CN111718911A

CN111718911A - Diels-Alder型加合物合成代谢途径中的FAD依赖氧化酶Ma-2及应用

Info

Publication number: CN111718911A
Application number: CN201910212270.1A
Authority: CN
Inventors: 王瑞杉; 戴均贵; 王升; 郭娟; 康传志; 黄璐琦
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2039-03-20
Also published as: CN111718911B

Abstract

本发明公开了Diels‑Alder型加合物合成代谢途径中的FAD依赖氧化酶Ma‑2及应用。本发明提供了如下蛋白：SEQ ID No.4所示Ma‑2蛋白或其经一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加，或序列具99％、95％、90％、85％或者80％以上同源性且具相同功能的蛋白，或N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。本发明所提供的Ma‑2因具有FAD依赖氧化酶的特征结构域，能催化二烯体与查尔酮类化合物双键间发生[4+2]环化反应形成D‑A型加合物。本发明，对于生产D‑A型加合物及研究酶促D‑A型[4+2]环化反应机制具有重要的理论及实际意义。

Description

Diels-Alder型加合物合成代谢途径中的FAD依赖氧化酶Ma-2 及应用

技术领域

本发明涉及药用植物基因工程领域，具体涉及Diels-Alder型加合物合成代谢途径中的FAD依赖氧化酶Ma-2及应用。

背景技术

药用植物有效成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为诠释药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。

桑是我国重要的传统中药材，含有桑药用部位的中药复方达200种以上。桑叶、桑椹、桑根皮、桑枝均可入药，其中桑叶祛风清热，凉血明目；桑葚补血滋阴，生津润燥；桑白皮(桑除去栓皮的干燥根皮)清肺平喘，行水消肿；桑枝祛风湿，利关节。 20世纪70年代以来，国内外学者系统研究了白桑、山桑、鲁桑、蒙桑等桑种的化学成分，分离鉴定芳香类、多羟基生物碱类、香豆素类和三萜类等多种具有良好生物活性的化合物。其中，Diels-Alder(D-A)型加合物是桑的特征性芳香类化合物。药理实验表明这些芳香类化合物具有多种生物活性，如抗高血压、抗微生物、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抑制血小板凝聚和抗氧化等。由于D-A型加合物化学结构新颖、独特，生物活性显著且多样化，引起了全球科技工作者的共同兴趣。针对桑悬浮培养细胞的底物饲喂实验及¹³C标记实验表明，D-A型加合物为芳香类化合物的异戊烯基修饰基团经氧化酶作用形成二烯体后再与查尔酮类化合物的双键在[4+2]环化酶的作用下发生分子间环化反应形成。然而，目前上述氧化酶及[4+2]环化酶均未获得鉴定。

小檗碱桥酶(berberine bridge enzymes，BBEs)是FAD依赖氧化酶超家族中的一个重要亚家族，在细菌、真菌和植物的次级代谢产物形成过程中发挥重要作用。该家族成员催化功能与D-A型加合物生物合成涉及的氧化反应类似。例如真菌次级代谢相关小檗碱桥酶PenH被报道可催化形成二烯体结构，分离自杜鹃花(Rhododendron) 的Daurichromenicacid合成酶作用机制均与PenH类似。尤其值得注意的是分离自大麻(Cannabis)的四羟基大麻酸合成酶(THCA)反应底物及催化机制均与桑D-A型加合物生物合成相关氧化反应类似。由于大麻与桑亲缘关系接近，四羟基大麻酸合成酶对桑D-A型加合物生物合成相关氧化酶候选基因的确定具有重要参考价值。

发明内容

本发明的目的是提供Diels-Alder型加合物合成代谢途径中的FAD依赖氧化酶Ma-2及应用。

第一方面，本发明要求保护一种蛋白质。

本发明所要求保护的蛋白质来源于桑(Morus alba L.)，命名为Ma-2，具体可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、 90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

第二方面，本发明要求保护编码前文第一方面所述蛋白质的核酸分子。

进一步，所述核酸分子为编码所述蛋白质的基因；所述基因是如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA 分子；

(B3)与(B1)-(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、 85％以上或者80％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃， 1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA 的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、 0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在 65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在 65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

SEQ ID No.4(Ma-2蛋白)由550个氨基酸组成。SEQ ID No.2(Ma-2基因)由 1653个核苷酸组成，编码SEQ ID No.4所示蛋白质。

第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述表达盒由启动子、所述基因和转录终止序列顺次连接而成。

所述重组载体可为重组克隆载体也可为重组表达载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体为将所述基因插入到pPIC3.5K(Invitrogen^TM，货号：V17320)载体的多克隆位点(如EcoR I和Not I)处后得到的重组质粒。

