CN114085850B

CN114085850B - 水稻中一个芳香族酚胺合成基因簇的克隆及抗病方面的应用

Info

Publication number: CN114085850B
Application number: CN202110141659.9A
Authority: CN
Inventors: 罗杰; 沈双欠; 刘贤青; 彭梦
Original assignee: Huazhong Agricultural University; Hainan University
Current assignee: Huazhong Agricultural University; Hainan University
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2041-02-02
Also published as: CN114085850A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。本发明具体公开了在水稻10号染色体上发现并鉴定了一个控制芳香族酚胺(羟基肉桂酰酪胺)生物合成的代谢基因簇。该基因簇由1个吡哆醇5'‑磷酸氧化酶(OsPDX3编码)，1个酪氨酸脱羧酶(OsTyDC1编码)和2个羟基肉桂酰基转移酶(OsTHT1和OsTHT2编码)组成，体外酶活力测定和超表达转基因水稻等手段证明了该代谢基因簇所编码的生物合成步骤。利用转基因技术分别获得了超表达OsTHT1和OsTHT2基因的水稻植株，靶向代谢组学检测结果显示超表达OsTHT1和OsTHT2转基因水稻比野生型水稻积累更多的羟基肉桂酰酪胺等芳香族酚胺，并且对两大典型病害(白叶枯和稻瘟病)具有更强的抗性。本发明揭示了水稻芳香族酚胺基因簇在水稻广谱抗病方面的作用，为水稻抗性方面的遗传改良育种提供了新的基因资源。

Description

水稻中一个芳香族酚胺合成基因簇的克隆及抗病方面的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。本发明具体公开了在水稻10号染色体上发现并鉴定了一个控制芳香族酚胺(羟基肉桂酰酪胺)生物合成的基因簇。该基因簇由1个吡哆醇5'-磷酸氧化酶(OsPDX3编码)，1个酪氨酸脱羧酶(OsTyDC1编码)和2个酰基转移酶(OsTHT1和OsTHT2编码)组成，体外酶活力测定和超表达转基因水稻等手段证明了该代谢基因簇所编码的生物合成步骤。利用转基因技术分别获得了超表达OsTHT1和OsTHT2基因的水稻植株，靶向代谢组学检测结果显示OsTHT1和OsTHT2超表达转基因水稻比野生型水稻明显积累更多的羟基肉桂酰酪胺代谢产物，接病实验结果显示相比于野生型水稻，这些超表达转基因水稻对水稻两大典型病害(白叶枯和稻瘟病)具有更强的抗性。本发明揭示了水稻芳香族酚胺基因簇在水稻广谱抗病方面的作用，为水稻抗性方面的遗传改良育种提供了新的基因资源。

背景技术

植物是固着生长，不可移动的，为了适应周围不断变化的生存环境，如自然灾害，病虫的侵袭，动物的咬食以及人类的活动，植物会产生各种各样的代谢产物。这些代谢物往往不是细胞正常生命活动所必需的，但是对植物适应环境非常重要。这个过程称为植物次生代谢，而这些代谢物统称为植物次生代谢产物(Croteau 2000)。植物抗毒素就是一类典型的具有活性，能够抵御病害反应的小分子次生代谢物。

水稻(Oryza sativa L.)是全世界最重要的粮食作物之一，白叶枯病和稻瘟病等重要病害严重影响并制约了水稻的产量(Chen and Ronald 2011)。近年来，大量研究聚焦于分离抗性基因来提高水稻对病害的抗性，但这些抗性基因往往只对某一种病害发挥关键作用。目前，仅有较少的研究关注水稻中的植物抗毒素积累对水稻广谱病害防御的关键作用。已报道的植物抗毒素大部分是萜类化合物，其生物合成受病原菌诱导，在水稻叶片中积累并表现出明显的抗菌活性(Lu et al 2018)。酚胺，也被称为羟基肉桂酰胺，指由羟基肉桂酸基团和胺类基团通过酰胺键(-CO-NH-)相连而成的化合物，是一类广泛分布且特异存在于植物中的次生代谢产物，是植物苯丙烷代谢途径的主要分支之一(Bassard et al2010)。越来越多的研究证据表明，酚胺(尤其是芳香族酚胺)的合成在机械损伤、病虫害侵袭和激素茉莉酸外源处理时会被显著诱导，暗示其在植物中可能具有广谱的防御作用(Zeiss et al 2020)，但是酚胺在水稻抵御白叶枯病害和稻瘟病害过程中的作用至今没有被报道。

植物代谢基因簇是指参与同一条植物代谢途径的多个不同酶家族来源的基因分布在同一条染色体上相邻或是相近的位置(Nutzmann et al 2016)。借助合成生物学等方式可以有效的利用这类代谢基因簇大量生物合成重要的目标代谢产物。近年来酚胺合成的基因在其他物种中也有部分报道(Back et al 2001；Kang et al 2006；Kim et al 2011)，但是这些研究聚焦于某一个催化步骤，酚胺合成的代谢基因簇仍有待挖掘。

综上，解析水稻中控制酚胺合成的代谢基因簇并探究其在水稻防御白叶枯病和稻瘟病中的作用具有重要意义，不仅有助于理解水稻等作物适应环境的具体机制，也可以进一步将其应用到水稻抗性方面的遗传改良过程中，满足人类生存和发展的需要。

发明内容

本发明的目的是在于突破目前对植物抗毒素的认知，分离并克隆羟基肉桂酰酪胺合成途径的代谢基因簇(包括OsPDX3，OsTyDC1，OsTHT1和OsTHT2)，并利用体外酶活测定和超表达转基因水稻等手段验证该基因簇编码的生物合成途径和其终产物参与水稻广谱抗白叶枯病和稻瘟病的功能，为利用该基因簇进行水稻抗性方面的遗传改良奠定基础。

本发明涉及分离一种包含OsPDX3(水稻基因组数据库TIGR，基因号：LOC_Os10g23120)基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段所编码的蛋白赋予植物具有催化磷酸吡哆醇生成磷酸吡哆醛的酶活功能。分离的OsPDX3基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示,其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:2所示。

本发明涉及分离一种包含OsTyDC1(水稻基因组数据库TIGR，基因号：LOC_Os10g23900)基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段所编码的蛋白赋予植物具有催化酪氨酸脱羧生成酪胺的酶活功能。分离的OsTyDC1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:3所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:4所示。对SEQ ID No:4所示序列进行蛋白质保守结构域分析，结果表明其属于磷酸吡哆醛(PLP)依赖的脱羧酶家族。

本发明涉及分离一种包含OsTHT1(水稻基因组数据库TIGR，基因号：LOC_Os10g23310)基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段所编码的蛋白赋予植物具有催化芳香族胺类(酪胺、色胺、5-羟色胺等)和羟基肉桂酰辅酶A生成羟基肉桂酰胺的酶活功能。分离的OsTHT1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:5所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQID No:6所示。该基因(片段)负责水稻中芳香族酚胺的积累，赋予水稻对白叶枯病和稻瘟病引起的病害产生广谱的抗病反应。对SEQ ID No:6所示氨基酸序列进行蛋白质保守结构域分析，结果表明其属于BAHD酰基转移酶基因家族。

本发明涉及分离一种包含OsTHT2(水稻基因组数据库TIGR，基因号：LOC_Os10g23820)基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段所编码的蛋白赋予植物具有催化芳香族胺类(酪胺、色胺、5-羟色胺等)和羟基肉桂酰辅酶A生成羟基肉桂酰胺的酶活功能。分离的OsTHT2基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:7所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQID No:,8所示。该基因(片段)负责水稻中芳香族酚胺的含量的积累，赋予水稻对白叶枯病和稻瘟病引起的病害产生广谱的抗病反应。对SEQ ID No:8所示序列进行蛋白质保守结构域分析，结果表明其属于BAHD酰基转移酶基因家族。

本发明的技术方案如下：

为了解析水稻代谢组自然变异的遗传和生化基础，前期研究中对529份水稻自然品种中所检测到的840种代谢产物进行了mGWAS(代谢物全基因组关联分析)(Chen et al2014)。基于此代谢组数据，本发明重点关注代谢物酪胺在群体中的含量差异，代谢物全基因组的关联分析结果表明，酪胺的含量在水稻群体中的变异和水稻10号染色体上11.8Mb-12.8Mb的位置具有极高的相关性。结合水稻基因组中(水稻基因组数据库TIGR)该区域基因注释信息，确定参与酪胺合成和下游代谢的候选基因，1个吡哆醇5'-磷酸氧化酶(由OsPDX3编码)，1个酪氨酸脱羧酶(由OsTyDC1编码)和2个酰基转移酶(由OsTHT1和OsTHT2编码)；并且这些候选基因分布在基因组上195kb的范围内。综合来看，这些候选基因主要属于三类不同的酶家族，该特征符合对植物代谢基因簇的定义，因此发明人根据其终产物是羟基肉桂酰酪胺，将此代谢基因簇命名为“羟基肉桂酰酪胺基因簇”。本发明分离并克隆了上述候选基因，即羟基肉桂酰酪胺合成途径的代谢基因簇组分(包括OsPDX3，OsTyDC1，OsTHT1和OsTHT2)，并利用体外酶活测定和超表达转基因水稻等手段验证该基因簇的终产物羟基肉桂酰酪胺的生物合成途径和其参与水稻广谱抗白叶枯病和稻瘟病的功能。

