CN110438101A

CN110438101A - 一种异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3及编码基因及应用

Info

Publication number: CN110438101A
Application number: CN201910798929.6A
Authority: CN
Inventors: 刘江; 陈建华; 周诚; 谢丛薇; 肖新力; 杨才琼; 李晓曼; 肖媛; 黄祥庆; 杜俊波; 张静; 王小春; 杨峰; 武晓玲; 杨文钰
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2019-11-12
Anticipated expiration: 2039-08-28
Also published as: CN110438101B

Abstract

本发明公开了一种异黄酮O‑甲基转移酶GmIOMT3及其编码基因和应用，从大豆中克隆得到异黄酮O‑甲基转移酶基因GmIOMT3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码的异黄酮O‑甲基转移酶GmIOMT3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明为鹰嘴豆素A的生物合成提供了一种新的方法。本发明所述的异黄酮O‑甲基转移酶GmIOMT3及其编码基因来自大豆，该酶催化合成的鹰嘴豆素A具有多种药用价值，在高品质大豆的选育中将发挥重要作用。

Description

一种异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3及编码基因及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3及编码基因及应用。

背景技术

异黄酮是一类黄酮类化合物，为广泛分布于高等植物的色素，植物苯丙氨酸代谢过程中，由肉桂酰辅酶A侧链延长后环化形成以苯色酮环为基础的酚类化合物，其3-苯基衍生物即为异黄酮，属植物次生代谢产物。类黄酮属，是一种芳香族含氧杂环化合物，黄酮的异构体。精制的异黄酮呈片状或针状结晶。一般无色，但随着羟基的增加，可呈黄至深黄色。异黄酮具有预防心血管疾病、预防骨质疏松、抗肿瘤和神经保护等丰富的生物活性。主要存在于豆科植物中，大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次级代谢产物，大豆中存在多种甲基化异黄酮，包括黄豆黄素(Glycitein)、刺芒柄花素(Formononetin)、鹰嘴豆素A(Biochanin A)等异黄酮苷元及其葡萄糖苷、乙酰化糖苷、丙二酰基化糖苷衍生物。

甲基化是黄酮类化学成分的重要修饰反应，可以增强黄酮的稳定性、提高生物利用度、增强转运能力、提高肠道吸收效率、增强生物活性；与非甲基化黄酮相比，甲基化黄酮具有更好的抗氧化性、抗癌活性、抗炎活性，药用价值更高。

甲基化异黄酮由异黄酮甲基转移酶催化合成，生物信息学分析结果显示，大豆中存在诸多具有潜在甲基化修饰功能的基因；经美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库的功能预测分析，大豆基因组中具有异黄酮甲基化修饰功能的甲基转移酶基因共有2个，分别为：GmIOMT1和GmIOMT2，但其功能均未得到验证；即：至今尚未发现任何一个对大豆异黄酮具有确切甲基化修饰功能的甲基转移酶基因。

目前，市面上鹰嘴豆素A主要从植物中纯化提取，具有雌激素样作用，有很好的抗癌活性，对糖尿病、认知功能障碍、高血脂等多种病症有改善功能，具有较高的药用价值；通过生物技术手段合成鹰嘴豆素A，具有重要的产业开发价值。但植物中鹰嘴豆素A含量低，不易提取，并提取量少。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3及编码基因及应用，GmIOMT3的发现对大豆甲基化异黄酮的深入研究具重要意义。制备鹰嘴豆素A中反应后体系中化合物种类少，易于纯化鹰嘴豆素A，而其前体物质染料木素含量很高，通过生物合成的方法可大量合成鹰嘴豆素A。

解决以上技术问题的本发明中的异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具有良好的催化合成O-甲基化异黄酮的活性。

所述编码基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码上述异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3的异黄酮O-甲基转移酶基因GmIOMT3。

异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3及其编码基因GmIOMT3，其碱基序列有别于GmIOMT1和GmIOMT2，具有特异性催化染料木素(大豆中主要的异黄酮苷元)生成鹰嘴豆素A(甲基化异黄酮)的功能。

本发明中所述异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3的应用，为在制备O-甲基化异黄酮中的应用。

