CN108795897B

CN108795897B - 一种糖基转移酶ugte1、其编码基因和应用

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Publication number: CN108795897B
Application number: CN201810526960.XA
Authority: CN
Inventors: 高伟; 黄璐琦; 马宝伟; 苏平; 刘喜红
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2018-05-29
Filing date: 2018-05-29
Publication date: 2019-06-07
Anticipated expiration: 2038-05-29
Also published as: CN108795897A

Abstract

本发明涉及一种糖基转移酶UGTE1及编码该糖基转移酶的基因，以及包含所述糖基转移酶编码基因的载体和重组细胞，利用所述糖基转移酶可以催化糖苷配基(或称底物或目标化合物)与糖基供体发生糖基化反应生成糖苷。

Description

一种糖基转移酶UGTE1、其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种糖基转移酶及其该糖基转移酶的编码基因，以及该糖基转移酶在糖苷类化合物生产中的应用，植物基因工程领域。

背景技术

化学法和酶法是目前进行糖基化修饰、糖苷合成的两大方法，糖类分子上多个可以反应的羟基，使得化学法糖基化必须进行复杂的基团保护剂糖苷合成后的去保护，才能在立体构象和区域位置上特异性合成糖苷键，如此频繁的步骤大大限制了其工业化合成糖胺的实用性。相比而言，酶法糖基化具有立体选择性和区域选择性，步骤简单，环境污染也更小。

糖基转移酶是一种能够能催化活化的糖供体到受体分子上而形成糖苷键的酶(Carbohydrate Active Enzymes；http://www.cazy.org)。常见的糖基供体有：葡萄糖，木酮糖，果糖，葡萄糖醛酸；常见的糖基受体有：氧基团，碳基团，氮基团，硫基团。植物中，糖基化反应经常出现在化合物生物合成中的最后步骤中，糖基化反应几乎发生在所有类型的化合物中，例如萜类，黄酮类，类胡萝卜素，氰醇类。糖基化作用能增加化合物的水溶性并减小毒副作用。根据GT氨基酸序列相似性、形成糖苷的立体化学结构和已知底物的特异性，目前已将其分为105个已编号的家族，但不同家族间的进化关系仍并不清楚，由于GT1中很多GT的C末端含有1个由44个氨基酸组成的保守序列，因此将GT1单独归为一个尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)超家族，其成员主要以UDP-葡萄糖和UDP-葡糖醛酸为糖基供体，该保守序列被认为是结合糖基供体的区域；而不含保守序列的GT归为另一个家族，其成员较少，其中的植物源GT催化固醇和甘油酯类的糖苷化。根据糖基转移酶的构型可以将其分为GT-A，GT-B和GT-C三种构型，根据GT催化反应机制，可将其分为“转化型”和“保留型”。

发明内容

本发明第一个方面，涉及一种分离的糖基转移酶UGTE1(或称雷公藤糖基转移酶，TwUGTE1)，其中所述酶：

(1)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或

(2)由包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码的多肽；或

(3)与上述(1)或(2)限定的酶同源；或

(4)由一核酸编码，所述核酸在严格条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补链杂交的多核苷酸所编码的多肽；或

(5)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸且功能相同的多肽。

术语“糖基转移酶”表示能够从活化的核苷酸糖转移到糖苷配基以形成糖苷的糖基转移酶。

当糖基转移酶通过O-糖苷键缀合糖到糖苷配基，可以称其为O-糖基转移酶。

术语“糖苷配基”表示糖苷配基的相应糖基化形式的非碳水化合物部分。当糖是葡萄糖时，可以将糖苷配基称为配基，此外，当糖是葡萄糖时，术语葡糖化可以代替糖基化使用。

当糖苷配基在羟基处糖基化时，通常产生所谓的O-糖苷键，即所谓的O-糖苷(或者，如果糖是葡萄糖，则为O-葡萄糖苷)。

术语“分离的酶”在本文中本质上涉及的是一种多肽从其天然环境中分离。如SEQID NO：2所示的糖基转移酶雷公藤植物细胞中分离，或者从重组大肠杆菌细胞表达后的产物中分离。“分离的酶”是指这样的多肽制备物，所述多肽制备物以重量计，含有至少20％纯度，优选至少40％纯度，更有选至少60％纯度，甚至更优选至少80％纯度，最优选至少90％纯度，并且甚至最优选至少95％纯度的多肽，如通过SDS-PAGE测定的纯度。