本发明为水稻广谱抵御白叶枯病和稻瘟病提供了一个新的方法。这种方法包括将羟基肉桂酰基因簇组分OsTHT1和OsTHT2 DNA片段与目的载体(pJC034)利用Gateway系统(Gonget al 2013)相连，阳性克隆再进行农杆菌介导的遗传转化，转化水稻品种为空育131，分别得到OsTHT1和OsTHT2超量表达植株。在T2代转基因阳性植株体内过量积累芳香族酚胺，赋予水稻对白叶枯和稻瘟病的广谱抗病反应。

本发明的优点在于：

本发明首次在水稻中克隆了一个控制芳香族酚胺合成的代谢基因簇，利用体外酶活测定和超表达转基因水稻等手段验证该基因簇编码羟基肉桂酰酪胺合成的三个连续步骤，其终产物羟基肉桂酰酪胺可以增强对白叶枯病和稻瘟病的广谱抗性功能，为利用该基因簇进行水稻抗性方面的遗传改良奠定基础，也为其他作物中相关代谢基因簇的挖掘及在抗性育种方面提供技术借鉴。

附图说明

SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的OsPDX3基因的全长核苷酸序列，序列长度为6053bp，其中包含其5’UTR、CDS、3’UTR。

SEQ ID NO:2是本发明分离克隆的OsPDX3基因编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是本发明分离克隆的OsTyDC1基因的全长核苷酸序列，序列长度为1581bp，其中包含其CDS序列。

SEQ ID NO:4是本发明分离克隆的OsTyDC1基因编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是本发明分离克隆的OsTHT1基因的全长核苷酸序列，序列长度为2043bp，其中包含其5’UTR、CDS、3’UTR。

SEQ ID NO:6是本发明分离克隆的OsTHT1基因编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是本发明分离克隆的OsTHT2基因的全长核苷酸序列，序列长度为1701bp，其中包含其5’UTR、CDS、3’UTR。

SEQ ID NO:8是本发明分离克隆的OsTHT2基因编码的氨基酸序列。

图1：羟基肉桂酰酪胺合成途径示意图。

图2：原核蛋白表达载体PGEX-6P-1的结构示意图及OsPDX3(86kDa)、OsTyDC1(82kDa)、OsTHT1(72kDa)和OsTHT2(73kDa)与GST融合蛋白纯化后SDS-PAGE凝胶电泳图。

图3：重组蛋白OsPDX3和OsTyDC1的体外酶活。a图显示色谱峰图依次展示了重组蛋白OsPDX3与底物PNP反应的酶活力结果。b图显示底物PNP和产物标准品PLP的质谱碎片。c图显示色谱峰图依次展示了重组蛋白OsTyDC1与底物酪氨酸反应的酶活力结果。d图显示底物酪氨酸和产物标准品酪胺的质谱碎片。e图显示重组蛋白OsTyDC1的酶动力特征。f图显示使用AOA作为竞争性抑制剂验证OsTyDC1的酶活对PLP的依赖性。I₅₀,反应产物被抑制50％时的抑制剂浓度。

图4：重组蛋白OsTHT1和OsTHT2的体外酶活。色谱峰图展示了重组蛋白OsTHT1和OsTHT2催化香豆酰辅酶A和酪胺的组合反应。Cou，香豆酰辅酶ATam，酪胺；standard代表底物酪胺和产物香豆酰酪胺的标准品。

图5：羟基肉桂酰酪胺基因簇组分在茉莉酸、白叶枯菌和稻瘟菌处理后的基因表达模式。水稻看家基因OsUbc13的表达量作为样品量一致的参照。hpi，接病后小时数。

图6：遗传转化超表达载体pJC034的结构示意图。

图7：T2代遗传转化植株中的OsTHT1和OsTHT2基因表达量。对照品种为水稻空育131，标记为WT。标准差基于三个生物学重复，每个样品为3株材料的混合样。显著性分析分别表示为*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001(t检验)。

图8：T2代OsTHT1和OsTHT2基因超表达遗传转化植株代谢物检测。标准差基于三个生物学重复，每个样品为3株材料的混合样。对照品种为水稻空育131，标记为WT。Ben，苯甲酰辅酶A；Cin，香豆酰辅酶A；Caf，咖啡酰辅酶A；Fer，阿魏酰辅酶A；Tam，酪胺；Trm，色胺；Ser，5-羟色胺。

显著性分析分别表示为*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001(t检验)。

图9：T2代OsTHT1和OsTHT2基因超表达遗传转化植株接病后病斑表型及统计数据。其中a图和b图分别为OsTHT1和OsTHT2基因超表达遗传转化植株接菌白叶枯菌PXO341病原菌14天后的病斑长度统计和白叶枯菌菌生物量统计，标准差基于3～10片接病叶子的生物学重复。c图和d图分别为OsTHT1和OsTHT2基因超表达转基因水稻接菌稻瘟菌RB22病原菌10天后的病斑长度统计和稻瘟菌生物量统计，标准差基于三个生物学重复。对照品种为水稻空育131，标记为WT。显著性分析分别表示为*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001(t检验)。

具体实施方式

以下实施例进一步定义本发明，并描述了分离羟基肉桂酰酪胺合成途径的代谢基因簇中包含的基因(OsPDX3，OsTyDC1，OsTHT1和OsTHT2)，体外酶活测定，遗传转化，以及广谱病原菌防御方面的应用。根据以下的描述和这些实施事例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：羟基肉桂酰酪胺基因簇的发现和定义

为了解析水稻代谢组自然变异的遗传和生化基础，前期研究中对529份水稻自然品种中所检测到的840种代谢产物进行了mGWAS(代谢全基因组关联分析)(Chen et al2014)。本发明重点关注代谢物酪胺在群体中的含量差异，全基因组的关联分析结果表明酪胺的含量变异和水稻10号染色体上11.8Mb-12.8Mb的位置具有极高的相关性。对酪胺代谢物的化学结构进行分析得知，酪胺是由氨基酸酪氨酸进行脱羧反应生成，进而可以和羟基肉桂酰辅酶A进行缩合反应生成代谢物羟基肉桂酰酪胺，前者主要由一类PLP依赖的酪氨酸脱羧酶催化，后者主要由BAHD家族酰基转移酶催化反应。根据此催化合成步骤并结合水稻基因组中(水稻基因组数据库TIGR)该位置基因注释信息，确定参与酪胺合成和进一步代谢的候选基因，1个吡哆醇5'-磷酸氧化酶(由OsPDX3编码)，1个酪氨酸脱羧酶(由OsTyDC1编码)和2个酰基转移酶(由OsTHT1和OsTHT2编码)。对基因的相对位置进行计算发现这些负责催化连续生化反应的基因分布在195kb的范围内。综合来看，候选基因主要属于三类不同的酶家族，基因相对位置分布小于200kb，该特征符合对植物代谢基因簇的定义，因此发明人根据其终产物是羟基肉桂酰酪胺，将此代谢基因簇命名为“羟基肉桂酰酪胺基因簇”(图1)。

实施例2：羟基肉桂酰酪胺基因簇组分(OsPDX3，OsTyDC1，OsTHT1和OsTHT2)的克隆及原核蛋白表达

1.OsPDX3，OsTyDC1，OsTHT1和OsTHT2基因的克隆和基因结构分析

申请人根据OsPDX3，OsTyDC1，OsTHT1和OsTHT2基因在粳稻“日本晴”基因组中的位置和结构(水稻基因组数据库TIGR)，于是根据预测的这些候选基因全长开放阅读框序列，设计带有同源重组接头的PCR特异引物(表1，由擎科生物公司合成)使用超保真KOD酶(大连宝生物工程有限公司)扩增上述4个基因的全长CDS片段。每个基因的PCR的产物纯化后在重组酶Exnase MultiS(南京诺唯赞公司)的作用下，分别与线性化的pGEX-6P-1载体(图2a，美国Invitrogen公司)进行同源重组反应后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。菌落PCR验证以获得阳性克隆，测序(武汉擎科生物公司)得到含有候选基因的无突变的正确克隆。

表1本发明中构建蛋白表达载体所用的引物

OsPDX3基因编码的蛋白质由549个氨基酸组成，用BLASTP(Altschul et al 1997)报道的方法对候选的OsPDX3编码的蛋白进行同源比对分析发现OsPDX3蛋白质与拟南芥的吡哆醇5'-磷酸氧化酶AtPDX3的氨基酸序列相似性为70.6％，因此预测OsPDX3蛋白质也具有吡哆醇5'-磷酸氧化酶的催化功能。根据InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)(Blum et al 2020)对蛋白质保守结构域进行预测，OsTyDC1基因编码的蛋白质由527个氨基酸组成，其包含一个大的高度保守的PLP依赖的酪氨酸脱羧酶结构域。使用InterProScan在线网站对OsTyDC1基因编码的蛋白质保守结构域进行搜索，发现该基因编码一个酪氨酸脱羧酶。OsTHT1和OsTHT2(Tyramine:N-hydroxycinnamoyl transferase,THTs)基因编码的蛋白质分别由437个和435个氨基酸组成，同源性分析发现这两个基因具有81.24％的同源性。使用InterProScan在线网站对OsTHT1和OsTHT2基因编码的蛋白质保守结构域进行搜索，发现该这两个基因都编码酰基转移酶。结合前人的研究结论BAHD酰基转移酶家族是一类数目庞大的蛋白家族，它的命名来自于该家族中最初鉴定的四个酰基转移酶(BEAT，AHCT，HCBT和DAT)的首字母缩写)，该基因家族的酶具有两个保守的结构域，分别位于序列中部的HXXXD结构域和位于C端的DFGWG结构域(D’Auria 2006)。蛋白的三维结构显示，HXXXD正好位于蛋白的催化中心，其中组氨酸残基对蛋白活力至关重要(Ma et al2005)。利用MEME在线网站(http://meme-suite.org/tools/meme)对OsTHT1和OsTHT2基因编码的蛋白质结构进行分析得知这两个基因含有上述两个典型的HXXXD和DFGWG保守结构域，因此这两个基因所编码的酶属于BAHD酰基转移酶家族。

