JP2023532382A - クロロゲン酸のイソクロロゲン酸への変換のための酵素 - Google Patents

クロロゲン酸のイソクロロゲン酸への変換のための酵素 Download PDF

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Abstract

本発明は、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるタンパク質であり、該タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、この配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列、若しくはこの配列のフラグメントを含む、又はからなる。また本発明は、クロロゲン酸からイソクロロゲン酸を生産する方法であり、前記タンパク質の生産及びクロロゲン酸との接触を含む。【選択図】図１

Description

本発明の１つの目的は、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することを可能にする酵素活性をもつタンパク質である。また、本発明のもう１つの目的は、本発明に係るタンパク質を生産することを含む、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換する方法、及びクロロゲン酸からイソクロロゲン酸の生産のための、その使用である。したがって、本発明は、物質を合成するための組換え酵素の生産及び使用の分野に属する。
イソクロロゲン酸、又は３，５－ジカフェオイルキナ酸又は３，５－ＤＣＱは、現在、多くの研究の対象となっており、いくつかの薬理学的特性は、特にアルツハイマー病や癌、ウイルス性疾患などの疾患の予防及び／又は治療並びに化粧品への応用の分野で重要な発展が指摘される。３，５－ＤＣＱは植物、特にサツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）から精製することができる（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ， “Ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｓｉｘｔｅｅｎ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ”； Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｓｏｃ． Ｈｏｒｔ． Ｓｃｉ． ， １３３（４）：４９２－５００， ２００８）。しかしながら、３，５－ＤＣＱは比較的少量でしか合成されないため、植物からのその精製には手間と費用がかかることから、広く使用するには適していない。さらに、異なるカフェオイルキナ酸異性体が同じ植物細胞によって生産される可能性があり、これは他の異性体と比較して、３，５－ＤＣＱを単離する追加工程をさらに意味する。
したがって、信頼性があり、容易で、安価な方法で大量のイソクロロゲン酸を得る手段が必要である。
ＷＯ２０１３／１７８７０５として公開されている国際出願は、クロロゲン酸（ＣＧＡ）をジ、トリ又はテトラカフェオイルキナ酸に変換するための酵素を記載している。前記酵素の機能は、ＨＣＴ（ヒドロキシシンナモイル－ＣｏＡシキミ酸／キナ酸ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ）又はＨＱＴ（ヒドロキシシンナモイル－ＣｏＡキナ酸ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ）タンパク質の機能に近く、より一般にはＢＡＨＤアシルトランスフェラーゼのファミリーに属する。
Ｋｏｊｉｍａ ａｎｄ Ｋｏｎｄｏ（“Ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｒｏｏｔ ｗｈｉｃｈ ｃａｔａｌｙｓｅｓ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ， ３－ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ， ｔｏ ｉｓｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ， ３，５－ ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ”， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ４９（８）， ２４６７－９， １９８５）は、サツマイモ抽出物中に存在し、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる、機能が正確に特定されておらず、構造が開示されていない酵素を記載している。
Ｖｉｌｌｅｇａｓ ｅｔ ａｌ（“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｒｏｏｔｓ”， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２６（６）， １５７７－８１， １９８７）は、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるクロロゲン酸カフェオイルトランスフェラーゼを記載している。
Ｔｅｕｔｓｃｈｂｅｉｎ ｅｔ ａｌ（“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｉｐａｓｅ－ｌｉｋｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ （Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ”， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２８５（４９）， ｐｐ． ３８３７４－８１， ２０１０）は、トマト抽出物中のクロロゲン酸グルカレートカフェオイルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）の同定を記載している。
本発明者らは、今般、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）の抽出物から、ＧＤＳＬリパーゼ／エステラーゼのファミリーに属する酵素を単離及びクローニングし、これはそれらのアミノ酸配列内に次の４つのアミノ酸：グリシン（Ｇ）－アスパラギン酸（Ｄ）－セリン（Ｓ）－ロイシン（Ｌ）の連結物の存在により特徴付けられる。この酵素は、ＩｂＧＤＳＬ、すなわち、「サツマイモのＧＤＳＬ酵素」と称される。本発明者らはまた、この酵素がクロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができ、高い基質特異性があり、排他的又はほぼ排他的な３，５－ＤＣＱ生産を行うことができることも示した。
本発明は、本発明によるＧＤＳＬエステラーゼ／リパーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターによって形質転換され、適当な培養条件下に置かれた宿主細胞の形質転換後にこの酵素が前記宿主細胞の総タンパク質抽出物中に検出されることから、前記の要件を満たす。さらに、本発明者らは、本発明による前記酵素が、単離された形態で、又は前記宿主細胞の培養培地中に存在する場合に機能的であることを実証した。本発明によるＧＤＳＬエステラーゼ／リパーゼは、３，５－ＤＣＱの形成を排他的に触媒して他のいずれの異性体も排除する。最後に、本発明者らは、本発明によるＧＤＳＬエステラーゼ／リパーゼが、植物抽出物中に存在するクロロゲン酸の３，５－ＤＣＱへの変換を効率的に触媒することを示した。
したがって、本発明の第１の目的は、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるタンパク質であって、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質である。本発明の第２の目的は、クロロゲン酸からイソクロロゲン酸（３，５－ＤＣＱ）を生産するための方法であって、この方法は、本発明に係るタンパク質を実施する。本発明の第３の目的は、クロロゲン酸からイソクロロゲン酸（３，５－ＤＣＱ）を生産するための本発明に係るタンパク質の使用である。
第１の目的によれば、本発明は、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質であって、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる、タンパク質である。
この第１の目的の１つの特別な態様によれば、本発明は、遺伝物質が改変された細胞によって生産されたタンパク質である、組換えタンパク質である。
「含む」とは、その要素が存在するが、他の要素も存在し得ることを意味する。アミノ酸配列の場合、問題の配列は、前記配列のＮ末端側又はＣ末端側に追加のアミノ酸を特にさらに含んでもよく、これらの追加のアミノ酸は、目的のタンパク質の特性決定及び／又は精製を特に容易にすることを可能にする。ヌクレオチド配列の場合、問題の配列は、特に前記配列の３’側又は５’側に追加のヌクレオチドをさらに含み得る。
