KR100965984B1 - 4ｃｌ 유전자 및 ｓｈｔ 유전자를 포함하는 재조합 벡터,그에 의해 형질전환된 세균 및 이를 이용한페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법 - Google Patents

4ｃｌ 유전자 및 ｓｈｔ 유전자를 포함하는 재조합 벡터,그에 의해 형질전환된 세균 및 이를 이용한페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 4CL 유전자 및 SHT 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 세균을 형질전환하고, 상기 형질전환된 세균으로부터 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히 상기 형질전환된 세균을 이용한 본 발명의 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법은 아주 간단하게 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 대량 생산할 수 있는 방법이며, 아울러 상기 본 발명의 형질전환된 세균은 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 배양액으로 분비하므로 형질전환체를 파쇄하지 않아도 되어 재활용이 가능하여 아주 경제적이다. 뿐만 아니라 상기 본 발명에 의하여 제조된 페닐프로파노이드 아미드계 화합물은 세균의 배양액 속에 다량 분포하여 용이하게 분리 및 정제될 수 있으므로, 본 발명의 생산방법은 비용 및 공정 면에서 매우 유리하다.
SHT, 4CL, 페닐프로파노이드, 아미드

Description

4ＣＬ 유전자 및 ＳＨＴ 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 그에 의해 형질전환된 세균 및 이를 이용한 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법{Recombinant vector containing 4CL gene and SHT gene, microorganism transformed thereof and method for producing phenylpropanoid amide-based compounds using the same}
본 발명은 4CL 유전자 및 SHT 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 세균을 형질전환하고, 상기 형질전환된 세균으로부터 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase; SHT) 유전자 및 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제(4-Coumarate-CoA ligase; 4CL) 유전자를 순차적으로 도입하여, 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세균에 관한 것이며, 또한 상기 재조합된 세균에 페놀 기질 및 아민 기질을 투여하여 세균을 배양하고 배양된 세균으로부터 생산된 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 분리 및 정제하여 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
페닐프로파노이드 아미드계 화합물은 다양한 약리적 효과를 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 구체적으로 홍화씨 깻묵에서 추출한 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 일종인 쿠마로일세로토닌 및 페루로일세로토닌은 항산화활성(Kawashima et al., J. Interferron & Cytokine Res. 18, 423-428, 1998), 항암활성(Zhang et al., Chemical & Pharma. Bull. 44, 874-876, 1996)이 있는 것으로 보고되고 있고, 뼈 형성 촉진(특허등록번호 제10-0354791호)에도 관련되어 있는 것으로 알려져 있으며 특히 최근에는 탁월한 미백효과가 있는 것으로도 보고되고 있다(Roh et al., Biol. Pharm. Bull. 27, 1976-1978, 2004). 한편 다른 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 일종인 페루로일티라민 및 카페오일티라민 화합물도 항암활성이 있는 것으로 알려져 있으며(Park et al., Cancer Let. 202, 161-171, 2003), 특히 상기 페루로일티라민의 경우는 미백활성이 있는 것으로도 보고되고 있다(Efdi et al., Biol. Pharm. Bull. 30, 1972-1974, 2007).
상기 페닐프로파노이드 아미드계 화합물은 페놀 화합물(phenolic compounds)과 아민류(amines) 화합물의 중합체로써, 대표적으로 페루로일세로토닌(feruloylserotonin), 쿠마로일세로토닌(coumaroylserotonin), 카페오일세로토닌(caffeoylserotonin), 시나포일세로토닌(sinapoylserotonin), 페루로일티라민(feruloyltyramine), 페루로일옥토파민(feruloyloctopamine), 쿠마로일티라민(coumaroyltyramine) 및 쿠마로일옥토파민(coumaroyloctopamine)등이 있다.
한편 상기 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생합성하는데 사용되는 아민 류는 티라민(tyramine), 세로토닌(serotonin), 도파민(dopamine), 펜에틸아민(phenethylamine), 노르아드레날린(noradrenaline) 및 옥토파민(octopamine) 등이 있으며, 페놀 화합물로는 페루로일코에이(feruloyl-CoA), 신나모일코에이(cinnamoyl-CoA), 쿠마로일코에이(4-coumaroyl-CoA), 사나포일코에이(sinapoyl-CoA) 및 카페오일코에이(caffeoyl-CoA) 등이 있다.
