KR20050005723A - 식물에서 세로토닌 유도체를 생합성하는 방법 - Google Patents

식물에서 세로토닌 유도체를 생합성하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물에서 세로토닌 유도체를 생합성하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하거나 또는 식물에서 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제의 과다발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 공지의 항암, 항산화 및 뼈 형성 촉진 활성을 갖는 페루로일세로토닌 및 쿠마로일세로토닌과 같은 세로토닌 유도체를 제조할 수 있다. 상기의 방법에 의해 제조된 세로토닌 유도체는 정제되어 이용되거나 식용 가능한 식물 그 자체로 이용될 수 있다.

Description

식물에서 세로토닌 유도체를 생합성하는 방법{Method for biosynthesizing the serotonin derivatives in plants}
본 발명은 식물에서 세로토닌 유도체를 생합성하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하거나 또는 식물에서 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제의 과다발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법에 관한 것이다.
세로토닌 유도체는 하이드록시신나모일 아민류 화합물(N-(hydroxycinna moyl)-amines)의 일종이다. 상기 하이드록시신나모일 아민류 화합물은 하이드록시신남산 유도체(hydroxycinnamic acid derivatives)와 방향성 아민류(aromatic amines) 화합물의 중합체이다. 그의 대표적인 물질로 페루로일티라민(feruloyl tyramine), 페루로일옥토파민(feruloyloctopamine), 쿠마로일티라민(4-coumaroylty ramine), 페루로일메톡시옥토파민(feruloyl-3'-methoxyoctopamine), 쿠마로일옥토파민(4-coumaroyloctopamine), 페루로일세로토닌(feruloylserotonin) 및 쿠마로일세로토닌(coumaroylserotonin)등이 있다. 상기 하이드록시신나모일 아민류 화합물은 주로 식물 세포벽으로 도입되어 세포벽의 구성성분인 리그닌 및 세포막 단백질과의 과산화중합반응(peroxidative polymerization)을 통해 식물의 세포벽 강화에 관여하고(Schmidt et al.,Planta, 205, 51-55, 1998), 식물에 병원균의 침입 또는 상처가 발생하는 경우에 합성량이 급격히 증가되는 것으로 알려져 있다 (Fritzermeier et al.,Plant Physiol.85, 34-41, 1987; Joos et al.,Eur. J. Biochem. 204, 621-629, 1992).
상기 하이드록시신나모일 아민류 화합물의 한 구성 화합물인 하이드록시신남산 유도체(hydroxycinnamic acid derivatives)는 페닐프로파노이드 경로(phenyl propanoid pathway)를 경유하여 합성된다. 즉, 하이드록시신나메이트(hydroxy cinnamate)는 ATP 및 코에이-에스에치(CoA-SH)를 사용하여 하이드록시신나메이트:코에이 리가제(hydroxycinnamate:CoA ligase)에 의해 하이드록시신나메이트-코에이(hydroxycinnamoyl-CoA)로 합성된다. 대표적인 것으로 페루로일코에이(feruloyl-CoA), 신나모일코에이(cinnamoyl-CoA), 쿠마로일코에이(4-coumaroyl-CoA) 및 시나포일코에이(sinapoyl-CoA) 등이 있다.
또한, 하이드록시신나모일 아민류 화합물의 또 다른 구성 화합물인 방향성 아민류 화합물은 시키메이트 경로(shikimate pathway)를 경유하여 합성된다. 즉, 방향성 아민류 화합물은 아미노산이 탈탄산화효소에 의해 탈탄산화되어 형성되며, 대표적인 것으로 티로신에서 유래된 티라민(tyramine), 트립토판에서 유래된 세로토닌(serotonin) 및 기타 도파민(dopamine), 노르아드레날린(noradrenaline) 및 옥토파민(octopamine) 등이 있다.
하이드록시신나모일 아민류 화합물들은 상기 페닐프로파노이드 경로에서 합성된 하이드록시신남산 유도체 및 상기 시키메이트 경로에서 합성된 방향성 아민류 화합물이 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(tyramine N-(hydroxycinnamoyl) transferase)에 의해 중합되어 생성된다.
상기 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(tyramine N-(hydroxycinnam oyl)transferase; 이하 'THT'라고 함)는 다양한 하이드록시신남산 유도체 및 방향성 아민류 화합물을 기질로 사용하여 하이드록시신나모일 아민류 화합물을 생성하는 효소로 알려져 있다. THT는 감자역병균(Phytophthora infestans)으로부터 제조된 유발제(elicitor)를 감자 현탁배양세포에 처리한 다음 크로마토그래피를 사용하여 최초로 정제되었다(Hohlfeld et al.,Plant Physiol.107, 545-552, 1995). 감자 THT의 분자량은 49,000, 최적 pH는 6.5∼6.8 및 최적온도는 55℃였다. 정제된 재조합 감자 THT의 하이드록시신남산 유도체 기질 친화성은 페루로일코에이 (feruloyl-CoA), 신나모일코에이(cinnamoyl-CoA), 쿠마로일코에이(4-coumaroyl- CoA) 및 시나포일코에이(sinapoyl-CoA)의 순이었다. 또한, 하이드록시신남산 유도체 기질로서 페루로일코에이를 사용한 경우의 감자 THT의 아민류 기질 친화성은 티라민, 옥토파민, 도파민 및 노르아드레날린의 순인 반면, 쿠마로일코에이를 사용한 경우의 감자 THT의 티라민 친화성은 10배 이상 증대하였고, 그 외 다른 아민류인 트립타민(trytamine), 아그마틴(agmatine), 푸트리신(putricine), 카다베린(cada verin), 스페르미딘(spermidine) 및 스페르민(spermine) 등은 기질로서 사용되지 않았다. 또한, THT는 상기 기질간의 경쟁적 저해제로서 작용하였다.
이후, 담배현탁배양액에 유발제(elicitor)로 프로나제(pronase)를 처리하여 THT 효소활성을 유도한 후 크로마토그래피를 이용하여 담배 THT가 부분 정제되었다 (Negrel et al.,Eur. J. Biochem.247, 1127-1135, 1997). 상기의 정제된 효소의 아미노산 서열 데이터를 기초로 공지의 방법을 사용하여 cDNA 클론이 수득된 바 있다(Schmidt et al.,J. Biol. Chem.274, 4273-4280, 1999). 상기 담배 THT 유전자의 아미노말단에 6개의 히스티딘을 부착하고, 이를 대장균 발현벡터 pQ30를 통해 발현시켜 아이피티지(IPTG)로 단백질의 발현을 유도한 다음 친화성 정제(affinity purification)법을 통해 정제함으로서 담배 THT를 수득한 바 있다. 상기 정제된 담배 THT는 신나모일코에이 및 페루로일코에이에 대해 가장 높은 하이드록시신남산유도체 기질 친화성을 보였고, 아민류 화합물 기질 친화성은 페루로일코에이를 공여체로 사용하는 경우 옥토파민이 가장 높았다.
또한, 디퍼런셜 스크리닝(differential screening) 기법을 이용하여 자외선 (UV)을 처리한 고추로부터 THT 유전자가 클로닝되었다(Back et al.,Plant Cell Physiol.42, 475-481, 2001). 정제된 재조합 고추 THT의 하이드록시신남산 유도체 기질 친화성은 신나모일코에이(cinnamoyl-CoA), 시나포일코에이(sinapoyl-CoA), 페루로일코에이(feruloyl-CoA) 및 쿠마로일코에이(coumaroyl-CoA) 순이었고, 신나모일코에이(cinnamoyl-CoA)의 최대반응속도(Vmax)는 쿠마로일코에이(coumaroyl-CoA)에 비해 약 15배 높았다. 고추 THT의 아민 기질 친화성은 티라민 및 옥토파민 순이었고, 티라민의 최대반응속도(Vmax)는 옥토파민에 비해 1.5배 높았다. 고추 THT 유전자의 mRNA는 모든 조직에서 발현되고, 조직에 상처가 발생시 THT 효소가 과다 발현됨을 확인하였다.
상기와 같이, 식물의 THT 효소는 다양한 하이드록시신남산 유도체 및 아민류 화합물을 기질로 사용하여 페루로일티라민, 페루로일옥토파민, 쿠마로일티라민, 페루로일메톡시옥토파민 및 쿠마로일옥토파민 등과 같은 다양한 하이드록시신나모일 아민류 화합물을 합성하지만, THT 효소가 그의 아민류 기질로서 세로토닌을 이용한다는 보고는 없었다.
한편, 하이드록시신나모일 아민류 화합물의 일종인 페루로일세로토닌 (feruloylserotonin) 및 쿠마로일세로토닌(coumaroylserotonin) 같은 세로토닌 유도체(serotonin derivatives)는 자연계에서 극히 일부의 식물체 내에 미량으로 존재하는 것으로 알려져 있다. 문헌에는 상기 세로토닌 유도체가 홍화(Carthamus tinctorius)로부터 분리되었으며 항산화 활성이 있다고 보고된 바 있다(Zhang et al.,Chemical & Pharma. Bull.44, 874-876, 1996). 이후 상기 세로토닌 유도체가 항산화 활성 외에 항암 활성도 갖는 것으로 보고 되었으며(Kawashima et al.,J. Interferron & Cytokine Res.18, 423-428, 1998), 대한민국 특허등록번호 제10-0354791호에는 상기 페루로일세로토닌 및 쿠마로일세로토닌의 신규한 용도인 뼈 형성 촉진 활성이 개시된 바 있다.