「からなる」とは、述べられたもの以外の要素が存在しないことを意味する。ただし、この制限には、目的のタンパク質の可能性のある翻訳後修飾が含まれる。
「少なくとも８０％の同一性を有する」とは、最適な全体的アラインメントの後、すなわち、２配列間の全体的なアラインメントにより、それらの間に最高の同一性のパーセンテージが得られた後に、前記配列が少なくとも８０％の同一性を有することを意味する。２配列の最適なグローバルアラインメントは、特に、当業者に周知のニードルマン・ヴンシュアルゴリズムに従って実行することができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， “Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ４８（３）：４４３－５３）。本発明に係るタンパク質は、最適な全体的アラインメントの後に配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、有利には少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はからなる。有利には、本発明に係るタンパク質は、最適なグローバルアラインメントの後に配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はからなる。
１つの特定の態様によれば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる本発明に係るタンパク質の中で、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選択される少なくとも１つの配列を含むタンパク質が好ましい。
別の特定の態様によれば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる本発明に係るタンパク質の中で、
１１番の位置にセリンアミノ酸、及び／又は
３１７番の位置にアスパラギン酸アミノ酸、及び／又は
１５３番の位置にアスパラギン酸アミノ酸、及び／又は
３２０番の位置にヒスチジンアミノ酸
を含むタンパク質が好ましい。
さらなる特定の態様によれば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる本発明に係るタンパク質の中で、１１番の位置にセリンアミノ酸、３１７番の位置にアスパラギン酸アミノ酸、１５３番の位置にアスパラギン酸アミノ酸、３２０番の位置にヒスチジンアミノ酸を含むタンパク質が好ましい。
別の特定の態様によれば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列フラグメントを含み、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる本発明に係るタンパク質の中で、１１番の位置にセリンアミノ酸、及び／又は３１７番の位置にアスパラギン酸アミノ酸、及び／又は１５３番の位置にアスパラギン酸アミノ酸、及び／又は３２０番の位置にヒスチジンアミノ酸を含むタンパク質が好ましい。
この態様によれば、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸フラグメントを含む、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる、本発明に係るタンパク質は、少なくとも５０のアミノ酸、好ましくは、少なくとも１００のアミノ酸、及びより好ましくは、少なくとも１５０のアミノ酸を含む。
「クロロゲン酸」とは、カフェ酸とキナ酸の単純エステルであり、また、カフェオイルキナ酸又は以下の式（Ｉ）で表されるｔｒａｎｓ－５－Ｏ－カフェオイル－Ｄ－キナ酸を意味する。
ジカフェオイルキナ酸はＤＣＱと略され、キナ酸分子で構成されているジエステルであり、４つのアルコール官能基のうち２つがカフェ酸分子でエステル化されている。ＤＣＱの一般式は以下の（II）で表され、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立して、カフェオイル基又は水素原子であり、ただし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも２つは水素原子ではない。
「イソクロロゲン酸」とは、また、３，５－Ｏ－ジカフェオイルキナ酸又は「３，５－ＤＣＱ」といわれ、アルコール官能基３及び５がカフェ酸分子でエステル化されているキナ酸分子で構成されているジエステルであり、以下の（III）で表される。３，５－ＤＣＱは、天然に存在しており、特にサツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）の抽出物に存在する。
「クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる」とは、図１に記載されている反応スキームに従い、適合した反応条件下に置かれた際に２つのクロロゲン酸分子の縮合によってクロロゲン酸からイソクロロゲン酸への形成を触媒することができるタンパク質を意味する。
より詳しくは、本発明に係るタンパク質は、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に主として、望ましくは例外なく、又はほぼ例外なく変換することができる。
さらに詳しくは、本発明に係るタンパク質の、上で定義された触媒活性は、以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ又は４つを満たす。
ａ）６０～２４０ナノモル・ｓ－１）のＶｍａｘ（最大初速度）、ｂ）２～５ｍＭのＫｍ（ミカエリス定数）（ＣＧＡに関して）、ｃ）６～６．６の最適作用ｐＨ；ｄ）３９～４１℃の最適作用温度。
特には、本発明に係るタンパク質の、上で定義された触媒活性は、以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ又は４つを満たす。
ａ）７．１８マイクロモル・ｍｉｎ－１（すなわち、１２０ナノモル・ｓ－１）のＶｍａｘ（最大初速度）；ｂ）３．５ｍＭのＫｍ（ミカエリス定数）（ＣＧＡに関して）；ｃ）６．３の最適作用ｐＨ；ｄ）３９．９℃の最適作用温度。
より詳しい態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号７の配列を含む配列、から選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質であって、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる、タンパク質である。
より詳しくは、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる、タンパク質であって、前記タンパク質は、いわゆる「ＧＤＳＬエステラーゼ／リパーゼ」酵素、特に、サツマイモ属の「ＧＤＳＬエステラーゼ／リパーゼ」酵素、より詳しくは、サツマイモの「ＧＤＳＬエステラーゼ／リパーゼ」酵素、並びにナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、及びアカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）の「ＧＤＳＬエステラーゼ／リパーゼ」酵素から選択される。
さらにより詳しくは、本発明は、選択された配列番号１のアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質であって、前記タンパク質は、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができ、サツマイモのＧＤＳＬエステラーゼ／リパーゼ酵素から選択される。
別の特定の態様によれば、本発明の目的は、本発明に係るタンパク質をコードする単離された核酸分子である。
より詳しくは、本発明の目的は、本発明に係るタンパク質をコードする単離された核酸分子であって、前記核酸分子は、配列番号２及び配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択される核酸配列を含む、又はからなる。 遺伝子コードの縮重により、異なる核酸配列が本発明に係るタンパク質をコードすることができる。本発明に係るタンパク質を生産するために選択された宿主に応じて、遺伝子コードの縮重は、宿主タンパク質中の所望するタンパク質の発現を最適化するため、核酸配列のコドンを、好ましくは選択された宿主で発見されたコドン使用頻度に適合させるために使用し得る。１つの特定の宿主細胞、例えば、酵母細胞や植物細胞で組換えタンパク質の生産を希望する当業者は、容易に利用可能なコドン最適化ソフトウェアのおかげで、簡単に最適コドンにアクセスすることができる。