在本发明中，所述重组菌为含有所述基因的重组酵母。进一步地，所述酵母为毕赤酵母。更加具体的，所述毕赤酵母为毕赤酵母SMD1168(Invitrogen^TM，货号： C17500)。

第四方面，本发明要求保护第一方面所述蛋白质在作为Diels-Alder型加合物合成代谢途径中的FAD依赖氧化酶中的应用。

第五方面，本发明要求保护第一方面所述蛋白质在催化二烯体与查尔酮类化合物双键间发生Diels-Alder型[4+2]环化反应形成Diels-Alder型加合物中的应用。

在本发明中，该应用具体为第一方面所述蛋白质在催化二烯体与Morachalcone A双键间发生Diels-Alder型[4+2]环化反应形成Diels-Alder型加合物Chalcomoracin中的应用。所述二烯体为Ma-1蛋白催化桑辛素C(Moracin C)的异戊烯基侧链脱氢重排形成的二烯体；所述Ma-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

第六方面，本发明要求保护第一方面所述蛋白质或第二方面所述核酸分子或第三方面所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在生产Diels-Alder型加合物中的应用。

第七方面，本发明要求保护第一方面所述蛋白质或第二方面所述核酸分子或第三方面所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备如下任一产品中的应用：

(D1)具有Diels-Alder型加合物合成代谢途径中FAD依赖氧化酶活性的产品。

(D2)能够催化二烯体与查尔酮类化合物双键间发生Diels-Alder[4+2]环化反应形成Diels-Alder型加合物的产品。在本发明中，具体为能够催化二烯体与Morachalcone A双键间发生Diels-Alder[4+2]环化反应形成Diels-Alder型加合物Chalcomoracin的产品；所述二烯体为Ma-1蛋白催化桑辛素C(Moracin C)的异戊烯基侧链脱氢重排形成的二烯体；所述Ma-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

(D3)用于生产Diels-Alder型加合物的产品。

(D4)用于研究酶促Diels-Alder[4+2]环化反应机制的产品。

在本发明中，前文所述的催化均可为20-40℃(具体如30℃)下催化。所述催化的时间可为15min(事实上反应速度极快，立即发生)。

在本发明中，所述二烯体的结构如式I所示；所述Morachalcone A的结构如式II所示；所述Chalcomoracin的结构如式III所示。

实验证明，本发明所提供的Ma-2因具有FAD依赖氧化酶的特征结构域，能催化二烯体与Morachalcone A双键间发生[4+2]环化反应形成Diels-Alder型加合物Chalcomoracin。本发明，对于生产Diels-Alder型加合物及研究酶促Diels-Alder[4+2] 环化反应机制具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为重组质粒pPIC3.5K-Ma-1和pPIC3.5K-Ma-2的PCR鉴定。1-24依次为pPIC3.5K-Ma-2的12个转化子，以及pPIC3.5K-Ma-1的12个转化子，M为DNA marker(DL2000)。

图2为反应体系中同时加入底物桑辛素(Moracin C)和Morachalcone A，含有蛋白酶Ma-1和Ma-2不同组合及空载蛋白时UPLC检测结果。

图3为反应体系中同时加入底物Moracin C和Morachalcone A且同时含有蛋白酶Ma-1和Ma-2时UPLC-TOF分析结果。

图4为反应产物Chalcomoracin紫外吸收及质谱图。

图5为反应体系中加入底物补骨脂乙素且含有蛋白酶Ma-1时UPLC-TOF分析结果。

图6为补骨脂乙素异戊烯基侧链脱氢后与邻位C-4'羟基成环的产物的质谱图。

图7为Ma-1编码的产物催化桑辛素C(Moracin C)异戊烯基侧链脱氢重排形成二烯体，催化补骨脂乙素或Morachalcone A异戊烯基侧链脱氢后与邻位C-4'羟基反应成环；Ma-2编码的产物催化二烯体与Morachalcone A双键间发生[4+2]环化反应形成 D-A型加合物Chalcomoracin。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

(桑辛素C)Moracin C：西力生物公司产品，货号BBP01975。

补骨脂乙素：西力生物公司产品，货号BBP No.：BBP02694。

Morachalcone A：西力生物公司产品，货号BBP No.：BBP01994。

毕赤酵母表达载体pPIC3.5K：(Invitrogen^TM，货号：V17320)。

毕赤酵母SMD1168：(Invitrogen^TM，货号：C17500)。

实施例1、D-A型加合物合成代谢途径FAD依赖氧化酶基因的筛选与克隆

一、D-A型加合物合成代谢途径FAD依赖氧化酶基因的筛选

以大麻(Cannabis)四羟基大麻酸合成酶(THCA)检索本实验构建的桑(Morus albaL.)转录组数据库，挑选E-Value值较低且FPKM值较高的FAD依赖氧化酶基因进行分析。