进一步，所述异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3及编码基因在制备鹰嘴豆素A中的应用。

所述鹰嘴豆素A为O-甲基化异黄酮鹰嘴豆素A。

其中，鹰嘴豆素A的制备方法包括以下步骤：

(1)获取转移酶GmIOMT3蛋白质并纯化；

(2)配制催化反应体系：反应体系以100μL计算：其中包括Tris-HCl缓冲液180-220mM，SAM(S-腺苷甲硫氨酸)0.9-1.1mM，DTT(二硫苏糖醇)3-5mM，MgCl₂ 0.8-1.2mM，目的蛋白(转移酶GmIOMT3)7-9μg，染料木素0.15-0.25mM，ddH2O(双蒸水)补齐至100μL；

tris-hcl缓冲液为常规的缓冲液。

(3)37℃反应30min，加入100μL乙腈终止反应；

将100μL反应体系混匀，37℃恒温孵育30min，完成后加入100μL乙腈终止反应。

(4)鹰嘴豆素A混合液，经过提纯即得。

反应后未经过纯化，液体仍是混合物，测定体系中异黄酮含量发现，加入的底物染料木素含量减少，合成了新的物质鹰嘴豆素A。

所述催化反应体系的pH值为7.9-8.2，反应温度为36-38℃。

所述反应体系以100μL计算：其中包括Tris-HCl缓冲液200mM，SAM(S-腺苷甲硫氨酸)1mM，DTT(二硫苏糖醇)4mM，MgCl22mM，目的蛋白(即转移酶GmIOMT3)8μg，染料木素0.2mM，ddH2O(双蒸水)补齐至100μL。

所述目的蛋白为异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3。

所述步骤(1)中纯化步骤为：将异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3蛋白质加入蛋白酶抑制剂，超声裂解细胞，4℃，7000r离心10min，将上清液转移至新的50ml离心管，加入Nickle-IDA填料，添加Binding buffer至50ml(Binding buffer至少为25ml)，使用倒置摇床，4℃，摇12h，使目的蛋白与填料结合。结合完成后，静置10min，去上清液，加Binding buffer至50ml，冰浴摇20min。按以上方法清洗填料5次，除去杂蛋白。以咪唑浓度为300mM的Elutionbuffer进行洗脱，然后跑胶验证，并测定蛋白浓度。

所述步骤(4)中提纯步骤具体为：将反应溶液减压浓缩至完全干燥后，以甲醇充分溶解，加入少量ODS反相硅胶拌样，超声振荡，使其混合均匀，减压浓缩至完全干燥，使样品完全吸附于硅胶表面；取ODS填料100g，甲醇湿法装柱直径2.0cm(可根据实际情况调整尺度)；干法上样，以“水—20％甲醇水溶液—30％甲醇水溶液—40％甲醇水溶液—60％甲醇水溶液—100％甲醇”梯度洗脱，重点收集40％甲醇水溶液的洗脱液，经减压浓缩、真空干燥后即得鹰嘴豆素A，其HPLC含量可达到90％以上(可根据实际情况使用制备液相色谱作进一步纯化)。

对纯化得到的鹰嘴豆素A减压干燥后，以氘代氯仿为溶剂测定其核磁共振氢谱、碳谱；其特征碳谱¹³C NMR：δ180.7,162.7,162.0,159.6,157.9,152.6,130.0,123.5,122.6,114.1,106.2,99.2,94.2,55.4，确证其化学结构为鹰嘴豆素A。

本发明中pH值与温度，该条件适合大部分OMT的催化反应，不同的温度与pH值会影响酶活性与催化效率。反应条件设置pH值为8.0，反应温度为37℃能让GmOMT酶有很好的活性。

ddH2O是单蒸水为原料再次蒸馏所得，纯度比单蒸水有所提高。蒸馏水能去除自来水内大部分的污染物，但挥发性的杂质无法去除，如二氧化碳、氨、二氧化硅以及一些有机物。或许这些物质会影响酶的活性，影响产物检测。

染料木素，产品别名5,7,4'-三羟基异黄酮、染料木黄酮、金雀异黄酮，主要存在于豆科之中，如槐角、山豆根中含量较大。具有抗氧化作用，具有雌激素及抗雌激素性质，可抑制拓析异物酶II的活性，可抑制酪氨酸蛋白激酶PTK的活性。

