JP2023514687A - グリコシルトランスフェラーゼ、これらをコードするポリヌクレオチドおよび使用方法 - Google Patents

グリコシルトランスフェラーゼ、これらをコードするポリヌクレオチドおよび使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023514687A
JP2023514687A JP2022549606A JP2022549606A JP2023514687A JP 2023514687 A JP2023514687 A JP 2023514687A JP 2022549606 A JP2022549606 A JP 2022549606A JP 2022549606 A JP2022549606 A JP 2022549606A JP 2023514687 A JP2023514687 A JP 2023514687A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
plant
polypeptide
trilobatin
seq
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022549606A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021165890A5 (ja
Inventor
ワン，ユレ
アトキンソン，ロス・グラハム
ヤウク，ヤール－キン
リー，ペンミン
Original Assignee
ザ・ニュージーランド・インスティチュート・フォー・プラント・アンド・フード・リサーチ・リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ・ニュージーランド・インスティチュート・フォー・プラント・アンド・フード・リサーチ・リミテッド filed Critical ザ・ニュージーランド・インスティチュート・フォー・プラント・アンド・フード・リサーチ・リミテッド
Publication of JP2023514687A publication Critical patent/JP2023514687A/ja
Publication of JPWO2021165890A5 publication Critical patent/JPWO2021165890A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12N9/1037—Naringenin-chalcone synthase (2.3.1.74), i.e. chalcone synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01074—Naringenin-chalcone synthase (2.3.1.74), i.e. chalcone synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01286—Chalcone 4'-O-glucosyltransferase (2.4.1.286)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01093—4-Hydroxybenzoate geranyltransferase (2.5.1.93)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts

Abstract

本発明は、トリロバチン含量が増加した、または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した宿主細胞、植物細胞または植物を生産する方法であって、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによる宿主細胞または植物細胞の形質転換を含む方法を提供する。本発明はまた、該ポリヌクレオチドを含有する、およびまたは発現するように遺伝子修飾された宿主細胞、植物細胞および植物も提供する。

Description

本発明は、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が変化した、および／またはトリロバチン含量が変化した植物を生産するための組成物および方法に関する。
トリロバチンは、スクロースより約１００×甘いことが報告されている植物性甘味料である（Ｊｉａら、２００８）。トリロバチンは、カエデバコリンゴ（Ｍ．ｔｒｉｌｏｂａｔａ）、マルス・シーボルディ（Ｍ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）およびマルス・トリンゴ（Ｍ．ｔｏｒｉｎｇｏ）を含む一連のクラブアップル（リンゴ属）種の葉に高レベルで見出される（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、１９８２；Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚら、２０１８ｂ）。トリロバチンは栽培リンゴ（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ ａｐｐｌｅ）（マルス・ドメスティカ（Ｍ． ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））では見出されないが、野生のブドウ属種の葉では低レベルで報告されている（Ｔａｎａｋａら、１９８３）。いくつかのマテバシイ属種もトリロバチンを含有し、中国ではその葉が甜茶を作るのに使用される（Ｓｕｎら、２０１５）。甘味料としてのトリロバチンの潜在的効用は、多くの食品および飲料配合物、例えば（Ｊｉａら、２００８；ＷＡＬＴＯＮら、２０１３）で認識されているが、その希少性によって有用性は限定される。柑橘類廃棄物の一連の組織からの抽出（ＳｕｎおよびＺｈａｎｇ、２０１７）およびその後の生体内変換（Ｌｅｉら、２０１８）の方法が記述されている。酵母でのトリロバチンの生合成も達成されている（Ｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒら、２０１７）が、生合成経路における全ての酵素の知識不足によって効率的生成は阻まれている。
トリロバチン（フロレチン－４’－Ｏ－グルコシド）およびフロリジン（フロレチン－２’－Ｏ－グルコシド）は、フェニルプロパノイド経路の側枝で生成されるジヒドロカルコン（ＤＨＣ）フロレチンの位置異性体である。ＤＨＣの生合成の初期重要段階（ｆｉｒｓｔ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｓｔｅｐ）は、ｐ－クマリル－ＣｏＡをｐ－ジヒドロクマリル－ＣｏＡに変換する二重結合還元酵素（ＤＢＲ）によって触媒され得る（Ｄａｒｅら、２０１３；Ｙａｈｙａａら、２０１７）。次の段階は、フロレチンを生産するためのカルコン合成酵素（ＣＨＳ）によるｐ－ジヒドロクマリル－ＣｏＡおよび３単位のマロニル－ＣｏＡの脱炭酸縮合および環化を伴う（Ｇｏｓｃｈら、２００９；Ｉｂｄａｈら、２０１４）。該経路の最終段階は、カルコンＡ環の２’位または４’位のどちらかでグルコースを結合させるためのＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）の作用を必要とする。別のリンゴＤＨＣ、シーボルジン（３－ヒドロキシフロレチン－４’－Ｏ－グルコシド）も、フロレチンのヒドロキシフロレチンへの変換後、またはトリロバチンのシーボルジンへの直接の変換によって、４’位でグリコシル化される。
ＵＧＴは典型的には、シロイヌナズナ属では１００を超える遺伝子（Ｒｏｓｓら、２００１）、およびリンゴ（Ｍ． ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）ゲノムでは２００を超える遺伝子（Ｃａｐｕｔｉら、２０１２）が記載されている大きな遺伝子ファミリーによってコードされる。全てのＵＧＴは、活性化された糖のＵＤＰ部分に結合する保存された植物二次産物グリコシルトランスフェラーゼ（Ｐｌａｎｔ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＰＳＰＧ）モチーフを含有する（Ｌｉら、２００１）。いくつかのＵＧＴは多様な受容体基質を利用することができる（Ｈｓｕら、２０１７；Ｙａｕｋら、２０１４）が、他のＵＧＴは高度に特異的であることが示されている（Ｆｕｋｕｃｈｉ－Ｍｉｚｕｔａｎｉら、２００３；Ｊｕｇｄｅら、２００８）。系統的分類は、いくつかのＵＧＴ活性の同定を容易にすることができる；しかし、機能性を系統発生的関連性だけに帰することは一般的に難しい。リンゴでは、フロリジンへのフロレチンの２’－Ｏ－グリコシル化を触媒する複数のＵＧＴが同定されている：ＵＧＴ８８Ｆ１／ＭｄＰＧＴ１（Ｊｕｇｄｅら、２００８）、ＵＧＴ８８Ｆ８（Ｅｌｅｊａｌｄｅ－Ｐａｌｍｅｔｔら、２０１９）、ＵＧＴ８８Ｆ４、ＵＧＴ７１Ｋ１（Ｇｏｓｃｈら、２０１０）、およびＵＧＴ７１Ａ１５（Ｇｏｓｃｈら、２０１２）。トランスジェニックリンゴにおけるＵＧＴ７１Ａ１５の過剰発現は、植物の形態に影響を与えないか、またはフロリジン濃度を有意に増加させなかったが、フロリジン対フロレチンのモル比を増加させた（Ｇｏｓｃｈら、２０１２）。対照的に、ＵＧＴ８８Ｆ１（ＭｄＰＧＴ１）ノックダウン株は、フロリジン蓄積の有意な低下、重度の表現型変化を示し、リンゴ腐らん病感染に対する耐性の増加を示した（Ｄａｒｅら、２０１７；Ｚｈｏｕら、２０１９）。
インビトロでフロレチンを４’位でグリコシル化する２つのリンゴ酵素、ＵＧＴ７１Ａ１５およびＵＧＴ７５Ｌ１７（ＭｄＰｈ－４’－ＯＧＴ）が報告されている（Ｇｏｓｃｈら、２０１２；Ｙａｈｙａａら、２０１６）。しかし、これらの酵素は天然には、フロリジンのみを生産する栽培リンゴの葉および果実で発現される。今のところ、植物体におけるトリロバチンに至る生合成経路は十分に解決されていない。
植物のトリロバチンレベルを増加させる手段を有することは有益となろう。トリロバチンを生産する手段を有することも有益となろう。
植物、酵母、および／または細菌における４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性および／もしくはトリロバチン含量を調節する組成物および方法を提供すること、ならびに／または少なくとも有用な選択肢を人々に提供することが本発明の少なくとも好ましい態様の目的である。
本明細書において、特許明細書、他の外部文書、または他の情報源を参照している場合、これは概ね、本発明の特徴を論じるための文脈を提供する目的のためである。特に具体的に記載のない限り、そのような外部文書またはそのような情報源の参照は、いかなる管轄区域においても、そのような文書もしくはそのような情報源が先行技術であること、または当技術分野における通常の一般的知識の一部を形成することを認めるものと解釈されるべきではない。
第１の側面では、本発明は、トリロバチン含量が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドによる植物細胞の形質転換を含む方法で概ね構成される。
１つの態様では、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドによる植物細胞の形質転換を含む方法が提供される。
好ましい態様では、変異体は４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する。
好ましくは、変異体は、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有する。
より好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
最も好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
別の態様では、トリロバチン含量が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列、またはその変異体を含むポリヌクレオチドによる植物細胞の形質転換を含む方法が提供される。
別の態様では、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列、またはその変異体を含むポリヌクレオチドによる植物細胞の形質転換を含む方法が提供される。
好ましい態様では、変異体は、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
好ましくは、変異体は、配列番号１０～１８のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。
より好ましくは、変異体は、配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。
最も好ましくは、ポリヌクレオチドは配列番号１０の配列を含む。
別の態様では、トリロバチン含量が増加した、または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、該植物細胞または植物において、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの変異体の発現を上方制御するステップを含む方法が提供される。
別の態様では、トリロバチン含量が増加した、または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、該植物細胞または植物において、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列、またはその変異体を含むポリヌクレオチドの発現を上方制御するステップを含む方法が提供される。
いくつかの態様によれば、上方制御するステップは遺伝子操作を含む。
いくつかの態様によれば、上方制御するステップは、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する植物との交配を含む。
いくつかの態様によれば、上方制御するステップは、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現する植物との交配を含む。
ある特定の態様では、植物細胞または植物は、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、もしくはカルコン合成酵素（ＣＨＳ）および二重結合還元酵素（ＤＢＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む、またはカルコン合成酵素（ＣＨＳ）、もしくはカルコン合成酵素（ＣＨＳ）および二重結合還元酵素（ＤＢＲ）をコードするポリヌクレオチドによっても形質転換される。
適切なカルコン合成酵素としては、ＨａＣＨＳ（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号Ｑ９ＦＵＢ７．１）およびＨｖＣＨＳ２（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号Ｑ９６５６２．１）、より好ましくはＨａＣＨＳが挙げられる。適切な二重結合還元酵素としては、ＳｃＴＳＣ１３（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号ＮＰ＿０１０２６９．１）およびＫＩＴＳＣ１３（ＮＣＢＩタンパク質アクセッションＸＰ＿４５２３９２．１）、より好ましくは ＳｃＴＳＣ１３が挙げられる。
別の態様では、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチド含む遺伝子構築物が提供される。
別の態様では、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列またはその変異体を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物が提供される。
好ましくは、遺伝子構築物は、本明細書に開示されるカルコン合成酵素（ＣＨＳ）および／または二重結合還元酵素（ＤＢＲ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
別の態様では、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドを発現するように遺伝子修飾された宿主細胞が提供される。
別の態様では、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列またはその変異体を含むポリヌクレオチドを発現するように遺伝子修飾された宿主細胞が提供される。
別の態様では、本明細書に開示される遺伝子構築物を含む宿主細胞が提供される。
宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞もしくは酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞であってもよい。
いくつかの態様では、宿主細胞は、大腸菌属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター属、アシネトバクター属およびシュードモナス属からなるリストから選択される細菌細胞である。好ましくは宿主細胞は、通性嫌気性微生物、好ましくはプロテオバクテリア、特に、例えば大腸菌属の腸内細菌、好ましくは大腸菌、特に大腸菌ロゼッタ、大腸菌ＢＬ２１、大腸菌Ｋ１２、大腸菌ＭＧ１６５５、大腸菌ＳＥ１およびそれらの誘導体である。
いくつかの態様では、宿主細胞は、出芽酵母、分裂酵母、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、トルラ酵母、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、クルイベロミセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニ、アークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）、およびカンジダ・アルビカンス種からなるリストから選択される酵母細胞である。いくつかの態様では、酵母細胞はサッカロミセテ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ）である。
いくつかの態様では、宿主細胞は、アスペルギルス属種およびトリコデルマ属種からなるリストから選択される真菌細胞である。
別の態様では、トリロバチンの生合成の方法であって、宿主細胞に供給され得る、または宿主細胞中に存在し得るフロレチンの存在下で、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼを発現することができる、本明細書に開示される宿主細胞を培養するステップを含む方法が提供される。
いくつかの態様では、ＵＤＰ－グルコースが宿主細胞に供給され得る、または宿主細胞中に存在し得る。
別の態様では、トリロバチンを生産する方法であって、本明細書に開示される宿主細胞からトリロバチンを抽出するステップを含む方法が提供される。
別の態様では、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドを発現するように遺伝子修飾された植物細胞が提供される。
別の態様では、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列またはその変異体を含むポリヌクレオチドを発現するように遺伝子修飾された植物細胞が提供される。
別の態様では、本明細書に開示される植物細胞を含む植物が提供される。
別の態様では、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が変化した植物を選択する方法であって、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドの発現変化について植物をテストするステップを含む方法が提供される。
別の態様では、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が変化した植物を選択する方法であって、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列またはその変異体を含むポリヌクレオチドの発現変化について植物をテストするステップを含む方法が提供される。
別の態様では、トリロバチン含量が変化した植物を選択する方法であって、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドの発現変化について植物をテストするステップを含む方法が提供される。
別の態様では、トリロバチン含量が変化した植物を選択する方法であって、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列またはその変異体を含むポリヌクレオチドの発現変化について植物をテストするステップを含む方法が提供される。
別の態様では、本明細書に開示されるトリロバチン含量が増加した、または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した植物細胞または植物を生産する方法によって生産される植物細胞または植物が提供される。
別の態様では、本明細書に開示されるトリロバチン含量が変化した、または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が変化した植物を選択する方法によって選択される植物細胞または植物が提供される。
別の態様では、本明細書に開示される方法のいずれか１つによって生産される植物の群または集団が提供される。
別の態様では、トリロバチンを生産する方法であって、本明細書に開示されるトリロバチン含量または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性の変化を有する植物細胞または植物からトリロバチンを抽出するステップを含む方法が提供される。
別の態様では、トリロバチンを生産する方法であって、ＵＤＰ－グルコースおよび、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは該ポリペプチドの変異体、または配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列もしくはその変異体を含むポリヌクレオチドをコードする発現構築物の発現産物とフロレチンを接触させて、トリロバチンを得るステップを含む方法が提供される。
本明細書に開示された一連の数（例えば、１～１０）への言及は、その範囲内の全ての有理数（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９および１０）、および同様にその範囲内の有理数の任意の範囲（例えば、２～８、１．５～５．５および３．１～４．７）への言及も包含し、したがって、本明細書に明示的に開示された全ての範囲の全ての部分範囲はこれにより明示的に開示されることが意図される。これらは、具体的に意図されたものの例にすぎず、列挙された最低値と最高値の間の数値の全ての可能性のある組合せが、同じように本出願で明示的に述べられているとみなされるべきである。
本発明はまた、本出願の明細書に個別にまたは集合的に言及または示された部分、要素および特徴、ならびに任意の２つ以上の前記部分、要素または特徴の任意のまたは全ての組合せで構成されていると概ね言うこともでき、本発明が関連する技術分野において既知の同等物を有する具体的な整数が本明細書で言及される場合、そのような既知の同等物は、個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれるとみなされる。
本発明は概ね上に定義された通りであるが、当業者は、本発明がそれに限定されないこと、および以下の説明が示す例の態様も本発明が含むことを理解するであろう。
本発明はこれより、添付図面を参照しながら記載される。
図１は、「ロイヤルガラ（Ｒｏｙａｌ Ｇａｌａ）」×Ｙ３分離集団におけるトリロバチン生産の遺伝子マッピングを示す図である。（Ａ）トリロバチン遺伝子座は、ＩＲＳＣ ８Ｋ ＳＮＰアレイ（Ｃｈａｇｎｅら、２０１２）を使用してＹ３のＬＧ７の塩基の近くに位置付けられた。センチモルガン（ｃＭ）での遺伝子の位置が左側に、塩基対の物理的位置が右側に示されている（「ゴールデンデリシャス」倍過半数体アセンブリＧＤＤＨ１３ ｖ１．１に基づく）。３つのＨＲＭ－ＳＮＰマーカーの物理的位置（表１）が示されている。（Ｂ）「ゴールデンデリシャス」ｖ１．０ｐアセンブリ（上）および倍過半数体アセンブリＧＤＤＨ１３ ｖ１．１（下）におけるトリロバチン遺伝子座のゲノム領域。各アセンブリの遺伝子座で同定された２つのＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子の物理的位置が遺伝子モデルの下に示されている。黒い遺伝子モデルはＰＧＴ２に対応し、斑点モデルはＰＧＴ３に対応する。 図２は、クラブアップルの交配種「アダムス（Ａｄａｍｓ）」の花由来の４’－ｏＧＴ活性の活性指向の精製を示す図である。活性画分が濃い灰色のバーとして示されている。（Ａ）Ｑ－セファロースクロマトグラフィーによる精製。（Ｂ）Ｑ－セファロースからのプール画分を使用したフェニルセファロースクロマトグラフィーによる精製。（Ｃ）フェニルセファロースからのプール画分を使用したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５クロマトグラフィーによる精製。溶出緩衝液のタンパク質濃度（２８０ｎｍ）、酵素活性、プール画分およびＮａＣｌまたは（ＮＨ４）２ＳＯ４勾配が示されている。（Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５クロマトグラフィーによる精製後の４つの活性画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析がレーン１～４に示されている。Ｍ＝Ｐｒｅｍｉｘｅｄ Ｂｒｏａｄタンパク質マーカー（Ｔａｋａｒａ、大連、中国）。矢印はＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に送られたバンドを示す。 図３は、ミカイドウ（Ｍａｌｕｓ ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ「Ｍａｋｉｎｏ」）の花弁由来の２’－ｏＧＴ活性の活性指向の精製を示す図である。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ クロマトグラフィーによる精製後（Ａ）、異なる２’－Ｏ－ＧＴ酵素活性を有する３つのタンパク質画分（灰色のバー）がＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析された（Ｂ）、レーン１～３。Ｍ＝Ｐｒｅｍｉｘｅｄ Ｂｒｏａｄタンパク質マーカー（Ｔａｋａｒａ、大連、中国）。矢印はＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に送られたバンドを示す。 図４は、ＰＧＴ１～３の発現および生化学的分析を示す図である。ＰＧＴ２（Ａ）、ＰＧＴ３（Ｂ）およびＰＧＴ１（Ｃ）の発現が、トリロバチンのみを含有する３つのリンゴ属系統種（黒いバー）、トリロバチンおよびフロリジンを含有する３つのリンゴ属系統種（白いバー）、およびフロリジンのみを含有する３つのリンゴ属系統種（灰色のバー）において遺伝子特異的プライマーを使用したｑＲＴ－ＰＣＲによって分析された（表２）。ＲＧ＝「ロイヤルガラ」。データは３つの生物学的反復の平均（±ＳＥ）である。発現は、（Ａ）および（Ｂ）ではリンゴ（Ｍ． ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）「ふじ（Ｆｕｊｉ）」と比べて、（Ｃ）ではマルス・トリンゴイデス（Ｍ． ｔｏｒｉｎｇｏｉｄｅｓ）と比べて示されている（１と設定された値）。フロレチンおよびＵＤＰ－グルコースの存在下、マルス・トリンゴイデス由来の組換えＰＧＴ２（Ｅ）、マルス・シーボルディ由来のＰＧＴ３（Ｆ）、リンゴ「ふじ」由来のＰＧＴ１（Ｇ）、および空ベクター対照（Ｈ）によって形成された産物がＨＰＬＣによって分析され、真正標準品（Ｄ）と比較された。Ｐ＝フロリジン、Ｔ＝トリロバチン、およびＰｔ＝フロレチン。 図４は、ＰＧＴ１～３の発現および生化学的分析を示す図である。ＰＧＴ２（Ａ）、ＰＧＴ３（Ｂ）およびＰＧＴ１（Ｃ）の発現が、トリロバチンのみを含有する３つのリンゴ属系統種（黒いバー）、トリロバチンおよびフロリジンを含有する３つのリンゴ属系統種（白いバー）、およびフロリジンのみを含有する３つのリンゴ属系統種（灰色のバー）において遺伝子特異的プライマーを使用したｑＲＴ－ＰＣＲによって分析された（表２）。ＲＧ＝「ロイヤルガラ」。データは３つの生物学的反復の平均（±ＳＥ）である。発現は、（Ａ）および（Ｂ）ではリンゴ（Ｍ． ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）「ふじ（Ｆｕｊｉ）」と比べて、（Ｃ）ではマルス・トリンゴイデス（Ｍ． ｔｏｒｉｎｇｏｉｄｅｓ）と比べて示されている（１と設定された値）。フロレチンおよびＵＤＰ－グルコースの存在下、マルス・トリンゴイデス由来の組換えＰＧＴ２（Ｅ）、マルス・シーボルディ由来のＰＧＴ３（Ｆ）、リンゴ「ふじ」由来のＰＧＴ１（Ｇ）、および空ベクター対照（Ｈ）によって形成された産物がＨＰＬＣによって分析され、真正標準品（Ｄ）と比較された。Ｐ＝フロリジン、Ｔ＝トリロバチン、およびＰｔ＝フロレチン。 図５は、Ｎｉ２＋親和性クロマトグラフィーによって精製された組換えＰＧＴ２（レーン１～６）およびＰＧＴ１（レーン８～１３）のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。４０ｍＭイミダゾール緩衝液を用いて溶出されたＰＧＴ２の粗酵素画分（レーン１、２）および２５０ｍＭイミダゾール緩衝液を用いた４つの精製画分（レーン３～６）。２５０ｍＭイミダゾール緩衝液を用いて溶出されたＰＧＴ１の４つの精製画分（レーン８～１１）、および４０ｍＭイミダゾール緩衝液を用いて溶出された粗酵素画分（レーン１２、１３）。Ｍ＝Ｐｒｅｍｉｘｅｄ Ｂｒｏａｄタンパク質マーカー（Ｔａｋａｒａ、大連、中国）。矢印は、精製組換えＰＧＴ２（左）およびＰＧＴ１（右）を示す。 図６は、リンゴ属由来のＰＧＴ２配列のアミノ酸アラインメントを示す図である。アミノ酸配列はＧｅｎｅｉｏｕｓ（バージョンＲ１０、ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ）を使用して整列された。下線は、全てのＵＦＧＴで見出された保存されたＰＳＰＧモチーフ（Ｌｉら、２００１）である。 図６は、リンゴ属由来のＰＧＴ２配列のアミノ酸アラインメントを示す図である。アミノ酸配列はＧｅｎｅｉｏｕｓ（バージョンＲ１０、ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ）を使用して整列された。下線は、全てのＵＦＧＴで見出された保存されたＰＳＰＧモチーフ（Ｌｉら、２００１）である。 図７は、ＰＧＴ２によって形成された産物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を示す図である。基準ピークプロット：（Ａ）フロレチン（Ｐｔ）およびトリロバチン（Ｔ）の混合標準産物；（Ｂ）ＰＧＴ２＋フロレチン＋ＵＤＰ－グルコース；（Ｃ）３－ＯＨフロレチン（３Ｐｔ）＋シーボルジン（Ｓ）の混合標準産物；（Ｄ）ＰＧＴ２＋３－ＯＨフロレチン＋ＵＤＰ－グルコース；質量スペクトル：（Ｅ）フロレチンのフルスキャン、ＭＳ２およびＭＳ３データ；（Ｆ）トリロバチンのフルスキャン、ＭＳ２およびＭＳ３データ；（Ｇ）３－ＯＨフロレチンのフルスキャン、ＭＳ２およびＭＳ３データ；ならびに（Ｈ）シーボルジンのフルスキャン、ＭＳ２およびＭＳ３データ。 図８は、ＰＧＴ２、ケルセチンおよびＵＤＰ－グルコースを含有する反応のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を示す図である。基準ピークプロット：（Ａ）ケルセチン（Ｑ）およびケルセチン－７－Ｏ－グルコシド（Ｑ７Ｇ）の混合標準産物；（Ｂ）ＰＧＴ２＋ケルセチン＋ＵＤＰ－グルコース；（Ｃ）ケルセチン－３－Ｏ－グルコシド（Ｑ３Ｇ）の標準産物；質量スペクトル：（Ｄ）ケルセチンのフルスキャン、ＭＳ２およびＭＳ３データ；（Ｅ）ケルセチン－７－Ｏ－グルコシドのフルスキャン、ＭＳ２およびＭＳ３データ；（Ｆ）ケルセチン－３－Ｏ－グルコシドのフルスキャン、ＭＳ２およびＭＳ３データ。 