二、桑中FAD依赖氧化酶基因的克隆

1、取生长至14d的桑悬浮培养细胞，利用Trizol法提取桑的总RNA，利用invitrogen的5’RACE试剂盒对FAD依赖氧化酶基因的5’末端进行扩增，获得候选基因全长序列。

2、全长cDNA的克隆和测序

对5’RACE结果和转录组数据库中有的3’末端进行拼接，搜索ORF区域，设计用于扩增全长基因的两对引物Ma-1-F1/Ma-1-R1和Ma-2-F1/Ma-2-R1。

Ma-1-F1：5’-ATGAAGTACTTTTCATTATCTTCGTC-3’；

Ma-1-R1：5’-TTACACAAGAAGAGATGGAATGC-3’。

Ma-2-F1：5’-ATGCAGTACTTTTCCTTCCC-3’；

Ma-2-R1：5’-TCACATTGCTGAATGTAGAGG-3’。

以桑(Morus alba L.)的cDNA为模板，采用引物对Ma-1-F1/Ma-1-R1和Ma-2-F1/Ma-2-R1分别进行扩增。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果表明约在1500bp处出现特异片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收目标片段，克隆至pGEM-T easy 载体(Promega)中，鉴定阳性克隆并进行测序验证)(北京华大基因)。

测序结果显示：采用引物对Ma-1-F/Ma-1-R扩增得到了含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的DNA片段，采用引物对Ma-2-F/Ma-2-R扩增得到了含有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的DNA片段。将SEQ ID No.1所示基因命名为Ma-1基因，SEQ ID No.2 所示基因命名为Ma-2基因。SEQ ID No.1为完整开放阅读框，编码SEQ ID No.3所示蛋白质(命名为Ma-1蛋白)；SEQ ID No.2为完整开放阅读框，编码SEQ ID No.4所示蛋白质(命名为Ma-2蛋白)。

经上述步骤最终获得含有Ma-1基因(SEQ ID No.1)的重组载体pGEM-T-Ma-1，以及含有Ma-2基因(SEQ ID No.2)的重组载体pGEM-T-Ma-2。

实施例2、FAD依赖氧化酶基因真核表达及功能分析

1、酵母表达载体的构建

根据Ma-1基因(SEQ ID No.1)和Ma-2基因(SEQ ID No.2)的核苷酸序列，分别设计带有EcoR I和Not I酶切位点的两对引物Ma-1-F2/Ma-1-R2和Ma-2-F2/ Ma-2-R2。

Ma-1-F2：5’-ATCCTACGTAGAATTCAAAAATGTCT-AAGTACTTTTCATTATCTT CGTCATTTG-3’；

Ma-1-R2：5’-AATTAATTCGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATG-CACAAGAAGAGATGGAATGC-3’。

Ma-2-F2：5’-ATCCTACGTAGAATTCAAAAATGTCT-CAGTACTTTTCCTTCCCT TCAT-3’；

Ma-2-R2：5’-AATTAATTCGCGGCCGCTCAATGATGATGATGATGATG-CATTGCTGAATGTAGAGG-3’。

以实施例1所得重组载体pGEM-T-Ma-1为模板，以Ma-1-F2/Ma-1-R2为引物进行PCR扩增，然后用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切扩增产物，胶回收后与经过同样双酶切的毕赤酵母表达载体pPIC3.5K的骨架大片段相连，得到重组表达载体 pPIC3.5K-Ma-1。

以实施例1所得重组载体pGEM-T-Ma-2为模板，以Ma-2-F2/Ma-2-R2为引物进行PCR扩增，然后用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切扩增产物，胶回收后与经过同样双酶切的毕赤酵母表达载体pPIC3.5K的骨架大片段相连，得到重组表达载体 pPIC3.5K-Ma-2。

之后将连接反应体系直接转化Trans1-T1(北京全式金生物技术有限公司)

采用引物对5’AOX1/3’AOX1对重组表达载体pPIC3.5K-Ma-1转化子进行PCR鉴定；采用引物对5’AOX1/3’AOX1对重组表达载体pPIC3.5K-Ma-2转化子进行PCR鉴定。