DTT是一种小分子有机还原剂，化学式为C4H10O2S2。其还原状态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构。DTT的还原力受pH值的影响，只在pH值大于7的情况下能够发挥还原作用，有较好的还原能力。

S-腺苷基甲硫氨酸(英语:S-adenosyl methionine，缩写为SAM)带有一个活化了的甲基，是一种参与甲基转移反应的辅酶，存在于所有的真核细胞中。

本发明中合成方法中先纯化表达异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3的大肠杆菌菌液中的GmIOMT3蛋白，以染料木素为异黄酮底物，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，在Mg²⁺存在的情况下，异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3催化染料木素合成鹰嘴豆素A。

本发明从大豆中克隆得到异黄酮O-甲基转移酶基因GmIOMT3，其编码的异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3具有良好的催化合成O-甲基化异黄酮的活性。利用异黄酮O-甲基转移酶基因GmIOMT3构建表达载体转化大肠杆菌(常规大肠杆菌)，获得超量表达异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3的大肠杆菌，从该大肠杆菌菌液中纯化得到GmIOMT3蛋白。

本发明为鹰嘴豆素A的生物合成提供了一种新的方法。

本发明所述的异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3及其编码基因来自大豆，其在高品质大豆品种的选育中也将发挥重要作用。

本发明中以染料木素作为底物，通过生物合成的方法可大量合成鹰嘴豆素A。本方法合成的产物杂质更少，利于鹰嘴豆素A的纯化，而且合成更加绿色环保，减少对环境的污染。GmIOMT3催化染料木素的转化效率为75％，能够用于鹰嘴豆素A的大量合成。本发明成本低、工艺简单、转化效率高、节约时间、对环境污染轻、适合工业化生产。

附图说明

图1为重组产物转化DH5α细胞菌落PCR产物电泳图

图2为重组质粒转化C41细胞菌落PCR产物电泳图

图3为纯化蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图

图4为GmIOMT3催化染料木素合成鹰嘴豆素A反应色谱图

图5为GmIOMT3催化染料木素合成鹰嘴豆素A反应质谱图

图6为GmIOMT3催化染料木素合成鹰嘴豆素A反应示意图

具体实施方式

实施例1克隆异黄酮O-甲基转移酶基因GmIOMT3、构建超表达载体及转化大肠杆菌

使用Omega公司的RNA提取试剂盒提取大豆叶片的总RNA，使用Thermo Scientific公司的反转录试剂盒进行反转录反应合成cDNA。以该cDNA为模板，正向引物gccatggctgatatcggatccATGGAGAAAGAGGAGAGCACGG，反向引物ttgtcgacggagctcgaattcTCATTTCTGAAACTCAAGGACAGTG，使用NEB公司的高保真PCR试剂盒进行PCR扩增；PCR条件为：98℃，30s；98℃，8s、72℃，25s；34个循环；72℃延伸2min。采用Omega公司的胶回收试剂盒经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。

使用NEB公司的BamHI-HF酶与EcoRI-HF酶对Biomed公司的pET-32a质粒进行线性化处理。使用Vazyme公司的同源重组试剂盒将目的基因片段与线性化pET-32a载体连接，将重组产物加入Biomed公司的DH5α感受态细胞进行转化，转化使用热激法。热激法为常规方法。

菌落PCR筛选同源重组产物成功转化至DH5α细胞的阳性菌，筛选方法为：挑选单个菌落转移至10μL无菌水，取2μL作为模板，使用正向引物gccatggctgatatcggatccATGGAGAAAGAGGAGAGCACGG，反向引物ttgtcgacggagctcgaattcTCATTTCTGAAACTCAAGGACAGTG，进行PCR扩增，PCR得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。

图1的M为marker，4、5、6、7为阳性菌，将4号阳性菌种命名为IOMTd1，扩增培养，提取重组质粒并测序，测序结果表明，重组质粒含有的基因片段序列与NCBI上的目的基因序列完全一致，表明异黄酮O-甲基转移酶基因GmIOMT3成功插入到表达载体pET-32a。将重组质粒加入C41感受态细胞进行转化，转化使用热激法，并使用上文提到的方法进行菌落PCR检测，结果如图2所示，图2的M为marker，1、2、5、6、7、8为阳性菌，将1号阳性菌命名为IOMTc1，扩增培养并保留菌种。