그러나, 상기와 같은 세로토닌 유도체의 유용성에도 불구하고 현재까지 세로토닌 유도체를 생합성하는 방법 및 세로토닌 유도체가 생합성된 기능성 식물에 대해서 보고된 바가 전혀 없을 뿐만 아니라, THT 효소가 그의 아민류 화합물 기질로서 세로토닌을 사용하여 세로토닌 유도체를 합성한다는 보고는 없었다.
이에, 본 발명자들은 세로토닌 유도체의 생합성 방법을 연구하던 중 식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하거나 또는 식물에서 THT 효소를 과다발현시키면, 식물체 내에 세로토닌 유도체가 생합성됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하는 단계를 포함하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 식물에 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(N-(hydroxycinnamoyl) transferase)의 과다발현을 유도하는 단계를 포함하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제 유전자가 도입되고, 조직배양을 통해 재분화되며 세로토닌 유도체가 생합성된 형질전환식물을 제공하는 것이다.
도 1은 바이너리 벡터(binary vector), pGA1611 및 pGA1611:THT의 T-DNA 영역 개략도(A) 및 pGA1611:THT의 전체 벡터 모식도(B)이다.
(Ubi-P: 옥수수 유비퀴틴 프로모터, THT: 고추 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제 유전자, Tnos: 노파린 합성 종결유전자, P35S: 꽃양배추 35S 프로모터, HPT: 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, TiA6-7: 옥토파인형 TiA6-7 종결유전자)
도 2는 T0세대 형질전환벼의 서던 블롯(Southern blot) 분석 결과를 나타내는 사진이다.
(W: 야생형 대조구 벼, TC: 형질전환 대조구 벼, T8 내지 T23: 형질전환 벼)
도 3은 T1세대 형질전환 벼의 노던 블롯(Northern blot) 분석 결과(A) 및 웨스턴 블롯(Western blot) 분석 결과(B)를 나타내는 사진이다.
(W: 야생형 대조구 벼, TC: 형질전환 대조구 벼, T8 내지 T23: 형질전환벼, P: 20ng의 정제된 재조합 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제 단백질)
도 4는 T2세대 형질전환벼의 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제 효소활성을 측정한 결과이다.
(W: 야생형 대조구 벼, TC: 형질전환 대조구 벼, T9 내지 T17: 형질전환벼)
도 5는 T2세대 형질전환벼의 하이드록시신나모일 아민류 화합물의 합성 여부를 나타내는 고속액체크로마토그래피(HPLC) 데이터이다.
(A는 쿠마로일티라민 및 페루로일티라민의 표준혼합물(CT: 쿠마로일티라민, FT:페루로일티라민); B는 야생형 대조구 벼; C는 형질전환벼; D는 티라민이 첨가된 배지에서 재배된 경우의 형질전환벼(CS: 쿠마로일세로토닌, FS:페루로일세로토닌); E는 정제된 고추 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제 효소, 페루로일코에이 및 세로토닌을 기질로 사용)
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하는 단계를 포함하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 식물에 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제의 과다발현을 유도하는 단계를 포함하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자가 도입되고, 조직배양을 통해 재분화되며 세로토닌 유도체가 생합성된 형질전환 식물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
일반적으로 대부분의 식물에서 세로토닌 유도체가 합성되지 않는 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명자들은 식물에 방향성 아민류 화합물 또는 하이드록시신남산 화합물을 처리하는 경우 식물체 내에 세로토닌 유도체가 생합성됨을 최초로 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 식물에 THT 효소를 과다발현시키는 경우에도 식물체 내에 세로토닌 유도체가 생합성됨을 최초로 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 식물체 내에 THT 효소의 과다발현을 유도한 경우에는 별도로 방향성 아민류 화합물 또는 하이드록시신남산 화합물을 공급하지 않더라도 식물체 내에서 세로토닌 유도체가 생합성됨을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 세로토닌 유도체의 생합성 방법은 식물에 방향성 아민류 화합물 또는 하이드록시신남산 화합물과 같은 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 세로토닌 유도체의 생합성 방법은 식물에 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제의 과다발현을 유도하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 식물로는 특별히 한정되지는 않으며, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 고추, 배추, 무, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류 식물이 모두 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 식량작물로서 벼를 사용하였으며, 채소작물류로서는 고추를 사용하였다 (실시예 1 참조).
본 발명에서 세로토닌 유도체는 하이드록시신남산 유도체와 세로토닌이 중합되어 생성된 하이드록시신나모일 세로토닌 화합물을 말한다. 더욱 바람직하게는, 항산화 활성, 항암 활성 및 뼈 생성 촉진 활성을 갖는 것으로 알려진 페루로일세로토닌(feruloylserotonin) 또는 쿠마로일세로토닌(coumaroylserotonin)일 수 있다.
1. 식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질 처리
본 발명에 따른 세로토닌 유도체의 생합성 방법은 식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에서 '세로토닌 유도체 생합성 유도물질'이란 식물에 흡수되어 식물 내의 세로토닌 유도체 합성 및 이동을 활성화시킴으로써 식물체 내에서 세로토닌 유도체의 생성을 유도할 수 있는 화합물을 말한다. 상기 세로토닌 유도체 생합성 유도물질로는 방향성 아민류 화합물 및 하이드록시신남산 화합물 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
상기 방향성 아민류 화합물로는 티라민(tyramine), 트립타민(tryptamine),세로토닌(serotonin), 도파민(dopamine), 노르아드레날린(noradrenaline) 및 옥토파민(octopamine)이 포함된다. 상기 하이드록시신남산 화합물로는 쿠마르산 (coumaric acid), 카페익산(caffeic acid), 페루릭산(ferulic acid), 신남산 (cinnamic acid) 및 시납산(sinapic acid)이 포함된다. 그 외 식물의 이차대사산물 생합성 유도물질로는 당 분야에 공지된 키틴(chitin), 곰팡이 세포벽 추출물 (fungal cell wall extracts) 및 자스몬산(Facchini et al.,Plant Physiol. 111, 687-697, 1996; Randhir et al.,Process Biochemistry37, 1247-1256, 2002; Ishihara et al.,Biosci. Biotech. Biochem.66, 2176-2182, 2002)등 이 포함될 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 세로토닌 유도체 생합성 유도물질은 자연으로부터 추출하거나 화학적 합성법에 의해 제조하거나 상업적으로 구입하여 사용할 수 있다.
상기 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 식물에 처리하는 방법으로는 상기 유도물질을 식물의 생장 배지에 첨가하거나 또는 토양에 처리함으로써 식물의 뿌리에 흡수시키는 것이 바람직하다. 상기 식물의 생장 배지로는 일반적으로 식물의 생장에 필요한 영양소가 함유된 조성물을 말한다. 상기 영양소로는 탄소원, 생장조절물질, 비타민, 아미노산과 같은 유기 영양소 및 여러 종류의 무기 영양소가 포함될 수 있다. 당 분야에 공지된 식물 생장 배지로는 예를 들어, MS 배지 및 변형 B5 배지(Modified B5 medium) 등이 있다. 상기 식물의 생장 배지는 식물의 종류에 따라 당 분야에 공지된 배지 중에서 가장 적합한 종류를 선택하여 사용할 수 있다.
한편, 상기 세로토닌 유도체 생합성 유도물질 중 하나인 세로토닌을 식물에 처리하는 경우에는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 식물의 경엽 또는 과육에 처리하는 것이 바람직하다.
상기 세로토닌 유도체 생합성 유도물질의 처리 농도는 식물이 생장하는 배지에 처리하는 경우 10∼50 μM의 농도 범위가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 50 μM의 농도로 처리한다.
상기 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 토양에 처리하는 경우에는 10∼100 μM 농도로 재배면적 당 100,000∼300,000 L/ha씩 처리한다. 바람직하게는, 100 μM 농도로 재배면적 당 300,000 L/ha씩 처리한다.