在提及核酸、蛋白或肽时，本文所用的术语“同源性”是指，一个核酸与另一核酸在其核苷酸序列上实质相同或相似，或蛋白或肽与另一种蛋白或肽在其氨基酸序列上实质相同或相似，但与比较的核酸或蛋白或肽并不完全相同。两个核酸或蛋白或肽之间的同源性的存在可以通过以下方式来确定：比较第一序列中的位置与第二序列中的对应位置，从而确定在该位置是否存在相同或相似的残基。当存在某一最小百分比的相同或相似的核酸或氨基酸时，两条比较的序列彼此同源。统一性表示在等同位置比较两条序列时，存在相同的核苷酸或氨基酸。任选地，可能有必要考虑序列空位以便产生可能的最佳对比。相似的氨基酸或具有相同或同等化学和/或物理性质的非相同氨基酸。用具有相同或同等化学和/或物理性质的另一氨基酸替换氨基酸被称为“保守取代”。氨基酸的物理化学性质实质是疏水性或电荷，就核酸而言，当编码序列中密码子内的一个核苷酸被替换为另一核苷酸时，其称为相似核苷酸或保守取代，新密码子例如由于遗传密码的简并性，仍然编码相同或相似的氨基酸。本领域技术人员知晓哪些核苷酸或氨基酸取代是保守取代

在提到互补核酸的配对时，本文实用了术语“杂交”。杂交和杂交的强度(即，核酸之间的关联强度)受到以下因素的影响，如核酸之间的互补程度，涉及的条件的严格性，形成的杂交体的核酸的Tm(熔解温度，和核酸内的G:C比)等。

术语“杂交”涉那个的及多核苷酸在至少中等严格调价与SEQ ID NO：1的核苷酸的互补链杂交，涉及核苷酸序列在中等严格条件下与对应于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其互补链的标记核酸探针杂交。使用比如X射线胶片可以检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

本领域有关杂交严格条件是本领域技术人员通常会理解有关的严格条件，即，对于中等严格条件，技术人员会理解的条件是中等严格条件。技术人员知道有关的杂交严格条件，见例如(J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manul,2d edition,Cold Spring Harbor,New York)。

根据本领域对于长度为至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃下5X SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切和变性的鲑精DNA预杂交和杂交，以及25％甲酰胺对应非常低和低严格性，35％甲酰胺对应中和中-高严格性或50％甲酰胺对应高和非常高严格性，之后进行标准Southern印记程序12至24小时最佳。

对应长度为至少100个核苷酸的长探针，所述载体材料最终洗涤三次，每次用2×SSC0.2％SDS洗涤15分钟，优选至少在45℃，(非常低严格性)，更优选至少在50℃(低严格性)，更优选至少在55℃(中等严格性)，更优选至少在60℃(中-高严格性)，甚至更优选至少在65℃(高严格性)，并且最优选至少在70℃(非常高严格性)。

在本发明的第二个方面，本发明还涉及第一方面的酶的片段，其中所述片段包含所述酶至少60，优选至少65、70、75、80、85、90、100、110、120、150、180、200、240、270、300、350、400、450、480或至少500个连续氨基酸，并且其中所述片段催化糖基配体与目标化合物糖基化。

在第三个方面，本发明涉及编码本发明第一方面的酶或本发明第二方面的片段的核酸，优选地，所述核酸为如下中的至少一种：

(1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸分子；或

(2)SEQ ID NO：1所示的核苷酸分子经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列；或

(3)在严格条件下与SEQ ID NO：1所示核苷酸分子杂交的核苷酸序列，所述严格条件为：在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％的SDS的0.1×SSC溶液中杂交。

本发明的一个实施方案中，提供了编码雷公藤糖基转移酶TwUGTE1的基因-雷公藤糖基转移酶基因TwUGTE1的克隆方法，具体步骤包括：A、提取雷公藤RNA，反转录得到第一链cDNA；B、根据雷公藤转录组基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；C、回收和纯化PCR产物；D、连接克隆载体，转化感受态细胞，筛选阳性克隆并测序，得到雷公藤糖基转移酶基因TwUGTE1。

本发明在涉及核酸的片段或酶的片段的情况下，应当理解的是，在核酸的情况下，所述片段编码肽催化糖基配体与目标化合物糖基化，或者在肽的情况下，所述片段催化糖基配体与目标化合物糖基化。

核酸或其片段可被并入载体如质粒中，作为将核酸引入宿主细胞，如细菌、真菌或植物细胞的方法。为了实现核酸或片段在细胞中的表达，可以将核酸功能性第连接到合适的启动子和/或其它调控序列。用于将这些载体引入宿主细胞的广泛的多种合适的载体和方法是本领域技术人员已知的。