さらにより詳しい態様によれば、本発明の目的は、本発明に係る少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの分子がそれぞれ所与の宿主細胞での前記タンパク質の発現に必要な手段の制御下に置かれている組換えベクター である。そのようなベクターには、特には、プラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バイナリー型ベクター（ｐＢＩＮ、ｐＧＷ）、及び選択した宿主細胞の機能として、あらゆるタイプの適当なベクターを選択し得る。宿主細胞の前記タンパク質の発現に必要な前記手段は、当業者によく知られている。「宿主細胞の前記タンパク質の発現に必要な手段」とは、前記タンパク質を得られるようにするあらゆる手段を意味し、特に、プロモーター、転写ターミネーター、複製開始点、及び可能な選択マーカーであり、前記手段は、所望するタンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作的に関係している。本発明に係るベクターは、さらに 、生産されたタンパク質の宿主細胞の培養培地への輸送を確実にするための手段をコードするヌクレオチド配列、及び／又は、生産されたタンパク質の精製を確実にするための手段をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。そのような手段は、当業者によく知られており、それゆえ、それらを容易に選択し、機能的なやり方で、前記ヌクレオチド配列を挿入することができる。前記タンパク質の精製を確実に行うため、公知手段の１つは、ヒスチジンタグ、又は一連のヒスチジンアミノ酸からなる。
より詳しくは、本発明の１つの目的は、本発明に係る少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの分子がそれぞれ酵母宿主細胞又は植物宿主細胞での前記タンパク質の発現に必要な手段の制御下に置かれている組換えベクターである。
酵母宿主細胞での前記タンパク質の発現に必要な手段は当業者によく知られており、それらは特に、ThermoFisher companyにより市販されているｐＰＩＣＺａ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯＸ８１５ベクターに存在する。
植物宿主細胞、特にタバコ、米、トマト、又は食虫植物細胞のような外来タンパク質の産生に通常使用される植物細胞での前記タンパク質の発現に必要な手段も、当業者によく知られている。
別の詳しい態様によれば、本発明の１つの目的は、本発明に係る少なくとも１つの単離された核酸分子、又は本発明に係る、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの分子がそれぞれ宿主細胞での前記タンパク質の発現に必要な手段の制御下に置かれている少なくとも１つの組換えベクターを含む宿主細胞である。
さらに詳しくは、本発明は、酵母細胞、特に、ピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、ヤロウイア・リポリティカ、コマガタエラ属細菌、及びクルイベロマイセス・ラクチス、好ましくはピキア・パストリス株の酵母細胞から選択される宿主細胞である。
別の詳しい態様によれば、本発明は、植物細胞、特に、ベンサミアナタバコ、サツマイモ、タバコ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、米、アラビカコーヒーノキ、トマト、キク科（アザミ、アーティチョーク）などから選択される宿主細胞である。
別の詳しい態様によれば、本発明は、本発明に係る少なくとも１つの単離された核酸分子、本発明に係る少なくとも１つの核酸分子を含む組換えベクター、又は本発明に係る少なくとも１つの植物宿主細胞を含む、トランスジェニック植物である。
好ましくは、本発明は、本発明に係る少なくとも１つの単離された核酸分子、本発明に係る少なくとも１つの核酸分子を含む組換えベクター、又は本発明に係る少なくとも１つのベンサミアナタバコ、サツマイモ、タバコ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、米、アラビカコーヒーノキ、トマト、又はキク科の宿主細胞を含む、トランスジェニック植物である。
第２の目的によれば、本発明は、イソクロロゲン酸を生産するための方法であって、適当な反応条件下で、クロロゲン酸と、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質であって、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるタンパク質とを接触させて、イソクロロゲン酸に富む組成物を得ることを含む、方法である。
１つの詳しい態様によれば、本発明は、イソクロロゲン酸を生産するための方法であって、適当な反応条件下で、クロロゲン酸と、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質であって、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるタンパク質とを接触させて、イソクロロゲン酸に富む組成物を得ることを含む、方法であって、
前記方法は、適当な培養培地中及び適当な条件下で、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質を発現することができる宿主細胞を培養する前工程であって、生産された前記タンパク質は任意選択により精製され、かつ／又は前記クロロゲン酸は単離された形態で、又は組成物中に存在し、前記組成物は特に植物抽出物である前工程、及び／又は
反応中に生産された前記イソクロロゲン酸を単離する次工程
をさらに含む、方法である。
１つの詳しい態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、前記タンパク質を、クロロゲン酸と接触させる前に精製する、方法である。前記精製は、当業者に知られている任意の手段により行われる。
別の詳しい態様によれば、本発明は、前記タンパク質をクロロゲン酸と接触させるときに、前記タンパク質は、前記タンパク質を生産した組換え宿主細胞の組成物又は混合物、特に培養培地、又は上清中に存在する方法である。
より詳しくは、この第２の目的によれば、本発明は、適当な培養培地中及び適当な条件下で、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質を発現することができる宿主細胞を培養する前工程をさらに含む、イソクロロゲン酸を生産するための方法である。
「適当な反応条件」とは、２つのＣＧＡ分子の縮合により３，５－ＤＣＱとキナ酸（ＱＡ）の形成を触媒する、ＩｂＧＤＳＬにより行われる酵素反応を実施することを可能にする各種のパラメータを意味する。前記反応の継続時間は、好ましくは４時間以上、好ましくは４～６０時間、好ましくは５０時間である。前記反応のｐＨは５～７、好ましくは６±０．５である。前記反応の温度は、３０～４０℃、好ましくは３５℃±５℃である。植物抽出物の体積当たりのＧＤＳＬ濃度は、０．５ｍｇ／Ｌ～１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは４．２ｍｇＧＤＳＬ／Ｌ±３．４である。
この第２の目的の別の詳しい態様によれば、本発明は、反応中に生産されたイソクロロゲン酸を単離する次工程をさらに含む、イソクロロゲン酸を生産するための方法である。
この第２の目的のより詳しい態様によれば、本発明は、イソクロロゲン酸を生産するための方法であって、以下の工程：
ｉ）クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるタンパク質を発現させるために、適当な培養培地中及び適当な条件下で、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質を発現することができる宿主細胞の培養、
ii）適当な反応条件下で、工程ｉ）で発現されたタンパク質と、クロロゲン酸との接触、及び
iii）工程ii）の反応中に生産されたイソクロロゲン酸の単離、を含む方法である。
第２の目的に対する本発明に係る方法においては、前記クロロゲン酸は、単離体で存在又は組成物中に存在し、該組成物は特に植物抽出物である。「植物抽出物」とは、発酵、浸漬、煮出し、又は煎じ出しによる、植物、又は少なくとも植物の一部の活性成分を抽出した結果物を意味する。前記植物抽出物は、特に液体又は粉末の形で添加され得る。好ましくは、本発明に係る前記方法においては、植物抽出物は、少なくとも５％のＣＧＡを含む。そのような植物抽出物は、コーヒー、ブルーベリー、ヒマワリ、ゴボウ、チコリー、アーティチョーク、ビワ、プルーン、ミント、ニンジン、ジャガイモ、リンゴ、及びセイヨウナシの植物抽出物から選択し得る。
さらに本発明は、イソクロロゲン酸を生産するための方法であって、以下の工程：
ｉ）クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるタンパク質を発現させるために、適当な培養培地中及び適当な条件下で、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質を発現することができる宿主細胞の培養、
ii）適当な反応条件下で、工程ｉ）で発現されたタンパク質と、クロロゲン酸との接触、及び
iii）工程ii）の反応中に生産されたイソクロロゲン酸の単離、を含む方法である。
詳しい態様によれば、本発明に係るイソクロロゲン酸を生産するための方法は、
以下の工程：
ｉ）クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるタンパク質を発現させるために、適当な培養培地中及び適当な条件下で、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質を発現することができるピキア・パストリス宿主細胞の培養であって、前記タンパク質は生産され、次いで、Ｐ．パストリス細胞の培養上清中に輸送される培養、