2.OsPDX3，OsTyDC1，OsTHT1和OsTHT2基因的原核表达及融合蛋白纯化

将带有目的片段OsPDX3，OsTyDC1，OsTHT1和OsTHT2的质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(上海唯地生物)中，挑取单菌落，接种于5mL含50μg/mL氨苄青霉素抗生素的LB培养基中，37℃过夜培养。次日取菌液按1：50接种至200mL含有50μg/mL氨苄青霉素抗生素的LB中，37℃200rpm扩大培养3小时，至菌液OD_600nm在0.5左右。吸取扩大培养后菌液10mL，不加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，上海生工股份有限公司)，作为空白对照。剩余菌液中加入IPTG(终浓度0.1-0.5mmol/L)，诱导蛋白表达。两者在18℃，200rpm的条件下培养过夜。用500mL离心管收集菌体，8000rpm，4℃离心5min。倒掉上清，加入50mL左右的ddH₂O洗菌体一遍，8000rpm，离心5min。倒掉上清，根据菌体浓度加入适量的PBS缓冲液悬浮菌体，置于冰上。使用高压细胞破碎仪(苏州安拓思纳米技术有限公司)对悬浮菌体进行细胞破碎。破碎的菌体始终保持在冰水混合物上，12000rpm 4℃离心30min，分离上清和沉淀。在沉淀中加入适量1×SDS Loading buffer，取200μL上清，加入50μl 5×SDS Loadingbuffer，在恒温器上100℃加热5min。加热后的样品冷却到室温后，12000rpm离心2min。取上清20uL点样，进行SDS-PAGE检测。比较不诱导、诱导后的细菌总蛋白确定目标蛋白的表达与否，目标蛋白存在于细胞破碎后的上清还是沉淀表明它的可溶性程度。

将谷胱甘肽琼脂糖4B琼脂糖(美国GE Healthcare公司)加入含有靶蛋白的上清液中。低温孵育1小时后，将混合物转移到纯化柱子中，用PBS缓冲液(5倍柱体积)充分洗涤，收集流出液。待洗涤充分后，再向纯化柱中加入含有15mmol还原型谷胱甘肽(上海生工股份有限公司)的PBS缓冲液。每次加入1mL，同时收集1mL穿流液，重复5-6次即可。通过SDS-PAGE确认所收集的穿流液中是否含有目标蛋白，如图2b所示，发明人依次获得纯化良好的OsPDX3，OsTyDC1，OsTHT1和OsTHT2蛋白融合GST标签蛋白的重组蛋白，将上述蛋白分装保存于-80℃冰箱待用。

实施例3：羟基肉桂酰酪胺基因簇组分(OsPDX3，OsTyDC1，OsTHT1和OsTHT2)的体外酶活测定

1.OsPDX3蛋白的体外酶活测定

为了验证候选基因OsPDX3的功能，发明人使用上述纯化的OsPDX3蛋白的进行体外酶活测定。OsPDX3蛋白体外酶活反应体系是20μL，以终浓度为25μmol/L 5’-磷酸吡哆醇(PNP，美国sigma公司)为底物，600ng纯化OsPDX3-GST重组蛋白(同时设置GST标签蛋白为负对照)，100mmol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.5)，在37℃孵育1小时后，加入40μL预冷的甲醇终止反应。将反应混合物通过4℃13000rpm离心10min，得到的上清用于LC-MS(LCMS-8060，日本岛津公司)分析。检测结果表明反应产物出现明显的色谱峰并且其保留时间和碎片模式与化合物5’-磷酸吡哆醛(PLP，美国sigma公司)标准品相同，说明OsPDX3蛋白催化PNP生成了PLP(图3a-b)。

2.OsTyDC1蛋白的体外酶活测定

为了验证候选基因OsTyDC1的功能，发明人使用上述纯化的OsTyDC1重组蛋白进行体外酶活测定。OsTyDC1蛋白体外酶活反应体系是20μL，以终浓度为50μmol/L酪氨酸(上海生工有限公司)为底物，25μmol/L 5’-磷酸吡哆醛(PLP，美国sigma公司)为底物，500ng纯化的OsTyDC1-GST重组蛋白(同时设置GST标签蛋白为负对照)，100mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，在37℃孵育30min后，加入40μL预冷的甲醇终止反应。将反应混合物通过4℃13000rpm离心10min，得到的上清用于LC-MS(LCMS-8060，日本岛津公司)分析。反应产物在1.4分钟出现明显的色谱峰并且其保留时间和碎片模式与化合物酪胺标准品(美国sigma公司)相同，说明OsTyDC1蛋白能够催化酪氨酸生成了酪胺(图3c-d)。

为了深入了解OsTyDC1蛋白的酶学特征，发明人对其酶动力学参数进行了测定。反应混合物中设置底物酪氨酸浓度从0到5mmol/L，100ng OsTyDC1蛋白和25μmol/L辅助因子PLP。利用软件SigmaPlot 12.5的酶动力学计算模块，选用Michaelis-Menten模型计算OsTyDC1蛋白对酪氨酸底物的Km值以及kcat值，其中每个反应重复两次。测定结果显示OsTyDC1蛋白对底物酪氨酸的Km值约为152.19μmol/L，kcat值约为0.42s^-1(图3e)。

为了验证OsTyDC1蛋白的酶活力对磷酸吡哆醛(PLP)的依赖性，发明人依次使用0-10mmol/L的竞争性抑制剂羟胺-O-乙酸(AOA,美国sigma公司)添加到OsTyDC1蛋白体外酶活反应体系中。相同反应时间内，反应产物酪胺的含量用于反映OsTyDC1的酶活力，I₅₀代表反应产物被抑制一半时对应的底物浓度的参数，实验结果表明I50约为9μmol/LAOA并且约5mmol/LAOA就能完全抑制OsTyDC1蛋白对酪氨酸进行脱羧反应的能力(图3f)。上述这些结果综合说明OsTyDC1基因编码的蛋白是一种PLP依赖的酪氨酸脱羧酶。

3.OsTHT1和OsTHT2蛋白的体外酶活测定

为了验证候选基因OsTHT1和OsTHT2的功能，发明人使用上述纯化的OsTHT1和OsTHT2蛋白的进行体外酶活测定。

酰基转移酶体外酶活反应体系是20μL，含有200μmol胺类底物，1mmol羟基肉桂酸辅酶A，500ng纯化蛋白，100mmol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.4)。在37℃孵育30min后，加入40μL预冷的甲醇终止反应。将反应混合物通过4℃13000rpm离心10min，上清用于LC-MS(LCMS-8060,日本岛津公司)分析。LC-MS检测结果显示，在OsTHT1和OsTHT2蛋白的反应产物中均检测到了羟基肉桂酰酪胺，说明这两个酶都具有催化酪胺酰基化修饰合成羟基肉桂酰酪胺的功能，负责羟基肉桂酸酪胺基因簇的最后一步催化反应(图4)。

为了深入了解OsTHT1和OsTHT2蛋白的酶学特征，发明人对其酶动力学参数进行了测定。酶动力学测定方法如下：固定胺类底物(包括色胺、酪胺和5-羟色胺)最终浓度在1mmol，改变羟基肉桂酸辅酶A(包括苯甲酸辅酶A、香豆酰辅酶A、咖啡酰辅酶A和阿魏酰辅酶A)浓度由低至高，设置8-10个浓度梯度。每个浓度下的体外反应同时进行，同时结束，测定产物酚胺的最终生成量。利用软件SigmaPlot 12.5的酶动力学计算模块，选用Michaelis-Menten模型计算酰基转移酶对辅酶A底物的Km值以及kcat值。类似地，固定辅酶A浓度，改变胺类底物浓度，可以测定酰基转移酶对胺类底物的Km值以及kcat值。酶动力数据显示，OsTHT1和OsTHT2对三种芳香胺的亲和力相似(表2)。对于OsTHT1而言，它对苯甲酰辅酶A和咖啡酰辅酶A的Km明显小于香豆酰辅酶A。而OsTHT2则不能利用苯甲酰辅酶A。这些实验结果说明，OsTHT1和OsTHT2是既可以利用色胺又可以利用酪胺的双功能酰基转移酶。