단, 세로토닌 유도체 생합성 유도물질 중 하나인 세로토닌의 경우에는 물에 0.1∼1 mM 농도로 희석하여 사용하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 1mM의 농도로 희석하여 사용한다. 또한, 세로토닌의 처리량은 재배면적 당 10,000 L/ha로 처리하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 세로토닌 유도체 생합성 유도물질의 처리 시기는 식물의 생육기 전반에 걸쳐 처리하는 것이 가능하나, 세로토닌 유도체 화합물을 식물의 종자나 과육에 축적시키기 위해서는 세로토닌 유도체 생합성 유도물질의 처리에 의한 식물의 생육 저해를 최소화할 수 있는 생육 후반기가 바람직하다. 즉, 세로토닌 유도체를 식물의 종자나 과육에 축적되도록 하기 위해서는 식물의 과육이 형성되는 시기 또는 종자가 등숙되는 시기에 처리하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 벼의 경우에는 출수 30∼40 일경에, 바람직하게는 출수 40 일경에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리한다. 고추의 경우에는 개화시기의 고추에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는 아민류 화합물로서 티라민 및 트립타민, 하이드록시신남산 화합물로서 신남산, 쿠마르산, 카페익산 및 페루릭산과 같은 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 출수 40 일경의 벼가 자라고 있는 토양에 처리하여 20∼30 일간 재배한 다음 벼의 종자에 함유된 세로토닌 유도체 함량을 측정하였다. 실험 결과, 상기 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하지 않은 무처리 벼의 종자에는 세로토닌 유도체가 검출되지 않았으나, 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리한 벼의 종자에는 쿠마로일세로토닌 및 페루로일세로토닌과 같은 세로토닌 유도체가 검출되었다(실시예 1-1) 참조).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 아민류 화합물로서 티라민 및 트립타민, 하이드록시신남산 화합물로서 신남산, 쿠마르산, 카페익산 및 페루릭산과 같은 세로토닌 생성 유도물질을 개화시기의 고추가 자라고 있는 토양에 처리하여 20 일간 재배한 다음 고추의 과육에 함유된 세로토닌 유도체 함량을 측정하였다. 실험 결과, 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하지 않은 무처리 고추의 과육에는 세로토닌 유도체가 검출되지 않았으나 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리한 고추의 과육에는 쿠마로일세로토닌 및 페루로일세로토닌과 같은 세로토닌 유도체가검출되었다(실시예 1-2) 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 물에 녹인 세로토닌을 고추 과육에 분무한 후 일정기간이 지난 다음 과육에 함유된 세로토닌 유도체를 분석하였다. 그 결과, 세로토닌을 처리하지 않은 대조구의 경우에는 세로토닌 유도체가 검출되지 않았으나, 세로토닌을 처리한 고추 과육에는 세로토닌 유도체가 높은 함량으로 검출되었다(실시예 2 참조).
이에, 본 발명자들은 상기 실험 결과로부터 식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리함으로써 식물체 내에 세로토닌 유도체가 생합성된다는 사실을 확인할 수 있었다.
2. 식물에 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제의 과다발현 유도
본 발명의 식물체에 세로토닌 유도체를 생합성하는 방법은 THT 효소의 과다발현 유도하는 것을 특징으로 한다.
상기 세로토닌 유도체를 생합성은 식물의 과육에 상처를 가하거나 또는 식물에 THT 효소를 암호화하는 유전자를 도입하는 것에 의해 수행될 수 있다.
상기에서 식물의 과육에 상처를 가하는 방법으로는 식물 과육의 한 부분을 일정한 크기로 절개하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는 충분히 성숙한 고추의 과육을 0.5 mm로 잘라서 상처를 낸 후 일정기간 지난 다음 세로토닌 유도체 함량을 분석하였다. 그 결과, 상처를 내지 않은 고추 과육의 경우에는 세로토닌 유도체가 검출되지 않았으나 상처를 낸 고추 과육의 경우에는 세로토닌 유도체가 높은 농도로 검출되었다(실시예 3 참조).
상기 실험 결과로부터 식물에 상처를 가함으로써 식물체 내에 세로토닌 유도체가 생합성된다는 사실을 확인할 수 있었다.
또한, 식물에서 THT 효소의 과다발현은 식물에 THT를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 다음과 같은 방법으로 도입시킴으로써 달성할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 THT를 암호화하는 유전자는 바람직하게는 가지과 (Solanum) 유래의 THT 유전자이고, 더욱 바람직하게는 고추(Capsicum annuum) 유래의 THT 유전자이며, 가장 바람직하게 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 고추 유래 cDNA이다. 상기 목적하는 THT 유전자는 당 분야에 공지된 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 증폭하여 수득할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 공지의 고추 THT 유전자를 함유한 전장 cDNA(Back et al.,Plant Cell Physiol.42, 475-481, 2001)를 주형으로 PCR을 수행하여 증폭시켜 사용하였다.
본 발명에서 사용되는 THT를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 공지의 식물 발현용 벡터를 기본 벡터로 하여 제조될 수 있으며, 일반적인 이원 벡터(binary vector), 코인테그레이션 벡터(cointegration vector) 또는 T-DNA 부위를 포함하지 않지만 식물에서 발현될 수 있도록 디자인된 일반벡터가 사용될 수 있다. 단자엽 식물, 특히 벼의 형질전환시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소에서 입수가능하며, 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 Ti 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측경계 부위에 형질전환체 선별 표지 유전자, 프로모터, 전사종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용하고 있다.
본 발명에서 사용되는 재조합 벡터는 THT를 암호화하는 유전자, 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 식물 특이적 발현을 조절하는 프로모터 및 선별 표지 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 식물 특이적 발현을 조절하는 프로모터는 옥수수 유비퀴틴 프로모터(ubiquitin promoter), 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터(CaMV 35S promoter), 액틴(actin) 프로모터, PG 프로모터 및 배유 특이 프로모터(endosperm-specific promoter) 등을 포함하지만 그것에 한정되는 것은 아니며, 유비퀴틴 프로모터가 바람직하다. 식물의 종자에 THT 유전자를 과다발현시켜 세로토닌 유도체의 생합성을 증대시키기 위해서는, 상기 식물 특이적 발현을 조절하는 프로모터로 글루테인 프로모터와 같은 종자 특이적 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 선별 표지 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein) 유전자, GUS(β-glucuronidase) 유전자, GAL(β-galactosidase) 유전자 등을 포함하지만 그것에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자 또는 다이하이드로폴레이트 환원효소 유전자 등이 사용될 수 있지만, 하이그로마이신 트랜스퍼라제 유전자가 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 당 분야에 공지된 분자생물학적 기법을 사용하여, 공지의 바이너리 벡터 pGA1611:C(기탁번호 KCTC 0692BP)에서 바실러스 섭틸리스 프로톡스 유전자를 제거하고, 여기에 고추 THT 전장 cDNA를 삽입한 바이너리 벡터 pGA1611:THT를 제조하여 사용하였다(도 1 참조).
상기 THT를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 식물로의 도입은 당업계에 공지된 통상적인 형질 전환 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 식물에 대한 형질전환은 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다(Horsch et al.,Science227:1229-1231, 1985). 예를 들면 벼에 대한 아그로박테리움-매개 형질전환법은 당업계의 문헌 등에 공지되어 있다(An et al.,EMBO J4:227-288, 1985). 형질전환용 숙주로 사용되는 아그로박테리움은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등이 사용된다. 단자엽 식물은 PEG 또는 전기천공법 등을 이용하여 프로토플라스트(protoplast) 내로 직접 유전자를 이식시키는 방법 또는 캘러스 조직 내로의 입자 투하(particle bombardment)를 사용하는 방법 등을 이용하여 형질전환될 수 있으며, 단일 DNA를 사용하는 형질전환법 및 다중 DNA를 사용하는 동시 형질전환법을 이용하여 형질전환될 수도 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기의 바이너리 벡터 pGA1611:THT를 공지의 동결융해법 (An,Methods Enzymol153: 292-305, 1987)을 통해 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(Cat. NO. 18313-015, GibcoBRL, 미국)에 도입시켜, 이를 이용하여 벼의 배반으로부터 유도된 캘러스에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였다(실시예 4-2) 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 THT 유전자가 형질전환된 벼의 게놈으로 안정하게 도입되었는지 여부 및 그 삽입 수를 평가하기 위해, T0세대의 형질전환 벼 게놈 DNA를 추출하여 서던 블롯 방법을 수행한 결과, 3개의 세포주를 제외한 모든 형질전환 세포주의 게놈 DNA에 고추 THT 유전자가 성공적으로 삽입되었음을 확인하였다(실시예 4-3) 및 도 2 참조).
또한, 형질전환 벼 게놈으로 도입된 고추 THT 유전자의 다음 세대로의 유전성(inheritance)을 확인하기 위하여, 하이그로마이신 저항성을 갖는 T0세대의 형질전환 벼를 자가수분시켜 생산된 종자(T1세대)를 하이그로마이신을 함유하는 배지에서 발아시켰을 때 나타나는 각 형질전환 세포주의 하이그로마이신 저항성 개체와 감수성 개체의 분리비를 조사하였다. 그 결과, 분리비는 약 3:1로 나타나 벼의 게놈에 삽입된 고추 THT 유전자는 멘델의 법칙에 따라 분리 및 발현됨을 확인하였다(실시예 4-4) 및 표 5 참조).
또한, 고추 THT 유전자가 mRNA 및 단백질로 안정하게 발현하는지 여부를 확인하기 위하여, T1세대의 형질전환 벼에 대하여 노던 블롯 및 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과, 형질전환 식물에서 고추 THT 유전자의 mRNA가 과다발현되고(실시예 4-5) 및 도 3의 A 참조), 고추 THT 단백질이 항상 발현됨을 확인하였다(실시예 4-6) 및 및 도 3의 B 참조).
또한, 형질전환 식물체 내에서 발현된 THT 단백질이 효소 활성을 갖는지 여부를 확인하기 위해, 잎에서 얻은 단백질 추출물을 THT 효소의 가장 특이적인 기질로 알려진 페루로일코에이(feruloyl-CoA) 및 티라민(tyramine)이 포함된 반응 혼합물에 첨가하여 페루로일티라민의 생성량을 측정한 결과, 고추 THT 유전자가 도입되지 않은 야생형 대조구(W) 및 형질전환대조구(TC) 벼에서는 효소 활성이 거의 관찰되지 않는 반면, 고추 THT 유전자가 도입된 형질전환 벼에서는 높은 효소 활성이 확인되었다(실시예 4-7) 및 도 4 참조).
