CN113557241A

CN113557241A - 大麻素前体的生产

Info

Publication number: CN113557241A
Application number: CN202080020312.2A
Authority: CN
Inventors: J·霍芬克; J·托池
Original assignee: Bibeting Crop Science Co ltd
Current assignee: Bibeting Crop Science Co ltd
Priority date: 2019-03-12
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2021-10-26
Also published as: EP3938382A1; US20220154197A1; WO2020182866A1; CA3133152A1

Abstract

公开了用于瞬时转化植物以产生Δ9‑四氢大麻酚酸合酶、大麻二酚酸合酶和/或大麻环萜酚酸合酶的核酸分子。所述核酸分子对应于包含以下编码多肽的核苷酸序列片段中至少其一的核苷酸序列，所述核苷酸序列片段与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少78％的序列同一性或包含核苷酸序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的至少15个连续核苷酸。所述核苷酸序列还包含用于将核苷酸序列靶向内质网的KDEL或HDEL驻留标签。还涉及包含所述核酸分子的病毒载体，以及基于所述核酸序列在宿主植物中瞬时表达来生产THCAS、CBDAS、CBCAS、THCA、CBDA、CBCA、THC、CBD和/或CBC的方法。

Description

大麻素前体的生产

发明领域

本发明涉及大麻素生产领域。更具体地说，本发明涉及在瞬时转化植物中生产大麻素前体例如Δ9-四氢大麻酚酸合酶(THCAS)、大麻二酚酸合酶(CBDAS)和/或大麻环萜酚酸合酶(CBCAS)的方法，以及促进这种瞬时表达的构建体。

背景技术

大麻素是化学上属于萜酚类的一组C₂₁化合物。大麻素在人类(称为“内源性大麻素”)和几种植物(称为“植物大麻素”)中天然产生，植物包括大麻(Cannabis Sativa)。例如，它们可见于普通大麻(C.sativa L.)的腺毛所产生的树脂中。已知的420多种大麻成分中，超过60种属于大麻素。大麻素聚积于腺毛中，占表皮下分泌物的80％以上。一般来说，这些物质可以存在于植物除种子之外的所有部位。大麻素与特定的大麻素受体及其他靶分子结合来调节广泛的生理过程，如神经递质释放。

在大麻属植物中，大麻素通过植物的代谢以羧酸的形式产生。然而，在大麻中发现了一系列其他类型的大麻素。为了清楚地讨论大麻素的植物化学成分，方便起见，可以将其分为三类：酸性大麻素；中性大麻素；和“人工产品”。大麻素的这一实践分类如图1所示。.

大麻素组内的一个重要区分是所谓的酸性大麻素与中性大麻素。因此，在新鲜植物材料中几乎找不到中性大麻素，但理论上所有大麻素都以所述酸性形式存在。在光、热或长期储存的影响下，经由相对不稳定的羧基以二氧化碳形式流失，可以将其转化为脱羧类似物。

酸性大麻素类包括多种结构。在典型的药物型大麻属植物中最常见的酸性大麻素类型是THCA、CBDA、CBGA和CBCA。这些酸可通过脱羧转化为中性对应物，分别形成THC、CBD、CBG和大麻环萜酚(CBC)。所述转换可例如以下所示：

由于降解条件而产生的大麻素值得特别注意，因为它们的存在主要是生长、收获、加工、储存和使用所有阶段中可变且不可预测的状况的结果。结果，组成明确的大麻(Cannabis)制剂可能会迅速转变为生物效应显著不同的产物。THC降解形成CBN和Δ-8-THC，而THCA可进一步降解为CBNA。

大麻素被证明具有多种有益的医药/治疗效果，因此，它们是一个活跃的研究领域，可用于各种疾病和/或镇痛用医药产品。

目前，药用大麻素的生产是通过化学合成或从生产这些大麻素的植物例如大麻(Cannabis sativa)中提取大麻素。然而，大麻素的现有生产方法存在一些缺点。

合成大麻素包括制药业高度开发的为治疗性药物应用而设计的药物。此类产品的目的通常是从天然大麻(cannabis)中获益，并将其转化为可稳定生产的合成药。这样，更容易满足处方药的律法要求，这通常在成分和浓度上要求高纯度和高一致性。虽然整株大麻(cannabis)常被用来发挥其天然的治疗性能，但其品种和变异如此之多，以至于在大多数国家使其通过管理处方药核准的监管程序会有难度。另一方面，合成药很容易高一致性、高纯度地复制。制药行业所需的纯度水平反映在以下事实上：尚没有基于植物提取物的大麻素生产工艺获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准，而一些合成化合物已获得批准。

然而，与从天然植物中提取大麻素相比，各种大麻素的化学合成是一个昂贵的过程。大麻素的化学合成还可能涉及使用不环保的化学品。环境影响可视为生产的额外成本，进一步降低了本已不太理想的经济成本效益。现有化学合成方法可能依赖于复杂的多步骤合成，由此导致产率低和生产成本高。此外，发现各种合成大麻素的药理活性不如从大麻(Cannabis Sativa)等植物中提取的大麻素。因此，本领域需要替代现有化学合成的方法，即就医药应用而言更具成本效益、更环保且更有效。

与大麻素的合成化学生产不同，有其他方法基于天然产生大麻素的植物来生产大麻素。为此目的最常用的植物是大麻(Cannabis Sativa)。大麻是一种典型的栽培植物。在开花周期中，植株自然产生各种大麻素。然后可以收获植株以获取大麻素。可以直接从植物本身摄取大麻素用于医疗目的，或者可以从收获的植物材料中提取大麻素。本领域已知有多种方法从大麻植物材料中提取大麻素。这些方法通常包括将含有大麻素的植物材料置于选择性溶解大麻素的化学溶液中。可采用各种合适的化学溶液，如己烷、乙醇和丁烷。冷水萃取法和亚临界或超临界CO₂萃取方法也是本领域已知的。因此，可以分离出含大麻素的化学溶液，留下多余的植物材料。然后可进一步处理含大麻素的溶液以供使用。

由大麻(Cannabis Sativa)等植物中天然生产和提取大麻素有一些缺点。由于大麻产生多种大麻素，因此通常很难通过提取工艺再现植物特定的大麻素特征。此外，植物基因型和/或表型以及环境条件的变化可能导致生长改变，并可能导致植物材料中大麻素水平差异，从而使再现性提取变得困难。需要说明的是，就药用而言，通常要求具备一致性的终端产品。不同的大麻素特征可能具有不同的药物作用，这对于药物产品来说是不可接受的。此外，从大麻(Cannabis Sativa)提取物中提取大麻素似乎不可避免地会产生大麻素混合物，而不是高纯度的单一药物化合物。例如，由于许多大麻素在结构上非常相似，因此很难将这些混合物纯化到高水平纯度，造成例如终端产品的大麻素染杂。

生物技术研究正在积极研究大麻素生产的其他方法。与植物生产大麻素相比，使用异源宿主系统生产可以有多项潜在优势，例如良好的工艺可扩展性以实现更高的时空产率，高度可控和标准化的工艺，例如符合良好生产规范(GMP)，以及供应管理，以及降低非法使用或生产的风险。此外，THCAS、CBDAS和CBCAS酶使用相同的底物进行转化。因此，建立能够产生CBGA的底盘菌株将允许根据底盘菌株表达这些大麻素生产酶的哪些基因来定制生产不同的大麻素或大麻素组合物，。许多公司目前正试图在酵母中生产大麻素，例如使用专属方法。通常，这些方法至少在概念上的基础或启示来自Luo等的“大麻素及其非天然类似物在酵母中的完全生物合成(Complete biosynthesis of cannabinoids and theirunnatural analogues in yeast)”，Nature 567，pp.123–126(https://doi.org/10.1038/s41586-019-0978-9)。

Xiaozhou Luo、Jay Keasling及其同事的这一方法中，将一系列基因改变引入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。通过调整酵母基因并插入细菌和大麻植物(cannabis)的其他基因，该团队创造了一种能够进行大麻素生产所涉全部化学反应的生物体。正如Keasling所说，由于大麻素路径中的酶“有点稀松”，该团队还可以引入脂肪酸，酵母将这些脂肪酸纳入到大麻素中，得到自然界中没有的THC和CBD的派生变体。然而，按照报告的产量，该平台尚不具备商业化的吸引力。仍然需要显著改善酵母的效率和发酵方案，以获得与植物提取大麻素具有成本竞争力的生物合成方法。

将酵母转化为大麻素微工厂仍然是有相当大的难度。尽管上述已知方案涉及16种基因修饰，但该程序的整体效率存在瓶颈制约：CBG生产所需的酶。大约十年前，研究人员在一种医用大麻中发现了被称为异戊烯基转移酶的酶。然而，在酵母中利用这种大麻衍生酶却不成功，即酵母不产生CBG。在另一种大麻中发现了异戊烯基转移酶的替代者。将该替代者引入酵母时，研究人员能够生产CBG及其衍生物。然而，产量仍然很低，因此这个仍然需要16种基因修饰的方法在经济上未必可行。

发明内容

本发明实施方式的目的之一是提供用于或涉及在瞬时转化植物(例如本氏烟草(Nicotiana Benthamiana)植株)中生产大麻素前体酶的高效、可再现、安全、简单、环保且/或成本效益高的手段和方法。