ii）適当な反応条件下で、工程ｉ）で発現されたタンパク質と、グリーンコーヒー抽出物中に存在するクロロゲン酸との接触、及び
iii）工程ii）の反応中に生産されたイソクロロゲン酸の単離、を含む。
別の詳しい態様によれば、本発明に係るイソクロロゲン酸を生産するための方法は、
以下の工程：
・ 適当な反応条件下で、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができ、かつ、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質と、グリーンコーヒー抽出物中に存在するクロロゲン酸との接触、及び
・先行する反応の反応中に生産されたイソクロロゲン酸の単離、を含む。
「グリーンコーヒー」とは、調理又は焙煎する前のコーヒー属の植物の豆、特にロブスタコーヒーノキ（Coffea canephora）又はアラビカコーヒーノキ（Coffea arabica）種の豆を意味する。好ましくは、「グリーンコーヒー」は、ロブスタコーヒーノキ（Coffea canephora）を意味する。
「グリーンコーヒー抽出物」とは、乾燥したグリーンコーヒー豆に含まれる代謝物を回収するために、エタノール中で固液抽出することにより得られる抽出物を意味する。使用されるエタノールは、純粋エタノール又は水性アルコール溶液の形態であり、後者は、１０％～９９．９％、より詳しくは４０％～９０％、さらにより詳しくは５０％～８５％のアルコールを含む。任意に、カフェインは、酢酸エチル又は酢酸エチル／ヘキサンの混合物を用いた処理により抽出物から除去される。抽出物は、当業者に知られている任意の適合方法、特に噴霧化又は凍結乾燥を行うことにより粉末状にされる。
本発明に係るグリーンコーヒー抽出物においては、クロロゲン酸が少なくとも２ｍＭ、好ましくは少なくとも５ｍＭ、少なくとも７．５ｍＭ、好ましくは１０ｍＭの最小濃度で存在する。
さらにより詳しい態様によれば、本発明に係るイソクロロゲン酸を生産するための方法は、
以下の工程：
・ クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるタンパク質を発現させるために、適当な培養培地中及び適当な条件下で、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質を発現することができるピキア・パストリス宿主細胞の培養であって、前記タンパク質は生産され、次いで、Ｐ．パストリス細胞の培養上清中に輸送される培養、
・適当な反応条件下で、工程ｉ）で発現されたタンパク質と、グリーンコーヒー抽出物中に存在するクロロゲン酸との接触、及び
・先行する前記工程の反応中に生産されたイソクロロゲン酸の単離、を含む。
別の詳しい態様によれば、本発明の１つの目的は、本発明に係る方法により得られる可能性のある生成物であって、前記方法は、適当な反応条件下で、クロロゲン酸濃度が２ｍＭ以上であるグリーンコーヒー抽出物と、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができ、かつ、
配列番号１、
配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、
前記配列番号１の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメント、及び
配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメント
から選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質とを接触させることを含む、生成物である。
別のさらに詳しい態様によれば、本発明の１つの目的は、本発明に係る方法により得られる可能性のある生成物であって、前記方法は、以下の工程：
・配列番号１のＩｂＧＳＤＬタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターにより形質転換されたＰ．パストリスを適当な栄養培地及び適当な条件下で培養し、前記タンパク質が生産され、次いで、培養上清中に輸送される工程、
・任意選択により、配列番号１の前記タンパク質を精製する工程、
・適当な反応条件下で、クロロゲン酸濃度が２ｍＭ以上であるグリーンコーヒー抽出物を前記培養上清、又は任意選択により前記精製タンパク質と接触させる工程、
・任意選択により、反応中に生産されたイソクロロゲン酸を単離する次工程
を含む。
第３の目的によれば、本発明は、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換するための、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる少なくとも１つのタンパク質、又はそのようなタンパク質を発現する宿主細胞、の使用である。
より詳しくは、本発明は、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換するための、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる少なくとも１つのタンパク質であって、適当な反応条件下で、宿主細胞から、又は前記タンパク質を生産するために宿主細胞が培養された培養培地から、前もって単離されることなく、クロロゲン酸と接触される、少なくとも１つのタンパク質の使用である。
別の詳しい態様によれば、本発明は、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換するための、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる少なくとも１つのタンパク質であって、適当な反応条件下で、宿主細胞から、又は前記タンパク質を生産するために宿主細胞が培養された培養培地から、前もって単離された又は精製された後に、クロロゲン酸と接触される、少なくとも１つのタンパク質の使用である。さらにより詳しくは、本発明に係る使用において、宿主細胞から単離された又は培養培地から精製された前記タンパク質は、クロロゲン酸を主に、又はクロロゲン酸のみを含む溶液に添加される。代替的に、本発明に係る使用において、宿主細胞から単離された又は培養培地から精製された前記タンパク質は、
特にクロロゲン酸を含む抽出物に添加される。
この第３の目的の別の詳しい態様によれば、本発明は、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換するための、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるタンパク質を発現する少なくとも１つの宿主細胞の使用である。
より詳しくは、本発明の１つの目的は、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換するための、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるタンパク質を発現する少なくとも１つの酵母細胞の使用である。好ましくは、前記酵母細胞は、
本発明に係る少なくとも１つの核酸分子を含む組換えベクターにより形質転換されたピキア・パストリス株の細胞であり、前記少なくとも１つの分子はそれぞれ宿主細胞での前記タンパク質の発現に必要な手段の制御下に置かれている。そのようなベクターは、特に、プラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バイナリー型ベクター（ｐＢＩＮ、ｐＧＷ）、及び選択した宿主細胞の機能として、あらゆるタイプの適当なベクターから選択される。
この第３の目的の別の詳しい態様によれば、本発明は、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換するための、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１のフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列のフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるタンパク質を発現する少なくとも１つの植物宿主細胞の使用である。
本発明のさらなる有利な点及び特徴は、添付の図に照らして、限定的ではない実施及び実施例の詳細な説明を読むことで明らかとなるであろう。