5’AOX1：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’；

3’AOX1：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

结果如图1所示。PCR扩增阳性结果应为2000bp左右，为外源基因加部分载体片段长度。

PCR检测阳性的重组表达载体pPIC3.5k-Ma-1经测序验证后，可知其结构描述为：将“5’-AAAAATGTCT+SEQ ID No.1的第4-1641+CATCATCATCATCATCATTAA-3’”所示DNA片段插入到pPIC3.5K载体的酶切位点EcoR I和Not I之间后得到的重组质粒。PCR检测阳性的重组表达载体pPIC3.5K-Ma-2经测序验证后，可知其结构描述为：将“5’-AAAAATGTCT+SEQ IDNo.2的第4-1650+CATCATCATCAT CATCATTGA-3’”所示DNA片段插入到pPIC3.5K载体的酶切位点EcoR I和Not I之间后得到的重组质粒。

2、诱导表达

将步骤1构建的pPIC3.5K-Ma-1质粒转化表达宿主菌毕赤酵母SMD1168，利用甲醇进行诱导表达16℃180rpm诱导5天，每24h补加甲醇使培养基中甲醇终浓度为1％ (体积百分含量)，培养基10000×g离心20min去除菌体后以15mL超滤管 (

Ultra-15，10K)3000×g离心浓缩，并将培养基替换为反应缓冲液(50 mM Tric-HCl，pH 7.4、10％(体积百分含量)的甘油)得到含有Ma-1蛋白的浓缩液。

将步骤1构建的pPIC3.5K-Ma-2质粒转化表达宿主菌毕赤酵母SMD1168，利用甲醇进行诱导表达16℃180rpm诱导5天，每24h补加甲醇使培养基中甲醇终浓度为 1％(体积百分含量)，培养基10000×g离心20min去除菌体后以15mL超滤管 (

Ultra-15，10K)3000×g离心浓缩，并将培养基替换为反应缓冲液(50 mM Tric-HCl，pH 7.4、10％(体积百分含量)的甘油)得到含有Ma-2蛋白的浓缩液。

实验同时设置将pPIC3.5K空载体转化表达宿主菌毕赤酵母SMD1168的空载对照组，得到空载对照浓缩液。

后续蛋白纯化以1mL镍柱Ni-NTA(GE,USA)进行。上样后以10mL含不同浓度咪唑的缓冲液(20mM磷酸缓冲液，0.5M NaCl，50-200mM咪唑，pH 7.4)梯度洗脱获得。以15mL超滤管(

Ultra-15，10K)3000×g离心浓缩蛋白并将洗脱缓冲液置换为反应缓冲液。最终蛋白纯度>80％，Bradford法(全式金)检测浓度约为2mg/mL。

3、桑FAD依赖氧化酶的活性分析

在含有约0.1mg/mL Ma-1蛋白和/或Ma-2蛋白的缓冲体系中加入底物桑辛素C(Moracin C)，补骨脂乙素和/或Morachalcone A的不同组合进行催化反应，缓冲体系包括50mM的Tric-HCl(pH 7.4)、10％(体积分数)的甘油和100μM底物。实验同时设置空载对照组，即以步骤2所得空载对照替换反应体系中的Ma-1蛋白和Ma-2蛋白。催化反应温度30℃，15分钟。反应完全后加入三倍体积乙酸乙酯萃取催化产物，进行LC-MS分析。

LC-MS仪器为Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱系统(沃特世公司，美国)配备Waters Separations Module 2695，Waters 2996Photodiode Array Detector检测器，Waters Millennium 32工作站；Waters Q-TOF飞行时间串联质谱仪(沃特世公司，美国)。色谱条件：色谱柱为Waters BEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)。流动相A为0.05％(体积百分含量)甲酸水溶液；流动相B为含有0.05％(体积百分含量)甲酸的乙腈。梯度洗脱条件为0min，5％B；0–1min，5％–50％B；1–3min， 50％–60％B；3–4.5min，60％–70％B；4.5–5min，70％–98％B；5–6min， 98％B(％表示体积百分含量)。流速0.5mL/min，进样室温度4℃，柱温25℃。进样量3μL，检测波长190-400nm。

质谱条件：离子源为ESI源，正离子检测模式，离子源温度100℃，雾化压力206.8kPa，碰撞电压175V。雾化气温度350℃，雾化气流量10L/min，毛细管电压3500V，扫描范围m/z 50–1000。

结果显示：

桑辛素C(Moracin C)(结构式见图7)和Morachalcone A(结构式见图7)共同存在条件下，反应体系中含有蛋白酶Ma-1和/或Ma-2不同组合以及空载的UPLC图谱见图2。Moracin C在蛋白酶Ma-1催化下底物消失但无法检测到明显产物(反应体系中无Ma-2)，推测原因为Moracin C脱氢重排形成二烯体(结构式见图7)，但二烯体在反应缓冲液中无法稳定存在。Moracin C和Morachalcone A单独或共同存在时，蛋白酶Ma-2催化下底物均无任何变化(反应体系中无Ma-1)。