상기와 같이 약리적 효과가 우수한 페닐프로파노이드 아미드계 화합물은 식물체에서 미량으로만 존재한다. 예를 들어 홍화씨에서는 그램 종자 당 20㎍ 정도의 페루로일세로토닌이 존재하며(Baek et al., J. Korean. Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 42, 366-368, 1999), 병원균에 감염된 대나무 가지에서 그램 무게 당 3~10㎍의 페루로일세로토닌 및 쿠마로일세로토닌이 존재하는 것으로 알려져 있다(Tanaka et al., Phytochemistry, 64, 965-969, 2003). 또한 고추의 꽃에서 7㎍의 쿠마로일세로토닌, 95㎍의 쿠마로일티라민, 및 21㎍의 페루로일티라민이 존재하는 것으로 보고되고 있다(Kang et al., Sci. Hortic. 26, 2009-2015, 2007). 또한 감자 및 옥수수에서도 미량의 페닐프로파노이드 아미드계 화합물 등이 발견되었다(Schmidt et al., J. Biol. Chem. 274, 4273-4280, 1999; Ishihara et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 1025-1031, 2000). 그러나 상기와 같이 페닐프로파노이드 아미드계 화합물은 식물체에서 미량으로만 존재하므로, 상기 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 식물체에서 추출하여 생산하는 방법은 경제적이지 못하므로, 이를 인공적으로 대량 생산하는 방법에 대한 개발이 절실한 상황이다.
한편, 유전자조작 기술이 발전하면서 박테리아 및 여러 동식물들을 이용한 목적 단백질 및 화합물의 대량생산 연구도 많이 이뤄지고 있다. 현재까지 대장균은 여러 유용 단백질 및 화합물을 대량 생산하는데 가장 널리 이용되고 있는 숙주 세포이며, 이에 관한 연구도 가장 많이 이뤄지고 있다(Hodgson, Bio/Technology, 11:887, 1993; Lee, Trends Biotechnol., 14:98, 1996). 그러나 상기 대장균을 이용한 목적 단백질 및 화합물의 대량 생산 방법은, 목적 단백질 및 화합물의 종류에 따라 재조합 벡터를 구현하고 이를 이용하여 형질전환하는 구체적인 생산 방법을 설계하여야 하며, 무엇보다도 비록 상기와 같은 생산 방법을 설계하였다 하더라도 실제 목적 단백질 또는 화합물이 효율적으로 생산될 수 있는지는 당업자가 용이하게 예측할 수 없는 문제점이 있다. 특히 목적단백질이 형질전환된 세균으로부터 바로 생산되지 않거나, 형질전환된 세균으로부터 생산된 단백질이 별도로 추가된 기질과 반응하지 못하여 화합물을 생산할 수 없는 경우 등 다양한 원인으로 인하여 당업자가 실제로 목적단백질 또는 화합물을 수득할 수 있는지 여부를 용이하게 예측할 수는 없다. 상기 다양한 원인으로는 예를 들면, 세포질 내에 존재하는 여러 가지 프로티아제(protease)에 의하여 단백질이 분해되어 생산 수율이 현저히 낮을 수 있으며 또한 단백질이 완전한 접힘(folding)을 이루지 못하고 활성을 잃은 상태의 불용성 응집체(inclusion body)를 형성하는 경우를 들 수 있다. 또는 형질전환된 세균에 기질을 처리하여도 기질이 세균에 의해 분해되거나, 또는 처리한 기질이 세균내로 효과적으로 들어가지 못해 화합물과 단백질간의 효소반응이 불가능하 여 화합물의 생산이 불가능한 경우도 발생 할 수 있기 때문이다.
본 발명자들은 약리적 효과가 우수한 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 식물체에서 생산하고자 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase) 유전자를 벼에 형질전환하여, 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생산하였다. 상기 형질전환 벼에서는 그램 생체중 당 77㎍의 쿠마로일세로토닌과 96㎍의 페루로일세로토닌을 생산하였다(Jang et al., Plant Physiol. 135, 346-356, 2004; 미국특허번호 7084322). 그러나 상기 형질전환 벼에서 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 정제하기 위해 식물체 파쇄, 컬럼정제 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 정제과정을 거쳐야 되고, 수율도 낮아 경제성이 용이 하지 않았다. 이 후 경제적이고 간단하게 생합성하는 방법에 대하여 연구하던 중, 많은 시행착오를 거쳐 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제(4-Coumarate-CoA ligase) 유전자와 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase) 유전자를 가장 효율적으로 발현시킬 수 있는 재조합 벡터를 설계하고, 이를 이용하여 세균을 형질전환한 후, 이에 아민 기질 및 페놀기질을 투여하여 다량의 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제(4-Coumarate-CoA ligase) 유전자와 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase) 유전자가 삽입된 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 세균을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 형질전환된 세균을 이용하여 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase) 유전자 및 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제(4-Coumarate-CoA ligase) 유전자가 순차적으로 연결되고, 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세균을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 상기 형질전환된 세균에 페놀 기질 및 아민 기질을 투여하여 세균을 배양하는 단계 및 (b) 상기 (a) 단계의 배양된 세균으로부터 생산된 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로써, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명에서 용어 "작동 가능하게 연결된다(operably linked)"는 것은 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 발현 조절 서열과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 상기 발현 조절 서열에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 즉, 발현 조절 서열의 조절 하에 폴리뉴클레오티드의 서열이 발현되어 원하는 폴리펩티드가 형성되도록 정확한 해독프레임을 유지시키는 것을 포함한다. 이와 같이 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드와 발현 조절 서열은 프로모터, 전사 종결부위, 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 벡터 내에 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로모터"는 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 개시부위에 인접하는, 유전자의 5' 비-코딩 부위에 위치한다.
