反应30s，循环35次。

3、将PCR扩增产物片段回收，然后通过T4连接酶连接到用Nde I和Xho I 双酶切过的pET-28a(+)载体，获得pET-28a(+)-RyUGT3A重组质粒。

4、pET-28a(+)-RyUGT3A重组质粒经Nde I和Xho I双酶切验证后转化到大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)中，经菌落PCR验证，挑取阳性菌落接种到LB液体培养基，37℃摇菌，直至OD600约为0.8，获得转基因工程菌。双酶切验证图见图4(M：DL5000 Marker；1：重组质粒pET-28a(+)-RyUGT3A；2：重组质粒 pET-28a(+)-RyUGT3A双酶切后)，菌落PCR验证图见图5(M：DL2000 Marker； 1-6：随机挑选的四个单克隆菌，其中1、3、4和5为阳性转化子)。

5、在上述转基因的工程菌中加入IPTG至终浓度为0.5mM，16℃诱导过夜，收集菌体，50mL收集一管，加入15mL PBS缓冲液(45.23g Na₂HPO₄·12H₂O， 8.07g C₆H₈O₇·H₂O，加水至1L，pH7.5)，充分悬浮菌体，在冰水浴条件下超声 45min，功率27％，工作2s，停歇2s。超声过后，在4℃的条件下12000rmp离心15min，收集上清液即为粗蛋白。根据融合蛋白上的His-Tag采用Ni-NTA柱纯化重组糖基转移酶，分别利用不同浓度的咪唑溶液洗脱目的蛋白，收集纯化液， 10％的SDS-PAGE电泳检测纯化效果。结果如图6(M：蛋白Marker；1：粗酶液；2：RyUGT3A纯化后)所示。

6、根据图6可看出，pET-28a(+)-RyUGT3A重组质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后，有重组蛋白的表达，上清蛋白经Ni-NTA柱纯化后得到了较纯的重组蛋白，且该蛋白的条带大小与预测的一致，加上重组标签后在55kDa左右有明显的重组蛋白条带。纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。

7、酶活性的测定：酶活反应体系为200μL，如表一。30℃反应1h后用等体积预冷的甲醇终止反应，15000离心5min，留样进行酶活分析。

表一重组蛋白酶催化反应体系

实施例4：pET-28a(+)-RyUGT3A重组蛋白的酶学活性检测分析

1、HPLC和LC-MS检测分析酶转化产物：酶活反应的供体为UDP-葡萄糖，受体为蒽醌类含β-OH的化合物(6-羟基茜草素、大黄素、2-羟基蒽醌、2-氨基-3- 羟基蒽醌)和黄酮类的化合物(山奈酚、黄芩素、芹菜素)。分析酶活产物HPLC 图谱，详见图示，其中：

图7-1-A为标准品6-羟基茜草素及其糖基化产物1和2的UV色谱图，图7-1-B 6-羟基茜草素糖基化产物1和2的质谱图，峰1和峰2分别为6-羟基茜草素3-O-β- 葡萄糖苷和6-羟基茜草素6-O-β-葡萄糖苷；

图7-2-A为标准品大黄素及其糖基化产物的UV色谱图，峰1为大黄素6-O-β- 葡萄糖苷，图7-2-B为大黄素的糖基化产物的质谱图；

图7-3-A为标准品2-羟基蒽醌及其糖基化产物的UV色谱图，峰1为2-羟基蒽醌2-O-β-葡萄糖苷，图7-3-B为2-羟基蒽醌的糖基化产物的质谱图；

图7-4-A为标准品2-氨基-3-羟基蒽醌及其糖基化产物的UV色谱图，峰1为 2-氨基-3-羟基蒽醌3-O-β-葡萄糖苷，图7-4-B为2-氨基-3-羟基蒽醌糖基化产物的质谱图；

图7-5-A为标准品山奈酚及其糖基化产物的UV色谱图，峰1和2分别为山奈酚7-O-β-葡萄糖苷和山奈酚3-O-β-葡萄糖苷，图7-5-B山奈酚的糖基化产物1 和2的质谱图；