原始菌落感受态细胞于Biomed公司购买。名称为C41大肠杆菌，Escherichiacoli。实验室常用菌株，在使用前，原始菌可以需要进行培育方法、驯化方法或纯化。

实施例2异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3的诱导表达与纯化

将IOMTc1菌种加入100ml LB培养基中，培养至OD600为0.5左右，加入终浓度为0.3mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，16℃，200rmp培养8h。培养完成后转移至50ml离心管中，4℃，7000r离心10min，去上清。加入15ml PBS缓冲液重悬细胞，4℃，7000r离心10min，去上清，以同样方法用PBS溶液清洗细菌4次，最后用15ml PBS溶液重悬目的菌。同时，用PBS溶液清洗GeneSTAR公司的Nickle-IDA树脂填料4次，以除去乙醇。100ml菌液使用100μL填料。

完成目的菌清洗后进行纯化，加入蛋白酶抑制剂，超声裂解细胞，4℃，7000r离心10min，将上清液转移至新的50ml离心管，加入Nickle-IDA填料，添加Binding buffer至50ml(Binding buffer至少为25ml)，使用倒置摇床，4℃，摇12h，使目的蛋白与填料结合。结合完成后，静置10min，去上清液，加Binding buffer至50ml，冰浴摇20min。按以上方法清洗填料5次，除去杂蛋白。

分别以500μL咪唑浓度为100、200、300、400、500mM的Elution buffer按浓度由低到高的次序进行洗脱，SDS-PAGE凝胶电泳验证结果如图3所示。M为marker，1号泳道为未纯化蛋白，2-6号为纯化后浓度梯度咪唑洗脱的蛋白，以3号泳道的蛋白作为目的蛋白，用bradford法测定蛋白浓度。洗脱时，也可以直接以咪唑浓度为300mM的Elution buffer进行洗脱，然后跑胶验证，并测定蛋白浓度。

面对无法从植物中纯化出GmIOMT3的难题，本发明在大肠杆菌中过表达GmIOMT3时，在GmIOMT3基因上加了6×His标签，这样才能从大肠杆菌中纯化出GmIOMT3。可用其他的纯化方法，本发明中使用的方法是一种较优的方法。

实施例3鹰嘴豆素A的生物合成与产物鉴定

使用实例2纯化得到的蛋白体外催化染料木素合成鹰嘴豆素A。以100μL反应为例，反应体系为：Tris-HCl200 mM，SAM 1mM，DTT 4mM，MgCl2 2mM，目的蛋白8μg，染料木素0.2mM，ddH2O补齐至100μL，pH 8.0，温度37℃。37℃反应30min，加入100μL乙腈终止反应。

使用UPLC-QTOF-MS对反应产物进行鉴定，结果如图4所示。图4-A为加入染料木素底物，未加入蛋白的空白对照，Peak 1为染料木素；图4-B为加入染料木素底物与蛋白的实验组，Peak 2为染料木素，Peak 3为催化反应合成物质；图4-C为只加入了鹰嘴豆素A标准品，Peak 4为鹰嘴豆素A。图4-B与图4-A相比，反应后染料木素底物减少，且新合成了Peak3所对应的物质，图4-B与图4-C相比，Peak 3与Peak 4保留时间一致。图5为各色谱峰的质谱图，染料木素分子量为270.24，鹰嘴豆素A分子量为284.26，测定时采用正离子模式，所以测得的分子量比实际值大1。如图5中C与D所示，催化产物分子量与鹰嘴豆素A分子量一致。

综上判定Peak 3为鹰嘴豆素A，即染料木素在异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3的催化下合成了鹰嘴豆素A，如图6所示。

实施例5

其它内容相同，其中配制催化反应体系：反应体系以100μL计算：其中包括Tris-HCl缓冲液220mM，SAM(S-腺苷甲硫氨酸)0.9mM，DTT(二硫苏糖醇)3mM，MgCl20.8mM，目的蛋白(转移酶GmIOMT3)7μg，染料木素0.15mM，ddH2O(双蒸水)补齐至100μL，pH 7.9，温度38℃。