表2 OsTHT1和OsTHT2的酶动力特征

注：NA，K_m数值太大而无法精确测定；ND，无法检测到活力。

实施例4：羟基肉桂酰酪胺基因簇组分的表达模式分析

为了验证接种白叶枯病和稻瘟病是否会诱导羟基肉桂酰酪胺基因簇组分的表达，本发明的研究人员进行了如下的实验研究：(1)分别使用0μmol、1μmol、5μmol浓度的茉莉酸甲酯外源处理4周左右苗期的水稻品种中花11植株。处理24小时之后分别取样水稻叶片组织提取总RNA。(2)对生长6周左右的水稻中花11叶片进行接菌白叶枯病菌处理(同时设置空白对照，标记为Mock)，分别在处理后0小时、12小时和24小时取水稻叶片组织提取总RNA。(3)对生长6周左右的水稻中花11叶片进行接稻瘟病菌处理(同时设置空白对照，标记为Mock)，分别在处理后0小时、24小时和48小时取水稻叶片组织提取RNA。对上述抽提的总RNA进行反转录。反转录具体步骤如下：取3～5g总RNA用DNaseI(美国Invitrogen公司)处理15min以去除基因组DNA污染，使用oligo(dT)18寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录。采用实时定量PCR分析试剂盒Green PCR Master Mix(宝生物工程大连有限公司)，根据试剂盒的使用说明书操作，在ABI 7500 Real-Time PCR system仪器(美国Applied Biosystems公司)上进行实时定量PCR反应。使用相对定量方法量化基因表达(Livak and Schmittgen 2002)。用水稻看家基因OsUbc13的表达量衡量并均一化样品RNA含量。qRT-PCR分析中的4个组分基因特异PCR引物如表3所示。qRT-PCR分析显示，羟基肉桂酰酪胺基因簇4个组分基因都受到茉莉酸激素和两种病原菌不同程度的诱导表达(图5)，说明这4个组分基因都参与水稻对两种病原菌的防御过程。

表3超表达载体构建和qRT-PCR检测所用引物

实施例5：羟基肉桂酰酪胺基因簇组分OsTHT1和OsTHT2超表达转基因材料的构建和遗传转化

超量表达遗传转化载体的构建

为了验证水稻植株对白叶枯病和稻瘟病的抗性是否与OsTHT1和OsTHT2基因的表达量相关。申请人将OsTHT1和OsTHT2基因的PCR产物(表3，使用含有attB1和attB2接头的引物扩增得到)与供体载体pDONR207(购自Invitrogen公司)混合，加入BP重组酶(美国invitrogen公司)进行同源重组反应，即可转化并得到带有目的基因的入门载体。然后在得到的入门载体的克隆中，利用LR重组酶(美国invitrogen公司)将目的基因再重组到目标超表达载体pJC034上(载体图谱见图6，该载体为发明人所在实验室改造后的载体，携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素基因启动子，能用于农杆菌介导的基因的超表达遗传转化)。

2.遗传转化和遗传转化植株OsTHT1和OsTHT2基因表达量的分析

通过农杆菌EHA105(该菌株来自澳大利亚CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)介导和水稻遗传转化体系，将正确克隆的质粒导入到水稻品种空育131中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤组织、再进行分化、生根、炼苗和移栽等步骤，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要是在Hiei等人报道的方法基础上(Hiei et al 1994)。本发明分别获得OsTHT1和OsTHT2独立转化植株65株和80株。

采用实时定量PCR分析检测基因在植物体内的表达量。将得到的超量表达植株进行繁殖，得到T2代转基因植株。结果显示，与对照野生型(非转基因水稻)空育131相比，阳性转化植株体内的OsTHT1(RH866和RH868家系)和OsTHT2基因的表达量获得大幅度提高(图7)。

3.OsTHT1和OsTHT2基因遗传转化植株代谢物分析

为了进一步验证候选基因在水稻体内调控代谢物合成的功能，发明人分别选取了OsTHT1和OsTHT2转基因材料的T2代植株中超表达倍数较高的家系OsTHT1(RH866和RH868家系)和OsTHT2(RH872和RH873家系)，对水稻叶片中的芳香族酚胺类物质包括羟基肉桂酰酪胺，羟基肉桂酰色胺和羟基肉桂酰5羟色胺进行LC-MS检测和分析。检测结果显示，相比于野生型材料，OsTHT1和OsTHT2的超表达植株中，这三类芳香族酚胺的含量均明显提高，说明OsTHT1和OsTHT2基因在水稻体内主要负责芳香族酚胺类物质的合成(图8)。

实施例6：酰基转移酶OsTHT1和OsTHT2转基因材料的接病处理

为了验证候选基因OsTHT1和OsTHT2在水稻抵御白叶枯病和稻瘟病过程中的作用，本发明的研究人员对OsTHT1和OsTHT2转基因材料在苗期接种白叶枯病菌菌株PX0341和稻瘟病菌株RB22。

水稻白叶枯病菌接菌具体的操作方法如下：水稻白叶枯病菌的培养采用土豆固体培养基(土豆300g，蔗糖15g，硝酸钙0.5g，十二水合磷酸氢二钠2g，蛋白胨5g，琼脂20g；加入蒸馏水至1L，调节pH至6.8～7.0)。培养温度为28℃，时间为2-3天。接种时，用蒸馏水稀释培养好的菌株，使其浓度为9×10⁹个/mL。白叶枯病菌的接种采用剪叶法(Sun et al 2004)，接种两周到三周后测量病斑长度及病叶长度，以病斑长度和病菌的生物量来衡量发病情况。

本发明中，水稻稻瘟菌接菌采用打孔接种的方式(Wang et al 2016)，具体的操作方法如下：将稻瘟菌种RB22接种在燕麦培养基(燕麦片30g,琼脂15g,加入蒸馏水至1L)上于25℃培养箱中暗培养10天，待菌丝长满培养皿后，刮去菌丝并用灭菌吐温水洗，晾干后在光照培养箱25℃培养7天，检查稻瘟菌产孢效果并用于接种。用0.05％的吐温水刮洗孢子，调节孢子浓度为3～4×10⁵个/mL；选取培养6～8周的水稻倒二叶进行接种；在距离叶尖适当位置处，取4厘米长胶带粘于叶片背部，用夹子轻轻夹一下粘有胶带的叶片中间部位，制造伤口，避免叶脉部位，注意不要将叶片打穿；吸取6μL孢子悬浮液滴于伤口处；用胶带轻轻包住液滴，将胶带四周粘住，不要留缝隙，尽量不要孢子悬浮液挥发；用避光布或黑色塑料袋罩住接种植株，置于25℃，95％湿度，黑暗环境培养；24小时后揭掉避光布，25℃，95％湿度，光照12小时，黑暗12小时交替培养；10～14天后调查病斑的长度和病原菌的生物量来衡量水稻发病情况。

结果显示，接种白叶枯病菌14天后，和野生型植株对照相比，OsTHT1和OsTHT2的超表达株系都呈现较短的病斑长度，其长度几乎减少到了50％。病原菌生物量定量统计显示，超表达植株叶片上的白叶枯病原菌生物量仅仅相当于野生型植株叶片上白叶枯病原菌生物量的40％～60％。类似地，与野生型植株对比，OsTHT1和OsTHT2超表达植株接菌稻瘟病菌株10天后的病斑长度和病原菌生物量显著降低至40％～60％，即抗性显著增强(图9)。结合上述结果表明，超表达羟基肉桂酰酪胺基因簇组分OsTHT1和OsTHT2基因能够显著增强水稻叶片中芳香族酚胺的积累，从而增强对水稻白叶枯病和稻瘟病的广谱抗性，因此可以采用这一途径来培育高抗水稻。