본 발명의 재조합 벡터는 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase) 유전자 및 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제(4-Coumarate-CoA ligase) 유전자가 순차적으로 연결되고, 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 한다. 이에 한정되지 않으나 바람직하게는 상기 재조합 벡터는 도 2에 기재된 개열지도를 갖는 벡터일 수 있다.
상기 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제(4-Coumarate-CoA ligase) 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제1(4-Coumarate-CoA ligase1), 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제2(4-Coumarate-CoA ligase2), 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제3(4-Coumarate-CoA ligase3) 및 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제4(4-Coumarate-CoA ligase4)로 이루어진 군에서 선택된 유전자인 것을 특징으로 하며, 가장 바람직하게는 애기장대에서 유래된 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제2(4-Coumarate-CoA ligase2)인 것을 특징으로 한다. 상기 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제(4-Coumarate-CoA ligase)는 다양한 페놀 기질에 코에이 그룹을 붙여 활성형태의 페놀 기질화합물을 합성할 수 있는 활성이 있다.
상기 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase) 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하며, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 고추에서 유래된 것을 특징으로 한다. 상기 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(Serotonin N- hydroxycinnamoyltransferase)는 상기 페놀 기질에 코에이가 결합된 활성형태의 페놀 화합물과 아민 기질을 이용하여 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생합성할 수 있는 활성이 있다.
따라서 상기와 같이 본 발명의 재조합 벡터는 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase) 유전자 및 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제(4-Coumarate-CoA ligase) 유전자가 순차적으로 연결되고, 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있어, 본 발명의 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생합성하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제2(4-Coumarate-CoA ligase2) 유전자를 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행한 후, 그 생성물을 제한효소 NdeI 및 XhoI으로 절단하고, pETDuet-1내의 동일한 제한효소 부위 내로 삽입시켜 pETDuet-4CL2 벡터를 제작하였다. 또한 고추 유래의 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase) 유전자를 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 그 생성물을 제한효소 NcoI 및 NotI으로 절단하고, 상기 제조된 pETDuet-4CL2 벡터에 삽입하여 pETDuet-SHT+4CL2 벡터를 제조하였다(<실시예 1-1> 참조).
본 발명의 형질전환된 세균은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 한다. 상기 세균은 이에 한정되지 않지만 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서 브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)로 이루어진 군에서 선택된 세균일 수 있으며 가장 바람직하게는 대장균일 수 있다.
상기 본 발명의 재조합 벡터를 상기 세균에 도입하는 공지된 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, CaCl2 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 열 쇼크 방법으로 재조합 벡터를 대장균에 도입하는 방법을 이용하였다(<실시예 1-2> 참조)
상술한 방법에 의해 제조된 본 발명의 형질전환 세균은 통상적인 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 통상적인 암피실린(ampicillin)이 함유된 YEP 배지를 사용할 수 있다. 세균의 배양은 통상의 세균 배양 조건상에서 가능하며 예를 들어, 온도범위 15℃ 내지 45℃에서 1시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 분리하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉 동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
본 발명자들은 상기와 같이 제조된 재조합 대장균을 'pETDuet-SHT+4CL2(BL21(DE3))'라 명명하고, 2008년 2월 4일에 한국유전자은행(Korean Collection for Type culture)에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11272BP). 또한 본 발명자들은 본 발명의 재조합 대장균에서 SHT 단백질이 안정적으로 발현되고 있음을 확임함으로써, 상기 SHT 단백질의 활성을 고려하면, 상기 재조합 대장균으로부터 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생산할 수 있음을 알 수 있었다(<실시예 2-1> 참조).
본 발명의 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법은 (a) 상기 형질전환된 세균에 페놀 기질 및 아민 기질을 투여하여 세균을 배양하는 단계 및 (b) 상기 (a) 단계의 배양된 세균으로부터 생산된 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a) 단계의 페놀 기질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 쿠마르산(coumaric acid), 카페익산(caffeic acid), 페루릭산(ferulic acid), 신남산(cinnamic acid) 및 시납산(sinapic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하며, 상기 (a) 단계의 아민 기질은 티라민(tyramine), 트립타민(tryptamine), 세로토닌(serotonin), 도파민(dopamine), 노르아드레날린(noradrenaline) 및 옥토파민(octopamine)으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 한다.
또한 상기 (a) 단계에서 형질전환된 세균에 페놀 기질 및 아민 기질뿐만 아니라, 필요한 경우 발현유도인자를 추가적으로 투여할 수 있다. 상기 발현유도인자는 유전자의 발현을 유도할 수 있는 물질로 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 사용할 수 있다.