本发明实施方式的优势之一是，大麻素前体酶可由生物材料以可再现和/或稳定的方式和/或工业规模来生产，例如以易于扩展的工艺且/或足够高的产率。

本发明实施方式的优势之一是，提供了一种成本效益高、环保且/或更高效的替代手段，以替代传统的田间或温室栽培和/或工业规模的化学合成来生产具有产业价值的大麻素前体酶。

本发明实施方式的优势之一是，可实现生产大麻素前体酶的高生产效率，不存在大麻传统田间或温室中栽培时间等限制因素。例如，瞬时转化的本氏烟草植株可在种植的5周和渗透后的另外7天内产生大麻素前体酶，而传统大麻栽培则为90至135天(自开花(autoflowering)物种为90天)。这代表了约3倍高的THC(a)、CBD(a)和/或CBC(a)生产速度。此外，THC(a)、CBD(a)和/或CBC(a)可作为基础通过降解或异构化转化生产其他大麻素。

本发明实施方式的优势之一是，可以克服或减轻用于生产大麻素前体酶的现有方法的一个或多个缺点，例如前文概述的那些方法及其缺点。

本发明实施方式的优势之一是，可利用价廉且易得的植物物种例如野生型本氏烟草作为获得所述一种或多种大麻素前体的平台，此类物种合适且有效的栽培方法是众所周知的。此类植物可用于经济可行且快速大规模地生产大麻素生物合成相关酶。

本发明实施方式的优势之一是，可以通过ER(内质网)定位来利用编码催化剂的THCAS、CBDAS和CBCAS在本氏烟草中的模块化。

本发明实施方式的优势之一是，可以减少或避免限制大麻素路径关键酶活性的糖修饰，例如酵母中蛋白质上的糖附着，此类糖修饰会造成产率低下。

本发明实施方式的优势之一是，可以减少或避免大麻素对宿主的毒性。例如，酵母或大肠杆菌等生物可能受大麻素毒性伤害。可以认为，通常情况下，这些分子可能是植物中进化形成的抵御虫害、微生物和其他生物威胁的防御机制。这意味着，对于被设计用来制造它们的生物体而言，这些化学物质往往会造成致命伤害。采用近似的植物品种可以减少甚至避免此类问题。

如本发明实施方式所述的方法、病毒载体和/或核酸分子实现了上述目的。

第一方面中，本发明涉及用于瞬时转化植物以产生Δ9-四氢大麻酚酸合酶(THCAS)和/或大麻二酚酸合酶(CBDAS)和/或大麻环萜酚酸合酶(CBCAS)的核酸分子，例如分离的核酸分子。所述核酸分子对应于核苷酸序列，例如下文所述的核苷酸序列。“对应于”可表示核酸分子由所述核苷酸序列或其直接等同体编码(例如直接编码)，例如核酸分子由所述核苷酸序列的密码子简并等同体编码，和/或由所述核苷酸序列的反向和/或互补序列编码，和/或由所述核苷酸序列的密码子简并等同体的反向和/或互补序列、和/或其同源体(homolog)(同源编码序列)编码。

所述核苷酸序列包括以下至少其一：(例如作为催化核苷酸序列片段)

i)编码多肽(其可具有THCAS活性)的核苷酸序列片段，与SEQ ID NO:4(或SEQ IDNO:4的反向和/或互补序列)具有至少(例如高于)

例如约：78％、优选至少82％、优选至少96％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％或完全序列同一性；

ii)包含核苷酸序列SEQ ID NO:4(或SEQ ID NO:4的反向和/或互补序列)的至少(或约)15个连续核苷酸的核苷酸序列片段；

iii)编码多肽(其可具有CBDAS活性)的核苷酸序列片段，与SEQ ID NO:5(或SEQID NO:5的反向和/或互补序列)具有至少(例如高于)

iv)包含核苷酸序列SEQ ID NO:5(或SEQ ID NO:5的反向和/或互补序列)的至少(或约)15个连续核苷酸的核苷酸序列片段；

v)编码多肽(具有CBCAS活性)的核苷酸序列片段，与SEQ ID NO:

6(或SEQ ID NO:6的反向和/或互补序列)具有至少(例如高于)例如约：

78％、优选至少82％、优选至少96％、例如至少98％、例如至少99％、例

如100％或完全序列同一性；以及

iv)包含核苷酸序列SEQ ID NO:6(或SEQ ID NO:6的反向和/或互补序列)的至少(或约)15个连续核苷酸的核苷酸序列片段。

术语“片段”不一定表示其意指的序列部分只是某较大序列的一部分，例如，片段可以指SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6全序列，或甚至不只包括(任何)所述序列。

核苷酸序列还可包含KDEL或HDEL驻留标签，这样，举例来说，KDEL或HDEL驻留标签被转录至核苷酸序列所编码蛋白质的C端，用来将核苷酸序列靶向内质网。例如，如本领域所知，此类KDEL驻留标签可编码靶肽(target peptide)序列Lys-Asp-Glu-Leu。例如，如本领域所知，此类HDEL驻留标签可编码靶肽序列His-Asp-Glu-Leu。

如本发明实施方式所述的核酸分子还可包含多组氨酸(poly-his)标签，例如编码至少2个(例如至少6个、例如6个、例如至少8个)组氨酸的标签，或用于促进纯化的其他纯化标签。纯化标签可置于核酸分子的核酸序列内，编码相应蛋白质C端的poly-his或本领域所知的其他纯化标签。

如本发明实施方式所述的核酸分子可偶联(例如可包含)至少一个异源部分和/或至少一个接头和/或至少一个信号序列和/或至少一个检测标记(或可包含编码上述特征中任何一项或多项的核苷酸序列片段)。

例如，核酸分子可包含相应宿主植物物种的至少一个信号序列，所述宿主例如烟草(例如本氏烟草或普通烟草)的pr1a。可采用其他宿主植物物种的信号序列，例如拟南芥(Arabidopsis Thaliana)、大麦(Hordeum Vulgare)、水稻(Oryza Sativa)、马铃薯(Solanum Tuberosum)和/或其他植物。例如，信号序列可包括普通烟草PR-1a信号肽编码序列(见例如UniprotKB id Q40557，条目版本66，序列版本1，最后一次序列更新1996年11月1日；例如仅其信号肽部分：序列第1-30位)，例如添加到N端。此类信号序列的其他例子包括：

-水稻：MASSSSRLSC CLLVLAAAAM AATA(UniprotKB登录id A0N0C1，TrEMBL序列版本1，录入日期：2020-02-26，测序日期2006-12-12)；

-拟南芥：MKIFNSSQNL FLAITFFLVL IVHLKA(UniprotKB Q39188，TrEMBL序列版本1，录入日期：2020-02-26，测序日期1996-11-01)；

-大麦：致病相关蛋白4-MAARLMLVAA LLCAATAMAT A(UniprotKB P93180，TrEMBL序列版本1，录入日期：2019-12-11，测序日期1997-05-01)；

-马铃薯：致病相关蛋白STH-2-MGVTSYTHET TTPIAPTRLF KALVV(UniprotKBP17642，Swiss-Prot序列版本1，录入日期：2020-02-26，测序日期1990-08-01)。

如本发明实施方式所述的核酸分子可包含或对应于核苷酸序列SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或其任何组合(或是其直接对等体)。

第二方面中，本发明涉及包含如本发明第一方面实施方式所述核酸分子的病毒载体。

如本发明实施方式所述的病毒载体还可包含用于去糖基化的另外的核苷酸序列，例如细菌PNGase F基因序列(见例如UniprotKB id P21163，条目版本107，序列版本2，最后一次序列更新1991年11月1日)。

如本发明实施方式所述的病毒载体中，所述核苷酸序列和/或所述另外的核苷酸序列可以是进行了本氏烟草或普通烟草密码子优化的。所述另外的核苷酸序列和所述核苷酸序列可以整合在一个序列中。

然而，不一定排除其他宿主植物。例如，(且可选地)所述核苷酸序列和/或另外的核苷酸序列可以针对不同物种进行了密码子选用指数优化，如本领域技术人员能理解的。其他说明性植物物种可包括：拟南芥(Arabidopsis Thaliana)、大麦(Hordeum Vulgare)、水稻(Oryza Sativa)、马铃薯(Solanum Tuberosum)和/或其他植物，优选易生长和/或易栽培的物种。

第三方面中，本发明涉及生产Δ9-四氢大麻酚酸合酶(THCAS)和/或大麻二酚酸合酶(CBDAS)和/或大麻环萜酚酸合酶(CBCAS)的方法。所述方法包括用本发明第一方面实施方式所述的核酸分子瞬时转化植物。所述方法包括从获自所述瞬时转化植物的植物生物质中提取THCAS和/或CBDAS和/或CBCAS。

核酸分子包括HDEL或优选KDEL驻留标签，用于将催化核苷酸序列片段i)、ii)、iii)、iv)、v)和/或vi)重定向至宿主植物例如本氏烟草或普通烟草属的内质网(ER)。因此，所述方法能实现ER/质外体靶向以获得活性THCAS和/或CBDAS和/或CBCAS。翻译后修饰如内质网中的糖基化可能有助于酶的正确折叠，因为蛋白质的去糖基化至少不会对活性产生负面影响，因此也不会对原生酶的稳定性产生负面影响。

