CN111286495B - 一种芦荟c-糖基转移酶序列及其在催化c-糖基化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的、来源于芦荟的C‑糖基转移酶以及编码该蛋白的核酸分子，包含该核酸分子的表达载体与包含该载体的宿主细胞，以及由该核酸分子编码的C‑糖基转移酶的生产方法，还涉及该酶在催化形成结构多样、具生物活性的C‑糖苷类化合物中的应用。

Description

一种芦荟C-糖基转移酶序列及其在催化C-糖基化中的应用

技术领域：

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新的、来源于芦荟的C-糖基转移酶、其核酸分子，包含该核酸分子的表达载体与包含该载体的宿主细胞，以及该C-糖基转移酶的生产方法，还涉及该酶在催化形成结构多样、具生物活性的C-糖苷类化合物中的应用。

技术背景：

糖基化是自然界次级代谢物的一种重要结构后修饰反应，根据糖苷键类型的不同，可分为O-、N-、S-和C-糖基化四种类型。C-糖基化是自然界中极少见的一类，目前发现的微生物源C-糖苷类化合物的糖基受体多是聚酮和短肽类化合物，供体多是六碳糖或脱氧六碳糖，如具有抗肿瘤活性的乌达霉素(Urdamycin A)和抗菌活性的美达霉素(Medermycin)等抗生素类(Künzel E.；Faust B.；Oelkers C.；Weissbach U.；Bearden D W.；WeitnauerG.；Westrich L.；Bechthold A.；Rohr J.Inactivation of the UrdGT2gene,whichencodes a glycosyltransferase responsible for the C-glycosyltransfer ofactivated d-olivose,leads to formation of the novel urdamycins I,J,andK.Journal of the American Chemical Society,1999,121,11058-11062.Ichinose K.；Ozawa M.；Itou K.；Kunieda K.；Ebizuka Y.Cloning,sequencing and heterologousexpression of the medermycin biosynthetic gene cluster of Streptomyces sp.AM-7161:towards comparative analysis of the benzoisochromanequinone geneclusters.Microbiology,2003,149,1633-1645.)；药用植物中也发现一些含C-糖基的天然产物，多数是黄酮、色酮、蒽醌和

酮等芳香酚类化合物，如治疗闭塞性脑血管疾病与冠心病的羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A)、治疗心血管疾病的葛根素(Puerarin)及具有抗炎、抑制酪氨酸酶活性的芦荟苦素(Aloesin)等。(Wei X.；Liu H.；Sun X.；Fu F.；Zhang X.；Wang J.；An J.；Ding H.Hydroxysafflor yellow A protects rat brainsagainst ischemia-reperfusion injury by antioxidant action.NeuroscienceLetters,2005,386,58-62.Kayano S.；Matsumura Y.；Kitagawa Y.；Kobayashi M.；Nagayama A.；Kawabata N.；Kikuzaki H.；Kitada Y.Isoflavone C-glycosides isolatedfrom the root of kudzu(Pueraria lobata)and their estrogenic activities.FoodChemistry,2012,134,282-287.Yagi A.；Takeo S.Anti-inflammatory constituents,aloesin and aloemannan in Aloe species and effects of tanshinon VI in Salviamiltiorrhiza on heart.Yakugaku zasshi:Journal of the Pharmaceutical Societyof Japan,2003,123,517-532.Jones K.；Hughes J.；Hong M.；Jia Q.；I.；OrndorffS.Modulation of melanogenesis by aloesin:a competitive inhibitor oftyrosinase.Pigment Cell&Melanoma Research,2002,15,335-340.)，它们分子中都具有C-糖基，是其发挥药理作用必不可少的活性基团。C-糖基化不仅能增加化合物的生物利用度和药理活性，且糖苷键不易断裂，结构稳定，使其具有稳定和持久的药效，是天然药物中一类非常重要的化合物分子。

近年来研究表明：许多C-葡萄糖苷对抗2型糖尿病有很好的药理作用，且这类化合物的毒副作用小。如国产沉香(Aquilaria sinensis)中的黄酮C-糖苷类化合物能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性(Feng J.；Yang X W.；Wang R F.Bio-assay guided isolation andidentification ofα-glucosidase inhibitors from the leaves of Aquilariasinensis.Phytochemistry,2011,72,242-247.)。但天然C-糖苷类化合物的种类少，结构多样性不足。因此，有机化学家及药物化学家试图采用化学法解决这些问题，如针对2型糖尿病SGLT2(Sodium-glucose co-transporter，钠-葡萄糖共转运体)靶点，设计合成了一系列非天然C-糖苷类化合物。这些C-糖苷类化合物表现出良好的SGLT2抑制活性，目前已上市的SGLT2抑制剂类糖尿病药物共有6个(达格列净、卡格列净、依格列净、鲁格列净、托格列净以及恩格列净)，均为C-糖苷。在化学合成中C-葡糖基的引入是其合成路线中的关键反应，涉及到立体选择性以及保护与脱保护反应，也是制约该类化合物高效制备合成的一个瓶颈反应步骤(Wang X.；Zhang L.；Byrne D.；Nummy L.；Weber D.；Krishnamurthy D.；Yee N.；Senanayake C H.Efficient synthesis of Empagliflozin,an inhibitor of SGLT-2,utilizing an AlCl₃-promoted silane reduction of aβ-glycopyranoside.OrganicLetters,2014,16,4090-4093.)。

如上所述，药理活性良好且结构稳定的C-糖苷类化合物引起了越来越多的化学家、生物学家以及药物学家的研究兴趣，包括天然资源的寻找、化学合成、生物合成以及药理活性等方面的研究。但是这类化合物的来源十分有限：首先，天然资源有限，微生物C-糖苷类化合物主要分布于链霉菌属(Streptomyces)中，大多为聚酮及肽类化合物；而植物中主要分布于豆科(Leguminosae)、菊科(Asteraceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、锦葵科(Malvaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、铁角蕨科(Aspleniaceae)等(吕修梅,王军宪.天然碳苷类化合物的化学和分布.中草药,2004,35,590-593.邓会群,王惠利,杨红,洪华珠,李爱英.天然产物的C-糖基化研究进展.生物技术通报,2009,5,27-30.)，多为黄酮、蒽醌、二苯甲酮和