図１（実施例１）は、２つのＣＧＡ分子の縮合による３，５－ＤＣＱとキナ酸（ＱＡ）の形成を触媒するＩｂＧＤＳＬによって行われる酵素反応のスキームを表す。 図２Ａ及び２Ｂ（実施例１）はそれぞれ、タンパク質のＣ末端の位置の６ヒスチジンタグに特異的に向けられた抗体を用いて実施されるウエスタンブロットアッセイによる酵素の検出を表し、ベンサミアナタバコ植物（図１Ａ）及びＰ．パストリス細胞（図１Ｂ）によるＩｂＧＤＳＬ（推定サイズ４０．１ｋＤａ）の生産を証明する。各図において、カラム１はエンプティーベクター（陰性対照）で形質転換された生産宿主で行った分析を表し、カラム２は目的の遺伝子を含むベクターで形質転換された生産宿主で行った分析を表す。 図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃ（実施例２）はそれぞれ、ｐＨ（図３Ａ）、温度（図３Ｂ）又はＣＧＡ基質濃度（ｍＭ）（図３Ｃ）の関数としての、３，５－ＤＣＱ濃度（ｍＭ）（図３Ａ及び３Ｂ）、又は３，５－ＤＣＱへの生物変換速度（マイクロモル／分）（図３Ｃ）。 図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃ（実施例２）はそれぞれ、ｐＨ（図３Ａ）、温度（図３Ｂ）又はＣＧＡ基質濃度（ｍＭ）（図３Ｃ）の関数としての、３，５－ＤＣＱ濃度（ｍＭ）（図３Ａ及び３Ｂ）、又は３，５－ＤＣＱへの生物変換速度（マイクロモル／分）（図３Ｃ）。 図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃ（実施例２）はそれぞれ、ｐＨ（図３Ａ）、温度（図３Ｂ）又はＣＧＡ基質濃度（ｍＭ）（図３Ｃ）の関数としての、３，５－ＤＣＱ濃度（ｍＭ）（図３Ａ及び３Ｂ）、又は３，５－ＤＣＱへの生物変換速度（マイクロモル／分）（図３Ｃ）。 図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃ（実施例３）はそれぞれ、３日のメタノール誘導後に３，５－ＤＣＱ標準のクロマトグラム（図４Ａ）及びエンプティーベクターで形質転換された（図４Ｂ）又はＩｂＧＤＳＬをコードする遺伝子を有するベクターで形質転換された（図４Ｃ）Ｐ．パストリスの上清で行われたＣＧＡから３，５－ＤＣＱへの変換のための酵素反応を表す。保持時間３．２分及び８．３分のピークはそれぞれ、ＣＧＡ（ｍ／ｚ ｎｅｇ ３５３）及び３，５－ＤＣＱ（ｍ／ｚ ｎｅｇ ５１５）に相当する。 図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃ（実施例３）はそれぞれ、３日のメタノール誘導後に３，５－ＤＣＱ標準のクロマトグラム（図４Ａ）及びエンプティーベクターで形質転換された（図４Ｂ）又はＩｂＧＤＳＬをコードする遺伝子を有するベクターで形質転換された（図４Ｃ）Ｐ．パストリスの上清で行われたＣＧＡから３，５－ＤＣＱへの変換のための酵素反応を表す。保持時間３．２分及び８．３分のピークはそれぞれ、ＣＧＡ（ｍ／ｚ ｎｅｇ ３５３）及び３，５－ＤＣＱ（ｍ／ｚ ｎｅｇ ５１５）に相当する。 図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃ（実施例３）はそれぞれ、３日のメタノール誘導後に３，５－ＤＣＱ標準のクロマトグラム（図４Ａ）及びエンプティーベクターで形質転換された（図４Ｂ）又はＩｂＧＤＳＬをコードする遺伝子を有するベクターで形質転換された（図４Ｃ）Ｐ．パストリスの上清で行われたＣＧＡから３，５－ＤＣＱへの変換のための酵素反応を表す。保持時間３．２分及び８．３分のピークはそれぞれ、ＣＧＡ（ｍ／ｚ ｎｅｇ ３５３）及び３，５－ＤＣＱ（ｍ／ｚ ｎｅｇ ５１５）に相当する。 図５Ａ及び５Ｂ（実施例３）は、エンプティーベクター（図５Ａ）又はＩｂＧＤＳＬをコードする遺伝子を有するベクター（図５Ｂ）のいずれかで形質転換されたＰ．パストリス培養への直接的基質添加によるクロロゲン酸から３，５－ＤＣＱへの生物変換反応のクロマトグラムを表す。各図において、上から下へ、右方向へ、それぞれ、ＣＧＡ添加前のＴ０、ＣＧＡ添加６時間誤及びＣＧＡ添加１２０時間誤に相当するクロマトグラムである。保持時間３．２分及び８．３分のピークはそれぞれ、ＣＧＡ（ｍ／ｚ ｎｅｇ ３５３）及び３，５－ＤＣＱ（ｍ／ｚ ｎｅｇ ５１５）に相当する。 図５Ａ及び５Ｂ（実施例３）は、エンプティーベクター（図５Ａ）又はＩｂＧＤＳＬをコードする遺伝子を有するベクター（図５Ｂ）のいずれかで形質転換されたＰ．パストリス培養への直接的基質添加によるクロロゲン酸から３，５－ＤＣＱへの生物変換反応のクロマトグラムを表す。各図において、上から下へ、右方向へ、それぞれ、ＣＧＡ添加前のＴ０、ＣＧＡ添加６時間誤及びＣＧＡ添加１２０時間誤に相当するクロマトグラムである。保持時間３．２分及び８．３分のピークはそれぞれ、ＣＧＡ（ｍ／ｚ ｎｅｇ ３５３）及び３，５－ＤＣＱ（ｍ／ｚ ｎｅｇ ５１５）に相当する。 図６Ａ及び６Ｂ（実施例３）はそれぞれ、反応時間（時間）の関数としての純粋なＣＧＡから３，５－ＤＣＱへの変換速度（モル％）（図６Ａ）又は３，５－ＤＣＱ濃度（ｍｇ／Ｌ）（図６Ｂ）を表す。５０％における理論限界は、全ＣＧＡ分子が３，５－ＤＣＱへ変換された際に得られる最大収量に相当する（それぞれ２：１の化学量論的収量）。図６Ａ：三角の曲線（５ｍＭ又は１．９ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、薄い十字の曲線（７．５ｍＭ又は２．６ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、濃い十字の曲線（９ｍＭ又は３．２ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、濃い四角の曲線（１０ｍＭ又は３．６ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、薄い四角の曲線（１５ｍＭ又は５．５ｇ／Ｌ ＣＧＡ）。図６Ｂ：三角の曲線（５ｍＭ又は１．９ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、薄い十字の曲線（７．５ｍＭ又は２．６ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、直線（９ｍＭ又は３．２ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、濃い四角の曲線（１０ｍＭ又は３．６ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、薄い四角の曲線（１５ｍＭ又は５．５ｇ／Ｌ ＣＧＡ）。 図６Ａ及び６Ｂ（実施例３）はそれぞれ、反応時間（時間）の関数としての純粋なＣＧＡから３，５－ＤＣＱへの変換速度（モル％）（図６Ａ）又は３，５－ＤＣＱ濃度（ｍｇ／Ｌ）（図６Ｂ）を表す。５０％における理論限界は、全ＣＧＡ分子が３，５－ＤＣＱへ変換された際に得られる最大収量に相当する（それぞれ２：１の化学量論的収量）。図６Ａ：三角の曲線（５ｍＭ又は１．９ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、薄い十字の曲線（７．５ｍＭ又は２．６ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、濃い十字の曲線（９ｍＭ又は３．２ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、濃い四角の曲線（１０ｍＭ又は３．６ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、薄い四角の曲線（１５ｍＭ又は５．５ｇ／Ｌ ＣＧＡ）。図６Ｂ：三角の曲線（５ｍＭ又は１．９ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、薄い十字の曲線（７．５ｍＭ又は２．６ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、直線（９ｍＭ又は３．２ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、濃い四角の曲線（１０ｍＭ又は３．６ｇ／Ｌ ＣＧＡ）、薄い四角の曲線（１５ｍＭ又は５．５ｇ／Ｌ ＣＧＡ）。 図７Ａ（実施例４）は、グリーンコーヒーヒドロアルコール抽出物中のカフェ酸誘導体の比較を示すクロマトグラムを表す。：ピーク１：ＭＣＱ１（他のモノ－カフェオイルキナ酸異性体）、ピーク２：ＭＣＱ２（他のモノ－カフェオイルキナ酸異性体）、ピーク３：ＣＧＡ（クロロゲン酸、５－Ｏ－カフェオイルキナ酸）；ピーク４：ＣＡ（カフェ酸）；ピーク５：ＭＦＱ（モノフェルロイルキナ酸）；ピーク７：４，５－ＤＣＱ（３，４ジカフェオイルキナ酸）；ピーク８：３，５－ＤＣＱ（３，５ジカフェオイルキナ酸）；ピーク９：３，４－ＤＣＱ（４，５ジカフェオイルキナ酸）。 図７Ｂ（実施例４）は、グリーンコーヒー抽出物におけるＩｂＧＤＳＬによる生物変換の前（黒いトレース）及び５０時間後（薄いトレース）に得られたグリーンコーヒーヒドロアルコール抽出物のクロマトグラムを表し；最初の基質濃度は１０ｍＭ ＣＧＡに相当する。ピーク１：ＭＣＱ；ピーク２：ＣＧＡ；ピーク３：ＭＦＱ；ピーク４：４．５－ＤＣＱ；ピーク５：３，５－ＤＣＱ；ピーク６：３，４－ＤＣＱ。薄いトレースと濃いトレースの間の差は特にピーク５：３，５－ＤＣＱに見られる。 図８（実施例４）は、反応時間（時間）の関数としてのＣＧＡ当量として表される種々の濃度のグリーンコーヒー抽出物に関して得られたＤＣＱ含量（ｍｇ／Ｌ）を表す。ＧＤＳＬ酵素を含有するＰ．パストリス培養培地の上清を３７倍に濃縮した。実線の曲線（ＣＧＡ １ｍＭ）、薄い丸の曲線（ＣＧＡ ３．５ｍＭ）、菱形の曲線（ＣＧＡ ５ｍＭ）、濃い四角の曲線（ＣＧＡ １０ｍＭ）。 図９（実施例４）は、時間（日）の関数としての、ＩｂＧＤＳＬを発現する（ＧＤＳＬ＋）又はＩｂＧＤＳＬを発現しない（ＧＤＳＬ－）Ｐ．パストリスの細胞懸濁液により生物変換された、グリーンコーヒー抽出物中に測定される３，５－ＤＣＱ含量（ｍｇ／Ｌ）を表す。 図１０（実施例４）は、ＧＤＳＬ酵素を含有するＰ．パストリス培養培地の上清を１０倍濃縮（丸）、２０倍濃縮（三角）又は３７倍濃縮（四角）した際の、時間（時間）の関数としての、５ｍＭ ＣＧＡを含有するグリーンコーヒー溶液のＩｂＧＤＳＬによる酵素的生物変換によって得られた３，５－ＤＣＱ含量（ｍｇ／Ｌ）を表す。