본 발명의 일 실시예에서는 고추 THT 효소가 과다발현된 형질전환 벼를 특별한 처리 없이 일반적인 토양에서 재배한 다음 벼의 종자 또는 경엽 내에 함유된 세로토닌 유도체 함량을 분석하였다. 그 결과, 벼의 경엽에서는 세로토닌 유도체가 검출되지 않았으나, 벼의 종자에서는 종자 1 g 당 689 ng의 세로토닌 유도체가 생합성되었음을 확인할 수 있었다(실시예 5 참조).
상기 실험 결과로부터, 식물에 THT 효소를 과다발현시킴으로써 식물에 세로토닌 유도체가 생합성될 수 있음을 확인할 수 있었다.
나아가, 본 발명의 세로토닌 유도체 생합성 방법은 상기 THT 효소가 과다발현된 형질전환 식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하는 방법은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 실시예에서는 고추 THT 효소가 과다발현된 형질전환 벼를 세로토닌 유도체 생합성 유도물질인 티라민(tyramine)과 같은 아민류 화합물 또는 쿠마르산(coumaric acid)과 같은 하이드록시신남산이 첨가된 배지에서 배양한 다음 벼의 경엽에 함유된 세로토닌 유도체의 함량을 분석하였다. 그 결과 조사된 모든 형질전환세포주에서 페루로일세로토닌 및 쿠마로일세로토닌과 같은 세로토닌 유도체가 경엽 1 g 당 평균적으로 총 174 ㎍의 세로토닌 유도체가 합성되었다(실시예 6-1) 및 표 6 참조).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 세로토닌 유도체 생합성 유도물질로서 티라민, 트립타민, 신남산, 쿠마르산, 카페익산 및 페루릭산을 각각 처리한 형질전환 벼를 재배한 다음 벼의 종자에 함유된 세로토닌 유도체 함량을 분석하였다. 실험 결과, 상기 형질전환 벼에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리한 경우에는 처리하지 않은 경우에 비해 보다 많은 양으로 세로토닌 유도체가 벼의 종자 내에 생성되었음을 확인할 수 있었으며, 형질전환 벼에서 생성된 세로토닌 유도체의 함량은 야생 벼에 비해 약 6 배∼25 배 더 높게 나타남을 확인할 수 있었다(실시예 6-2) 및 표 7 참조).
상기 실험 결과로부터 본 발명자들은 본 발명의 THT 유전자가 과다발현되는 형질전환 식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하는 경우 식물체 내에 세로토닌 유도체가 생합성됨을 확인할 수 있었으며, 형질전환 식물의 경우 야생 식물에 비해 세로토닌 유도체를 더 많이 생합성 할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 형질전환 벼의 잎에 THT 효소의 기질로서 세로토닌을 각각 1 mM 농도로 분무하고 24시간 후 잎을 채취하여 세로토닌 유도체의 함량을 분석하였다. 실험 결과, 세로토닌을 처리한 잎에서는 경엽 1 g 당 2 ㎍ 정도의 페루로일세로토닌이 검출되었다(실시예 6-3) 참조).
상기 실험 결과로부터 THT 유전자가 과다발현되는 형질전환 식물의 잎에 세로토닌을 처리함으로써 세로토닌 유도체가 합성될 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 세로토닌 유도체가 생합성된 형질전환식물로부터 세로토닌 유도체를 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법을 제공한다. 상기 세로토닌 유도체의 분리 및 정제는 식물로부터 특정 화합물을 추출 또는 정제하는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
예를 들면, 식물을 건조 및 분쇄하여 용매로 유효성분을 추출하는 용매 추출법을 사용할 수 있으며, 상기 추출액을 크로마토그래피와 같은 공지의 방법으로 보다 순수한 형태로 정제할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 합성된 페루로일세로토닌 및 쿠마로일세로토닌과 같은 세로토닌 유도체는 상술한 바와 같이 형질전환식물로부터 공지의 방법에 의해 순수 분리하여 사용할 수도 있으나, 식용 식물을 이용하여 형질전환한 경우에는 분리 및 정제 과정을 거치지 않고, 식물 세포 자체, 그로부터 재분화시킨 형질전환 식물체의 일부, 특히 종자 또는 그 추출물을 이용하는 것이 비용 및 공정 면에서 바람직하다.
상기와 같은 실험 결과를 종합하여 볼 때, 식물체 내에서 세로토닌 유도체의 생합성은 THT 효소가 세로토닌을 아민 기질로 사용함으로써 이루어지는 것임을 확인하였다(실시예 7). 또한, 식물에서 THT 효소가 기질 친화성을 갖는 티라민을 기질로 하여 티라민 유도체를 생합성하지 않는 것은 식물 내에 티라민이 거의 존재하지 않거나, 기질 친화성이 세로토닌 보다 낮기 때문일 것으로 추정된다. 한편, 티라민을 식물의 재배용 배지에 첨가하여 인위적으로 공급한 경우에도 티라민이 기질로 이용되지 않았는데 이는 첨가된 티라민이 식물체에 존재하는 페놀옥시다아제 (phenoloxidase)에 의해 급격히 퀴논(quinone)으로 분해되기 때문일 것으로 추정된다(Negrel et al.,Plant Physiol.103, 329-334, 1993).
또한, 식물체 내에 THT 유전자를 도입함으로써 식물에서 THT 유전자가 과다발현되도록 하면, 과다발현된 THT 효소가 식물체 내에 존재하는 세로토닌과 하이드록시신남산 유도체를 기질로 사용하여 세로토닌 유도체가 생합성 되도록 할 수 있음을 확인할 수 있었다.
나아가, THT 유전자가 과다발현된 식물에 세로토닌 생합성 유도물질을 인위적으로 공급함으로써 식물체 내에 세로토닌 유도체의 생합성을 더욱 촉진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
이에, 본 발명자들은 상기 고추 THT 효소가 세로토닌과 하이드록시신남산 유도체를 기질로 사용하여 세로토닌 유도체를 합성할 것이라는 추정을 확증하기 위해, 본 발명의 일 실시예에서 정제된 재조합 고추 THT 효소, 페루로일코에이 (feruloyl-CoA) 및 세로토닌을 함께 첨가하여 생체 외(in vitro)에서 효소반응을 수행한 다음, 그 반응 산물을 고속액체크로마토그래피로 분석하였다. 그 결과 페루로일세로토닌이 합성됨을 확인하였다(실시예 7 참조 및 도 5의 E 참조). 또한, 쿠마로일코에이와 세로토닌을 기질로 제공하였을 때도 고추 THT 효소가 쿠마로일세로토닌을 합성함을 확인하였다(결과 미도시).
이로부터, 본 발명자들은 고추 THT 효소가 세로토닌과 하이드록시신남산 유도체를 기질로 이용하여 페루로일세로토닌 및 쿠마로일세로토닌과 같은 세로토닌 유도체를 합성하는 특징이 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 THT 효소의 특징은 본 발명자들이 최초로 제시하는 것이다.
나아가, 본 발명은 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자가 도입되고, 조직배양을 통해 재분화되며 세로토닌 유도체가 생합성된 형질전환 식물을 제공한다.
본 발명에서 상기 식물은 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포, 종자 및 캘러스를 모두 포함한다. 상기 형질전환식물로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 고추, 배추, 무, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류 식물이 모두 포함된다. 가장 바람직하게는, 상기 형질전환 식물은 벼가 포함된다. 특히, 식용 가능한 식물체를 형질전환시켜 THT의 과다발현에 의한 세로토닌 유도체가 합성되는 경우 식물체 자체를 직접 섭취함으로써 항암 효과, 항산화 효과 및 뼈 형성 촉진 효과를 직접 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 세로토닌 유도체 생합성 방법은 식물의 종자나 과육에 세로토닌 유도체를 축적시킬 수 있으므로, 본 발명의 방법에 따라 제조된 식물의 종자나 과육 자체를 그대로 섭취할 수 있는 장점이 있다.
상기 형질전환된 식물 세포들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 방법에 따라 형질전환된 식물세포를50㎍/㎖ 하이그로마이신을 함유하는 선별 배지에서 배양시킨 후, 생존한 하이그로마이신 저항성 캘러스로부터 잎을 유도하기 위해 재분화 배지로 옮겨 일정시간 배양시킴으로써 4 내지 8%의 캘러스가 신초(shoot)로 재분화되었다. 이후, 재분화 신초를 뿌리 유도배지로 옮기고 배양시켜 완전한 THT 과다발현 식물체를 획득하였다(실시예 4-2) 참조).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
세로토닌 유도체 생합성 유도물질의 처리에 따른 식물의 세로토닌 유도체 생합성
1-1) 세로토닌 유도체 생합성 유도물질의 처리에 따른 벼의 세로토닌 유도체 생합성
논에서 재배되고 있는 벼(품종: 낙동)에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하고 세로토닌 유도체가 합성되었는지의 여부를 조사하였다.