如本发明实施方式所述的方法中，所述植物可以是本氏烟草或普通烟草。植物(表达宿主)可以是任何野生型本氏烟草栽培品种。本发明的范围还包括采用永久转化、表达TCHAS、CBDAS或CBCAS基因的转基因本氏烟草或普通烟草相关物种。

优势之一是，如本发明实施方式所述的方法可显著减少生产时间，例如与从大麻生物质中提取和/或纯化THCA、CBDA和/或CBCA的传统方法相比，例如减少多达70％。

如本发明实施方式所述的方法可包括过滤和/或纯化提取的THCAS和/或CBDAS和/或CBCAS，例如用色谱法。

如本发明实施方式所述的方法中，色谱法可包括固定化金属亲和螯合色谱。

如本发明实施方式所述的方法中，植物还可例如同时瞬时转化以(共)表达去糖基化序列，用于获得没有糖基化的THCA和/或CBDA和/或CBCA表达，例如用于确保所需蛋白质的稳定性。

如本发明实施方式所述的方法可包括用如本发明第二方面实施方式所述的病毒载体将核苷酸序列导入至少一种根癌农杆菌菌株。

如本发明实施方式所述的方法可包括将所述植物暴露于所述至少一种根癌农杆菌菌株，例如用所述菌株感染所述植物。

如本发明实施方式所述的方法中，所述至少一种根癌农杆菌菌株可包括根癌农杆菌多菌株(例如高产株)组合来提高转染率，所述多菌株组合包含或由以下菌株组成：GV3101，C58C1和LBA4404以及野生型菌株A4、At06、At10和At77。

第四方面中，本发明涉及生产Δ9-四氢大麻酚酸(THCA)和/或大麻二酚酸(CBDA)和/或大麻环萜酚酸(CBCA)的方法，包括如本发明第三方面实施方式所述的方法。

所述方法包括：

-通过CBGA的氧化环化而不羟化将(例如纯化的)THCAS转化为THCA，例如通过将CBGA加入上清液中孵育6至8小时；

-通过CBGA的氧化环化而不羟化将(例如纯化的)CBDAS转化为CBDA，例如通过将CBGA加入上清液中孵育6至8小时；

-通过CBGA的氧化环化而不羟化将(例如纯化的CBCAS转化为CBCA，例如通过将CBGA加入上清液中孵育6至8小时；

由此获得的THCA、CBDA和/或CBCA可以其酸性形式(例如按其原样)用于药物类应用。

所述方法还可包括对所得THCA、CBDA和/或CBCA进行脱羧以分别获得THC、CBD和/或CBC。

所得THCA、CBDA和/或CBCA可作为基础用于生物合成其他大麻素，例如通过降解和/或异构化。

独立权利要求和从属权利要求描述了本发明的具体特征和优选特征。从属权利要求的特征可以适当地与独立权利要求的特征以及其他从属权利要求的特征相结合，而不限于权利要求中明确表述的。

以上发明内容概述和后文的附图详述和具体实施方式详细描述都是示例性和解释性的，并且旨在为权利要求所述的发明提供进一步的解释。本领域技术人员将能从本发明的以下详细描述中看出其他目的、优点和创新特征。

附图说明

图1显示大麻素的分类及其生产过程，用来说明与本发明实施方式相关的概念。

图2显示，如本发明实施方式所述的，PR-1A/THCAS/PNGASE-F/ER/6XHIS构建体的载体图谱。

图3显示，如本发明实施方式所述的，PR-1A/CBDAS/PNGASE-F/ER/6XHIS构建体的载体图谱。

图4显示，如本发明实施方式所述的，PR-1A/CBCAS/PNGASE-F/ER/6XHIS构建体的载体图谱。

图5显示CBCAS的信号肽序列预测，用于说明本发明的实施方式。

附图是示意性的，没有限定性。附图中的元素不一定按比例显示。本发明不局限于附图所示的本发明具体实施方式。

具体实施方式

尽管下文描述了示例性实施方式，但本发明仅由权利要求来限定。因此，将权利要求明确包括在此处的具体说明部分，其中，每项权利要求以及权利要求从属关系所允许的每种权利要求组合方式各自构成本发明的各种实施方式。

所用原材料未必一概详述。原材料可以是市售产品。本领域技术人员所知的工艺步骤或制备方法未必在此一概详述，则这些工艺步骤或制备方法可视为是本领域技术人员所知的。

在权利要求中，“包含”或“包括”一词不限于其后所述的特征、元素或步骤，也不排除其他特征、元素或步骤。这一用语表示存在述及特征，但不排除还存在或加入一项或多项特征。

在此处具体说明部分给出了各种具体细节。本发明的实施方式可以不用这些具体细节来实施。此外，为了清楚和简洁起见，公知的特征、元素和/或步骤未必在此详述。

下面结合实施方式来具体说明本发明的实施，以便本领域技术人员更好地理解本发明。需要说明的是，实施方式仅用于进一步解释本发明，而不应将其理解为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员可以看出，本领域技术人员能够更好地理解本发明的保护范围。

第一方面中，本发明涉及用于瞬时转化植物以产生Δ9-四氢大麻酚酸合酶(THCAS)和/或大麻二酚酸合酶(CBDAS)和/或大麻环萜酚酸合酶(CBCAS)的核酸分子。所述核酸分子对应于包含以下至少其一的核苷酸序列：

i)与SEQ ID NO:4具有至少78％序列同一性或包含核苷酸序列SEQ ID NO:4的至少15个连续核苷酸的编码多肽的核苷酸序列片段；和/或

ii)与SEQ ID NO:5具有至少78％序列同一性或包含核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少15个连续核苷酸的编码多肽的核苷酸序列片段；和/或

iii)与SEQ ID NO:6具有至少78％序列同一性或包含核苷酸序列SEQ ID NO:6的至少15个连续核苷酸的编码多肽的核苷酸序列片段。

所述核苷酸序列还包含用于将核苷酸序列靶向内质网的KDEL或HDEL驻留标签。

第二方面中，本发明涉及包含所述核酸分子的病毒载体。

所述方法包括：

-通过CBGA的氧化环化而不羟化将(例如纯化的CBCAS转化为CBCA，例如通过将CBGA加入上清液中孵育6至8小时。

因此，本发明提供工程化重组THCAS、CBDAS和/或CBCAS融合构建体，例如前文所述的核酸分子，以及包含所述构建体的病毒载体和涉及其使用的方法。

实施方式可提供或实现更有效且成本效益更高的方法，所述方法能够通过瞬时转化植物(例如本氏烟草)来产生参与大麻素生物合成的酶。如实施方式所述的示例方法可包括在根癌农杆菌中插入核酸分子(例如纳入感兴趣的基因)，并通过农杆菌渗透将构建体导入植物细胞(例如5周龄的本氏烟草植株)的内质网(ER)。

本氏烟草可视为用于在生产条件下瞬时表达重组蛋白的优选生物反应器。这种小型观赏植物叶茎比高，水培非常多产。本氏烟草能耐受转染载体，在转染后5-7天异源蛋白质合成最多。这种生物反应器的规模升级就是种植更多的植株，而不是重新工程化。然而，本领域技术人员可以将本文的发现转用于其认为合适的其他宿主植物物种，因此，这些也被认为包含在本发明的实施方式中。

植物具备准确生产植物、人和动物蛋白质所需的所有真核细胞机制。因此，生物反应器可以是个体植株。植物非常适合表达复杂蛋白质，并且因为不支持人或动物病原体生长而能将风险降至最低。

这种方法的好处之一是，大麻素的生产快速、连续、低成本且可靠，并且只生产特定的大麻素或特定亚组的大麻素。大麻素的提取和纯化过程可以很简单，因为植物生物质中只有一种大麻素或选定的几种大麻素。方法可以线性放大，例如种植更多植物即可。此外，它是一种可持续的方法，比合成生产更环保，并可纯化到符合药用的要求。

分别通过THCAS、CBDAS和CBCAS的CBGA氧化环化而不羟化得到的大麻素的酸形式(THCA、CBDA和CBCA)可用作药物产品，或者可将这些酸性大大麻素转换为各自的中性形式来使用，例如，可分别由THCA、CBDA和CBCA脱羧产生THC、CBD和CBC。由此产生的大麻素产品可用于制药/功能食品行业，例如用于处置多种健康问题。

例如，可通过将CBGA与溶液中和/或固定化状态的重组THCAS、CBDAS和CBCAS在适宜条件下混合适宜时长来进行接触，所述条件和时长是适宜将至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％的CBGA转化为THCA、CBDA和CBCA的条件和时长。

就瞬时转化本氏烟草中表达蛋白质而言，可将THCAS、CBDAS和/或CBCAS编码序列与内质网(ER)驻留标签(例如KDEL)和多组氨酸标签融合，例如都融合在蛋白质(即核酸分子转录的蛋白质)的C端。KDEL标签允许蛋白质在ER中累积，这一策略可获得更高的积累和/或减少植物蛋白降解。