또한 상기 (a) 단계에서 페놀 기질 및 아민 기질은 이에 한정되지 않지만 각각 0.5mM~5mM이 투여하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 각각 0.5mM로 투여할 수 있다. 또한 발현유도인자를 투여하는 경우 이에 한정되지 않지만 각각 0.01mM~1mM이 투여하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 각각 0.1mM로 투여할 수 있다.
또한 상기 (a) 단계에서 세균을 배양하기 위한 조건으로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 28~40℃의 조건에서 2~4시간 배양하는 것이 바람직하다.
상기 (a) 단계에서 상기 형질전환된 세균에서 생산된 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제(4-Coumarate-CoA ligase) 효소가 페놀 기질에 코에이 그룹을 붙여 활성형태의 페놀 화합물을 합성하고, 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase) 효소는 상기 활성형태의 페놀 화합물과 아민 기질을 이용하여 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생합성할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 형질전환된 세균에 발현유도인자(IPTG) 0.1mM, 쿠마르산 1mM 및 세로토닌 1mM 농도로 처리하고, 28℃의 조건에서 36시간 배양하였다(<실시예 2-1> 참조). 또한 상기 형질전환된 세균에 발현유도인자(IPTG)를 0.1mM를 투여한 후, 쿠마르산(coumaric acid) 및 세로토닌(serotonin)을 각각 0.5, 1, 1.5, 2 또는 5mM로 처리 한 다음 28℃에서 3시간 동안 배양한 결과, 2mM 기질 농도에서 쿠마로일세로토닌의 생산이 포화상태에 도달함을 알 수 있었다(<실시예 2-2> 참조). 한편 상기 형질전환된 세균에 다양한 페놀 기질 및 아민 기질을 투여한 결과 다양한 페닐프로파노이드 아미드계 화합물이 대량 생산될 수 있음을 알 수 있었다(<실시예 3> 참조).
한편 상기 (b) 단계의 페닐프로파노이드 아미드계 화합물은 쿠마로일세로토닌, 페루로일세로토닌, 카페오일세로토닌, 시나포일세로토닌, 시나모일세로토닌, 쿠마로일옥토파민 및 쿠마로일티라민으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 한다.
상기 (b) 단계에서 상기 배양된 세균으로부터 생산된 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 분리하는 것은 이에 한정되지 않지만 세균 배양액에 유기용매를 투여하여 쉽게 분리할 수 있다. 상기 유기용매로는 이에 한정되지 않지만 에테르, 클로로포름, 및 에틸아세테이트로 이루어진 그룹 중에서 선택하여 사용할 수 있으며 바람직하게는 에틸아세테이트(ethylacetate)를 사용할 수 있다. 또한 필요에 따라 크로마토그래피와 같은 통상적으로 사용되는 정제 방법을 이용하여 상기 용매에 의한 추출액으로부터 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 정제할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 배양된 세균을 원심 분리하여 수득한 균체침전물 또는 배양액에 에틸아세테이트로 투여하여 페닐프로파노이드 아미드계 화합물 을 분리한 후, 고속액체크로마토그라피(HPLC)를 수행하여 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 정량하였다(<실시예 2-2> 참조). 특히 상기 균체침전물 보다는 상기 배양액에서 더 많은 페닐프로파노이드 아미드계 화합물이 분리 및 생산되었다(도 4 참조).
상기 본 발명의 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법은 본 발명의 형질전환된 세균에 페놀 기질 및 아민 기질을 투여함으로써 아주 간단하게 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 대량 생산할 수 있는 방법이며, 특히 상기 본 발명의 형질전환된 세균은 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 배양액으로 분비하므로 형질전환체를 파쇄하지 않아도 되어 재활용 또는 연속배양이 가능하여 아주 경제적이다. 뿐만 아니라 상기 본 발명에 의하여 제조된 페닐프로파노이드 아미드계 화합물은 세균의 배양액 속에 다량 분포하여 용이하게 분리 및 정제될 수 있으므로, 본 발명의 생산방법은 비용 및 공정 면에서 매우 유리하다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 재조합 벡터에 의하여 제조된 본 발명의 형질전환된 세균에 페놀 기질 및 아민 기질을 투여하면 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 대량 생산할 수 있다. 따라서 상기 형질전환된 세균을 이용한 본 발명의 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법은 아주 간단하게 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 대량 생산할 수 있는 방법이며, 특히 상기 본 발명의 형질전환 된 세균은 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 배양액으로 분비하므로 형질전환체를 파쇄하지 않아도 되어 재활용 또는 연속배양이 가능하여 아주 경제적이다. 뿐만 아니라 상기 본 발명에 의하여 제조된 페닐프로파노이드 아미드계 화합물은 세균의 배양액 속에 다량 분포하여 용이하게 분리 및 정제될 수 있으므로, 본 발명의 생산방법은 비용 및 공정 면에서 매우 유리하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
4CL2 및 SHT 유전자 발현용 재조합 대장균의 제조
<1-1> 4CL2 및 SHT 유전자의 클로닝 및 형질전환용 발현 벡터의 제조
4CL(4-Coumarate-CoA ligase) 유전자는 공지된 애기장대에서 유래된 4CL2 (유전자은행번호 AF106086)((Ehlting et al., Plant J. 19, 9-20, 1999) 유전자의 염기서열을 이용하여, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)을 통해 클로닝하였다.