在第四个方面，涉及一种包含本发明所述核酸的重组表达载体，其中所述表达载体其包含启动子、本发明所述核酸和核酸片段，以及转录终止子，其中所述启动子与所述核酸可操作地连接，并且所述核酸与所述转录终止子可操作地连接。

在第五个方面，本发明涉及涉及一种重组宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第三方面所述核酸分子，或第四方面所述的表达载体，所述细胞优选为大肠杆菌。

术语“重组表达载体”涉及包含本发明的多核苷酸，启动子，及转录和翻译终止信号的重组表达载体。上述的各种核酸和控制序列可以结合在一起以产生重组表达载体，其可包括一个或多个方便的限制性位点以允许这些位点插入或替代编码多肽的核苷酸序列。

术语“重组宿主细胞”在本文中应根据本领域来理解，如本领域中公知的，重组多核苷酸(例如DNA)分子是通过基因重组实验室方法(例如分子克隆)将来自多个源的遗传基因物质汇集在一起，创建不能以其他方式在生物有机体中发现的序列而形成的多核苷酸(例如DNA)分子。如本领域技术人员可以理解的重组宿主细胞包含重组多核苷酸(例如DNA)分子，因此，重组宿主细胞将不会被理解为包括天然野生型细胞-诸如天然野生型大肠杆菌。

可优选的是，本发明中重组宿主细胞是包含编码本发明所述糖基转移酶的重组糖基转移酶基因的重组宿主细胞，细胞为大肠杆菌，如BL21(DE3)大肠杆菌。

如本发明所讨论，在实施例中使目标化合物与SEQ ID NO：2的糖基转移酶在体外接触。这可以看做是本领域技术人员执行这样的体外接触步骤的常规方案。

SEQ ID NO：2所示的糖基转移酶在大肠杆菌中重组表达，因此，制成了包含编码SEQ ID NO：2糖基转移酶基因的重组大肠杆菌细胞。

在第六个方面，本发明涉及一种制备糖苷的方法，所述方法包括，在适于酶促反应的条件下，使糖苷配基(或称“目标化合物”)和糖基供体与本发明第一方面所述的酶，或第二方面所述的片段进行反应，从而发生将糖基供体转移到糖苷配基官能团的糖基化反应步骤。

利用本发明第五方面得到的包含TwUGTE1的重组细胞进行糖基化反应制备糖苷的方法可以是，包括如下方式：(1)将本发明第三方面所得的基因(或称为核酸和核酸片段)构建到pMAL-c2X表达载体中；(2)利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导雷公藤糖基转移酶融合蛋白表达，纯化雷公藤糖基转移酶融合蛋白；(3)纯化TwUGTE1，并利用SDS-PAGE电泳检测纯化蛋白；(4)测定蛋白浓度，(5)利用所得糖基转移酶融合蛋白在适于酶促反应的条件下催化多种化合物进行糖基化反应。

其中所述糖苷配基为可与糖基供体生成氧糖苷键的化合物，优选为含羟基类的可形成氧糖苷键的化合物，更优选为酚类化合物。

用于酶促糖基化反应的合适条件是本领域技术人公知的，并且也可以从本发明实施例和引用的现有技术文献推测得。

术语“糖基化”涉及碳水化合物作为糖基供体被连接至另一个分子(糖苷配基)的羟基或其它官能团的反应。

术语“糖基供体”涉及一种碳水化合物，如糖，其与合适的受体化合物反应以形成新的糖苷键。糖可以例如是半乳糖，葡糖胺，N-乙酰氨基葡萄糖，木糖，葡萄糖醛酸，鼠李糖，阿拉伯糖，甘露糖或葡萄糖的D和L异构体。或者，所述糖可以是用作核苷酸二磷酸酯的碳水化合物衍生物，诸如肌醇，橄榄糖，夹竹桃糖等。此外，所述糖可以比如是单糖，二糖或三糖。在低聚和多糖的情况下，糖倍逐一链接，通过例如涉及实用一个或多个糖基转移酶。如果是葡萄糖，可以将糖基转移酶称为葡糖转移酶。

糖基供体为通常为核苷二磷酸活化形式的糖基，优选为优选为UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸、NDP-脱氧六碳糖或NDP-糖胺。

术语“碳水化合物”包含碳的水合物，即具有化学计量公式C_n(H₂O)_n的化合物。通用术语包括单糖、低聚糖和多糖，以及通过还原羰基(糖醇)、通过一个或多个末端基团氧化为羧酸或通过氢原子、氨基、硫醇基或类似基团替代一个或多个羟基基团而从单糖衍生的物质。

根据本领域-术语“糖苷(gycoside)”是指这样的化合物，其通过水解产生糖和非糖(糖苷配基)残基，例如黄酮类糖苷水解，可以产生糖部分，及黄酮类(非糖部分)化合物。