酮类化合物，结构多样性不足；C-糖苷类化合物的化学合成较为困难，尤其在糖基引入时涉及到立体选择性、位置选择性、引入糖基化的数目、保护和去保护以及苛刻的反应条件等等(Xu G.；Lv B.；Roberge J Y.；Xu B.；Du J.；DongJ.；Chen Y.；Peng K.；Zhang L.；Tang X.；Feng Y.；Xu M.；Fu W.；Zhang W.；Zhu L.；DengZ.；Sheng Z.；Welihinda A.；Sun X.Design,synthesis,and biological evaluation ofdeuterated C-aryl glycoside as a potent and long-acting renal sodium-dependent glucose cotransporter 2inhibitor for the treatment of type2diabetes.Journal of Medicinal Chemistry,2014,57,1236-1251.Wang X.；Zhang L.；Byrne D.；Nummy L.；Weber D.；Krishnamurthy D.；Yee N.；Senanayake C H.Efficientsynthesis of Empagliflozin,an inhibitor of SGLT-2,utilizing an AlCl₃-promotedsilane reduction of aβ-glycopyranoside.Organic Letters,2014,16,4090-4093)，制约了它们的制备。

因此，寻找高效合成C-糖苷类化合物的新方法不仅具有重要的理论意义还具有潜在的应用价值，其中酶法生物合成是可供选择的方法之一。从自然界中能够合成C-糖苷类化合物的生物体中克隆关键的C-糖基转移酶基因，进行外源表达以及构建C-糖基转移酶工程菌及其突变体，对结构多样的化合物进行定向C-糖基化，可为C-糖苷类化合物的合成提供全新的方法。

有关C-糖基转移酶的研究是近年天然产物及药物化学研究的热点领域之一，尤其是微生物次级代谢产物生物合成相关的C-糖基转移酶，目前已功能鉴定的微生物C-糖基转移酶基因有四个(Künzel E.；Faust B.；Oelkers C.；Weissbach U.；Bearden D W.；Weitnauer G.；Westrich L.；Bechthold A.；Rohr J.Inactivation of the UrdGT2gene,which encodes a glycosyltransferase responsible for the C-glycosyltransfer ofactivated d-olivose,leads to formation of the novel urdamycins I,J,andK.Journal of the American Chemical Society,1999,121,11058-11062.Liu T.；KharelM K.；Fischer C.；McCormick A.；Rohr J.Inactivation of gilGT,encoding a C-glycosyltransferase,and gilOIII,encoding a P450enzyme,allows the details ofthe late biosynthetic pathway to Gilvocarcin V to be delineated.ChemBioChem,2006,7,1070-1077.Fischbach M A.；Lin H.；Liu D R.；Walsh C T.In vitrocharacterization of IroB,a pathogen-associated C-glycosyltransferase.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,2005,102,571-576.Li L.；Wang P.；Tang Y.C-glycosylation of anhydrotetracycline scaffold with SsfS6from theSF2575biosynthetic pathway.The Journal of Antibiotics,2014,67,65-70.)。有关植物C-糖基转移酶的相关研究进展缓慢，只报道了六种植物中C-糖基转移酶，大部分研究仅完成酶的功能鉴定，这些酶大都具有较严格的底物选择性，限制了其作为催化剂用于化合物的结构修饰。

综上所述，有关C-糖基转移酶的研究仍存在如下限制性：

1、C-糖苷类化合物天然资源少、结构多样性不足，化学合成困难；

2、目前大部分研究仅完成对该类酶的功能鉴定，且大多C-糖基转移酶应用范围窄，具有严格的底物(包括受体和供体)选择性，少有将重组C-糖基转移酶开发为工具酶而应用于不同结构类型化合物的酶法C-糖基化。

因此，开发具有底物宽泛性的C-糖基转移酶不仅能避免了化学法糖基化存在的立体及区域选择性差、官能团的保护和脱保护及污染环境等缺点，同时又可以作为C-糖基化的工具酶，用于制备结构多样、具生物活性的C-糖苷类化合物。

发明内容：

为了克服现有技术中的不足，本发明解决的技术问题是提供一种新的C-糖基转移酶、其核酸分子，包含该核酸分子的表达载体与包含该载体的宿主细胞，该C-糖基转移酶的生产方法，以及该C-糖基转移酶在制备结构多样且具生物活性的C-糖苷类化合物的应用。

为解决本发明的技术问题，提供如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面是提供一种新的C-糖基转移酶、其氨基酸序列为：

(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，氨基酸序列命名为AbGT73；

(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经保守变异得到的氨基酸序列，即经替换、缺失或添加氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

以上所述的C-糖基转移酶中，在该C-糖基转移酶上可进行常规修饰；或者在C-糖基转移酶上还连接有用于检测或纯化的标签。

以上所述的C-糖基转移酶中，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰；所述的标签包括His₆、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、Profinity eXact。

本发明技术方案的第二方面是提供编码本发明第一方面所述C-糖基转移酶的核酸分子，优选SEQ ID NO.2所示的核酸序列，核酸序列命名为AbGT73。

本发明技术方案的第三方面是提供一种含有本发明第二方面所述核酸分子的重组表达载体。将本发明第二方面所述的核酸分子通过酶切连接于表达载体，优选pET-28a(+)表达载体。

本发明技术方案的第四方面是提供一种含有本发明第三方面所述重组表达载体的宿主细胞。所述的宿主细胞选自细菌、酵母、植物细胞和动物细胞，优选细菌宿主细胞。

本发明技术方案的第五方面是提供本发明第一方面所述C-糖基转移酶的生产方法，其特征在于，在合适的培养基中培养含有该C-糖基转移酶基因序列的的宿主细胞，提取、纯化所述的重组酶。

本发明技术方案的第六方面提供本发明第一方面所述C-糖基转移酶在制备结构多样、具生物活性的C-糖苷类化合物方面的应用。其中的化合物底物即C-糖基化受体，包括以间苯二酚与间苯三酚作为结构母核的一系列化合物，如苯乙酮类、苯甲醛类、苯戊酮类、二苯甲酮类、二氢查尔酮类、苯甲酸酯类、间苯三酚醚类、黄酮类、苄基苯类、联苄类、噻吩类以及生物碱类化合物等。其中的糖基供体，包括不同活化形式的NDP-葡萄糖、NDP-半乳糖及这两种糖的其他供体形式。