구체적으로 상처가 생긴지 12시간이 지난 애기장대 잎으로부터 TRI 시약을 이용(Molecular Research Center, Inc., 미국)하여 전체 RNA를 추출하였고, 이 전체 RNA를 주형으로 하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 먼저 cDNA를 합성하기 위해 역전사효소(reverse transcriptase) SuperScript II(Invitrogen Inc., 미국)를 이용하였고, 프라이머는 올리고 dT를 사용하였다. 상기 역전사효소 반응 산물을 주형으로 하고, NdeI 제한효소부위(밑줄그음)를 갖는 전방향 프라이머 5'-(atacatatgacgacacaagat)-3'(서열번호 1) 및 XhoI 제한효소부위(밑줄그음)를 갖는 역방향 프라이머 5'-(agactcgagctagttcattaatcc)-3'(서열번호 2)을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 상기 PCR 반응에 의한 4CL2 유전자 생성물(서열번호 5)을 제한효소 NdeI 및 XhoI으로 절단하고, 겔 정제한 후, 벡터 pETDuet-1(Novagen사, 미국)내의 동일한 제한효소 부위 내로 삽입시켜 pETDuet-4CL2 벡터를 제작하였다.
또한 고추 SHT(Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase) 유전자의 전장 cDNA(유전자은행번호 AF329463)(Back et al., Plant Cell Physiol. 42, 475-481, 2001, 서열번호 6)를 주형으로, NcoI 제한효소부위(밑줄그음)를 갖는 전방향 프라이머 5'-(cataccatggcttctgctcct)-3'(서열번호 3) 및 NotI 제한효소부위(밑줄그음)를 갖는 역방향 프라이머 5'-(tatgcggccgcctaacagcttcctgcacc)-3'(서열번호 4)을 사용하여 PCR 반응을 수행였다. 상기 PCR 반응에 의한 생성물을 제한효소 NcoI 및 NotI으로 절단하고, 겔 정제한 후, 상기 제조된 pETDuet-4CL2 벡터내의 동일한 제한효소 부위 내로 삽입시켜 pETDuet-SHT+4CL2 벡터를 제조하였다(도 1 및 2 참조)
<1-2> 4CL2 및 SHT 유전자 발현용 재조합 대장균의 제조
상기 <실시예 1-1>에서 제조된 pETDuet-SHT+4CL2 벡터 1㎍ DNA를 상업적으로 구입 가능한 E.coli BL21(DE3)(Novagen사, 미국) 균주 15㎕와 혼합하여, 얼음에 30분간 두었다가, 42℃에 40초간 열 쇼크를 가하고, 다시 얼음에 1분간 냉각 시킨 후, 60㎕의 SOC 배지(Bacto-trypton 20g, Bacto-yeast extracts 5g, NaCl 0.5 g, 1M KCl 2.5 ml/L)를 첨가한 후 1시간동안 37℃에 배양하였다. 배양 후 상기 균주를 암피실린이 함유된 YEP 고체 배지에서 배양하여 4CL2 및 SHT 유전자 발현용 재조합 대장균을 제조하였다. 상기 제조된 재조합 대장균을 'pETDuet-SHT+4CL2(BL21(DE3))'라 명명하고, 2008년 2월 4일에 한국유전자은행(Korean Collection for Type culture, 대전 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원내 소재)에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11272BP).
<실시예 2>
재조합 대장균을 이용한 쿠마로일세로토닌(coumaroylserotonin)의 생산
<2-1> 재조합 대장균에서 SHT 단백질의 발현 여부 확인
상기 <실시예 1-2>에서 제조된 4CL2 및 SHT 유전자 발현용 재조합 대장균을 통상적인 암피실린(ampicillin) 함유 YEP 배지에서 배양물의 흡광도(O.D.600)가 1.5에 도달 할 때까지 37℃에서 배양한 후, 발현유도인자(IPTG)를 0.1mM, 쿠마르산 1mM 및 세로토닌을 1mM 농도로 처리하고, 28℃의 조건에서 36시간 배양하면서, 시간 별로 상기 대장균 배양액을 원심 분리하여 균체침전물과 배양액으로 구분하였 다.