术语“酚类化合物”涉及次级植物代谢物，它们经有莽草酸和苯丙烷途径生物合成的，且它们是具有一个、两个或更多个羟基直接键合到它们的环系统的芳族化合物或它们的衍生物。例如酚类化合物的例子可以是黄酮类化合物、苯甲酸衍生物、芪类化合物、查耳酮类化合物、色酮类化合物和香豆素衍生物。

附图说明

图1为电泳图，其中图1A为提取雷公藤悬浮细胞RAN的琼脂糖凝胶电泳图；图1B糖基转移酶基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；图1C糖基转移酶融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE凝胶电泳图。

图2为不同糖苷配基与UDPG糖基化反应后的UV图、质谱图，其中：

图2-1-A为标准品4-甲基伞形酮和4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷的UV色谱图，图2-1-B为糖基化反应产物4-甲基伞形酮及4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷UV色谱图，峰1和峰2分别为4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷和4-甲基伞形酮，图2-1-C和图2-1-D分别为标准品和糖基化反应产物4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷质谱图。

图2-2-A为标准品乔松素及乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的UV色谱图，图2-2-B为糖基化反应产物乔松素及乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的UV色谱图，其中峰1和峰2分别为乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷和乔松素，图2-2-C为标准品乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷质谱图，图2-2-D为糖基化反应产物乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷质谱图。

图2-3-A为标准品甘草素及新甘草苷的UV色谱图，图2-3-B为糖基化反应产物甘草苏及新甘草苷UV色谱图，其中峰1和峰2分别为新甘草苷和甘草素，图2-3-C为标准品新甘草苷的质谱图，图2-3-D为糖基化反应产物新甘草苷质谱图。

图2-4-A为标准品丹叶大黄素及土大黄苷的UV色谱图，图2-4-B为糖基化反应产物丹叶大黄素及土大黄苷的UV色谱图，其中峰1和峰2分别为土大黄苷和丹叶大黄素，图2-4-C为标准品土大黄苷质谱图，图2-4-D为糖基化反应产物土大黄苷的质谱图。

图2-5-A为标准品雷酚内酯及雷酚内酯苷的UV色谱图，图2-5-B为糖基化反应产物雷酚内酯及雷酚内酯苷的UV色谱图，其中峰1和峰2分别为雷酚内酯苷和雷酚内酯，图2-5-C为标准品雷酚内酯苷的质谱图，图2-5-D为糖基化反应产物雷酚内酯苷的质谱图。

具体实施方式

以下通过优选实施例并结合附图具体说明本发明的各个方面和特征，本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明，而不是限制本发明的范围。在不背离权利要求书范围的条件下，本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。例如，将实施例中所实用的启动子和表达载体替换为本领域中常用的其它启动子和表达载体，是本领域的普通技术人员所能够理解并实现的。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)悬浮细胞在文献“雷公藤4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的全长克隆与表达分析.中国中药杂志,2015,40(21):4165-4170”中公开过，公众可从首都医科大学分子生药与中药资源实验室获得。

实施例1、雷公藤悬浮细胞总RNA提取及cDNA第一链的获得

取雷公藤悬浮细胞，迅速放于液氮中，-80℃低温保存备用，用于提取RNA。RAN提取过程中研钵、镊子、药匙、磁珠等器皿用酒精燃烧30min，并使用专用的去除RNA酶的新的离心管和移液枪枪头。提取方法按照总RNA提取试剂盒(上海普罗麦格生物产品有限公司)操作说明书进行。

利用Genova Nano三合一超微量分光光度计测定总RNA的浓度和纯度后，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，利用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技北京有限公司)进行反转录。

实施例2引物设计及PCR扩增

根据雷公藤转录组数据注释筛选得到基因全长序列片段，利用Primer5设计特异性引物TwUGTE1-R和TwUGTE1-F引物，将设计的引物送睿博生物技术有限公司合成，-20℃保存，引物序列如下：

TwUGTE1-R CCACATCACTCAACGTAGTACATAC(ID NO：3)

TwUGTE1-F CTACCTTATCCTAATTCACGCTTAC(ID NO：4)

参照KAPAHIFI高保真酶(北京普凯瑞生物科技有限公司)的扩增方法克隆目标序列的全长基因，反应体系如下：

利用上述反应体系进行二次扩增。PCR反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测其大小，电泳图见图1B。

实施例3回收和纯化PCR产物

PCR反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，160V电压，电泳30min。目的条带用胶回收试剂盒(Thermo公司)的方法切胶回收。