Moracin C和Morachalcone A共同存在条件下，向反应体系中同时加入蛋白酶Ma-1和Ma-2，生成了分子量为648(m/z)的新物质，通过分析新产物的紫外吸收与主要裂解方式，认为该产物为Moracin C异戊烯基侧链脱氢重排形成二烯体后与 Morachalcone A双键发生[4+2]反应成环的产物Chalcomoracin(结构式见图7)(图3)，产物Chalcomoracin紫外吸收及质谱图见图4。

以补骨脂乙素为底物，Ma-1蛋白催化组在总离子流图321(m/z)处有新物质产生(图5)，新物质质谱图如图6，产物鉴定为补骨脂乙素异戊烯基侧链脱氢后与邻位 C-4'羟基成环的产物。

以上结果表明：Ma-1编码的产物能够催化桑辛素C(Moracin C)异戊烯基侧链脱氢重排形成二烯体，催化补骨脂乙素或Morachalcone A异戊烯基侧链脱氢后与邻位C-4'羟基反应成环；Ma-2编码的产物能催化二烯体与Morachalcone A双键间发生[4+2] 环化反应形成D-A型加合物Chalcomoracin(见图7)。

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> Diels-Alder型加合物合成代谢途径中的FAD依赖氧化酶Ma-2及应用