상기 배양기간 동안 상기 실시예 <1-2>에서 제조된 재조합 대장균에서 SHT 단백질이 발현되는지를 알아보기 위하여, 상기 재조합 대장균의 전체 배양액 5㎕를 전기영동으로 분리한 후(SDS-PAGE), 니트로셀루로즈(nitrocellulose) 막에 블롯팅시키고, SHT 항체로 면역 반응시켰다(Back et al., Plant Cell Physiol. 42, 475-481, 2001). 상기 반응에 의한 밴드를 검출하기 위하여 웨스턴 블롯팅 키트(Boehringer Manheim 사, 독일)를 이용하였으며 상기 실험 결과를 도 3에 기재하였다.
상기 도 3에 기재된 바와 같이, 상기 배양기간 동안 재조합 대장균에서 SHT 단백질이 안정적으로 발현되고 있음을 알 수 있었으며, 상기 SHT 단백질이 아민 기질과 페놀 화합물을 이용하여 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생합성하는 효소인 점을 고려하면, 상기 재조합 대장균으로부터 대표적인 페닐프로파노이드 아미드계 화합물이 생산될 수 있음을 알 수 있었다.
<2-2> 재조합 대장균을 이용한 쿠마로일세로토닌의 생산
상기 <실시예 2-1>에서 제조된 균체침전물 또는 배양액에 함유된 쿠마로일세로토닌(comaroylserotonin)을 정량하기 위하여, 상기 균체침전물을 그램 무게 당 1㎖의 0.1M Tris-HCl 버퍼에 녹이거나 또는 1㎖ 배양액을 각각 등량의 에틸아세테이트로 분획한 후, 에틸아세테이트 분획물을 40℃의 감압농축기에 넣어 용매를 완전히 제거하고, 100㎕의 메탄올에 녹여 고속액체크로마토그라피(HPLC)로 정량하였 다. 상기 고속액체크로마토그라피에서 사용된 컬럼은 Wakosil II 3C18HG(4.6× 150mm)이며, 전개용매로 0.5% TFA가 함유된 35% 메탄올을 사용하였으며 분리된 물질은 320nm에서 측정하여(Jang et al., Plant Physiol. 135, 346-356, 2004), 그 결과를 도 4에 기재하였다.
상기 도 4에 기재된 바와 같이, 상기 배양액에서는 약 200㎎/ℓ, 상기 균체침전물에서는 약 30㎎/ℓ의 쿠마로일세로토닌이 생산되었으며 총 230㎎/ℓ의 쿠마로일세로토닌이 기질 처리 후 3시간 내에 생산되었고, 배양시간 36 시간동안 안정적으로 생산되고 있음을 확인 할 수 있었다. 특히 기질 처리 후 배양시간을 좀 더 세분화해 본 결과, 30분 내에 150㎎/ℓ 정도의 쿠마로일세로토닌이 생산되었고, 2시간 내에 최대치인 230~240㎎/ℓ 에 도달됨을 볼 수 있었다.
따라서 상기 재조합된 대장균은 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 2시간 정도의 짧은 시간 내에 대부분 배양액으로 분비하므로, 배양액으로부터 상기 화합물을 추출한 후, 배양액을 다시 대장균 균체와 혼합하여 재활용 또는 연속배양을 함으로써, 상기화합물을 24시간 내에 12회 정도 연속적으로 추출할 수 있어 매우 용이하게 대량으로 상기 화합물을 수득할 수 있음을 알 수 있다.
<2-3> 재조합 대장균을 이용한 쿠마로일세로토닌의 기질 농도별 생산량 비교
상기 <실시예 2-1>에서 배양된 재조합 대장균(O.D. 600= 1.5)에 발현유도인자(IPTG)를 0.1mM를 투여한 후, 쿠마르산(coumaric acid) 및 세로토닌(serotonin)을 각각 0.5, 1, 1.5, 2 또는 2.5mM로 처리 한 다음 28℃에서 3시간 동안 배양하고 원심 분리하였다. 상기 원심 분리한 후 배양액에 함유된 쿠마로일세로토닌의 함량을 상기 <실시예 2-2>와 동일한 방법으로 정량하고 그 결과를 도 5에 기재하였다.
상기 도 5에 기재된 바와 같이, 쿠마르산 및 세로토닌을 0.5 또는 1mM을 처리한 경우 200mg/ℓ의 쿠마로일세로토닌이 생산되었고, 2 또는 2.5mM 을 처리한 경우 250mg/ℓ의 쿠마로일세로토닌이 생산됨을 확인하였다. 상기 결과로부터, 쿠마르산 및 세로토닌의 농도를 높일수록 쿠마로일세로토닌 생산량이 증대되지만, 기질 농도에 비례해서 지속적으로 쿠마로일세로토닌이 생산량이 증대되는 것은 아니며, 2mM 기질 농도에서 쿠마로일세로토닌의 생산이 포화상태에 도달함을 알 수 있었다. 특히, 0.5mM 및 1mM의 쿠마르산(coumaric acid) 및 세로토닌(serotonin)을 처리 할 경우, 모든 기질이 쿠마로일세로토닌 생산에 이용되기 때문에, 잔존하는 기질이 배양액에 더 이상 존재하지 않는다. 따라서 컬럼정제나 고속액체크로마토그라피(HPLC)정제과정을 거치지 않아도 배양액의 에틸아세테이트 추출만으로도 98-100% 순도의 정제된 쿠마로일세로토닌을 손쉽게 수득 할 수 있다.