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序列表

<110> 海南大学

华中农业大学

<120> 水稻中一个芳香族酚胺合成基因簇的克隆及抗病方面的应用

<140> 2021101416599

<141> 2021-02-02

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6053

<212> DNA

<213> Artioposthia triangulata

<400> 1

agacgggtgg gcaactgggg cgacgatgct gaccgtggcg gcttccgcac tccgcaacaa 60

caaaaaatcc accgccgcgg cctgcttctc ccttgctatg cccttcctcc tctcctcccc 120

cacccctcct cccccacctc actcctcctc tctcccccgg agccctagcc ctcgccctcg 180

cctcccgctc ccgccacccc gccgcgccgc cctcgtcacc gccgcgcagg accctcggtg 240

gcggcgggcc atggcgtcgc tggccgtctc ggcgtccgcg tcggcgtcgg gggaggaggt 300

gacgcacctc gcgcagcggg aggcggcgga gatcgacgag cagctcatgg gcccgctcgg 360

cttcagcgtc gaccagctca tggtccggta ctcctccctc cctcccccgg cctccactcg 420

gcttctctga ctcatccatc ccttgggttt ggtgtgtgtg tgtgtgcagg agcttgcggg 480

gcttagcgtt gcggcggcgg ttgcggaggt aaaggcaccc gctcagaggc tttgtttccc 540

ccgatttggg tgatgatgtt tactgtgtga tgggtttcag tacctttcaa ttttggttgc 600

tgtggcggtt tcaatcgttt cttgctactt atttggccac tacaggagca actgttcatg 660

gtcattatgg acaaaacctt tacaaagggg ataggctagg ctgtgtttag ttccaccggc 720

aaaaaaaaat tgctgggcca catcaaatat atagacacac atttgaagta ttaaatgtag 780

actaataaca aaacaaatta cataatccac atgtaaactg cgagacgaat ttattaagcc 840

taattaatcc gtcattagca aatgtttact gtagcaccag attgtcagat catggcacaa 900

ttaggcttaa aagattcgtc tcgcaattta cacgcaatct gtgtaattag tttttttttg 960

tcaatattta atactccgta catgtgttca aacgttcgat gtgacggggc aaaaaaattt 1020

gccggtggat ctaaacaccc ccttagttac gtttatatac gagaaagcga tatctagtga 1080

cataacgcaa ggtcttccaa aagtagaaca aatcttcaaa gcgcgttcaa ttgattcact 1140

atcgctgaat ctcgaaagga atttgtgctc ccaatacgta actgccttac ctgaatgtgt 1200

tgatattatg ctggagtatt gtgtttcttc aagacgtggt agtttgatta ataagcatgt 1260

aaattagcga ctctaatcag caacgaggag ttgcacaact ttttggcttt gttactgtag 1320

ctggtgtact cgtgctctgc agttttgttt caagattttt ttaaaaaatc atgcatataa 1380

tcatctaggt tggaatgcag cactaccgca ttatcatgct gtttcctgtt gttgctgaac 1440

atgatgagaa atgcaactaa tcatcttgtg cctggctgtc tgctgtcaaa gaatggacta 1500

gccaatacag caatgaagtg atttaactgt ttaatgggtt tgtgtaattc cactaacttt 1560

gagtagagaa aatgaaatct ggtcagacct aaaaaaatgg aactgtcatc atgtggttca 1620

catttttctt tctttggatt tccttcttgt acctgtttgt tactgttatg agtcttaatt 1680

agtgatactt tattgtattg accccccaaa aaaaatcaca ggtttacaag ttgggtgaac 1740

atacaagggt gctagtaatc tgtggtccag gaaataatgg tggtgatggt ctggtagctg 1800

ctcgtcatct tcatcacttt gggtacaagc cttctgtatg ttatccaaaa cgcacgccca 1860

agcctctgta ttctggcctt tgtactcagg taaactgata tatcctgttc cattttcttg 1920

gcgtgccaaa tgcttcctct tttccaatat aattcgagcc actcttttgt ttcagcttga 1980

atcactaaca atccctttcg ttcctgttga agacctacct gcaaatttat cggaggagtt 2040

tgacatcatt attgatgcaa tgtttggttt ttcgtttcat ggtatgtgca tgctatccaa 2100

tatcttatca taatcatagt aattttgatg tgaagctggt actagggaac tgatcagtgc 2160

ctgctactta tatatttatt ccttatgaat attctgtatg atgtgatttg taaagtaagg 2220

ccatagattc tctgttagac tgtagtgtgg tagtctcttt atcaacagga acttaggaat 2280

gaaacaagtg agaattgatg tagctcaact gtggtatgaa taacagctga tgtcatgtaa 2340

tatattacta gttcttttgt cgcaaattgt atttgagact ttgttaaata tactgtatcg 2400

atcttgttat atgtcaagtt ttttttttct tttgataatg ggacaattga cagatttgta 2460

tgagtgaaca actaaggcat agtttactgc actgttttac taaagcaaga atgatttgtg 2520

cattaagata atgctgccaa tgctatcatt tggattaaat tggattggat tgagcccaga 2580

tcccagagtt agcccccatt gcatttgcaa cgcaggaatt tataggatta attcacaaga 2640

atcatttcat gtaccacatg aattgagaaa aggccttaag ttccaaaagg gttttcagtg 2700

agtctgttcc tgagctcagt gatgctttca tttattttag cttttttttt tcttttggga 2760

aatatcaatg caggaacacc aagaccacca tttgatgatc ttatcaacag gcttgtttca 2820

ctgagtgcta ttgataattc tgctaaaaga ccagcaattg tttctgttga tatcccttcg 2880

gggtggcacg ttgaagaggg agatatcaat ggaggagggt ttaaacctga tatgctggtt 2940

agcaacttag catccttttc agaagctttc tggatttgaa tcaatatagt agtataagat 3000

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ttgactgcac caaagctctg tgcaaaaaaa tttaccggtc cacaccattt tcttgggggt 3120

agatttgttc ccccacctat tgtgagcaaa tataagcttc atcttcctcc atatcccggt 3180

acctcaatgt gtgtgagaat tggaaaagct ccatctgttg acatttcatc tctaagagaa 3240

aattacatct cccctgaact tctcgagaat caggtgatgc ctgatccatt tgatcaggta 3300

ctatcaaact gaaagaattt tgaatttatt catcttatac attagtaaag tattgttctt 3360

ctgaatggga tgaatgtttt atttgatttg cttgtagttc gttagatggt ttgatgaagc 3420

tgttactgct ggtctacgtg aaccaaatgc tatggcttta acaactgccg ataaggaggg 3480

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ctttatgtca gaatgataat tttagtggac atctgtgtgc agttcgtcaa gaatggttct 3600

tttaaagggt gttgataagc agggatttgt ttggtaaata caagtgatta cttaaacaat 3660

ttctcgctgt tagtccaagt ttctctggaa ctactgactt gtgattctgc tgggccttgt 3720

acaggtatac aaattatggt agccagaagg cacatgattt atctgagaat ccaaatgccg 3780

ctctgctttt ctactggaat gagatgaacc ggcaggtgat tttaccaatc ctatgctaaa 3840

ttgtgttatc tgtagtacta tctaatagca agaggattaa acacctttcc aacatgtaat 3900

acaaaacaaa ttcactagcg taatcaatga ccgtcaacag aatgttgctc tttgtattct 3960

gcagtttttg ctatttttgt atcttgccat gtcaatttat tgttctgcaa tcaacaatca 4020

tttgactagg ttttaagttt ctgttccatc tgatttgtag catcaattat tgaacactgt 4080

gtattcattt gttaagtaat atgcaatgag ccgtgtttca aaccagggca aagaaaatac 4140

catgttgctt tatattgcaa actcgattca gctgatgcct ggtatttatt gtcatgcagg 4200

taagagtaga aggttctgtt cagaaggttc cagaagaaga atctgagaag tatttccaca 4260

gccgcccacg agggagtcaa cttggtgcaa tagtcagcaa gcaggtactg ttattggctt 4320

attgctgttt agtacaaaaa cttatggttc ccacatgttt tactcaaaga tcaaatgaaa 4380

gtataacatg cttcaaaatg aaatgaaaat cgataatacc tatgctattt tctagagcac 4440

tatcattcct ggaagggaag ttcttcagca ggcgtacaag gaattggaac aaaagtattc 4500

tgatgggtga gtttgacatg ccagttattt ccatacttgg tattagtaca ttatttttct 4560

aattctattg gacattggca tgaactattc actttggtta tgtttttctc gggcagttta 4620

cttttgagtt atcaaattac ttcagaattt aagtcatatg gtacttttga ctactttcac 4680

catacagtag cctgaagttc aataaaaatg agctcctggc attgataaac ccagatttat 4740

ggatagtaac cattaaaatc aaggtgctga tagttatttg taaccatgaa cctatcaagc 4800

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ttggatatac aaagtttgtg atggaatgat cctcctgttg gaaacttgga gctgcagcac 4920

attgtttttg tccctctctg tatagagtgg aaaactggaa agggaaggaa agcaaattaa 4980

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tgtcgttgat ctgcagcagc gtgatcccaa aacctgatta ctggggtggg tacagattaa 5220

caccaaaact ttttgagttc tggcaaggcc aacagtctcg actgcatgac cggtatgttt 5280

catacagcca ttatattttt ctctcttatt tatttagaca acatagctat taactcgtaa 5340

tatctcgact gcatgaccgg cttcagtatt cactgcgaga agtagatagg agcacagtat 5400

ggcacatcga gaggttgtcc ccttgactag taaccccatc ccagctcttt ggtaataaaa 5460

aggatctcat cttattatca agaatcaaat cttatcccag ctgcaaggag tcccaattgc 5520

tcgatgatgt tagtgccatg attaggtcgc gtgtttgaga ctgtgagtgc ctgaagctct 5580

gctttttgac atgcccttca cacatctgat gttctctgaa gcacagagtg gatgaatcca 5640

tgaaggccct tctcttggtc ataagatttt tctgtaaatg ccattaaatt ttaaccgtcc 5700

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atcaagcata taagtcaata aagttgtgtg ctgcaatggc attgtctgct ttaccagttt 5880

gctgctagct aatagggctt tgcgtgttgc gtctgtgcct attatgatag ataaggctgt 5940

atgttttggg tcattcactc tggtgtaagc atcgtcgtgc agttgcacaa tcactgagat 6000

tactagtaac tctggcaagt ttggtagtat tggaggtatt gagattacaa gaa 6253

<210> 2

<211> 548

<212> PRT

<213> Artioposthia triangulata

<400> 2

Met Leu Thr Val Ala Ala Ser Ala Leu Arg Asn Asn Lys Lys Ser Thr

1 5 10 15

Ala Ala Ala Cys Phe Ser Leu Ala Met Pro Phe Leu Leu Ser Ser Pro

20 25 30

Thr Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Ser Ser Leu Pro Arg Ser Pro Ser