试验了包括单羟基苯乙酮(2-OH-苯乙酮、3-OH-苯乙酮、4-OH-苯乙酮)、二羟基苯乙酮(3,5-二羟基苯乙酮、2,6-二羟基苯乙酮、2,4-二羟基苯乙酮)、羟甲基苯乙酮(2,6-二羟基-4-甲基苯乙酮、2,4-二羟基-6-甲基苯乙酮)、羟甲基苯甲醛(2,4-二羟基-6-甲基苯甲醛)、三羟基苯乙酮(2,4,6-三羟基苯乙酮及其羟基甲基化的化合物、1,3-二乙酰基间苯三酚)、三羟基苯甲醛、三羟基苯戊酮、二苯甲酮(桑橙素)、二氢查尔酮(根皮素)、黄酮(芹菜素、大豆苷元、2-羟基柚皮素)、香豆素(7-羟基-4-甲基香豆素、7-巯基-4-甲基香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素)、1-乙基-2,4-二羟基苯、1-苄基-2,4-二羟基苯、苄基苯类化合物(1-苄基-2,4,6-三羟基苯及其苄基苯环对位/间位氢被甲基、丁基、氟、氯、甲氧基、苯环等取代)、联苄类化合物(1-苯乙基-2,4,6-三羟基苯及其乙基苯环上对位氢被羟基、甲氧基、氟、氯等取代)以及5个含O-/S-/N-杂环类取代基的临苯二酚或间苯三酚类化合物等共16种结构类型总计45个芳香类化合物作为糖基受体进行重组蛋白酶促催化反应。通过HPLC-MS/MS检测发现：表现出了罕见的C-糖基受体杂泛性：所试验的13种结构类型芳香类化合物共计45个芳香类化合物中，有11种共计34个化合物能被AbGT73催化发生C-糖基化反应，且能够产生C-半乳糖苷。此外，尤为重要的是，AbGT73对三羟基苯甲醛、三羟基苯乙酮、三羟基苯戊酮、桑橙素、根皮素等具有100％的转化率，并能够引入两个C-糖基形成双C-糖苷。不仅如此，AbGT73还能够催化7-羟基-4-甲基香豆素、7-巯基-4-甲基香豆素及7-氨基-4-甲基香豆素分别形成O-糖苷键、S-糖苷键以及N-糖苷键，具有C-,O-,S-和N-糖基化活性，这种催化活性的糖基转移酶是以前没有报道的。

分别选择根皮素、1-乙基-2,4-二羟基苯、1-苄基-2,4-二羟基苯、苄基苯类化合物(1-苄基-2,4,6-三羟基苯及其苄基苯环对位/间位氢被甲基、丁基、氟、氯、甲氧基、苯环等取代)、联苄类化合物(1-苯乙基-2,4,6-三羟基苯及其乙基苯环上对位氢被羟基、甲氧基、氟、氯等取代)以及5个含O-/S-/N-杂环类取代基的临苯二酚或间苯三酚类化合物为C-糖基化受体，以UDP-葡萄糖C-糖基化供体，通过重组蛋白放大酶促反应对相应C-糖基化产物进行了酶法合成、分离纯化及结构鉴定。共分离得到20个产物，18个为新化合物，丰富了C-糖苷类化合物的结构类型。结构解析发现，AbGT73能够可以催化芳香化合物骨架上特异位点的C-糖基化，且为β-糖苷键连接；从反应类型来讲，AbGT73既能催化C-糖基化反应，也能够催化O-,S-和N-糖基化反应，为首次发现的同时具有C-、O-、S-和N-糖基化能力的糖基转移酶。

补充说明

除另有说明，本文所使用的科技术语与本发明所属领域技术人员通常理解的含义相同。实施本发明也可采用类似或等效于本文所述内容的任何方法和材料，本文描述了具体的实施方式和优选的方法和材料，并不对本发明进行任何限制。

有益技术效果：

本发明所述的C-糖基转移酶具有很强的底物宽泛性，可以对多种不同结构类型的化合物进行C-糖基化修饰。与目前现有技术相比，既避免了化学法糖基化存在的立体及区域选择性差、官能团的保护和脱保护及污染环境等缺点，同时又具有较宽的底物谱，可以开发成为C-糖基化的工具酶，用于制备结构多样、具生物活性的C-糖苷类化合物。

附图说明

图1.重组AbGT73蛋白催化2,4,6-三羟基苯乙酮与UDP-葡萄糖进行C-糖基化反应的HPLC-MS²检测谱图.

图2.重组AbGT73蛋白催化根皮素与UDP-葡萄糖进行C-糖基化反应的HPLC-MS²检测谱图.

图3.重组AbGT73蛋白催化2,4,6-三羟基苯乙酮与UDP-半乳糖进行C-糖基化反应的HPLC-MS²检测谱图.

图4.重组AbGT73蛋白催化2,4,6-三羟基苯乙酮与UDP-半乳糖进行C-糖基化反应的HPLC-MS²检测谱图.

图5.AbGT73基因编码蛋白系统进化树分析.OsCGT(Oryza sativa,CAQ77160)；ZmCGT(Zea mays AFW76993)；FeCGTa(Fagopyrum esculentum,BAP90360)；GtUF6CGT1(Gentiana triflora,BAQ19550)；UGT78G1(Medicago truncatula,XP_003610163.1)；UrdGT2(Streptomycesfradiae,AAF00209)；IroB(E.coli,CAE55724)；SsfS6(Streptomycessp.SF2575,ADE34512)；gilGT(S.griseoflavus,AAP69578.2)；GmIF7GT(Glycine max,BAF64416.1)；UGT85H2(M.truncatula,2PQ6_A)；UGT71G1(M.truncatula,AAW56092.1)；VvGT1(Vitis vinifera,AAB81682.1)；UGT72B1(V.vinifera,OAP00532.1)；CaUGT2(Catharanthus roseus,BAD29722.1)；PtUGT78L1(Populus trichocarpa,AGE45996.1)；DcUGT2(Dactylopius coccus,ATL15304.1)；MiCGT(Mangifera indica,KT200208).