< 실시예 3>
재조합 대장균을 이용한 다양한 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산
상기 <실시예 2-1>에서 배양된 재조합 대장균에 발현유도인자(IPTG)를 0.1mM를 투여한 후, 하기와 같은 다양한 페놀 기질 및 아민 기질을 1mM 농도로 처리하여 생성된 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 상기 <실시예 2-2>와 동일한 방법으로 정량하고 그 결과를 도 6에 기재하였다.
상기 도 6에 기재된 바와 같이, 쿠마르산 및 세로토닌을 처리한 경우 200㎎/ℓ의 쿠마로일세로토닌이 생산되었고 페루릭산(ferulic acid) 및 세로토닌을 처리한 경우 페루로일세로토닌이 약 90㎎/ℓ 생산됨을 확인하였다. 또한 쿠마르산과 옥토파민(octopamine)을 처리한 경우 쿠마로일옥토파민이 약 200㎎/ℓ 생산되었고, 쿠마르산과 티라민(tyramine)을 처리한 경우 쿠마로일티라민이 180㎎/ℓ 생산됨을 확인하였다.
상기의 결과로부터 SHT 유전자 및 4CL2 유전자를 대장균에 발현함으로써 다양한 종류의 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
도 1은 4CL 및 SHT 유전자 발현용 재조합 대장균 발현 벡터의 모식도이다(SHT: 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제, 4CL: 4-쿠마레이트 코엔자임A 리가아제).
도 2는 4CL2 및 SHT 유전자 발현용 재조합 대장균 발현 벡터의 개열지도이다(SHT: 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제, 4CL2: 4-쿠마레이트 코엔자임A 리가아제, T7/lac: T7/lac 프로모터, rbs:리보좀 결합부위, T7 ter: T7 종결부위, f1 origin: 복제 개시점, AmpR: 암피실린 저항성 유전자).
도 3은 재조합 대장균에서 SHT 단백질의 발현 여부를 시간별로 확인한 결과를 나타낸 사진이다(SHT: 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제).
도 4는 재조합 대장균을 이용한 쿠마로일세로토닌의 생산정도를 시간별로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다(CS: 쿠마로일세로토닌).
도 5는 재조합 대장균을 이용한 쿠마로일세로토닌의 기질 농도별 생산량을 비교한 그래프이다.
도 6은 재조합 대장균을 이용한 다양한 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산량을 나타낸 그래프이다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Recombinant vector containing 4CL gene and SHT gene, microorganism transformed thereof and method for preparation phenylpropanoid amide-based compounds using the same <130> NP08-0013 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4CL-F <400> 1 atacatatga cgacacaaga t 21 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4CL-R <400> 2 agactcgagc tagttcatta atcc 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SHT-F <400> 3 cataccatgg cttctgctcc t 21 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SHT-R <400> 4 tatgcggccg cctaacagct tcctgcacc 29 <210> 5 <211> 1671 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 5 atgacgacac aagatgtgat agtcaatgat cagaatgatc agaaacagtg tagtaatgac 60 gtcattttcc gatcgagatt gcctgatata tacatcccta accacctccc actccacgac 120 tacatcttcg aaaatatctc agagttcgcc gctaagccat gcttgatcaa cggtcccacc 180 ggcgaagtat acacctacgc cgatgtccac gtaacatctc ggaaactcgc cgccggtctt 240 cataacctcg gcgtgaagca acacgacgtt gtaatgatcc tcctcccgaa ctctcctgaa 300 gtagtcctca ctttccttgc cgcctccttc atcggcgcaa tcaccacctc cgcgaacccg 360 ttcttcactc cggcggagat ttctaaacaa gccaaagcct ccgcggcgaa actcatcgtc 420 actcaatccc gttacgtcga taaaatcaag aacctccaaa acgacggcgt tttgatcgtc 480 accaccgact ccgacgccat ccccgaaaac tgcctccgtt tctccgagtt aactcagtcc 540 gaagaaccac gagtggactc aataccggag aagatttcgc cagaagacgt cgtggcgctt 600 cctttctcat ccggcacgac gggtctcccc aaaggagtga tgctaacaca caaaggtcta 660 gtcacgagcg tggcgcagca agtcgacggc gagaatccga atctttactt caacagagac 720 gacgtgatcc tctgtgtctg gcctatgttc catatatacg ctctcaactc catcatgctc 780 tgtagtctca gaattggtgc cacgatcttg ataatgccta agttcgaaat cactctcttg 840 ttagagcaga tacaaaggtg taaagtcacg gtggctatgg tcgtgccacc gatcgtttta 900 gctatcgcga agtcgccgga gacggagaag tatgatctga gctcggttag