図９は、組換えＰＧＴ２およびＰＧＴ１の生化学的特性を示す図である。ＰＧＴ２（Ａ）およびＰＧＴ１（Ｂ）の活性が、３つの緩衝液系を使用して、３７℃、ｐＨ範囲４～１２にわたってテストされた。ＰＧＴ２およびＰＧＴ１の温度依存的活性が、それぞれ（Ｃ）および（Ｄ）に示されている。ＵＤＰ－グルコース（Ｆ）のＫｍ値は、固定フロレチン濃度５００μＭを用いて２～５００μＭの濃度で決定された。全てのデータは３つの反復の平均（±ＳＥ）である。Ｋｍ値はＳｉｇｍａｐｌｏｔで非線形回帰によって算出された。 図９は、組換えＰＧＴ２およびＰＧＴ１の生化学的特性を示す図である。ＰＧＴ２（Ａ）およびＰＧＴ１（Ｂ）の活性が、３つの緩衝液系を使用して、３７℃、ｐＨ範囲４～１２にわたってテストされた。ＰＧＴ２およびＰＧＴ１の温度依存的活性が、それぞれ（Ｃ）および（Ｄ）に示されている。ＵＤＰ－グルコース（Ｆ）のＫｍ値は、固定フロレチン濃度５００μＭを用いて２～５００μＭの濃度で決定された。全てのデータは３つの反復の平均（±ＳＥ）である。Ｋｍ値はＳｉｇｍａｐｌｏｔで非線形回帰によって算出された。 図９は、組換えＰＧＴ２およびＰＧＴ１の生化学的特性を示す図である。ＰＧＴ２（Ａ）およびＰＧＴ１（Ｂ）の活性が、３つの緩衝液系を使用して、３７℃、ｐＨ範囲４～１２にわたってテストされた。ＰＧＴ２およびＰＧＴ１の温度依存的活性が、それぞれ（Ｃ）および（Ｄ）に示されている。ＵＤＰ－グルコース（Ｆ）のＫｍ値は、固定フロレチン濃度５００μＭを用いて２～５００μＭの濃度で決定された。全てのデータは３つの反復の平均（±ＳＥ）である。Ｋｍ値はＳｉｇｍａｐｌｏｔで非線形回帰によって算出された。 図１０は、タバコにおけるトリロバチンおよびフロリジン生産のエンジニアリングを示す図である。ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉に、ｐＨＥＸ２＿ＰＧＴ２、ｐＨＥＸ２＿ＰＧＴ１または陰性対照ｐＨＥＸ２＿ＧＵＳ（それぞれ、ｐＨＥＸ２＿ＭｄＭｙｂ１０、ｐＨＥＸ２＿ＭｄＣＨＳ、ｐＨＥＸ２＿ＭｄＤＢＲ＋ｐＢＩＮ６１－ｐ１９と組み合わせた）を含有するアグロバクテリウム懸濁液を浸潤させた。トリロバチンおよびフロリジンの生産は、浸潤７日後にＤｉｏｎｅｘ－ＨＰＬＣによって解析された。実験は三重に行われ、ただ一つの代表的なトレースが示されている。（Ａ）ｐＨＥＸ２＿ＰＧＴ２；（Ｂ）トリロバチン［Ｔ］標準物；（Ｃ）ｐＨＥＸ２＿ＰＧＴ１；（Ｄ）フロリジン［Ｐ］標準物；（Ｅ）陰性対照ｐＨＥＸ２＿ＧＵＳ。 図１１は、トランスジェニック「ＧＬ３」リンゴ株におけるＰＧＴ２発現レベルおよびジヒドロカルコン含量を示す図である。（Ａ）１４のトランスジェニック「ＧＬ３」株（＃）におけるＰＧＴ２の相対的発現が、若葉から抽出されたＲＮＡを使用してｑＲＴ－ＰＣＲによって決定された。発現はＭｄａｃｔｉｎに対して補正され、野生型（ＷＴ）「ＧＬ３」対照（１に設定された値）と比べて示されている。（Ｂ）ＨＰＬＣによって決定されたＤＨＣ含量。データは平均±ＳＥ、生物学的反復ｎ＝３として示されている。統計解析は、ダネットの多重比較検定ｖｓ ＷＴを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで行われた。フロリジンまたはフロレチン含量に有意差は観察されなかった。有意に高いＰＧＴ２発現およびトリロバチン含量ｖｓ対照が示されている（Ｐ＜０．００１＝＊＊＊、Ｐ＜０．０１＝＊＊、Ｐ＜０．０５＝＊、ｎｓ＝有意でない）。 図１２は、ＰＧＴ２を過剰発現するトランスジェニック「ＧＬ３」植物のＨＰＬＣおよびｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す図である。（Ａ）野生型（ＷＴ）「ＧＬ３」および各トランスジェニック株（＃）におけるフロリジン（Ｐ）＋トリロバチン（Ｔ）の全含量。１４のトランスジェニック「ＧＬ３」リンゴ株におけるＰＧＴ１（Ｂ）、ＭｄＣＨＳ（Ｃ）、およびＰＧＴ３（Ｄ）の相対的発現が、若葉から抽出されたＲＮＡを使用してｑＲＴ－ＰＣＲによって決定された。発現はＭｄａｃｔｉｎに対して補正され、野生型対照（１に設定された値）と比べて示されている。データは平均±ＳＥ、ｎ＝３として示されている。統計解析は、ダネットの多重比較検定ｖｓ ＷＴを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで行われた。Ｐ＋Ｔ含量の全含量（Ａ）、ＰＧＴ１の発現（Ｂ）またはＭｄＣＨＳ（Ｃ）に有意差は観察されなかった。ＰＧＴ３発現（Ｄ）については対照より有意に多かった（Ｐ＜０．００１＝＊＊＊、Ｐ＜０．０１＝＊＊、Ｐ＜０．０５＝＊、ｎｓ＝有意でない）。 図１２は、ＰＧＴ２を過剰発現するトランスジェニック「ＧＬ３」植物のＨＰＬＣおよびｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す図である。（Ａ）野生型（ＷＴ）「ＧＬ３」および各トランスジェニック株（＃）におけるフロリジン（Ｐ）＋トリロバチン（Ｔ）の全含量。１４のトランスジェニック「ＧＬ３」リンゴ株におけるＰＧＴ１（Ｂ）、ＭｄＣＨＳ（Ｃ）、およびＰＧＴ３（Ｄ）の相対的発現が、若葉から抽出されたＲＮＡを使用してｑＲＴ－ＰＣＲによって決定された。発現はＭｄａｃｔｉｎに対して補正され、野生型対照（１に設定された値）と比べて示されている。データは平均±ＳＥ、ｎ＝３として示されている。統計解析は、ダネットの多重比較検定ｖｓ ＷＴを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで行われた。Ｐ＋Ｔ含量の全含量（Ａ）、ＰＧＴ１の発現（Ｂ）またはＭｄＣＨＳ（Ｃ）に有意差は観察されなかった。ＰＧＴ３発現（Ｄ）については対照より有意に多かった（Ｐ＜０．００１＝＊＊＊、Ｐ＜０．０１＝＊＊、Ｐ＜０．０５＝＊、ｎｓ＝有意でない）。 図１３は、トランスジェニック「ロイヤルガラ」ＰＧＴ２過剰発現株におけるジヒドロカルコン含量を示す図である。フェノール化合物が、野生型（ＷＴ）「ロイヤルガラ」および１１のトランスジェニックＰＧＴ２株（＃）の若葉から７０％メタノールおよび２％ギ酸を含有する溶液中に抽出され、ジヒドロカルコン（ＤＨＣ）含量がＤｉｏｎｅｘ－ＨＰＬＣによって決定された。（Ａ）各株における個々のジヒドロカルコンの濃度。（Ｂ）各株におけるフロリジン（Ｐ）＋トリロバチン（Ｔ）の全含量。 図１４は、リンゴ葉茶およびトリロバチン等甘味度（ｉｓｏｓｗｅｅｔｎｅｓｓ）の分析を示す図である。（Ａ）ＨＰＬＣによって決定された、野生型（ＷＴ）およびＰＧＴ２を過剰発現する２つのトランスジェニック「ＧＬ３」株（＃１、＃９）から調製されたリンゴ葉茶中の個々のフロリジン（Ｐ）およびトリロバチン（Ｔ）含量。データは、平均±ＳＥ、乾燥葉材料（ＤＭ）ｎ≧７、およびリンゴ葉茶（ＬＴ）ｎ＝３として示されている。統計解析は、ダネットの多重比較検定ｖｓ ＷＴを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで行われた。Ｐ＜０．００１＝＊＊＊でＷＴより有意に高い。（Ｂ）トリロバチンとスクロース間の等甘味度比較テスト。等甘味度は、３５．２±１．６６（Ｒ２＝０．９８）として確立された。示されたデータは平均±ＳＥ、参加者ｎ＝５である。 図１５は、トリロバチンを生産するための代謝経路を示す図である。ＴＡＬ － チロシンアンモニアリアーゼ；４ＣＬ － ４－クマル酸－ＣｏＡリガーゼ；ＤＢＲ － 二重結合還元酵素；ＣＨＳ － カルコン合成酵素；ＰＧＴ１ － フロレチン ２’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ１；ＰＧＴ２ － フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ２。 図１６は、トリロバチン生産経路の成分を発現する大腸菌によって生産されたトリロバチンの濃度を示す図である。「ＥＲＥＤ＋ＰＧＴ２」は、ＴＡＬ、４ＣＬ、ＣＨＳ２、ＥＲＥＤ、およびＰＧＴ２を発現する細胞によって生成された濃度を示す。「ＳｃＴＳＣ１３＋ＰＧＴ２」は、ＴＡＬ、４ＣＬ、ＣＨＳ２、ＴＳＣ１３、およびＰＧＴ２を発現する細胞によって生成されたトリロバチン濃度を示す。Ｃ－１’は、ＴＡＬ、４ＣＬ、ＣＨＳ２、およびＰＧＴ２を発現するが、二重結合還元酵素を欠く細胞によって生成された濃度を示す。Ｃ－２は、ＴＡＬ、４ＣＬおよびＣＨＳ２を発現する細胞によって生成された濃度を示す。Ｃ－３は、ＴＡＬおよび４ＣＬを発現する細胞によって生成された濃度を示す。 図１７は、ＨａＣＨＳ、ＳｃＴＳＣ１３、Ａｔ４ＣＬ２、ＡｔＰＡＬ２、ＡｍＣ４ＨおよびＳｃＣＰＲ１を有する背景での、４８時間および７２時間時点の、ＰＧＴ２を発現する出芽酵母によって生産されたトリロバチンの濃度を示す図である。フロレチン株対照（Ｐｔ）について、トリロバチン生産は検出されなかった。
本発明、そのいくつかの態様において、トリロバチンを生産する方法、および増加したトリロバチン含量または増加した４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する植物細胞または植物を含む宿主細胞を生産する方法に関する。
本発明は、本明細書に記載された遺伝子的、生化学的および分子的特徴付けではあるが、植物体のトリロバチン生産に関与する立体特異的グリコシルトランスフェラーゼ、フロレチングリコシルトランスフェラーゼ２（ＰＧＴ２）の同定に基づく。栽培リンゴの葉におけるＰＧＴ２の過剰発現は、トランスジェニックリンゴ葉茶のトリロバチンレベルおよび知覚された甘味の両方を有意に増加させた。
トリロバチン生産に関与する特定のグリコシルトランスフェラーゼの同定は、トリロバチンを含有する植物を育てるためのマーカー利用選択を開発できるようにし、高レベルのこの天然の低カロリー甘味料を生物工学的手段、例えば作物におけるバイオファーミングおよび酵母などの宿主細胞の代謝工学により生産できるようにする。
故に、本発明の１つの側面によれば、トリロバチン含量が増加した、または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した宿主細胞、植物細胞または植物を生産する方法であって、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドによる宿主細胞または植物細胞の形質転換を含む方法が提供される。
本発明はまた、トリロバチン含量が増加した、または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した宿主細胞、植物細胞または植物を生産する方法であって、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列、またはその変異体を含むポリヌクレオチドによる宿主細胞または植物細胞の形質転換を含む方法を提供する。
用語「トリロバチン」は本明細書で使用される場合、フロレチン－４’－Ｏ－グルコシドとも呼ばれるジヒドロカルコン配糖体を指し、その構造は以下に示される（式Ｉ）：
Figure 2023514687000001
トリロバチンは、ＩＵＰＡＣ名１－［２，６－ジヒドロキシ－４－［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）－３，４，５－トリヒドロキシ－６－（ヒドロキシメチル）オキサン－２－イル］オキシフェニル］－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパン－１－オン、およびＣＡＳ＃４１９２－９０－９を有する。
用語「フロレチン」は本明細書で使用される場合、ジヒドロナリンゲニン、フロレトールまたは３－（４－ヒドロキシフェニル）－１－（２，４，６－トリヒドロキシフェニル）プロパン－１－オンとも呼ばれるジヒドロカルコンを指し、その構造は以下に示される（式ＩＩ）：
Figure 2023514687000002
用語「４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する」は本明細書で使用される場合、４－水酸基での基質へのグルコース部分の結合を指す。
トリロバチン生合成は、典型的には補助基質フロレチンおよびＵＤＰ－グルコースを必要とし、４－水酸基でのフロレチンへのグルコース部分の結合を伴う。４－水酸基でのフロレチンへのグルコース部分の結合は、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素によって典型的には達成される。そのようなグリコシルトランスフェラーゼ酵素は、活性化されたヌクレオチド糖（例えばＵＤＰ－グルコース）から、受容体分子（例えばフロレチン）の４－水酸基への糖部分（例えばグルコース）の転移を触媒する。本発明者らは、フロレチングリコシルトランスフェラーゼ２（ＰＧＴ２）と呼ばれる、植物体におけるトリロバチン生産に関与する立体特異的グリコシルトランスフェラーゼを同定した。
本出願者らは、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド（配列番号１～９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０～１８）を、表１２にまとめられているように同定した。
本出願者らは、開示された４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼポリペプチド配列の全て（配列番号１～９）が有意な配列保存を有し、互いの変異体であることを示した（図６）。
同様に本出願者らは、開示された４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列の全て（配列番号１０～１８）が有意な配列保存を有し、互いの変異体であることを示した。
これらのポリヌクレオチド配列（配列番号１０～１８）またはポリペプチド配列（配列番号１～９）をコードする配列を含有する遺伝子構築物、ベクターおよび植物が本明細書に開示される。
ある特定の態様では、本明細書に開示された遺伝子構築物およびベクターを含む植物および宿主細胞が提供される。
いくつかの態様では、適切な対照植物と比べて４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が変化した植物、および適切な対照植物と比べてトリロバチン含量が変化した植物が提供される。いくつかの態様では、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加し、トリロバチンが増加した植物が提供される。
他の態様では、そのような植物の生産の方法、およびそのような植物の選別の方法が提供される。
適切な対照植物としては、同じ種もしくは変種の非形質転換植物、または対照構築物で形質転換された植物が挙げられる。
ポリヌクレオチドおよび断片
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、任意の長さの、ただし好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、非限定的な例として、遺伝子のコードおよび非コード配列、センスおよびアンチセンス配列相補体、エキソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、組換えポリペプチド、単離および精製された天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡ配列、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ配列、核酸プローブ、プライマーおよび断片を含む。
本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列の「断片」は、目的の標的に特異的にハイブリダイズすることができる、連続するヌクレオチドの部分配列、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド長の配列である。本明細書に開示される断片は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも６０ヌクレオチドの連続するヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド配列の断片は、アンチセンス、遺伝子サイレンシング、三重らせんもしくはリボザイム技術において使用することができ、またはプライマー、プローブとしてマイクロアレイに含めることができ、または本明細書に開示されるポリヌクレオチドベースの選択方法において使用することができる。
用語「プライマー」は、鋳型にハイブリダイズされ、鋳型に相補的なポリヌクレオチドの重合を開始させるのに使用される、通常は遊離３’ＯＨ基を有する短いポリヌクレオチドを指す。そのようなプライマーは、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１１、より好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１３、より好ましくは少なくとも１４、より好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６、より好ましくは少なくとも１７、より好ましくは少なくとも１８、より好ましくは少なくとも１９、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長である。
用語「プローブ」は、ハイブリダイゼーションベースのアッセイにおいて、プローブに相補的なポリヌクレオチド配列を検出するのに使用される短いポリヌクレオチドを指す。プローブは、本明細書に定義されるポリヌクレオチドの「断片」からなってもよい。好ましくはそのようなプローブは、少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも３００、より好ましくは少なくとも４００、および最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチド長である。
ポリペプチドおよび断片
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結された、完全長タンパク質を含む、任意の長さの、ただし好ましくは少なくとも５個のアミノ酸のアミノ酸鎖を包含する。本明細書に開示されるポリペプチドは精製された天然産物であってもよく、または組換えもしくは合成手法を使用して部分的もしくは完全に生産されてもよい。該用語は、ポリペプチド、ポリペプチドの集合体、例えば二量体もしくは他の多量体、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチド変異体、またはそれらの誘導体を指すことがある。
ポリペプチドの「断片」は、生物活性に必要とされる機能を果たすおよび／またはポリペプチドの三次元構造を提供するポリペプチドの部分配列である。該用語は、上記の酵素活性を果たすことができるポリペプチド、ポリペプチドの集合体、例えば二量体もしくは他の多量体、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチド変異体、またはそれらの誘導体を指すことがある。
用語「単離された」は、本明細書に開示されたポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用される場合、それらの天然の細胞環境から取り除かれた配列を指すのに使用される。単離された分子は、生化学的手法、組換え手法、および合成手法を含む任意の方法または方法の組合せによって得ることができる。
用語「組換え」は、その天然の状況においてそれを取り囲む配列から取り除かれ、および／またはその天然の状況には存在しない配列と組み換えられるポリヌクレオチド配列を指す。
「組換え」ポリペプチド配列は、「組換え」ポリヌクレオチド配列からの翻訳によって生産される。
特定の属または種に由来する本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して用語「由来する」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その属または種で天然に見出されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同じ配列を有することを意味する。したがって、特定の属または種に由来するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、合成的または組換え的に生産されてもよい。
変異体
本明細書で使用される場合、用語「変異体」は、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠失され、置換され、または付加された、具体的に同定された配列とは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体、または天然に存在しない変異体であってもよい。変異体は同じ種由来または他の種由来であってもよく、ホモログ、パラログおよびオルソログを包含することがある。本明細書に記載された変異体は、ポリペプチドのコード配列の部位特異的突然変異誘発により、または異なる天然に存在するポリペプチドのコード配列からのドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピング」）によって作出することもできる。本明細書に記載された機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を修飾するための手法は公知であり、とりわけ、指向性進化法、部位特異的突然変異誘発法およびランダム突然変異誘発手法が挙げられ、ポリペプチドの特定の活性を増加させ、基質特異性を変化させ、発現レベルを変化させ、細胞内位置を変化させ、またはポリペプチド－ポリペプチド相互作用を望ましいように修飾するのに有用であり得る。そのような修飾されたポリペプチドは、変異体とみなされる。
ある特定の態様では、本明細書に開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は、本明細書に開示されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同じまたは類似した生物活性を有する。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関して用語「変異体」は、本明細書に定義されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの全ての形態を包含する。
ポリヌクレオチド変異体
変異体ポリヌクレオチド配列は、本明細書に開示される配列と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、および最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を好ましくは示す。同一性は、本明細書に開示されたポリヌクレオチドの少なくとも２０ヌクレオチド位置、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも５００ヌクレオチド位置の、および最も好ましくは全長にわたる比較ウィンドウにわたって見出される。
ポリヌクレオチド配列同一性は、以下のように決定することができる。対象ポリヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｕｓｏｖａ、Ｔｈｏｍａｓ Ｌ． Ｍａｄｄｅｎ（１９９９）、「Ｂｌａｓｔ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ－ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． １７４：２４７～２５０頁）で、ＢＬＡＳＴＮ（ＢＬＡＳＴプログラムスイート、バージョン２．２．５［Ｎｏｖ ２００２］からの）を使用して候補ポリヌクレオチド配列に対して比較される。低複雑性部分のフィルタリングをオフにするべき点を除いて、ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメータが利用される。
ポリヌクレオチド配列の同一性は、以下のユニックスコマンドラインパラメータを使用して調べることができる：
ｂｌ２ｓｅｑ －ｉ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ１－ｊ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ２ －Ｆ Ｆ －ｐ ｂｌａｓｔｎ
パラメータ－Ｆ Ｆは、低複雑性区域のフィルタリングをオフにする。パラメータ－ｐは、配列のペアに適したアルゴリズムを選択する。ｂｌ２ｓｅｑプログラムは、配列同一性を同一のヌクレオチドの数およびパーセンテージの両方としてライン「Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝」に報告する。
ポリヌクレオチド配列同一性は、グローバル配列アラインメントプログラム（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ． Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ． Ｄ．（１９７０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８、４４３～４５３頁）を使用して、候補ポリヌクレオチド配列と対象ポリヌクレオチド配列との重複の全長にわたって算出することもできる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムの完全実装は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのｎｅｅｄｌｅプログラム（Ｒｉｃｅ，Ｐ． Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．およびＢｌｅａｓｂｙ，Ａ． ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｊｕｎｅ ２０００、１６巻、６号、２７６～２７７頁）に見出され、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／から入手することができる。欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）サーバーは、２つの配列間のＥＭＢＯＳＳ－ｎｅｅｄｌｅグローバルアラインメントをオンラインで行うための設備もｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／で提供している。
あるいは、２つの配列を最適グローバルアラインメントを、ターミナルギャップにペナルティを与えることなく計算するＧＡＰプログラムが使用されてもよい。ＧＡＰは以下の論文に記載されている：Ｈｕａｎｇ，Ｘ．（１９９４）Ｏｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ． Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １０、２２７～２３５頁。
ポリヌクレオチドの％配列同一性を算出するための別の方法は、比較される配列をＣｌｕｓｔａｌ Ｘ（Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎら、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２３、４０３～５頁）を使用して整列させることに基づく。
本発明のポリヌクレオチド変異体はまた、１つまたは複数の具体的に同定された配列の機能的同等性を保存している可能性があり、偶然によって生じたとは合理的に思われ得ない、１つまたは複数の具体的に同定された配列と類似性を示すものも包含する。ポリペプチドに関するそのような配列類似性は、上に記載されたＢＬＡＳＴプログラムスイートから公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して決定することができる。
ポリヌクレオチド配列の類似性は、以下のユニックスコマンドラインパラメータを使用して調べることができる：
ｂｌ２ｓｅｑ －ｉ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ１ －ｊ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ２ －Ｆ Ｆ －ｐ ｔｂｌａｓｔｘ
パラメータ－Ｆ Ｆは、低複雑性区域のフィルタリングをオフにする。パラメータ－ｐは、配列のペアに適したアルゴリズムを選択する。このプログラムは配列間の類似性の領域を見出し、そのような領域ごとに、ランダム配列を含有する固定された参照サイズのデータベース中にそのようなマッチを偶然認めることが期待され得る期待回数である「Ｅ値」を報告する。このデータベースのサイズは、ｂｌ２ｓｅｑプログラムでのデフォルトによって設定される。１よりはるかに少ない小さなＥ値に関して、Ｅ値はほぼ、そのようなランダムマッチの確率である。
変異体ポリヌクレオチド配列は、具体的に同定された配列のいずれか１つと比較した場合、１×１０－１０未満、より好ましくは１×１０－２０未満、より好ましくは１×１０－３０未満、より好ましくは１×１０－４０未満、より好ましくは１×１０－５０未満、より好ましくは１×１０－６０未満、より好ましくは１×１０－７０未満、より好ましくは１×１０－８０未満、より好ましくは１×１０－９０未満、および最も好ましくは１×１０－１００未満のＥ値を好ましくは示す。
あるいは、本明細書に開示される変異体ポリヌクレオチドは、指定されたポリヌクレオチド配列、またはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」、およびその文法的同等物は、温度および塩濃度の定義された条件下で標的ポリヌクレオチド分子（サザンブロットまたはノーザンブロットなどのＤＮＡまたはＲＮＡブロットに固定化された標的ポリヌクレオチド分子など）にハイブリダイズするポリヌクレオチド分子の能力を指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする能力は、最初にあまりストリンジェントでない条件下でハイブリダイズし、次いで所望のストリンジェンシーにストリンジェンシーを高めることによって決定することができる。
約１００塩基長を超えるポリヌクレオチド分子に関して、典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、天然の二本鎖の融解温度（Ｔｍ）より低い２５～３０℃以下（例えば、１０℃）である（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ参照）。約１００塩基を超えるポリヌクレオチド分子のＴｍは、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ－ｌｏｇ（Ｎａ＋）によって算出することができる。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ、１９６２、ＰＮＡＳ ８４：１３９０頁）。１００塩基長を超えるポリヌクレオチドの典型的なストリンジェントな条件は、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液で予洗；６５℃、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで一晩ハイブリダイズ；その後、６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回、各３０分の洗浄および６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回、各３０分の洗浄などのハイブリダイゼーション条件となるであろう。
１００塩基未満の長さを有するポリヌクレオチド分子に関して、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍより５～１０℃低い。平均すると、１００ｂｐ未満の長さのポリヌクレオチド分子のＴｍは、およそ（５００／オリゴヌクレオチド長）℃低下する。