图6.重组AbGT73蛋白的C-糖基化功能的研究.A图与B图为AbGT73可识别的受体底物，并催化形成C-、O-、S-和N-糖苷。

具体实施方式

提供下面这些实施例，以进一步阐明本发明的各个方面。这些实施例是非限制性的，而且不应当被理解为限定了本发明的任何方面。本发明的保护范围只受权利要求书的限制。在不背离权利要求书范围的条件下，本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。例如，将实施例中所使用的启动子和表达载体替换为本领域中常用的其他启动子和表达载体，是本领域的普通技术人员所能够理解并实现的。

另外，需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的常规方法。

实施例1：AbGT73基因的克隆

1、总RNA的提取和cDNA第一链的合成

选择适量库拉索芦荟叶作为材料，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，充分研磨至粉末状；将研磨成粉末状的样品转移至离心管中，加入500μL Buffer RCL/100mg组织(E.Z.N.A^TM Plant RNA Kit)，用涡旋仪进行匀浆处理并用枪反复吹吸至混匀；55℃孵育3min；15,000×g离心5min，取上清转移至过滤柱，14,000×g离心2min。将过滤出的液体加入等体积Buffer RCB，上下颠倒5-10次。将液体转移至RNA吸附柱，10,000×g离心1min；弃过滤液，用400μL RWC wash Buffer加入到吸附柱，10,000×g离心1min；将吸附柱室温晾干后将50μL ddH₂O洗脱总RNA。1.0％非变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并采用紫外分光光度计测定OD₂₆₀/OD₂₈₀比值以及RNA浓度。使用SMARTer^TM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech,USA)合成cDNA。

2、RT-PCR扩增目的基因片段

根据库拉索芦荟转录组信息设计候选基因AbGT73的特异性引物(SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4)，使用KOD DNA Polymerase进行PCR扩增，以获得AbGT73基因全长。胶回收PCR产物(目的基因片段)，连接至pEASY-blunt载体，转化Trans1-T1感受态细胞，进行蓝白斑筛选和菌落PCR筛选，阳性克隆摇菌送测序，确认候选基因的序列信息。

2.1、PCR反应体系：

2.2、PCR循环：

1)94℃ 2min；2)98℃ 10sec；3)58℃ 30sec；4)68℃ 1min；

5)go to 2)35cycles；6)68℃ 10min；7)10℃保持

3、克隆所得基因与已公开发表的糖基转移酶序列相似性比对分析

通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对克隆得到的基因与已公开发表的糖基转移酶基因进行序列相似性比对分析。

4、AbGT73基因编码蛋白的生物信息学分析

通过expasy(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)对前期克隆所得目的基因编码蛋白的理化性质进行预测；通过TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对目的基因编码蛋白跨膜区进行预测；通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)和Vector NTI对氨基酸序列进行比对分析；通过MEGA version 5进行系统进化分析。见图5

实施例2：AbGT73基因的表达、重组蛋白分离纯化及催化功能研究

1、Rosetta-pET28a-AbGT73重组表达菌株的构建、重组蛋白诱导表达及检测

pET-28a(+)载体含有“T7”强启动子和“T7”起始翻译信号，载体在N-terminal及C-terminal均含His标签蛋白序列，此外载体中含有多个常用的多克隆酶切位点，可根据需要在目标蛋白N-terminal或C-terminal加入His标签进行融合表达。

根据pET28a(+)载体多克隆位点两侧的基因序列，设计含17bp载体同源臂的引物(SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)，通过PCR技术分别在目的基因编码序列(CDS)的N-端和C-端引入同源臂，胶回收PCR产物。利用同源重组酶实现目的基因与线性化的pET28a(+)载体的连接，构建重组质粒pET28a-AbGT73，转化大肠杆菌(Trans1T1)克隆宿主，PCR筛选阳性转化子，并送测序鉴定阅读框的正确性。将测序正确的转化子，放大培养，提取质粒，转大肠杆菌Rosetta感受态细胞，PCR筛选阳性克隆。阳性转化子于15％甘油中–80℃保存。

重组蛋白诱导表达、粗酶液提取及检测步骤如下：1)、将经测序鉴定序列正确的阳性转化子接种于同时含卡那霉素(pET-28a载体携带抗性)及氯霉素(Rosetta宿主菌携带抗性)的LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养12h；2)、将活化后的种子液再次以100:1的比例接种于LB(卡那霉素⁺，氯霉素⁺)培养基中，选用250mL三角瓶，每瓶装液量50mL(放大实验选用500mL三角瓶，每瓶装液量180mL)；3)、37℃，200rpm培养至OD₆₀₀≈0.6，于每瓶培养物中加入终浓度为0.5mM的IPTG；18℃，200rpm条件下诱导目的蛋白表达；4)、诱导培养16h后收集菌体，6,000×g离心5min，弃上清，菌体用ddH₂O洗1–2次，洗净培养基；5)、向菌体中加入3mL/g蛋白提取缓冲液(50mM Tris-HCl，0.5mg/mL溶菌酶，1mM PMSF，pH 7.4)，涡旋重悬沉淀；6)、将离心管置于冰水混合物中超声破碎15min(130w,3s/3s)，4℃，15,000×g离心30min，上清即为粗酶液。

2、AbGT73重组蛋白的分离纯化

利用Rosetta-pET28a-AbGT73重组表达菌株进行蛋白分离纯化，目的基因与6×His·tag融合表达，故利用Ni Sepharose^TM 6Fast Flow resin(GE Healthcare公司)亲和层析柱及PD-10Desalting Columns(GE Healthcare公司)对含有His标签的融合蛋白进行分离纯化，具体步骤如下：

2.1、缓冲液的配制：

1)、binding buffer：20mM磷酸缓冲液，500mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.2；

2)、elution buffer：20mM磷酸缓冲液，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.2；

3)、desalting buffer：50mM Tris-HCl，1mM DTT，1％甘油，50mM NaCl；

4)、lysis buffer：binding buffer+1mg/mL lysozyme，1mM PMSF，5μg/mL DNaseI，1mM MgCl₂，pH 7.2。

2.2、Ni Sepharose^TM 6Fast Flow resin亲和层析柱的预处理：

按照每1mL Ni Sepharose^TM 6Fast Flow resin柱床可结合2L重组菌株培养液所表达蛋白的比例选择合适大小的亲和层析柱装柱，依次用10倍柱体积的ddH₂O，bindingbuffer，elution buffer洗脱，最后用binding buffer平衡层析柱。

2.3、AbGT73重组蛋白粗提液制备及上样

重组菌株培养及蛋白诱导表达步骤与本实施例1节一致，诱导培养的重组菌于4℃，6,000×g离心收集菌体，按照3mL/g的比例于菌体中加入lysis buffer，涡旋重悬沉淀，4℃反应30min。在冰浴条件下，超声破碎15min(130w，3s/3s)，4℃，15,000×g离心30min，上清即为蛋白粗提液。所得到的蛋白粗提液用0.45μm滤膜过滤，以1mL/min的流速上样于入亲和层析柱中。

2.4、AbGT73重组蛋白洗脱

上样结束后，以10倍柱体积binding buffer洗脱杂蛋白，流速1mL/min，洗脱未与柱床紧密结合的杂蛋白，待洗脱液在280nm处紫外吸收值趋于0时，进行目的蛋白洗脱。分别配制不同咪唑浓度的洗脱缓冲液对目的蛋白进行梯度洗脱，咪唑浓度梯度如下：50mM、100mM、200mM、300mM，最后用elution buffer洗脱，每个浓度梯度洗脱5个柱体积，对流份进行SDS-PAGE检测。将含有目的蛋白的高纯度流份于超滤离心管中(规格30kDa，Millipore)进行超滤浓缩。