实施例4连接克隆载体，转化感受态细胞，筛选阳性克隆并测序

测定胶纯化回收后的质量和浓度，将质量浓度符合要求的产物连接到pEASY-Blunt Zero载体(北京全式金生物技术有限公司)上，连接体系如下：

将添加好的反应体系在30℃放置15min进行连接，连接产物放置在冰上，转化到TransT1大肠杆菌感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，转化过程如下：

(1)连接好的载体加入到TransT1感受态细胞中，冰上放置30min；

(2)42℃热激30s，取出放冰上2min；

(3)添加液体LB培养基500μL，37℃的摇床上180r·min^-1震荡培养1h，在含氨苄抗性的固体培养基上37℃培养过夜，挑选单菌落送睿博生物科技有限公司完成测序。

在拟南芥数据库(http://www.p450.kvl.dk/index.shtml)及NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)基因数据库中下载不同家族的糖基转移酶基因，用MEGA 7.0软件进行序列比对后用临近连接法构建系统进化树。分析结果表明TwUGTE1基因属于糖基转移酶基因1家族E亚家族。

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站中下载At2VCE，Mt2ACV，SrUGT88B1，RhQ4R1T9，P1UGT1利用DANMAN软件进行多重序列比对。结果表明TwUGTE1中含有关键氨基酸H30，D132以及在碳末端由44个氨基酸组成的PSPG(Plant secondary productglycosyltransferase)保守结构域。

实施例5将基因TwUGTE1构建到pMAL-c2X表达载体中

将测序结果正确的菌株和pMAL-c2X载体菌株分别接种到含相应抗性的液体LB培养基(100mg·L^-1氨苄霉素)中，37℃、220r/min下震荡培养12～16h，用质粒小提试剂盒(天根生化科技北京有限公司)提取质粒。

设计目的基因特异性的引物，送睿博兴科生物技术有限公司合成。

F:CGCGGATCCATGCAGGAGGACAAATTCACATATT(ID NO：5)

R:TGCACTGCAGCTTCCATTGCTCGACTAGCTTGGCC(ID NO：6)

以测序正确的质粒为模板，用高保真酶扩增得到插入片段扩增产物。

PCR反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，160V电压，电泳30min。目的条带用胶回收试剂盒(Thermo公司)的方法切胶回收，利用Genova Nano三合一超微量分光光度计测定回收TwUGTE1基因的浓度。

将载体pMAL-c2X和TwUGTE1基因分别用BamH I和Pst I HF限制性内切酶进行双酶切，酶切体系如下：

37℃水浴酶切2h，2％琼脂糖凝胶电泳，目的条带用胶回收试剂盒(Thermo公司)的方法切胶回收，检测胶回收的质量和浓度。

于冰水浴中配制重组反应体系，反应体系如下：

重组反应体系克隆载体使用量为0.018pmol；最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量约为0.036pmol。

体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，50℃反应15min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min，之后，将反应产物进行转化到TransT1大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄抗性的LB固体培养基上37℃培养过夜，挑选单菌落送睿博兴科生物科技有限公司完成测序。测序结果正确的菌株接种至50mL含有100mg/L氨苄霉素的LB培养基中培养过夜，用质粒小提试剂盒(天根生化科技北京有限公司)提取质粒，质粒存放于-20℃冰箱。

实施例6重组大肠杆菌制备、酶的发酵表达及纯化

pMAL-c2X-TwUGTE1转化到BL21(DE3)大肠杆菌(北京全式金生物技术有限公司)表达感受态细胞中，转化过程按说明书操作。

蛋白诱导表达：

(1)将重组质粒与空载体pMAL-c2X分别转化到大肠杆菌表达型感受态细胞BL21(DE3),选取阳性单克隆菌落37℃，250r·min^-1摇14h后,按1.5‰的比例各扩大培养200mL,37℃摇到OD600约为0.6-0.8后,加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM,低温16℃诱导表达18h。

(2)低温诱导的菌液4℃10000×g离心3min收集菌体,Resuspension buffer 5mL重悬。

(3)加入Chicken white lysozyme(50mg·mL^-1)，于重悬菌体中,至0.5mg·mL^-1,混均,冰上静置20min。

(4)加入10％Triton X-100至终浓度0.1％。加入1/10体积的5mol·L^-1NaCl溶液,超声破碎30min(超声5s,暂停5s),4℃、12 000×g离心30min。