ペプチド核酸（ＰＮＡ）として知られるＤＮＡ模倣体（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９１年１２月６日；２５４（５０３７）：１４９７～５００）に関して、Ｔｍ値はＤＮＡ－ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドのＴｍ値より高く、Ｇｉｅｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９８年１１月１日；２６（２１）：５００４～６頁に記載された式を使用して算出することができる。１００塩基未満の長さを有するＤＮＡ－ＰＮＡハイブリッドの例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍより５～１０℃低い。
本明細書に開示される変異体ポリヌクレオチドはまた、本明細書に開示される配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重の結果、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに類似した活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列を変えない配列変化は「サイレント変異」である。ＡＴＧ（メチオニン）およびＴＧＧ（トリプトファン）を除いて、同じアミノ酸に対する他のコドンは、例えば特定の宿主生物におけるコドン使用を最適化するための、当技術分野で認識されている手法によって変えることができる。
コードされたポリペプチド配列に、その生物活性を著しく変化させることなく１つまたは複数のアミノ酸の保存的置換をもたらすポリヌクレオチド配列変化もまた本発明に含まれる。当業者は、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法を知っているであろう（例えば、Ｂｏｗｉｅら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７、１３０６頁参照）。
コードされたポリペプチド配列でのサイレント変異および保存的置換による変異体ポリヌクレオチドは、前に記載されているｔｂｌａｓｔｘアルゴリズムにより、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）からのＢＬＡＳＴプログラムスイート（バージョン２．２．５［Ｎｏｖ ２００２］）から公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して決定することができる。
４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼとして本明細書に開示された変異体ポリヌクレオチドの機能は、例えば、実施例セクションに記載されているようにそのような配列を細菌で発現させ、コードされたタンパク質の活性をテストすることによって評価することができる。変異体の機能は、同じく本明細書において実施例セクションに記載されているように、植物中の４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性またはトリロバチン含量を変化させるその能力についてテストすることもできる。
ポリペプチド変異体
ポリペプチドに関して用語「変異体」は、天然に存在する、組換えおよび合成により生産されたポリペプチドを包含する。変異体ポリペプチド配列は、本発明の配列と好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、および最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、本明細書に開示されるポリペプチドの少なくとも２０個のアミノ酸位置、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸位置、より好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸位置の、および最も好ましくは全長にわたる比較ウィンドウにわたって見出される。
ポリペプチド配列同一性は、以下の方法で決定することができる。対象ポリペプチド配列は、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑのＢＬＡＳＴＰ（ＢＬＡＳＴプログラムスイート、バージョン２．２．５［Ｎｏｖ ２００２］からの）を使用して、候補ポリペプチド配列と比較される。低複雑性領域のフィルタリングがオフにされるべき点を除いて、ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメータが利用される。
ポリペプチド配列同一性は、グローバル配列アラインメントプログラムを使用して、候補ポリペプチド配列と対象ポリペプチド配列の間の重複の全長にわたって算出することもできる。上で論じたように、ＥＭＢＯＳＳ－ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／で利用可能）およびＧＡＰ（Ｈｕａｎｇ、Ｘ．（１９９４）Ｏｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ． Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １０、２２７～２３５頁）もポリペプチド配列同一性の算出に適切なグローバル配列アラインメントプログラムである。
ポリペプチド％配列同一性を算出する別の方法は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ（Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎら、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２３、４０３～５頁）を使用して比較される配列を整列させることに基づく。
本明細書に開示されるポリペプチド変異体はまた、１つまたは複数の具体的に同定された配列の機能的同等性を保存している可能性があり、偶然によって生じたとは合理的に思われ得ない、１つまたは複数の具体的に同定された配列と類似性を示すものも包含する。ポリペプチドに関するそのような配列類似性は、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）からのＢＬＡＳＴプログラムスイート（バージョン２．２．５［Ｎｏｖ ２００２］）から公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して決定されてもよい。ポリペプチド配列の類似性は、以下のユニックスコマンドラインパラメータを使用して調べることができる：
ｂｌ２ｓｅｑ －ｉ ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ１－ｊ ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ２ －Ｆ Ｆ －ｐ ｂｌａｓｔｐ
パラメータ－Ｆ Ｆは、低複雑性区域のフィルタリングをオフにする。パラメータ－ｐは、配列のペアに適したアルゴリズムを選択する。このプログラムは配列間の類似性の領域を見出し、そのような領域ごとに、ランダム配列を含有する固定された参照サイズのデータベース中にそのようなマッチを偶然認めることが期待され得る期待回数である「Ｅ値」を報告する。１よりはるかに少ない小さなＥ値に関して、これはほぼ、そのようなランダムマッチの確率である。
変異体ポリペプチド配列は、具体的に同定された配列のいずれか１つと比較した場合、１×１０－１０未満、より好ましくは１×１０－２０未満、より好ましくは１×１０－３０未満、より好ましくは１×１０－４０未満、より好ましくは１×１０－５０未満、より好ましくは１×１０－６０未満、より好ましくは１×１０－７０未満、より好ましくは１×１０－８０未満、より好ましくは１×１０－９０未満、および最も好ましくは１×１０－１００未満のＥ値を好ましくは示す。
その生物活性を有意に変化させることがない、記載されたポリペプチド配列の１つまたは複数のアミノ酸の保存的置換もまた本発明に含まれる。当業者は、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法を知っているであろう（例えば、Ｂｏｗｉｅら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７、１３０６頁参照）。
４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性をアッセイする方法は当技術分野で周知であり、例えば、ＬＣ－ＭＳのための標準的なグリコシルトランスフェラーゼ酵素アッセイおよび酵素ＵＤＰ－グルコースピロホスホリラーゼに関する放射性アッセイが挙げられる。４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼとしてのポリペプチド変異体の機能は、本明細書において実施例セクションに記載された方法によって評価することもできる。
変異体を同定する方法
物理的方法
変異体ポリペプチドは、ＰＣＲベースの方法（Ｍｕｌｌｉｓら編 １９９４ Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ）を使用して同定されてもよい。典型的には、本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子の変異体をＰＣＲによって増幅するのに有用なプライマーのポリヌクレオチド配列は、対応するアミノ酸配列の保存領域をコードする配列に基づき得る。
あるいは、当業者に周知のライブラリースクリーニング方法が使用されてもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８７）。プローブ配列の変異体を同定する場合、正確な配列マッチが探索される場合と比べて、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーは典型的には下げられるであろう。
ポリペプチド変異体は、物理的方法によって、例えば、本明細書に開示されたポリペプチドに対して産生された抗体を使用して発現ライブラリーをスクリーニングすること（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８７）、またはそのような抗体の助けを借りて天然源からポリペプチドを同定することによって同定することもできる。
コンピュータベースの方法
ポリヌクレオチド変異体およびポリペプチド変異体の両方を含む本明細書に開示される変異体配列は、配列データベース（パブリックドメインデータベースとしては、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ、ＰＩＲ等が挙げられる）を検索するためのパブリックドメイン配列アラインメントアルゴリズムおよび配列類似性検索ツールを使用して、当業者に周知のコンピュータベースの方法によって同定することもできる。例えばオンライン情報源の、例えばＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２９：１～１０頁および１１～１６頁、２００１参照。類似性検索は標的配列を読み出し、解析される配列（すなわち、クエリ配列）と比較のために整列させる。配列比較アルゴリズムは、各アラインメントに総合スコアを割り当てるスコアリングマトリックスを使用する。
配列データベース中の変異体を同定するのに有用なプログラムの例示的なファミリーは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮおよびｔＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡＳＴプログラムスイート（バージョン２．２．５［Ｎｏｖ ２００２］）であり、（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）または国立医学図書館国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）３８Ａ棟、８Ｎ８０５室、ベセスダ、ＭＤ ２０８９４ ＵＳＡ）から公的に利用可能である。ＮＣＢＩサーバーは、プログラムを使用していくつかの公的に利用可能な配列データベースをスクリーニングするための設備も提供している。ＢＬＡＳＴＮは、ヌクレオチドクエリ配列をヌクレオチド配列データベースに対して比較する。ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸クエリ配列をタンパク質配列データベースに対して比較する。ＢＬＡＳＴＸは、全てのリーディングフレームで翻訳されたヌクレオチドクエリ配列をタンパク質配列データベースに対して比較する。ｔＢＬＡＳＴＮは、タンパク質クエリ配列を、全てのリーディングフレームで動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して比較する。ｔＢＬＡＳＴＸは、ヌクレオチドクエリ配列の６フレーム翻訳を、ヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳に対して比較する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトパラメータを用いて使用されてもよく、またはパラメータはスクリーニングを精密にするために必要に応じて変更されてもよい。
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡＳＴファミリーアルゴリズムの使用は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９～３４０２、１９９７の刊行物に記載されている。
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ、ｔＢＬＡＳＴＸ、または類似したアルゴリズムによって生成される、クエリ配列による１つまたは複数のデータベース配列に対する「ヒット」は、配列の類似した部分を整列させ、同定する。ヒットは、類似度および配列重複の長さの順に並べられる。データベース配列に対するヒットは、一般に、クエリ配列の配列長のほんの一部の重複に相当する。
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮおよびｔＢＬＡＳＴＸアルゴリズムは、アラインメントの「期待」値も生成する。期待値（Ｅ）は、ランダム連続配列を含有する同じサイズのデータベースを検索する場合、偶然に認めることが「期待」され得るヒット数を示す。期待値は、データベースに対するヒットが真の類似性を示しているかを決定するための有意性の閾値として使用される。例えば、ポリヌクレオチドヒットに割り当てられた０．１のＥ値は、スクリーニングされたデータベースのサイズのデータベースにおいて、類似したスコアを有する配列の整列された部分に対して、全く偶然に０．１のマッチを認めることが期待され得るという意味に解釈される。整列されマッチした部分に対して０．０１以下のＥ値を有する配列に関して、そのデータベースにおいてＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮまたはｔＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを使用して偶然にマッチを見出す確率は、１％以下である。
関連する配列群の多重配列アラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＧｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）ＣＬＵＳＴＡＬＷ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ， ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：４６７３～４６８０頁、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ－ｉｇｂｍｃ．ｕ－ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ＢｉｏＩｎｆｏ／ＣｌｕｓｔａｌＷ／Ｔｏｐ．ｈｔｍｌ）またはＴ－ＣＯＦＦＥＥ（Ｃｅｄｒｉｃ Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ、Ｄｅｓｍｏｎｄ Ｇ． Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｊａａｐ Ｈｅｒｉｎｇａ、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（２０００）３０２：２０５～２１７頁））またはプログレッシブ、ペアワイズアラインメントを使用するＰＩＬＥＵＰ（ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８７、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ２５、３５１頁）を用いて実施することができる。
パターン認識ソフトウェアアプリケーションが、モチーフまたは特徴のある（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列を見出すのに利用可能である。例えば、ＭＥＭＥ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｍ ｆｏｒ Ｍｏｔｉｆ Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ）は一連の配列中のモチーフおよびシグネチャ配列を見出し、ＭＡＳＴ（Ｍｏｔｉｆ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、これらのモチーフを使用してクエリ配列中の類似したまたは同じモチーフを同定する。ＭＡＳＴ結果は、適切な統計データおよび見出されたモチーフの視覚的概要と共に一連のアラインメントとして示される。ＭＥＭＥおよびＭＡＳＴは、カリフォルニア大学サンディエゴ校で開発された。
ＰＲＯＳＩＴＥ（ＢａｉｒｏｃｈおよびＢｕｃｈｅｒ、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２、３５８３頁；Ｈｏｆｍａｎｎら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７、２１５頁）は、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列から翻訳された特徴付けされていないタンパク質の機能を同定する方法である。ＰＲＯＳＩＴＥデータベース（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ）は生物学的に重要なパターンおよびプロファイルを含有し、新たな配列をタンパク質の既知のファミリーに割り当てる、または新たな配列にどの既知のドメインが存在するかを決定するのに適切なコンピュータツールと共に使用できるように設計されている（Ｆａｌｑｕｅｔら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０、２３５頁）。Ｐｒｏｓｅａｒｃｈは、所与の配列パターンまたはシグネチャを用いてＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴおよびＥＭＢＬデータベースを検索することができるツールである。
タンパク質ドメインモデルデータベースの別の例は、Ｐｆａｍである（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら、１９９７、Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２８：４０５～４２０頁；Ｆｉｎｎら、２０１０、Ｔｈｅ Ｐｆａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ‘， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３８：Ｄ２１１～Ｄ２２２頁）。「Ｐｆａｍ」は、Ｐｆａｍ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって維持され、ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／（欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）を含むいくつかの資金提供を受けたワールドワイドウェブサイトで利用可能なタンパク質ドメインおよびタンパク質ファミリーの大きなコレクションを指す。Ｐｆａｍの最新のリリースはＰｆａｍ３０．０である（２０１６年６月）。Ｐｆａｍドメインおよびファミリーは、多重配列アラインメントおよび隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を使用して同定される。Ｐｆａｍ－Ａファミリーまたはドメイン割り当ては、タンパク質ファミリーの代表的なメンバーおよびシードアラインメントに基づくプロファイルの隠れマルコフモデルを使用する精選されたシードアラインメントによって生成される高品質の割り当てである（特に指定のない限り、クエリタンパク質とＰｆａｍドメインまたはファミリーとのマッチは、Ｐｆａｍ－Ａマッチである）。次いで、該ファミリーに属する全ての同定された配列が、該ファミリーの完全アラインメントを自動的に生成するのに使用される（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ（１９９８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６、３２０－３２２；Ｂａｔｅｍａｎ（２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６、２６３－２６６；Ｂａｔｅｍａｎ（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１３８～Ｄ１４１頁；Ｆｉｎｎ（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３４、Ｄ２４７～２５１頁；Ｆｉｎｎ（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３８、Ｄ２１１～２２２頁）。例えば上記参照ウェブサイトを使用してＰｆａｍデータベースにアクセスすることによって、タンパク質配列は、ＨＭＭＥＲ相同性検索ソフトウェア｛例えば、ＨＭＭＥＲ２、ＨＭＭＥＲ３、または上級バージョン、ｈｍｍｅｒ．ｏｒｇ）を使用してＨＭＭに対してクエリされ得る。クエリタンパク質がｐｆａｍファミリーの中にある（または特定のＰｆａｍドメインを有する）として同定する有意なマッチは、ビットスコアがＰｆａｍドメインの収集閾値以上であるマッチである。期待値（ｅ値）も、クエリタンパク質をＰｆａｍに含めるための、またはクエリタンパク質が特定のＰｆａｍドメインを有するかどうかを決定するための基準として使用することができ、低いｅ値（１．０よりはるかに少ない、例えば０．１未満、０．０１以下）は、マッチが偶然によるものである確率が低いことを表す。
４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼをコードすると本明細書に開示されている変異体ポリヌクレオチドの機能は、本明細書において実施例セクションに記載された方法によって活性をテストすることができ、または植物中のトリロバチン含量を変更するそれらの能力をテストすることができる。
ポリヌクレオチドを単離または作製する方法
本明細書に開示されたポリヌクレオチド分子は、当業者に公知の様々な手法を使用することによって単離することもできる。例として、そのようなポリヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｌｌｉｓら編 １９９４ Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒに記載されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用により単離することができる。本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列に由来する、本明細書に定義されるプライマーを使用して増幅することができる。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドを単離するさらなる方法は、ハイブリダイゼーションプローブとして本明細書に記載された配列を有するポリヌクレオチドの全部、または一部の使用を含む。標識されたポリヌクレオチドプローブを、ニトロセルロース膜またはナイロン膜などの固体支持体に固定されたポリヌクレオチドにハイブリダイズする手法は、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。例示的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は：５．０×ＳＳＣ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、１×デンハルト溶液中、６５℃、２０時間ハイブリダイゼーション；１．０×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムで洗浄（毎回５５℃で２０分の洗浄３回）、および場合により０．５×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム中、６０℃で１回洗浄（２０分間）である。任意選択のさらなる洗浄（２０分間）が０．１×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、６０℃の条件下で実施されてもよい。
本明細書に開示されるポリヌクレオチド断片は、制限エンドヌクレアーゼ消化、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅などの当技術分野で周知の手法によって作製されてもよい。
部分的ポリヌクレオチド配列が、対応する完全長ポリヌクレオチド配列を同定するための当技術分野で周知の方法において使用されてもよい。そのような方法としては、ＰＣＲベースの方法、５’ＲＡＣＥ（Ｆｒｏｈｍａｎ ＭＡ、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１８：３４０～５６頁）およびハイブリダイゼーションベースの方法、コンピュータ／データベースベースの方法が挙げられる。さらに、例として、インバースＰＣＲは、既知の領域に基づくプライマーから始まる、本明細書に開示されたポリヌクレオチド配列に隣接する未知の配列の獲得を可能にする（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｒｉｇｌｉａら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６、８１８６頁）。該方法は、いくつかの制限酵素を使用して遺伝子の既知の領域で適切な断片を生成する。断片は次いで、分子内ライゲーションによって環状化され、ＰＣＲ鋳型として使用される。既知の領域から多様なプライマーが設計される。完全長クローンを物理的にアセンブルするために、標準的な分子生物学アプローチが利用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８７）。
特定の種由来のトランスジェニック植物を生産する場合、その種に由来する配列（複数可）でそのような植物を形質転換することが有益であり得る。利点は、トランスジェニック生物を生成する上での異種間形質転換に関する人々の懸念を軽減することであり得る。さらに、遺伝子の下方制御が所望の結果である場合、発現低下が望まれる植物中の配列と同一の（または少なくとも高度に類似した）配列を利用することが必要となることがある。とりわけこれらの理由のために、いくつかの異なる植物種の特定の遺伝子のオルソログを同定し、単離できることが望ましい。
変異体（オルソログを含む）は、本明細書に記載された方法によって同定されてもよい。
ポリペプチドを単離または作製する方法
変異体ポリペプチドを含む本明細書に開示されるポリペプチドは、固相法（例えばＳｔｅｗａｒｔら、１９６９、ｉｎ Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ、サンフランシスコ カリフォルニア）を使用した直接ペプチド合成、または、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（フォスターシティ、カリフォルニア）を使用した自動合成などの当技術分野で周知のペプチド合成方法を使用して調製することができる。ポリペプチドの変異型もそのような合成中に作製することができる。
本明細書に開示されるポリペプチドおよび変異体ポリペプチドは、当技術分野で周知の様々な手法（例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２巻、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用して天然源から精製することもできる。
あるいは、本明細書に開示されるポリペプチドおよび変異体ポリペプチドは、以下に論じるように本明細書に開示される適切な宿主細胞で組換え発現され、細胞から分離されてもよい。
構築物、ベクターおよびその成分
１つの態様によれば、本発明のいくつかの態様による方法において有用なポリヌクレオチドは、植物または宿主細胞を形質転換する上で有用な核酸構築物で提供され得る。適切な植物および宿主細胞は本明細書に記載されている。
用語「遺伝子構築物」は、その中に別のポリヌクレオチド分子（インサートポリヌクレオチド分子）、例えば、限定されるものではないが、ｃＤＮＡ分子を挿入している可能性があるポリヌクレオチド分子、通常、二本鎖ＤＮＡを指す。遺伝子構築物は、インサートポリヌクレオチド分子を転写し、場合により、転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする必要なエレメントを含有してもよい。インサートポリヌクレオチド分子は宿主細胞に由来してもよく、または異なる細胞もしくは生物に由来してもよく、および／または合成もしくは組換えポリヌクレオチドであってもよい。宿主細胞の内部に入ると、遺伝子構築物は宿主染色体ＤＮＡに組み込まれるようになり得る。遺伝子構築物はベクターに連結されてもよい。
用語「ベクター」は、遺伝子構築物を宿主細胞に輸送するのに使用されるポリヌクレオチド分子、通常、二本鎖ＤＮＡを指す。ベクターは、大腸菌などの少なくとも１つの追加の宿主系で複製することができ得る。
用語「発現構築物」は、インサートポリヌクレオチド分子を転写し、場合により、転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする必要な調節エレメントを含む遺伝子構築物を指す。発現構築物は典型的には、５’から３’方向に：
ａ）構築物が形質転換されることになる宿主細胞において機能的なプロモーター、
ｂ）発現されるポリヌクレオチド、および
ｃ）構築物が形質転換されることになる宿主細胞において機能的なターミネーター
を含む。
用語「コード領域」または「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、適切な調節配列の制御下で転写産物および／またはポリペプチドを生成することができるゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列のセンス鎖を指す。コード配列は、５’翻訳開始コドンおよび３’翻訳停止コドンの存在によって同定される。遺伝子構築物に挿入される場合、「コード配列」は、プロモーター配列およびターミネーター配列に作動可能に連結されると発現することができる。
多くの微生物は、ポリシストロニックｍＲＮＡから複数の遺伝子産物を発現することができるため、所望であれば、それらの微生物のための単一調節領域の制御下で複数のポリペプチドが発現され得る。
「作動可能に連結される」は、発現される配列が、プロモーター、組織特異的調節エレメント、時間的調節エレメント、エンハンサー、リプレッサーおよびターミネーターを含む調節エレメントの制御下に置かれることを意味する。典型的には、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、モノシストロン遺伝子の調節領域の１～約５０ヌクレオチド下流に位置する。