2.5、AbGT73重组蛋白脱盐

分别以10倍柱体积预冷的ddH₂O、desalting buffer平衡PD-10DesaltingColumn，将超滤所得蛋白浓缩液缓慢上样于脱盐柱上层，待样品完全进入柱子后以desalting buffer洗脱并开始接样，每1mL接作一个流分进行SDS-PAGE检测，根据PD-10脱盐柱洗脱原理，合并流份，以desalting buffer稀释至恰当体积，进行蛋白含量测定。

3、AbGT73的催化功能的研究

以UDP-葡萄糖为糖基供体，以2,4,6-三羟基苯乙酮及根皮素作为糖基受体底物，通过重组蛋白酶促反应进行对AbGT73的功能进行研究。反应体系如下：0.2mM糖基受体，0.4mM糖基供体，50μg重组AbGT73蛋白，总反应体积100μL，反应缓冲液(50mM Tris-HCl，1mMDTT，5％甘油，50mM NaCl)，30℃水浴反应12h，加入200μL冰甲醇终止反应，15,000×g离心30min，取上清进行HPLC-MS/MS分析(图1-图4)。

实施例3：重组AbGT73的糖基受体适应性

AbGT73重组蛋白的诱导表达及分离纯化与如实施例2所述。所试验糖基受体包括单羟基苯乙酮(2-OH-苯乙酮、3-OH-苯乙酮、4-OH-苯乙酮)、二羟基苯乙酮(3,5-二羟基苯乙酮、2,6-二羟基苯乙酮、2,4-二羟基苯乙酮)、羟甲基苯乙酮(2,6-二羟基-4-甲基苯乙酮、2,4-二羟基-6-甲基苯乙酮)、羟甲基苯甲醛(2,4-二羟基-6-甲基苯甲醛)、三羟基苯乙酮(2,4,6-三羟基苯乙酮及其羟基甲基化的化合物、1,3-二乙酰基间苯三酚)、三羟基苯甲醛、三羟基苯戊酮、二苯甲酮(桑橙素)、二氢查尔酮(根皮素)、黄酮(芹菜素、大豆苷元、2-羟基柚皮素)、香豆素(7-羟基-4-甲基香豆素、7-巯基-4-甲基香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素)、1-乙基-2,4-二羟基苯、1-苄基-2,4-二羟基苯、苄基苯类化合物(1-苄基-2,4,6-三羟基苯及其苄基苯环对位/间位氢被甲基、丁基、氟、氯、甲氧基、苯环等取代)、联苄类化合物(1-苯乙基-2,4,6-三羟基苯及其乙基苯环上对位氢被羟基、甲氧基、氟、氯等取代)以及含O-/S-/N-杂环类取代基的临苯二酚或间苯三酚类化合物(图6)。重组AbGT73催化芳香类化合物C-糖基化反应受体适应性实验的标准酶促催化反应体系为：0.2mM糖基受体，0.4mM UDP-葡萄糖，50μg重组AbGT73蛋白，总反应体积100μL，反应缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM DTT，5％甘油，50mM NaCl)，30℃水浴反应12h，加入200μL甲醇终止反应，15,000×g离心30min，取上清于HPLC-MS/MS分析。

实施例4：重组AbGT73糖基供体适应性

重组AbGT73蛋白的诱导表达及分离纯化与如实施例2所述。所试验糖基供体为UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖醛酸。重组AbGT73催化芳香类化合物C-糖基化反应供体适应性实验标准酶促催化反应体系为：0.2mM糖基受体，0.4mM UDP-糖基供体，50μg重组AbGT73蛋白，总反应体积100μL，反应缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM DTT，5％甘油，50mMNaCl)，30℃水浴反应12h，加入200μL冰甲醇终止反应，15,000×g离心30min，取上清于HPLC-MS/MS分析。

实施例5：应用重组AbGT73制备双C-糖基化2,4,6-三羟基苯乙酮产物

1、重组蛋白放大酶促反应

重组蛋白放大酶促反应条件：20mL反应体系，含1.5mM C-糖基化受体，3mM C-糖基化供体，2.4mg重组AbGT73蛋白，反应缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM DTT，1％甘油，50mMNaCl)，30℃反应12h。将反应液直接减压蒸干，甲醇重悬，过0.45μm滤膜，用于semi-prep.HPLC分离。

2、C-糖基化产物的分离纯化与结构鉴定

通过semi-prep.HPLC对反应产物进行分离纯化。液相系统：反相半制备柱为Shiseido MGIII C18(250mm×10.0mm I.D.,5μm)。2,4,6-三羟基苯乙酮(11)为糖基受体，以UDP-葡萄糖为糖基供体，制备获得1个产物(11a)，见图1。分离得到的反应产物进一步经¹H NMR、¹³C NMR及MS进行结构鉴定，产物MS及NMR数据如下：

3,5-di-C-β-D-glucosyl-2,4,6-trihydroxyacetophenone:ESI-MS m/z 491.46[M-H]^-；¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz):δ＝4.98(2H,brs,-OH),4.93(1H,brs,-OH),4.69(2H,d,J＝9.8Hz,Glc-H₁,Glc-H_1′),3.63(2H,d,J＝11.8Hz,Glc-H),3.57(2H,dd,J＝11.8,4.3Hz,Glc-H),3.51(2H,t,J＝9.5Hz,Glc-H),3.22–3.29(6H,m,Glc-H),2.57(3H,s,-CH₃)；¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz):δ＝203.1(C＝O),164.1(C-4),163.8(C-2),163.8(C-6),105.3(C-1),103.9(C-3),103.9(C-5),81.5(Glc-5),81.5(Glc-5′),78.5(Glc-3),78.5(Glc-3′),75.3(Glc-1),75.3(Glc-1′),72.7(Glc-2),72.7(Glc-2′),69.7(Glc-4),69.7(Glc-4′),60.5(Glc-6),60.5(Glc-6′),33.1(-CH₃).