本発明は以下の実施例１～４からより良く理解されるが、これらの実施例は本発明を説明するために示されるものであって、その範囲を限定しない。
実施例１：サツマイモの組換えＧＤＳＬ酵素の同定、生産及び特性決定
１．１ 材料及び方法
サツマイモの相補的ＤＮＡライブラリーは、文書ＷＯ２０１３／１７８７０５に記載されているプロトコールにしたがって、３，５－ＤＣＱに富む空中栽培条件下で栽培された植物の根から調製した。並行して、イソクロロゲン酸シンターゼ活性を有するタンパク質を段階的に選択するために、３，５－ＤＣＱに富むサツマイモ塊茎からの複雑なタンパク質抽出物の断片化を行った。この実験の最後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルを取得し、観察されたタンパク質の配列を決定した。４００のペプチドが得られ、ペプチド配列をヌクレオチド配列の翻訳産物と比較するｔＢｌａｓｔｎプログラムを使用して、それらのアミノ酸配列をサツマイモｃＤＮＡライブラリーとアラインした。したがって、組織トランスクリプトームを構成する全配列の中で、配列決定されたペプチドと高い相同性を有する配列が検出された。
ｃＤＮＡライブラリーから候補配列を同定した後、そのコード配列を、ｃＤＮＡに変換された全メッセンジャーＲＮＡの抽出物から単離した。このために、空中栽培条件下で栽培したサツマイモの根からのｍＲＮＡは、供給者の指示（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ－ＱＩＡＧＥＮ）にしたがって、植物組織に固有の市販の抽出キットを使用して抽出した。抽出されたｍＲＮＡの品質をアッセイ及びチェックした後、一方では、タンパク質のＣ末端位置に、生産後のその検出及びその精製に必要な６ヒスチジンタグを付加するように設計された配列特異的プライマー、そして他方で、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換及びＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による配列の増幅を可能にする市販のキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ－ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を使用し、一工程で候補タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅した。得られたアンプリコンを次に、配列決定と様々な発現系専用のいくつかのベクターへの組み込みを可能とする基本的な市販のベクター（ｐＣＲ（商標）８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（商標）－ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）にクローニングした。
サツマイモｃＤＮＡライブラリーのペプチドアラインメントにより、配列決定されたすべての転写産物の中でＧＤＳＬエステラーゼ／リパーゼをコードする遺伝子の同定が可能になった。ＩｂＧＤＳＬをコードするペプチド及びヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２である。
その後、ＩｂＧＤＳＬをコードする遺伝子を、相同組換えによって植物細胞専用の発現ベクターに組み込んだ。遺伝子増幅の際、遺伝子の末端に６個のヒスチジンからなるタグを付加し、転写及び翻訳の後にＣ末端タグタンパク質を得る。このタグにより、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の精製が容易になる。
次に、このベクターを、Ｃｈｅｎら（“Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ａｆｔｅｒ ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６ （４）： ６６４－６８， １９９４）の研究に記載されている凍結－解凍法にしたがって、目的のＤＮＡを植物細胞にトランスフェクトすることができるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＥＨＡ１０５株に導入する。ベクターを組み込んだ細菌は、同時に抗生物質に対する耐性を獲得し、したがって、この抗生物質の存在下でそれらを非形質転換細菌から選択することを可能とする。
ベンサミアナタバコの一過性形質転換のために、組換えベクターを有するアグロバクテリアを、選択抗生物質を添加した１５ｍＬの栄養培地で培養し、２００ｒｐｍでの攪拌下２８℃で２４時間インキュベートする。翌日、形質転換の３時間前に、アグロバクテリア培養物に１００ｐＭのアセトシリンゴンを加えて病原性を活性化する。この後、細菌を遠心分離し、栄養培地に１回又は２回移して抗生物質を除去し、最終的にｐＨ５．６の浸潤バッファー（１０ｍＭ ＳＳ、１００μＭアセトシリンゴン）に移した。細菌懸濁液のＯＤ６００ｎｍ（光学密度）を０．５に調整する。
昼夜１６時間／８時間の光周期、人工光（７０μｍｏｌ ｍ－２ｓ－１）下、２６℃、湿度７０％の培養チャンバーで栽培したいくつかの３～４週齢のベンサミアナタバコ植物の地上部をアグロバクテリア溶液に完全に浸漬させ、ポンプに接続したベルジャーで真空浸透を行う。大気圧条件に戻す前に、組織へのアグロバクテリアの侵入を誘導するために、２０ｍｂａｒまで真空ステップを実行する。次いで、ベンサミアナタバコ植物を、上記と同じ環境条件下で６日間栽培に戻した。この間に、アグロバクテリアがＩｂＧＤＳＬ遺伝子に相当する目的のＤＮＡを植物細胞にトランスフェクトし、宿主細胞の転写及び翻訳機構によってタンパク質が生成される。
このシステムによるタンパク質生産の確認は、タンパク質のＣ末端位置に付加された６－ヒスチジンタグに対して特異的に向けられた抗体を使用したウエスタンブロットによって決定した（図２Ａ）。
並行して、タンパク質をコードする遺伝子を、相同組換えによってＰ．パストリス専用の発現ベクターに組み込む。このベクターは、培養培地においてメタノールの存在下でタンパク質の発現及び分泌を可能とする。この作業で使用される従来のＰ．パストリス変換プロトコールは、Ｃｒｅｇｇ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ （“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”． Ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｄａｖｉｄ Ｒ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｍ． Ｃｒｅｇｇ， ２７－３９． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙＴＭ Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３８５／０－８９６０３－４２１－６：２７， １９９８）に記載されている。酵素生産の確認は、ウエスタンブロットによって上記のように行った（図２Ｂ）。
１．２結果
結果は、生産宿主の形質転換後、アグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ葉からの総タンパク質抽出物及び遺伝子形質転換酵母の上清で、ウエスタンブロットによって酵素が検出されたことを示す。したがって、陰性対照（図２Ａ ウェル１）とは異なり、ＩｂＧＤＳＬをコードする遺伝子を６日間アグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコ組織では、４０ｋＤａ前後のバンドが見られる（図２Ａ ウェル２）。同様に、ＩｂＧＤＳＬ遺伝子で形質転換されたＰ．パストリス培養物は、エンプティーベクターで形質転換された陰性対照（図２Ａ ウェル１）とは異なり、３日以内に酵素を生産し、培養培地中に分泌した（図２Ｂ ウェル２）。
実施例２：精製した組換えＩｂＧＤＳＬの触媒活性の特性決定
植物系で生産された精製組換え酵素に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素アッセイを行う。６日の共培養の後、ベンサミアナタバコ葉を目的の遺伝子を有するベクターでアグロインフィルトレーションし、収穫し、抽出バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で粉砕する。次いで、抽出物を遠心分離し、ＩｂＧＤＳＬを含む全ての可溶性タンパク質を含む上清を回収し、０．２μｍ濾過により除菌する。次いで、ニッケルカラム（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ－ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）にて供給者の指示にしたがって、、タンパク質精製を行う。精製後に回収したタンパク質含有溶出画分は、１０ｋＤａをカットオフとする遠心分離ユニット（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ－ＰＭＮＬ １０ｋＤａ－ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）で濃縮及び脱塩する。