图7-6-A标准品黄芩素及其糖基化产物1和2的UV色谱图，峰1和2分别为黄芩素7-O-β-葡萄糖苷和黄芩素6-O-β-葡萄糖苷，图7-6-B黄芩素糖基化产物1 和2的质谱图；

图7-7-A标准品芹菜素及其糖基化产物1和2的UV色谱图，其中1号峰为芹菜素7-O-β-葡萄糖苷，图7-7-B芹菜素和其糖基化产物1和2的质谱图。

6-羟基茜草素3-O-β-葡萄糖苷：brownish black powder.ESI-MS for C₂₁H₁₉O₁₀[M-H]^-:431.35.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.40(1H,s,H-4),7.42(1H,s,H-5), 7.17(1H,d,J＝8.4Hz,H-7),8.06(1H,d,J＝8.4Hz,H-8),5.09(1H,d,J＝6.0Hz, H-1′),3.34(2H,overlap,H-2′,3′),3.25(1H,overlap,H-4′),3.41(1H,overlap,H-5′), 3.70(1H,d,J＝11.8Hz,H-6′a),3.54(1H,dd,J＝11.8,5.1Hz,H-6′b),2.16(3H,s, 2-CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:161.3(s,C-1),120.8(s,C-2),160.6(s, C-3),105.5(d,C-4),113.1(d,C-5),165.0(s,C-6),121.8(d,C-7),129.6(d,C-8), 186.2(s,C-9),181.8(s,C-10),110.6(s,C-1a),132.0(s,C-4a),135.3(s,C-5a),123.6 (s,C-8a),100.4(d,C-1′),73.2(d,C-2′),76.3(d,C-3′),69.4(d,C-4′),77.3(d,C-5′), 60.5(t,C-6′),8.5(q,2-CH₃).

大黄素6-O-β-葡萄糖苷：brownish black powder.ESI-MS for C₂₁H₁₉O₁₀[M-H]^-:431.31.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.10(1H,s,H-2),7.43(1H,s,H-4),7.19 (1H,s,H-5),6.91(1H,s,H-7),5.11(1H,d,J＝7.2Hz,H-1′),3.32(2H,overlap,H-2′, 5′),3.46(1H,overlap,H-3′),3.22(1H,overlap,H-4′),3.71(1H,d,J＝10.8Hz,H-6′a), 3.52(1H,overlap,H-6′b),2.38(3H,s,3-CH₃).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ: 163.8(s,C-1),124.3(d,C-2),148.4(s,C-3),120.5(d,C-4),108.8(d,C-5),164.5(s, C-6),109.2(d,C-7),161.7(s,C-8),189.7(s,C-9),181.1(s,C-10),113.5(s,C-1a), 134.8(s,C-4a),132.8(s,C-5a),110.8(s,C-8a),100.0(d,C-1′),73.1(d,C-2′),77.3(d, C-3′),69.5(d,C-4′),76.3(d,C-5′),60.6(t,C-6′),21.6(q,3-CH₃).

2-羟基蒽醌2-O-β-葡萄糖苷：brown powder.ESI-MS for C₂₁H₁₉O₁₀[M+HCOO]^-:431.17.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.70(1H,s,H-1),7.53(1H,d,J＝8.8Hz, H-3),8.18(3H,overlap,H-4,5,8),7.92(2H,d,J＝6.1Hz,H-6,7),5.15(1H,d,J＝ 6.3Hz,H-1′),3.34(2H,overlap,H-2′,3′),3.23(1H,overlap,H-4′),3.46(1H,overlap, H-5′),3.71(1H,d,J＝11.8Hz,H-6′a),3.52(1H,overlap,H-6′b).¹³C NMR(100MHz, DMSO-d₆)δ:113.2(d,C-1),162.0(s,C-2),122.0(d,C-3),129.5(d,C-4),126.8(d, C-5),134.7(d,C-6),134.3(d,C-7),126.7(d,C-8),182.2(s,C-9),181.4(s,C-10), 135.0(s,C-1a),127.3(s,C-4a),133.1(s,C-5a,8a),100.1(d,C-1′),73.2(d,C-2′),76.4 (d,C-3′),69.5(d,C-4′),77.3(d,C-5′),60.5(t,C-6′).