THCAS构建体包含以SEQ ID NO:4为代表的催化核苷酸序列(例如不含信号肽)或其合适的类似物或足够(即足以表达所需的THCAS酶)的部分。类似地，CBDAS催化核苷酸序列可以SEQ ID NO:5为代表，CBCAS催化核苷酸序列可以SEQ ID NO:6为代表(两者均涵盖其合适的类似物或其足够的部分)。

核酸分子可包含用于获得全功能去糖基化THCAS和/或CBDAS和/或CBCAS的细菌PNGase F基因序列。

核酸分子包含内质网驻留标签，例如KDEL标签，例如位于蛋白质C端。

核酸分子可包含用于目标宿主植物的信号肽(的编码核苷酸序列片段)，例如本氏烟草PR-1a信号肽。

核酸分子可包含纯化标签，例如多组氨酸标签。例如，可用标签肽，例如将其工程到工程化融合酶的一级结构中，以促进产生的THCAS、CBDAS和/或CBCAS的纯化。示例包括多组氨酸标签、链霉亲和素(生物素结合)标签、鞭毛抗原标签、血凝素标签或谷胱甘肽S-转移酶标签等。

例如，核酸分子可包含THCAS、CBDAS和/或CBCAS的所述催化核苷酸序列、加在N端的普通烟草PR-1a信号肽，然后是内质网(ER)驻留标签KDEL和多组氨酸标签，这两者均融合在蛋白质的C端。

可对核酸分子进行密码子优化以便在特定宿主植物物种中表达，例如本氏烟草。

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3公开了此类核酸分子的核苷酸序列，分别用于在本氏烟草中瞬时表达THCAS、CBDAS和CBCAS，即构建体PR-1A/THCAS/PNGASE-F/ER/6xHIS、PR-1A/CBDAS/PNGASE-F/ER/6xHIS和PR-1A/CBCAS/PNGASE-F/ER/6xHIS各自的核苷酸序列，各自都进行了本氏烟草密码子优化。

图2、图3和图4显示了实施方式所述病毒载体的对应病毒载体图谱，其中包含实施方式所述的核酸分子，用于在烟草中分别瞬时表达THCAS、CBDA和CBCAS。

上述构建体也可克隆在两个载体中；一个作为包含PNGase F基因序列的构建体发挥作用，另一个作为包含THCAS、CBDAS和/或CBCAS基因的构建体发挥作用。本发明的实施方式可涉及此类多载体的组合。

可用短(346bp)但强的组成性花椰菜花叶病毒35S启动子(P35S)、kozak翻译起始序列和胭脂氨酸合酶多腺苷酸化终止子信号来调节基因表达。在本发明的范围内还包括采用核苷酸序列和所有同源编码序列的N-端截短、C-端截短和N-与C-两端截短形式的、具有至少45％的序列同一性的构建体。

本发明实施方式可涉及包含所述核酸分子的组合物，例如，所述组合物中没有其他蛋白质成分。

例如，该组合物中重组THCAS、CBCAS和/或CBDAS融合酶(即核酸分子)的重量百分比可为约0.00001％至99.99999％、例如约0.00001％至99.99999％、例如约0.0001％至99.9999％、例如约0.001％至99.999％、例如约0.001％至99.999％、例如约0.01％至99.99％、例如约0.1％至99.9％、例如约1％至99％。

表达和纯化后获得的THCAS、CBDAS和CBCAS可由CBGA通过氧化环化而不羟化进一步生物合成分别获得THCA、CBDA和CBCA。然后，酶法合成的THCA、CBDA和CBCA可以羧化，例如通过在120℃加热，分别获得THC、CBD和CBC。获得的THCA、CBDA和CBCA还可作为基础进一步修饰形成其他大麻素，例如通过降解或异构化。

在前文所述的农杆菌渗透实验中，采用5至7周龄的本氏烟草植株。将本氏烟草种子种在温室中。在发光二极管(LED)24小时/天、7天/周的光照下进行本氏烟草的育苗(Seedling)和萌发(germination)。选择了与光合作用的作用光谱相匹配的红色和蓝色二极管(25％蓝色和75％红色)。其他波长可能效率较低或无效。将LED聚光在植物上。与其他商业解决方案相比，该系统中植物生长到可用成熟度的速度快20％。全部种子在26.6℃用相同的土壤和肥料萌发。

关于目标基因的生物合成，普通大麻(Cannabis Sativa)(汉麻(hemp)，休闲大麻(marijuana))的THCAS(UniProtKB-Q8GTB6，条目版本71，序列版本1，最后一次序列更新2003年3月1日)、CBDAS(UniProtKB-A6P6V9，条目版本50，序列版本1，最后一次序列更新2007年8月21日)和CBCAS(GenBank:LY658672.1,cf.KR 1020190025485-A/8 2019年3月11日)分别与细菌PNGase F基因序列(UniprotKB-P21163，条目版本107，序列版本2，最后一次序列更新1991年11月1日)、加到N端的普通烟草PR-1a信号肽(UniprotKB-Q40557，条目版本66，序列版本1，最后一次序列更新1996年11月1日；仅信号肽部分：序列第1-30位)、KDEL内质网驻留标签和加到C端的多组氨酸标签联用，形成生物合成新工程重组THCAS、CBDAS和CBCAS酶的模板。在基因的5′端和3′端分别加入EcoRI和BgIII的限制性位点。针对本氏烟草表达优化密码子使用，基因合成由Genscript Inc.完成。将THCAS 2436bp片段和CBDAS2613bp片段克隆到pUC57载体中，以便基因亚克隆到植物表达载体中。(这些示例性THCAS、CBDAS和CBCAS构建体的完整核苷酸序列分别见SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；各自对应的病毒载体图谱见图2、3和4)。N-连接糖基化是一种翻译后修饰，有助于许多蛋白质的正确折叠、稳定性和生物活性，包括异源表达系统中产生的重组亚单位疫苗和治疗性蛋白质。一些真核(以及细菌)蛋白质在原生宿主中可能不含N-聚糖，但当这些蛋白质在异源真核表达系统中表达时，它们的蛋白质可能含有多个潜在的糖基化位点，这些位点会异常糖基化，可能导致功能活性受损。事实上，碳水化合物的附着可能会强烈影响蛋白质的物理化学性质，因此可能会改变其基本生物学性质，如特定活性、配体-受体相互作用和免疫原性，体内使用时可能造成安全隐患。由于THCAS、CBDAS和CBCAS在表达和纯化后会表现出糖基化，因此可以认为这种修饰会影响蛋白质的稳定性。因此，为了在植物细胞中产生去糖基化蛋白质，我们将细菌PNGase F(肽：N-糖苷酶F)与目标蛋白(THCAS、CBDSA和/或CBCAS)瞬时共表达。PNGase F是一种34.8-kDa的酶，由革兰氏阴性菌脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)分泌。它切割N-连接糖蛋白中高甘露糖、杂合复合低聚糖最内里GlcNAc与天冬酰胺残基之间的键，除非(1–3)核心被岩藻糖基化。

用BLAST分析对大麻(cannabis)基因组序列进行分析，寻找与THCA合酶高度近似的基因。由此鉴定到一个与THCA合酶具有96％核苷酸相似性的基因。根据随后的生化特征鉴定，作者将该基因命名为大麻(Cannabis sativa)环萜酚酸合酶(CBCAS)，并将包括信号肽序列在内的全序列保存于Genbank数据库，注册号为LY658672.1。我们预测了信号肽序列(见图5)，摈弃了这些重复序列(replicates)。

由于原生THCAS、CBDAS和CBCAS基因采用串联稀有密码子，可能降低翻译效率甚至破坏翻译机制，通过将密码子选用指数(codon adoption index，CAI)由0.72提高到0.86来利用本氏烟草的密码子使用偏好。为了延长mRNA的半衰期，对GC含量和不利峰进行了优化。影响核糖体结合和mRNA稳定性的茎环结构被破坏。此外，还筛选并成功修饰了负顺式作用(negative cis-acting)位点。

为了构建植物表达载体，通过EcoRI和BglII消化从pUC57-THCAS、pUC57-CBDAS和pUC57-CBCAS中切取完整THCAS 2436bp-片段-orf、CBDAS 2613bp-片段-orf和CBCAS2616bp-片段-orf，亚克隆到pPRP[Exp]-CaMV35S二元载体中35S启动子控制下。通过限制性酶消化确认转化集落。从所选集落中抽提重组质粒pCambia-THCAS、pCambia-CBDAS和pCambia-CBCAS，转入农杆菌进行农杆菌渗透实验。

pPRP[Exp]-CaMV35S-THCAS、pPRP[Exp]-CaMV35S-CBDAS和pPRP[Exp]-CaMV35S-CBCAS构建体用电穿孔技术(2.5kV，25mF，400Ω)转入根癌农杆菌菌株GV3101、C58C1和LBA4404以及野生型菌株A4、At06、At10和At77。将转化细胞铺在含50mg/ml氨苄西林(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))的LB琼脂培养基上。