<130> GNCLN190726

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1644

<212> DNA

<213> Morus alba

<400> 1

atgaagtact tttcattatc ttcgtcattt gccagaatta tcatcgttct ttattcaatt 60

tcgttagcaa attcagcgcg cactcatgaa gactttcttc aatgcctcac cactcgtata 120

tccgagaact ctaccaacac ttctaaaacc tttccctaca tcactccaaa taatccgtcg 180

tattccacta cattgaattc atccatacaa aacaaacgtt tttcttctcc ttcgacccca 240

aaaccatttg ccattatcac tccatttcat ttctcccacg ttcaagctac tgttttttgc 300

tccaagaaac atagcattca aattagaacc cgaagtggtg gccatgatta tgagggtctt 360

tcttatgtgt ccagtgtctc gtttgtccta attgacttga gaaatttaag ttcaattagt 420

gtagacgtgg agagcaaatc tgcgtgggtt caagctggag ctacactggg tgagctttat 480

tataagattg gtgagaaaag tgaaaacctt gccttccctg ctggtgattg ccattctgta 540

ggtgttggtg gacatatcag cggaggaggc tacggttact taactcgaaa atatggcctc 600

tcagctgata atgttcttga cgcgaaatta atcgatgcta aaggaagaat tcttgatcgg 660

aaatctatgg gcgaagattt gttttgggcc ttacgtggtg gtggagctgc gagcttcgga 720

atcgttcttg catggaaact tcgactggtt cctgtgccat caacagtgac tgtgtttgat 780

attaagcgga atatgagcga tgctgcaaca aagaagttcg ttcatcagtg gcaaaggcga 840

gcagacaaag tcgatgagga tctgtcaatc tacatcacat tcagaactgc gagttctatt 900

gataaagaag ggaataaaaa aattatacta gaagctctcc cccgagggac attccatggc 960

agcgtggatc ggctccttca attaatgcaa aaggagtttc ctgagttagg tttgctaaga 1020

caggagtgca ccgaaatgaa atgggtggag tcctttctct atttcaactt cttcagaaat 1080

ggagaatcct tggatgtttt acttaatagg aaatctagtt acaacgtcgc gtatttcaag 1140

gcaaaatctg accatgtgaa agagcctatt ccagatgacg tgtttgaagg aatgttggaa 1200

aagttatatg aagaagaggt aggaagtact tcgattgatg tatttcctta cggaggaaaa 1260

atgaatgaga tttcagaatc cgtaatccca ttcccacacc gagtcgggaa cctctactac 1320

atccattact tcgtgcaatg gcaagaggaa gaagtggata ttacatcacc caacaaacat 1380

ataacttggt taaaaagact ttacgattac atgactcctt atgtgtctaa aaatccaagg 1440

actgcatttt tcaatttcag agaccttgat cttgggatgg ataacaacaa ggatggcaac 1500

acttataaca atatttctca tgcaagcatt tggggcacca agtatttcaa gagtaatttc 1560

aataggttgg ttcgtgtaaa gactatagtt gatccaacta atttctttac aaacgaacaa 1620

agcattccat ctcttcttgt gtaa 1644

<210> 2

<211> 1653

<212> DNA

<213> Morus alba

<400> 2

atgcagtact tttccttccc ttcatcgtta gccaaaatca ccatctttct gatcttttca 60

tttgtattcg caagttcagc taacgacact catgaagcct ttcttgagtg cctgaccact 120

cgtataccct ccaactccac cttcaccccg caatccatca tctacactcc agataatccg 180

tcgtattcaa ctatattgga ttcaacgact caaaatcctc gttttctttc ttcttcgaca 240

agaaatccat ttgccatcat cacaccactt cacgcctccc acatacaagc cgctctttat 300

tgttcccaga aacatggcga gcagatgaga atccgaagcg gcggccatga ttatgaaggc 360

ctttcttacc agtccagtgt gccgtttttc atacttgact tgagaaactt gagttctatt 420

agtattgacg cgaagagcaa gtctgcgtgg gttcaggccg gagcgacgat tggtgaactt 480

tattatggga tagctaaaac gagcctgaat cttagctttc ccggcggcgt tgctcacact 540

atcggcgttg ggggacagtt aggtggagga ggctatggct attcgacgag aaaatatggg 600

ctcgcgtccg ataacgtcat cgacgcacag ttaatcgatg ctcgaggaag aattctcgat 660

cgaaaaacca tgggggaaga tttgttttgg gccatccgcg gtggtggagc gggaagcttc 720

ggaatcgttc ttgcctggaa aattcgcctt gttaacacac catcgacagt gactatattt 780

gaagccgtga ggagttggga aaacaataca acaaaaaagt tcatccgtcg atatcaacgt 840

cgcgcttcca aaaccgataa ggatctaacc atcttcgtcg gattccgaac tacgagttct 900

acagatgaag aagggaatga gagaatttca atactaacta tcgtctcggc cacattccac 960

ggcagcaagg ataggctcct tcagttagtg caaaaggagt ttcccgactt gggtttggtt 1020

agtgaagagt gcaccgaaat gtcatgggtt cgatccatta tccatttcaa tttattcggg 1080

gacgaagtac ccttggaggt tctactcaat agaacgctca atttcgaaat gaaggctttt 1140

aaattgagat ctgactatgt acaaaagcct attccagatg acgtgttaga aaaattattg 1200

agtaagttgt atgatgaaga gacaggagaa ggttacatcg aattttttcc ttatggagga 1260

aaaatgagta agatttcaga atctgaaatc ccgttcccat accgagccgg aaacctctac 1320

aaccttcggt acatggtgtc atggaaggat gatggaaaca ttacaagaac caacatgcat 1380

cttagctgga taaaagatgc ttacgattac atgacacctt acgtgtcaaa agatccgagg 1440

ggcgcatatc tgaacttcag agatctcgac atcggagtta atgtcaatga gagcgactac 1500

gattacgtcg cgaaagcaag cgtttggggt actaagtatt ttaggaataa tttttataga 1560

ttagttgata taaagacaat agttgatcca actaatttct ttaaatacga gcaaagtatc 1620

ccacctcttc ctcctctaca ttcagcaatg tga 1653

<210> 3

<211> 547

<212> PRT

<213> Morus alba

<400> 3

Met Lys Tyr Phe Ser Leu Ser Ser Ser Phe Ala Arg Ile Ile Ile Val

1 5 10 15

Leu Tyr Ser Ile Ser Leu Ala Asn Ser Ala Arg Thr His Glu Asp Phe

20 25 30

Leu Gln Cys Leu Thr Thr Arg Ile Ser Glu Asn Ser Thr Asn Thr Ser

35 40 45

Lys Thr Phe Pro Tyr Ile Thr Pro Asn Asn Pro Ser Tyr Ser Thr Thr

50 55 60

Leu Asn Ser Ser Ile Gln Asn Lys Arg Phe Ser Ser Pro Ser Thr Pro

65 70 75 80

Lys Pro Phe Ala Ile Ile Thr Pro Phe His Phe Ser His Val Gln Ala

85 90 95

Thr Val Phe Cys Ser Lys Lys His Ser Ile Gln Ile Arg Thr Arg Ser

100 105 110

Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Val Ser Ser Val Ser Phe

115 120 125

Val Leu Ile Asp Leu Arg Asn Leu Ser Ser Ile Ser Val Asp Val Glu

130 135 140

Ser Lys Ser Ala Trp Val Gln Ala Gly Ala Thr Leu Gly Glu Leu Tyr

145 150 155 160

Tyr Lys Ile Gly Glu Lys Ser Glu Asn Leu Ala Phe Pro Ala Gly Asp

165 170 175

Cys His Ser Val Gly Val Gly Gly His Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Gly