「調節領域」は、転写または翻訳の開始および速度、ならびに転写産物または翻訳産物の安定性および／または移動性に影響を与えるヌクレオチド配列を有する核酸を指す。調節領域としては、限定するものではないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、ならびにそれらの組合せが挙げられる。調節領域は、典型的には少なくともコア（基本）プロモーターを含む。調節領域は、エンハンサー配列、上流エレメントまたは上流活性化領域（ＵＡＲ）などの、少なくとも１つの制御エレメントも含むことができる。調節領域は、調節領域が配列の転写または翻訳を調節するために有効であるように調節領域およびコード配列を配置することによって、コード配列に作動可能に連結される。例えば、コード配列およびプロモーター配列を作動可能に連結するために、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は典型的にはプロモーターの１～約５０ヌクレオチド下流に配置される。しかし、調節領域は、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドも上流、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流に配置することもできる。
含まれる調節領域の選択は、限定されるものではないが、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および特定の培養段階中の優先的発現を含むいくつかの要因に依存する。コード配列と比べて調節領域を適切に選択し、配置することによってコード配列の発現をモジュレートすることは、当業者にとって日常的な事柄である。１つを超える調節領域、例えば、イントロン、エンハンサー、上流の活性化領域、転写ターミネーター、および誘導性エレメントが存在し得ることが理解されるであろう。
用語「非コード領域」は、翻訳開始部位の上流および翻訳終結部位の下流にある非翻訳配列を含む。これらの配列は、それぞれ５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲとも呼ばれる。これらの配列は、転写開始および終結ならびに翻訳効率の調節に必要とされるエレメントを含んでもよい。用語「非コード」は、ゲノムクローン内にイントロン配列も含む。
ターミネーターは転写を終結する配列であり、翻訳配列の下流の遺伝子の３’非翻訳末端で見出される。ターミネーターは、ｍＲＮＡ安定性の重要な決定因子であり、いくつかの場合では、空間的調節機能を有することが見出されている。
用語「プロモーター」は、遺伝子転写を調節する、コード領域の上流の非転写ｃｉｓ調節エレメントを指す。プロモーターは、転写開始部位およびＴＡＴＡボックスなどの保存ボックス、ならびに転写因子が結合するモチーフを特定するｃｉｓイニシエーターエレメントを含む。
「導入遺伝子」は、１つの生物から採取され、形質転換によって異なる生物に導入されるポリヌクレオチドである。導入遺伝子は、導入遺伝子が導入される生物の種と同じ種または異なる種に由来してもよい。
「逆方向反復」は、リピートの後半が相補鎖中にある、反復される配列である。例えば、
（５’）ＧＡＴＣＴＡ……．ＴＡＧＡＴＣ（３’）
（３’）ＣＴＡＧＡＴ……．ＡＴＣＴＡＧ（５’）
リードスルー転写は、反復される領域間に３～５ｂｐのスペーサーがあることを条件として、相補的塩基対形成を起こしてヘアピン構造を形成する転写物を生成するであろう。
構築物およびベクターを生成するための方法
本明細書に開示される遺伝子構築物は、本明細書に開示される１つもしくは複数のポリヌクレオチド配列および／または本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、例えば、細菌、真菌、昆虫、哺乳動物または植物生物を形質転換するために有用であり得る。本明細書に開示された遺伝子構築物は、本明細書に定義される発現構築物を含むことが意図される。
遺伝子構築物およびベクターを生成および使用するための方法は、当技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８７）に一般に記載されている。
宿主細胞
他の態様では、本明細書に開示される遺伝子構築物またはベクターを含む宿主細胞が提供される。好ましい態様では、宿主細胞は、ｉ）配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくは該ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドを発現する、またはｉｉ）配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列、もしくその変異体を含むポリヌクレオチドを発現するように遺伝子修飾される。
本明細書に開示される、発現構築物などの遺伝子構築物を含む宿主細胞は、本明細書に開示されたポリペプチドの組換え生成のための当技術分野で周知の方法（例えば Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８７ ；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８７）において有用である。そのような方法は、本明細書に開示されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現に適したまたはこれを促す条件の適切な培地における宿主細胞の培養を伴い得る。場合により培養物中に分泌され得る発現された組換えポリペプチドは、次いで当技術分野で周知の方法によって、培地、宿主細胞または培養培地から分離され得る（例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２巻、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）。
故に、いくつかの態様によれば、本明細書に開示される宿主細胞は、本発明のいくつかの態様によるトリロバチンを生産する方法において有用である。本明細書に開示される宿主細胞、または本明細書に開示される方法により使用される宿主細胞は、好ましくは、本明細書に開示されるトリロバチンの生物工学的生産のための生産株であり、または生産株として機能する。
トリロバチン生産株としての使用のために選択された種および株は、最初に、どの生産遺伝子が該株に対して内因性であり、どの遺伝子が存在しないかを決定するために分析される。内因性対応物が該株に存在しない遺伝子は、有利には１つまたは複数の発現構築物にアセンブルされ、次いで欠損機能を供給するために該株に形質転換される。
例示的な原核生物および真核生物種は、以下により詳細に記載される。しかし、他の種も適切であり得ることが理解されるであろう。例えば、適切な種は、ハラタケ属、アスペルギルス属、バチルス属、カンジダ属、コリネバクテリウム属、エレモテシウム属、大腸菌属、フザリウム属／ジベレラ属、クリベロマイセス属、アイカワタケ属、マツオウジ属、ファフィア属、ファネロカエテ属、ピキア属、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ）属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、スファセロマ（Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ）属、キサントフィロマイセス属またはヤロウィア属などの属にあってもよい。そのような属からの例示的な種としては、ケガワタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｔｉｇｒｉｎｕｓ）、アイカワタケ（Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ）、白色腐朽菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、トルラ酵母（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ jａｄｉｎｉｉ）、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ ３２）、ロドトルラ・ムチラギノーザ（Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）ＵＢＶ－ＡＸ、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）／イネ馬鹿苗病菌、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられる。
いくつかの態様では、微生物は、大腸菌、出芽酵母、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドバクター・カプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、またはロドトルラ・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）などの原核生物であってもよい。
いくつかの態様では、微生物は、イネ馬鹿苗病菌、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、分裂酵母、クロコウジカビ、ヤロウィア・リポリティカ、アシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、または出芽酵母などの子嚢菌類であってもよい。
いくつかの態様では、微生物は、ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）、ドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、クロレラ種、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、ホンダワラ属（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ）、マコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、セネデスムス・アルメリエンシス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓ）種などの藻類細胞またはラン藻細胞であってもよい。
サッカロミセス属種
サッカロミセス属は、合成生物学で広く使用されているシャーシ生物であり、組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。例えば、出芽酵母に関する突然変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデルおよび利用可能な他の情報のライブラリーがあり、産物収率を高める様々なモジュールの合理的設計を可能にしている。組換え微生物を作製するための方法が知られている。
アスペルギルス属種
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビおよびアスペルギルス・ソーヤ（Ａ． ｓｏｊａｅ）などのアスペルギルス種は、食品生産で広く使用されている微生物であり、組換え微生物プラットフォームとしても使用することができる。アスペルギルス・ニデュランス（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・クラバタス（Ａ． ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａ． ｆｌａｖｕｓ）、クロコウジカビ、およびアスペルギルス・テレウス（Ａ． ｔｅｒｒｅｕｓ）のゲノムのヌクレオチド配列が利用可能であり、フラックスを増大させ、産物収量を増加させるための合理的設計および内因性経路の修飾を可能にしている。アスペルギルス属の代謝モデルが開発されている。一般に、クエン酸およびグルコン酸などのいくつかの食品成分の工業生産にはクロコウジカビが培養されており、故にクロコウジカビなどの種が一般にトリロバチンの生産に適している。
大腸菌
合成生物学で広く使用されている別のプラットフォーム生物である大腸菌も、組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。サッカロミセス属と同様に、大腸菌に関する突然変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデルおよび利用可能な他の情報のライブラリーがあり、産物収率を高める様々なモジュールの合理的設計を可能にしている。サッカロミセス属について上に記載したものと類似した方法が、組換え大腸菌微生物を作製するのに使用され得る。
アガリクス、ジベレラ、およびファネロカエテ属種
アガリクス、ジベレラ、およびファネロカエテ属種は培養下で大量のイソプレノイドを生産することが知られているため、これらは有用であり得る。故に、トリロバチンを含む大量のフェニルプロパノイドを生産する前駆物質は、内因性遺伝子によって既に生産されている。
アークスラ・アデニニボランス（ブラストボトリス・アデニニボランス（Ｂｌａｓｔｏｂｏｔｒｙｓ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ））
アークスラ・アデニニボランスは、稀な生化学的特徴を有する二形性酵母である。アークスラ・アデニニボランスは幅広い基質で増殖することができ、硝酸同化することができる。アークスラ・アデニニボランスは、天然のプラスチックを生産することができる株の生成、または環境試料でのエストロゲンのバイオセンサーの開発にうまく適用されている。
ヤロウィア・リポリティカ
ヤロウィア・リポリティカも二形性酵母であり、半子嚢菌科（ｆａｍｉｌｙ Ｈｅｍｉａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する。ヤロウィア・リポリティカの全ゲノムが知られている。ヤロウィア属は好気性であり、非病原性であると考えられている。ヤロウィア属は疎水性基質（例えばアルカン、脂肪酸、油）を使用する上で効率的であり、糖で増殖することができる。ヤロウィア属は工業的応用の可能性が高く、油性微生物である。ヤロウィア・リポリティカはその乾燥細胞重量のおよそ４０％まで脂質含量を蓄積することができ、脂質蓄積および再移動に関するモデル生物である。
ロドトルラ種
ロドトルラは単細胞性の着色酵母である。油性赤酵母、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）は、粗グリセリンから脂質およびカロテノイドを生産することが示されている。ロドトルラ・トルロイデス株は、バイオマスおよび脂質生産性の改善ための効率的なフェドバッチ発酵システムであることが示されている。
ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）
ロドスポリジウム・トルロイデスは油性酵母であり、脂質生産経路を改変するのに有用である。
ロドバクター属種
ロドバクター属は、組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。大腸菌と同様、利用可能な突然変異体および適切なプラスミドベクターのライブラリーがあり、産物収量を高める様々なモジュールの合理的設計を可能にしている。イソプレノイド経路は、カロテノイドおよびＣｏＱ１０の生産増加のためにロドバクター属の膜性細菌種で改変されている。大腸菌について上に記載したものと類似した方法が、組換えロドバクター属微生物を作製するのに使用され得る。
カンジダ・ボイジニ
カンジダ・ボイジニは、メチロトローフ酵母である。ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）およびピキア・パストリスなどの他のメチロトローフ種のように、カンジダ・ボイジニは、異種タンパク質を生産するための優れたプラットフォームを提供する。分泌された外来タンパク質の数グラム範囲の収量が報告されている。計算法、ＩＰＲＯは、最近、カンジダ・ボイジニキシロースレダクターゼの補因子特異性をＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへ実験的にスイッチングする突然変異を予測した。
ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）（ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ））
ハンゼヌラ・ポリモルファは、別のメチロトローフ酵母（カンジダ・ボイジニ参照）である。さらに、ハンゼヌラ・ポリモルファは幅広い他の基質で増殖することができる；ハンゼヌラ・ポリモルファは熱耐性であり、硝酸同化することができる（クルイベロミセス・ラクチスも参照）。これは、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリンおよびＣ型肝炎の治療用のインターフェロンアルファ－２ａ、さらには一連の工業用酵素の生産に適用されている。
クルイベロミセス・ラクチス
クルイベロミセス・ラクチスは、通常、ケフィアの生産に適用される酵母である。これはいくつかの糖で、最も重要には乳汁および乳清中に存在するラクトースで増殖することができる。クルイベロミセス・ラクチスは、とりわけ、チーズを生産するためのキモシン（通常、子ウシの胃に存在する酵素）の生産にうまく適用されている。生産は４０，０００Ｌスケールの発酵槽で行われる。
ピキア・パストリス
ピキア・パストリスは、メチロトローフ酵母である（カンジダ・ボイジニおよびハンゼヌラ・ポリモルファ参照）。これは、外来タンパク質を生産するための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォーム要素はキットとして入手可能であり、タンパク質の生産のために学術界で世界的に使用されている。複合型ヒトＮ－グリカンを生産することができる株が改変されている（酵母グリカンはヒトで見出されるものと類似しているが、同一ではない）。
ニセツリガネゴケ属種
ニセツリガネゴケ属のコケは懸濁液培養で増殖させると、酵母または他の真菌培養物と類似した特徴を有する。この属は、他の細胞タイプで生産することが困難であり得る植物二次代謝産物を生産するための重要な細胞タイプになりつつある。
培養、発現および単離
他の態様では、トリロバチンの生合成の方法であって、宿主細胞に供給され得る、または宿主細胞に存在し得るフロレチンの存在下で４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼを発現することができる、本明細書に開示される宿主細胞を培養するステップを含む方法が提供される。
トリロバチン生合成は、典型的には、補助基質フロレチンおよびＵＤＰ－グルコースを必要とする。故に、１つの態様によれば、宿主細胞はフロレチンおよびＵＤＰ－グルコースを含む。別の態様では、ＵＤＰ－グルコースおよび／またはフロレチンは宿主細胞に供給され得る。フロレチンおよびＵＤＰ－グルコースは、それぞれ別々にまたは組み合わされて、細胞に対して内因性であってもよく、または外因的に追加されてもよい。さらに、トリロバチンを生産する、またはトリロバチンの生産を上方制御するために、基質（例えばフロレチンおよび／またはＵＤＰ－グルコース）が、内因性レベルのこれらの基質を含む細胞に外因的に追加されてもよい。そのようなステップは、基質を外因的に受け取っていない宿主細胞と比較して、基質レベル（例えばフロレチンおよび／またはＵＤＰ－グルコース）の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上の増加を典型的にはもたらす。
さらにまたはあるいは、トリロバチンを生産する、またはトリロバチンの生産を上方制御するために、フロレチンおよび／またはＵＤＰ－グルコース生合成経路に成分を導入する、または成分のレベルを増加することによって、細胞中の基質（例えばフロレチンおよび／またはＵＤＰ－グルコース）レベルが提供または上方制御されてもよい。したがって、フロレチンレベルを生産または上方制御するために、ナリンギンジヒドロカルコン、フロリジン、フロレチン－４’－Ｏ－グルコシドまたはｐ－ジヒドロクマロイル－ＣｏＡが提供または上方制御されてもよい。あるいは、カルコン合成酵素またはナリンゲニン－カルコン合成酵素（ＣＨＳ）が、フロレチンの生産またはフロレチンの合成の上方制御のために補助基質３×マロニル－ＣｏＡと共に提供または上方制御されてもよい。同様に、ＵＤＰ－グルコースの生産または上方制御のために、グルコース－１－リン酸が提供または上方制御されてもよい。あるいは、ＵＤＰ－グルコース－ピロホスホリラーゼが、ＵＤＰ－グルコースの合成のための補助基質ＵＴＰと共に提供または上方制御されてもよい。
基質（例えばフロレチンおよび／またはＵＤＰ－グルコース）の外因性の追加は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、細胞培養培地などで宿主細胞を基質（例えばフロレチンおよび／またはＵＤＰ－グルコース）と接触させることによって達成されてもよい。
細胞での追加の酵素の発現は、本明細書に記載される核酸構築物またはゲノム編集（例えば、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現のための）を使用して達成することができる。１つを超える外因性ポリヌクレオチド（例えば２、３、４、５等）単一の核酸構築物で提供されてもよく、あるいは、２つを超える（例えば３、４、５等）核酸構築物が単一の宿主細胞に導入されてもよいことが理解されるであろう。
好ましい態様では、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、またはカルコン合成酵素（ＣＨＳ）および二重結合還元酵素（ＤＢＲ）が宿主細胞に存在していてもよく、または導入されてもよい。例えば、適切なカルコン合成酵素としては、ＨａＣＨＳ（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号：Ｑ９ＦＵＢ７．１）およびＨｖＣＨＳ２（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号：Ｑ９６５６２．１）が挙げられ、好ましくはＨａＣＨＳである。適切な二重結合還元酵素としては、ＳｃＴＳＣ１３（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号：ＮＰ＿０１０２６９．１）およびＫＩＴＳＣ１３（ＮＣＢＩタンパク質アクセッションＸＰ＿４５２３９２．１）が挙げられ、好ましくはＳｃＴＳＣ１３である。
本明細書に開示された宿主細胞は、本明細書に開示されるトリロバチンを生産する方法において使用することができ、とりわけ、ケモスタット、バッチ、フェドバッチ培養、連続灌流発酵、および連続灌流細胞培養を含む従来の発酵プロセスを使用して培養することができる。
例えば、宿主細胞が微生物（例えば大腸菌）であれば、方法は、本発明のいくつかの態様の方法のステップを触媒する酵素、例えば４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（例えばＰＧＴ２）が発現される条件下の培養培地で微生物を増殖させることを含み得る。組換え微生物は、フェドバッチまたは連続プロセスで増殖されてもよい。典型的には、組換え微生物は、規定温度（複数可）で所望の期間、発酵槽で増殖される。そのような決定は当業者の技能の範囲内である。
例えば、本発明によるプロセスの１つの態様では、組換え微生物は、好ましくは最大バイオマス濃度に達するまで好気条件下で培養される。この関連で、ＯＤ６００は、好ましくは少なくとも１～１５以上の範囲、好ましくは５～３００の範囲、特に１０～２７５の範囲、好ましくは１５～２５０の範囲であるべきである。微生物は、次いで好ましくは嫌気条件下で培養され、例えばイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および／またはラクトース（対応する適切なプロモーターまたは対応する適切な発現系を使用する場合）による誘導により、導入された遺伝子構築物またはベクターに基づく所望のアミノ酸配列または所望の酵素の発現が実施される。
好ましくは、培養は、少なくとも部分的にまたは完全に嫌気条件下で行われる。
微生物に応じて、当業者は培養の目的のために適切な環境条件を創出することができ、特に、適切な（培養）培地を提供することができる。培養は、好ましくはＬＢまたはＴＢ培地で実施される。あるいは、植物原料、特に柑橘類、グレープフルーツおよびオレンジ植物からなるまたは含む、（より複雑な）培地が使用される。培養は、例えば、２０℃を超える、好ましくは２５℃を超える、特に３０℃を超える温度（好ましくは３０～４０℃の範囲）で実施される。
１つまたは複数の適切な誘導物質、例えばＩＰＴＧまたはラクトースが誘導（例えばｌａｃオペロンの）に使用される場合、組換え微生物を０．００１～１ｍＭ、好ましくは０．００５～０．９ｍＭ、特に好ましくは０．０１～０．８ｍＭの量で含有する（培養）培地に関する誘導物質を使用することが好ましい。
トリロバチンを単離または精製するために、有機溶媒による抽出が例えば実施されてもよい。これらの溶媒は、好ましくは以下のリストから選択される：イソブタン、２－プロパノール、トルエン、酢酸メチル、２－ブタノール、ヘキサン、１－プロパノール、石油エーテル、１，１，１，２－テトラフルオロエタン、メタノール、プロパン、１－ブタノール、ブタン、エチルメチルケトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、エタノール、ジブチルエーテル、ＣＯ２、ｔｅｒｔ．ブチルメチルエーテル、アセトン、ジクロロメタンおよびＮ２Ｏ。水との視覚的に認識可能な界面を形成するそれらの溶媒が特に好ましい。この後、溶媒中の残留水の除去、および溶媒自体の除去が実施されてもよく、今度はトリロバチンを、例えば、場合によりそれに続く結晶化および産物の乾燥に適した（おそらく異なる）溶媒に再溶解させてもよい。あるいはまたはさらに、吸着精製、蒸留精製および／またはクロマトグラフィー精製が実施されてもよい。
あるいは、乾燥方法が、形成されたトリロバチンの単離または精製に使用されてもよく、特に、細胞含有または細胞不含発酵溶液の真空ベルト乾燥、噴霧乾燥、蒸留または凍結乾燥が使用され得る。
構築物およびベクターを含む植物細胞および植物を生産するための方法
他の態様では、本明細書に開示される遺伝子構築物を含む植物細胞、および本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変化させるように修飾された植物細胞が提供される。そのような細胞を含む植物も提供される。
４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性の変化は、本発明のいくつかの態様による方法により植物で変化させることができる。そのような方法は、そのような植物細胞および植物における４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性、またはトリロバチン含量を調節するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変化させるように設計された構築物による植物細胞および植物の形質転換を必要とし得る。そのような方法はまた、本明細書に開示される構築物と、そのような植物細胞および植物における４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性および／またはトリロバチン含量を調節する１つまたは複数のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変化させるように設計された１つまたは複数の他の構築物との組合せによる、植物細胞および植物の形質転換も含む。
植物細胞、植物およびその部分をポリペプチドで形質転換する方法は、Ｄｒａｐｅｒら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉ． Ｐｕｂ． Ｏｘｆｏｒｄ、３６５頁；ＰｏｔｒｙｋｕｓおよびＳｐａｎｇｅｎｂｕｒｇ、１９９５、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ．；ならびにＧａｌｕｎおよびＢｒｅｉｍａｎ、１９９７、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ． Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎの中に示された、Ｇｅｌｖｉｎら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ． Ｍａｎｕａｌ． Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄ． Ｐｕｂ． Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ． Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載されている。
植物の遺伝子操作のための方法
いくつかの植物形質転換戦略が利用可能である（例えばＢｉｒｃｈ、１９９７、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、４８、２９７頁、Ｈｅｌｌｅｎｓ ＲＰら （２０００）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２：８１９～３２頁、Ｈｅｌｌｅｎｓ ＲらＰｌａｎｔ Ｍｅｔｈ １：１３頁）。例えば、戦略は、通常、ポリヌクレオチド／ポリペプチドが発現される植物細胞、器官および／もしくは特定の発生段階で、ポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を増加させる、または通常、ポリヌクレオチド／ポリペプチドが発現されない細胞、組織、器官および／または特定の発生段階で、ポリヌクレオチド／ポリペプチドを異所的に発現するように設計されてもよい。発現されたポリヌクレオチド／ポリペプチドは、形質転換される植物種に由来してもよく、または異なる植物種に由来してもよい。
形質転換戦略は、通常、ポリヌクレオチド／ポリペプチドが発現される植物細胞、組織、器官または特定の発生段階でのポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を低減するように設計されてもよい。そのような戦略は、遺伝子サイレンシング戦略として知られている。
トランスジェニック植物における遺伝子の発現のための遺伝子構築物は、典型的には、１つまたは複数のクローニングポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーター、ターミネーター、および形質転換された植物中の遺伝子構築物の存在を検出するための選択可能なマーカー配列を含む。
本明細書に記載された構築物での使用に適したプロモーターは、単子葉または双子葉植物の細胞、組織または器官で機能性であり、細胞、組織および器官特異的プロモーター、細胞周期特異的プロモーター、時間的プロモーター、誘導性プロモーター、ほとんどの植物組織で活性な恒常的プロモーター、および組換えプロモーターが挙げられる。プロモーターの選択は、そのように所望されるクローニングポリヌクレオチドの時間的および空間的発現に依存するであろう。プロモーターは、通常は目的の導入遺伝子に付随するもの、または他の植物、ウイルス、ならびに植物病原性細菌および真菌の遺伝子に由来するプロモーターであってもよい。当業者は、過度な実験をすることなく、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を使用して植物の形質を修飾および調節する上での使用に適したプロモーターを選択することができるであろう。恒常的植物プロモーターの例としては、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーターおよびオクトピンシンターゼプロモーター、ならびにトウモロコシ由来のＵｂｉ１プロモーターが挙げられる。特定の組織で活性な、内部発生シグナルまたは外部非生物的もしくは生物的ストレスに応答する植物プロモーターは、科学文献に記載されている。例示的なプロモーターは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ ０２／００８９４に記載されている。