酵素アッセイは、２００～４００ｎｇの精製タンパク質（すなわち、数μｌ）を含む５０μｌ容量で行う。最適な反応ｐＨは、４～９のｐＨ範囲が構築されるポリバッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＭＥＳ／０．１Ｍ酢酸）を使用して決定する。１００ｍＭクロロゲン酸（ＣＧＡ）原液は、ｐＨ６．５のポリバッファーで希釈した９９％以上の純度のＣＧＡ粉末から実験の直前に調製する。各反応後、１５０μｌの無水エタノールを５０μｌの反応混合物に加えて反応を停止し、反応中に存在する生成分子を抽出する。次いで、アッセイを遠心分離し、ＵＰＬＣ－ＭＳ分析のために上清を回収した。
分析ステップに使用される装置は、寸法１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、２．６μｍのＫｉｎｅｔｅｘ Ｂｉｐｈｅｎｙｌカラム（００Ｆ－４６２２－ＡＮ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，トーランス，ＣＡ，ＵＳＡ）を備えた逆相で作動するＳｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ ＵＰＬＣ（ＬＣ－３０ＡＤポンプ、ＳＩＬ－３０ＡＣオートサンプラー、ＣＴＯ－２０Ａオーブン、ＳＰＤ－Ｍ２０Ａダイオードアレイ検出器；京都、日本）である。移動相は、溶媒Ａ（Ｍｉｌｉ－Ｑ超純水、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＋０．１％ギ酸、Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ、Ｖａｌ－ｄｅ－Ｒｅｕｉｌ、フランス）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、シュタインハイム、ドイツ）で構成され、その勾配は次のようにプログラムした：フェーズＢ（％）５～２５％（０～１０分）；２５～９０％（１０～１０．５分）；９０％（１０．５～１２分）、９０～５％（１２～１２．１分）、５％（１２．１～１４．１分）。分析流速は、オーブン温度４０℃で０．５ｍＬ／分である。カラム出口では、ダイオードアレイ検出器が２２０～３７０ｎｍのＵＶスペクトルを記録する。この機器は、１００～１，０００のｍ／ｚ範囲でエレクトロスプレーイオン化（４．５ｋＶ）の負モードで作動する質量分析計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ－２０２０）に接続されている。ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェア（バージョン５．６０ ＳＰ２）を使用してシステムを操作する。
３，５－ＤＣＱの定量は、３３０ｎｍで３，５－ＤＣＱ標準のピーク面積を測定することによって行う。３，５－ＤＣＱ標準は、７０／３０ ＤＭＳＯ／水混合物中、１００ｍｇ／Ｌの濃度で調製し、塩酸でｐＨ３に酸性化する。他の化合物（クロロゲン酸及び他のＤＣＱ異性体）の含量は、３，５－ＤＣＱ当量として表される。含量は、ある化合物に関して下式にしたがって計算される。
Figure 2023532382000002
３，５－ＤＣＱは、異なる３，４－ＤＣＱ及び４，５－ＤＣＱ化合物が同じ分子ファミリーに属しているため、これらの化合物の定量標準として使用する。
ＩｂＧＤＳＬがＣＧＡを３，５－ＤＣＱに変換するために必要な物理化学的パラメーターを決定する実験は、植物発現系で生産された精製酵素について行った。
ＩｂＧＤＳＬは、あるＣＧＡ分子から別のＣＧＡ分子にカフェオイル基を転移することにより、２つのＣＧＡ分子を３，５－ＤＣＱに縮合することができるエステラーゼ／リパーゼである（図１）。したがって、ここではＣＧＡはアシル供与体として使用される。反応媒体へのカフェイン酸の添加は、３，５－ＤＣＱの形成を促進しない。
ＩｂＧＤＳＬによるＣＧＡの３，５－ＤＣＱへの変換に最適なｐＨを決定するために、４～９のｐＨ範囲を確立した。５０μＬの反応では、固定量の精製ＩｂＧＤＳＬを固定濃度の１０ｍＭ ＣＧＡと、ポリバッファーによって設定された種々のｐＨ条件で接触させる。反応物を２５℃で３０分間インキュベートし、エタノールで停止させた。得られた曲線から、最適な反応ｐＨは６～７であると判定された（図３Ａ）。
ＩｂＧＤＳＬによるＣＧＡの３，５－ＤＣＱへの変換のための最適反応温度を決定するために、１５～４５℃の温度範囲を確立した。固定量の精製ＩｂＧＤＳＬ、固定濃度の１０ｍＭ ＣＧＡ、及びｐＨ６．５のポリバッファーでは、変換に最適な温度は３４～４１℃で、最大値は３７℃であると推定される（図３Ｂ）。
生成物によるＩｂＧＤＳＬ活性の阻害が観察される閾値基質濃度を決定するために、ＣＧＡ濃度範囲を確立した。固定量の酵素と６．５に設定したｐＨでは、３６℃で３０分のインキュベーション後に１０ｍＭのＣＧＡ濃度から酵素活性の減速が見られる（図３Ｃ）。
実施例３：Ｐ．パストリス培養上清中の組換えＩｂＧＤＳＬ活性の特性決定
ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＧＡの３，５－ＤＣＱへの生物変換には、代謝活性の高いＰ．パストリス培養の確立が必要である。酵母は、ｐＨ６．０に調整した１００ｍＭリン酸カリウムバッファーを含む栄養培地で培養する。これにより、微生物細胞から得られた酵素と基質が接触する培地をｐＨ６に維持することが可能である。２５０～３００ｒｐｍの振盪下、３０℃で一晩、２５ｍＬの酵母培養の接種材料を確立した後、これを用いて、１前後のＯＤ６００ｎｍが得られるように１００～２００ｍＬ容量の栄養培地に接種を行う。ＩｂＧＤＳＬの生産を開始するために、この培養物に０．５％メタノールを添加する。タンパク質生産の誘導レベルを維持するために、メタノールの添加を２４時間ごとに繰り返す。この培養の確立の３日後、ＣＧＡを培地に直接添加して、１０ｍＭの最終濃度とする。
この実験の最初のステップは、Ｐ．パストリスによって生産されたＩｂＧＤＳＬがＣＧＡを３，５－ＤＣＱに変換できるかどうかを示すことであり、元の酵素が潜在的に３倍にグリコシル化される可能性があり、Ｐ．パストリスによって生成されたグリカンツリーが植物のグリカンツリーと同じように構成及び編成されていないことが分かる。これらの違いは、安定性に直接影響し、酵素の適切な活性を妨げる可能性がある。そうするために、一方はエンプティーベクター（陰性対照）で形質転換され、他方はＩｂＧＤＳＬをコードする遺伝子を有するベクターで形質転換された２つのＰ．パストリス培養からの上清を３日間のメタノール誘導の後に回収した。これらの上清を、ｐＨ６．５で１０ｍＭクロロゲン酸とともに３６℃で３０分間インキュベートした。次に、エタノールを添加して酵素反応を停止させ、ＵＰＬＣ－ＭＳにより分析した。
得られた結果は、陰性対照（図４Ｂ）とは異なり、ＩｂＧＤＳＬが分泌された上清は、３，５－ＤＣＱ標準（図４Ａ）と同じ保持時間（８．３分）と質量（ｍ／ｚ ｎｅｇ ５１５）のピークを示す（図４Ｃ）ことを示す。したがって、この微生物の異種発現系によって合成された酵素は、翻訳後レベルでのいくつかの違いがあるのにもかかわらず機能的である。インキュベーションが３０分だけであったことを考慮に入れる必要があり、これによりピーク強度が低いことを説明できる。
この実験の第２のステップは、酵素を発現するＰ．パストリス培養培地に直接添加したＣＧＡが３，５－ＤＣＱに直接変換できるかどうかを示すことである。この目的は、必要に応じて酵素の精製工程を避けることである。
メタノールで３日間タンパク質発現を誘導した後、終濃度１０ｍＭでｐＨ６に緩衝した培養物にＣＧＡを直接添加し、微生物細胞と３日間接触させた。この実験は、Ｐ．パストリス生物の培養と増殖に理想的な温度である３０℃で行った。
次いで、上清をＵＰＬＣ－ＭＳにより分析した。図５Ｂに示される得られた結果は、ＩｂＧＤＳＬを発現するＰ．パストリスの培養物が３日以内に極めて高い効率でＣＧＡを３，５－ＤＣＱに変換できることを示す。実際、４４％前後の生物変換収率が推定され、１分子の３，５－ＤＣＱを形成するためには２分子のＣＧＡが必要であるため、最大化学量論的限界は５０％である。
ＣＧＡは、得られる最終的な変換率に影響を与えることなく、毎日、又は誘導期の開始時に、又は誘導期の終了時に無差別に添加できることが実証された。
純粋なＣＧＡの３，５ＣＤＱへの変換動力学は、開始時のＣＧＡ濃度の関数として確立された（図６Ａ）。５０時間の生物変換の後、５ｍＭ濃度と７．５ｍＭ濃度の両方で最大収率３２％が得られた。ここで試験した７．５ｍＭを超える濃度は、３，５－ＤＣＱの最終収量を低下させる。
５０時間の生物変換の後に測定された３，５－ＤＣＱ含量は、開始時の７．５及び９ｍＭの純粋なＣＧＡ濃度では、１．２ｇ／Ｌ程度の最大量を示す（図６Ｂ）。
実施例４：培養培地に分泌された、ＩｂＧＤＳＬを発現するＰ．パストリス細胞の培養上清によるグリーンコーヒー抽出物由来のクロロゲン酸の３，５－ＤＣＱへの生物変換