2-氨基-3-羟基蒽醌3-O-β-葡萄糖苷：brownish red powder.ESI-MS forC₂₀H₂₀NO₈[M-H]^-:400.35.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.39(1H,s,H-1),7.70 (1H,s,H-4),8.10(1H,overlap,H-5,8),7.83(2H,overlap,H-6,7),4.89(1H,d,J＝5.7 Hz,H-1′),3.39(4H,overlap,H-2′,3′,4′,5′),3.73(1H,d,J＝11.9Hz,H-6′a),3.58(1H, dd,J＝11.9,4.9Hz,H-6′b),6.43(2H,s,2-NH₂).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ: 110.2(d,C-1),145.2(s,C-2),147.7(s,C-3),112.7(d,C-4),126.3(d,C-5,8),133.5(d, C-6,7),182.6(s,C-9),180.4(s,C-10),129.9(s,C-1a),122.4(s,C-4a),133.7(s,C-5a), 134.1(s,C-8a),101.7(d,C-1′),73.2(d,C-2′),77.3(d,C-3′),69.6(d,C-4′),75.7(d, C-5′),60.5(t,C-6′).

山奈酚7-O-β-葡萄糖苷：brownish black powder.ESI-MS for C₂₁H₁₉O₁₁[M-H]^ˉ:447.33.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:6.42(1H,s,H-6),6.80(1H,s,H-8),8.09 (2H,d,J＝8.3Hz,H-2′,6′),6.95(2H,d,J＝8.3Hz,H-3′,5′),5.07(1H,d,J＝7.4Hz, H-1″),3.28(2H,overlap,H-2″,H-5″),3.47(2H,overlap,H-3″,H-6″b),3.17(1H, overlap,H-4″),3.70(1H,d,J＝10.4Hz,H-6″a).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ: 147.5(s,C-2),136.4(s,C-3),176.2(s,C-4),160.4(s,C-5),98.8(d,C-6),162.7(s, C-7),94.3(d,C-8),155.8(s,C-9),104.7(s,C-10),121.6(s,C-1′),129.5(d,C-2′,6′), 115.5(d,C-3′,5′),159.4(s,C-4′),99.9(d,C-1″),73.1(d,C-2″),77.2(d,C-3″),69.6(d, C-4″),76.5(d,C-5″),60.6(t,C-6″).

山奈酚3-O-β-葡萄糖苷：brownish black powder.ESI-MS for C₂₁H₁₉O₁₁[M-H]^ˉ:447.33.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:6.21(1H,s,H-6),6.43(1H,s,H-8),8.03 (2H,d,J＝8.5Hz,H-2′,6′),6.88(2H,d,J＝8.5Hz,H-3′,5′),5.46(1H,d,J＝7.3Hz, H-1″),3.08-3.53(6H,sugar protons).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:156.4(s,C-2), 133.2(s,C-3),177.5(s,C-4),161.2(s,C-5),98.8(d,C-6),164.4(s,C-7),93.7(d,C-8), 156.2(s,C-9),103.9(s,C-10),120.9(s,C-1′),130.9(d,C-2′,6′),115.1(d,C-3′,5′), 160.0(s,C-4′),100.9(d,C-1″),74.2(d,C-2″),76.4(d,C-3″),69.9(d,C-4″),77.5(d, C-5″),60.9(t,C-6″).

黄芩素7-O-β-葡萄糖苷：brown powder.ESI-MS for C₂₁H₁₉O₁₀[M-H]^ˉ:431.35. ¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.00(1H,s,H-3),7.05(1H,s,H-8),8.07(2H,d,J＝ 7.2H,H-2′,6′),7.60(3H,overlap,H-3′,4′,5′),5.02(1H,d,J＝7.1Hz,H-1″), 3.19-3.76(6H,sugarprotons).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:163.5(s,C-2),104.7 (d,C-3),182.6(s,C-4),146.5(s,C-5),130.9(s,C-6),151.7(s,C-7),94.3(d,C-8), 149.2(s,C-9),106.1(s,C-10),130.7(s,C-1′),126.4(d,C-2′,6′),129.2(d,C-3′,5′), 132.1(d,C-4′),101.0(d,C-1″),73.2(d,C-2″),75.9(d,C-3″),69.7(d,C-4″),77.4(d, C-5″),60.7(t,C-6″).