植物形質転換遺伝子構築物で一般的に使用される例示的なターミネーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓターミネーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンターゼまたはオクトピンシンターゼターミネーター、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ゼイン遺伝子ターミネーター、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼターミネーターおよびジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ＰＩ－ＩＩターミネーターが挙げられる。
植物形質転換で一般的に使用される選択可能なマーカーとしては、カナマイシン耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ＩＩ遺伝子（ＮＰＴ ＩＩ）、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐性を与えるａａｄＡ遺伝子、Ｉｇｎｉｔｅ（ＡｇｒＥｖｏ）およびＢａｓｔａ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）耐性に対するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ遺伝子）、ならびにハイグロマイシン耐性に対するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）が挙げられる。
植物および植物組織におけるプロモーター発現解析に使用され得るレポーター遺伝子（宿主にとって外来性の活性、通常、酵素活性および／または可視シグナル（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＵＳ、ＧＦＰ）を発現するコード配列）を含む遺伝子構築物の使用も企図される。レポーター遺伝子文献は、Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３０３、２０９頁、およびＳｃｈｒｏｔｔ、１９９５、Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｔ．、Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ．編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ． Ｂｅｒｌｉｎｅ、３２５～３３６頁に概説されている。
遺伝子サイレンシング戦略は、遺伝子自体、またはコードされたポリペプチドの発現をもたらす調節エレメントに着目されてもよい。「調節エレメント」は本明細書ではできる限り広い意味で使用され、目的の遺伝子と相互作用する他の遺伝子を含む。
本明細書に開示されるポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を減少または停止させるように設計された遺伝子構築物は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのアンチセンスコピーを含んでもよい。そのような構築物ではポリヌクレオチドは、プロモーターおよびターミネーターに関してアンチセンス方向に置かれる。
「アンチセンス」ポリヌクレオチドは、産生された転写物が、遺伝子のｍＲＮＡ転写物に対して相補的となるように、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセグメントを反転させることによって得られる。例えば、
５’－ＧＡＴＣＴＡ－３’（コード鎖） ３’－ＣＴＡＧＡＴ－５’（アンチセンス鎖）
３’－ＣＵＡＧＡＵ－５’ｍＲＮＡ ５’－ＧＡＵＣＵＡ－３’アンチセンスＲＮＡ
遺伝子サイレンシング用に設計された遺伝子構築物は、逆方向反復も含むことができる。「逆方向反復」は、リピートの後半が相補鎖中にある、反復される配列である。例えば、
５’－ＧＡＴＣＴＡ………ＴＡＧＡＴＣ－３’
３’－ＣＴＡＧＡＴ………ＡＴＣＴＡＧ－５’
形成された転写物は、相補的塩基対形成を起こしてヘアピン構造を形成し得る。通常、ヘアピン形成を可能にするには反復される領域間に少なくとも３～５ｂｐのスペーサーがー必要とされる。
別のサイレンシングアプローチは、ｍｉＲＮＡと同等の転写物を標的にする小さなアンチセンスＲＮＡの使用を必要とする（Ｌｌａｖｅら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７、２０５３頁）。本明細書に開示されるポリヌクレオチドに対応するそのような小さなアンチセンスＲＮＡの使用が、明示的に企図される。
用語遺伝子構築物は本明細書で使用される場合、小さなアンチセンスＲＮＡおよび遺伝子サイレンシングをもたらす他のそのようなポリペプチドも含む。
本明細書に定義される発現構築物による形質転換は、センス抑制として知られるプロセスを通して遺伝子サイレンシングをもたらすこともできる（例えばＮａｐｏｌｉら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２、２７９；ｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ Ｎｉｅｂｅｌら、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、７、３４７頁）。いくつかの場合、センス抑制は、全体または一部のコード配列の過剰発現を必要とするが、イントロンまたは ５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）などの遺伝子の非コード領域の発現も必要とし得る。キメラ部分的センス構築物は、複数の遺伝子を協調的に発現停止するのに使用することができる（Ａｂｂｏｔｔら、２００２、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２８（３）：８４４～５３頁；Ｊｏｎｅｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔａ ２０４：４９９～５０５頁）。本明細書に開示されるポリヌクレオチドの発現を停止するためのそのようなセンス抑制戦略の使用も企図される。
遺伝子サイレンシング用に設計された遺伝子構築物中のポリヌクレオチドインサートは、コード配列および／または非コード配列、例えばプロモーターおよび／もしくはイントロンおよび／もしくは５’もしくは３’ＵＴＲ配列、または対応する遺伝子に対応し得る。
他の遺伝子サイレンシング戦略としては、ドミナントネガティブアプローチおよびリボザイム構築物の使用が挙げられる（ＭｃＩｎｔｙｒｅ、１９９６、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ、５、２５７頁）。
転写前サイレンシングは、遺伝子自体またはその調節エレメントの突然変異を通してもたらされ得る。そのような突然変異は、点突然変異、フレームシフト、挿入、欠失および置換を含み得る。
以下は、以下の植物種を遺伝的に形質転換するのに使用することができる遺伝子形質転換プロトコルを開示している代表的な刊行物である：コメ（Ａｌａｍら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １８、５７２頁）；リンゴ（Ｙａｏら、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １４、４０７～４１２頁）；トウモロコシ（米国特許出願第５，１７７，０１０号および５，９８１，８４０号）；コムギ（Ｏｒｔｉｚら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １５、１９９６、８７７頁）；トマト（米国特許出願第５，１５９，１３５号）；ジャガイモ（Ｋｕｍａｒら、１９９６ Ｐｌａｎｔ Ｊ． ９，：８２１頁）；キャッサバ（Ｌｉら、１９９６ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、７３６頁）；レタス（Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅら、１９８７、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ６、４３９頁）；タバコ（Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７、１２２９頁）；ワタ（米国特許出願第５，８４６，７９７号および５，００４，８６３号）；草（米国特許第５，１８７，０７３号および６，０２０，５３９号）；ペパーミント（Ｎｉｕら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １７、１６５頁）；柑橘類植物（Ｐｅｎａら、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１０４、１８３頁）；キャラウェイ（Ｋｒｅｎｓら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ、１７、３９頁）；バナナ（米国特許出願第５，７９２，９３５号）；ダイズ（米国特許第５，４１６，０１１号；５，５６９，８３４号；５，８２４，８７７号；５，５６３，０４４５５号および５，９６８，８３０号）；パイナップル（米国特許出願第５，９５２，５４３号）；ポプラ（米国特許第４，７９５，８５５号）；一般的な単子葉（米国特許第５，５９１，６１６号および６，０３７，５２２号）；アブラナ属（米国特許第５，１８８，９５８号；５，４６３，１７４号および５，７５０，８７１号）；穀類（米国特許第６，０７４，８７７号）；セイヨウナシ（Ｍａｔｓｕｄａら、２００５、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２４（１）：４５～５１頁）；サクラ属（Ｒａｍｅｓｈら、２００６ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２５（８）：８２１～８頁；ＳｏｎｇおよびＳｉｎｋ ２００５ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２００６ ；２５（２）：１１７～２３頁；Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｐａｄｉｌｌａら、２００３ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（１）：３８～４５頁）；イチゴ（Ｏｏｓｕｍｉら、２００６ Ｐｌａｎｔａ． ２２３（６）：１２１９～３０頁；Ｆｏｌｔａら、２００６ Ｐｌａｎｔａ Ａｐｒ １４；ＰＭＩＤ：１６６１４８１８頁）、バラ（Ｌｉら、２００３）、キイチゴ属（Ｇｒａｈａｍら、１９９５ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９５；４４：１２９～３３頁）、トマト（Ｄａｎら、２００６、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｖ２５：４３２～４４１頁）、リンゴ（Ｙａｏら、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １４、４０７～４１２頁）およびアクチニディア・エリアンサ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｅｒｉａｎｔｈａ）（Ｗａｎｇら、２００６、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２５，５：４２５～３１頁）。他の種の形質転換も本発明によって企図される。適切な方法およびプロトコルは科学文献で入手可能である。
１つの態様では、トリロバチン含量が増加した、または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、植物細胞または植物において、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの変異体の発現を上方制御するステップを含む方法が提供される。
別の態様では、トリロバチン含量が増加した、または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、植物細胞または植物において、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列、またはその変異体を含むポリヌクレオチドの発現を上方制御するステップを含む方法が提供される。
当技術分野で公知のいくつかの方法は、本明細書に開示されるヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を変化させるために使用することができる。そのような方法としては、限定されるものではないが、Ｔｉｌｌｉｎｇ（Ｔｉｌｌら、２００３、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２％、２０５頁）、およびいわゆる「デルタ遺伝子」技術（Ｌｉら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７（３）、２３５頁）が挙げられる。
他の方法は、目的の遺伝子における標的二本鎖ＤＮＡの破壊を生じる配列特異的ヌクレアーゼの使用を必要とし得る。そのような方法に例としては：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｃｕｒｔｉｎら、２０１１、Ｓａｎｄｅｒら、２０１１）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼまたは「ＴＡＬＥＮ」（Ｃｅｒｍａｋら、２０１１、Ｍａｈｆｏｕｚら、２０１１、Ｌｉら、２０１２）、および「メガヌクレアーゼ」とも呼ばれるＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（Ｔｚｆｉｒａら、２０１２）が挙げられる。
ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ，ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ，ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）技術などの改変されたヌクレアーゼを使用する標的ゲノム編集は、特異性をカスタマイズできるＣａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを生成するための重要な新規のアプローチである。これらのヌクレアーゼによって媒介されるゲノム編集は、多種多様な生物医学的に重要な細胞タイプ、および伝統的に遺伝子操作が難しかった生物において、内因性遺伝子を迅速に、容易におよび効率的に修飾するのに使用されている。生細胞において内因性遺伝子発現を調節する、または特定のゲノム遺伝子座を標識することができる異種ドメインを動員するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの改訂版が開発されている（ＳａｎｄｅｒおよびＪｏｕｎｇ、２０１４）。該手法は真菌に適用可能である（Ｎｏｄｖｉｇら、２０１５）。
植物におけるポリペプチドの発現の、例えばゲノム編集による上方制御は、（ｉ）目的のポリペプチド、もしくはこれがその制御下に置かれている調節配列をコードする内因性配列を置き換えること、および／または（ｉｉ）目的のポリペプチドをコードする新たな遺伝子をゲノムの標的領域に挿入すること、および／または（ｉｉｉ）目的のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の上方制御をもたらす点突然変異を導入する（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’－ＵＴＲおよび／もしくは３’－ＵＴＲなどの調節配列を変化させること、またはコード配列の突然変異によって）ことによって達成することができる。
このようにして、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは該ポリペプチドの変異体をコードする、または配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列もしくはその変異体を含む内因性遺伝子が上方制御され、トリロバチン含量の増加または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性の増加をもたらし得る。
特定のポリペプチドを標的にする抗体またはその断片も、そのポリペプチドの活性を調節するように植物で発現されてもよい（Ｊｏｂｌｉｎｇら、２００３、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１（１）、３５頁）。トランスポゾンタギングアプローチも適用することができる。さらに、本明細書に開示されるポリペプチドと相互作用するペプチドが、ファージディスプレイ（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの技術により同定されてもよい。そのような相互作用ペプチドは、植物で発現され、または植物に適用されて本明細書に開示されるポリペプチドの活性に影響を与えることができる。本明細書に開示されるヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現の変化における上記の各アプローチの使用が、具体的に企図される。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「発現を変化させる」および「発現変化」という用語は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドに対応するゲノムＤＮＡが修飾され、故に本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現変化をもたらす状況を包含することが意図される。ゲノムＤＮＡの修飾は、遺伝子形質転換、または突然変異を誘導するための当技術分野で公知の他の方法によってもよい。「発現変化」は、産生されるメッセンジャーＲＮＡおよび／またはポリペプチドの量の増加または減少に関し得、産生されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列の変化によるポリペプチドの活性変化ももたらし得る。
植物を選択する方法
４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼまたはトリロバチン含量が変化した植物を選択する方法も提供される。そのような方法は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の変化について植物をテストすることを必要とする。そのような方法は、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性またはトリロバチン含量の変化が必ずしも容易に測定し得ない若齢または初期発生段階で適用されてもよい。
メッセンジャーＲＮＡなどのポリヌクレオチドの発現は、対応するポリペプチドの発現の指標としてしばしば使用される。ポリヌクレオチドの発現を測定するための例示的な方法としては、限定されるものではないが、ノーザン分析、ＲＴ－ＰＣＲおよびドットブロット分析が挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８７）。本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの部分は、故に、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼまたはトリロバチンのレベルが変化した植物を同定する方法において、本明細書に定義されるプローブまたはプライマーとして有用である。本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、そのような植物を同定するように設計された、ハイブリダイゼーション実験でのプローブとして、またはＰＣＲベースの実験でのプライマーとして使用されてもよい。
あるいは、抗体が、本明細書に開示されるポリペプチドに対して産生されてもよい。抗体を産生および使用する方法は、当技術分野で一般的である（例えば：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ Ａ Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９９８参照）。そのような抗体は、本明細書に開示されたポリペプチドの発現変化を検出する方法において使用することができる。そのような方法としては、ＥＬＩＳＡ（Ｋｅｍｅｎｙ、１９９１、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ＥＬＩＳＡ、ＮＹ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ）およびウエスタン分析（Ｔｏｗｂｉｎ ＆ Ｇｏｒｄｏｎ、１９９４、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、７２、３１３頁）が挙げられ得る。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の分析、および４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼが変化した、またはトリロバチン含量が変化した植物の選択のためのこれらのアプローチは、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性またはトリロバチン含量が変化した変種を生産するように設計された従来の育種プログラムにおいて有用である。
植物
用語「植物」は、植物全体、植物の任意の部分、栄養繁殖体および植物の子孫を含むことが意図される。
用語「栄養繁殖体」は、種子および挿し木を含む、有性または無性どちらかの生殖または繁殖において使用され得る植物の任意の部分を意味する。
「トランスジェニック」または「形質転換された」植物は、遺伝子操作または形質転換の結果として新たな遺伝物質を含有する植物を指す。新たな遺伝物質は、得られたトランスジェニックもしくは形質転換植物と同じ種の植物、または異なる種からの植物に由来してもよい。形質転換植物は、新たな遺伝物質で安定にまたは一過性に形質転換される植物を含む。
本発明のいくつかの態様による植物を成長させ、自家受粉させるかまたは異なる植物株と交配させてもよく、所望の表現型特徴を有する得られた交配種が同定されてもよい。２世代またはそれより多い世代を成長させて、対象表現型特徴が安定に維持され、受け継がれることを確保してもよい。そのような標準的な育種アプローチから得られた植物も、本発明の側面を形成する。
４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼをコードすると本明細書に開示された変異体ポリヌクレオチドの機能は、例えば、本明細書の実施例セクションに記載されているように、そのような配列を細菌で発現させ、コードされたタンパク質の活性をテストすることによって評価され得る。
４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性および／またはトリロバチン含量の変化は、本発明のいくつかの態様による方法により植物において変化させることもできる。そのような方法は、そのような植物細胞および植物における４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性および／またはトリロバチン含量を調節するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変化させるように設計された、本明細書に開示される構築物による植物細胞および植物の形質転換を必要とし得る。そのような方法は、好ましくは、明細書に開示される構築物と、そのような植物細胞および植物におけるトリロバチン含量を調節する１つまたは複数の他のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変化させるように設計された１つまたは複数の他の構築物との組合せによる、植物細胞および植物の形質転換も含む。好ましくは、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、および二重結合還元酵素（ＤＢＲ）の組合せが、植物細胞または植物で発現される。
本明細書に開示された本発明の方法において特に有用な植物としては、緑色植物（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）スーパーファミリーに属する全ての植物、特に、以下を含むリストから選択される飼料またはマメ科牧草、観賞用植物、食用作物、樹木、または低木を含む単子葉植物および双子葉植物が挙げられる：とりわけ、アカシア属種、カエデ属種、マタタビ属種、トチノキ属種、ニュージランドカウリ（Ａｇａｔｈｉｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、アルビジア・アマラ（Ａｌｂｉｚｉａ ａｍａｒａ）、アルソフィラ・トリカラー（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｔｒｉｃｏｌｏｒ）、ウシクサ属種、シロイヌナズナ属種、ラッカセイ属種、ビンロウジュ（Ａｒｅｃａ ｃａｔｅｃｈｕ）、アステリア・フラグランス（Ａｓｔｅｌｉａ ｆｒａｇｒａｎｓ）、アストラガルス・キケル（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｃｉｃｅｒ）、バイキアエア・プルリジュガ（Ｂａｉｋｉａｅａ ｐｌｕｒｉｊｕｇａ）、カバノキ属種、アブラナ属種、オヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ）、ブルケア・アフリカーナ（Ｂｕｒｋｅａ ａｆｒｉｃａｎａ）、ブテア・フロンドーサ（Ｂｕｔｅａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）、カダバ・ファリノーサ（Ｃａｄａｂａ ｆａｒｉｎｏｓａ）、ベニゴウカン（Ｃａｌｌｉａｎｄｒａ）属種、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ダンドク（Ｃａｎｎａ ｉｎｄｉｃａ）、トウガラシ属種、カシア属種、セントロセマ・プベスケンス（Ｃｅｎｔｒｏｅｍａ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、ボケ属種、シナニッケイ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｓｓｉａ）、アラビカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）、コロフォスペルマム・モパネ（Ｃｏｌｏｐｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｍｏｐａｎｅ）、コロニラ・バリア（Ｃｏｒｏｎｉｌｌｉａ ｖａｒｉａ）、コトネアステル・セロティナ（Ｃｏｔｏｎｅａｓｔｅｒ ｓｅｒｏｔｉｎａ）、サンザシ属種、キュウリ属種、イトスギ属種、シルバーファーン（Ｃｙａｔｈｅａ ｄｅａｌｂａｔａ）、マルメロ（Ｃｙｄｏｎｉａ ｏｂｌｏｎｇａ）、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、オガルカヤ属種、ダルベルジア・モネタリア（Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｍｏｎｅｔａｒｉａ）、ダバリア・ジバリカタ（Ｄａｖａｌｌｉａ ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）、ヌスビトハギ属種、ディクソニア・スクアローサ（Ｄｉｃｋｓｏｎｉａ ｓｑｕａｒｏｓａ）、ジヘテロポゴン・アンプレクテンス（Ｄｉｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ ａｍｐｌｅｃｔｅｎｓ）、ジオクレア属種、フジマメ属種、ドリクニウム・レクタム（Ｄｏｒｙｃｎｉｕｍ ｒｅｃｔｕｍ）、エキノクロア・ピラミダリス（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｐｙｒａｍｉｄａｌｉｓ）、チシャノキ（Ｅｈｒａｒｔｉａ）属種、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ）、スズメガヤ（Ｅｒａｇｒｅｓｔｉｓ）属種、デイゴ属種、ユーカリ属種、ユークレア・シンペリ（Ｅｕｃｌｅａ ｓｃｈｉｍｐｅｒｉ）、ユーラリア・ビローサ（Ｅｕｌａｌｉａ ｖｉｌｌｏｓａ）、ソバ属種、フェイジョア・セロウィアナ（Ｆｅｉｊｏａ ｓｅｌｌｏｗｉａｎａ）、オランダイチゴ属種、フレミンギア（Ｆｌｅｍｉｎｇｉａ）属種、フレイキネティア・バンクシー（Ｆｒｅｙｃｉｎｅｔｉａ ｂａｎｋｓｉｉ）、ゲンノショウコ（Ｇｅｒａｎｉｕｍ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）、グリシン・ジャバニカ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）、グリリシディア（Ｇｌｉｒｉｃｉｄｉａ）属種、アプランドワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、グレビレア属種、グイボウルティア・コレオスペルマ（Ｇｕｉｂｏｕｒｔｉａ ｃｏｌｅｏｓｐｅｒｍａ）、イワオウギ属種、ヘマルスリア・アルテシマ（Ｈｅｍａｒｔｈｉａ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、ヘテロポゴン・コントルタス（Ｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、オオムギ、ヒパルレニア・ルファ（Ｈｙｐａｒｒｈｅｎｉａ ｒｕｆａ）、オトギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｅｒｅｃｔｕｍ）、ハイペルテリア・ディソルタ（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｌｉａ ｄｉｓｓｏｌｕｔａ）、インディゴ・インカルナータ（Ｉｎｄｉｇｏ ｉｎｃａｒｎａｔａ）、アヤメ属種、レプタルレナ・ピロリフォリア（Ｌｅｐｔａｒｒｈｅｎａ ｐｙｒｏｌｉｆｏｌｉａ）、ハギ（Ｌｅｓｐｅｄｉｚａ）属種、アキノノゲシ（Ｌｅｔｔｕｃａ）属種、ギンネム（Ｌｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）、ローデシア・シンプレクス（Ｌｏｕｄｅｔｉａ ｓｉｍｐｌｅｘ）、ロトヌス・バイネシー（Ｌｏｔｏｎｕｓ ｂａｉｎｅｓｉｉ）、ハス属種、マクロチローマ・アキシラレ（Ｍａｃｒｏｔｙｌｏｍａ ａｘｉｌｌａｒｅ）、リンゴ属種、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、メタセコイア（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ）、ムサ・サピエンタム（Ｍｕｓａ ｓａｐｉｅｎｔｕｍ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎｕｍ）属種、イガマメ（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）属種、ツノウマゴヤシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｐｕｓ）属種、イネ属種、ペルトフォルム・アフリカヌム（Ｐｅｌｔｏｐｈｏｒｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、チカラシバ属種、アボガド（Ｐｅｒｓｅａ ｇｒａｔｉｓｓｉｍａ）、ペチュニア属種、インゲンマメ属種、カナリーヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、フォルミウム・クッキアヌム（Ｐｈｏｒｍｉｕｍ ｃｏｏｋｉａｎｕｍ）、カナメモチ属種、カナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）、マツ属種、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ポドカルプス・トタラ（Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ ｔｏｔａｒａ）、ポゴナルスリア・フレッキイ（Ｐｏｇｏｎａｒｔｈｒｉａ ｆｌｅｃｋｉｉ）、ポゴナルスリア・スクアローサ（Ｐｏｇｏｎａｒｔｈｒｉａ ｓｑｕａｒｒｏｓａ）、ポプラ属種、プロソピス・シネラリア（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｃｉｎｅｒａｒｉａ）、ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）、プテロロビウム・ステラツム（Ｐｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ ｓｔｅｌｌａｔｕｍ）、ナシ属種、カシ属種、シャリンバイ（Ｒｈａｐｈｉｏｌｅｐｓｉｓ ｕｍｂｅｌｌａｔａ）、ニカウ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｔｙｌｉｓ ｓａｐｉｄａ）、ルス・ナタレンシス（Ｒｈｕｓ ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、セイヨウスグリ（Ｒｉｂｅｓ ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａ）、スグリ属種、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、バラ属種、キイチゴ属種、ヤナギ属種、スキザクリウム・サンギネウム（Ｓｃｈｙｚａｃｈｙｒｉｕｍ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｍ）、コウヤマキ（Ｓｃｉａｄｏｐｉｔｙｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）、セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、セコイア・デンドロン（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ホウレンソウ属種、スポロボルス・フィンブリアツス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ）、スチブルス・アロペクロイデス（Ｓｔｉｂｕｒｕｓ ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ）、スチロサンテス・フミリス（Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｏｓ ｈｕｍｉｌｉｓ）、タデハギ属種、ラクウショウ（Ｔａｘｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）、テメダ・トリアンドラ（Ｔｈｅｍｅｄａ ｔｒｉａｎｄｒａ）、ジャジクソウ属種、コムギ属種、アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、スノキ属種、ソラマメ属種、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ワトソニア・ピラミダタ（Ｗａｔｓｏｎｉａ ｐｙｒａｍｉｄａｔａ）、オランダカイウ（Ｚａｎｔｅｄｅｓｃｈｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アマランサス、チョウセンアザミ、アスパラガス、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、カラードグリーン、亜麻、ケール、レンズマメ、アブラナ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、ワラ（ｓｔｒａｗ）、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、カボチャおよび茶。