180 185 190

Tyr Leu Thr Arg Lys Tyr Gly Leu Ser Ala Asp Asn Val Leu Asp Ala

195 200 205

Lys Leu Ile Asp Ala Lys Gly Arg Ile Leu Asp Arg Lys Ser Met Gly

210 215 220

Glu Asp Leu Phe Trp Ala Leu Arg Gly Gly Gly Ala Ala Ser Phe Gly

225 230 235 240

Ile Val Leu Ala Trp Lys Leu Arg Leu Val Pro Val Pro Ser Thr Val

245 250 255

Thr Val Phe Asp Ile Lys Arg Asn Met Ser Asp Ala Ala Thr Lys Lys

260 265 270

Phe Val His Gln Trp Gln Arg Arg Ala Asp Lys Val Asp Glu Asp Leu

275 280 285

Ser Ile Tyr Ile Thr Phe Arg Thr Ala Ser Ser Ile Asp Lys Glu Gly

290 295 300

Asn Lys Lys Ile Ile Leu Glu Ala Leu Pro Arg Gly Thr Phe His Gly

305 310 315 320

Ser Val Asp Arg Leu Leu Gln Leu Met Gln Lys Glu Phe Pro Glu Leu

325 330 335

Gly Leu Leu Arg Gln Glu Cys Thr Glu Met Lys Trp Val Glu Ser Phe

340 345 350

Leu Tyr Phe Asn Phe Phe Arg Asn Gly Glu Ser Leu Asp Val Leu Leu

355 360 365

Asn Arg Lys Ser Ser Tyr Asn Val Ala Tyr Phe Lys Ala Lys Ser Asp

370 375 380

His Val Lys Glu Pro Ile Pro Asp Asp Val Phe Glu Gly Met Leu Glu

385 390 395 400

Lys Leu Tyr Glu Glu Glu Val Gly Ser Thr Ser Ile Asp Val Phe Pro

405 410 415

Tyr Gly Gly Lys Met Asn Glu Ile Ser Glu Ser Val Ile Pro Phe Pro

420 425 430

His Arg Val Gly Asn Leu Tyr Tyr Ile His Tyr Phe Val Gln Trp Gln

435 440 445

Glu Glu Glu Val Asp Ile Thr Ser Pro Asn Lys His Ile Thr Trp Leu

450 455 460

Lys Arg Leu Tyr Asp Tyr Met Thr Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro Arg

465 470 475 480

Thr Ala Phe Phe Asn Phe Arg Asp Leu Asp Leu Gly Met Asp Asn Asn

485 490 495

Lys Asp Gly Asn Thr Tyr Asn Asn Ile Ser His Ala Ser Ile Trp Gly

500 505 510

Thr Lys Tyr Phe Lys Ser Asn Phe Asn Arg Leu Val Arg Val Lys Thr

515 520 525

Ile Val Asp Pro Thr Asn Phe Phe Thr Asn Glu Gln Ser Ile Pro Ser

530 535 540

Leu Leu Val

545

<210> 4

<211> 550

<212> PRT

<213> Morus alba

<400> 4

Met Gln Tyr Phe Ser Phe Pro Ser Ser Leu Ala Lys Ile Thr Ile Phe

1 5 10 15

Leu Ile Phe Ser Phe Val Phe Ala Ser Ser Ala Asn Asp Thr His Glu

20 25 30

Ala Phe Leu Glu Cys Leu Thr Thr Arg Ile Pro Ser Asn Ser Thr Phe

35 40 45

Thr Pro Gln Ser Ile Ile Tyr Thr Pro Asp Asn Pro Ser Tyr Ser Thr

50 55 60

Ile Leu Asp Ser Thr Thr Gln Asn Pro Arg Phe Leu Ser Ser Ser Thr

65 70 75 80

Arg Asn Pro Phe Ala Ile Ile Thr Pro Leu His Ala Ser His Ile Gln

85 90 95

Ala Ala Leu Tyr Cys Ser Gln Lys His Gly Glu Gln Met Arg Ile Arg

100 105 110

Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Gln Ser Ser Val Pro

115 120 125

Phe Phe Ile Leu Asp Leu Arg Asn Leu Ser Ser Ile Ser Ile Asp Ala

130 135 140

Lys Ser Lys Ser Ala Trp Val Gln Ala Gly Ala Thr Ile Gly Glu Leu

145 150 155 160

Tyr Tyr Gly Ile Ala Lys Thr Ser Leu Asn Leu Ser Phe Pro Gly Gly

165 170 175

Val Ala His Thr Ile Gly Val Gly Gly Gln Leu Gly Gly Gly Gly Tyr

180 185 190

Gly Tyr Ser Thr Arg Lys Tyr Gly Leu Ala Ser Asp Asn Val Ile Asp

195 200 205

Ala Gln Leu Ile Asp Ala Arg Gly Arg Ile Leu Asp Arg Lys Thr Met

210 215 220

Gly Glu Asp Leu Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Ala Gly Ser Phe