35 40 45

Pro Arg Pro Arg Leu Pro Leu Pro Pro Pro Arg Arg Ala Ala Leu Val

50 55 60

Thr Ala Ala Gln Asp Pro Arg Trp Arg Arg Ala Met Ala Ser Leu Ala

65 70 75 80

Val Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Gly Glu Glu Val Thr His Leu Ala

85 90 95

Gln Arg Glu Ala Ala Glu Ile Asp Glu Gln Leu Met Gly Pro Leu Gly

100 105 110

Phe Ser Val Asp Gln Leu Met Glu Leu Ala Gly Leu Ser Val Ala Ala

115 120 125

Ala Val Ala Glu Val Tyr Lys Leu Gly Glu His Thr Arg Val Leu Val

130 135 140

Ile Cys Gly Pro Gly Asn Asn Gly Gly Asp Gly Leu Val Ala Ala Arg

145 150 155 160

His Leu His His Phe Gly Tyr Lys Pro Ser Val Cys Tyr Pro Lys Arg

165 170 175

Thr Pro Lys Pro Leu Tyr Ser Gly Leu Cys Thr Gln Leu Glu Ser Leu

180 185 190

Thr Ile Pro Phe Val Pro Val Glu Asp Leu Pro Ala Asn Leu Ser Glu

195 200 205

Glu Phe Asp Ile Ile Ile Asp Ala Met Phe Gly Phe Ser Phe His Gly

210 215 220

Thr Pro Arg Pro Pro Phe Asp Asp Leu Ile Asn Arg Leu Val Ser Leu

225 230 235 240

Ser Ala Ile Asp Asn Ser Ala Lys Arg Pro Ala Ile Val Ser Val Asp

245 250 255

Ile Pro Ser Gly Trp His Val Glu Glu Gly Asp Ile Asn Gly Gly Gly

260 265 270

Phe Lys Pro Asp Met Leu Val Ser Leu Thr Ala Pro Lys Leu Cys Ala

275 280 285

Lys Lys Phe Thr Gly Pro His His Phe Leu Gly Gly Arg Phe Val Pro

290 295 300

Pro Pro Ile Val Ser Lys Tyr Lys Leu His Leu Pro Pro Tyr Pro Gly

305 310 315 320

Thr Ser Met Cys Val Arg Ile Gly Lys Ala Pro Ser Val Asp Ile Ser

325 330 335

Ser Leu Arg Glu Asn Tyr Ile Ser Pro Glu Leu Leu Glu Asn Gln Val

340 345 350

Met Pro Asp Pro Phe Asp Gln Phe Val Arg Trp Phe Asp Glu Ala Val

355 360 365

Thr Ala Gly Leu Arg Glu Pro Asn Ala Met Ala Leu Thr Thr Ala Asp

370 375 380

Lys Glu Gly Lys Pro Ser Ser Arg Met Val Leu Leu Lys Gly Val Asp

385 390 395 400

Lys Gln Gly Phe Val Trp Tyr Thr Asn Tyr Gly Ser Gln Lys Ala His

405 410 415

Asp Leu Ser Glu Asn Pro Asn Ala Ala Leu Leu Phe Tyr Trp Asn Glu

420 425 430

Met Asn Arg Gln Val Arg Val Glu Gly Ser Val Gln Lys Val Pro Glu

435 440 445

Glu Glu Ser Glu Lys Tyr Phe His Ser Arg Pro Arg Gly Ser Gln Leu

450 455 460

Gly Ala Ile Val Ser Lys Gln Ser Thr Ile Ile Pro Gly Arg Glu Val

465 470 475 480

Leu Gln Gln Ala Tyr Lys Glu Leu Glu Gln Lys Tyr Ser Asp Gly Ser

485 490 495

Val Ile Pro Lys Pro Asp Tyr Trp Gly Gly Tyr Arg Leu Thr Pro Lys

500 505 510

Leu Phe Glu Phe Trp Gln Gly Gln Gln Ser Arg Leu His Asp Arg Leu

515 520 525

Gln Tyr Ser Leu Arg Glu Val Asp Arg Ser Thr Val Trp His Ile Glu

530 535 540

Arg Leu Ser Pro

545

<210> 3

<211> 1581

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atggcacctg caccctcgca ctgccacgcc acgaatggca acaatggcgc catcgccgcc 60

tctgatacgc cggtgaagac acagcattgc gcgcggctgc tcgacgccga cgagttccgg 120

cgtcagggtc gtctggttgt cgaccttatc gccgactact acgccggcat gggggaatac 180

cccgtgcacc ccaccgtcag ccctggcttc ctccgccacc gcctcccggc ggagccgccg 240

tcccgccggg agcccgacgc gttcgccgcg gcgatgcagg acgtccgtga cgtcatcctg 300

ccggggctga cgcactggca gagcccccgc cacttcgcgc acttcccggc gtcgagcagc 360

accgccggcg ccctcggcga ggcgctcgcc gccggcatca acgtcgttcc cttcacgtgg 420

gccgcctcgc ctgccgccac cgagctggag atggtggtcg tggactggct cggcaaggcg 480

ctccacctgc cggagcggct gctgttcgcc ggaggcgggg gcggctccat cctcgggacc 540

acctgcgagg ccatcctctg cgccctcgtc gccgctaggg accgcaagct ggcggcgatc 600

ggcgagggga ggatcggcga cctcgtcgtc tactgctccg accagaccca cttcgcgttc 660

tgcaaggccg cgcgcattgc cggcatccgg cgcgagcatt gccgcgagat accgacctac 720

cgggacgacg cgttcgcgct ctctccggcg gcgctgcggg ccgccatgcg gcgcgacgcc 780

gacgccggcc tggtcccgct gttcgtgtgc gccacggtcg ggaccaccca gaccaccgcc 840

gtggaccccg tcggcgagct ctgcgccgcc gcggcgccgc acggcgcctg ggtgcacgtc 900

gacgcggcgt acgcggggtc ggcgatggtg tgcccggagc tccgcggcgc ggtcgccggc 960

ggcgtcgagg ccgtggactc gttcagcatg aacgcccaca agtggctgct ggcgaacaac 1020

gactgctgcg tcatgtgggt gaggacgccg tcggcgctgg tggcggcgct gggcacggac 1080

caggagtaca tcctcaagga cgccgcggcg gagacggcgg cggcggacgg cggcgagggc 1140

gtcgtggact acaaggactg gggcatcacg ctgacgcggc ggttccgcgc gctcaagctg 1200

tggctggtgc tccgatgcta cggcgtggag ggcctgcgcg agcacatccg gtcccacgtc 1260

ggcatggccg ccgcgttcga gggcatggtc agggccgacg cgaggttcga ggtggtgacg 1320

ccgaggcggt tcgcgctggt gtgcttccgg ctccggtcac ccaacaagaa gacggcgaac 1380

gagctcaaca ggcggctcct cgaggaggtg aacgcggcca gctcgggacc gtacatgagc 1440

tccgccaatg tcggcggcgt gtacatgctc aggtgcgccg tcggcagcac gctcaccgag 1500

gagcgccacg tccgggaagc ctggaaggtt gtccaggatc gggctacgtc catcctttcg 1560

aaaatggaga ttattatgta g 1633

<210> 4

<211> 526

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Met Ala Pro Ala Pro Ser His Cys His Ala Thr Asn Gly Asn Asn Gly

1 5 10 15

Ala Ile Ala Ala Ser Asp Thr Pro Val Lys Thr Gln His Cys Ala Arg

20 25 30

Leu Leu Asp Ala Asp Glu Phe Arg Arg Gln Gly Arg Leu Val Val Asp

35 40 45

Leu Ile Ala Asp Tyr Tyr Ala Gly Met Gly Glu Tyr Pro Val His Pro

50 55 60

Thr Val Ser Pro Gly Phe Leu Arg His Arg Leu Pro Ala Glu Pro Pro

65 70 75 80

Ser Arg Arg Glu Pro Asp Ala Phe Ala Ala Ala Met Gln Asp Val Arg

85 90 95

Asp Val Ile Leu Pro Gly Leu Thr His Trp Gln Ser Pro Arg His Phe

100 105 110

Ala His Phe Pro Ala Ser Ser Ser Thr Ala Gly Ala Leu Gly Glu Ala

115 120 125

Leu Ala Ala Gly Ile Asn Val Val Pro Phe Thr Trp Ala Ala Ser Pro

130 135 140

Ala Ala Thr Glu Leu Glu Met Val Val Val Asp Trp Leu Gly Lys Ala

145 150 155 160

Leu His Leu Pro Glu Arg Leu Leu Phe Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser

165 170 175

Ile Leu Gly Thr Thr Cys Glu Ala Ile Leu Cys Ala Leu Val Ala Ala

180 185 190

Arg Asp Arg Lys Leu Ala Ala Ile Gly Glu Gly Arg Ile Gly Asp Leu

195 200 205

Val Val Tyr Cys Ser Asp Gln Thr His Phe Ala Phe Cys Lys Ala Ala

210 215 220

Arg Ile Ala Gly Ile Arg Arg Glu His Cys Arg Glu Ile Pro Thr Tyr

225 230 235 240

Arg Asp Asp Ala Phe Ala Leu Ser Pro Ala Ala Leu Arg Ala Ala Met

245 250 255

Arg Arg Asp Ala Asp Ala Gly Leu Val Pro Leu Phe Val Cys Ala Thr

260 265 270

Val Gly Thr Thr Gln Thr Thr Ala Val Asp Pro Val Gly Glu Leu Cys

275 280 285

Ala Ala Ala Ala Pro His Gly Ala Trp Val His Val Asp Ala Ala Tyr

290 295 300

Ala Gly Ser Ala Met Val Cys Pro Glu Leu Arg Gly Ala Val Ala Gly

305 310 315 320

Gly Val Glu Ala Val Asp Ser Phe Ser Met Asn Ala His Lys Trp Leu

325 330 335

Leu Ala Asn Asn Asp Cys Cys Val Met Trp Val Arg Thr Pro Ser Ala

340 345 350

Leu Val Ala Ala Leu Gly Thr Asp Gln Glu Tyr Ile Leu Lys Asp Ala

355 360 365

Ala Ala Glu Thr Ala Ala Ala Asp Gly Gly Glu Gly Val Val Asp Tyr

370 375 380

Lys Asp Trp Gly Ile Thr Leu Thr Arg Arg Phe Arg Ala Leu Lys Leu

385 390 395 400

Trp Leu Val Leu Arg Cys Tyr Gly Val Glu Gly Leu Arg Glu His Ile

405 410 415

Arg Ser His Val Gly Met Ala Ala Ala Phe Glu Gly Met Val Arg Ala

420 425 430

Asp Ala Arg Phe Glu Val Val Thr Pro Arg Arg Phe Ala Leu Val Cys

435 440 445

Phe Arg Leu Arg Ser Pro Asn Lys Lys Thr Ala Asn Glu Leu Asn Arg

450 455 460

Arg Leu Leu Glu Glu Val Asn Ala Ala Ser Ser Gly Pro Tyr Met Ser

465 470 475 480

Ser Ala Asn Val Gly Gly Val Tyr Met Leu Arg Cys Ala Val Gly Ser

485 490 495

Thr Leu Thr Glu Glu Arg His Val Arg Glu Ala Trp Lys Val Val Gln

500 505 510

Asp Arg Ala Thr Ser Ile Leu Ser Lys Met Glu Ile Ile Met

515 520 525

<210> 5

<211> 2043

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

acagtgacac attacaccac acacgtagca aaacacatcg tacgtacgta caccaagatc 60

tgatcgatcg acgacggcgg cgatggctgc agtgacggtg gagatcacgc ggagcgaggt 120

gctcaggccg tcgccggcgt cggccggcgg cggcgagatg gtcccgctca ccgtcttcga 180

ccgcgccgcc acggacggct acatcccgac catgttcgcc tgggacgccg cggcggcggc 240

ggcgctgtcc aacgacgcca tcaaggacgg cctggccgcc gtgctgtccc ggttcccgca 300

cctcgccggc aggttcgccg tcgacgagcg cggccggaag tgcttccggc taaacaacgc 360

cggcgcgagg gtcctcgagg cctccgccgc cggcgacctc gccgacgccc tcgcgcacga 420

cgtcgccgcc cacgtcaacc agctctaccc ccaagccgac aaggtaagat cgatcagcta 480

ctccgacgtt ttgacattag ttaaatttaa actatttcga gtttaactaa gatcgtagaa 540

aaatatagta ttatttactt aattagtttt atcaaattaa tagttaaata tatttaattt 600

tataataaat cgtcttgtgt tgaaattgtt attatatttt tctataaatt tagtcaacct 660

caaagcagat taactttaac caaaaccaaa acggtctaat aacctaaaac gggagggatt 720

agctagcttc agttcgacac gtaccaaaca ctagctagct tttacgtacg aaacgtgcat 780

gcgatcatgc acgcgtgtgc aagcgtacgt gacgtgatgt atttcaagtt tgacacgtat 840

cgtttccgtc cgtttgcagg atcgtgtgga cgagccactg ttgcaggtgc agctgacgcg 900

gtacacgtgc ggcgggttgg tgatcggcgc ggtgagccac caccaggtcg ccgacggcca 960

gtccatgagc gtcttcttca ccgagtgggc cgccgccgtg cgcaccgccg gcgccgccct 1020

cccgacgccg ttcctcgacc ggtcggccgt cgcggcgccg cgcatcccgc cggcgccggc 1080

gttcgaccac cggaacgtcg agttcagggg cgaggggagc aggagccact cctacggcgc 1140

cctcccgctg gagaggatgc ggaacctcgc cgtccacttc ccgccggagt tcgtcgccgg 1200

cctcaaggcc cgcgtcggcg gcgcgcggtg cagcacgttc cagtgcctcc tggcgcacgc 1260

gtggaagaag atcacggcgg cgcgcgacct ctcgccgaag gagtacacgc aggtgagggt 1320

cgccgtcaac tgccgcggcc gcgccggccc ggcggtgccc acggactact tcggcaacat 1380

ggtgctctgg gcgttcccga ggatgcaggt ccgcgacctc ctctccgcca gctacgccgc 1440

cgtggtcggc gtcatccgcg acgccgtggc gcgcgtcgac gagcggtaca tccagtcgtt 1500

cgtggacttc ggcgaggtgg ccgccggcga cgagctcgcg ccgacggcgg cggagccggg 1560

cacggcgttc tgcccggacc tggaggtcga cagctggata gggttcaggt tccacgacct 1620

cgacttcggc ggcgggccgc cgtgcgcgtt cctgccgccg gacgtgccca tcgacgggtt 1680

gctcatcttc gtgccgtcgt gcgcggcgaa gggcggcgtc gagatgttca tggcgctcga 1740

cgaccagcac gtcgaggctt tgaggcagat ttgctactcc atggactgat tgttagctaa 1800

tatacgaaag tagatacaga catacagtac gtgcatgcaa gggttgcata attaattgca 1860

tgcacatcaa cgaacttgtt ttttctttat tccttgtcaa aggagttaat taagctaatg 1920

caacgaatgt atgatttcaa taggaattac attgtggatg tgtgatatac atgtgtaagc 1980

cttgctagtg taaatatttc agtaaggaat aaaagtatat gtgttcgtgt gtaaaaaatg 2040

aat 2111

<210> 6

<211> 436

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Met Ala Ala Val Thr Val Glu Ile Thr Arg Ser Glu Val Leu Arg Pro

1 5 10 15

Ser Pro Ala Ser Ala Gly Gly Gly Glu Met Val Pro Leu Thr Val Phe

20 25 30

Asp Arg Ala Ala Thr Asp Gly Tyr Ile Pro Thr Met Phe Ala Trp Asp

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Asn Asp Ala Ile Lys Asp Gly Leu