实施例6

配制催化反应体系：反应体系以100μL计算：其中包括Tris-HCl缓冲液l80 mM，SAM(S-腺苷甲硫氨酸)1.1mM，DTT(二硫苏糖醇)5mM，MgCl21.2mM，目的蛋白(转移酶GmIOMT3)9μg，染料木素0.25mM，ddH2O(双蒸水)补齐至100μL，pH 8.2，温度36℃。

实施例7

提纯鹰嘴豆素A：将终止反应后的反应溶液减压浓缩至完全干燥后，以甲醇充分溶解，加入少量ODS反相硅胶拌样，超声振荡，使其混合均匀，减压浓缩至完全干燥，使样品完全吸附于硅胶表面；取ODS填料100g，甲醇湿法装柱直径2.0cm(可根据实际情况调整尺度)；干法上样，以“水—20％甲醇水溶液—40％甲醇水溶液—60％甲醇水溶液—100％甲醇”梯度洗脱，重点收集40％甲醇水溶液的洗脱液，经减压浓缩、真空干燥后即得鹰嘴豆素A，其HPLC含量可达到90％以上(可根据实际情况使用制备液相色谱作进一步纯化)。对纯化得到的鹰嘴豆素A减压干燥后，以氘代氯仿为溶剂测定其核磁共振氢谱、碳谱；其特征碳谱¹³CNMR：δ180.7,162.7,162.0,159.6,157.9,152.6,130.0,123.5,122.6,114.1,106.2,99.2,94.2,55.4，确证其化学结构为鹰嘴豆素A。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3及编码基因及应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1068