采用先前所述的农杆菌渗透法，用根癌农杆菌在本氏烟草中进行瞬时表达。针对THCAS、CBDAS和CBCAS，分别将100μl转化农杆菌冻存细胞接种在5ml LB肉汤培养基(赛默科技(Thermo Fisher Scientific))中，并添加50mg/ml氨苄西林。培养物在28℃、220rpm振摇孵育过夜。用2x500μl接种2x50ml LB培养基。细胞培养物28℃、220rpm振摇孵育，直到培养物达到O.D.600＝0.6。6000rpm离心收获细胞，重悬于2x50ml MES缓冲液(10mMMES；pH值5.5，10mM MgCl₂)。这些混合物在室温下与120μM乙酰丁香酮孵育2.5小时，分别加入渗透缓冲液(1x MS、10mM MES、2.5％葡萄糖)配制的THCAS、CBDAS和CBCAS的农杆菌悬液中。为了研究单糖对vir基因诱导的影响，将不同百分比的葡萄糖(0、1、2或4％)加入渗透缓冲液(1xMS、10mM MES、200μM乙酰丁香酮)配制的农杆菌悬液。5-7周龄的本氏烟草在真空室内进行渗透：将本氏烟草植株的气生组织浸没在杆菌悬液中，并施加50-400毫巴真空30、45或60秒。

最理想的渗透通常在50-100mbar下进行60秒。破除真空后，从真空室中取出经渗透的本氏烟草植株，用水彻底淋洗，并在与渗透前生长所用相同的生长条件下生长5-7天。为了避免可变性，每个试验，对叶片和叶片上的位置，相似年龄的每株植物的同等大小的叶片进行农杆菌渗透。

关于Southern印迹分析，在不同的时间间隔(渗透后4、6、8、和10天)收获经pPRP[Exp]-CaMV35S-THCAS、pPRP[Exp]-CaMV35S-CBDAS和pPRP[Exp]-CaMV35S-CBCAS3构建体农杆菌渗透的各片叶片，并以未经渗透的植株作为对照。用DNeasy植物DNA小抽试剂盒(QIAGEN)抽提经渗透叶片的DNA，用核酸内切酶EcoRI片段化。分别用pUC57-THCAS、pUC57-CBDAS和pUC57-CBCAS释放的重组THCAS 2436bp-片段-orf、CBDAS 2613bp-片段-orf和CBCAS 2616bp-片段-orf作为探针。分别使用生物素Deca标记DNA标记试剂盒(ThermoFisher Scientific)和生物素显色检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行标记和检测。

关于蛋白质印迹分析，收获经农杆菌渗透的本氏烟草各片叶片，在液氮中研磨。用SDS提取缓冲液(2％SDS，0.2％溴酚蓝，10％甘油)提取总蛋白，提取物以14500g、4℃离心20分钟澄清。将上清液转移到新鲜试管中，测定THCAS、CBDAS和CBCAS的蛋白质含量(Bradford检测-1976)。SDS-PAGE分离总蛋白(各40μg)，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。聚偏二氟乙烯膜封闭至少2小时，然后用兔抗THCAS、兔抗CBDAS和兔抗CBCAS按1:500稀释进行检测。充分淋洗后，将膜与1:5000稀释的相应二抗孵育，然后与碱性磷酸酶偶联。用BCIP/NBT(Amresco)进行免疫检测。

关于实时聚合酶链式反应(RT-PCR)检测嵌合基因，用illustra RNAspin小抽试剂盒(GE healthcare)抽提经农杆菌渗透叶片的总RNA。设计核心区的寡核苷酸对来检测核心区THCAS、CBDAS和CBCAS基因的存在情况；使用THCAS-特异性正向引物：5′-CTCGTATACACTCAACACGACC-3’(SEQ ID NO:7)和反向引物：GTAGGACATACCCTCAGCATCATG-3’(SEQ ID NO:8)，CBDAS-特异性正向引物：5′-GAGGCTATGGACCATTGA(SEQ ID NO:9)和反向引物：5′-GGACAGCAACCAGTCTAA-3’(SEQ ID NO:10)，以及CBCAS-特异性正向引物：5′-CGGATGTACTGTTATGCTCCAA-3’(SEQ ID NO:11)和反向引物：5′-AAGCTTTCATGGTACCCCATGATGATGCCGTGGAAGAG-3’(SEQ ID NO:12)。先前没有报道过共显性DNA标志物的PCR参数(Onofri等，2015；Pacifico et al.2006)，对其进行了如下优化：每个反应包含1.5mMMgCl₂、0.2mM dNTP、0.4μM正向引物和0.2μM THCAS特异性、CBDAS特异性和CBCAS特异性反向引物，以及2U

Taq DNA聚合酶(Life Technologies#10966-034)。热循环参数为94℃、2分钟，然后25轮：94℃、30秒，58℃、30秒，72℃、1分15秒。PCR反应在0.2mL 96孔PCR板(Thermo Scientific#AB-0600)中进行，用平盖条(Thermo Scientific#AB-0786)密封，用Gradient Palm–Cycler^TM梯度PCR仪(Corbett生命科学公司)，总体积为50μL。D589和B1080/B1192扩增产物在1.5％和1％

LE琼脂糖凝胶(Cambrex#50004)上电泳分离，GelRed^TM染色(Biotium#41003)。然后使用Bio-Rad Molecular

Gel Doc^TMXR+系统和Image Lab^TM软件在紫外光下将扩增产物可视化。

采用直接ELISA法确认农杆菌渗透后的转基因表达。用ELISA提取缓冲液(2％PVP，0.03M Na₂SO₃)提取TCHAS、CBDAS和CBCAS总蛋白。ELISA 96孔板(Thermo FisherScientific)以250μl抗原和THCA、CBDA、CBCA总可溶蛋白包被，然后在4℃孵育过夜。次日用淋洗缓冲液洗板三次，每次5分钟。加入250μl封闭缓冲液(PBS-吐温20，5％低脂牛奶)封闭其余蛋白质结合位点，室温下孵育2.5小时。

用PBS和吐温20淋洗后，用封闭缓冲液1:1000稀释抗TCHAS、抗CBDAS和抗CBCAS抗体后每孔加250μl。板在37.5℃的湿度箱内孵育3.5小时。倾除板上液体并洗板三次，每次5分钟。向板中加入250μl底物缓冲液(0.3g(NaN₃)，96ml二乙醇胺，600ml H₂O)，然后室温下孵育直至显色。用自动ELISA读板仪(BIOBASE 2000)最后读取630nm波长处的吸光度，每次15分钟。ELISA值表示为波长处的平均吸光度(λ＝640A°)。与阴性对照(C-)相比，S3、S5、S7、S10渗透样品在15分钟和30分钟读取时间后显示阳性结果。本氏烟草叶内THCAS、CBDAS和CBCAS基因在渗透后第5天达到最高表达水平，在渗透后第7天和第10天表达水平下降。

用固定化金属亲和螯合色谱(IMAC)纯化蛋白。为了将金属离子固定在快速螯合琼脂糖介质(Chelating Sepharose Fast Flow)上，将200mM NiSO₄(Sigma-Aldrich)溶液通过色谱柱(GE Life Sciences)。用含有0.02％叠氮化物的蒸馏水洗柱以除去过量的NiSO₄。然后用10倍柱体积的ANiS缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，50mM NaCl，100mM咪唑，10mMβ-巯基乙醇，0.02％(w/v)叠氮化物)以3ml/min的流速对柱进行平衡。将配制在ANiS缓冲液中的粗提物上样到镍螯合快速琼脂糖介质(Nickel Chelating Sepharose Fast Flow)色谱柱(GE-Life-Sciences)上，柱体积10ml。用至少10倍柱体积的ANiS缓冲液洗柱，然后换成咪唑浓度递增的线性梯度，咪唑浓度从l00mM(ANiS缓冲液)增至500mM的BNiS缓冲液(50mMTris-HCl，pH 7.4，50mM NaCl，500M咪唑，10mMβ-巯基乙醇，0.02％(w/v)叠氮化物)。

超滤浓缩目标蛋白。将蛋白质溶液加入体积为10ml或50ml的搅拌槽(

Millipore Sigma)中,并通过截留分子量为30kDa的超滤截留盘再生纤维素膜(

Millipore Sigma)。使用离心过滤装置(

Millipore Sigma)按照供应商的说明完成小体积蛋白质(300–600μl)浓集。选择膜的排阻极限来截留目标蛋白质。

为了测定THCAS、CBDAS和CBCAS的酶活，将各自的150mg冷冻植物材料在500llTHCAS、CBDAS和CBCAS反应缓冲液(100mM柠檬酸三钠，pH值5.5)中匀浆并离心(17000x g，15min)。然后，将上清液与CBGA(最终浓度为0.05mM，1.9％(v/v)ACN)于37℃孵育2小时。加275μl冰冷乙腈终止反应，然后冰上孵育30分钟。最后，通过离心(17000x g，30分钟，4℃)将上清液与固体颗粒分离纯化两次。

用Poroshell 120SB-C18柱(3.0 9 150mm，2.7μm)，通过HPLC-MS分析THCA、CBDAS和CBCAS分析提取物。HPLC–MS分析的详细参数见补充数据。为了确认THCAS、CBDAS和CBCAS，将化合物的质谱与真实标准品的质谱比对，并通过LC–ESI–MS/MS进一步确认。通过260nm紫外色谱图峰面积积分进行THCAS、CBDAS和CBCAS的定量。酶对THCA生产的活性为137±14fkat g_FW ^-1，对CBDA的活性为132±11fkat g_FW ^-1，对CBCA的活性为129±13ffkat g_FW ^-1。