ＣＧＡの３，５－ＤＣＱへの生物変換反応も、図７Ａに組成が示されているグリーンコーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）抽出物から行った。１０ｍＭに相当するＣＧＡ濃度を含み、３０℃、ｐＨ６で５０時間にわたって生物変換されたこのグリーンコーヒー抽出物は、その組成が図７Ｂに示されている新しい抽出物につながった。ＩｂＧＤＳＬは、３，５－ＤＣＱの形成を排他的に触媒し、他のいずれの異性体も排除することに留意されたい。さらに、ＣＧＡに相当するものを除いてピークの減少が見られないので、クロロゲン酸以外のカフェ酸含有基質は生物変換されない。ＩｂＧＤＳＬによるグリーンコーヒー抽出物の生物変換により、抽出物に最初に存在する３，５－ＤＣＱ含量が４．５倍（Ｔ０で２００ｍｇ／Ｌ、Ｔ５０ｈで９００ｍｇ）増加し、ＣＧＡの開始濃度は１０ｍＭに相当する。グリーンコーヒー抽出物に由来するＣＧＡの３，５－ＤＣＱへの生物変換は、ＤＳＬとの長時間にわたる反応の影響を分析するために、４日後と７日後に行った（図９）。測定された３，５－ＤＣＱ含量は４日目と７日目の間で増加せず、したがって、長時間の発酵を実行することに特に問題はないことに留意されたい。Ｐ．パストリスの発酵によって得られるＩｂＧＤＳＬ酵素の濃度は、ＣＧＡから３，５－ＤＣＱへの変換の反応速度を加速する（図１０）。６０時間の生物変換の後、１０、２０、及び３７倍の酵素濃縮係数で同じレベルの３，５－ＤＣＱ濃度を得ることができることに留意されたい。結論として、Ｐ．パストリス培養物から得られた組換えＩｂＧＤＳＬ酵素は、純粋なクロロゲン酸を変換するか、グリーンコーヒー抽出物などのクロロゲン酸を天然に含む植物抽出物を変換することにより、クロロゲン酸を３，５－ＤＣＱに大量に変換するための効率的な触媒である。

Claims (14)

  1. 配列番号１、
    配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、
    前記配列番号１の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメント、及び
    配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメント
    から選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質であって、
    クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる、タンパク質。
  2. ＧＤＳＬエステラーゼ／リパーゼ酵素、特に、サツマイモ属のＧＤＳＬエステラーゼ／リパーゼ酵素から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
  3. サツマイモのＧＤＳＬエステラーゼ／リパーゼ酵素から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のタンパク質。
  4. 請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離された核酸分子。
  5. 配列番号２及び配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する配列から選択される核酸配列を含む、又はからなる、請求項４に記載の単離された核酸分子。
  6. 請求項４又は５に記載の少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの分子がそれぞれ宿主細胞での前記タンパク質の発現に必要な手段の制御下に置かれている組換えベクター。
  7. 請求項４又は５に記載の少なくとも１つの単離された核酸分子、又は請求項６に記載の少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞。
  8. 酵母細胞、特に、ピキア・パストリス株の酵母細胞から、又は植物細胞、特に、ベンサミアナタバコから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の宿主細胞。
  9. イソクロロゲン酸を生産するための方法であって、適当な反応条件下で、クロロゲン酸と、
    配列番号１、
    配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、
    前記配列番号１の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメント、及び
    配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメント
    から選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質であって、
    クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができるタンパク質とを
    接触させて、イソクロロゲン酸に富む組成物を得ることを含む、方法。
  10. 適当な培養培地中及び適当な条件下で、配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質を発現することができる宿主細胞を培養する前工程であって、生産された前記タンパク質は任意選択により精製され、かつ／又は前記クロロゲン酸は単離された形態で、又は組成物中に存在し、前記組成物は特に植物抽出物である前工程、及び／又は
    反応中に生産された前記イソクロロゲン酸を単離する次工程
    をさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. 配列番号１、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、前記配列番号１の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメント、及び配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、前記タンパク質が生産され、次いで、Ｐ．パストリス細胞により培養上清中に輸送され、かつ
    前記クロロゲン酸がグリーンコーヒー抽出物である組成物中に存在する、
    請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 適当な反応条件下で、クロロゲン酸濃度が２ｍＭ以上であるグリーンコーヒー抽出物と、
    クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができ、かつ、
    配列番号１、
    配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、
    前記配列番号１の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメント、及び
    配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメント
    から選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、タンパク質とを接触させることを含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法、により得られる可能性のある生成物。
  13. 前記方法が、以下の工程：
    配列番号１のＩｂＧＳＤＬタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターにより形質転換されたＰ．パストリスを適当な栄養培地及び適当な条件下で培養し、前記タンパク質が生産され、次いで、培養上清中に輸送される工程、
    任意選択により、配列番号１の前記タンパク質を精製する工程、
    適当な反応条件下で、クロロゲン酸濃度が２ｍＭ以上であるグリーンコーヒー抽出物を前記培養上清、又は任意選択により前記精製タンパク質と接触させる工程、
    任意選択により、反応中に生産されたイソクロロゲン酸を単離する次工程
    を含む、請求項１２に記載の生成物。
  14. クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換するための、
    配列番号１、
    配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列、
    前記配列番号１の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメント、及び
    配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する前記配列の少なくとも５０のアミノ酸を含むフラグメント
    から選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなり、クロロゲン酸をイソクロロゲン酸に変換することができる少なくとも１つのタンパク質、又はそのようなタンパク質を発現する宿主細胞、の使用。
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