50 55 60

Ala Ala Val Leu Ser Arg Phe Pro His Leu Ala Gly Arg Phe Ala Val

65 70 75 80

Asp Glu Arg Gly Arg Lys Cys Phe Arg Leu Asn Asn Ala Gly Ala Arg

85 90 95

Val Leu Glu Ala Ser Ala Ala Gly Asp Leu Ala Asp Ala Leu Ala His

100 105 110

Asp Val Ala Ala His Val Asn Gln Leu Tyr Pro Gln Ala Asp Lys Asp

115 120 125

Arg Val Asp Glu Pro Leu Leu Gln Val Gln Leu Thr Arg Tyr Thr Cys

130 135 140

Gly Gly Leu Val Ile Gly Ala Val Ser His His Gln Val Ala Asp Gly

145 150 155 160

Gln Ser Met Ser Val Phe Phe Thr Glu Trp Ala Ala Ala Val Arg Thr

165 170 175

Ala Gly Ala Ala Leu Pro Thr Pro Phe Leu Asp Arg Ser Ala Val Ala

180 185 190

Ala Pro Arg Ile Pro Pro Ala Pro Ala Phe Asp His Arg Asn Val Glu

195 200 205

Phe Arg Gly Glu Gly Ser Arg Ser His Ser Tyr Gly Ala Leu Pro Leu

210 215 220

Glu Arg Met Arg Asn Leu Ala Val His Phe Pro Pro Glu Phe Val Ala

225 230 235 240

Gly Leu Lys Ala Arg Val Gly Gly Ala Arg Cys Ser Thr Phe Gln Cys

245 250 255

Leu Leu Ala His Ala Trp Lys Lys Ile Thr Ala Ala Arg Asp Leu Ser

260 265 270

Pro Lys Glu Tyr Thr Gln Val Arg Val Ala Val Asn Cys Arg Gly Arg

275 280 285

Ala Gly Pro Ala Val Pro Thr Asp Tyr Phe Gly Asn Met Val Leu Trp

290 295 300

Ala Phe Pro Arg Met Gln Val Arg Asp Leu Leu Ser Ala Ser Tyr Ala

305 310 315 320

Ala Val Val Gly Val Ile Arg Asp Ala Val Ala Arg Val Asp Glu Arg

325 330 335

Tyr Ile Gln Ser Phe Val Asp Phe Gly Glu Val Ala Ala Gly Asp Glu

340 345 350

Leu Ala Pro Thr Ala Ala Glu Pro Gly Thr Ala Phe Cys Pro Asp Leu

355 360 365

Glu Val Asp Ser Trp Ile Gly Phe Arg Phe His Asp Leu Asp Phe Gly

370 375 380

Gly Gly Pro Pro Cys Ala Phe Leu Pro Pro Asp Val Pro Ile Asp Gly

385 390 395 400

Leu Leu Ile Phe Val Pro Ser Cys Ala Ala Lys Gly Gly Val Glu Met

405 410 415

Phe Met Ala Leu Asp Asp Gln His Val Glu Ala Leu Arg Gln Ile Cys

420 425 430

Tyr Ser Met Asp

435

<210> 7

<211> 1701

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

actcggaaac caatccacac aaacaaccac ctgatagcta agctaattaa ttaagctaag 60

tacactgaca cacacacaaa cacctagtaa ttaatcagaa gcttgggcag cttgggtagc 120

aaggccatgg ctgtggcggt ggagatcaca cggagcgagg tgctcaggcc gtcggagacg 180

ttggcggccg gcggcggcgg caagaggagc cagctcaccg tgttcgaccg tgcagccatg 240

gactggtaca tcccggccgt cttcgcgtgg gacggcgccg cggcgccgtc caacgacgag 300

gttaagggcg gcctcgccgc cgtgctggcc cggtacccgc acctcgccgg gaggttcgac 360

gtcgacgagc gtggccggag gtgcttcaac ctcaacaacg ccggtgtgag ggtcctcgag 420

gccaccgtcg ccgccgacct cgccgacgcc ctcgcgcacg acgtcgccgc tcacgtcaac 480

gagctctacc ccaaggccga catggtataa acatagctag ttagatagag caacgtgaca 540

tgttcaatta tggaattaat tgtacgtgtt ttttgacacg tgtgttttgc atatgttgca 600

ggagaacgcc gacgagccgg tgttccaggt gcagctgacg cggtacgcgt gcggcgggct 660

ggtgattggc acggcgtgca accaccaggt ctccgatggc cagtccatga gcttcttcta 720

cgtcgcgtgg gccgccgccg tgcgcagcgc cggcgccacc ctcccgacgc cgttcgtcga 780

ccgcgcggcg atcgcggttc cccgcggccc gccggcgccg gcgttcgacc accggaacat 840

cgagttcaag ggcgagcaca gctggaccca ctcctacggc tccctccccc tggagcggat 900

caggaacctc gccgtccact tcccggacga gttcgtcgcc ggcctcaagt cccacgtcgg 960

cgcccggtgc agcacgttcc agtgcctcct ggcgcacgcg tggaagaaga tcacggcggc 1020

gcgcgacctc tcgccggagg agtacacgca ggtgagggtc gccgtcaact gccgcggccg 1080

cgccagcccg gcggtgccca tggactactt cggcaacatg gtgctctggg cgttcccgag 1140

gatgagagtc cgggacctcc tctcctccag ctacgccgcc gtggtcggcg tcatccgcaa 1200

cgccgtggcg cgcgtcgacg agcagtacat ccagtcgttc gtcgacttcg gggaggtggc 1260

cgccggcgac gagctgacgc cgacggcggc gccgccgggc acggtgttct gcccggacct 1320

ggaggtggac agctggctag ggttcaggtt ccacgacctc gacttcggcc gtggcccgcc 1380

gtgcgcgttc ctgccgccgg acgtgcccgt cgaggggttg ctcatcttcg tgccgtcgtg 1440

tgcggcgaag ggtggcgtcg agatgttcat ggcgctcgac gacgttcatg tcgaggcttt 1500

caggcaaatc tgctactcca tggactgatc aagcgaatat atttcacaaa agtattgtat 1560

ctataatata ttgttatagt ttgttacaag tacaagaatt gtgtgcatat ttgcaagatt 1620

agccagtcaa ttacgacctg tcatatactc tctctgttac taattattaa ttcttttctt 1680

attatttttt caaacatatt t 1757

<210> 8

<211> 434

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 8

Met Ala Val Ala Val Glu Ile Thr Arg Ser Glu Val Leu Arg Pro Ser

1 5 10 15

Glu Thr Leu Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys Arg Ser Gln Leu Thr Val

20 25 30

Phe Asp Arg Ala Ala Met Asp Trp Tyr Ile Pro Ala Val Phe Ala Trp

35 40 45

Asp Gly Ala Ala Ala Pro Ser Asn Asp Glu Val Lys Gly Gly Leu Ala

50 55 60

Ala Val Leu Ala Arg Tyr Pro His Leu Ala Gly Arg Phe Asp Val Asp

65 70 75 80

Glu Arg Gly Arg Arg Cys Phe Asn Leu Asn Asn Ala Gly Val Arg Val

85 90 95

Leu Glu Ala Thr Val Ala Ala Asp Leu Ala Asp Ala Leu Ala His Asp

100 105 110

Val Ala Ala His Val Asn Glu Leu Tyr Pro Lys Ala Asp Met Glu Asn

115 120 125

Ala Asp Glu Pro Val Phe Gln Val Gln Leu Thr Arg Tyr Ala Cys Gly

130 135 140

Gly Leu Val Ile Gly Thr Ala Cys Asn His Gln Val Ser Asp Gly Gln

145 150 155 160

Ser Met Ser Phe Phe Tyr Val Ala Trp Ala Ala Ala Val Arg Ser Ala

165 170 175

Gly Ala Thr Leu Pro Thr Pro Phe Val Asp Arg Ala Ala Ile Ala Val

180 185 190

Pro Arg Gly Pro Pro Ala Pro Ala Phe Asp His Arg Asn Ile Glu Phe

195 200 205

Lys Gly Glu His Ser Trp Thr His Ser Tyr Gly Ser Leu Pro Leu Glu

210 215 220

Arg Ile Arg Asn Leu Ala Val His Phe Pro Asp Glu Phe Val Ala Gly

225 230 235 240

Leu Lys Ser His Val Gly Ala Arg Cys Ser Thr Phe Gln Cys Leu Leu

245 250 255

Ala His Ala Trp Lys Lys Ile Thr Ala Ala Arg Asp Leu Ser Pro Glu

260 265 270

Glu Tyr Thr Gln Val Arg Val Ala Val Asn Cys Arg Gly Arg Ala Ser

275 280 285

Pro Ala Val Pro Met Asp Tyr Phe Gly Asn Met Val Leu Trp Ala Phe

290 295 300

Pro Arg Met Arg Val Arg Asp Leu Leu Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Val

305 310 315 320

Val Gly Val Ile Arg Asn Ala Val Ala Arg Val Asp Glu Gln Tyr Ile

325 330 335

Gln Ser Phe Val Asp Phe Gly Glu Val Ala Ala Gly Asp Glu Leu Thr

340 345 350

Pro Thr Ala Ala Pro Pro Gly Thr Val Phe Cys Pro Asp Leu Glu Val

355 360 365

Asp Ser Trp Leu Gly Phe Arg Phe His Asp Leu Asp Phe Gly Arg Gly

370 375 380

Pro Pro Cys Ala Phe Leu Pro Pro Asp Val Pro Val Glu Gly Leu Leu

385 390 395 400

Ile Phe Val Pro Ser Cys Ala Ala Lys Gly Gly Val Glu Met Phe Met

405 410 415

Ala Leu Asp Asp Val His Val Glu Ala Phe Arg Gln Ile Cys Tyr Ser

420 425 430

Met Asp

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ttccaggggc ccctgggatc c 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tcagtcacga tgcggccgc 19

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ttccaggggc ccctgggatc catgctgacc gtggcggctt c 41

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tcagtcacga tgcggccgca ggggacaacc tctcgatgtg 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ttccaggggc ccctgggatc catggcacct gcaccctcgc 40

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

tcagtcacga tgcggccgcc tacataataa tctccatttt cgaaagg 47

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ttccaggggc ccctgggatc catggctgca gtgacggtgg agat 44

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

tcagtcacga tgcggccgcc aatcagtcca tggagtagca 40

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

ttccaggggc ccctgggatc catggctgtg gcggtggaga tca 43

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

tcagtcacga tgcggccgct gatcagtcca tggagtagca g 41

<210> 19

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

aaaaagcagg ctta 14

<210> 20

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

agaaagctgg gta 13

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ccttcatacg ctatttattt gcttg 25

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

aaaaagcagg cttaatgctg accgtggcgg cttc 34

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

agaaagctgg gtaaggggac aacctctcga tgtg 34

<210> 24

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

aaaaagcagg cttatcacac atggcacctg cacc 34

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

agaaagctgg gtagtatgag gcgcatgcag cag 33

<210> 26

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

aaaaagcagg cttaatggct gcagtgacgg tggagat 37

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

agaaagctgg gtacaatcag tccatggagt agca 34

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

aaaaagcagg cttaatggct gtggcggtgg agatca 36

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

agaaagctgg gtatgatcag tccatggagt agcag 35

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

tggcatctct cagcacattc c 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

tggcatacag gcgagtccac 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

gcggttgcgg aggtttacaa 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

acgagcagct accagaccat 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

cccaacaaga agacggcgaa 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

gatggacgta gcccgatcct 20

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

tacatccagt cgttcgtgga ctt 23

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

atgagcaacc cgtcgatgg 19

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

catggactac ttcggcaaca 20

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

gacgaacgac tggatgtact g 21

Claims

1.OsTHT1基因和/或OsTHT2基因在增加水稻对白叶枯病和稻瘟病害抗性中的应用，所述OsTHT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，OsTHT1基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：6所示；所述OsTHT2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，OsTHT1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。