<212> DNA

<213> 大豆（Glycine max）

<400> 1

atggagaaag aggagagcac ggaacagcga aagcaagcga ggcttgccat tatggagctc 60

gccaacatga taagcgttcc catggcgcta aacgccgtcg ttcgcctcaa cgtcgccgac 120

gccatctggc aaggcggcgc caacaacccc ctctccgccg ctgagatcct cccccgcctc 180

cttcccgccg gcggcggcga cgccgagaac ctccagcggc tcctccggat gctggccagt 240

tacggcgtct tctacgagca cctctccgcc ggcgagcgga agtactccct caccgacgtc 300

ggcaaaacgc ttgtcaccga tgaacaaggc ctgtcgtacg cgcattacgt gctccaacac 360

caccaggatg cgttgatgag agcgtggcca atggtgcacg aggcagtagt ggaccctaca 420

aaggagccct tcgagagggc aaatggggag ccagcatatg gatactatct gaagcaccca 480

gagatgaatg acctaatggt gagggccatg tcaggggtgt cagtgccctt cattagggcc 540

atgttggagg gctatgatgg ctttcaaggt gtggagaagc ttgtggatgt gggtggtagt 600

ggcggtgatt gccttcgtat gatcttggaa aaacacccca ccatcaaaga agggatcaac 660

tttgacctac ctgaagttgt ggccaaagcc ccacaaatcc catttgtaac ccatgtgggt 720

ggtgacatgt tcaagtttat tccccaagga gatgctatct tcatgaagtg ggtgctaaca 780

acatggactg atgaagaatg caagcacata atgcagaact gtcacaaggc actccctgag 840

ggaggaaaac taatagcatg tgagccagtg ctcccggagg actcagacga gagtcacaga 900

acgagggcat tgcttgaagg tgacattttt gtgatgacaa tctacagagc caaagggaag 960

cacaggactg aagaacagtt caggcaatta gccattgatg caggcttccc tcgtttcaga 1020

gccttccatg ttgaccattt ctacactgtc cttgagtttc agaaatga 1068

<210> 2

<211> 355

<212> PRT

<213> 大豆（Glycine max）

<400> 2

Met Glu Lys Glu Glu Ser Thr Glu Gln Arg Lys Gln Ala Arg Leu Ala

1 5 10 15

Ile Met Glu Leu Ala Asn Met Ile Ser Val Pro Met Ala Leu Asn Ala

20 25 30

Val Val Arg Leu Asn Val Ala Asp Ala Ile Trp Gln Gly Gly Ala Asn

35 40 45

Asn Pro Leu Ser Ala Ala Glu Ile Leu Pro Arg Leu Leu Pro Ala Gly

50 55 60

Gly Gly Asp Ala Glu Asn Leu Gln Arg Leu Leu Arg Met Leu Ala Ser

65 70 75 80

Tyr Gly Val Phe Tyr Glu His Leu Ser Ala Gly Glu Arg Lys Tyr Ser

85 90 95

Leu Thr Asp Val Gly Lys Thr Leu Val Thr Asp Glu Gln Gly Leu Ser

100 105 110

Tyr Ala His Tyr Val Leu Gln His His Gln Asp Ala Leu Met Arg Ala

115 120 125

Trp Pro Met Val His Glu Ala Val Val Asp Pro Thr Lys Glu Pro Phe

130 135 140

Glu Arg Ala Asn Gly Glu Pro Ala Tyr Gly Tyr Tyr Leu Lys His Pro

145 150 155 160

Glu Met Asn Asp Leu Met Val Arg Ala Met Ser Gly Val Ser Val Pro

165 170 175

Phe Ile Arg Ala Met Leu Glu Gly Tyr Asp Gly Phe Gln Gly Val Glu

180 185 190

Lys Leu Val Asp Val Gly Gly Ser Gly Gly Asp Cys Leu Arg Met Ile

195 200 205

Leu Glu Lys His Pro Thr Ile Lys Glu Gly Ile Asn Phe Asp Leu Pro

210 215 220

Glu Val Val Ala Lys Ala Pro Gln Ile Pro Phe Val Thr His Val Gly

225 230 235 240

Gly Asp Met Phe Lys Phe Ile Pro Gln Gly Asp Ala Ile Phe Met Lys

245 250 255

Trp Val Leu Thr Thr Trp Thr Asp Glu Glu Cys Lys His Ile Met Gln

260 265 270

Asn Cys His Lys Ala Leu Pro Glu Gly Gly Lys Leu Ile Ala Cys Glu

275 280 285

Pro Val Leu Pro Glu Asp Ser Asp Glu Ser His Arg Thr Arg Ala Leu

290 295 300

Leu Glu Gly Asp Ile Phe Val Met Thr Ile Tyr Arg Ala Lys Gly Lys

305 310 315 320

His Arg Thr Glu Glu Gln Phe Arg Gln Leu Ala Ile Asp Ala Gly Phe

325 330 335

Pro Arg Phe Arg Ala Phe His Val Asp His Phe Tyr Thr Val Leu Glu

340 345 350

Phe Gln Lys

355

Claims

1.一种异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的编码异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3的异黄酮O-甲基转移酶基因GmIOMT3，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3的应用，其特征在于：所述异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3在制备O-甲基化异黄酮中的应用。

4.根据权利要求1所述的异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3的应用，其特征在于：所述异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3及编码基因在制备鹰嘴豆素A中的应用。

5.根据权利要求4所述的一种异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3的应用，其特征在于：鹰嘴豆素A的制备方法包括以下步骤：

(1)获取转移酶GmIOMT3蛋白质并纯化；

(2)配制催化反应体系：反应体系以100μL计算：其中包括Tris-HCl缓冲液180-220mM，SAM(S-腺苷甲硫氨酸)0.9-1.1mM，DTT(二硫苏糖醇)3-5mM，MgCl2 0.8-1.2mM，目的蛋白(转移酶GmIOMT3)7-9μg，染料木素0.15-0.25mM，ddH2O(双蒸水)补齐至100μL；

(3)在温度37℃反应30min，加入100μL乙腈终止反应；

(4)鹰嘴豆素A混合液经提纯后即得鹰嘴豆素A。

6.根据权利要求5所述的异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3的应用，其特征在于：所述催化反应体系的pH值为7.9-8.2，反应温度为36-38℃。

7.根据权利要求4所述的异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3，其特征在于：所述反应体系以100μL计算：其中包括Tris-HCl缓冲液200mM，SAM1 mM，DTT 4mM，MgCl2 2mM，目的蛋白8μg，染料木素0.2mM，ddH2O补齐至100μL。

8.根据权利要求4-7中任一项所述的异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3的应用，其特征在于：所述目的蛋白为异黄酮O-甲基转移酶GmIOMT3。