(5)取1mL的Amylose Resin加入到柱子中，Amylose Resin事先用5倍柱体积Washbuffer清洗。

(6)将破碎的菌液上清加到含有Amylose Resin的15mL离心管中，小摇床高转速冰上晃动2h。

(7)加入15倍柱体积Wash buffer清洗后再用15倍柱体积Resuspension buffer清洗。

(8)加入1倍柱体积Elution buffer A洗脱一次。加入两倍柱体积Elution bufferB，4℃摇晃10min后洗脱，重复两次。

(9)将Elution buffer B洗脱液分别用10KD和30KD的超滤管浓缩空载对照蛋白和糖基转移酶融合蛋白，浓缩蛋白于-80℃保存。

实施例7酶的纯度检测

(1)利用SDS-PAGE凝胶快速配置试剂盒(碧云天)配置凝胶，按说明书操作。

两配对好的玻璃板用ddH2O冲洗干净，晾干。按装置说明组装好制胶器。用注射器吸取配好的8％分离胶，注入玻璃板间，以水压平胶面，水平放置30min以上。待分离胶凝固好，倒出水并用吸水纸吸干，再用注射器把浓缩胶注入，插入梳子，水平放置30min以上；

(2)样品处理

将少量蛋白质样品与6×Protein Loading Buffer在一个1.5mL离心管中混合，放入100℃水浴中加热5min，常温12000g离心5min，取上清作SDS-PAGE分析。

(3)上样

取10μL样品加入样品池中,并加入10μL分子量蛋白标准品作对照。

(4)电泳

在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，点样孔端接负极，电泳时首先用积层胶电压80V(约需20min)，当样品进入分离胶时改电压120V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止(约需45min)。

(5)染色

考马斯亮蓝R250染色液：0.25％考马斯亮蓝R250(W/V)，45％甲醇(V/V)，10％冰乙酸；用滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。采用快染的方法，将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，微波30s。

(6)脱色

脱色液(100mL)：10mL冰乙酸；45mL乙醇；45mL蒸馏水。将胶从染色液中取出，放入考马斯亮兰脱色液中，多次换液脱色至蛋白带清晰。

(7)凝胶摄像

在图像处理系统下将脱好色的凝胶摄像，见图1C。

实施例8利用TwUGPT1催化多种化合物进行糖基化反应

应用改良改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒(生工生物工程股份有限公司)和全波长微孔板检测仪(SpectraMax Plus 384)光吸收型酶标仪测定蛋白浓度。

糖基转移酶底物诱导反应体系(100μL)如下：

30℃水浴反应48h后，加等体积的甲醇终止反应，12000r·min^-1离心收集上清液，保存于-20℃，用于HPLC-MS分析目标糖苷，以空载体诱导酶液对照。底物(糖苷配基)分别为4-甲基伞形酮，乔松素，甘草素，丹叶大黄素、雷酚内酯；糖基化产物分别为4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷，乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷，新甘草苷，土大黄苷，雷酚内酯苷(图2-1至图2-5)。

HPLC分析4-甲基伞形酮及4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷，仪器：安捷伦液相色谱仪1260；流动相A：水；流动相B：乙腈；1mL·min^-1；进样量20μL；色谱柱：安捷伦ZORBAXSB-C18(250×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；检测波长：315nm；0-20min：95％(A)-85％(A)；25-30min：77％(A)-70％(A)；40-50min:53％(A)-0％(A)。

HPLC分析乔松素及乔松素7-O-β-D-葡萄糖苷，仪器：安捷伦液相色谱仪1260；流动相A：水；流动相B：乙腈；1mL·min^-1；进样量20μL；色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-C18(250×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；检测波长：285nm；0-65min：90％(A)-50％(A)。

HPLC分析甘草素及新甘草苷，仪器：安捷伦液相色谱仪1260；流动相A：水；流动相B：乙腈；1mL·min^-1；进样量20μL；色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-C18(250×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；检测波长：276nm；0-10min：95％(A)-95％(A)；12-22min：85％(A)-85％(A)；52-55min:63％(A)-0％(A)。

HPLC分析丹叶大黄素及土大黄苷，仪器：安捷伦液相色谱仪1260；流动相A：水；流动相B：乙腈；1mL·min^-1；进样量20μL；色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-C18(250×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；检测波长：320nm；0-10min：95％(A)-95％(A)；20-50min：72％(A)-67％(A)；55min：52％(A)。

HPLC分析雷酚内酯及雷酚内酯苷，仪器：安捷伦液相色谱仪1260(1200)；流动相A：水；流动相B：乙腈；0.8mL·min^-1；进样量20μL；色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-C18(250×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；检测波长：210nm；0-10min：95％(A)-70％(A)；20-22min：70％(A)-60％(A)；32-35min:50％(A)-40％(A)；45min:35％(A)。