芹菜素7-O-β-葡萄糖苷：brown powder.ESI-MS for C₂₁H₁₉O₁₀[M-H]^ˉ:431.35. ¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:6.85(1H,s,H-3),6.43(1H,s,H-6),6.82(1H,s, H-8),7.94(2H,d,J＝8.3Hz,H-2′,6′),6.94(2H,d,J＝8.3Hz,H-3′,5′),5.07(1H,d,J ＝7.2Hz,H-1″),3.29(2H,overlap,H-2″,H-5″),3.48(2H,overlap,H-3″,H-6″b),3.19 (1H,t,J＝8.9Hz,H-4″),3.72(1H,d,J＝10.9Hz,H-6″a).¹³C NMR(100MHz, DMSO-d₆)δ:164.3(s,C-2),103.1(d,C-3),182.0(s,C-4),161.6(s,C-5),99.6(d,C-6), 163.0(s,C-7),94.8(d,C-8),157.0(s,C-9),105.4(s,C-10),120.9(s,C-1′),128.7(d, C-2′,6′),116.7(d,C-3′,5′),161.3(s,C-4′),99.9(d,C-1″),73.2(d,C-2″),77.2(d, C-3″),69.6(d,C-4″),76.5(d,C-5″),60.7(t,C-6″).

根据上述图示，发现重组酶pET-28a(+)-RyUGT3A对含β-OH蒽醌类化合物和7-OH或3-OH黄酮类的化合物皆具有糖基化活性，且转化效率可达95％以上。

HPLC条件：

HPLC型号：Waters ACQUITY Arc

流动相：A相：甲酸水溶液；B相：乙睛。

洗脱梯度：0-5min：5％-20％B；5-8min：20％-22％B；8-17min：22-25％B；17-23min：25-35％B；23-25min：35-50％B；25-32min：50-100％B。

检测波长：蒽醌类：280nm；黄酮类：350nm。

利用质谱鉴定酶活产物，发现重组酶pET-28a(+)-RyUGT3A对于受体为含β-OH蒽醌类的化合物(6-羟基茜草素、2-羟基蒽醌、大黄素、2-氨基-3-羟基蒽醌) 和黄酮类的化合物(山奈酚、黄芩素、芹菜素)的酶活反应产物主要峰只有一个，其质荷比均比底物质荷比多出162(产物增加的分子量为一个葡萄糖和底物羟基脱去一分子水后的差值)，表明所有的产物均为单葡萄糖苷。

质谱条件：

质谱前的样品准备，3倍体积的乙酸乙酯萃取酶活反应液，萃取3次，然后合并萃取液于旋蒸仪上50℃旋干，甲醇溶解后，15000rpm离心10min后上样。

利用UPLC MS/MS对样品进行分离，柱子为Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈ column(2.1×50mm,1.7μm)，流动相与HPLC相同，洗脱梯度为：0-3min，10-100％ B，最后10％B平衡2min，进样体积2μL，流速为0.2ml/min，检测波长同上。

UPLC-MS/MS质谱条件：电喷雾离子化，全离子扫描，负离子模式negative-ion(EI)质谱分析。气体温度(dissociation temperature)：500℃，氮气流速(nitrogen gasflow rate)：800l/h，毛细管电压(capillary voltage)：2.5kV，锥孔电压(cone voltage)：52V，碰撞电压(collision)：50V,停留时间(dwell time)：240ms。采集质谱范围m/z：100-1000。

2、转化产物的核磁数据分析：为了确定产物的加糖位点，对表一进行放大反应(50ml)，再通过制备的方法分别制备出各个反应的主要产物，然后进行核磁图谱分析确定各个化合物的结构，通过对各个化合物核磁谱图的分析，发现重组酶pET-28a(+)-RyUGT3A对蒽醌类化合物的加糖位点具有区域选择性，即特异性的选择对蒽醌类化合物的β-OH进行糖基化；而对黄酮的糖基化位点主要为7-OH 和3-OH。