实施例6：应用重组AbGT73制备双C-糖基化根皮素产物

除反应液后处理方式外，重组蛋白放大酶促反应及C-糖基化产物的分离纯化与结构鉴定步骤与实施例5所述相同。实施例6反应液的后处理方式为用5倍体积乙酸乙酯萃取5次回收转化产物，减压蒸干，甲醇重悬，过0.45μm滤膜。以根皮素(18)为糖基受体，以UDP-葡萄糖为糖基供体，制备获得1个产物(18a)，见图2。分离得到的反应产物进一步经¹H NMR、¹³CNMR及MS进行结构鉴定，产物MS及NMR数据如下：

phloretin-3′,5′-di-C-β-D-glucoside:ESI-MS m/z 599.09[M+H]⁺；¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz):δ＝9.14(2H,s,-OH),7.03(2H,d,J＝8.4Hz,H-2),7.03(2H,d,J＝8.4Hz,H-6),6.67(2H,d,J＝8.4Hz,H-3),6.67(2H,d,J＝8.4Hz,H-5),5.02(2H,d,J＝5.3Hz,Glc-OH),4.98(2H,brs,Glc-OH),4.77(2H,brs,Glc-OH),4.72(2H,d,J＝9.5Hz,Glc-H₁),4.71(2H,overlapped,Glc-OH),3.57-3.63(4H,m,Glc-H),3.47(2H,m,Glc-H),3.26-3.29(4H,m,Glc-H),3.17(2H,m,H-α),2.79(2H,t,J＝7.7Hz,H-β)；¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz):δ＝205.6(C＝O),161.6(C-4′),161.5(C-2′),161.5(C-6′),155.9(C-4),132.0(C-1),129.7(C-2),129.6(C-6),115.5(C-3),115.5(C-5),105.0(C-1),104.5(C-3′),104.5(C-5′),81.6(Glc-5),81.6(Glc-5′),78.3(Glc-3),78.3(Glc-3′),75.1(Glc-1),75.1(Glc-1′),72.5(Glc-2),72.5(Glc-2′),69.6(Glc-4),69.6(Glc-4′),60.4(Glc-6),60.4(Glc-6′),46.7(C-α),29.7(C-β).

实施例7：应用重组AbGT73制备C-糖基化1-乙基-2,4-二羟基苯产物

重组蛋白放大酶促反应及C-糖基化产物的分离纯化与结构鉴定步骤与实施例6所述相同。以1-乙基-2,4-二羟基苯为糖基受体，以UDP-葡萄糖为糖基供体，制备获得1个转化产物。分离得到的反应产物进一步经¹H NMR、¹³C NMR及MS进行结构鉴定，产物MS及NMR数据如下：

ethyl phloroglucinol-3-C-β-D-glucoside ESI-MS m/z 315.20[M-H]^-；¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz):δ＝8.86(1H,s,-OH),8.65(1H,s,-OH),7.86(1H,s,-OH),5.88(1H,s,H-5),4.95(1H,d,J＝4.6Hz,Glc-OH),4.76(1H,d,J＝5.5Hz,Glc-OH),4.67(1H,t,J＝5.3Hz,Glc-OH),4.60(1H,d,J＝9.8Hz,Glc-H₁),3.63(1H,m,Glc-H),3.57(1H,m,Glc-H),3.39(1H,m,Glc-H),3.28(1H,m,Glc-H),3.21(2H,m,Glc-H),2.41(2H,m,-CH₂-),0.96(3H,t,J＝7.3Hz),¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz):δ＝155.7,155.1,153.9,109.2,103.6,95.2(C-5),81.3(Glc-5),78.6(Glc-3),75.9(Glc-1),73.1(Glc-2),69.7(Glc-4),60.6(Glc-6),16.1(-CH₂-),14.7(-CH₃).

实施例8：应用重组AbGT73制备C-糖基化1-苄基-2,4-二羟基苯产物

重组蛋白放大酶促反应及C-糖基化产物的分离纯化与结构鉴定步骤与实施例6所述相同。以1-苄基-2,4-二羟基苯为糖基受体，以UDP-葡萄糖为糖基供体，制备获得1个转化产物。分离得到的反应产物进一步经¹H NMR、¹³C NMR及MS进行结构鉴定，产物MS及NMR数据如下：

3-C-β-D-glucosyl-1-benzylbenzene-2,4-diol ESI-MS m/z 361.24[M-H]^-；¹HNMR(Methanol-d₄,600MHz):δ＝7.17-7.20(4H,m,overlapped,H-2′,H-3′,H-5′,H-6′),7.09(1H,m,H-4′),6.78(1H,d,J＝8.3Hz,H-6),6.28(1H,d,J＝8.3Hz,H-5),4.94(1H,d,J＝9.9Hz,Glc-H₁),3.85(1H,dd,J＝2.3,12.1Hz,Glc-H),3.82(2H,d,J＝6.6Hz,-CH₂-),3.78(1H,dd,J＝4.5,12.1Hz,Glc-H),3.65(1H,dd,J＝8.8Hz Glc-H),3.50(2H,m,Glc-H),3.41(1H,m,Glc-H)；¹³C NMR(Methanol-d₄,150MHz):δ＝154.3,154.0,141.8(C-1′),129.9,128.4(C-3′),128.4(C-5′),127.6(C-2′),127.6(C-6′),125.1,120.3,111.0,106.9,81.1(Glc-5),78.2(Glc-3),76.2(Glc-1),73.1(Glc-2),69.6(Glc-4),60.6(Glc-6),34.7(-CH₂-).

实施例9：应用重组AbGT73制备C-糖基化1-苄基-2,4,6-三羟基苯产物

重组蛋白放大酶促反应及C-糖基化产物的分离纯化与结构鉴定步骤与实施例6所述相同。以1-苄基-2,4,6-三羟基苯为糖基受体，以UDP-葡萄糖为糖基供体，制备获得1个转化产物。分离得到的反应产物进一步经¹H NMR、¹³C NMR及MS进行结构鉴定，产物MS及NMR数据如下：

3-C-β-D-glucosyl-1-benzylbenzene-2,4,6-triol ESI-MS m/z 377.33[M-H]^-；¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz):δ＝9.04(1H,s,-OH),8.77(1H,s,-OH),7.95(1H,s,-OH),7.14-7.18(4H,m,H-2′,H-3′,H-5′,H-6′),7.06(1H,m,H-4′),5.91(1H,s,H-5),4.58(1H,d,J＝9.7Hz,Glc-H₁),3.70(2H,s,-CH₂-),3.53-3.60(2H,m,Glc-H),3.16-3.21(4H,m,overlapped,Glc-H)；¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz):δ＝156.0,155.4,154.6,142.9(C-1′),128.8(C-3′),128.8(C-5′),128.2(C-2′),128.2(C-6′),125.4(C-4′),106.7(C-1),103.6(C-3),95.2(C-5),81.4(Glc-5),78.6(Glc-3),75.9(Glc-1),73.1(Glc-2),69.7(Glc-4),60.5(Glc-6),25.6(-CH₂-).