いくつかの態様では、「バイオマス」用に特別に成長させた植物が使用されてもよい。例えば、適切な植物としては、トウモロコシ、スイッチグラス、ソルガム、ススキ、サトウキビ、ポプラ、マツ、コムギ、イネ、ダイズ、ワタ、オオムギ、芝草、タバコ、ジャガイモ、竹、セイヨウアブラナ、テンサイ、ヒマワリ、ヤナギ、およびユーカリが挙げられる。さらなる態様では、植物は、とりわけ、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、暖竹（Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ）、リードカナリーグラス（Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、ジャイアントススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）、ススキ属種、メドハギ（ｓｅｒｉｃｅａ ｌｅｓｐｅｄｅｚａ）（Ｌｅｓｐｅｄｅｚａ ｃｕｎｅａｔａ）、キビ、ドクムギ（Ｌｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ、ドクムギ属種）、オオアワガエリ、コキア（Ｋｏｃｈｉａ ｓｃｏｐａｒｉａ）、飼料大豆、アルファルファ、クローバー、サンヘンプ、ケナフ、バヒアグラス、バミューダグラス、ダリスグラス、パンゴラグラス、ビッグブルーステム、インディアングラス、ウシノケグサ（ウシノケグサ属種）、カモガヤ属種、ミナトカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、スムーズブロムグラス、オーチャードグラス、またはケンタッキーブルーグラスが挙げられる。
あるいは、藻類および他の非緑色植物が本発明のいくつかの態様の方法に使用されてもよい。１つの態様では、植物は、ラカンカ（Ｓ． ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）などのウリ科の植物である。
１つの態様によれば、植物は、限定されるものではないが、リンゴの木、セイヨウナシの木、マルメロの木、アンズの木、セイヨウスモモの木、サクラの木、モモの木、ラズベリー、ビワの木、イチゴ植物、アーモンドの木、ならびに観賞用の樹木および低木（例えばバラ、セイヨウナツユキソウ（ｍｅａｄｏｗｓｗｅｅｔｓ）、カナメモチ（ｐｈｏｔｉｎｉａｓ）、ピラカンサ、ナナカマド、およびサンザシ）などのバラ科の植物である。
好ましいナシ（ｐｅａｒ）の属はピルス属である。
好ましいナシ種としては：マメナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃａｌｌｅｒｙａｎａ）、ピルス・コーカシカ（Ｐｙｒｕｓ ｃａｕｃａｓｉｃａ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ピルス・エレアグリフォリア（Ｐｙｒｕｓ ｅｌａｅａｇｒｉｆｏｌｉａ）、ピルス・ハイブリッドカルティバー（Ｐｙｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｃｕｌｔｉｖａｒ）、ヤマナシ（Ｐｙｒｕｓ ｐｙｒｉｆｏｌｉａ）、ピルス・サリチフォリア（Ｐｙｒｕｓ ｓａｌｉｃｉｆｏｌｉａ）、シベリアナシ（Ｐｙｒｕｓ ｕｓｓｕｒｉｅｎｓｉｓ）およびチュウゴクナシ（Ｐｙｒｕｓ ｘ ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ）が挙げられる。
特定に好ましい属はリンゴ属である。
好ましいリンゴ種としては：マルス・アルデンハメンシス（Ｍａｌｕｓ ａｌｄｅｎｈａｍｅｎｓｉｓ）、マルス・アンガスティフォリア（Ｍａｌｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、ワリンゴ（Ｍａｌｕｓ ａｓｉａｔｉｃａ）、シベリアクラブアップル（Ｍａｌｕｓ ｂａｃｃａｔａ）、マルス・コロナリア（Ｍａｌｕｓ ｃｏｒｏｎａｒｉａ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、タイワンリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｕｍｅｒｉ）、マルス・フロレンティナ（Ｍａｌｕｓ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎａ）、カイドウズミ（Ｍａｌｕｓ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）、マルス・フスカ（Ｍａｌｕｓ ｆｕｓｃａ）、ハナカイドウ（Ｍａｌｕｓ ｈａｌｌｉａｎａ）、マルス・ホナネンシス（Ｍａｌｕｓ ｈｏｎａｎｅｎｓｉｓ）、ツクシカイドウ（Ｍａｌｕｓ ｈｕｐｅｈｅｎｓｉｓ）、マルス・イオエンシス（Ｍａｌｕｓ ｉｏｅｎｓｉｓ）、マルス・カンスエンシス（Ｍａｌｕｓ ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ）、エゾノコリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃａ）、ミカイドウ（Ｍａｌｕｓ ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ）、マルス・ニードツベツキアナ（Ｍａｌｕｓ ｎｉｅｄｚｗｅｔｚｋｙａｎａ）、マルス・オムブロフィリア（Ｍａｌｕｓ ｏｍｂｒｏｐｈｉｌｉａ）、マルス・オリエンタリス（Ｍａｌｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、マルス・プラッティー（Ｍａｌｕｓ ｐｒａｔｔｉｉ）、イヌリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ）、セイヨウリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）、マルス・サージェンティ（Ｍａｌｕｓ ｓａｒｇｅｎｔｉｉ）、マルス・シーボルディ、マルス・シーベルシー（Ｍａｌｕｓ ｓｉｅｖｅｒｓｉｉ）、マルス・シルウェストリス（Ｍａｌｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、マルス・トリンゴイデス、マルス・トランシトリア（Ｍａｌｕｓ ｔｒａｎｓｉｔｏｒｉａ）、カエデバコリンゴ、オオウラジロノキ（Ｍａｌｕｓ ｔｓｃｈｏｎｏｓｋｉｉ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、リンゴｘマルスｘシーベルシー（Ｍａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ ｘ Ｍａｌｕｓ ｓｉｅｖｅｒｓｉｉ）、マルスｘドメスティカｘセイヨウナシ、マルス・シャオジネンシス（Ｍａｌｕｓ ｘｉａｏｊｉｎｅｎｓｉｓ）、マルス・ユンナネンシス（Ｍａｌｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）、リンゴ属種、およびセイヨウカリン（Ｍｅｓｐｉｌｕｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）が挙げられる。
特に好ましい植物種はリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）である。
特定の態様では、植物はリンゴ、カエデバコリンゴまたはマルス・シーボルディである。
別の態様では、植物はブドウ属種の植物である。例示的なブドウ属種としては、限定されるものではないが、ヴィティス・ピアセツキー・マキシム（Ｖｉｔｉｓ ｐｉａｓｅｚｋｉｉ ｍａｘｉｍ）およびアマヅル（Ｖｉｔｉｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｅｒａ ｍａｋｉｎｏ）が挙げられる。
好ましい態様では植物は、限定されるものではないが、以下の属を含む群から選択される種由来の植物である：スミラックス属（Ｓｍｉｌａｘ）（例えばスミラックス・グリシフィラ（Ｓｍｉｌａｘ ｇｌｙｃｉｐｈｙｌｌａ））、マテバシイ属（例えばリトカルプス・ポリスタキウス（Ｌｉｔｈｏｃａｒｐｕｓ ｐｏｌｙｓｔａｃｈｙｕｓ））、およびオランダイチゴ属。
植物からトリロバチンを抽出するための方法
本発明のいくつかの態様によれる植物からのトリロバチンの抽出によるトリロバチンの生産のための方法も提供される。トリロバチンは、当業者に公知の多くの異なる方法によって植物から抽出することができる。
ジヒドロカルコンを抽出するための様々な方法が知られている。例えば、Ｓｕｎら（２０１５）（参照により本明細書に組み込まれる）は、２相溶媒系（ｎ－ヘキサン－酢酸エチル－エタノール－水）を使用して甜茶（Ｌｉｔｈｏｃａｒｐｕｓ ｐｏｌｙｓｔａｃｈｙｕｓ Ｒｅｈｄ）からトリロバチンを抽出する。１３０ｍｇの粗甜茶抽出物から、９８．４％純度で４８．４ｍｇのトリロバチンの収量が得られた。Ｔａｎａｋａ Ｔ．ら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｌｏｂａｔｉｎ， ａ Ｓｗｅｅｔ Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｔｉｓ ｐｉａｓｅｚｋｉｉ Ｍａｘｉｍ， ａｎｄ Ｖ． ｓａｃｃｈａｒｉｆｅｒａ Ｍａｋｉｎｏ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（１９８３）４７：１０、２４０３～２４０４頁（参照により本明細書に組み込まれる）は、ブドウ属の葉からのトリロバチンの単離の方法を提供している。Ｘｉａｎｇ－Ｄｏｎｇ ＱｉｎおよびＪｉ－Ｋａｉ Ｌｉｕ Ｚ．、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．（２００３）５８ｃ、７５９～７６１頁（参照により本明細書に組み込まれる）は、リトカルプス・パキフィラス（Ｌｉｔｈｏｃａｒｐｕｓ ｐａｃｈｙｐｈｙｌｌｕｓ）の葉からのトリロバチンの単離の方法を提供している。Ｑｉｎ、Ｘ．ら、Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｒａｂａｐｐｌｅ Ｌｅａｖｅｓ Ｓｈｏｗｅｄ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１５、２０、２１１９３～２１２０３頁（参照により本明細書に組み込まれる）は、５０％エタノール／水を使用してリンゴ属クラブアップルの葉からトリロバチンを抽出する方法を提供している。さらに、Ｘｉａｏ Ｚ．ら、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｅｓｔｓ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈａｌｃｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｍａｌｕｓ ’Ｒｅｄ Ｓｐｌｅｎｄｏｒ’ ｆｒｕｉｔ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ２０１７年９月１５日；２３１：３２４～３３１頁（参照により本明細書に組み込まれる）は、リンゴ属「レッドスプレンダー（Ｒｅｄ Ｓｐｌｅｎｄｏｒ）」果実からトリロバチンおよび他のジヒドロカルコンを、８０％エタノールでの抽出により抽出し、その後石油エーテル、次いで酢酸エチルで抽出している。
これらの方法は、当業者に周知のアプローチを使用したより大規模なトリロバチン抽出のためにスケールアップすることができる。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「少なくとも一部が～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ ｉｎ ｐａｒｔ ｏｆ）」を意味する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を含む、本明細書および特許請求の範囲における記載を解釈する場合、各記載のこの用語によって始まる特徴以外の他の特徴も存在し得る。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの関連する用語も同様に解釈されるべきである。
本明細書で使用される場合、用語「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、「および（ａｎｄ）」もしくは「または（ｏｒ）」を意味し、または文脈により可能になる場合は両方を意味する。
本明細書で使用される場合、名詞に続く用語「複数可（ｓ）」は、その名詞の複数形および／または単数型を意味する。
本発明は、本出願の本明細書に、個別または集合的に言及されまたは示された部分、要素および特徴、ならびに任意の２つ以上の前記部分、要素または特徴の任意のまたは全ての組合せで構成されるとおおむね言うこともでき、本発明が関係する技術分野において既知の同等物を有する特定の整数が本明細書で言及される場合、そのような既知の同等物は、個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれるとみなされる。
本発明はこれより、以下の非限定的な例を参照して説明される。
本発明の範囲を上述の例のみに限定する意図はない。当業者によって理解されるように、本発明の範囲から逸脱することなく多くの変形形態が可能である。
１． 実施例１－リンゴにおける４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の同定
１．１ 材料および方法
１．１．１ 植物材料
Ｍｔ Ａｌｂｅｒｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ ＆ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＰＦＲ）（オークランド、ニュージーランド）の温室で栽培した「ロイヤルガラ」とＹ３の間のＦ１実生集団におけるトリロバチン生産をマッピングした。Ｙ３は、クラブアップルの交配種「アオテア（Ａｏｔｅａ）」×リンゴ（マルス・ドメスティカ）「Ｍ９」に由来する。「アオテア」は、マルス・シーボルディ（シーボルジンを生産する）の自由交雑に由来する。カエデバコリンゴおよび「アオテア」は、ニュージーランド、ハブロックノースのＰＦＲ研究果樹園で栽培した。クラブアップルの交配種「ラディアント（Ｒａｄｉａｎｔ）」とリンゴ「ふじ」間の差次的遺伝子発現解析用のミカイドウおよびＦ１集団は、西北農林科技大学、Ｌｕｏｃｈｕａｎ Ａｐｐｌｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ（中国陝西省）で栽培した。全ての他の材料は、西北農林科技大学（中国陝西省楊陵）の実験果樹園で栽培した。全ての樹を自身の根で栽培し、病害および害虫防除のための標準的な園芸栽培実務および管理を使用して管理した。
１．１．２ 化学物質
トリロバチンは、リンゴ属「レッドスプレンダー（Ｒｅｄ Ｓｐｌｅｎｄｏｒ）」（Ｘｉａｏら、２０１７）から精製した。シーボルジン、３－ＯＨフロレチンおよびケルセチン配糖体はＰｌａｎｔＭｅｔａＣｈｅｍ（ｗｗｗ．ＰｌａｎｔＭｅｔａＣｈｅｍ．ｃｏｍ）から、シアニジンはＥｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ（ｗｗｗ．ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ．ｃｏｍ）から購入した。フロリジンおよびフロレチンを含む全ての他の化学物質は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）から入手した。
１．１．３ トリロバチン遺伝子座のマッピング
「ロイヤルガラ」×Ｙ３集団の実生からの葉組織を採取し、液体窒素で瞬間凍結する前に秤量した。フェノール類を、Ｄａｒｅら、（２０１７）に記載されているように葉組織１００～２５０ｍｇから抽出し、ポリフェノールを、Ａｎｄｒｅら、（２０１２）に記載されているようにダイオードアレイ検出器が装備されたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００システムでのＤｉｏｎｅｘ－ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ、サニーベール、ＣＡ、ＵＳＡ）によって２８０ｎｍで定量した。実生ＤＮＡをＤＮＡｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、遺伝子型をＩＲＳＣ ８Ｋ ＳＮＰアレイ（Ｃｈａｇｎｅら、２０１２）を使用して決定した。ＳＮＰアレイデータをＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅを使用して解析した。遺伝子地図をＪｏｉｎＭａｐバージョン４．０（ｖａｎ Ｏｏｉｊｅｎら、２００６）を使用して構築し、Ｙ３のトリロバチン遺伝子座の位置をＬＧ７に同定した。次いで、ＰＧＴ２候補遺伝子内に設計したＨＲＭプライマー（図１、表１）およびＣｈａｇｎｅら、（２０１２）のようなＰＣＲ条件を使用してＰＧＴ２の位置を定義した。
Figure 2023514687000003
１．１．４ 活性指向のタンパク質精製
以下のプロトコルを、クラブアップルの交配種「アダムス」由来の４’－ｏＧＴ活性およびミカイドウ由来の２’－ｏＧＴ活性の活性指向の精製に使用した。花弁（５０ｇ）を、液体窒素中でＩＫＡ（登録商標）Ｗｏｒｋｓ（ＶＷＲ、ラドナー、ＰＡ、ＵＳＡ）製のＡ１１グラインダーを用いて細かい粉末に粉砕した。４０ｍｌ抽出緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１４ｍＭβ－メルカプトエタノール、５ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセリン、２ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム塩、および０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）および０．０５ｇ・ｍｌ－１ポリビニルポリピロリドンを添加後、凍結粉末をＸＨＦ－Ｄ高速分注器（ｄｉｓｐｅｒｓａｔｏｒ）（Ｎｉｎｇｂｏ Ｓｃｉｅｎｔｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、寧波、中国）を使用してホモジナイズした。ホモジネートを１２，０００ｇで２０分間遠心分離し、上清をタンパク質粗抽出物として回収した。上清中のタンパク質を、３０％～７０％飽和で硫酸アンモニウムによって沈殿させた。回収したペレットを抽出緩衝液に溶解し、緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭ ＤＴＴ）を含むＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して脱塩した。タンパク質溶液を、ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ Ｐｌｕｓタンパク質クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して緩衝液Ａで予め平衡化した１０ｍｌ Ｑ－セファロースＨｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が充満したＸＫ１６／２０カラムに充填した。タンパク質を、１０カラム容量、流速１ｍｌ・分－１で０％～１００％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ）の直線勾配（ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用いて溶出した。各画分２ｍｌを回収し、ＨＰＬＣを使用してＧＴ活性についてアッセイした。ＧＴ活性が高い画分をプールし、溶媒を、限外濾過遠心分離管（Ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔｕｒｂｏ１５、ｗｗｗ．ｓａｒｔｏｒｉｕｓ．ｃｏｍ）を用いて緩衝液Ｃ（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、２ｍＭ ＤＴＴ、１Ｍ硫酸アンモニウム）に交換した。この画分を次いで、緩衝液Ｃで平衡化した１０ｍｌ Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が充満した別のＸＫ１６／２０カラムに充填した。タンパク質を、１０×カラム容量、流速１ｍｌ・分－１で１００％～０％緩衝液Ｃの直線勾配を用いて溶出した。各画分２ｍｌを回収し、活性画分をプールし、限外濾過遠心分離管を使用して緩衝液Ａで脱塩した。タンパク質を、１２０ｍｌ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５分取グレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が充満したＸＫ１６／７０カラムでさらに精製し、平衡化し、流速０．８ｍｌ・分－１で緩衝液Ａを用いて溶出した。各画分１ｍｌを回収し、ＧＴ活性についてアッセイした。限外濾過遠心分離管を使用して各活性画分を別々に濃縮し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に使用した。全てのタンパク質精製ステップは０～４℃で行った。カラム温度は、ＴＨＤ－０６Ｈ循環水槽（Ｔｉａｎｈｅｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、寧波、中国）を使用して制御した。
精製したタンパク質画分を１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、クマシーブルーＲ－２５０染色によって可視化した。標的バンドを切断し、Ｇａｏら、（２０１７）に従ってトリプシンを用いてゲル内消化した。ペプチド混合物を次いで、緩衝液Ａ（０．１％ギ酸）中でＣ１８逆相分析カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅａｓｙ Ｃｏｌｕｍｎ、長さ１０ｃｍ、内径７５μｍ、レジン３μｍ）に接続された逆相トラップカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ １００、１００μｍ×２ｃｍ、ｎａｎｏＶｉｐｅｒ Ｃ１８）に充填し、ＩｎｔｅｌｌｉＦｌｏｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって制御された流速３００ｎＬ・分－１で緩衝液Ｂ（８４％アセトニトリルおよび０．１％ギ酸）の直線勾配を用いて分離した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を、Ｅａｓｙ ｎＬＣ（Ｐｒｏｘｅｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、現Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で６０分間行った。質量分析器は陽イオンモードで操作した。ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア、バージョン１．５．３．１７（Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、マルティンスリート、ドイツ）を使用して、ＮＣＢＩおよびｗｗｗ．ｒｏｓａｃｅａｅ．ｏｒｇ．で入手可能なリンゴデータベース（Ｍａｌｕｓ＿ｘ＿ｄｏｍｅｓｔｉｃａ．ｖ１．０－ｐｒｉｍａｒｙ．ｐｒｏｔｅｉｎ．ｆａ．ｇｚ）と比較してＭＳ／ＭＳスペクトルを検索した。
１．１．５ 差次的遺伝子発現解析
クラブアップルの交配種「ラディアント」とリンゴ「ふじ」間の交雑から発生したＦ１集団を、ＨＰＬＣによってトリロバチンおよびフロリジンについてスクリーニングした。トリロバチン＋フロリジン（Ｔ＋Ｐ）を含有する８１本、およびフロリジン（Ｐ）のみを含有する８１本を同定した。葉を広げているものを各実生（高さ約２０ｃｍ）から回収し、Ｔ＋ＰおよびＰの３つのプール反復試料を調製した（反復試料ごとに２７本からの葉を含有）。トリゾール試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して製造者の指示に従って凍結粉砕粉末から全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡの完全性をＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００でチェックした。配列決定ライブラリーを、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して製造者の推奨に従って１試料あたり３μｇ ＲＮＡから生成し、インデックスコードを各試料の属性配列に加えた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ４０００プラットフォームを使用してＮｏｖｏｇｅｎｅ（北京、中国）によってＲＮＡを配列決定した。
トランスクリプトーム解析のために、各試料の３回の生物学的反復からのＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ４０００プラットフォームを使用してＮｏｖｏｇｅｎｅ（北京、中国）によって配列決定した。ＢＯＷＴＩＥ ｖ２．２．３およびＴｏｐＨａｔ ｖ２．０．１２を用いて、リンゴ（マルス・ドメスティカ）「ゴールデンデリシャス」ｖ１．０ｐアセンブリ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｏｓａｃｅａｅ．ｏｒｇ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｍａｌｕｓ／ｍａｌｕｓ＿ｘ＿ｄｏｍｅｓｔｉｃａ／ｇｅｎｏｍｅ＿ｖ１．０）に対してリードを整列させた。ＤＥＧＳｅｑ Ｒパッケージ（１．２６．０）を使用して差次的遺伝子発現解析を行った。
１．１．６ ｑＲＴ－ＰＣＲ分析
Ｍａｌｎｏｙら、（２００１）によって記載されているように、全ＲＮＡを若葉から抽出した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、大連、中国）を使用して、製造者の指示に従って１μｇの全ＲＮＡから合成した。ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ、大連、中国）を使用したＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてｑＲＴ－ＰＣＲを行った。参照遺伝子としてＭｄＡｃｔｉｎを使用した。相対的発現レベルは、２ －ΔΔＣＴ方法（ＬｉｖａｋおよびＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、２００１）に従って算出した。それぞれ３回の技術的反復を伴う３回の生物学的反復をｑＲＴ－ＰＣＲ分析に使用した。遺伝子特異的プライマーを表２にリストする。
Figure 2023514687000004
１．２ 結果
１．２．１ 分離集団におけるトリロバチンのマッピングレベル