3、pET-28a(+)-RyUGT3A重组酶动力学参数分析：

为进一步了解重组蛋白的催化特性，我们检测了它对于6-羟基茜草素的催化活性。酶活反应体系总体积为200μL，其中包括：50ng重组蛋白 pET-28a(+)-RyUGT3A与10mM葡萄糖和6-羟基茜草素分别为50-300μM(分别为50/100/150/200/250/300μM)30℃反应10min，然后等体积预冷的甲醇终止反应，15000rpm高速离心5min后，取30μL HPLC检测，液相条件同上。米氏常数Km是通过米氏方程与双倒数作图法(Lineweaver-Burk plot)计算获得的，结果发现pET-28a(+)-RyUGT3A重组蛋白对于6-羟基茜草素的Km值为20.5μM(见图8)。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 糖基转移酶基因RyUGT3A及其编码蛋白与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggccgga agcagctgca cgtcttcttc ttccccatgt tagctcacgg ccacatgctc 60

ccaatcctgg atatggcaaa agtcttcagc tcacgcgccg tcaaatccac catcatcacc 120

acccaccacc acgtccccat gttccagaag gccatccaga agagcgtcga cgccggcctc 180

gacatctccg tccggggaat aacattctcg gccgccgcct ccggcttgcc ggagggaaca 240

gagagcctag acatggtgaa gtccgaagaa atgctcgcta aattcgtcct cggaaccatc 300

atgctccggg atgaactgga gaaccttcta gaagaactcc gcccagactg cctcgtcgcc 360

gacatgttct tcccatgggc cacggacgcg gcggcgaagt tcaacatccc gcggctgatc 420

ttccacggca ccagcacgtt cgcaaactcc gccggcgagt cgcttcgccg gaacgagccg 480

tacgacggcg tttcgtccga ctccgaaccg tttattatcc ccgaacttcc tcacgagata 540

aagatgacga gaggccaggt ttcgttatac gagaggaaga agctcgaaac agagacggag 600

tttagcaagc tgattaagga agtcagagct tcagaatcga aatgctacgg agtgattaac 660

aacagcttct acgaactgga accggattac gtcgaatact acacgaagaa actcgggaga 720

agagcatggc acgtgggccc gctccttctc tgcaacaacg aggttgaaga taaggcagaa 780

agagggaaga aatccgccat tgatgaagat gacatcatgc aatggctgga ttccaaacct 840

caaaactccg tggtgtacgt ctgtttcgga agcatggcga acttcacacg cgatcagttg 900

cacgagatcg cgaaaggact ggaatcctcg gaccaggatt tcctctgggt tgtccggaaa 960

tgcgtcgacg aagaagacga cagcgagaaa tggttcccga agggattcga ggacagaatc 1020

aaggagaatg gaaaggggtt aatcattaag ggatgggcgc ctcagctttt gattctgaac 1080

catgaatctg tcggagcatt cgtgacgcat tgcgggtgga attcgacgct ggagagtgtt 1140

tcttccgggg tcccgatgat aacatggccg atgtttgcgg agcagttttt gaatgagaaa 1200

ttgcttaccg acgttttaaa gattggggtg gcggtggggg ccacccagtg gagtagggtg 1260

aatgtggagg ttctgaaagg ggagaaactg ggggaggcgg tggcgcgtgt gatggtgggt 1320

ggtgaggcgg tggcgattag gaccagagct aaggagttga aggatagggc gaaggcggct 1380

gttgaaaaag gtggatcctc gtatgacgat ttaaattcac tcattcaaga attgagtgca 1440

taccattcaa ataattga 1458

<210> 2

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Arg Lys Gln Leu His Val Phe Phe Phe Pro Met Leu Ala His

1 5 10 15

Gly His Met Leu Pro Ile Leu Asp Met Ala Lys Val Phe Ser Ser Arg

20 25 30

Ala Val Lys Ser Thr Ile Ile Thr Thr His His His Val Pro Met Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Ile Gln Lys Ser Val Asp Ala Gly Leu Asp Ile Ser Val

50 55 60

Arg Gly Ile Thr Phe Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Pro Glu Gly Thr

65 70 75 80

Glu Ser Leu Asp Met Val Lys Ser Glu Glu Met Leu Ala Lys Phe Val

85 90 95

Leu Gly Thr Ile Met Leu Arg Asp Glu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Glu