출수 40일경의 낙동벼가 자라고 있는 토양에 티라민, 트립타민, 신남산, 쿠마르산, 카페익산, 페루릭산(시그마 알드리치, 한국)을 각각 물에 녹여 100 μM의농도로 제조한 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 재배면적 당 300,000 L/ha의 처리량으로 각각 1회 처리한 후 20 일간 재배하였다.
이때, 대조구로는 상기 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하지 않고 동일한 조건으로 재배한 벼를 사용하였다.
상기에서 재배한 벼를 수확한 후 벼 종자의 껍질을 제거하여 현미를 수득하였다. 상기 현미 1 g에 함유된 하이드록시신나모일 아민류 화합물을 공지된 방법에 따라 추출한 다음(Ishihara et al.,Biosci. Biotechnol. Biochem.64, 1025-1031, 2000) 고속액체크로마토그래피 분석을 수행하였다.
실험 결과, 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리한 벼의 추출물로부터 체류시간이 각각 6.4분(a 화합물) 및 7.2분(b 화합물)인 두 물질이 확인되었다. 상기 두 물질을 이온-스프레이 액체크로마토그래피 질량분석기(ion-spray LC/MS)를 사용하여 분석한 결과, 상기 a 화합물의 경우, m/z(전하에 대한 질량비) 147의 스펙트럼이 확인되어 쿠마르산(coumaric acid)의 아미드(amide) 특성을 암시하였고, 분자량은 322로 확인되었으며, B 화합물의 경우 m/z 177의 이온 피크가 확인되어 페루로일(feruloyl)의 존재를 암시하였고, 분자량은 352로 확인되어, 상기 두 화합물은 두 개의 질소 원자를 가진 하이드록시신나모일 아민류 화합물로 추정되었다(결과 미도시). 상기 a 화합물 및 b 화합물과 인위적으로 합성된 쿠마로일세로토닌 및 페루로일세로토닌의 질량(MS) 및 자외선(UV) 스펙트럼을 비교 분석한 결과 상기 a 화합물은 쿠마로일세로토닌(coumaroylserotonin)으로, 상기 b 화합물은 페루로일세로토닌(feruloylserotonin)으로 확인되었다. 화합물 a 및 b의 질량(MS) 및 자외선(UV) 스펙트럼 결과는 다음과 같다.
화합물 a. UV λmax (relative intensity): 293 (100), 310 (99) ion-spray MS, m/z (relative intensity): 147 (100, [M-C10H11N2O]+), 323 (25, [M+H]+).
화합물 b. UV λmax (relative intensity): 294 (89), 316 (100) ion-spray MS, m/z (relative intensity): 177 (100, [M-C10H11N2O]+), 353 (34, [M+H]+).
상기 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리한 벼의 종자 추출물 중에 함유된 쿠마로일세로토닌 및 페루로일세로토닌의 양은 공지의 방법으로 합성한 표준물질(Villegas & Brodelius,Physiol. Plant.78, 414-420, 1990)을 사용하여 고속액체크로마토그래피 분석 결과로부터 측정하였다.
그 결과, 신남산을 처리한 경우에 세로토닌 유도체가 가장 많이 생산되었으며, 그 다음으로는 티라민과 페루릭산을 처리한 경우에 세로토닌 유도체가 많이 생산되는 것으로 나타났다. 반면, 세로토닌 생성 유도물질을 처리하지 않은 대조구 벼의 경우에는 쿠마로일세로토닌 및 페루로일세로토닌과 같은 세로토닌 유도체가 검출되지 않았다(표 1).
세로토닌 유도체 생합성 유도물질의 처리에 따른 벼 종자의 세로토닌 유도체 함량
세로토닌 유도체생합성 유도물질 세로토닌 유도체 함량(종자 1g에 함유된 양, ng)
쿠마로일세로토닌 페루로일세로토닌 총함량
무처리(대조구) - - -
티라민 처리 19 54 73
트립타민 처리 20 28 48
신남산 처리 48 76 124
쿠마르산 처리 15 21 36
카페익산 처리 20 23 43
페루릭산 처리 33 37 70
1-2) 세로토닌 유도체 생합성 유도물질의 처리에 따른 고추의 세로토닌 유도체 생합성
고추(품종: 풍천)에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하고 세로토닌 유도체가 합성되었는지의 여부를 조사하였다.
개화시기의 고추가 자라고 있는 토양에 티라민, 트립타민, 신남산, 쿠마르산, 카페익산, 페루릭산을 각각 물에 녹여 100 μM의 농도로 제조한 세로토닌 생성 유도물질을 재배면적 당 300,000 L/ha의 처리량으로 각각 1회 처리하여 20일간 재배하였다.
상기에서 재배한 고추의 성숙한 과육을 채취한 다음 상기 1-1)과 동일한 방법으로 세로토닌 유도체의 함량을 분석하였다. 대조구로는 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하지 않고 다른 재배조건은 동일하게 하여 재배한 고추를 사용하였다.
실험 결과, 신남산을 처리한 고추 과육의 세로토닌 유도체 함량이 가장 높게 나타났으며 그 다음으로는 페루릭산과 티라민을 처리한 고추 과육의 세로토닌 유도체 함량이 높게 나타났다. 반면, 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하지 않은 대조구 고추의 과육에는 세로토닌 유도체가 검출되지 않았다.
상기 실험 결과로부터 식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리한 경우 세로토닌 유도체가 생합성됨을 알 수 있었다(표 2).
세로토닌 유도체 생합성 유도물질의 처리에 따른 고추 과육의 세로토닌 유도체 함량
세로토닌 유도체생합성 유도물질 세로토닌 유도체 함량(과육 1g에 함유된 양, ng)
쿠마로일세로토닌 페루로일세로토닌 총함량
무처리(대조구) - - -
티라민 처리 150 210 360
트립타민 처리 61 79 140
신남산 처리 214 276 490
쿠마르산 처리 120 170 290
카페익산 처리 138 162 300
페루릭산 처리 145 230 375
<실시예 2>
세로토닌 처리에 따른 고추의 세로토닌 유도체 생합성
고추(품종: 풍천)에 세로토닌을 처리하고 세로토닌 유도체가 생합성 되는지를 조사하였다.
고추가지에 달려있는 상태의 고추 과육에 세로토닌을 물에 녹여 1 mM의 농도로 제조한 용액을 재배면적당 10,000 L/ha로 분무하였다. 분무한지 72시간 후 고추 과육을 채취하여 세로토닌 유도체 함량을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였다. 대조구로는 고추 과육에 세로토닌을 분무하지 않은 고추 과육을 사용하였다.
실험 결과, 세로토닌을 처리한 고추 과육에 세로토닌 유도체가 다량으로 검출되었다. 반면 세로토닌을 처리하지 않은 대조구 고추 과육의 경우에는 세로토닌 유도체가 검출되지 않았다(표 3).
상기 실험 결과로부터 식물에 세로토닌을 처리함으로써 세로토닌 유도체가 생합성될 수 있음을 알 수 있었다.
세로토닌 처리에 따른 고추 과육의 세로토닌 유도체 함량
세로토닌 유도체 함량(과육 1 g에 함유된 양, ng)
쿠마로일세로토닌 페루로일세로토닌 총함량
무처리(대조구) - - -
세로토닌 처리 1538 1028 2566
<실시예 3>
상처를 가한 고추의 세로토닌 유도체 생합성
개화 후 30일경 된 충분히 성숙한 고추(풍천)의 과육을 0.5mm로 잘라서 상처를 냈다. 72시간이 경과된 후 상기 고추 과육의 세로토닌 유도체 함량을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였다. 대조구로는 상처를 내지 않은 고추 과육을 사용하였다.
실험 결과, 상처를 낸 고추 과육에 세로토닌 유도체가 다량으로 검출되다(표 4). 반면, 상처를 내지 않은 고추 과육의 경우에는 세로토닌 유도체가 검출되지 않았다(표 4).
상처를 가한 고추 과육 내 세로토닌 유도체의 함량
세로토닌 유도체 함량(과육 1 g에 함유된 양, ng)
쿠마로일세로토닌 페루로일세로토닌 총함량
무처리(대조구) - - -
상처 처리 500 291 791
<실시예 4>
고추 THT 유전자를 과다발현하는 형질전환 식물의 제조
4-1) 고추 THT 유전자의 클로닝 및 형질전환용 발현 벡터의 제조
고추(Capsicum annuum) THT 유전자를 증폭하기 위하여 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR)을 수행하였다. 상기 PCR은 공지의 고추 THT 유전자의 전장 cDNA(서열번호 3)(Back et al.,Plant Cell Physiol.42, 475-481, 2001)를 주형(template)으로 하여HindIII 제한효소부위(밑줄그음)를 갖는 전방향프라이머 5'-(atcaagcttatggcttctgctcctcaa)-3'(서열번호 1) 및SacI 제한효소부위 (밑줄그음)를 갖는 역방향 프라이머 5'-(gtggagctcctaacagcttcctgcacc)-3'(서열번호 2)를 사용하여 수행하였다. 상기 방법에 의해 생성된 PCR 생성물을HindIII 및SacI으로 절단하고, 겔 정제한 후, 벡터 pBluescript (Strategene사, USA)내의 동일한 제한효소 부위 내로 삽입시켜 삽입된 염기서열의 이상여부를 확인하였다.