实施例10：应用重组AbGT73制备C-糖基化1-苯乙基-2,4,6-三羟基苯产物

重组蛋白放大酶促反应及C-糖基化产物的分离纯化与结构鉴定步骤与实施例6所述相同。以1-苯乙基-2,4,6-三羟基苯为糖基受体，以UDP-葡萄糖为糖基供体，制备获得1个转化产物。分离得到的反应产物进一步经¹H NMR、¹³C NMR及MS进行结构鉴定，产物MS及NMR数据如下：

3-C-β-D-glucosyl-1-phenethylbenzene-2,4,6-triol ESI-MS m/z 391.03[M-H]^-；¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz):δ＝8.91(1H,s,-OH),8.79(1H,s,-OH),7.94(1H,s,-OH),7.22-7.26(2H,m,H-3′,H-5′),7.15(2H,t,J＝7.5Hz,H-2′,H-6′),7.03(1H,J＝7.5Hz,H-4′),5.85(1H,s,H-5),4.59(1H,d,J＝9.7Hz,Glc-H₁),3.53-3.60(2H,m,Glc-H),3.17-3.21(4H,m,overlapped,Glc-H),1.55-1.56(4H,m,-CH₂-,-CH₂-)；¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz):δ＝156.3,155.3,154.4,147.3(C-1′),127.9(C-3′),127.9(C-5′),127.8(C-2′),127.8(C-6′),125.1(C-4′),111.4(C-1),103.6(C-3),94.9(C-5),81.4(Glc-5),78.6(Glc-3),76.0(Glc-1),73.1(Glc-2),69.7(Glc-4),60.5(Glc-6),33.3(-CH₂-),18.7(-CH₂-).

实施例11：应用重组AbGT73制备C-糖基化1-(4′-甲基-苄基)-2,4,6-三羟基苯产 物

重组蛋白放大酶促反应及C-糖基化产物的分离纯化与结构鉴定步骤与实施例5所述相同。以1-(4′-甲基-苄基)-2,4,6-三羟基苯为糖基受体，以UDP-葡萄糖为糖基供体，制备获得1个转化产物。分离得到的反应产物进一步经¹H NMR、¹³C NMR及MS进行结构鉴定，产物MS及NMR数据如下：

3-C-β-D-glucosyl-1-(4-methylbenzyl)benzene-2,4,6-triol ESI-MS m/z391.37[M-H]^-；¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz):δ＝9.03(1H,s,-OH),8.77(1H,s,-OH),7.95(1H,s,-OH),7.08(2H,d,J＝7.9Hz,H-3′,H-5′),6.98(2H,d,J＝7.9Hz,H-2′,H-6′),5.93(1H,s,H-5),4.95(1H,s,Glc-OH),4.87(1H,s,Glc-OH),4.77(1H,s,Glc-OH),4.67(1H,s,Glc-OH),4.61(1H,d,J＝9.7Hz,Glc-H₁),3.64(2H,s,-CH₂-),3.56-3.64(2H,m,Glc-H),3.17-3.39(4H,m,Glc-H),2.21(3H,s,-CH₃)；¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz):δ＝155.9(C-6),155.7(C-6),154.5(C-4),139.8(C-1′),134.14(C-4′),128.7(C-2′),128.7(C-3′),128.7(C-5′),128.7(C-6′),107.0(C-1),103.6(C-3),95.2(C-5),81.4(Glc-5),78.6(Glc-3),75.9(Glc-1),73.1(Glc-2),69.7(Glc-4),60.5(Glc-6),28.2(-CH₂-),21.0(-CH₃).

序列表

<110> 中国医学科学院药物研究所

<120> 一种芦荟C-糖基转移酶序列及其在催化C-糖基化中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 470

<212> PRT

<213> 库拉索芦荟(Aloe vera)

<400> 1

Met Ser Asn Ser Gly Arg Pro His Val Ala Leu Leu Pro Ser Ala Gly

1 5 10 15

Met Gly His Leu Thr Pro Phe Cys Arg Leu Ala Ala Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Arg Gly Gly Gly Asp Leu Asp Val Ser Phe Ile Thr Ala Glu Pro Thr

35 40 45

Val Ser Leu Lys Glu Tyr Leu Gln Ile Arg Asp Leu Leu Ser Ser Phe

50 55 60

Pro Ser Ile Lys Ser His Arg Phe Lys Val Pro Glu Leu Ser Pro Ser

65 70 75 80

Gln Phe Pro Ser Ser Pro Asp Pro Phe Phe Gln Gln Trp Glu Ser Ile

85 90 95

Arg Arg Cys Ala His Leu Leu Pro Pro Leu Leu Ala Ser Ala Thr Ala

100 105 110

Leu Ile Ile Asp Thr Ala Ser Ala Ser Ala Val Leu Pro Val Ala Lys

115 120 125

Gln Leu Asn Ile Pro Ala Tyr Ile Leu Phe Thr Ser Ser Ala Ser Met

130 135 140

Leu Ser Leu Val Ala His Phe Pro Ser His Val Ile Ser Ser Thr Ser

145 150 155 160

Pro Ser Ala Pro Leu Met Ser Asn Ile Leu Ile Pro Gly Leu Lys His

165 170 175

Pro Val Pro Ala Ala Trp Val Pro Pro Pro Leu His Val Pro Gly His

180 185 190

Ile Phe Ser Thr Leu Thr Val Asp Asn Gly Arg Cys Leu Pro Glu Ala

195 200 205

Asp Gly Val Ile Ile Asn Thr Phe Asp Ala Leu Glu Pro Glu Val Leu

210 215 220

Ala Ala Leu Asn Gly Gly Arg Val Ala His Gly Leu Pro Arg Val Phe

225 230 235 240

Ala Val Gly Pro Leu Val Ala Pro Pro Pro Pro Gln Gln Met Glu Glu

245 250 255

Thr Gly Gly Gly Asp Tyr Pro Ile Ala Trp Leu Asp Arg Gln Arg Asp

260 265 270

Lys Ser Val Val Tyr Val Ser Phe Gly Ser Arg Thr Ala Met Ser Pro

275 280 285

Glu Gln Ile Arg Glu Leu Ala Ala Gly Leu Glu Arg Ser Gly Cys Ser

290 295 300

Phe Leu Trp Val Ile Lys Thr Lys Lys Val Asp Arg Asp Glu Glu Glu

305 310 315 320

Thr Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Glu Gly Tyr Val Glu Arg Val Lys