225 230 235 240

Gly Ile Val Leu Ala Trp Lys Ile Arg Leu Val Asn Thr Pro Ser Thr

245 250 255

Val Thr Ile Phe Glu Ala Val Arg Ser Trp Glu Asn Asn Thr Thr Lys

260 265 270

Lys Phe Ile Arg Arg Tyr Gln Arg Arg Ala Ser Lys Thr Asp Lys Asp

275 280 285

Leu Thr Ile Phe Val Gly Phe Arg Thr Thr Ser Ser Thr Asp Glu Glu

290 295 300

Gly Asn Glu Arg Ile Ser Ile Leu Thr Ile Val Ser Ala Thr Phe His

305 310 315 320

Gly Ser Lys Asp Arg Leu Leu Gln Leu Val Gln Lys Glu Phe Pro Asp

325 330 335

Leu Gly Leu Val Ser Glu Glu Cys Thr Glu Met Ser Trp Val Arg Ser

340 345 350

Ile Ile His Phe Asn Leu Phe Gly Asp Glu Val Pro Leu Glu Val Leu

355 360 365

Leu Asn Arg Thr Leu Asn Phe Glu Met Lys Ala Phe Lys Leu Arg Ser

370 375 380

Asp Tyr Val Gln Lys Pro Ile Pro Asp Asp Val Leu Glu Lys Leu Leu

385 390 395 400

Ser Lys Leu Tyr Asp Glu Glu Thr Gly Glu Gly Tyr Ile Glu Phe Phe

405 410 415

Pro Tyr Gly Gly Lys Met Ser Lys Ile Ser Glu Ser Glu Ile Pro Phe

420 425 430

Pro Tyr Arg Ala Gly Asn Leu Tyr Asn Leu Arg Tyr Met Val Ser Trp

435 440 445

Lys Asp Asp Gly Asn Ile Thr Arg Thr Asn Met His Leu Ser Trp Ile

450 455 460

Lys Asp Ala Tyr Asp Tyr Met Thr Pro Tyr Val Ser Lys Asp Pro Arg

465 470 475 480

Gly Ala Tyr Leu Asn Phe Arg Asp Leu Asp Ile Gly Val Asn Val Asn

485 490 495

Glu Ser Asp Tyr Asp Tyr Val Ala Lys Ala Ser Val Trp Gly Thr Lys

500 505 510

Tyr Phe Arg Asn Asn Phe Tyr Arg Leu Val Asp Ile Lys Thr Ile Val

515 520 525

Asp Pro Thr Asn Phe Phe Lys Tyr Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu Pro

530 535 540

Pro Leu His Ser Ala Met

545 550

Claims

1.蛋白质，为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为基因；所述基因是如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(B3)与(B1)-(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为含有权利要求2或3所述核酸分子的重组酵母；

进一步地，所述酵母为毕赤酵母。

6.权利要求1所述蛋白质在作为Diels-Alder型加合物合成代谢途径中的FAD依赖氧化酶中的应用。

7.权利要求1所述蛋白质在催化二烯体与查尔酮类化合物双键间发生Diels-Alder型[4+2]环化反应形成Diels-Alder型加合物中的应用；

进一步地，所述查尔酮类化合物为Morachalcone A；所述Diels-Alder型加合物为Diels-Alder型加合物Chalcomoracin。

8.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在生产Diels-Alder型加合物中的应用。

9.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备如下任一产品中的应用：

(D1)具有Diels-Alder型加合物合成代谢途径中FAD依赖氧化酶活性的产品；

(D2)能够催化二烯体与查尔酮类化合物双键间发生Diels-Alder型[4+2]环化反应形成Diels-Alder型加合物的产品；

进一步地，所述查尔酮类化合物为Morachalcone A；所述Diels-Alder型加合物为Diels-Alder型加合物Chalcomoracin；

(D3)用于生产Diels-Alder型加合物的产品；

(D4)用于研究酶促Diels-Alder型[4+2]环化反应机制的产品。

10.根据权利要求7或9所述的应用，其特征在于：所述二烯体的结构如式I所示；和/或

所述Morachalcone A的结构如式II所示；和/或

所述Chalcomoracin的结构如式III所示；