在悬浮培养物中添加CBGA后，THCAS、CBDAS和CBCAS能够产生高达2.11g THCA/kg叶生物质、2.03g CBDA/kg叶生物质和1.48g CBCA/kg叶生物质，表明瞬时转化的本氏烟草纳入了定制酶而能够生物合成强化特性的(新型)大麻素。此外，如前文发明内容概述中所述，本发明能够按周连续生产大麻素前体酶，相比种植和收获耗时长久的传统大麻种植有明显优势。这些策略将有助于支持大麻素作为药物的潜在价值。

序列表

<110> 比贝婷作物科学有限公司(Perpetuum CropScience BVBA)

<120> 大麻素前体的生产

<130> TR011WO

<150> EP19162347.9

<151> 2019-03-12

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2436

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 本氏烟草密码子优化的PR-1A/THCAS/PNGASE-F/ER/6xHIS构建体的核苷酸序列

<400> 1

atgggattcg tacttttctc tcagctccct agtttccttc ttgtttcaac tttacttttg 60

tttctcgtga tttctcattc ttgtcgggca aataattctc atattcaagc cacaatactt 120

tgttctaaga aggttggtct ccaaattaga acacgaagtg ggggacatga cgcagaagga 180

atgagttaca ttagtcaagt cccttttgta gtagttgatt tgagaaatat gcatagcatt 240

aagattgatg tacatagtca aacggcttgg gtagaagctg gggccacttt aggtgaggtt 300

tactactgga tcaatgagaa aaacgaaaat ctttccttcc cagggggtta ctgtcccact 360

gtgggagtag ggggacactt tagtggaggc ggctatggtg ctcttatgcg gaactacgga 420

cttgcagcag ataatattat tgatgctcat ttggttaacg tcgatggaaa agttcttgac 480

agaaagtcta tgggcgaaga tttattttgg gctatccgag ggggaggtgg agagaacttt 540

gggattatcg cagcatggaa aattaaactt gtagccgtgc catcaaaatc tacgatattt 600

agcgtgaaga agaatatgga gattcacggc ttagttaagc tttttaacaa atggcaaaac 660

attgcatata aatacgataa agaccttgtt ctcatgactc atttcattac gaagaacatt 720

actgacaatc atggtaagaa taaaacaacc gtccacggtt actttagttc tattttccat 780

ggcggcgtcg actccttagt cgatcttatg aataagagtt ttccagagct cggaattaaa 840

aaaactgatt gtaaggagtt ttcatggata gatacaacta ttttttacag tggtgtcgtg 900

aatttcaata ctgcaaattt caagaaggaa atccttttgg atcgatctgc tggcaagaaa 960

acagctttta gcatcaagtt ggattatgtt aaaaaaccta ttccggaaac agctatggtt 1020

aagattttgg agaagttgta tgaagaggat gtgggtgccg gaatgtacgt tttgtaccca 1080

tacggcggca taatggagga aattagtgag tcagctatac cttttcccca tcgtgcaggt 1140

atcatgtatg aattgtggta tacggcatct tgggagaaac aggaagataa tgagaagcat 1200

atcaattggg ttagatcagt ctacaatttc actactcctt atgtgagtca gaacccacgt 1260

cttgcatacc tcaactatcg agatcttgat ttaggcaaga caaaccatgc ttctcctaat 1320

aattatactc aagctagaat ctggggcgaa aaatacttcg gcaagaattt taatagactt 1380

gtgaaggtaa aaactaaggt cgatccgaat aattttttta ggaatgagca gtctatccca 1440

cctttaccac cacatcacca tgccccagct gacaacaccg ttaatataaa gacatttgat 1500

aaggtgaaga atgcatttgg agatggattg agccaaagtg cagagggtac ttttactttt 1560

ccagctgacg ttaccactgt taaaacgatt aagatgttta taaagaatga gtgcccaaat 1620

aaaacttgtg acgaatggga ccgttatgct aacgtatacg tgaaaaataa gactacgggg 1680

gagtggtatg aaataggcag gtttatcacc ccatactggg tcggtacaga gaagcttccc 1740

cggggactgg agatagacgt tacagacttc aaatcactgt tgagcggcaa tactgaatta 1800

aagatttaca ccgagacctg gttggctaag ggaagagaat attctgttga ttttgatatt 1860

gtctacggta ctcctgacta taaatatagc gccgttgtcc cagtcattca gtataacaag 1920

tctagtattg atggtgttcc ttatggcaaa gcccatacac ttggcttgaa gaaaaacatt 1980

caattgccta ccaatacaga aaaagcttac ttgaggacca ctatatcagg ctggggtcac 2040

gctaagccat atgatgctgg ttctagagga tgcgcagagt ggtgttttcg aactcataca 2100

atcgcaataa acaatgctaa cacgtttcaa catcaacttg gtgcacttgg ttgttccgca 2160

aacccaatta ataatcagtc accagggaat tgggcaccag atcgtgcagg atggtgtcca 2220

ggaatggctg tccctacgcg aattgacgtt cttaataata gtttgacagg atcaactttc 2280

tcttatgagt ataaattcca gtcatggaca aataatggta ctaatggcga cgctttttac 2340

gccatctcct ctttcgttat tgcaaaatcc aatacaccga tttctgcacc tgtggtcact 2400

aataaggatg agttgcatca ccatcatcac cattaa 2436

<210> 2

<211> 2613

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 本氏烟草密码子优化的PR-1A/CBDAS/PNGASE-F/ER/6xHIS构建体的核苷酸序列

<400> 2

atgggattcg tacttttctc tcagctccct agtttccttc ttgtttcaac tttacttttg 60

tttctcgtga tttctcattc ttgtcgggca aatcctaggg aaaatttcct taagtgtttt 120

agtcaatata tcccaaataa tgctaccaat ttgaagcttg tatacacaca aaataatcca 180

ttgtatatgt cagtgttgaa ctctactatt cataacttga ggtttactag cgacacaacg 240

cctaagccgt tggttattgt aacgccatca cacgttagcc acatccaagg aaccattctt 300

tgttccaaga aagtcggact gcaaattagg acccgtagtg gtggtcatga ttcagagggt 360

atgtcttaca tttctcaggt tccatttgtg attgttgatt tgaggaatat gcgatcaatc 420

aagatagatg ttcactcaca gactgcatgg gtggaagctg gggccacatt gggcgaggtc 480

tactattggg ttaatgaaaa aaacgagaat ctttcattgg ctgctgggta ctgtccaacc 540

gtttgcgctg gcggtcattt tggtggcgga ggctacggac ccttgatgag gaattatggt 600

ttggctgcag ataatattat tgacgctcac ttagttaatg tccatggaaa ggtccttgat 660

agaaagagca tgggtgagga ccttttttgg gcccttcggg gtggtggagc tgagtctttt 720

ggcatcattg tcgcttggaa aattagatta gtcgctgttc cgaagtcaac tatgttcagc 780

gttaagaaaa tcatggagat tcacgagttg gttaagttgg tcaataaatg gcagaacatt 840

gcttataaat atgataaaga cttattgctt atgactcact ttattactag gaatataaca 900

gataatcagg gtaaaaacaa aacagccatc cacacatact tcagcagcgt ctttctcgga 960

ggggtagact cactcgtgga tttgatgaac aaatcattcc ctgaacttgg cattaagaag 1020

actgactgcc gacagctctc atggattgat acgattattt tctacagtgg agttgtaaac 1080

tatgatacgg acaattttaa caaggaaatt ttattagata ggtctgccgg acaaaacggt 1140

gcatttaaaa ttaaacttga ttatgttaaa aagcctattc cagagagcgt gtttgttcaa 1200

attttggaaa agttgtatga agaagatatc ggtgcaggga tgtacgctct ttacccttac 1260

ggtggtatta tggacgaaat tagtgagtca gctatcccat tcccacatag agctggaatc 1320

ttatatgaat tatggtacat atgcagttgg gagaagcagg aggataatga aaagcacctt 1380

aattggattc ggaacatcta caattttatg acaccatatg tttccaaaaa cccgcggctt 1440

gcttacctga actaccgaga tttagatatt ggaatcaatg atccgaaaaa tcctaacaat 1500

tacacacagg caaggatatg gggcgagaag tacttcggta aaaattttga cagattggtt 1560

aaagtgaaaa cactcgtgga tccgaataat ttcttccgta atgagcaaag catccctccc 1620

cttccaaggc atcggcacgc cccagctgac aacaccgtta atataaagac atttgataag 1680

gtgaagaatg catttggaga tggattgagc caaagtgcag agggtacttt tacttttcca 1740

gctgacgtta ccactgttaa aacgattaag atgtttataa agaatgagtg cccaaataaa 1800

acttgtgacg aatgggaccg ttatgctaac gtatacgtga aaaataagac tacgggggag 1860

tggtatgaaa taggcaggtt tatcacccca tactgggtcg gtacagagaa gcttccccgg 1920

ggactggaga tagacgttac agacttcaaa tcactgttga gcggcaatac tgaattaaag 1980

atttacaccg agacctggtt ggctaaggga agagaatatt ctgttgattt tgatattgtc 2040

tacggtactc ctgactataa atatagcgcc gttgtcccag tcattcagta taacaagtct 2100

agtattgatg gtgttcctta tggcaaagcc catacacttg gcttgaagaa aaacattcaa 2160

ttgcctacca atacagaaaa agcttacttg aggaccacta tatcaggctg gggtcacgct 2220

aagccatatg atgctggttc tagaggatgc gcagagtggt gttttcgaac tcatacaatc 2280

gcaataaaca atgctaacac gtttcaacat caacttggtg cacttggttg ttccgcaaac 2340

ccaattaata atcagtcacc agggaattgg gcaccagatc gtgcaggatg gtgtccagga 2400

atggctgtcc ctacgcgaat tgacgttctt aataatagtt tgacaggatc aactttctct 2460

tatgagtata aattccagtc atggacaaat aatggtacta atggcgacgc tttttacgcc 2520

atctcctctt tcgttattgc aaaatccaat acaccgattt ctgcacctgt ggtcactaat 2580

aaggatgagt tgcatcacca tcatcaccat taa 2613

<210> 3

<211> 2616

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 本氏烟草密码子优化的PR-1A/CBCAS/PNGASE-F/ER/6xHIS构建体的核苷酸序列