トリロバチンレベルを、栽培リンゴと野生リンゴ（「ロイヤルガラ」×Ｙ３）間の交雑から発生した分離集団においてマッピングした。雌親株「ロイヤルガラ」（リンゴ（Ｍ． ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））はフロリジンのみを生産したが、雄親株Ｙ３（マルス・シーボルディに由来）は、トリロバチンおよびフロリジンの両方を生産した。表現型を決定した５１本のうち、３０本はトリロバチンおよびフロリジンを含有し、２１本はフロリジンだけを含有した。分離比（１：０．７；Ｘ２＝１．５８）は、トリロバチン含量が、単一遺伝子によって制御される定性的形質として分離していることを示唆した。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＲｏｓＢＲＥＥＤ ＳＮＰ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＩＲＳＣ）８Ｋ ＳＮＰアレイ（Ｃｈａｇｎｅら、２０１２）を用いて葉のＤＮＡをスクリーニングして得られたデータを、ＪｏｉｎＭａｐバージョン４．０（ｖａｎ Ｏｏｉｊｅｎら、２００６）を使用して解析した。トリロバチン生合成の制御のための単一遺伝子座（Ｔｒｉｌｏｂａｔｉｎ）は、「ゴールデンデリシャス」倍過半数体ゲノムアセンブリ（ＧＤＤＨ１３ ｖ１．１）（Ｄａｃｃｏｒｄら、２０１７）においてＬｉｎｋａｇｅ Ｇｒｏｕｐ（ＬＧ）７の位置３２，５２７，８７３ｂｐ（図１Ａ）に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーより遠位の下側アームで同定された。ＬＧ７の該塩基に近い３４，４６０，００～３４，４６１，０００ｂｐ（ＬＧ７の全長は、ＧＤＤＨ１３ ｖ１．１では３６，６９１，１２９である）における２つの候補ＰＧＴ遺伝子（図１Ａ、Ｂ）から開発された高分解能融解（ＨＲＭ）ＳＮＰマーカーを使用して、該遺伝子座をさらに定義した。ＬＧ７でマッピングされた位置は、連鎖および関連解析を使用してリンゴ属で最近報告されたジヒドロカルコン含量に関する３つの独立した分離遺伝子座（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚら、２０１８ａ）の１つと一致した。
１．２．２ 活性指向のタンパク質精製によって同定された候補グリコシルトランスフェラーゼ
トリロバチン生産に必要とされる４’－ｏＧＴ活性は高いが、フロリジン合成には極めて低い２’－ｏＧＴ活性を含有する組織を使用して、活性指向のタンパク質精製によって候補４’－ｏＧＴを同定した。クラブアップルの交配種「アダムス」の花弁は、葉と比べてＲｕｂｉｓｃｏのレベルは低いが、果実と比べて４’－ｏＧＴ活性がより高いことから、これを適切な実験材料として同定した。精製は連続的なクロマトグラフィーステップを要し（Ｑ－セファロース、フェニルセファロースおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５；図２Ａ～Ｃ）、その後、４’－ｏＧＴ活性が高い画分をプールし、さらなる精製に使用した。サイズ排除クロマトグラフィー後の最終ステップでは、４’－ｏＧＴ 酵素活性が異なる４つのタンパク質画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。４４～６６ｋＤａ（典型的なＵＧＴの予想されるサイズ）の間の単一バンドの量は、４’－ｏＧＴ活性の量（図２Ｃ）と類似したパターンで変化した（図２Ｄ）。このバンドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけ、５０個のタンパク質に対応するペプチドをリンゴ「ゴールデンデリシャス」ｖ１．０ゲノムアセンブリ（Ｖｅｌａｓｃｏら、２０１０）で同定した。５個の最も豊富なタンパク質を表にリストする。
列２の遺伝子モデルの説明は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴｎ検索によって得た。ＩＢＡＱ＝タンパク質の観察可能なペプチドの数で割った全てのペプチド強度の合計。解析は２回行い、両方の解析（Ｒ１、Ｒ２）で見出された最も豊富なタンパク質を列３および４に示す。予測されたＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ８８Ａ１様タンパク質をコードする遺伝子モデルＭＤＰ００００８３６０４３／ＭＤＰ００００３１８０３２に対応するペプチドが、最も高い存在量で観察された（全ペプチドの２６％）。
Figure 2023514687000005
フロリジン生合成のための高い２’－ｏＧＴ活性を示すが、４’－ｏＧＴ活性は示さないミカイドウの花弁を、上に記載した方法を使用して候補２’－ｏＧＴの活性指向の精製に使用した。サイズ排除クロマトグラフィー後、４４～６６ｋＤａの間の単一バンドの量は、２’－ｏＧＴ活性と一致するパターンで変化した（図３）。このバンドのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析後、ＭＤＰ００００２１９２８２／ＭＤＰ０００００５２８６２に対応するペプチドが最も高い存在量（全ペプチドの８８％）で観察された。ＭＤＰ００００２１９２８２は、Ｊｕｇｄｅら、（２００８）によって以前に記載されたフロレチン特異的２’－ｏＧＴであるＭｄＰＧＴ１（ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ８８Ｆ１）をコードする。
１．２．３ 差次的遺伝子発現解析によって同定された候補グリコシルトランスフェラーゼ
セクション １．１．５に記載されている差次的遺伝子発現（ＤＧＥ）解析を使用する第２のアプローチを使用して、トリロバチンは高いがフロリジンは低い組織で候補４’－ｏＧＴを同定した。観賞用クラブアップルの交配種「ラディアント」（トリロバチンおよびフロリジンの両方を含有）とリンゴ「ふじ」（フロリジンのみを含有）間で交雑種を作製した。ＲＮＡ抽出およびトランスクリプトーム解析のために、Ｆ１後代をトリロバチンを含むまたは含まない２つの表現型に分けた。産生トリロバチンを生産する後代では、１０９個の遺伝子の発現レベルが少なくともｌｏｇ２倍変化＞４に上方制御された。最大のｌｏｇ倍変化を示す５個の遺伝子を表４に示す。
列２の遺伝子モデルの説明は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴｎ検索によって得た。予測されたＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ８８Ａ１様タンパク質ＭＤＰ００００８３６０４３の発現レベルは最も大きな差次的発現を示し、トリロバチンを含む植物では、含まない植物と比べてｌｏｇ２倍変化＞７超に上方制御された。
Figure 2023514687000006
１．２．４ 候補遺伝子の遺伝子マッピングおよび発現解析
活性指向のタンパク質精製およびＤＥＧ解析によって同定された候補ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ８８Ａ１様タンパク質である、遺伝子モデルＭＤＰ００００８３６０４３のＨＲＭマーカー解析による遺伝子マッピングは、ＭＤＰ００００８３６０４３が、ＬＧ７でトリロバチン生産に関して同定された遺伝子座（図１Ａ）と同じ場所に位置することを示している。「ゴールデンデリシャス」ｖ１．０ｐアセンブリ（Ｖｅｌａｓｃｏら、２０１０）では、ＭＤＰ００００８３６０４３は約２４，５３１，７５１ｂｐに位置し、倍過半数体アセンブリＧＤＤＨ１３ ｖ１．１における遺伝子モデルＭＤ０７Ｇ１２８１０００／１１００（３４，４５９，２６０ｂｐに位置する）に対応する（図１Ｂ）。ＭＤＰ００００３１８０３２（ＭＤ０７Ｇ１２８０８００）によってコードされる、活性指向のタンパク質精製によって同定された第２のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ８８Ａ１様タンパク質は、両方のアセンブリにおいて約１０．３ｋｂ離れて位置している（図１Ｂ）。これら２つのＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子モデルの領域で同定された４つのＳＮＰ変異体を使用して、ＨＲＭ解析用のマーカーを開発した（表１のＨＲＭプライマー配列）。マッピング結果は、ＬＧ７におけるＭＤＰ００００８３６０４３およびＭＤＰ００００３１８０３２の位置を確証し（図１Ａ）、マーカーの３つ（ＨＲＭ１～３）が分離後代でのトリロバチンの有無と正確に一致することを示した。
Figure 2023514687000007
ＭＤＰ００００８３６０４３（以後、ＰＧＴ２と呼ぶ）およびＭＤＰ００００３１８０３２（ＰＧＴ３と呼ぶ）の相対的発現を、９つのリンゴ属系統種（図４）の葉でｑＲＴ－ＰＣＲによって決定した；主にトリロバチンを生産する３系統種、トリロバチンおよびフロリジンの両方を生産する３系統種、およびフロリジンのみを生産する３系統種。ＰＧＴ２は、トリロバチンを生産する６つのリンゴ属系統種の全てで高度に発現されたが、トリロバチンを合成しない３つの系統種では発現は本質的になかった（図４Ａ）。反対に、ＰＧＴ１の発現は、フロリジンを生産する６つのリンゴ属系統種で高かった（図４Ｂ）。ＰＧＴ３の発現は９つの系統種の全てで観察され、該試料におけるトリロバチンまたはフロリジンの有無とは相関しなかった（図４Ｃ）。
１．３ 考察
グリコシルトランスフェラーゼは大きな遺伝子ファミリーによってコードされ、特異的な活性を有する酵素を相同性に基づき同定することは困難である。インビトロでフロレチンを４’－Ｏ－グリコシル化することができる２つの酵素が報告されている（Ｇｏｓｃｈら、２０１２；Ｙａｈｙａａら、２０１６）が、これらの遺伝子は、フロリジンのみを生産する組織で発現される。この実施例では、本発明者らは複数のアプローチを使用して、フロレチングリコシルトランスフェラーゼ２がリンゴにおけるトリロバチンの生産に関与しているかを示した。トリロバチン生産に関する遺伝子座はＰＧＴ２遺伝子と同じ場所に位置し、ＰＧＴ２に対して開発されたＨＲＭマーカーは、トリロバチン生産により忠実に分離された。さらに、実施例２に記載された分子および生化学的分析は、トリロバチン（またはシーボルジン）が生産される系統種でのみＰＧＴ２が発現されたこと、および該酵素がインビトロで４’－ｏＧＴ活性を示したことを実証している。
２． 実施例２－大腸菌におけるＰＧＴ２およびＰＧＴ３の発現および生化学的分析
２．１ 材料および方法
２．１．１ 化学物質
トリロバチンは、リンゴ属「レッドスプレンダー」（Ｘｉａｏら、２０１７）から精製した。シーボルジン、３－ＯＨフロレチンおよびケルセチン配糖体はＰｌａｎｔＭｅｔａＣｈｅｍ（ｗｗｗ． ＰｌａｎｔＭｅｔａＣｈｅｍ．ｃｏｍ）から、シアニジンはＥｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ（ｗｗｗ．ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ．ｃｏｍ）から購入した。フロリジンおよびフロレチンを含む全ての他の化学物質は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）から入手した。
２．１．２ クローニング
ＰＧＴ１～３のＯＲＦを表６のプライマーを使用して増幅し、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ｗｗｗ．ｖａｚｙｍｅ．ｃｏｍ）を使用してｐＥＴ２８ａ（＋）（ｗｗｗ．ｎｏｖａｇｅｎ．ｃｏｍ）にライゲートした。
Figure 2023514687000008
２．１．３ 大腸菌でのタンパク質発現
組換えタンパク質は、１６℃、２４時間、８０ｒｐｍで０．５ｍＭイソプロピル－１－チオ－β－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で発現させた。組換えタンパク質の精製は、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して行った。溶出画分を、酵素活性の決定およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に使用した（図５）。活性画分をＶｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ）を使用して濃縮した。
２．１．４ グリコシルトランスフェラーゼ活性アッセイ
ＧＴ活性アッセイは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭフロレチン、０．５ｍＭ ＵＤＰ－グルコース、および３０～８０ｎｇ酵素を含有する２００μＬ反応物で行った。反応混合物を４０℃で１０分間インキュベートし、４０μＬの１Ｍ ＨＣｌを添加して反応を止めた。産物の２８０ｎｍでのＨＰＬＣ解析のために、ＮａＯＨ（１Ｍ）を使用してｐＨを中性に調整した。
いくつかの緩衝液系を使用して、ＰＧＴ２およびＰＧＴ１の活性をｐＨ範囲４～１２にわたり３７℃でテストした：ｐＨ４．０、５．０、６．０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ７．０、８．０、９．０、１０．０の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液およびｐＨ１１．０、１２．０の０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＯＨ；ｐＨ８．６、９．０、１０．０、１０．６のグリシン－ＮａＯＨ緩衝液；ならびにｐＨ６．０～１１．０のＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液。
ＰＧＴ２およびＰＧＴ１の最適温度を決定するために、反応をそれぞれ１５～５０℃および１５～６０℃で０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０で実施した。Ｋｍ値を決定する反応を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０で４０℃、１０分間行った。フロレチン（Ｅ）のＫｍ値は、固定ＵＤＰ－グルコース濃度５００μＭでの４～５００μＭの濃度で決定した。ＵＤＰ－グルコースのＫｍ値は、固定フロレチン濃度５００μＭを用いて２～５００μＭの濃度で決定した。Ｋｍ値をＳｉｇｍａｐｌｏｔで非線形回帰によって算出した。
２．２ 結果
２．２．１ ＰＧＴ２およびＰＧＴ３のクローニング
ＰＧＴ２の完全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を６つのリンゴ属系統種の葉から増幅した。トリロバチンを合成する５つの系統種由来のＰＧＴ２ ＯＲＦは、ｗｗｗ．ｒｏｓａｃｅａｅ．ｏｒｇで入手可能なリンゴ「ゴールデンデリシャス」ｖ１．０ｐアセンブリからのＭＤＰ００００８３６０４３遺伝子モデルに対して９１～９４％のアミノ酸同一性を示した（図６）。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：リンゴ「ふじ」－１（ＭＮ３８１００３）、マルス・トリンゴイデス－１（ＭＮ３８０９９９）、マルス・トリンゴイデス－２（ＭＮ３８１０００）、マルス・シーボルディ－１（ＭＮ３８１００１）、クラブアップルの交配種「アダムス」－１（ＭＮ３８１００２）、クラブアップルの交配種「アオテア」－１（ＭＮ３８１００６）、カエデバコリンゴ－１（ＭＮ３８１００４）およびカエデバコリンゴ－２（ＭＮ３８１００５）。
全ての系統種がリンゴ「ふじ」を除いてトリロバチンを生産する。リンゴ「ふじ」の葉から得られたＰＧＴ２の完全ＯＲＦは、マルス・トリンゴイデスから得られたものと同一であったが、極めて低い発現レベルのためにＰＧＴ２を「ふじ」から得ることは困難であった。
２．２．２ 大腸菌での発現および活性アッセイ
５つのリンゴ属系統種由来のＰＧＴ２およびＰＧＴ３ならびに「ふじ」由来のＰＧＴ１を大腸菌で発現させ、フロレチンおよびＵＤＰ－グルコシドを基質として使用して形成された産物をＨＰＬＣによって決定した。全てのＰＧＴ２酵素が、トリロバチン標準物と同じ保持時間で実行した７．５分に単一のピークを生産した（図４Ｄ）。マルス・トリンゴイデス由来のＰＧＴ２によって生産された産物の代表的なＨＰＬＣトレースを、図４Ｅに示す。全てのＰＧＴ３酵素（図４Ｆ）および「ふじ」由来のＰＧＴ１（図４Ｇ）は、フロリジン（図４Ｄ）と同じ保持時間で６．０分にピークを生産したが、トリロバチンは生産しなかった。空ベクター対照（図４Ｈ）によってフロリジンまたはトリロバチンは生産されなかった。
糖供与体としてのＵＤＰ－グルコシド、およびリンゴで一般的に見出される、またはフロレチンに構造的相同性を有する１２種類の基質を使用して、マルス・トリンゴイデス由来の組換えＰＧＴ２の基質特異性をさらに特徴付けした。各反応の産物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定した。フロレチンはＰＧＴ２の最も良い受容体であり、基準ピークプロットは、２１．５分で単一のピークが形成され、トリロバチン標準物と共溶出されたことを示した（図７Ａ、Ｂ）。ＰＧＴ２は３－ＯＨフロレチンのグリコシル化も触媒して、約６０％の比較的高い変換率（表７）でシーボルジンを生産した（図７Ｃ、Ｄ）。ケルセチン－３－Ｏ－グルコシドを、ケルセチンを使用して９．１％のより低い変換率（表７）で反応産物として検出した（図８Ａ～Ｆ）。
Figure 2023514687000009
ジヒドロカルコンの４’位はケルセチンの７位に対応するが、ケルセチン－７－Ｏ－グルコシドは観察されなかったため、この結果は驚くべきである。他の基質による反応では産物は検出されなかった。フルスキャンおよびＭＳ／ＭＳ質量スペクトルデータを使用して、ＰＧＴ２反応の産物をさらに特徴付けた。フロレチン（図７Ｅ）はその擬分子イオンｍ／ｚ２７３［Ｍ－１］－）として検出されたのに対し、トリロバチン（図７Ｆ）、３－ＯＨフロレチン（図７Ｇ）およびシーボルジン（図７Ｈ）は、対応するギ酸付加体［Ｍ＋ギ酸］）－１として主に検出された。ギ酸付加体のＭＳ２は、トリロバチンおよびシーボルジングルコシドについて予想された擬分子イオンをｍ／ｚ４３５および４５１［Ｍ－１］－）で同定した。ｍ／ｚ４３５および４５１［Ｍ－１］－）グルコシドイオンのＭＳ３は、それぞれフロレチンおよび３－ＯＨフロレチンアグリコンのｍ／ｚ２７３およびｍ／ｚ２８９［Ｍ－１］－）イオンを同定した。
ＰＧＴ２およびＰＧＴ１酵素活性を、温度１５～６０℃で４～１２のｐＨ範囲にわたり次のように比較した：
３つの緩衝液系を使用して、ＰＧＴ２（Ａ）およびＰＧＴ１（Ｂ）の活性をｐＨ範囲４～１２にわたり３７℃でテストした：黒い線＝ｐＨ４．０、５．０、６．０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ７．０、８．０、９．０、１０．０の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液およびｐＨ１１．０、１２．０の０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＯＨ。赤い線＝ｐＨ８．６、９．０、１０．０、１０．６のグリシン－ＮａＯＨ緩衝液。緑の線＝ｐＨ６．０～１１．０のＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液。両方の酵素の最適ｐＨはｐＨ８．０～９．０であった（図９Ａ、Ｂ）。
ＰＧＴ２およびＰＧＴ１の温度依存的活性をそれぞれ（Ｃ）および（Ｄ）に示す。フロレチン（Ｅ）のＫｍ値は、固定ＵＤＰ－グルコース濃度５００μＭでの４～５００μＭの濃度で決定した。最適温度は約４０℃であった（図９Ｃ、Ｄ）。
ＵＤＰ－グルコース（Ｆ）のＫｍ値は、固定フロレチン濃度５００μＭを用いて２～５００μＭの濃度で決定した。フロレチンに関するＰＧＴ２のＫｍ値は、１８．０±６．７μＭ（Ｖｍａｘ＝１．８５±０．１７ｎｍｏｌ・分－１）であり、ＵＤＰ－グルコースに関しては１０３．６±２３．０μＭ：（Ｖｍａｘ＝２．０７±０．１７ｎｍｏｌ・分－１）であった（図９Ｅ、Ｆ）。これらのＫｍ値は、同じ精製条件下でフロレチンに関するＰＧＴ１について得られたＫｍ値４．１±１．２μＭ（Ｖｍａｘ＝１．５４±０．０８ｎｍｏｌ・分－１）、およびＵＤＰ－グルコースに関するＰＧＴ１について得られたＫｍ値４９１±４１μＭ（Ｖｍａｘ＝８．８４±０．３５ｎｍｏｌ・分－１）に匹敵する（図９Ｅ、Ｆ）。
２．３ 考察
この実施例では本発明者らは、ＰＧＴ２がトリロバチン生合成に関与していることをさらに示している。本発明者らは、ＰＧＴ２が大腸菌で発現され得、４－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を生産し得ること、ならびにこの酵素がフロレチンおよびＵＤＰ－グルコースと接触するとトリロバチンを生産し得ることも示している。
３． 実施例３－構造解析
３．１ 材料および方法
ＰＧＴ１～３の配列は、ｉＴＡＳＳＥＲサーバー（ＹａｎｇおよびＺｈａｎｇ、２０１５）に別々に提出された。構造解析に使用した最良モデルのＣスコアは、ＰＧＴ１、２および３、それぞれに関して、それぞれ－０．３８、０．９４および１．５２であった。重ね合わせ、構造解析および図示は、ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ、バージョン２．０（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ、２０１５）を使用して行った。
３．２ 結果
ＵＤＰ－グルコースに関する位置特異性の違いの構造基盤を調べるために、ｉＴＡＳＳＥＲサーバー（ＹａｎｇおよびＺｈａｎｇ、２０１５）を使用して構造的相同性モデルをＰＧＴ１～３について別々に得た。モデルを重ね合わせ、ＵＤＰ－グルコース（供与体）および２，４，５－トリクロロフェノール（ＴＣＰ、受容体；Ｂｒａｚｉｅｒ－Ｈｉｃｋｓら、２００７；ＰＤＢエントリー２ＶＣＥ）と結合したＵＧＴ７２Ｂ１の結晶構造と比較した。全体に、全ての構造は、互いの間のＲＭＳＤが約１Åで極めて類似していた。ＰＧＴ２／ＰＧＴ１、ＰＧＴ２／ＰＧＴ３、およびＰＧＴ１／ＰＧＴ３間の配列同一性は、それぞれ４８、８６および４７％である。しかし、予測されたＵＤＰ結合部位の周囲では、３つの酵素間のアミノ酸保存ははるかに高く（＞９５％の同一性）（表８）、同じ供与体分子に結合するこれらの酵素の能力と一致した。さらに、該モデルにおける触媒ダイアド残基の位置（ＰＧＴ２およびＰＧＴ３ではＨｉｓ１６／Ａｓｐ１１８、ＰＧＴ１ではＨｉｓ１５／Ａｓｐ１１８）は、ＵＧＴ７２Ｂ１の結晶構造と極めて良く一致していた。対照的に、ＰＧＴ２とＰＧＴ１間のアミノ酸保存は、受容体結合ポケットを形づくる１３個のアミノ酸で相当に低かった（２３％の同一性；３残基）。同様に、それほど顕著ではないが、受容体結合ポケットの周囲のＰＧＴ２とＰＧＴ３間のアミノ酸保存は６９％に低下した（９残基）。
Figure 2023514687000010
３．３ 考察
同じ受容体（フロレチン）の２つの別個の異性体（フロリジンｖｓトリロバチン）への酵素的変換は、特定の高次構造における活性部位の内側の受容体に結合し、受容体の水酸基を触媒性ヒスチジンおよび糖供与基の近くで（それぞれ、フロレチンの２’および４’位で）グリコシル化されるように配置する酵素の能力に起因する。ＰＧＴ２およびＰＧＴ１のそれぞれの受容体結合ポケットのアミノ酸組成の大きな変化を浮き彫りにしたＰＧＴ２およびＰＧＴ１に関するモデリング結果は、異なる活性を有し、異なる産物を生成するこれら２つの酵素の能力と一致する。しかし、３Ｄモデルでは個々の側鎖の位置がもともと不確実なために、受容体結合ポケットの内側のフロレチンの高次構造のさらなるモデリングを行うことはできない。ＰＧＴ３の場合、３Ｄモデル解析は、低い酵素活性が、受容体結合ポケット内のＰＧＴ２とは異なる４個のアミノ酸の１個（または組合せ）に起因している可能性があることを示唆している。これらのうち、ＰＧＴ３のよりかさ高いＰｈｅがＰＧＴ２の１４５位でＡｓｎに置換されると、ポケットのサイズが限定され、受容体の結合を損なう可能性がある。しかし、この仮説を確かめ、ＰＧＴ２の４’－ｏＧＴ活性と比べてＰＧＴ３の２’－ｏＧＴ活性をさらに理解するには結晶構造解析研究が必要とされる。
４． 実施例４－タバコにおけるトリロバチン生産の代謝工学
４．１ 材料および方法
ＰＧＴ２をカエデバコリンゴから、ｐＨＥＸ２－ＭｄＣＨＳおよびＭｄＤＢＲを「ロイヤルガラ」から、以下のプライマーを使用して増幅した：
Figure 2023514687000011
遺伝子をｐＨＥＸ２にクローニングして、バイナリーベクターｐＨＥＸ２－ＰＧＴ２、ｐＨＥＸ２－ＣＨＳおよびｐＨＥＸ２－ＤＢＲをそれぞれ生成した。ｐＨＥＸ２－Ｍｙｂ１０、ｐＢＩＮ６１－ｐ１９（遺伝子サイレンシングｐ１９のサプレッサーを含有する）および対照構築物ｐＨＥＸ２－ＧＵＳの構築は、以前に報告されている（Ｖｏｉｎｎｅｔら、２００３；Ｅｓｐｌｅｙら、２００７；Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎら、２０１３）。全ての構築物を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＧＶ３１０１に電気穿孔した。新たに増殖させた培養物を同等の比で混合し、Ｈｅｌｌｅｎｓら、（２００５）に記載されているようにベンサミアナタバコ葉に浸潤させた。７日後、葉を採取し、Ｄｉｏｎｅｘ－ＨＰＬＣ分析用にフェノール化合物を抽出した。
４．２ 結果
トリロバチンおよびフロリジン生産に関する完全なリンゴ経路をベンサミアナタバコで再構成するために、ＭｄＭｙｂ１０および２つの生合成遺伝子ＭｄＤＢＲおよびＭｄＣＨＳを一緒に一過性発現させて、グリコシル化のためのフロレチン基質の合成を触媒させた。ＭｄＭｙｂ１０転写因子は、フェニルプロパノイド経路を通じた基質フラックスを増加させるのに必要であった。ＭｄＭｙｂ１０、ＭｄＤＢＲ、ＭｄＣＨＳおよびＰＧＴ２が浸潤した葉をＤｉｏｎｅｘ－ＨＰＬＣによって分析し、トリロバチン標準物に対応する３２分でのピークを示したが（図１０Ａ、Ｂ）、ＰＧＴ１が浸潤した葉はフロリジンに対応する２７．２分でのピークを示した（図１０Ｃ、Ｄ）。ＧＵＳ対照ベクターを接種した葉では、フロリジンもトリロバチンも検出されなかった（図１０Ｅ）。これらの結果は、生物工学的応用に関して、３つの生合成遺伝子および転写因子が、タバコ（およびおそらく任意の他の植物）においてトリロバチンおよびフロリジン生産までの経路を再構成するのに十分であることを示すものである。
４．３ 考察
この例で本発明者らは、植物の４’－ｏＧＴ活性およびトリロバチン含量がＰＧＴ２の発現によって増加され得ることを示している。
トリロバチン生産に関する４’－ｏＧＴを同定し、タバコにおけるトリロバチンおよびフロリジン生産までのリンゴ経路を再構成することは、酵母でのバイオファーミングおよび代謝工学などの生物工学的手段を介して、高レベルのトリロバチンを生産可能にすることができる。このアプローチの効用は、酵母でＰＧＴ１について既に実証されている（Ｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒら、２０１７）が、植物体ではまだ実証されていない。大量のトリロバチンを生産する能力により、食品および飲料産業ではトリロバチンを天然の甘味料としてテストできるようになるが、潜在的な健康上の利益についてもテストできるようになるであろう（Ｆａｎら、２０１５；Ｘｉａｏら、２０１７）。
５． 実施例５－リンゴにおけるＰＧＴ２の過剰発現および官能評価
５．１ 材料および方法
５．１．１ トランスジェニックリンゴ植物の生成
ＰＧＴ２のコード領域をマルス・トリンゴイデスから以下のプライマーを使用して増幅し、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ｗｗｗ．ｖａｚｙｍｅ．ｃｏｍ）を使用してｐＣＡＭＢＩＡ２３００にクローニングした：
Figure 2023514687000012
ＰＧＴ２：ｐＣＡＭＢＩＡプラスミドを、次いでアグロバクテリウム・ツメファシエンス（株ＧＶ３１０１）細胞に形質転換した。トランスジェニック「ＧＬ３」リンゴ植物を、Ｄａｉら（２０１３）およびＳｕｎら（２０１８）に従ってアグロバクテリウム媒介形質転換によって生成した。トランスジェニック「ロイヤルガラ」植物はｐＨＥＸ２－ＰＧＴ２で形質転換し、Ｙａｏら（１９９５、２０１３）によって記載されているように植物を再生した。
トランスジェニック「ＧＬ３」リンゴ株におけるＰＧＴ２発現レベルおよびジヒドロカルコン含量を、ｑＲＴ－ＰＣＲおよびＨＰＬＣを使用して決定した。１４のトランスジェニック「ＧＬ３」株（＃）におけるＰＧＴ２の相対的発現を、若葉から抽出したＲＮＡを使用してｑＲＴ－ＰＣＲによって決定した。発現をＭｄａｃｔｉｎに対して補正し、野生型（ＷＴ）「ＧＬ３」対照（１に設定された値）と比べて示す。プライマーおよび産物サイズを表２に示す。フェノール化合物を若葉から、５０％メタノールおよび２％ギ酸を含有する溶液に抽出し、個々のＤＨＣ含量をＨＰＬＣによって決定した。
５．１．２ 官能パネル分析
野生型および２つのＰＧＴ２トランスジェニック「ＧＬ３」株由来のリンゴ葉を水で洗浄し、室温で乾燥させた。葉を２００℃で１分間保持して酵素を不活性化し、次いでオーブンで８０℃、６０分間乾燥させた。乾燥葉５ｇを葉：水の比１：１００（ｇ：ｍｌ）で使用してリンゴ葉茶を作製した。約８０℃の水を１５分間葉に添加し、次いで全ての葉を取り除いてさらなる抽出を停止した。次いで官能分析のために茶を水槽に５０℃で維持した。官能パネルは２３名からなり、女性１４名および男性９名（全て２０～３０歳）を含めた。参加は自由意志であり、全ての参加者が試験に参加する前に書面による同意を提出した。３点比較法のために、参加者に３つのトレーを与えた。各トレーには３つのカップがあり（各カップに茶２ｍｌ）、カップにはトランスジェニックおよび野生型の葉茶が、２杯のトランスジェニックおよび１杯の野生型、または２杯の野生型および１杯のトランスジェニックのどちらかのランダムデザインで入っていた。参加者に各トレーの３つの試料を連続して試飲し、どの試料が異なるかを選択するよう依頼した。野生型ｖｓトランスジェニックリンゴ葉茶の相対的な甘味を評価するために、２つの試料（１つはトランスジェニックおよび１つは野生型）を提示し、２３名のパネリストに２つの試料を１～１０のアンカリングなしの甘味尺度（ｕｎａｎｃｈｏｒｅｄ ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ ｓｃａｌｅ）で採点するよう依頼した。全ての試飲テストに関して、参加者は試料を１～２秒間口に入れたままにし、次いで廃棄容器に吐き出した。参加者は試料と試料の間に口を水でゆすぎ、各試料セットの合間に乾燥ビスケットが提供された。
３点比較法でトリロバチンに高い鋭敏さを有した参加者５名を選択して、トリロバチンとスクロースの間で等甘味度比較テスト行った。各参加者に、１つのトリロバチン溶液および８つのスクロース溶液を異なる試飲濃度で与えた。溶液は、リンゴ葉茶について上に記載したように調製した。トリロバチン溶液は１００ｍｌあたり１２．３、１８．５、２７．８および４１．７ｍｇで提供し、一方スクロース溶液は１００ｍｌあたり２９６．３、４４４．４、５９２．６、６６６．７、８８８．９、１０００、１３３３．３および２０００ｍｇで提供した。
５．２ 結果
５．２．１ リンゴにおける過剰発現
ＰＧＴ２は、２つのリンゴ背景「ＧＬ３」および「ロイヤルガラ」で過剰発現された。１４のトランスジェニック「ＧＬ３」株が得られ、ＰＧＴ２発現は、８つの株（＃１、４、５、６、７、９、１１、１４）からの４週齢の植物の葉で野生型と比べて有意に増加した（図１１Ａ）。トリロバチンのレベルは、同じ８つの株＋株＃１０で野生型と比べて有意に増加し、レベルは５．４～１１．０ｍｇ・ｇ－１ ＦＷに及んだ（図１１Ｂ）。「ＧＬ３」トランスジェニック株の間では、フロリジン、フロレチン（図１１Ｂ）またはトリロバチンおよびフロリジンの全含量（図１２Ａ）に有意差は観察されなかった。ＰＧＴ２を過剰発現する１１のトランスジェニック「ロイヤルガラ」株も再生し、野生型と比べて増加したレベルのトリロバチンを含有することが示され、レベルは３～１１ｍｇ・ｇ－１ ＦＷにおよび（図１３Ａ）、トリロバチンおよびフロリジンの全含量は類似していた（図１３Ｂ）。
ＰＧＴ１、ＭｄＣＨＳおよびＰＧＴ３の相対的発現も、「ＧＬ３」トランスジェニックＰＧＴ２過剰発現株でｑＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ＰＧＴ１（図１２Ｂ）およびＭｄＣＨＳ（図１２Ｃ）の発現レベルは、１４のトランスジェニックリンゴ株で有意に変化しなかった。興味深いことに、全ての１３／１４トランスジェニック「ＧＬ３」株でＰＧＴ３の相対的発現は有意に減少した（図１２Ｄ）。最も低いレベルでＰＧＴ２およびトリロバチンを発現する株で最も強い抑制が観察された。これは、導入されたＰＧＴ２導入遺伝子による内因性ＰＧＴ３遺伝子の同時抑制を示唆するものである。
５．２．２ ＰＧＴ２トランスジェニック植物由来のリンゴ葉茶の官能評価
官能分析を使用して、リンゴ葉茶の味覚に対するＰＧＴ２過剰発現の影響を調査した。４月齢の野生型「ＧＬ３」植物および２つのトランスジェニック株（＃１、９）から葉を採取した。乾燥後、野生型およびトランスジェニック葉のフロリジン含量は類似していた（約１５０ｍｇ・ｇ－１ ＤＷ）。トランスジェニック株はトリロバチン（約１００ｍｇ・ｇ－１ ＤＷ）も含有していたが、野生型は含有していなかった（図１４Ａ）。浸した後、フロリジンの約２７％およびトリロバチンの１６％が茶の中に抽出された（図１４Ａ）。