고추 유래의 THT 유전자를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 본 출원인의 선출원인 대한민국 특허등록번호 제10-0350929호에서 제조된 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) 프로톡스 유전자를 포함하는 바이너리 벡터 pGA1611:C(기탁번호 KCTC 0692BP)를 사용하였다. 상기 바이너리 벡터 pGA1611:C(기탁번호 KCTC 0692BP)에 포함된 바실러스 섭틸리스 프로톡스 유전자를 제한효소SacI 및HindIII를 이용하여 절단하였다. 이후 상기에서 제조된 PCR 생성물을 제한효소HindIII 및SacI으로 절단하고, 겔 정제한 후 리가아제(ligase)를 사용하여 상기 절단된 부위에 삽입시켜, 고추 THT 전장 유전자를 발현할 수 있는 바이너리 벡터 pGA1611: THT를 제작하였으며, 그 구조를 도 1에 나타내었다. 도 1의 개략도에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서 제조된 바이너리 벡터 pGA1611:THT는 고추 THT 유전자, 상기 유전자의 상류에 기능적으로 연결된 옥수수 유비퀴틴 프로모터(constitutive ubiquitin promoter) 및 선별 표지로 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hygromycin phosphotransferase)를 포함한다.
4-2) 벼의 형질전환 및 재분화
상기 실시예 4-1)에서 제작된 바이너리 벡터 pGA1611:THT를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404(Cat. No. 18313-015, GibcoBRL, 미국)에 도입시켰다. 상기 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 균주를 테르라사이클린 5 ㎍/㎖ 및 하이그로마이신 40 ㎍/㎖을 포함하는 YEP 배지(1%의 Bacto-peptone, 1%의 Bacto-yeast extract 및 0.5%의 NaCl 함유)에서 28℃의 조건으로 하룻밤 동안 배양시켰다. 이 배양물을 원심분리시키고 펠릿들을 동일 부피의 아세토시링곤 100 ㎍/㎖을 함유하는 AA 배지(Hiei et al.,Plant Mol. Biol. 35, 205-218, 1997)에 현탁시켜 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 현탁액을 제조하였다. 벼의 캘러스는 N6 배지에 파종된 벼(품종: 낙동)의 배반으로부터 유도되었다(Rashid et al.,Plant Cell Rep.15; 727-730, 1996; Hiei et al.,Plant Mol. Biol.35, 205-218, 1997). 3 내지 4 주령의 밀집된 벼의 캘러스를 상기 세균 현탁액 중에 3분 동안 침적시킨 다음, 멸균 여과지를 현탁액에 접촉시켜 현탁액을 흡수 및 건조시킴으로써 과량의 균체를 현탁액에서 제거시켰다. 상기 공조배양된 캘러스를 세포탁심(Cefotaxim) 250 ㎍/㎖을 함유하는 멸균수로 세척시켜 잔존 세균을 제거시키고, 50 ㎍/ml 하이그로마이신을 함유하는 선별 배지로 옮겨 배양한 결과 전체의 10-15%의 캘러스가 생존하였다. 상기에서 생존한 하이그로마이신 저항성 캘러스들로부터 잎을 유도하기 위해 재분화 배지(regeneration medium)인 무라시게스쿠그(MS)배지(2 mg/l의 벤질아미노퓨린, 1 mg/l의 나프탈렌아세틱산 및 50 mg/l 하이그로마이신 포함)로 옮겨 28℃에서 3주 동안 배양시켰다. 상기 선별된 캘러스 중 4-8%의 캘러스가 신초(shoot)로 재분화되었다. 이후 뿌리유도배지에 옮겨 완전한 식물체를 획득하였다(Lee et al.,Plant Cell Physiol.41, 743-749, 2000).
또한, 대조군으로 상기의 실험과정 중 고추의 THT 유전자가 삽입되지 않은 pGA1611 벡터로 형질전환시킨 점을 제외한 모든 과정을 동일하게 수행한 형질전환 대조구(transgenic control) 벼를 제작하였다.
4-3) THT 유전자의 도입 확인을 위한 T0세대의 서던 블롯 분석
하이그로마이신 선별 배지로부터 재분화된 형질전환 세포주의 벼 게놈 내로 상기 고추 THT 유전자가 안정하게 도입되었는지 여부와 이의 삽입 수를 측정하기 위하여, 상기에서 제조된 14개 세포주(T8, T9, T10, T12, T13, T14, T16, T17, T18, T19, T20, T21, T22 및 T23)의 형질전환 T0벼, 야생형 대조구 벼 및 형질전환 대조구 벼의 잎으로부터 공지의 방법으로 각각 추출한 게놈 DNA들을HindIII로 분해시키고, 0.8 %(w/v) 아가로스 겔 상에서 전기영동을 실시하여 크기별로 분획화시켰다. 상기 분획을 나일론막(Nylon 66 plus, Pharmacia Biotech.)에 블롯팅 (blotting) 시킨 후,32P-표지된 고추 THT 유전자와 혼성화(hybridization) 시켰다.
프로브(probe) 처리된 트랜스유전자 내에HindIII 부위가 존재하지 않기 때문에, 혼성화된 밴드의 수는 형질전환 식물의 게놈에서 트랜스 유전자의 삽입수와 일치한다. 상기 결과를 도 2에 나타내었다. 야생형 대조구 벼 및 형질전환 대조구 벼에서 추출한 게놈 DNA에서는 혼성화 밴드가 검출되지 않았으며, T8 내지 T23의 세포주 중 T12 및 T20을 제외한 모든 형질전환 세포주에서 추출한 게놈 DNA에서는 각각 5kb 이상 크기의 혼성화 밴드가 검출되었고, 도 2에는 잘 나타나 있지 않지만 T17 세포주에서도 희미한 1개의 밴드가 있음이 확인되었다. 이는 상기 T12 및 T20을 제외한 모든 형질전환 세포주에서, 고추 THT 유전자가 벼의 게놈에 성공적으로 삽입되었음을 나타낸다.
4-4) 하이그로마이신 저항성 벼의 분리
형질전환 벼의 T0세대로부터 T1세대로 트랜스유전자가 안정하게 전달되는지를 확인하기 위하여, 자가수분 볍씨로부터 종자량이 많이 확보된 형질전환벼를 선택하여 T1세대에 대하여 조사하였다. 즉, 6개 세포주의 T0세대 형질전환 벼(T9, T10, T13, T14, T16 및 T17)를 자가수분시켜 제조된 종자(T1세대)를 하이그로마이신 50 ㎍/㎖를 포함하는 무라시게스쿠그(MS) 고형화 배지의 절반 농도에서 현미를 발아시켰을 때 나타나는 각 형질전환 세포주의 하이그로마이신 저항성 개체와 감수성 개체의 분리 비율을 조사하였다. 상기 시험된 형질전환 세포주의 하이그로마이신 저항성 분리 패턴을 하기 표 5에 나타내었다.
그 결과 T9 세포주를 제외한 나머지 세포주들의 하이그로마이신에 대한 저항성 대 감수성의 분리비는 약 3:1이었다. 이는 벼의 게놈에 삽입된 트랜스유전자가 멘델의 법칙을 따라 분리 및 발현됨을 나타낸다. T10 세포주는 서던 블롯에서는 2개의 밴드가 검출되어 15:1 또는 3:1 분리비가 예측되었지만, 실제의 분리비는 약1.5:1로 나타났고, 이 수치는 3:1에 가까워 유전자좌를 1로 표시하였다. 한편, T9 세포주의 하이그로마이신 저항성비의 분리비는 15:1로, 이는 THT 유전자가 벼의 게놈상 서로 다른 위치에 2개 존재함을 나타낸다.
하이그로마이신 저항성 벼의 분리
세포주번호 T0에서의유전자 삽입수(서던 블롯) T1종자의 하이그로마이신 저항성 유전자 좌
저항성 종자수 감수성 종자수
T9 3 132 7 2
T10 2 79 51 1
T13 1 101 34 1
T14 2 104 33 1
T16 2 99 30 1
T17 1 103 31 1
4-5) T1세대의 노던 블롯 분석
형질전환된 벼로부터 종자량이 많이 확보된 세포주의 T1세대에서 고추 THT 유전자의 mRNA가 발현되는지 여부를 확인하기 위하여, 노던 블롯 분석을 이용하여 측정하였다. 상기 실시예 4-4)의 T9 내지 T17 세포주로부터 하이그로마이신 저항성을 갖는 것으로 확인된 T1세대 개체들, 야생형 대조구 벼 및 형질전환 대조구 벼들을 각각 온실에서 재배하였다. TRⅠ 시약(Sigma 사)을 사용하여 재배된 벼의 잎으로부터 추출된 상기 세포주의 전체 RNA를 포름알데히드를 포함한 1% 아가로스 겔상에서 전개 완충액으로 20 mM Mops [3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산] 용액을 사용하여 분획화시켰다. 전개가 완료된 겔을 나일론막에 블롯팅시키고, 전장 고추 THT와 혼성화시키고, 이의 결과를 도 3의 A에 나타내었다.
야생형 대조구 벼(W) 및 형질전환 대조구 벼(TC)에서는 고추 THT 유전자의 mRNA가 발현되지 않은 반면, 형질전환 세포주에서는 고추 THT 유전자의 mRNA가 과다발현됨을 확인하였다. 특히, T9, T10, T14 및 T16 형질전환 세포주에서 가장 많은 발현율을 나타내었다. 상기 결과는 상기 세포주들에서 고추 THT 유전자의 mRNA가 성공적으로 과다발현됨을 나타낸다.