<400> 3

atgggattcg tacttttctc tcagctccct agtttccttc ttgtttcaac tttacttttg 60

tttctcgtga tttctcattc ttgtcgggca aatcctcaag aaaatttttt gaagtgcttt 120

tcagaataca tcccaaataa tccagctaac cctaaattca tttatacaca gcatgatcag 180

ctttacatga gtgtactgaa ttctactatc caaaatcttc gttttacatc agacacaacc 240

cccaagccac ttgttattgt tactccatca aatgtatctc acattcaagc atctatattg 300

tgttccaaaa aggttggtct ccagattagg acaaggtcag gcggacatga tgctgagggc 360

ctgtcttaca tatcacaggt cccattcgca atcgttgacc tccgaaatat gcacactgtc 420

aaagtcgata tacactcaca gacagcatgg gtggaagcag gtgctactct aggtgaagtt 480

tattactgga tcaacgaaat gaatgaaaac ttttcctttc ctggaggata ttgtccaact 540

gtcggagtag ggggtcattt cagtggagga ggatatggtg ctttgatgag aaactacggt 600

ttggctgctg ataatataat tgatgcacat ttagtgaatg tcgatggaaa agtacttgat 660

agaaagagca tgggggaaga tctattttgg gccattcgtg gaggaggagg cgagaatttc 720

gggattattg cagcttgtaa gattaaattg gtcgtggtcc cttccaaggc tacaattttt 780

tctgtgaaga agaatatgga aattcacggt cttgttaagc ttttcaataa atggcagaat 840

atcgcttaca agtatgataa agaccttatg ctcaccactc atttccgtac taggaatata 900

acagataacc atggaaagaa caagaccact gtacatggat atttcagctc tatcttttta 960

ggtggagttg atagccttgt cgatctcatg aataagagtt tccctgagct cggaatcaaa 1020

aagactgact gtaaagaatt gtcatggatt gataccacca ttttctacag cggggtcgtt 1080

aactacaaca ctgctaattt taaaaaagag attcttttag atcgtagtgc aggcaaaaag 1140

accgccttca gtataaagct cgattacgtt aaaaagttga tccctgaaac agcaatggtg 1200

aagatattag aaaaactgta tgaagaggaa gtgggagtcg ggatgtatgt cctttatcct 1260

tatgggggta tcatggacga gatatccgag tcagcaatac catttcccca tcgtgctggc 1320

ataatgtacg aactttggta tacagctaca tgggaaaagc aggaagacaa cgaaaagcac 1380

atcaactggg ttcgttctgt ttataacttt actacaccct atgtttctca gaatccacgt 1440

ctggcctatt taaattacag ggatctagat ttagggaaaa caaatcctga gagcccaaac 1500

aactacacac aagctcgaat ttggggtgag aagtacttcg gaaaaaattt taaccgttta 1560

gtgaaggtaa agactaaggc agatccaaac aattttttca ggaatgaaca aagcattcct 1620

ccactaccac ctagacatca tgccccagct gacaacaccg ttaatataaa gacatttgat 1680

aaggtgaaga atgcatttgg agatggattg agccaaagtg cagagggtac ttttactttt 1740

ccagctgacg ttaccactgt taaaacgatt aagatgttta taaagaatga gtgcccaaat 1800

aaaacttgtg acgaatggga ccgttatgct aacgtatacg tgaaaaataa gactacgggg 1860

gagtggtatg aaataggcag gtttatcacc ccatactggg tcggtacaga gaagcttccc 1920

cggggactgg agatagacgt tacagacttc aaatcactgt tgagcggcaa tactgaatta 1980

aagatttaca ccgagacctg gttggctaag ggaagagaat attctgttga ttttgatatt 2040

gtctacggta ctcctgacta taaatatagc gccgttgtcc cagtcattca gtataacaag 2100

tctagtattg atggtgttcc ttatggcaaa gcccatacac ttggcttgaa gaaaaacatt 2160

caattgccta ccaatacaga aaaagcttac ttgaggacca ctatatcagg ctggggtcac 2220

gctaagccat atgatgctgg ttctagagga tgcgcagagt ggtgttttcg aactcataca 2280

atcgcaataa acaatgctaa cacgtttcaa catcaacttg gtgcacttgg ttgttccgca 2340

aacccaatta ataatcagtc accagggaat tgggcaccag atcgtgcagg atggtgtcca 2400

ggaatggctg tccctacgcg aattgacgtt cttaataata gtttgacagg atcaactttc 2460

tcttatgagt ataaattcca gtcatggaca aataatggta ctaatggcga cgctttttac 2520

gccatctcct ctttcgttat tgcaaaatcc aatacaccga tttctgcacc tgtggtcact 2580

aataaggatg agttgcatca ccatcatcac cattaa 2616

<210> 4

<211> 1551

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 本氏烟草密码子优化的(THCAS)

<400> 4

aatccaagag agaattttct aaagtgcttt tctaaacata tacccaataa cgttgcaaac 60

ccaaagttag tgtatactca gcatgatcaa ctttacatgt cgatacttaa ttccactata 120

caaaatctga gatttatatc tgatacaact ccaaaacctc ttgttattgt cactccatct 180

aataattcac atatacaggc tacaattctc tgcagtaaga aggttggact tcaaatcaga 240

actcgcagtg gcggtcatga cgctgaagga atgagttaca tctcacaagt accttttgta 300

gtggttgatc taaggaacat gcattccatc aaaattgatg ttcattctca gaccgcgtgg 360

gttgaagctg gtgctacact tggggaagtg tactattgga taaatgagaa gaatgaaaat 420

ttatcatttc ctgggggata ttgtcccact gtgggagttg gcggtcactt ttcgggtggg 480

ggatatggcg cattgatgag gaattacggt ctagccgctg acaatattat tgacgcacac 540

ctcgtaaacg tagatggcaa ggtgttggat agaaagtcaa tgggtgagga cctattttgg 600

gctattaggg gtggtggggg tgaaaacttt ggtattatcg cagcttggaa aattaagctt 660

gtggcagtcc ctagtaaatc taccatattc tccgtcaaga aaaatatgga gatacatgga 720

ttggttaagt tatttaacaa atggcaaaac attgcctaca agtatgataa agatttggtc 780

ctgatgactc atttcataac aaagaacatc accgataacc acggaaaaaa taagacaaca 840

gtgcatgggt acttcagctc catctttcac ggcggcgtcg attctttggt agatttgatg 900

aataaaagct tccctgagct gggaataaag aaaactgatt gtaaagagtt cagctggatt 960

gatactacaa tattttattc aggtgttgtt aacttcaaca cggcaaattt caagaaggaa 1020

attttgcttg acagaagtgc tgggaagaaa actgcattct ctattaaatt ggattatgtg 1080

aaaaaaccta ttcccgaaac cgctatggta aagattctgg agaagcttta tgaggaggat 1140

gttggtgctg ggatgtatgt tctttatcca tatggaggca ttatggaaga gatttctgaa 1200

tcagcaattc catttcctca tcgtgccgga attatgtacg aattgtggta tacggcatca 1260

tgggaaaaac aggaagataa tgaaaagcat atcaattggg tccggtcagt ttataatttt 1320

acaaccccat atgtcagtca gaatccgcga ttagcttatt taaactacag ggacctcgac 1380

ctgggtaaaa cgaatcatgc gtctccgaac aactacactc aagcaagaat ttggggagag 1440

aaatattttg gaaagaattt caatcgatta gtgaaggtaa aaacaaaagt tgatccaaat 1500

aattttttcc gtaacgaaca aagtatcccg cctctccctc cacaccatca c 1551

<210> 5

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 本氏烟草密码子优化的(CBDAS)