gatggttaag 960 tctggagcag ctcctcttgg taaggagctt gaagatgcta ttagtgctaa gtttcctaac 1020 gccaagcttg gtcagggcta tgggatgaca gaagcaggtc cggtgctagc aatgtcgtta 1080 gggtttgcta aagagccgtt tccagtgaag tcaggagcat gtggtacggt ggtgaggaac 1140 gccgagatga agatacttga tccagacaca ggagattctt tgcctaggaa caaacccggc 1200 gaaatatgca tccgtggcaa ccaaatcatg aaaggctatc tcaatgaccc cttggccacg 1260 gcatcgacga tcgataaaga tggttggctt cacactggag acgtcggatt tatcgatgat 1320 gacgacgagc ttttcattgt ggatagattg aaagaactca tcaagtacaa aggatttcaa 1380 gtggctccag ctgagctaga gtctctcctc ataggtcatc cagaaatcaa tgatgttgct 1440 gtcgtcgcca tgaaggaaga agatgctggt gaggttcctg ttgcgtttgt ggtgagatcg 1500 aaagattcaa atatatccga agatgaaatc aagcaattcg tgtcaaaaca ggttgtgttt 1560 tataagagaa tcaacaaagt gttcttcact gactctattc ctaaagctcc atcagggaag 1620 atattgagga aggatctaag agcaagacta gcaaatggat taatgaacta g 1671 <210> 6 <211> 753 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 6 atggcttctg ctcctcaacc accaactcta tctgaaaaaa ccactaatct ctcaccggaa 60 aacgacaatg ttacgatcac cggaaagata tatacaagag tccgccttgc tacaaaatct 120 gatctgcacc atgcatacca gttgttttac caaatccacg cataccataa ccaatttcat 180 ttattcaaag caacagagtc ctccttatcg gacttgttct ttaaagaaaa tcctcttccc 240 cttttctacg gaccaaccct acttctactc gaagtctccc cgaccgcttt tactgaaccc 300 aaaaataaca aggacgaagg gttcaaaccc gtctttacag cgctcgacct taaatttcct 360 gtcgtggaag gacaagttga ggagtttcgg tccaaatatg atgatggaac cgataaacgt 420 gatgtgttca tcgcgggata tgcttacttt tttgctagtt attcactctt cgggaacgac 480 aaaccgggga tccatttcga cagtctttac ttcagggaaa gctatagaaa attgggaatg 540 ggaaaattgt tgtttggaac tgttgcgtct attgctgcga acaatgggtt tgctgcggtg 600 gagggaattg tagcagtttg gaataaaaag tcatatgatt tttatgtgag tatgggtgtt 660 gaaatgcatg atgactttag gtttggcaaa ttggacggtg aaaatcttca aaagtacgct 720 gataaggaga aaaatggtgc aggaagctgt tag 753

Claims (12)

  1. 서열번호 6의 염기서열을 갖는 세로토닌 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase) 유전자 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 4-쿠마레이트-코엔자임A 리가아제(4-Coumarate-CoA ligase) 유전자가 순차적으로 연결되고, 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 2에 기재된 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  5. 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 세균.
  6. 제5항에 있어서, 상기 형질전환된 세균은 대장균인 것을 특징으로 하는 세균.
  7. 제6항에 있어서, 상기 대장균은 기탁번호 KCTC 11272BP 인 것을 특징으로 하는 세균.
  8. (a) 제5항의 세균에 페놀 기질 및 아민 기질을 투여하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 배양된 세균으로부터 생산된 페닐프로파노이드 아미드계 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 페놀 기질은 쿠마르산(coumaric acid), 카페익산(caffeic acid), 페루릭산(ferulic acid), 신남산(cinnamic acid) 및 시납 산(sinapic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 아민 기질은 티라민(tyramine), 트립타민(tryptamine), 세로토닌(serotonin), 도파민(dopamine), 노르아드레날린(noradrenaline) 및 옥토파민(octopamine)으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 (b) 단계의 페닐프로파노이드 아미드계 화합물은 쿠마로일세로토닌, 페루로일세로토닌, 카페오일세로토닌, 시나포일세로토닌, 시나모일세로토닌, 쿠마로일옥토파민 및 쿠마로일티라민으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 제5항의 세균에 페놀 기질 및 아민 기질을 투여하여 배양하는 것은 페놀 기질 및 아민 기질을 각각 0.5mM~5mM을 투여하여 28~40℃의 조건에서 2~4시간 배양하는 것을 특징으로 하는 페닐프로파노이드 아미드계 화합물의 생산방법.
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