4-6) T1세대의 웨스턴 블롯 분석
T1세대 형질전환 벼의 게놈 내로 삽입된 고추 THT 유전자가 단백질로 안정적으로 발현되는지를 확인하기 위하여, 20 ng의 재조합 THT 단백질을 대조구로 하여 14개 세포주(T8, T9, T10, T12, T13, T14, T16, T17, T18, T19, T20, T21, T22 및 T23)의 형질전환 벼, 야생형 대조구 벼 및 형질전환 대조구 벼에 대하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 측정하였다. 벼 잎 0.2 g을 1 ml 추출버퍼로 추출하고 14,500 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액 50 ㎍을 전기영동으로 분리시킨 다음(SDS-PAGE), 니트로셀루로즈(nitrocellulose) 막에 블롯팅시키고, THT 항체로 면역반응시켰다(Back et al.,Plant Cell Physiol. 42, 475-481, 2001). 밴드 검출은 웨스턴 블롯팅 키트(Boehringer Manheim 사, 독일)을 이용하였다. 그 결과를 도 3의 B에 나타내었다.
야생형 대조구 벼(W) 및 형질전환 대조구 벼(TC)의 경우, 고추 THT 유전자의 삽입과 mRNA 발현이 관찰되지 않았으므로 예상대로 그 단백질 발현 역시 검출되지 않았다. 본 발명의 실시예에서 제조된 형질전환 벼의 세포주 중 8개의 세포주(T9, T10, T13, T14, T16, T17, T18 및 T19)의 형질전환 벼에서만 고추 THT 단백질의 발현이 확인되었다. 또한, THT 유전자가 삽입되지 않은 2개 세포주(T12 및 T20)에서는 예상대로 단백질 발현이 검출되지 않았다. 한편, 서던 블롯 분석에서 THT 유전자가 삽입되었다고 확인된 일부 형질전환 세포주(T8, T21, T22 및 T23번)에서는 THT 단백질 발현이 관찰되지 않았다.
4-7) T2분리세대의 THT 효소활성 측정
상기 실시예에서 웨스턴 블롯 분석을 통해 T1세대의 형질전환 벼에서 THT 단백질 발현 여부를 확인하였으나, 상기 단백질이 T2세대 벼에서도 안정적으로 발현되고 효소 활성을 가지는지 여부를 조사하기 위하여, THT 효소의 기질인 페루로일코에이(feruloyl-CoA) 및 티라민(tyramine)을 사용하여 효소활성을 측정하였다. 실험 대상으로 6개 세포주(T9, T10, T13, T14, T16 및 T17)의 형질전환 벼를 자가수분시켜 제조된 종자(T1세대) 중 상기 실시예 4-4)에서 하이그로마이신 저항성을 갖는 것으로 확인된 것을 자가수분시켜 제조된 벼의 종자(T2세대)를 사용하였다. 상기 T2세대 벼에서 얻은 단백질 추출물을 THT 효소의 기질인 페루로일코에이(feruloyl-CoA) 및 티라민(tyramine)이 포함된 반응 혼합물에 첨가하여, THT 효소의 생성물인 페루로일티라민의 양을 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였다. THT 효소의 활성도는 고속액체크로마토그래피 분석 결과 얻어진 피크 넓이를 pkat(pico katal) 단위로 환산하여 도 4에 나타내었다. 야생형 대조구 벼 및 형질전환 대조구 벼의 경우 THT 효소 활성이 전혀 나타나지 않았다. 반면, THT 유전자가 형질전환된 T2세대 벼의 경우, 세포주 간에 약간의 차이는 있지만 THT 효소 활성을 나타내었다. 이는 형질전환 벼 내에서 THT 유전자가 그 단백질로 안정적으로 발현되고, 상기 발현된 효소는 활성을 나타냄을 의미한다.
<실시예 5>
THT 유전자를 과다발현하는 형질전환 벼의 세로토닌 유도체 생합성
5-1) 일반배지에서 성장한 형질전환 벼의 경엽 내 세로토닌 유도체 생합성
무라시게스쿠그(MS) 고형화 배지에서(Duchefa Biochemie사, 네덜란드) 성장한 T2세대 형질전환 벼의 경엽 내에 세로토닌 유도체가 생합성 되었는지의 여부를 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 통하여 분석하였다. 무라시게스쿠그(MS) 고형화 배지에서 성장된(Duchefa Biochemie 사, 네델란드) T14 세포주의 T2세대 형질전환 벼 및 야생형 대조구 벼의 잎 0.3 g을 각각 채취하여 상기 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 각각 하이드록시신나모일 아민류 화합물을 추출하고 고속액체크로마토그래피로 분석하였다.
그 결과를 도 5의 B 및 도 5의 C에 나타내었다. T2세대 형질전환 벼 및 야생형 대조구 벼 모두에서 세로토닌 유도체 뿐 만 아니라 티라민 유도체와 같은 하이드록시신나모일 아민류 화합물은 거의 발견되지 않았다.
5-2) 논에서 재배한 형질전환 벼의 종자 내 세로토닌 유도체 생합성
T2세대 형질전환 벼의 종자를 파종하여, 20일 육묘한 후 재식밀도 30cm× 15 cm 간격으로 1본씩 논에 이앙하였다. 논에서 재배한 T2세대 형질전환 벼의 종자 내에 세로토닌 유도체가 생합성 되었는지의 여부를 상기 실시예 1-1)과 동일하게 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 통하여 분석하였다.
실험 결과, 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 첨가하지 않은 논에서 재배한 형질전환 벼의 종자 내에 세로토닌 유도체가 다량으로 검출되었다. 즉, 종자 1 g에 쿠마로일세로토닌이 276 ng, 페루로일세로토닌이 413 ng으로 검출되어 총 세로토닌 유도체 함량이 689 ng으로 나타났다. 따라서, 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리하지 않고 THT 유전자가 과다발현되도록 식물을 형질전환시키는 것만으로도 식물의 종자 내에 세로토닌 유도체가 생합성 되도록 할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 6>
세로토닌 유도체 생합성 유도물질의 처리에 따른 THT 유전자를 과다발현하는 형질전환 벼의 세로토닌 유도체 생합성
6-1) 티라민 또는 쿠마르산이 첨가된 배지에서 성장된 형질전환 벼의 경엽 내에 생성된 세로토닌 유도체 함량
세로토닌 생성 유도물질로서 티라민 또는 쿠마르산이 첨가된 배지에서 THT 과다발현 벼가 성장되는 경우, 세로토닌 유도체가 합성되는지 여부를 조사하였다. 상기 T2세대형질전환 벼를 고추 THT 효소의 기질인 티라민(tyramine) 또는 쿠마르산(coumaric acid)이 50 μM 농도로 첨가된 무라시게스쿠그(MS) 배지(Duchefa Biochemie사, 네덜란드)에 치상하여 무균배양하였다. 상기 배지에서 12시간 빛 상태 및 12시간 암 상태를 반복하여 2주간 배양한 T2세대 형질전환 벼 및 야생형 대조구 벼의 잎으로부터 상기 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 각각 하이드록시신나모일 아민류 화합물을 추출하고 고속액체크로마토그래피로 분석하였다.
실험 결과, 티라민 또는 쿠마르산이 첨가된 배지에서 성장된 벼의 추출물로부터 체류시간(retention time)이 각각 8.5분(CT) 및 9.6분(FT)인 쿠마로일티라민 및 페루로일티라민은 검출되지 않았다. 체류시간이 각각 6.4분 및 7.2분인 쿠마로일세로토닌과 페루로일세로토닌이 검출되었다.
이로써 형질전환 벼가 티라민 또는 쿠마르산이 첨가된 배지에서 성장되는 경우, 페루로일세로토닌 및 쿠마로일세로토닌과 같은 하이드록시신나모일 아민류 화합물이 식물체 내에서 생합성됨을 확인하였으며, 50 μM 티라민이 함유된 세로토닌 유도체 배지에서 성장시킨 경우의 결과를 표 6에 나타내었다. 상기 결과에 의하여 세포주에 따라 세로토닌 유도체 합성량은 다소 달랐지만 모든 세포주에서 세로토닌 유도체가 합성되었으며, 평균적으로 경엽 1 g 당 총 174 ㎍ 정도의 세로토닌 유도체가 합성됨을 확인하였다. 대조구에서는 경엽 1 g 당 총 1 ㎍ 정도의 미량의 세로토닌 유도체가 검출되었다.
티라민 첨가된 배지에서 성장된 형질전환 벼의 경엽에 함유된 세로토닌 유도체 함량
쿠마로일세로토닌(㎍/g 경엽) 페루로일세로토닌(㎍/g 경엽) 총 세로토닌유도체 함량
야생형대조구(W) 0 1 1
형질전환대조구(TC) 0 1 1
형질전환벼(세포주) T9 24 24 48
T10 86 114 200
T13 224 200 424
T14 46 78 124
T16 50 70 120
T17 36 92 128
평균 78 96 174
6-2) 다양한 종류의 세로토닌 유도체 생합성 유도물질의 처리에 따른 형질전환 벼의 종자 내에 생성된 세로토닌 유도체 함량 비교
T2세대 형질전환 벼 중 T14를 토양에 치상한 다음 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 토양에 처리하여 재배한 후 형질전환 벼 종자에 함유된 세로토닌 유도체의 함량을 분석하였다.