<400> 5

aatccgagag agaatttttt gaaatgtttc tctcaatata tccccaacaa tgcaacaaat 60

ctgaaactgg tttacactca gaataatccg ttatacatgt ctgttttgaa ctctacgata 120

cataatctta ggttcacatc tgacacaact ccaaaacctc tcgtgattgt gactcccagc 180

catgtctccc acatccaagg cacgattctt tgcagtaaga aggtaggatt gcagataagg 240

acacgttccg gcggtcatga tagtgaaggt atgtcctaca tcagccaagt tccatttgtt 300

attgttgacc ttagaaacat gcggagtatt aaaattgatg ttcattcaca gaccgcatgg 360

gtagaagctg gagcaactct gggggaggta tactattggg tgaatgaaaa aaatgaaaat 420

ttaagtcttg ctgcaggcta ttgtcctact gtttgtgctg gtgggcattt tggggggggg 480

ggatatggac ctctaatgcg aaactatggg cttgcagccg ataacatcat tgatgctcat 540

cttgtcaatg tgcatggaaa agtactggat cggaagtcaa tgggagagga tctattttgg 600

gccctccgag gtggtggtgc tgaaagtttt ggaattatag ttgcttggaa aatacgcctc 660

gtggcagtcc ccaagagcac catgttctca gtcaagaaga ttatggaaat tcatgaattg 720

gtgaagttgg taaacaaatg gcaaaacatt gcttacaagt atgataaaga tcttttgctt 780

atgactcact tcatcaccag gaatataact gataatcagg gaaagaacaa aactgccatt 840

cacacatatt tttcatcggt cttcttggga ggtgttgact ctcttgttga tttgatgaat 900

aagagttttc ctgagctggg tattaagaaa acagattgta ggcagctctc atggatagat 960

accattatat tttattctgg agttgtaaat tatgacacag acaatttcaa taaagagatt 1020

ttactcgaca gatcagctgg ccaaaatggt gcatttaaga tcaaacttga ttatgttaaa 1080

aagccaattc cagaatcggt gtttgtccag attctcgaga agctatatga agaagacatt 1140

ggtgcgggaa tgtatgcttt gtatccttat ggtgggatca tggatgaaat atctgagtca 1200

gctattcctt ttcctcacag agccggcata ttatatgagc tttggtatat ttgctcttgg 1260

gaaaaacaag aggataacga gaaacattta aattggatta ggaacatata caatttcatg 1320

acaccatatg tgtcaaagaa tcctcgtctg gcatatttga attacagaga tttggacatt 1380

ggaatcaatg atcctaaaaa cccaaacaac tacacacaag cgcgcatatg gggcgaaaag 1440

tactttggta agaattttga taggctggtg aaagttaaaa ctttagtaga tccaaataac 1500

ttctttagaa atgagcaatc catcccacca cttcctagac atagacac 1548

<210> 6

<211> 1551

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 本氏烟草密码子优化的(CBCAS)

<400> 6

aaccctcaag aaaatttcct taaatgcttt tctgaataca ttccaaacaa tcctgctaat 60

cccaaattta tttatactca acatgaccag ctgtacatgt cagtattgaa ttccacaatt 120

caaaatctaa gatttacctc tgatactact ccaaagcccc ttgtgatagt cactccttca 180

aatgtttcac acattcaggc atctatactt tgttcaaaga aggtaggact ccaaatcagg 240

acaaggagtg gaggtcatga tgctgaggga ttatcttata ttagtcaagt gccatttgct 300

atagttgact tgagaaatat gcatacagtt aaggtcgaca ttcattctca aacagcctgg 360

gttgaagctg gagctacttt aggcgaagtt tattattgga ttaacgaaat gaatgagaat 420

ttctcattcc ccggtggata ctgtccaact gtgggagttg gtgggcattt cagcgggggt 480

ggctatggag ccctgatgag aaactacggc ctagcagcag acaatattat tgatgcacac 540

ctcgtcaatg tggatgggaa agtacttgat aggaaaagta tgggagagga tcttttttgg 600

gcgataagag gagggggtgg tgagaatttt ggtataattg ctgcttgtaa aattaaattg 660

gtagtagttc ctagtaaagc aaccattttc tcggtgaaaa agaacatgga aatccacggc 720

ttagtcaaac ttttcaacaa atggcaaaac attgcctaca aatatgataa ggatttaatg 780

cttacaactc attttcggac acgaaacata accgataacc atggtaagaa taagaccact 840

gttcacggat attttagctc gatcttcttg ggtggcgttg actccctagt tgatcttatg 900

aacaagtctt ttccagagct tggaatcaag aagacagatt gcaaagaact gtcttggatt 960

gatacgacga tattttattc aggcgttgtg aactataata cagcaaattt caagaaagag 1020

attctccttg accgttccgc ggggaaaaaa actgcttttt caatcaagct agattatgtt 1080

aagaaattaa tccctgaaac cgcaatggtg aagatactcg agaagttgta cgaggaagag 1140

gtcggtgttg ggatgtacgt cctgtatcct tatggtggca ttatggatga gatctccgaa 1200

tctgccatac ctttcccaca tagagctggc attatgtatg aactatggta tacggcaact 1260

tgggaaaagc aagaagataa tgaaaagcat ataaattggg tgaggtcagt ttacaacttt 1320

accacaccat atgtaagtca gaatccgcga ttggcttatt tgaattatag ggatttagac 1380

ttgggaaaaa ctaatccgga aagccctaat aattacacac aggcacgtat ttggggtgaa 1440

aaatactttg gaaaaaattt taatagattg gtaaaggtta aaacaaaggc tgatccaaat 1500

aacttctttc gcaatgagca gagtatccca cctttacctc caagacatca c 1551

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THCAS-特异性正向引物

<400> 7

ctcgtataca ctcaacacga cc 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THCAS-特异性反向引物

<400> 8

gtaggacata ccctcagcat catg 24

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBDAS-特异性正向引物

<400> 9

gaggctatgg accattga 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBDAS-特异性反向引物

<400> 10

ggacagcaac cagtctaa 18

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBCAS-特异性正向引物

<400> 11

cggatgtact gttatgctcc aa 22

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBCAS-特异性反向引物

<400> 12

aagctttcat ggtaccccat gatgatgccg tggaagag 38

Claims

1.一种用于瞬时转化植物以产生Δ9-四氢大麻酚酸合酶THCAS和/或大麻二酚酸合酶CBDAS和/或大麻环萜酚酸合酶CBCAS的核酸分子，所述核酸分子对应于包含以下至少其一的核苷酸序列：

iii)与SEQ ID NO:6具有至少78％序列同一性或包含核苷酸序列SEQ ID NO:6的至少15个连续核苷酸的编码多肽的核苷酸序列片段；

所述核苷酸序列还包含用于将所述核苷酸序列靶向内质网的KDEL或HDEL驻留标签。

2.如权利要求1所述核酸分子，其中，所述核苷酸序列还包含多组氨酸标签或其它促进纯化的标签。

3.如权利要求1或2所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含至少一个异源部分和/或至少一个接头和/或至少一个信号序列和/或至少一个检测标记。

4.如权利要求3所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含对应于PR-1a信号肽、致病相关蛋白4或致病相关蛋白STH-2的所述信号序列。

5.如前述任一权利要求所述的核酸分子，其中，所述核酸分子对应于或包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。

6.一种病毒载体，包含前述任一权利要求所述的核酸分子。

7.如权利要求6所述的病毒载体，其中，所述病毒载体还包含用于去糖基化的另外的核苷酸序列。

8.如权利要求7所述的病毒载体，其中，所述另外的核苷酸序列是进行了本氏烟草或普通烟草密码子优化的。

9.一种生产Δ9-四氢大麻酚酸合酶THCAS和/或大麻二酚酸合酶CBDAS和/或大麻环萜酚酸合酶CBCAS的方法，所述方法包括：

-用权利要求1至5中任一项所述的核酸分子瞬时转化植物，以及

-从获自所述瞬时转化植物的植物生物质中提取THCAS和/或CBDAS和/或CBCAS。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述植物是本氏烟草或普通烟草。

11.如权利要求9或10所述的方法，还包括过滤和/或纯化所提取的THCAS和/或CBDAS和/或CBCAS。

12.如权利要求11所述的方法，其中，所述过滤和/或纯化包括色谱过程。

13.如权利要求9至12中任一项所述的方法，其中，所述植物还经瞬时转化以共表达去糖基化序列，从而获得无糖基化的THCA和/或CBDAS和/或CBCAS表达。

14.如权利要求9至13中任一项所述的方法，包括用权利要求6至8中任一项所述的病毒载体将所述核苷酸序列导入至少一种根癌农杆菌菌株中。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述至少一种根癌农杆菌菌株包括根癌农杆菌多菌株组合，所述多菌株组合包含或由以下菌株组成：GV3101，C58C1和LBA4404以及野生型菌株A4、At06、At10和At77。

16.一种生产Δ9-四氢大麻酚酸(THCA)和/或大麻二酚酸(CBDA)和/或大麻环萜酚酸(CBCA)的方法，包括如权利要求9至15中任一项所述的方法，以及通过大麻萜酚酸的氧化环化而不羟化将THCAS转化为THCA，和/或将CBDAS转化为CBDA，和/或将CBCAS转化为CBCA。

17.如权利要求16所述的方法，还包括对所得THCA、CBDA和/或CBCA进行脱羧以分别获得THC、CBD和/或CBC。