100 105 110

Leu Arg Pro Asp Cys Leu Val Ala Asp Met Phe Phe Pro Trp Ala Thr

115 120 125

Asp Ala Ala Ala Lys Phe Asn Ile Pro Arg Leu Ile Phe His Gly Thr

130 135 140

Ser Thr Phe Ala Asn Ser Ala Gly Glu Ser Leu Arg Arg Asn Glu Pro

145 150 155 160

Tyr Asp Gly Val Ser Ser Asp Ser Glu Pro Phe Ile Ile Pro Glu Leu

165 170 175

Pro His Glu Ile Lys Met Thr Arg Gly Gln Val Ser Leu Tyr Glu Arg

180 185 190

Lys Lys Leu Glu Thr Glu Thr Glu Phe Ser Lys Leu Ile Lys Glu Val

195 200 205

Arg Ala Ser Glu Ser Lys Cys Tyr Gly Val Ile Asn Asn Ser Phe Tyr

210 215 220

Glu Leu Glu Pro Asp Tyr Val Glu Tyr Tyr Thr Lys Lys Leu Gly Arg

225 230 235 240

Arg Ala Trp His Val Gly Pro Leu Leu Leu Cys Asn Asn Glu Val Glu

245 250 255

Asp Lys Ala Glu Arg Gly Lys Lys Ser Ala Ile Asp Glu Asp Asp Ile

260 265 270

Met Gln Trp Leu Asp Ser Lys Pro Gln Asn Ser Val Val Tyr Val Cys

275 280 285

Phe Gly Ser Met Ala Asn Phe Thr Arg Asp Gln Leu His Glu Ile Ala

290 295 300

Lys Gly Leu Glu Ser Ser Asp Gln Asp Phe Leu Trp Val Val Arg Lys

305 310 315 320

Cys Val Asp Glu Glu Asp Asp Ser Glu Lys Trp Phe Pro Lys Gly Phe

325 330 335

Glu Asp Arg Ile Lys Glu Asn Gly Lys Gly Leu Ile Ile Lys Gly Trp

340 345 350

Ala Pro Gln Leu Leu Ile Leu Asn His Glu Ser Val Gly Ala Phe Val

355 360 365

Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Ser Ser Gly Val

370 375 380

Pro Met Ile Thr Trp Pro Met Phe Ala Glu Gln Phe Leu Asn Glu Lys

385 390 395 400

Leu Leu Thr Asp Val Leu Lys Ile Gly Val Ala Val Gly Ala Thr Gln

405 410 415

Trp Ser Arg Val Asn Val Glu Val Leu Lys Gly Glu Lys Leu Gly Glu

420 425 430

Ala Val Ala Arg Val Met Val Gly Gly Glu Ala Val Ala Ile Arg Thr

435 440 445

Arg Ala Lys Glu Leu Lys Asp Arg Ala Lys Ala Ala Val Glu Lys Gly

450 455 460

Gly Ser Ser Tyr Asp Asp Leu Asn Ser Leu Ile Gln Glu Leu Ser Ala

465 470 475 480

Tyr His Ser Asn Asn

485

Claims

1.一种糖基转移酶基因RyUGT3A，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述糖基转移酶基因RyUGT3A编码的蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.一种含有权利要求1所述糖基转移酶基因RyUGT3A的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，将糖基转移酶基因RyUGT3A连接到pET-28a(+)载体的多克隆位点中构建获得，命名为pET-28a(+)-RyUGT3A。

5.权利要求1所述糖基转移酶基因RyUGT3A或权利要求2所述编码蛋白在蒽醌糖苷和黄酮糖苷的生物合成中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将含β-OH蒽醌类化合物和7-OH或3-OH黄酮类化合物转化成对应糖苷。

7.权利要求3或4所述重组质粒在蒽醌糖苷和黄酮糖苷的生物合成中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过在大肠杆菌中的表达pET-28a(+)-RyUGT3A，得到RyUGT3A重组蛋白，将含β-OH蒽醌类化合物和7-OH或3-OH黄酮类化合物转化成对应的糖苷。