세로토닌 유도체 생합성 유도물질로는 티라민, 트립타민, 신남산, 쿠마르산, 카페익산 및 페루릭산을 사용하였으며, 상기 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 물에 녹여 각각 100 μM의 농도로 제조한 다음 재배면적 당 300,000 L/ha의 처리량으로 출수 40 일경의 벼가 자라고 있는 토양에 처리하여 20 일간 재배하였다.
상기에서 재배한 벼의 종자를 회수하고 상기 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 세로토닌 유도체의 함량을 분석하였다. 분석한 결과는 상기 실시예 1-1)의 야생 벼의 종자에 함유된 세로토닌 유도체의 함량과 비교하였다.
실험 결과, 형질전환 벼의 종자 내에 함유된 세로토닌 유도체의 함량은 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 처리한 경우 더 증가함을 알 수 있었다. 특히, 티라민을 첨가한 배지에서 배양한 벼의 종자 내에 함유된 세로토닌 유도체 함량이 가장 높은 것으로 나타났다(표 7).
세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 첨가한 배지에서 배양한 형질전환 벼의 종자 내에 함유된 세로토닌 유도체 함량
세로토닌 유도체생합성 유도물질 세로토닌 유도체 함량(종자 1 g에 함유된 양, ng)
쿠마로일세로토닌 페루로일세로토닌 총함량
무처리 276 413 689
티라민 처리 314 684 998
트립타민 처리 376 382 758
신남산 처리 403 406 809
쿠마르산 처리 325 599 924
카페익산 처리 368 430 798
페루릭산 처리 313 537 850
또한, 상기 형질전환 벼의 종자 내에 함유된 세로토닌 유도체 함량을 상기 실시예 1-1)의 야생 벼의 종자 내에 함유된 세로토닌 유도체 함량과 비교한 결과, 형질전환 벼의 종자 내 세로토닌 유도체가 야생 벼에 비해 6배∼25배 더 많이 생성되었음을 알 수 있었다.
6-3) 세로토닌의 처리에 따른 형질전환 벼의 경엽 내에 생성된 세로토닌 유도체 함량 비교
T2세대 형질전환 벼 중 T14를 토양에 치상한 다음 세로토닌을 경엽에 분무처리하여 재배한 후 형질전환 벼 종자에 함유된 세로토닌 유도체의 함량을 분석하였다.
즉, 세로토닌을 물에 녹여 1mM의 농도로 제조한 용액을 출수 40 일경의 T14의 경엽에 재배면적 당 300,000 L/ha의 처리량으로 분무 처리한 후 20 일간 재배하였다. 상기에서 재배한 벼의 종자를 회수하고 상기 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 세로토닌 유도체의 함량을 분석하였다.
실험 결과, 세로토닌을 처리한 벼의 경엽 1 g 당 2 ㎍정도의 페루로일세로토닌이 검출되었다.
<실시예 7>
세로토닌이 고추 THT 효소의 기질로 이용되는지 여부 조사
고추 THT 효소가 세로토닌(serotonin)을 아민 기질로 이용하는지를 확인하기 위하여, 카복실 말단에 6개의 히스티딘이 부착된 고추 THT 단백질을 친화성크로마토그래피(affinity chromatography) 방법으로 정제한 THT 효소(Back et al.,Plant Cell Physiol. 42, 475-481, 2001)를 사용하여 실험하였다. 1 ㎍의 상기 정제된 고추 THT 효소, 1 mM의 페루로일코에이(feruloyl-CoA)(시그마 알드리치, 한국) 및 10 mM의 세로토닌(시그마 알드리치, 한국)을 함께 첨가한 다음 10 분간 동안 30℃에서 효소반응 시켰다. 반응이 완료된 후 반응산물을 고속액체크로마토그래피로 분석하였다.
실험 결과, 상기에서 합성된 물질은 7.2분의 체류시간을 보인 페루로일세로토닌과 정확하게 일치하는 것으로 확인되었다(도 5의 E). 이는 고추 THT 효소가 세로토닌을 아민 기질로 이용하여 페루로일세로토닌을 합성하는 특징을 지니고 있음을 보여 준다. 또한, 쿠마로일코에이와 세로토닌을 기질로 제공하였을 때도 고추 THT 효소가 쿠마로일세로토닌을 합성함을 확인하였다(결과 미도시).
본 발명에 따른 방법에 의해 공지의 항암, 항산화 및 뼈 형성 촉진 활성을 갖는 페루로일세로토닌 및 쿠마로일세로토닌과 같은 세로토닌 유도체를 생합성할 수 있다. 상기의 방법에 의해 합성된 세로토닌 유도체는 정제되어 이용되거나 식용 가능한 식물 그 자체로 이용될 수 있다.
<110> CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for biosynthesizing the serotonin derivatives in plants <150> KR2003-0041041 <151> 2003-06-24 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR of a THT gene isolated from Capsicum annuum <400> 1 atcaagctta tggcttctgc tcctcaa 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for PCR of a THT gene isolated from Capsicum annuum <400> 2 gtggagctcc taacagcttc ctgcacc 27 <210> 3 <211> 753 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> gene <222> (1)..(753) <223> a full-length THT gene isolated from Capsicum annuum <400> 3 atggcttctg ctcctcaacc accaactcta tctgaaaaaa ccactaatct ctcaccggaa 60 aacgacaatg ttacgatcac cggaaagata tatacaagag tccgccttgc tacaaaatct 120 gatctgcacc atgcatacca gttgttttac caaatccacg cataccataa ccaatttcat 180 ttattcaaag caacagagtc ctccttatcg gacttgttct ttaaagaaaa tcctcttccc 240 cttttctacg gaccaaccct acttctactc gaagtctccc cgaccgcttt tactgaaccc 300 aaaaataaca aggacgaagg gttcaaaccc gtctttacag cgctcgacct taaatttcct 360 gtcgtggaag gacaagttga ggagtttcgg tccaaatatg atgatggaac cgataaacgt 420 gatgtgttca tcgcgggata tgcttacttt tttgctagtt attcactctt cgggaacgac 480 aaaccgggga tccatttcga cagtctttac ttcagggaaa gctatagaaa attgggaatg 540 ggaaaattgt tgtttggaac tgttgcgtct attgctgcga acaatgggtt tgctgcggtg 600 gagggaattg tagcagtttg gaataaaaag tcatatgatt tttatgtgag tatgggtgtt 660 gaaatgcatg atgactttag gtttggcaaa ttggacggtg aaaatcttca aaagtacgct 720 gataaggaga aaaatggtgc aggaagctgt tag 753

Claims (13)

  1. 식물에 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 식물의 생장 배지에 첨가하거나 토양에 처리하거나 경엽에 처리하거나 과육에 처리하는 방법 중에서 선택된 어느 하나의 방법으로 처리하는 단계를 포함하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세로토닌 유도체 생합성 유도물질은 방향성 아민류 화합물, 하이드록시신남산 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 방향성 아민류 화합물이 티라민(tyramine), 트립타민 (tryptamine), 세로토닌(serotonin), 도파민(dopamine), 노르아드레날린(noradren aline) 및 옥토파민(octopamine)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 하이드록시신남산 화합물이 쿠마르산(coumaric acid), 카페익산(caffeic acid), 페루릭산(ferulic acid), 신남산(cinnamic acid) 및 시납산(sinapic acid)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법.
  5. 식물에서 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(N-(hydroxycinna moyl) transferase)의 과다발현을 유도하는 단계를 포함하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(N-(hydroxycinnamoyl) transferase)의 과다발현은 식물의 과육에 상처를 가하는 것에 의해 유도하는 것임을 특징으로 하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(N-(hydroxycinnamoyl) transferase)의 과다발현은 식물에 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(tyramine N-(hydroxycinnamoyl) transferase)를 암호화하는 유전자를 도입하는 것에 의해 유도하는 것임을 특징으로 하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자는 고추(Capsicum annum) 유래 유전자인 것을 특징으로 하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 고추(Capsicum annuum) 유래 cDNA인 것을 특징으로 하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(N-(hydroxycinnamoyl) transferase)의 과다발현이 유도된 식물에 상기 세로토닌 유도체 생합성 유도물질을 공급하는 단계를 추가로 포함하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세로토닌 유도체는 페루로일세로토닌 또는 쿠마로일세로토닌인 것을 특징으로 하는 세로토닌 유도체의 생합성 방법.
  12. 티라민 하이드록시신나모일 트랜스퍼라제(N-(hydroxycinnamoyl) transferase )를 암호화하는 유전자가 도입되고, 조직배양을 통해 재분화되며 세로토닌 유도체가 생합성된 형질전환 식물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 식물이 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 고추, 배추, 무, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 형질전환 식물.
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KR100858002B1 (ko) * 2007-02-23 2008-09-10 전남대학교산학협력단 유인제로서 메탄올을 이용하는 식물에서의페닐프로파노이드 아미드 화합물의 생합성 유도제 및생합성 방법
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