质谱条件：设备型号:Bruker FT-ICR-MS solarix Maldi/ESI 9.4T；液相色谱:Agilent 1260；数据收集软件：ftmsControl 2.0and Compass Hystar 4.0；数据处理软件：dataAnalysis 4.1；离子源类型：ESI；气体流速：4mL·min^-1；气体温度：180℃；喷雾器压力：1.0bar；离子类型：Negative；毛细管电压：4KV；帽电压：-500V。

序列表

<110> 首都医科大学

<120> 一种糖基转移酶UGTE1、其编码基因和应用

<141> 2018-05-29

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> 雷公藤(Tripterygium wilfordii)

<400> 1

atgcaggagg acaaattcac atattcacac acacacagag aagtttcaat ggctgccata 60

gttctgtatc caactacagg tatgggccac ctcatatcca tggtagagtt gggcaagctc 120

atactcactc accacccatc tttcaccgtc aacatcctcc tccccacagc tccctacgcc 180

actggctcta ctgctcaata catttctgcc gtctccacca caaacccatc tatcatcttc 240

caccaccttc cccctgtttc tctccctcta gaccctgcct cttattcctg tgtcgaagcc 300

ctcacgttcg acctcattcg cctcaacaac cccaacgtcc acactgcaat ccaatcaatt 360

tctcaaacat ccaccgtcca tgccttaatc ctggactttt tttgtaatgc ggctcttgat 420

gttgctacag aacttgatgt tccagcttac tttttcctta cttctggtgc tagttttcta 480

gctctgtttt gtcactttcc aacaattgac agaagcacca ataagaattt caaggatctc 540

gagactactg ttaacctccc ttacttgcca ccgataccct tgtctcatat gccagagcca 600

atgcttgaaa aagacacaac agagtatgct ggcttcattg attgctcagt tggtttgagt 660

aaatcaaccg gaatcatcgt taacacgttt agcactctcg aaccaaaagc tgtgaaggcc 720

ttggcagatg gagtttgcaa tcctgatggt ccaacaccgc cagttttctg cattggacca 780

ctaattgtca caaatcgtca aatcggtaat gagggtgatg ataaggtgct tggatctgaa 840

tgcttaactt ggctcgacaa gcaaccaagt caaagcatag tatttttgtg ttttggtagc 900

ttgggcttgc tttctaagga acagttgagg gaaatagcta ttggtttgga gaagagtggc 960

caaaggttct tgtgggtggt acggaaccca ccttcggagg acaaaaagca gaggttcctc 1020

actcaaccag acccagatct gaattctttg ttctctgatg gtttcttgga ccgtacaaag 1080

gagagaggac tggtagttaa gcggtgggca ccacaggtgg cagtgttaaa tcatgaagca 1140

gttggagggt tcgtgactca ctgtggctgg aactcagttt tggaatcggt ttgtgcaggt 1200

ataccaatgg ttgcatggcc gttatacgca gaacaaaagt ttaacaaggc attgctggtt 1260

gaggagctga agctggcttt gccaatgaac gagtccgaaa ctgggttcgt tagtgcaacc 1320

gaggttgaga agcgagttag agaattgatg gagtcggagg aaggtaactc attgagggaa 1380

cgagtaacgg caaagagaaa tgaagcaatg aaggctatgg aagagggtgg atcatccagg 1440

gttgcattgg ccaagctagt cgagcaatgg aagtaa 1476

<210> 2

<211> 491

<212> PRT

<213> 雷公藤(Tripterygium wilfordii)