325 330 335

Gly Arg Gly Leu Val Val Asn Gly Trp Val Glu Gln Glu Glu Ile Leu

340 345 350

Arg His Arg Ala Val Gly Gly Phe Val Ser His Cys Gly Trp Asn Ser

355 360 365

Val Thr Glu Ala Ala Val Ala Gly Val Arg Val Leu Cys Trp Pro Arg

370 375 380

Met Gly Asp Gln Arg Leu Asn Ala Glu Val Val Arg Arg Ser Gly Val

385 390 395 400

Gly Val Trp Met Glu Glu Trp Ser Trp Glu Ala Glu Gly Gly Val Val

405 410 415

Gly Gly Glu Glu Ile Gly Arg Arg Val Lys Glu Met Met Glu Asp Glu

420 425 430

Gly Leu Arg Asp Ser Ala Glu Arg Val Ala Glu Glu Ala Arg Val Ala

435 440 445

Leu Gly Val Gly Gly Thr Ser Ser Lys Glu Met Glu Glu Phe Ile Ser

450 455 460

Arg Ile Met Met Gly Ser

465 470

<210> 3

<211> 1413

<212> DNA

<213> 库拉索芦荟(Aloe vera)

<400> 3

atgtcaaact ccggcaggcc tcacgtagcc ctcctcccca gcgctggaat gggccacctt 60

actcccttct gccgcctcgc cgcgctcctc tcctcccgtg gcggtggcga tctcgacgtc 120

tccttcatca ccgccgagcc caccgtctcg ctcaaggagt acctccaaat cagagaccta 180

ctctcctcgt tcccttccat aaaatcccac cgcttcaaag tccccgaatt atccccctct 240

cagttcccct ccagccccga ccctttcttc caacaatggg agtccatccg ccgctgcgct 300

cacctcctcc cccctctcct cgcctccgcc accgccctca tcatcgacac cgcctccgca 360

tctgccgtcc tccccgtcgc caagcagctc aacatccccg cctacatcct attcacctcc 420

tccgcgtcca tgctctccct cgtcgctcac ttccccagtc acgtgatctc ctccacttca 480

ccgtcagccc ctctgatgag caacatcctc atcccaggcc tcaagcaccc cgtgccagcc 540

gcgtgggtcc cgccgccgct ccacgtcccc ggccatatct tctcgaccct aactgtcgac 600

aacggacgct gcctcccgga agccgacggc gtcatcatca acacgttcga cgctctggaa 660

ccggaagtgc ttgcggcgct gaacggcggg agagtggcgc acgggctgcc gagggtgttc 720

gccgtcggcc ccctcgtggc tcctccgccg ccacagcaga tggaggagac agggggtggc 780

gactacccga tcgcgtggct cgaccggcag cgggataagt cggtggtgta cgtgagcttc 840

ggcagccgca ccgcaatgag cccggagcag atccgggagc tcgcggccgg gctggagcgg 900

agcgggtgct cgttcctgtg ggttatcaag accaagaagg tggaccgaga cgaggaggaa 960

acagacttgg gtgctctttt aggagaaggg tatgtggaga gggtgaaggg gagggggttg 1020

gtggtgaacg ggtgggtgga gcaggaggag atactgaggc acagggcggt ggggggattc 1080

gtgagccact gcgggtggaa ctcggtgacg gaggcggcag tggcgggggt gagggtgctg 1140

tgttggccga ggatggggga ccagaggctg aatgcggagg tggtgaggag gagcggggtg 1200

ggggtctgga tggaggagtg gagctgggag gcggaggggg gagtggtggg tggggaggag 1260

atcgggagaa gagtgaagga gatgatggag gatgaggggc tgagggattc cgctgagaga 1320

gtcgcggagg aggccagggt ggctctcggg gttggtggga cctctagcaa ggagatggaa 1380

gagttcatta gtagaataat gatgggcagc taa 1413

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 正向引物AbGT73-F(Aloe vera)

<400> 3

atgtcaaact ccggcaggcc tcacgtagcc ct 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 反向引物AbGT73-R(Aloe vera)

<400> 4

ttagctgccc atcattattc tactaatgaa ct 32

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 带同源臂正向引物AbGT73-Fe(Aloe vera)

<400> 5

gtgccgcgcg gcagccatat gtcaaactcc ggcaggcct 39

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 带同源臂反向引物AbGT73-Re(Aloe vera)

<400> 6

gcggccgcaa gcttgtcgtt agctgcccat cattattct 39

Claims (14)

1.一种来源于芦荟的C-糖基转移酶，其特征在于，其氨基酸序列为：

SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，氨基酸序列命名为AbGT73。

2.根据权利要求1的C-糖基转移酶，其特征在于，在C-糖基转移酶上进行常规修饰；或者在C-糖基转移酶上还连接有用于检测或纯化的标签。

3.根据权利要求2的C-糖基转移酶，其特征在于，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、或固定化修饰；所述的标签包括His₆、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、或Profinity eXact。

4.一种编码权利要求1的C-糖基转移酶的核酸分子。

5.根据权利要求4的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，核苷酸序列命名为AbGT73。

6.一种重组表达载体，包含由权利要求4-5任一项所述的核酸分子。

7.一种含有权利要求4-5任一项所述核酸分子或权利要求6所述重组表达载体的宿主细胞。

8.根据权利要求7的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是选自细菌、酵母、植物细胞、动物细胞。

9.根据权利要求8的宿主细胞，其特征在于，所述的细菌选自大肠杆菌(Escherichiacoli)。

10.一种生产权利要求1所述C-糖基转移酶的方法，其特征在于，在合适的培养基中培养权利要求7-8中任意一项的宿主细胞，经提取、纯化得到的C-糖基转移酶。

11.权利要求1所述的C-糖基转移酶或权利要求4-5任一项所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体或权利要求7-8任一项所述的宿主细胞在催化底物C-糖基化反应中的应用。

12.根据权利要求11的应用，其特征在于，所述的C-糖基化反应是指将糖基受体及糖基供体在C-糖基转移酶作用下反应，并经过提取、分离手段获得产物C-糖苷类化合物。

13.根据权利要求12的应用，其特征在于，所述的糖基受体化合物包括苄基苯类化合物、联苄类化合物、二苯甲酮类化合物、黄酮类化合物及苯乙酮类化合物。

14.根据权利要求12的应用，其特征在于，所述的糖基供体为UDP-葡萄糖。

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