３点比較法では、パネリストは、野生型から生産された茶と比べてトランスジェニックＰＧＴ２葉から生産された茶の風味を明らかに区別することができた（ｐ＜０．０１、観察数ｎ＝７０）。この識別の根拠を決定するために、パネリストに次いで各試料の甘味をアンカリングなしの甘味尺度（１～１０）で評価するように依頼した。３．２に評価された野生型と比べて、２つのトランスジェニック株の平均甘味は、それぞれ４．８および４．６に有意に（ｐ＜０．０５、ｎ＝２３）高く評価された。
クラブアップルの交配種「アダムス」の葉から精製されたトリロバチンとスクロースの間の等甘味度比較テストは、トリロバチンがスクロースより約３５倍甘いことを示した（図１４Ｂ）。この数字は以前に報告された数字（Ｊｉａら、２００８）よりやや低く、テストしたトリロバチンの純度、送達系、またはスクロースまたはトリロバチンに対するパネリストの感受性のばらつきに関係している可能性がある。
５．３ 考察
ＰＧＴ２を過剰発現するトランスジェニック植物から作られたリンゴ葉茶の官能分析は、それらが野生型リンゴ葉から作られた茶と明白に区別され得ることを実証した。茶に抽出されたトリロバチンのレベル（図１４Ａ、約１５０ｍｇ・Ｌ－１）は、トリロバチンについて報告されている甘味検出閾値（３～２００ｍｇ・Ｌ－１；Ｊｉａら、２００８）を上回る。トランスジェニック葉茶で甘味の増加を感じることはトリロバチンの生産の増加と一致しており、苦味のあるフロリジンのレベルの減少とは一致しない。
トランスジェニック植物の葉におけるトリロバチンおよびフロリジン両方の生産は、葉で利用可能なフロレチン基質のプールを巡ってＰＧＴ２はＰＧＴ１とかなり競合していること、およびＰＧＴ２は 、果実で生産されるフロレチンの小さめのプールを巡ってもＰＧＴ１と競合しているはずであることを示す。トランスジェニック「ロイヤルガラ」植物が熟すとき、果実中にＰＧＴ２過剰発現を有するトランスジェニック植物由来のリンゴ果実の官能分析により、該果実が野生型植物由来のリンゴ果実と区別され得ることも実証されるはずであると予想される。
本発明の好ましい態様は例としてのみ記載されており、本発明の範囲から逸脱することなくこれに変更を行うことができる。
６． 実施例６－大腸菌におけるトリロバチンの生産
６．１ 材料および方法
６．１．１ クローニング
マルス・トリンゴイデス由来のＰＧＴ２－２のコード配列（配列番号１１；ＮＣＢＩアクセッション番号ＭＮ３８１０００；Ｗａｎｇら、２０２０）をＧｅｎｅＡｒｔで大腸菌用にコドン最適化し、ＴＷＩＳＴ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｗｉｓｔｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／）によって合成した。ＰＧＴ２－２コード配列を、ＥｃｏＲＶおよびＫｐｎＩ制限部位を使用した制限／ライゲーションクローニングによってｐＣＤＦＤｕｅｔ（商標）－１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）にクローニングした。
トリロバチン生産経路の他の成分（図１５）を、表９に示されているように同じ方法を使用して同時発現プラスミドにクローニングした。
Figure 2023514687000013
６．１．２ 発現
ＢＬ２１（ＤＥ３）エレクトロコンピテント大腸菌細胞を、二重結合還元酵素を除くトリロバチン代謝経路の全てをもたらすプラスミド１および２、ならびに二重結合還元酵素をもたらすプラスミド３または４のどちらか（表９および図１５）で同時形質転換した。対照株も得られた－二重結合還元酵素を欠くＣ－１’；二重結合還元酵素およびＰＧＴ２を欠くＣ－２；ならびに二重結合還元酵素、ＰＧＴ２、およびＣＨＳ２を欠くＣ－３。
細菌株を、ＬＢ（１％ｗ／ｖトリプトン、０．５％ｗ／ｖ酵母エキス、１％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）でＯＤ６００＝０．７まで３７℃、１８０ｒｐｍで増殖させた。次いで、１ｍＭイソプロピル－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して遺伝子発現およびタンパク質蓄積を誘導し、培養物を２８℃、１００ｒｐｍで１６時間増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、１ｍＭ ＩＰＴＧおよび２５０μＭ Ｌ－チロシンを補充した同じ容量（２０ｍＬ）のテリフィックブロス（１．２％ｗ／ｖトリプトン、２．４％ｗ／ｖ酵母エキス、０．４％ｖ／ｖグリセリン、０．１７Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．７２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４）に再懸濁した。Ｌ－チロシンの供給は２８℃、１００ｒｐｍで４時間、代謝産物抽出まで実施した。
６．１．３ 代謝産物抽出および分析
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物（１ｍＬ）を、１分間混合して等量の酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で抽出し、その後１６，０００ｇで２分間遠心分離した。ＥｔＯＡｃ相を除去し、残りの下にある水相を前と同じように再抽出した。上清を回収し、酢酸エチルを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓ（商標）で陰圧下、３０℃で１時間３０分、インキュベーションによって蒸発させた。ペレットを２００μＬ ８０％ｖ／ｖ メタノールに再懸濁し、４℃で保管した。
代謝産物解析は、以前に報告されているように（Ｖｒｈｏｖｓｅｋら、２０１２）ＵＨＰＬＣ／ＱｑＱ－ＭＳ／ＭＳシステムで実施した。２μＬを注入し、真正標準品を用いた検量線によって濃度を算出した。試料は三重に解析した。
６．２ 結果
２つの異なる二重結合還元酵素、ＥＲＥＤおよびＴＳＣ１３を、大腸菌におけるトリロバチン生産経路の一部として機能するそれらの能力についてテストした。
ＴＡＬ、４ＣＬ、ＣＨＳ２、ＥＲＥＤ、およびＰＧＴ２の大腸菌での同時発現は、トリロバチンの生産をもたらした（表１０；図１６）。ＥＲＥＤに代わる二重結合還元酵素としての出芽酵母ＴＳＣ１３の使用は、検出可能なトリロバチン生産を全くもたらさなかった。
二重結合還元酵素を欠いた対照実験は、検出可能なトリロバチンを全く生産しなかった（表１０および図１６のＣ－１’）。二重結合還元酵素およびＰＧＴ２を欠いた対照、または二重結合還元酵素、ＰＧＴ２、およびＣＨＳ２を欠いた対照も検出可能なトリロバチンを全く生産しなかった（それぞれ、表１０および図１６のＣ－２およびＣ－３）。
Figure 2023514687000014
６．３ 考察
この実施例では、本発明者らは、トリロバチン生産経路に関与する遺伝子を大腸菌で発現できること、および培養で増殖させた大腸菌によってトリロバチンを生産できることを示している。
７． 実施例７－出芽酵母におけるトリロバチンの生産
７．１ 材料および方法
７．１．１ クローニング
マルス・トリンゴイデス由来のＰＧＴ２－２のコード配列（配列番号１１；ＮＣＢＩアクセッション番号ＭＮ３８１０００；Ｗａｎｇら、２０２０）をＧｅｎｅＡｒｔで出芽酵母用にコドン最適化し、ＴＷＩＳＴ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｗｉｓｔｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／）によって合成した。ＰＧＴ２－２コード配列を、Ｓａ／ＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用した制限／ライゲーションクローニングによってｐＡＴ４２５（Ｉｓｈｉｉら、２０１４）にクローニングした。
ライゲートしたプラスミドを大腸菌ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、実施例６セクション ６．１．１に記載されているように配列決定した。
７．１．２ 発現
ＨａＣＨＳ（コボウズオトギリ；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９ＦＵＢ７．１）、ＳｃＴＳＣ１３（出芽酵母；ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００１１８００７４．１）、Ａｔ４ＣＬ２（シロイヌナズナ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿１８８７６１．１）、ＡｔＰＡＬ２（シロイヌナズナ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿１９０８９４）、ＡｍＣ４Ｈ（ドクセリモドキ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡ０６２９０４．１）およびＳｃＣＰＲ１（出芽酵母；ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿０１１９０８）を有する、フロレチンを生産する出芽酵母のウラシル栄養要求株に、ＰＧＴ２－２含有ベクターまたはＧｉｅｔｚおよびＳｃｈｉｅｓｔｌ（２００７）による空ベクターを形質転換し、ウラシルおよびロイシンを含まない合成ドロップアウト（ＳＤ）培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）（ＳＤ－Ｕ－Ｌ）に播種し、３０℃で３日間インキュベートした。次いで、単一の形質転換体コロニーを５ｍＬ ＳＤ－Ｕ－Ｌで一晩、３０℃、２００ｒｐｍで増殖させ、５０ｍＬ ＳＤ－Ｕ－Ｌを接種するのに使用した。酵母培養物は、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間および７２時間増殖させた。
７．１．３ 代謝産物解析
代謝産物解析は、実施例６、セクション６．１．３に記載されているように行った。
７．２ 結果
出芽酵母によるトリロバチンの生産を、４８時間および７２時間時点で決定した。トリロバチン生産はＰＧＴ２－２発現株に関して両時点で検出可能であり、フロレチン株対照に関して生産は検出されなかった（表１１および図１７）。
Figure 2023514687000015
７．３ 考察
この実施例では、本発明者らは、トリロバチン生産経路に関与する遺伝子が出芽酵母で発現され得ること、およびトリロバチンは、培養で増殖させると出芽酵母によって生産され得ることを示している。
Figure 2023514687000016
Figure 2023514687000017
配列表：
＞配列１［生物＝マルス・トリンゴイデス］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＰＧＴ２－１）、ポリペプチド
Figure 2023514687000018
＞配列２［生物＝マルス・トリンゴイデス］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＰＧＴ２－２）、ポリペプチド
Figure 2023514687000019
＞配列３［生物＝マルス・シーボルディ］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＭｓＰＧＴ２－１）、ポリペプチド
Figure 2023514687000020
＞配列４［生物＝リンゴ属］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＡｄａｍｓＰＧＴ２－１）、ポリペプチド
Figure 2023514687000021
＞配列５［生物＝マルス・ドメスティカ］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＭｄＰＧＴ２－１）、ポリペプチド
Figure 2023514687000022
＞配列６［生物＝カエデバコリンゴ］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｂＰＧＴ２－１）、ポリペプチド
Figure 2023514687000023
＞配列７［生物＝カエデバコリンゴ］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｂＰＧＴ２－２）、ポリペプチド
Figure 2023514687000024
＞配列８［生物＝リンゴ属］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（Ａｏｔｅａ ＰＧＴ２－１）、ポリペプチド
Figure 2023514687000025
＞配列９［生物＝マルス・ドメスティカ］ Ｃａｚｙｍｅ ＩＤ：ＭＤＰ００００８３６０４３。ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ８８Ａ１、ポリペプチド
Figure 2023514687000026
＞配列１０［生物＝マルス・トリンゴイデス］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＰＧＴ２－１）、完全コード配列
Figure 2023514687000027
＞配列１１［生物＝マルス・トリンゴイデス］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＰＧＴ２－２）、完全コード配列
Figure 2023514687000028
＞配列１２［生物＝マルス・シーボルディ］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＭｓＰＧＴ２－１）、完全コード配列
Figure 2023514687000029
＞配列１３［生物＝リンゴ属］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＡｄａｍｓＰＧＴ２－１）、完全コード配列
Figure 2023514687000030
＞配列１４［生物＝マルス・ドメスティカ］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＭｄＰＧＴ２－１）、完全コード配列
Figure 2023514687000031
＞配列１５［生物＝カエデバコリンゴ］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｂＰＧＴ２－１）、完全コード配列
Figure 2023514687000032
＞配列１６［生物＝カエデバコリンゴ］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｂＰＧＴ２－２）、完全コード配列
Figure 2023514687000033
＞配列１７［生物＝リンゴ属］フロレチン４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＡｏｔｅａＰＧＴ２－１）、完全コード配列
Figure 2023514687000034
＞配列１８［生物＝マルス・ドメスティカ］ Ｃａｚｙｍｅ ＩＤ：ＭＤＰ００００８３６０４３。ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ８８Ａ１、完全コード配列
Figure 2023514687000035
（参考文献）
Figure 2023514687000036
Figure 2023514687000037
Figure 2023514687000038
Figure 2023514687000039

Claims (41)

  1. トリロバチン含量が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドによる植物細胞の形質転換を含む方法。
  2. ４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドによる植物細胞の形質転換を含む方法。
  3. 前記変異体が４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記変異体が、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１の配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記植物細胞または植物が、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、またはカルコン合成酵素（ＣＨＳ）および二重結合還元酵素（ＤＢＲ）をコードするポリヌクレオチドによっても形質転換される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. トリロバチン含量が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列、またはその変異体を含むポリヌクレオチドによる植物細胞の形質転換を含む方法。
  9. ４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列、またはその変異体を含むポリヌクレオチドによる植物細胞の形質転換を含む方法。
  10. 前記変異体が、４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項８または９に記載の方法。
  11. 前記変異体が、配列番号１０～１８のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記変異体が、配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記ポリヌクレオチドが配列番号１０の配列を含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記植物細胞または植物が、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、またはカルコン合成酵素（ＣＨＳ）および二重結合還元酵素（ＤＢＲ）をコードするポリヌクレオチドによっても形質転換される、請求項８～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. トリロバチン含量が増加した、または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、前記植物細胞または植物において、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドの変異体の発現を上方制御するステップを含む方法。
  16. トリロバチン含量が増加した、または４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が増加した植物細胞または植物を生産する方法であって、前記植物細胞または植物において、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列、またはその変異体を含むポリヌクレオチドの発現を上方制御するステップを含む方法。
  17. 前記上方制御するステップが、遺伝子操作を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 前記上方制御するステップが、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する植物との交配を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
  19. 前記上方制御するステップが、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現する植物との交配を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
  20. 前記植物細胞または植物が、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、もしくはカルコン合成酵素（ＣＨＳ）および二重結合還元酵素（ＤＢＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む、またはカルコン合成酵素（ＣＨＳ）、もしくはカルコン合成酵素（ＣＨＳ）および二重結合還元酵素（ＤＢＲ）をコードするポリヌクレオチドによっても形質転換される、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
  22. 配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列またはその変異体を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
  23. 前記遺伝子構築物が、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）および／または二重結合還元酵素（ＤＢＲ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２１または２２に記載の遺伝子構築物。
  24. 請求項２１～２３のいずれか１項に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞。
  25. 配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドを発現するように遺伝子修飾された宿主細胞。
  26. 配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列またはその変異体を含むポリヌクレオチドを発現するように遺伝子修飾された宿主細胞。
  27. 前記宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞もしくは酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  28. トリロバチンの生合成の方法であって、前記宿主細胞に供給され得る、または前記宿主細胞に天然に存在し得るフロレチンの存在下で４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼを発現することができる、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
  29. トリロバチンを生産する方法であって、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の宿主細胞からトリロバチンを抽出するステップを含む方法。
  30. 配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドを発現するように遺伝子修飾された植物細胞。
  31. 配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列またはその変異体を含むポリヌクレオチドを発現するように遺伝子修飾された植物細胞。
  32. 請求項３０または３１に記載の植物細胞を含む植物。
  33. ４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が変化した植物を選択する方法であって、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドの発現変化について植物をテストするステップを含む方法。
  34. ４’－Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ活性が変化した植物を選択する方法であって、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列またはその変異体を含むポリヌクレオチドの発現変化について植物をテストするステップを含む方法。
  35. トリロバチン含量が変化した植物を選択する方法であって、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドの発現変化について植物をテストするステップを含む方法。
  36. トリロバチン含量が変化した植物を選択する方法であって、配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列またはその変異体を含むポリヌクレオチドの発現変化について植物をテストするステップを含む方法。
  37. 請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法によって生産される植物細胞または植物。
  38. 請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法によって選択される植物細胞または植物。
  39. 請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法によって生産される植物の群または集団。
  40. トリロバチンを生産する方法であって、請求項３０、３１、３２、３７または３８のいずれか１項に記載の植物細胞または植物からトリロバチンを抽出するステップを含む方法。
  41. トリロバチンを生産する方法であって、ＵＤＰ－グルコースおよび、配列番号１～９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは前記ポリペプチドの変異体、または配列番号１０～１８のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列もしくはその変異体を含むポリヌクレオチドをコードする発現構築物の発現産物とフロレチンを接触させて、トリロバチンを得るステップを含む方法。
JP2022549606A 2020-02-19 2021-02-19 グリコシルトランスフェラーゼ、これらをコードするポリヌクレオチドおよび使用方法 Pending JP2023514687A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NZ76187720 2020-02-19
NZ761877 2020-02-19
PCT/IB2021/051407 WO2021165890A1 (en) 2020-02-19 2021-02-19 Glycosyltransferases, polynucleotides encoding these and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023514687A true JP2023514687A (ja) 2023-04-07
JPWO2021165890A5 JPWO2021165890A5 (ja) 2024-02-28

Family

ID=77391488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022549606A Pending JP2023514687A (ja) 2020-02-19 2021-02-19 グリコシルトランスフェラーゼ、これらをコードするポリヌクレオチドおよび使用方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230114811A1 (ja)
EP (1) EP4107260A4 (ja)
JP (1) JP2023514687A (ja)
CN (1) CN115485377A (ja)
AU (1) AU2021223171A1 (ja)
CA (1) CA3171655A1 (ja)
MX (1) MX2022010284A (ja)
WO (1) WO2021165890A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115341047B (zh) * 2021-10-26 2023-03-21 西北农林科技大学 一种与苹果属植物三叶苷有无性状相关的分子标记及应用
CN117417921A (zh) * 2023-10-19 2024-01-19 西北农林科技大学 蛋白酶在水解制备根皮素及植物抗虫中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ564691A (en) * 2007-12-21 2010-03-26 Nz Inst Plant & Food Res Ltd Glycosyltransferases, polynucleotides encoding these and methods of use
US10767187B2 (en) * 2016-03-09 2020-09-08 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Identification and characterization of UDP-glucose:phloretin 4′-O-glucosyl transferase from Malus x domestica Borkh

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022010284A (es) 2022-10-20
AU2021223171A1 (en) 2022-09-08
EP4107260A4 (en) 2024-03-27
US20230114811A1 (en) 2023-04-13
WO2021165890A1 (en) 2021-08-26
CA3171655A1 (en) 2021-08-26
CN115485377A (zh) 2022-12-16
EP4107260A1 (en) 2022-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2580429C (en) Compositions and methods for producing steviol and steviol glycosides
CN104769121B (zh) 香草醛合酶
US9648813B2 (en) Regulation of gene expression via uORF of GDP-L-galactose phosphorylase (GGP) gene
CA2889985C (en) Improved acyltransferase polynucleotides, polypeptides, and methods of use
US8859848B2 (en) Phloretin glycosyltransferases, polynucleotides encoding these and methods of use
AU2008221696B2 (en) Transferases, epimerases, polynucleotides encoding these and uses thereof
WO2013058655A1 (en) Methods and compositions for producing drimenol
JP2023514687A (ja) グリコシルトランスフェラーゼ、これらをコードするポリヌクレオチドおよび使用方法
MX2015005260A (es) Polinucleotidos, polipeptidos y metodos de uso mejorados de aciltransferasa.
US9957519B2 (en) Acyltransferase polynucleotides, polypeptides and methods of use
WO2016016826A1 (en) Methods and materials for manipulating phloridzin production
US20160108416A1 (en) Atsp1, an e3 ubiquitin ligase, and its use
JP2013141421A (ja) 芳香族アミノ酸含量の増大した植物およびその作製方法
WO2006011815A2 (en) Phosphatases, polynucleotides encoding these and uses thereof
NZ553705A (en) Transferases, polynucleotides encoding these and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240219

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240219