<400> 2

Met Gln Glu Asp Lys Phe Thr Tyr Ser His Thr His Arg Glu Val Ser

1 5 10 15

Met Ala Ala Ile Val Leu Tyr Pro Thr Thr Gly Met Gly His Leu Ile

20 25 30

Ser Met Val Glu Leu Gly Lys Leu Ile Leu Thr His His Pro Ser Phe

35 40 45

Thr Val Asn Ile Leu Leu Pro Thr Ala Pro Tyr Ala Thr Gly Ser Thr

50 55 60

Ala Gln Tyr Ile Ser Ala Val Ser Thr Thr Asn Pro Ser Ile Ile Phe

65 70 75 80

His His Leu Pro Pro Val Ser Leu Pro Leu Asp Pro Ala Ser Tyr Ser

85 90 95

Cys Val Glu Ala Leu Thr Phe Asp Leu Ile Arg Leu Asn Asn Pro Asn

100 105 110

Val His Thr Ala Ile Gln Ser Ile Ser Gln Thr Ser Thr Val His Ala

115 120 125

Leu Ile Leu Asp Phe Phe Cys Asn Ala Ala Leu Asp Val Ala Thr Glu

130 135 140

Leu Asp Val Pro Ala Tyr Phe Phe Leu Thr Ser Gly Ala Ser Phe Leu

145 150 155 160

Ala Leu Phe Cys His Phe Pro Thr Ile Asp Arg Ser Thr Asn Lys Asn

165 170 175

Phe Lys Asp Leu Glu Thr Thr Val Asn Leu Pro Tyr Leu Pro Pro Ile

180 185 190

Pro Leu Ser His Met Pro Glu Pro Met Leu Glu Lys Asp Thr Thr Glu

195 200 205

Tyr Ala Gly Phe Ile Asp Cys Ser Val Gly Leu Ser Lys Ser Thr Gly

210 215 220

Ile Ile Val Asn Thr Phe Ser Thr Leu Glu Pro Lys Ala Val Lys Ala

225 230 235 240

Leu Ala Asp Gly Val Cys Asn Pro Asp Gly Pro Thr Pro Pro Val Phe

245 250 255

Cys Ile Gly Pro Leu Ile Val Thr Asn Arg Gln Ile Gly Asn Glu Gly

260 265 270

Asp Asp Lys Val Leu Gly Ser Glu Cys Leu Thr Trp Leu Asp Lys Gln

275 280 285

Pro Ser Gln Ser Ile Val Phe Leu Cys Phe Gly Ser Leu Gly Leu Leu

290 295 300

Ser Lys Glu Gln Leu Arg Glu Ile Ala Ile Gly Leu Glu Lys Ser Gly

305 310 315 320

Gln Arg Phe Leu Trp Val Val Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp Lys Lys

325 330 335

Gln Arg Phe Leu Thr Gln Pro Asp Pro Asp Leu Asn Ser Leu Phe Ser

340 345 350

Asp Gly Phe Leu Asp Arg Thr Lys Glu Arg Gly Leu Val Val Lys Arg

355 360 365

Trp Ala Pro Gln Val Ala Val Leu Asn His Glu Ala Val Gly Gly Phe

370 375 380

Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Val Leu Glu Ser Val Cys Ala Gly

385 390 395 400

Ile Pro Met Val Ala Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gln Lys Phe Asn Lys

405 410 415

Ala Leu Leu Val Glu Glu Leu Lys Leu Ala Leu Pro Met Asn Glu Ser

420 425 430

Glu Thr Gly Phe Val Ser Ala Thr Glu Val Glu Lys Arg Val Arg Glu

435 440 445

Leu Met Glu Ser Glu Glu Gly Asn Ser Leu Arg Glu Arg Val Thr Ala

450 455 460

Lys Arg Asn Glu Ala Met Lys Ala Met Glu Glu Gly Gly Ser Ser Arg

465 470 475 480

Val Ala Leu Ala Lys Leu Val Glu Gln Trp Lys

485 490

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccacatcact caacgtagta catac 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ctaccttatc ctaattcacg cttac 25

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cgcggatcca tgcaggagga caaattcaca tatt 34

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tgcactgcag cttccattgc tcgactagct tggcc 35

Claims

1.一种分离的糖基转移酶，所述酶为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述糖基转移酶的核酸。

3.根据权利要求2所述核酸，所述核酸为SEQ ID NO：1所示的核苷酸分子。

4.表达载体，其包含启动子、权利要求2或3所述核酸、和转录终止子，其中所述启动子与所述核酸可操作地连接，并且所述核酸与所述转录终止子可操作地连接。

5.重组宿主细胞，包含权利要求2或3所述核酸，或权利要求4所述表达载体。

6.权利要求5所述重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞为大肠杆菌。

7.权利要求1所述酶、权利要求2或3所述核酸、权利要求4所述表达载体、或权利要求5或6所述重组宿主细胞在糖基化反应中的运用。

8.一种生产糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：在适于酶促反应的条件下，使糖苷配基和糖基供体与权利要求1所述酶或权利要求5或6所述重组宿主细胞进行反应，从而将糖基供体转移到糖苷配基的官能团上。

9.权利要求8所述方法，其中所述糖苷配基为可与糖基供体生成氧糖苷键的化合物。

10.权利要求9所述方法，其中所述糖苷配基为含羟基类的可与糖基供体形成氧糖苷键的化合物。

11.权利要求10所述方法，其中所述含羟基类的可与糖基供体形成氧糖苷键的化合物为酚羟基类化合物。

12.权利要求8所述的方法，其中所述糖基供体为核苷二磷酸活化形式的糖基。

13.权利要求12所述的方法，其中所述核苷二磷酸活化形式的糖基为UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸、NDP-脱氧六碳糖或NDP-糖胺。